Днк, кодирующая белок-7 морфогенеза кости человека, содержащая промоторную область гена, кодирующего данный белок, и способ ее получения

1 Предпосылки изобретения Область изобретения Настоящее изобретение относится к 5'расположенному участку ДНК, включающему промотор гена, кодирующего белок морфогенеза костей (здесь и далее обозначаемый как BMP7). Кроме того, настоящее изобретение относится к способу анализа низкомолекулярного соединения, которое позитивно или негативно регулирует экспрессию гена ВМР-7 человека, с использованием массива клеток животного или дрожжей, в которые вносят рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий 5'расположенный участок ДНК, в составе которого имеется промотор ВМР-7 человека, соединенный с подходящим геном-репортером, с использованием активности гена-репортера в качестве индикаторного признака. Описание уровня техники К настоящему времени было установлено,что активность, связанная с морфогенезом костной ткани, свойственна фактору морфогенеза костей - BMP, относящемуся к надсемейству(Science, 1965, 150, 893-897; Science, 1988, 242,1528-1534). Известными типами BMP являются белки от ВМР-1 до BMP-14. Среди них для факторов от ВМР-2 до BMP-14 было подтверждено наличие активности по контролю морфогенеза(формирования) костей. Белки BMP, представляемые от ВМР-2 до BMP-14, считаются эффективными с точки зрения лечения и профилактики различных патологий костей и заболеваний костей, однако в природе они существуют в очень малых количествах. Следовательно, доступность большого количества белков от ВМР-2 до BMP-14, необходимых для указанного лечения, требует получения рекомбинантного белка. Выработка рекомбинантного белка обычно является весьма высокозатратным процессом по сравнению с получением низкомолекулярных соединений. Более того, существует целый ряд ограничений для лекарственного средства с точки зрения его физических свойств и способов его введения, связанных с характеристиками белка. С учетом этих замечаний низкомолекулярное органическое соединение, реально обладающее активностью, равной такой активности белка BMP, может быть очень перспективным лекарственным средством. Соединение,получаемое в анализе с применением способа,заявляемого настоящим изобретением, обладает активностью по индукции экспрессии ВМР-7 человека, являющегося фактором остеогенеза, а также характеризуется эффективностью, такой же как у ВМР-7 человека, указывающей на его эффективную применимость. С другой стороны,если ВМР-7 человека связан с гиперплазией костной и хрящевой тканей, то подавление его экспрессии может предотвращать остеогиперплазию. В соответствии с настоящим изобретением можно идентифицировать подавление экс 004509 2 прессии ВМР-7, и настоящее изобретение представляет способ анализа вещества с точки зрения подавления гиперплазии. Кроме того, известно, что ВМР-7 человека обладает активностью по усилению дифференцировки почечных клеток (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93,9021-9026). Таким образом, представляемая настоящим изобретением экспериментальная система может быть включена в способ анализа агента, предназначенного для лечения заболевания почек. С точки зрения такого анализа единственным ранее опубликованным примером является использование промотора гена ВМР-2 (международная патентная заявка WO 97/15308), причем примеров применения промотора гена ВМР-7 не было. Кроме того, поскольку представляемые настоящим изобретением материалы для заявляемого способа происходят от организма человека, то можно ожидать, что обнаруженные соединения проявят эффект при их практическом применении. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к ДНК,содержащей нуклеотиды 1-10877 SEQ ID NO: 1,приведенной в списке последовательностей,кодирующей белок-7 морфогенеза кости (ВМР 7) человека и содержащей промоторную область гена, кодирующего указанный белок. Настоящее изобретение также относится к способу получения указанной ДНК и к вектору, содержащему указанную ДНК. Низкомолекулярные соединения и их производные обладают морфогенетической активностью и ингибиторной активностью в отношении костной и хрящевой тканей по типу активности ВМР-7 человека, и они эффективны в качестве профилактических или терапевтических средств против заболеваний хрящевой и костной тканей, средств против развития костных метастаз или терапевтических и профилактических средств против избыточного остеогенеза. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана экзон-интронная структура 5'-расположенного участка гена ВМР-7 человека длиной 10,8 т.п.н. и его рестрикционная карта. Закрашенный участок соответствует экзону, а незакрашенный участок после него интрону. На фиг. 2 изображен рекомбинантный экспрессирующий вектор (плазмида pMSS115),включающий 5'-сегмент гена ВМР-7 человека. Промоторный сегмент длиной 4400 пар нуклеотидов (нуклеотиды 3813-8222, показанные вXbaI-сайта 5'-концевой структуры на фиг. 1) был встроен по рестрикционному NheI-сайту исходной плазмиды pGL3. На фиг. 3 приведены результаты измерений активности промотора гена ВМР-7 человека 3 Описание предпочтительного осуществления Настоящее изобретение относится к ДНК,нуклеотидная последовательность которой показана в виде перечня нуклеотидов 1-10877 вSEQ ID NO: 1 списка последовательностей, которая кодирует промоторный участок гена белка-7 морфогенеза, костей человека или его фрагмент. В последовательности SEQ ID NO: 1 списка последовательностей показан 5'расположенный участок гена ВМР-7 человека. Настоящее изобретение относится к способу получения ДНК, показанной в SEQ IDNO:1 списка последовательностей, путем осуществления следующих стадий:(1) расщепление геномной ДНК клеток плаценты человека рестриктазой HindIII;(3) клонирование выделенного, расщепленного рестриктазой HindIII фрагмента ДНК в фаговый вектор DASH-II, предварительно расщепленный той же рестриктазой;(4) упаковка упомянутого вектора в зрелую фаговую частицу;(5) получение геномной клонотеки путем инфицирования клеток Escherichia coli полученным фагом;(7) субклонирование в плазмидный вектор. Тип используемого здесь плазмидного вектора ничем не ограничен и может быть выбран из тех, которые доступны на коммерческой основе. Предпочтительным примером такого вектора может быть плазмида pUC18. Настоящее изобретение относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору,характеризующемуся встроенной в генрепортер полной или частичной последовательностью ДНК по SEQ ID NO: 1 списка последовательностей. В частности, рекомбинантный экспрессирующий вектор конструируют таким образом, чтобы разместить 5'-участок гена ВМР-7 человека, представленный в SEQ ID NO: 1 списка последовательностей, перед геномрепортером. Ген-репортер, такой как ген люциферазы или ген -галактозидазы, будет свидетельствовать об экспрессии исходного продукта данного гена. Тип вектора, используемого для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, ничем специально не ограничивается, и может быть использован коммерчески доступный вектор. В качестве предпочтительного примера настоящим изобретением используется вектор на основе плазмиды pGL3. На основеpGL3 был сформирован вектор pMSS115 (длиной 9200 пар нуклеотидов), являющийся рекомбинантным экспресирующим вектором, включающим промотор гена ВМР-7 человека и люциферазный ген-репортер. В настоящем изобретении он обозначается как рекомбинантный экспрессирующий вектор. Необходимым явля 004509 4 ется внесение этого вектора в клетки млекопитающего, предпочтительно в клетки остеобластного типа человека, такие как клетки SaOS-2,с использованием липосом. Клетки животного,трансфицированные рекомбинантным экспрессирующим вектором, отбирают с использованием маркерного гена резистентности. Настоящее изобретение относится к способу анализа связанного с костной тканью вещества, отличающегося использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, отличающегося соединением полной или частичной ДНК, показанной в SEQ ID NO: 1 списка последовательностей, с геном-репортером. Оно относится к способу анализа связанного с костной тканью вещества, причем таким связанным с костной тканью веществом является вещество,индуцирующее остеогенез, или причем связанным с костной тканью веществом является вещество, подавляющее остеогенез. Низкомолекулярное соединение, которое индуцирует или подавляет экспрессию ВМР-7 человека, может быть получено путем выделения промотора,который контролирует экспрессию гена, соединяя его с подходящим репортерным геном и внося полученную генную структуру в подходящую клетку млекопитающего с целью формирования анализаторной системы. Вещество,которое регулирует экспрессию гена ВМР-7 человека в такой анализаторной системе, воздействует на данный промотор так, что это обусловливает повышение или снижение уровня экспрессии гена-репортера. Таким образом,простое и несложное определение уровня активности репортера делает возможным тестирование анализируемого вещества. Клетка животного, трансфицированная упомянутым вектором, может быть использована в способе тестирования библиотеки химических соединений путем высокопроизводительного скрининга (Nature, 1996, 384, supl., 14-16) и анализа активного компонента вещества естественного происхождения. То вещество, которое обусловливает снижение или усиление активности, обнаруживается при воздействии ее на клетку в течение подходящего периода времени с последующим определением уровня активности репортера. Полученное таким образом вещество может регулировать экспрессию путем прямого воздействия на транскрипционный фактор или косвенно на промотор гена BMP-7 человека за счет влияния на элементы сигнальных путей. Следовательно, эти соединения будут эффективными в качестве терапевтических средств против заболеваний костной и хрящевой тканей, метастаз костных опухолей или гиперплазии костей. Кроме того, эти соединения применимы в качестве терапевтических средств в отношении болезней почек. Вещество, полученное в соответствии с настоящим изобретением, обладает морфогене 5 тической активностью в отношении костной и хрящевой ткани и эффективно в качестве агента для терапии и профилактики в области ортопедической хирургии (переломы, остеоартрит,такой как остеоартроз суставов и остеоартроз тазобедренного сустава, эпифизарный остеомиелит, повреждения хрящей, такие как повреждения мениска, регенерация костной и хрящевой ткани после повреждений и удаления опухоли, костная пластика, такая как создание межпозвонковых анкилозов и расширение позвоночного канала, а также наследственные патологии костей и хряща, такие как дизостеогенез и ахондроплазия) или стоматологии (костная пластика, такая как заделка нбной расщелины, реконструкция челюстных костей и наращивание остаточных альвеолярных выступов), а также при остеопорозе. Более того,такое вещество по настоящему изобретению может быть использовано при пересадке костной ткани в пластической хирургии. Аналогичные пути применения будут эффективны и в случае ветеринарной хирургии. С другой стороны, настоящим изобретением может представляться вещество, подавляющее развитие костной или хрящевой ткани. В этом случае это вещество применяется в качестве профилактического или терапевтического средства при гиперплазии кости и хряща. Кроме того, настоящее изобретение может представлять вещество, характеризующееся способностью усиливать дифференциацию почечных клеток, благодаря чему она может быть применена в качестве средства лечения и профилактики заболеваний почек. Примеры Настоящее изобретение будет более наглядно объяснено с помощью приводимых далее примеров. При этом во всех отношениях нижеследующие примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими. Пример 1. Выделение 5'-участка гена ВМР-7 человека. Геномная ДНК клеток плаценты человека(Clontech) обрабатывали рестриктазами различного типа (BamHI, BgIII, EcoRI, HindIII, PstI,SacI, SalI, SmaI, SphI и XbaI), разделяли методом электрофореза в агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и подвергали Саузерн-гибридизации с использованием в качестве зонда кДНК гена BMP-7 (EMBO J., 1990, 9,2085-2093). В результате, было установлено, что расщепление рестриктазой HindIII среди других использовавшихся рестриктаз позволило получить ДНК-фрагмент длиной примерно 11 тысяч пар нуклеотидов, включающий наиболее крупный участок гена ВМР-7 человека. Затем геномную ДНК клеток плаценты человека обрабатывали рестриктазой HindIII и разделяли методом электрофореза в агарозном геле с последующим выделением из геля фрагмента ДНК длиной примерно 11 тысяч пар нуклеотидов. 6 Полученный фрагмент ДНК был клонирован в(Stratagene Ltd.), инфицировали им клетки Escherichia coli штамма XL-1 Blue MRA (Stratagene Ltd.) с формированием в результате геномной клонотеки. Эту клонотеку разделяли на пулы. Каждый из пулов амплифицировали с помощью ПЦР (Nucl. Acids Res., 1993, 21, 26272631), а именно, применяли метод ПЦР с затравками (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 списка последовательностей),соответствующими транслируемому сегменту, с целью выделения пула, от которого может быть выделена искомая 5'-последовательность гена ВМР-7 человека. Кроме того, 5'-расположенный фрагмент длиной 10,8 тысяч пар нуклеотидов субклонировали в состав вектора pUC18 (предоставлен AmershamPharmacia Biotech). Этот вектор обозначили какE.coli pKOT314. Вектор E.coli pKOT314 внесли в коллекцию Национального института биологии и технологии человека Министерства международной торговли и промышленности Японии (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken 305-8566) 30 марта 1998 года с получением депозитарного номера FERM P-16737 с последующим внесением 17 февраля 1999 года в международный депозитарий под юрисдикцией Будапештского соглашения (депозитарныйFERM ВР-6651). Пример 2. Определение нуклеотидной последовательности 5'-участка гена ВМР-7 человека. Нуклеотидная последовательность выделенного 5'-расположенного участка гена ВМР-7 человека была установлена с помощью ДНКсеквенатора ALF (Amersham Pharmacia Biotech),работа которого основана на методе Сэйнджера(Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74, 5463-5467). Определенная в этом анализе нуклеотидная последовательность показана вSEQ ID NO: 1 ранее уже были опубликованы(ЕМВО J., 1990, 9, 2085-2093). Однако имеется значительное число отличий от последовательности, приводимой настоящим изобретением. Пример 3. Конструирование рекомбинантного экспрессирующего вектора, включающего промотор гена ВМР-7 человека и люциферазный ген-репортер. Как показано на фиг. 1, промотор гена ВМР-7 человека расположен выше 1-го экзона. С учетом этого фрагмент длиной 4400 пар нуклеотидов, включающий промотор от второгоXbaI-сайта до третьего XbaI-сайта, считая от 5'конца в соответствии с показанным на фиг. 1,вносили по рестрикционному NheI-сайту исходного вектора pGL (Promega Ltd.) так, чтобы этот фрагмент располагался выше гена 7 репортера люциферазы, с целью конструирования рекомбинантного экспрессирующего вектора pMSS115 (9200 пар нуклеотидов). Он показан на фиг. 2. Пример 4. Измерение активности промотора гена ВМР-7 человека (внесение рекомбинантного экспрессирующего вектора в клетку человека и экспрессия по непостоянному типу). С целью экспрессии по непостоянному типу рекомбинантного экспрессирующего вектора с промотором ВМР-7 человека упомянутый рекомбинантный экспрессирующий вектор(pMSS115) в равном количестве смешивали с вектором pRL-SV40 (Promega Ltd.), включающим ген люциферазы организма sea pansy, взятый в качестве внутреннего контроля для определения эффективности внесения гена. Затем к смеси, предназначенной для добавления к остеосаркомным клеткам человека линий HOS,MG63 и SaOS-2, добавляли катионные липосомы - липофектамин (Lipotech Oriental Co.). Активность люциферазы огненного муравья Solenopsis invicta и люциферазы sea pansy измеряли с использованием набора реактивов PikkaGene Dual kit (Toyo Ink Co.). Полученные результаты показаны на фиг. 3. Уровень промоторной активности выражали отношением активности люциферазы огненного муравья и активности люциферазы sea pansy. Исходя из этих результатов, стало ясно, что ДНК по SEQ IDNO: 1 списка последовательностей обладает промоторной активностью. Пример 5. Внесение рекомбинантного экспрессирующего вектора в клетку человека и стабильная экспрессия. С целью стабильной экспрессии рекомбинантного экспрессирующего вектора, включающего ВМР-7 человека, упомянутый вектор смешивали с вектором, включающим ген резистентности к пуромицину, в соотношении 10:1,а также смешивали с катионными липосомами липофектамином (Lifetech Oriental Co.), которые затем добавляли к остеосаркомным клеткам человека HOS с целью их трансфицирования. Клетки, в которые попал анализируемый ген,отбирали из культуральной среды, содержащей пуромицин (Sigma Ltd.). Пример 6. Скрининг активного низкомолeкулярного соединения. Отобранные клетки вносили в лунки 96 луночного планшета, обрабатывали в течение 13 дней веществами, представляющими различные библиотеки химических соединений, обрабатывали цитолитическим агентом (PromegaLtd.) и измеряли каталитическую активность с использованием набора реактивов для определения люциферазной активности (Promega Ltd.). С помощью данного подхода был выделен ряд веществ, индуцирующих или подавляющих экспрессию ВМР-7 человека. 8 Описание списка последовательностей 210 1 223 Нуклеотидная последовательность участков, расположенных в 5'-части гена ВМР-7 человека, включающих 1-й экзон. 210 2 223 Прямая ПЦР-затравка для клонирования 5'-последовательности гена ВМР-7 человека, соответствующая участку 1-го экзона. 210 3 223 Обратная ПЦР-затравка для клонирования 5'-последовательности гена ВМР-7 человека, соответствующая участку 1-го экзона. Список последовательностейSEQ ID NO: 1, приведенной в списке последовательностей, кодирующая белок-7 морфогенеза кости (ВМР-7) человека и содержащая промоторную область гена, кодирующего указанный белок. 2. Способ получения ДНК, охарактеризованной в п.1, предусматривающий следующие стадии:(1) расщепление геномной ДНК клеток плаценты человека рестриктазой HindIII,(2) выделение фрагмента ДНК размером приблизительно 11 т.п.н. с помощью электрофореза обработанной HindIII смеси в агарозном геле,(3) клонирование выделенного расщепленного HindIII фрагмента ДНК в -фаговый вектор DASHII, обработанный HindIII,(4) упаковка указанного вектора в фаг,(5) получение геномной клонотеки путем инфицирования Escherichia coli полученным фагом,(6) скрининг по методу ПЦР с использованием ПЦР-праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:2 и 3, приведенные в списке последовательностей, соответствующих области экзона 1 гена ВМР-7, и(7) субклонирование генного фрагмента размером 10,8 т.п.н., расположенного в 5'концевой области гена ВМР-7 человека, в плазмидный вектор с получением ДНК, охарактеризованной в п.1. 3. Рекомбинантный экспрессирующий вектор, полученный встраиванием ДНК по п.1 в участок, расположенный выше репортерного гена.