Соединения, фармацевтические композиции и способы лечения сердечной недостаточности

СОЕДИНЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Предлагается соединение формулы А которое может быть названо метил 4-[(2-фторо-3[(6-метил(3-пиридиламино]карбониламино фенил)метил]пиперазинкарбоксилат, или его фармацевтически приемлемая соль. Кроме того, предлагается фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или адъювант и соединение формулы А или его фармацевтически приемлемую соль. Также заявлен способ лечения сердечной недостаточности у млекопитающего,включающий назначение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения формулы А или его фармацевтически приемлемой соли либо фармацевтической композиции,содержащей соединение формулы А или его фармацевтически приемлемую соль. При этом сердечная недостаточность является конгестивной сердечной недостаточностью, включая систолическую сердечную недостаточность. 016138 Изобретение относится к замещенным производным соединения мочевины, особенно к химическим структурным элементам, которые выборочно модулируют саркомер сердца, и, в частности, к химическим структурным элементам, фармацевтическим соединениям и способам лечения болезни сердца."Саркомер" - упорядоченно расположенная клеточная структура, обнаруженная в сердечной и скелетной мышце, состоящая из интердигитарных тонких и толстых филаментов; она занимает почти 60% объема клетки сердца. Толстые филаменты состоят из "миозина" - белка, ответственного за преобразование химической энергии (гидролиз АТФ) в силу и направленное движение. Миозин и его функционально родственные представители называются моторными белками. Тонкие филаменты состоят из комплекса белков. Один из этих белков - "актин" (филаментный полимер) является субстратом, к которому подтягивается миозин во время генерации силы. С актином связан набор регулирующих белков: "комплекс тропонина" и "тропомиозин", которые делают взаимодействие актин-миозина зависимым от изменений внутриклеточного уровня Са 2+. С каждым сердечным сокращением уровни Са 2+ растут и падают, вызывая сокращение сердечной мышцы, за которым следует расслабление сердечной мышцы. Каждый компонент саркомера вносит вклад в реакцию сокращения. Миозин изучен лучше всех из моторных белков. Из тринадцати отдельных классов миозина в клетке человека, миозин класса II отвечает за сокращение скелетных, сердечной и гладкой мышц. Миозин этого класса значительно отличается по соединению у аминокислот и по общей структуре от миозинов других двенадцати классов. Миозин класса II состоит из двух глобулярных головных доменов, связанных вместе длинной альфа-спиральной спираль-спиральной хвостовой частью, которая собирается другим миозином класса IIs с образованием ядра толстого филамента саркомера. Глобулярные головки имеют каталитический домен, в котором происходит связывание актина и функционирование АТФ миозина. После прикрепления к актиновому филаменту выход фосфата (сравните АТФ и АДФ) ведет к изменению структурной конформации каталитического домена, который, в свою очередь, изменяет ориентацию подобного плечу рычага домена связывания легкой цепи, который идет от глобулярной головки; это движение названо гребковым. Это изменение ориентации головки миозина относительно актина приводит к перемещению толстого филамента, частью которого он является, относительно тонкого актинового филамента, с которым он связан. Нарушение связи глобулярной головки с актиновым филаментом(также Са 2+ модулируемый), соединенной с возвращением каталитического домена и легкой цепи к их стартовой конформации/ориентации, заканчивает цикл сокращения и расслабления. Сердечная мышца млекопитающих состоит из двух форм кардиального миозина: альфа и бета, и они хорошо различимы. В сердечной мышце взрослого человека преобладающей является бета-форма(90%). По наблюдениям у человека обе регулируются в условиях сердечной недостаточности, как на транскрипционном, так и на трансляционном уровнях, при этом при сердечной недостаточности альфаформа подавляется. Обнаружены последовательности всех миозинов человека: скелетной, сердечной и гладкой мышц. При том что кардиальные альфа- и бета-миозины очень схожи (93%-ная идентичность), оба они сильно отличаются от миозина гладкой мышцы человека (42%-я идентичность) и больше похожи на миозин скелетной мышцы (80%-ная идентичность). Миозины сердечной мышцы обладают невероятно высокой гомологией для всех видов млекопитающих, например кардиальные как альфа-, так и бета-миозины у человека и крысы идентичны на 96%, и полученная последовательность из 250 остатков кардиального бета миозина свиньи и соответствующая последовательности кардиального бета-миозина человека имеют 100% гомологию. Такая гомология последовательностей оказывает положительное влияние на предсказуемость изучения миозина на основе терапии моделей сердечной недостаточности у животных. Компоненты саркомера сердца являются целями для лечения сердечной недостаточности, например, путем увеличения сократительной способности или способствования полному расслаблению для модулирования систолической и диастолической функции соответственно. Конгестивная сердечная недостаточность (КСН) не является специфическим заболеванием, а является скорее комплексом проявлений и симптомов, каждый из которых вызван неспособностью сердца адекватно отвечать на напряжение увеличением сердечного выброса. Доминирующей патофизиологией,связанной с конгестивной сердечной недостаточностью, является систолическая дисфункция, ухудшение сократительной способности сердца (с последовательным сокращением количества крови, выбрасываемой при каждом сердечном сокращении). Систолическая дисфункция с компенсационным расширением полостей желудочков приводит к самой общей форме сердечной недостаточности, "дилатационная кардиомиопатия", которая, как полагают, является той же самой КСН. Контрапунктом систолической дисфункции является диастолическая дисфункция - ухудшение способности наполнять желудочки кровью,что также может привести к сердечной недостаточности даже с сохраненной функцией левого желудочка. Конгестивная сердечная недостаточность, в конечном счете, связана непосредственно с дисфункцией кардиального миоцита, включая снижение его способности сокращаться и расслабляться. Многие из одних и тех же основных состояний могут вызвать систолическую и/или диастолическую дисфункцию, например атеросклероз, артериальная гипертензия, вирусная инфекция, дисфункция клапана и генетическое расстройство. У пациентов с этими состояниями обычно проявляются одни и те же классические симптомы: одышка, отек и непреодолимая усталость. Примерно у половины пациентов-1 016138 с дилатационной кардиомиопатией причиной их сердечной дисфункции является ишемическая болезнь сердца вследствие коронарного атеросклероза. У этих пациентов был либо один инфаркт миокарда, либо несколько инфарктов миокарда; в этих случаях последующее рубцевание и повторное моделирование приводят к развитию дилатационной и гипоконтрактильной болезни сердца. Время от времени возбудитель не может быть идентифицирован, поэтому болезнь упоминается как "идиопатическая дилатационная кардиомиопатия". Независимо от ишемического или другого происхождения пациентов с дилатационной кардиомиопатией ждет плачевный прогноз: чрезмерная заболеваемость и высокая смертность. Превалирование конгестивной сердечной недостаточности возрастает до эпидемических размеров по мере старения населения и по мере того, как кардиологи добиваются успехов при снижении смертности от ишемической болезни сердца, самой общей прелюдии к конгестивной сердечной недостаточности. Примерно у 4,6 млн человек в США была диагностирована конгестивная сердечная недостаточность; распространенность такого диагноза приближается к 10 на 1000 после 65 лет. Госпитализация в случае конгестивной сердечной недостаточности является обычно результатом неадекватной амбулаторной терапии. Из больниц с диагнозом конгестивная сердечная недостаточность выписывалось 377000 человек в 1979 г. и 970000 человек в 2002 г., что делает КСН самым общим диагнозом при выписке пациентов в возрасте 65 лет и старше. За пять лет смертность от конгестивной сердечной недостаточности достигла 50%. Следовательно, в то время как терапии для болезни сердца значительно улучшились и продолжительность жизни увеличилась еще на несколько лет, продолжаются поиски новых и улучшенных способов лечения, особенно для КСН."Острая" конгестивная сердечная недостаточность (известна также как острая "декомпенсация" сердечной недостаточности) характеризуется резким снижением сердечной функции в результате ряда причин, например, у пациента, страдающего конгестивной сердечной недостаточностью, новый инфаркт миокарда, прекращение лечебного курса, и нарушение диеты может вызвать скопление жидкости в виде отека и метаболическую недостаточность даже в состоянии отдыха. Терапевтический препарат, который улучшает сердечную функцию во время такого острого эпизода, может оказать помощь в ослаблении этой метаболической недостаточности, и ускорении устранения отека, что способствует возвращению к более стабильному состоянию "компенсации" конгестивной сердечной недостаточности. Пациенты с очень запущенной конгестивной сердечной недостаточностью, особенно на конечной стадии болезни,также могут получить пользу от терапевтического препарата, который усиливает сердечную функцию,например, для стабилизации при ожидании трансплантата сердца. Другие потенциальные выгоды могут быть получены пациентами с насосом для шунтирования, например назначением препарата, который помогает остановленному или замедленному сердцу в возобновлении нормальной функции. Терапевтический препарат, который моделирует расслабление, может помочь пациентам с диастолической дисфункцией (недостаточное расслабление сердечной мышцы). Инотропы - препараты, которые повышают способность к сокращению сердца. Как группа, все существующие инотропы не в состоянии соответствовать золотому стандарту по терапии сердечной недостаточности, т.е. продлевать жизнь пациентов. Кроме того, существующие препараты, которые плохо обеспечивают избирательность для сердечной ткани, что частично ведет к распознанным неблагоприятным эффектам, что ограничивает их применение. Несмотря на этот факт, внутривенные инотропы продолжают широко использоваться при острой сердечной недостаточности (например, с учетом перорального приема препаратов или при отправке пациентов на трансплантацию сердца), тогда как при хронической сердечной недостаточности перорально принимаемый дигоксин используется как инотроп для снятия симптомов у пациентов, повышения качества жизни, и сокращения сроков госпитализации. Современные инотропные терапии улучшают сократительную способность путем увеличения временного повышения кальция через аденилилциклазный путь, или путем замедления разложения цАМФ через ингибирование фосфодиэстеразы (PDE), что может быть вредно для пациентов с сердечной недостаточностью. Учитывая то, что современные препараты имеют ограничения, для улучшения сердечной функции при конгестивной сердечной недостаточности необходимы новые подходы. Последним из разрешенных к применению внутривенных препаратов кратковременного действия был милринон, который появился более 15 лет назад. Единственному из доступных пероральных лекарственных средств дигоксину уже более 200 лет. Крайне необходимы препараты, которые используют новые механизмы действия и могут привести к лучшим результатам, имея в виду ослабление симптомов, безопасность и смертность пациентов как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе. Новые препараты с улучшенными терапевтическими показателями по сравнению с современными препаратами обеспечат достижение этих клинических результатов. Избирательность препаратов, направленных на саркомер сердца (например, путем связывания кардиального бета-миозина), была идентифицирована как важное средство обеспечения этих улучшенных терапевтических показателей. В настоящем изобретении предлагаются такие препараты (в частности,активаторы саркомера) и способы их идентификации и применения. Другой подход может состоять в непосредственной активизации кардиального миозина без изменения временного повышения кальция с целью улучшения сократительной способности сердца. В настоя-2 016138 щем изобретении предлагаются такие препараты (в частности, активаторы миозина) и способы их идентификации и применения. Предлагается соединение формулы А Формула А которое можно назвать [3-фторо-5-(3-пиридин-3-илуреидо)бензил]метилметиловый эфир карбоновой кислоты или метил 4-[(2-фторо-3-[(6-метил(3-пиридиламино]карбониламинофенил)метил]пиперазинкарбоксилат (используя NamExpert, имеющееся на Cheminnovation или функцию автоматического присвоения названия ChemDraw Utlra версии 9.0 Cambridge Soft Corporation). Кроме того, предлагается расфасованная фармацевтическая композиция, в состав которой входит фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или адъювант и по крайней мере один описанный здесь химический структурный элемент, и инструкции по применению данной композиции для лечения пациента, страдающего болезнью сердца. Также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или адъювант и соединение или его фармацевтически приемлемую соль. Кроме того, предлагается способ лечения сердечной болезни у млекопитающего, который включает назначение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества по крайней мере одного описанного здесь химического структурного элемента или фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый инертный наполнитель, носитель или адъювант и по крайней мере один описанный здесь химический структурный элемент. Также предлагается способ лечения сердечной недостаточности у млекопитающего, включающий назначение млекопитающему терапевтически эффективного количества описанного здесь соединения или его фармацевтически приемлемой соли либо фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение или его фармацевтически приемлемой соли. Кроме того, предлагается способ модулирования кардиального саркомера у млекопитающего, который включает назначение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества по крайней мере одного описанного здесь химического структурного элемента или фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый инертный наполнитель, носитель или адъювант и по крайней мере один описанный здесь химический структурный элемент. Кроме того, предлагается способ усиления действия кардиального миозина у млекопитающего, который включает назначение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества по крайней мере одного описанного здесь химического структурного элемента или фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый инертный наполнитель, носитель или адъювант и по крайней мере один описанный здесь химический структурный элемент. Кроме того, при производстве медикамента для лечения болезни сердца предлагается применение по крайней мере одного описанного здесь химического структурного элемента. Другие аспекты и примеры осуществления настоящего изобретения будут ясны специалистам из следующего подробного описания. В данном описании следующие слова и фразы имеют вполне определенные значения, сформулированные ниже, кроме расширенных значений, которые указываются отдельно. Приведенные сокращения и термины имеют следующие значения по всему тексту: В данном описании следующие слова и фразы имеют вполне определенные значения, сформулированные ниже, кроме расширенных значений, которые указываются отдельно. В данном случае, если какая-либо переменная встречается больше одного раза в химической формуле, ее определение в каждом случае не зависти от ее определения в каждом другом случае. Дефис ("-"), который располагается не между двумя буквами или символами, используется для указания точки присоединения заместителя, например -CONH2 присоединяется через атом углерода."Произвольный" или "произвольно" означает, что впоследствии описанный случай или обстоятельство могут происходить или не происходить и что описание включает примеры, в которых этот случай или это обстоятельство происходят и примеры, в которых они не происходят, например, "произвольно замещенный алкил" относится как к "алкильной группе", так и к "замещенной алкильной группе" как определяется ниже. Специалистам ясно, если речь идет о любой группе, содержащей один или более заместителей, что такие группы не предназначены для включения в них какого-либо замещения или заме-4 016138 щающей структуры, что является непрактичным с точки зрения пространственного размещения, невыполнимо с точки зрения синтеза и/или нестабильно с точки зрения внутренне присущих свойств. Термин "алкил" включает нормальную цепь и разветвленную цепь с указанным числом атомов углерода. Алкильные группы это группы с С 20 или более легкая, например C13 или более легкая, например С 6 или низший, например C1-С 6-алкил включает как прямую, так и разветвленную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода. К примерам алкильных групп относится метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, 2-пентил, изопентил, неопентил, гексил, 2-гексил, 3 гексил, 3-метилпентил и т.п. Алкилен - другая подгруппа алкила, обращающаяся к тем же самым остаткам, что и алкил, но имеющая другие точки присоединения, например СО-алкилен указывает на ковалентную связь, a C1-алкилен относится к группе метилена. Когда называется алкильный остаток, имеющий определенное количество атомов углерода, то он включает все геометрические изомеры, имеющие данное количество атомов углерода, например "бутил" включает н-бутил, втор-бутил, изобутил и tбутил; "пропил" включает н-пропил и изопропил. Термин "низший алкил" относится к алкильным группам, имеющим от одного до четырех атомов углерода. Термин "циклоалкил" указывает на кольцо насыщенного углеводорода или конденсированное сдвоенное кольцо с определенным количеством атомов углерода, обычно от 3 до 12 кольцевых атомов углерода, чаще 3-10 или 3-7. Примеры циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил, а также мостиковые и каркасные насыщенные кольцевые группы, например норборнан. Примеры конденсированных сдвоенных колец включают октагидро-1 Н-инден, октагидропентален, 1,2,3,3 а, 4,5-гексагидропентален, 1,2,4,5,6,7,7 а-гептагидро-2 Н-инден, 4,5,6,7-тетрагидро-2 Н-инден и т.п. Под термином "алкокси" понимается алкильная группа, присоединенная через кислородный мостик, например метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, терт-бутокси, пентокси,2-пентилокси, изопентокси, неопентокси, гексокси, 2-гексокси, 3-гексокси, 3-метилпентокси и т.п. Вообще, алкильная группа алкоксигруппы это группа с С 20 или более легкая, например С 13 или более легкая, например С 6 или низший. "Низшее алкокси" относится к алкоксигруппам, имеющим от одного до четырех атомов углерода. Под термином "циклоалкокси" понимается циклоалкильная группа, присоединенная через кислородный мостик, например циклопропокси, циклобутокси, циклопентокси, циклогексокси, циклогептокси и т.п. Вообще циклоалкильная группа циклоалкоксигруппы это группа с С 20 или более легкая, например С 13 или более легкая, например С 6 или низший.(гетероциклоалкил)-С(О)-, где группа присоединяется к материнской структуре через функциональную карбонильную группу и где алкил, циклоалкил, арил, гетероарил, и гетероциклоалкил это описанные здесь структуры. Ацильные группы имеют указанное количество атомов углерода с углеродом кетогруппы, включаемой в пронумерованные атомы углерода, например С 2 ацильная группа это ацетильная группа, имеющая формулу СН 3(С=О)-. Под термином "алкоксикарбонил" понимается сложноэфирная группа, формула которой (алкокси)(С=О)-, присоединяемая через углерод карбонила, где алкоксигруппа имеет указанное количество атомов углерода. Таким образом, C1-С 6-алкоксикарбонилгруппа является алкоксигруппой с количеством атомов углерода от 1 до 6, присоединенных через его кислород к карбонильному линкеру. Под термином "амино" понимается группа -NH2. Термин "аминокарбонил" относится к группе CONRbRc, гдеRb выбирается из группы, в состав которой входит водород, произвольно замещенный C1-С 6-алкил,произвольно замещенный арил и произвольно замещенный гетероарил иRc выбирается из группы, в состав которой входит водород и произвольно замещенный С 1-С 4-алкил; илиRb и Rc, взятые вместе с азотом, с которым они связаны, образуют произвольно замещенный 5-7 членный азотсодержащий гетероциклоалкил, который произвольно включает 1 или 2 дополнительных гетероатома, выбираемых из O, N и S в гетероциклоалкильном кольце; где каждая замещенная группа независимо замещается одним заместителем или большим числом заместителей, независимо выбираемых из следующих структурных элементов: C1-C4-алкил, арил, гетероарил, арил-C1-C4-алкил-, гетероарил-C1-C4-алкил-, C1-C4-галоалкил, -OC1-C4-алкил, -OC1-C4 алкилфенил, -C1-C4-алкил-ОН, -OC1-C4-галоалкил, галоген, -ОН, -NH2, -C1-C4-алкил-NH2, -N(C1-C4 алкил)(C1-C4-алкил), -NH(C1-С 4-алкил), -N(C1-C4-алкил)(C1-C4-алкилфенил), -NH(C1-C4-алкилфенил),циан-, нитро, оксо (в качестве заместителя циклоалкила, гетероциклоалкила, или гетероарила), -СО 2 Н,-C(O)OC1-C4-алкил, -CON(C1-C4-алкил)(C1-C4-алкил), -CONH(C1-C4-алкил), -CONH2, -NHC(O)(C1-C4 алкил), -NHC(O)(фенил), -N(C1-C4-алкил)C(O)(C1-C4-алкил), -N(C1-C4-алкил)С(О)(фенил), -С(О)C1-C4 алкил, -С(О)C1-C4-фенил, -С(О)C1-C4-галоалкил, -ОС(О)C1-C4-алкил, -SO2(C1-C4-алкил), -SO2(фенил),-SO2(C1-C4-галоалкил), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4-алкил), -SO2NH(фенил), -NHSO2(C1-C4-алкил),-NHSO2(фенил) и -NHSO2(C1-C4-галоалкил)."Арил" включает 5- и 6-членные карбоциклические ароматические кольца, например бензол; сдво-5 016138 енные кольцевые системы, где по крайней мере одно кольцо является карбоциклическим и ароматическим, например нафталин, индан, и тетралин; и системы трициклического кольца, где по крайней мере одно кольцо являются карбоциклическим и ароматическим, например флуорен. Например, арил включает 5- и 6-членные карбоциклические ароматические кольца, конденсированные до 5-7-членного гетероциклоалкилового кольца, содержащего 1 или более гетероатомов, выбираемых из N, О и S. Для таких конденсированных сдвоенных кольцевых систем, где только одно из колец является карбоциклическим ароматическим кольцом, точка присоединения может быть в карбоциклическом ароматическом кольце или гетероциклоалкильном кольце. Бивалентные радикалы, образованные из замещенных производных соединений бензола и имеющие свободные валентности в атомах кольца, называются замещенными радикалами фенилена. Название бивалентных радикалов, полученных из одновалентных полициклических радикалов углеводорода, название которых оканчивается на "-ил", путем отделения одного атома водорода от атома углерода со свободной валентностью, образуется путем добавляется "-иден" к названию соответствующего одновалентного радикала, например нафтильная группа с двумя точками присоединения называется нафтилиден. Арил, однако, не включает гетероарил по определению и не пересекается с ним в любом случае. Следовательно, если одно или более карбоциклических ароматических колец конденсированы с гетероциклоалкильным ароматическим кольцом, получаемая в результате кольцевая система является гетероарильной, неарильной, по определению. Термин "арилокси" относится к О-арильной группе. В термине "арилалкил" или "аралкил", арил и алкил - по определению, и точка присоединения - на алкильной группе. Этот термин охватывает бензил, фенэтил, фенилвинил, фенилаллил и т.п., но не ограничивается ими. Термин "гало" включает фторогруппу, хлорогруппу, бромогруппу и йодогруппу, а термин "галоген" включает фтор, хлор, бром и йод. Термин "галоалкил" указывает на алкил по приведенному выше определению с указанным количеством атомов углерода, замещенных одним или более атомом галогена, вообще, до максимально допустимого количества атомов галогена. Примеры галоалкила включают трифторметил, дифторметил, 2 фторэтил и пента-фторэтил, но не ограничиваются ими. В данном случае "модуляция" относится к изменению активности миозина или саркомер, которое является прямой или косвенной реакцией на наличие, по крайней мере, одного описанного здесь химического структурного элемента, относительно активности миозина или саркомера при отсутствии соединения. Изменением может быть увеличение активности или уменьшение активности вследствие прямого взаимодействия соединения с миозином или саркомером, или вследствие взаимодействия соединения с каким-то одним фактором или большим числом факторов, которые, в свою очередь, воздействуют на активность миозина или саркомера. Термин "замещенный" в данном контексте означает, что один атом водорода или большее их количество на обозначенном атоме или группе замещенны атомами, выбираемыми из указанной группы, при условии, что не превышена нормальная валентность обозначенного атома. Если заместителем является оксо (т.е. =O), тогда на этом атоме замещаются 2 атома водорода. Сочетания заместителей и/или переменных допустимы только, если такие сочетания приводят к устойчивым соединениям или полезным синтетическим промежуточным звеньям. Под устойчивым соединением или устойчивой структурой подразумевается соединение, которое является достаточно стойким, чтобы пережить выделение из реакционной смеси с последующим получением препарата, имеющего, по крайней мере, практическое применение. Если не оговорено иначе, названия заместителей включаются в название центральной структуры,например, следует понимать, что, если в качестве произвольного заместителя приводится (циклоалкил)алкил, то точка присоединения этого заместителя к основной структуре находится на участке алкила. Под терминами "замещенный" циклоалкил, арил, гетероциклоалкил и гетероарил также подразумеваются заместители оксо (=O) и оксид (-O-), например N-оксиды азотсодержащих арильных групп, например пиридин-1-оксид, или производные соединения S(O) и S(O)2 серосодержащих групп. Соединения по формуле А включают оптические изомеры соединений по формуле А, рацематы, и другие смеси на их основе, но не ограничиваются ими. Кроме того, соединения по формуле А включаютZ- и Е-формы (или формы цис- и транс-) соединений с углерод-углеродными двойными связями. В этих ситуациях отдельные зеркальные изомеры или диастереомеры, т.е оптически активные формы, могут быть получены асимметричным синтезом или разделением рацематов. Разделение рацематов может быть достигнуто, например, обычными способами, например кристаллизацией в присутствии растворителя,или хроматографией при использовании, например колонку хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). При том что соединения по формуле А существуют в различных таутомерных формах, химические структурные элементы настоящего изобретения включают все таутомерные формы данного соединения. Соединения по формуле А также включают кристаллические и аморфные формы соединений,включая, например, полиморфы, псевдополиморфы, сольваты, гидраты, несольватированные полиморфы(включая ангидриты), конформационные полиморфы и аморфные формы соединений, а также смеси на их основе. "Кристаллическая форма", "полиморф" и "новая форма" могут здесь использоваться попере-6 016138 менно и включают все кристаллические и аморфные формы соединений, включая, например, полиморфы, псевдополиморфы, сольваты, гидраты, несольватированные полиморфы (включая ангидриты), конформационные полиморфы и аморфные формы, а также смеси на их основе, если не упоминается специфическая кристаллическая или аморфная форма. Химические структурные элементы по настоящему изобретению включают соединения по формуле А и все их фармацевтически приемлемые формы, но не ограничиваются ими. Упомянутые здесь фармацевтически приемлемые формы соединений включают фармацевтически приемлемые соли, хелаты, нековалентные комплексы, пролекарства и смеси на их основе. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения описываемые здесь соединения находятся в форме фармацевтически приемлемых солей. Следовательно, термины "химический структурный элемент" и "химические структурные элементы" также охватывают фармацевтически приемлемые соли, хелаты, нековалентные комплексы, пролекарства и смеси на их основе."Фармацевтически приемлемые соли" включают соли с неорганическими кислотами, например гидрохлорат, фосфат, дифосфат, гидробромат, сульфат, сульфинат, нитрат и подобные соли; а также соли с органической кислотой, например соль яблочной кислоты, соль малеиновой кислоты, соль фумаровой кислоты, соль винной кислоты, соль янтарной кислоты, соль лимонной кислоты, соль ацетатной кислоты, соль молочной кислоты, соль метансульфокислоты, р-толуолсульфонат, 2-гидроксиэтилсульфонат,соль бензойной кислоты, соль салициловой кислоты, соль стеариновой кислоты и алканоат, например ацетат, НООС-(СН 2)n-СООН, где n принимает значения от 0 до 4, и подобные соли, но не ограничиваются ими. Точно так же фармацевтически приемлемые катионы включают натрий, калий, кальций, алюминий, литий и аммоний, но не ограничиваются ими. Кроме того, если соединение по формуле А получено как соль, полученная добавлением кислоты,свободное основание может быть получено путем подщелачивания раствора кислой соли. Наоборот, если продуктом является свободное основание, соль, полученная путем добавки, особенно фармацевтически приемлемая соль, может быть получена путем растворения свободного основания в подходящем органическом растворителе и обработкой раствора кислотой, в соответствии с обычными процедурами для приготовления соли путем добавления кислоты из основных смесей. Специалистам известны различные технологии синтеза, которые могут использоваться для приготовления нетоксичных фармацевтически приемлемых солей, полученных путем добавки. Как отмечалось выше, пролекарства также попадают в зону химических структурных элементов,например, производные соединения сложного эфира или амида соединений по формуле А. Термин "пролекарства" включает любые соединения, которые становятся соединениями по формуле А, когда назначаются пациенту, например, после метаболической обработки пролекарства. Примеры пролекарств включают ацетат, формиат и бензоат и подобные производные соединения функциональных групп (например, алкоголь или группы амина) в соединениях по формуле А, но не ограничиваются ими. Термин "сольват" относится к химическому структурному элементу, который образуется при взаимодействии растворителя и соединения. Подходящими сольватами являются фармацевтически приемлемые сольваты, например, гидраты, включая, например, полугидраты, моногидраты, дигидраты, тригидраты и т.д. Термин "хелат" относится к химическому структурному элементу, который образуется путем формирования координационной связи с ионом металла в двух (или больше) точках. Термин "нековалентный комплекс" относится к химическому структурному элементу, который образуется при взаимодействии соединения и другой молекулы, при этом между соединением и молекулой не образуется ковалентная связь, например, комплексообразование может происходить через взаимодействия Ван-дер-Ваальса, образование водородной связи, и электростатические взаимодействия (также называется образованием ионной связи). Термин "активный препарат" используется для обозначения химического структурного элемента,который обладает биологической активностью. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения "активным препаратом" является соединение, которое применяется в фармацевтике. Термин "терапевтически эффективное количество" химического структурного элемента по настоящему изобретению означает количество, эффективное для лечения болезни при назначении пациенту(человеку или не человеку), например, терапевтически эффективным количеством может быть количество, достаточное для лечения болезни или расстройства, чувствительного к активации миозина. Терапевтически эффективное количество может быть установлено экспериментально, например, путем анализа концентрации в крови химического структурного элемента, или теоретически, путем расчета биологической активности. Под термином "значимый" понимается любое обнаруживаемое изменение, которое является статистически значимым при стандартном параметрическом испытании статистической значимости, например, Т-испытание Стьюдента, где р 0,05. Термин "пациент" относится к животному, например млекопитающему, например человеку, который был или будет объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Способы настоящего изобретения могут быть полезны как при лечении людей, так и в ветеринарии в некоторых примерах осуществления-7 016138 настоящего изобретения, пациент это млекопитающее. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения пациентом является человек."Лечение" означает любое лечение болезни пациента, включая:a) профилактику заболевания, т.е. предотвращение проявления клинических симптомов болезни;c) замедление или блокировку развития клинических симптомов и/илиd) ослабление болезни, т.е. вызывание регрессии клинических симптомов. Описываемые здесь химические структурные элементы можно синтезировать при использовании известных способов, например, как это показано ниже со ссылкой на схемы реакции. Если не оговорено обратное, описываемые здесь реакции происходят при атмосферном давлении обычно в пределах диапазона температур от -10 до 110 С. Кроме того, если только не приводится в примерах или не определяется иначе, время и условия реакции даются приближенно, например, приблизительно при атмосферном давлении, приблизительно в пределах диапазона температур от -10 до 110 С,приблизительно в течение периода от 1 до 24 ч; реакции оставляют на ночь в среднем на период около 16 ч. Каждый из терминов "растворитель", "органический растворитель" или "инертный растворитель" относится к растворителю, инертному в условиях описываемой в связи с ним реакции [включая, например, бензол, толуол, ацетонитрил, тетрагидрофуран ("ТГФ"), диметилформамид ("ДМФ"), хлороформ,хлористый метилен (или дихлорметан), диэтиловый эфир, метанол, пиридин и т.п.]. Если не оговорено обратное, растворители, используемые в реакциях по настоящему изобретению, являются инертными органическими растворителями. Выделение и очистка химических структурных элементов и описываемых здесь промежуточных химических соединений при необходимости могут производиться по любой подходящей технологии разделения или очистки, например, фильтрацией, экстракцией, кристаллизацией, хроматографией на колонках, тонкослойной хроматографией или толстослойной хроматографией, или сочетанием этих технологий. Иллюстрации соответствующих технологий разделения и изоляции даются со ссылкой на приведенные ниже примеры. Однако могут использоваться и другие эквивалентные технологии разделения и изоляции. При необходимости (R)- и (S)-изомеры могут быть растворены известными способами, например,путем образования диастереоизомерных солей или комплексов, которые могут быть разделены, например, кристаллизацией; путем образования диастереоизомерных производных соединений, которые могут быть разделены, например, кристаллизацией, газожидкостной или жидкостной хроматографией; путем выборочной реакции одного зеркального изомера с энантиомер-специфическим реактивом, например,путем энзиматического окисления или восстановления, сопровождаемых разделением модифицированных и немодифицированных зеркальных изомеров; или газожидкостной или жидкостной хроматографией в хиральной среде, например, на хиральном твердом носителе, например, кремнеземе со связанным хиральным лигандом или в присутствии хирального растворителя. В другом случае, специфический зеркальный изомер может синтезироваться асимметричным синтезом при использовании оптически активные реагенты, субстраты, катализаторы или растворители, или путем преобразования одного зеркального изомера в другой с помощью асимметричного превращения. Многие из произвольно замещенных стартовых соединений 101, 103, 201, 301 и другие реагенты коммерчески доступны, например, в компании Олдрич Кемикал (Aldrich Chemical Company) (Милуоки,WI - Milwaukee) или могут быть легко приготовлены специалистами при использовании обычно применяемых способов синтеза. Схема реакции 1 где R1 - замещенный пиперазинил, R2 - 6-метил-пиридин-3-ил. Синтез соединений по формуле I. В соответствии со схемой реакции 1 в емкость с магнитной мешалкой, орошением и баком для горячего конденсата под азотом загружают фосген или экв. фосгена (обычно трифосген) и неполярный,апротонный растворитель, например, дихлорметан или тетрагидрофуран. Раствор соединения по формуле 101 в неполярном, апротонном растворителе, например дихлорметане или тетрагидрофуране, добавляют по каплям приблизительно в течение 10-60 мин и раствор перемешивают от 1 до 15 ч. Соединение по формуле 103 добавляется по частям и раствор размешивается приблизительно в течение 10-60 мин. Основание, например, DIEA, добавляется по каплям в течение приблизительно одного часа, и раствор перемешивают от 1 до 15 ч. Продукт - соединение по формуле 105 выделяют и очищают. Изоцианат по формуле 201 может быть независимо получен и выделен из любого соответствующего амина (т.е. R2-NH2) при использовании фосгена, или эквивалента фосгена, или из соответствующей карбоновой кислоты (т.е. R2-COOH) при использовании перегруппировки Курциуса или Гофмана. Смеси соединений по формулам 101 и 201 в апротонном растворителе, например дихлорметане или тетрагидрофуране, при температуре от -40 до 110 С перемешивают от 1 до 15 ч. Продукт соединения по формулеI выделяют и очищают. Описываемые здесь химические структурные элементы отобраны для кардиального саркомера и модулируют его, применяются для связывания и/или обеспечения активности кардиального миозина, что увеличивает степень гидролиза АТФ. Согласно контексту термин "модулировать" означает либо увеличение, либо уменьшение активности миозина, тогда как "обеспечивать" означает увеличение активности. В испытаниях репрезентативных соединений по настоящему изобретению было обнаружено, что их назначение может также увеличить силу сокращения волокон сердечной мышцы. Химические структурные элементы, фармацевтические соединения и способы их использования по настоящему изобретению применяются для лечения сердечных болезней, включают, но не ограничиваются: острую конгестивную сердечную недостаточность (или декомпенсацию сердечной недостаточности) и хроническую конгестивную сердечную недостаточность; в частности болезни, связанные с систолической сердечной дисфункцией. Помимо этого при данной терапии обеспечивается стабилизация сердечной функции у больных, ожидающих трансплантации сердца, и помощь остановленному или замедленному сердцу в возобновлении нормальной функции после установки насоса для шунтирования. Для выработки силы используется гидролиз АТФ миозином в саркомере. Поэтому увеличение гидролиза АТФ соответствовало бы увеличению силы или степени сокращения мышцы. В присутствии актина активность аденозинтрифосфатазы, обусловленная миозином, возрастает более чем в 100 раз. Таким образом, гидролиз АТФ не только является мерилом ферментативной активности миозина, но также и его взаимодействия с актиновым филаментом. Соединение, которое модулирует кардиальный саркомер,может быть идентифицировано увеличением или уменьшением степени гидролиза АТФ миозином. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения показано увеличение в 1,4 раза при концентрации меньше 10 мкМ (например, меньше 1 мкМ). В анализах на такую активность может использоваться миозин человека, хотя обычно используется миозин других организмов. Используются также системы, которые моделируют регулирующую роль кальция при связывании миозина с декоративным тонким филаментом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения подготовка биохимически функционального саркомера может использоваться для определения ин-витро активности аденозинтрифосфатазы, например как это описано в заявке США 09/539164, поданной 29 марта 2000 г. Функциональное биохимическое поведение саркомера, включая чувствительность гидролиза аденозинтрифосфатазы к кальцию, может быть восстановлено путем комбинирования его очищенных индивидуальных составляющих (в частности, включая его регуляторные компоненты и миозин). Другой функциональной подготовкой является ин-витро анализ подвижности. Он может выполняться путем введения тестового соединения в миозинсвязанный микроскопический препарат и путем наблюдения за скоростью скольжения актиновых филаментов по поверхности стекла, покрытой миозином (Крон С. Дж. (Kron S.J.) (1991)Methods Enzymol. 196:399-416). Степень гидролиза АТФ ин-витро коррелирует с повышением активности миозина, которая может быть определена путем контроля за производством либо АДФ, либо фосфата, например, как это описано в заявке США 09/314464, поданной 18 мая 1999 г. Производство АДФ может также контролироваться при связывании производства АДФ с окислением никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный(путем применения ферментов пируваткиназы и лактатдегидразы) и контролируя уровень никотинамидаденин-динуклеотид восстановленный либо с помощью спектра поглощения, либо флюоресценцией(Грингард П. (Greengard, P.), Нэйче (Nature) 178 (часть 4534): 632-634 (1956); Mol. Pharmacol, январь 1970 г.; 6(1):31-40). Для контроля за производством фосфата может использоваться пуриннуклеозид фосфорилаза, что связывает производство фосфата с распадом аналога пурина, что приводит к изменениям либо спектра поглощения (Proc Natl Acad Sci USA 1992 Jun 1; 89(11):4884-7), либо флюоресценции(Biochem J., 1990 Mar 1; 266(2):611-4). Для определения абсолютной степени активности белка могут применяться и единичные измерения, но обычно используются многократные измерения на одном образце в различное время; такие измерения имеют более высокую специфичность особенно в присутствии тестовых соединений, спектр поглощения или флюоресценции которых сходен со спектром поглощения или флюоресценции ферментов. Тестовые соединения могут испытываться параллельно с использованием многолуночных планшет-9 016138 либо путем размещения отдельных соединений в лунках, либо проверяя их в смесях. Затем в лунки могут вводиться дополнительно компоненты анализа, включая целевой белковый комплекс, связанные с ним ферменты и субстраты, и АТФ, и после этого может измеряться степень поглощения или флюоресценции в каждой лунке планшеты с помощью планшет-ридера. В данном способе используются 384-луночные планшеты и реакционный объем 25 мкл. Для измерения степени гидролиза АТФ в каждой лунке используется система сопряженных ферментов пуриваткиназа/лактатдегидраза (Хуанг Т.Г. и Hackhey D.D. (Huang TG and Hackhey D.D.) (1994) J. Biol. Chem. 269 (23):16493-16501). Специалистам понятно, что компоненты анализа добавляются в буферные растворы и реагенты. Так как отмеченные здесь способы позволяют выполнять кинетические измерения, инкубационные периоды оптимизированы, что обеспечивает адекватные сигналы обнаружения по фону. Анализ сделан в реальном времени, что позволяет видеть кинетику гидролиза АТФ, и увеличивает отношение сигнал-шум анализа. Используя сердечные волокна с проникновением детергента (известны также как покрытые кожей сердечные волокна) или миофибриллы (субклеточные мышечные ферменты), можно измерить модуляцию аденозинтрифосфатазы сердечного мышечного волокна и/или силу сокращения, например, как описано у Хайкала X. (Haikala H.) и др. 1995) J. Cardiovasc Pharmacol. 25 (5):794-801). Покрытые кожей сердечные волокна сохраняют свойственную им организацию саркомера, но не сохраняют все аспекты клеточной циркуляции кальция; такая модель характеризуется двумя преимуществами: во-первых, клеточная мембрана не является барьером, препятствующим проникновению соединения, и во-вторых, концентрацию кальция можно регулировать. Поэтому любое увеличение аденозинтрифосфатазы или силы сокращения является непосредственной мерой влияния тестового соединения на белки саркомера. Измерения на аденозинтрифосфатазе выполняются описанным выше способом. Натяжение мышцы измеряется при креплении одного конца мышечного волокна к стенду, а другого конца к датчику измерения силы. После растяжения волокна для устранения провисания датчик силы регистрирует увеличение натяжения в начале сокращения волокна. Это измерение называют изометрическим натяжением, так как волокно не укорачивается. Активация мышечного волокна с проникновением выполняется путем помещения его в буферный раствор кальция с последующим введением дополнительного тестового соединения или контроля. После таких описываемых здесь испытаний химические структурные элементы вызвали увеличение силы при концентрациях кальция, связанных с физиологической сжимающей активностью, и очень небольшой прирост силы в расслабляющем буферном растворе при низких концентрациях кальция или в отсутствии кальция (результат, полученный с использованием этиленгликольтетрауксусной кислоты). Избирательную проницаемость для кардиального саркомера и кардиального миозина можно определить путем замещения компонентов некардиального саркомера и миозина в одном или больше из вышеописанных анализов, и сравнения полученных результатов с результатами, полученными при использовании кардиальных эквивалентов. Способность химического структурного элемента (вещества) увеличивать наблюдаемый уровень(содержания) аденозинтрифосфатазы при ин-витро восстановленном анализе саркомера или миофибрилле может следовать из увеличенной скорости обновления S1-миозина или, в другом случае, увеличенной чувствительности декоративного актинового филамента к активации Са. Чтобы различать эти два возможных режима действия, сначала измеряется влияние химического структурного элемента на активность S1-аденозинтрифосфатазы с недекоративными актиновыми филаментами. Если наблюдается увеличение активности, влияние химического структурного элемента на Са-чувствительный регулирующий аппарат может быть опровергнуто. Второй более чувствительный анализ может быть выполнен для идентификации химических структурных элементов, активирующее влияние которых на миозин S1 увеличивается в присутствии декоративного актина (по сравнению с чистыми актиновыми филаментами). В этом втором анализе сравниваются активности кардиального S1 и скелетного S1 по актиновым филаментам кардиальной и скелетной регуляции (во всех 4 размещениях). Начальная оценка ин-виво активности может быть определена по клеточным моделям сократительной способности миоцита, например, как это описано у Поппинга С. (Popping S.) др. 1996). J. Physiol 271: Н 357-Н 364) и Вольска Б.М. (Wolska B.M.) и др. 1996). J. Physiol 39:H24-H32). Одно преимущество модели миоцита состоит в том, что могут быть выделены системы компонентов, которые приводят к изменениям сократительной способности, и определяются главные участки воздействия. Затем на моделях всего органа, например, модель сердечной функции изолированного сердца (Лангендорф - Langendorff) с ин-виво применением эхокардиографии или инвазивных гемодинамических измерений, и на анимальных моделях сердечной недостаточности, например, на модели окклюзии левой сердечной артерии крысы могут оцениваться химические структурные элементы с клеточной активностью (например, отбор химических структурных элементов следующего профиля: 120%-ное увеличение фракционного укорочения относительно базового при 2 мкМ, или изменение продолжительности диастолической фазы (5%-ное изменение. В конечном счете, активность для лечения сердечной недостаточности демонстрируется слепыми плацебоконтролируемыми клиническими испытаниями на людях. Описываемые здесь химические структурные элементы применяются в терапевтически эффективной дозировке, например, дозировке для лечения болезненных состояний, описанных выше. Уровни до- 10016138 зировки описываемых здесь химических структурных элементов должны быть оптимизированы для человека и, в общем, суточная доза составляет приблизительно от 0,05 до 100 мг/кг массы тела; в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения приблизительно от 0,10 до 10,0 мг/кг массы тела,и в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения приблизительно от 0,15 до 1,0 мг/кг массы тела. Таким образом, для назначения человеку массой 70 кг в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения диапазон дозировки составил бы приблизительно от 3,5 до 7000 мг в сутки; в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения приблизительно от 7,0 до 700,0 мг в сутки,и в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения приблизительно от 10,0 к 100,0 мг в сутки. Назначаемое количество химического структурного элемента зависит, конечно, от субъекта и состояния болезни, подлежащей лечению, степени поражения, вида и графика приема, и мнения лечащего врача, например, вероятный диапазон дозы для перорального приема составляет приблизительно 70-700 мг в сутки, а для внутривенного назначения вероятный диапазон дозы составляет приблизительно 70-700 мг в сутки в зависимости от фармакокинетики соединения. Назначение описываемых здесь химических структурных элементов может быть любым из принятых способов, например перорально, подъязычно, подкожно, внутривенно, через нос, местно, чрезкожно,интраперитонеально, внутримышечно, внутрилегочно, влагалищно, ректально, или внутриглазно, и не ограничивается ими. Пероральное и парентеральное введение общепринято в лечении проявлений, что является целью настоящего изобретения. Фармацевтически приемлемые соединения включают твердую, полутвердую, жидкую и аэрозольную формы дозировки, например, таблетки, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, свечи, аэрозоли и т.п. Химические структурные элементы могут также назначаться длительно или под контролем, включая инъекции вещества замедленного всасывания, осмотические насосы, пилюли, трансдермальные (включая электроперенос) накладки и т.п. для длительного и/или назначаемого по времени приема, периодического назначения в заданной дозе. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения соединения назначаются в единичных дозах, что подходит для разового приема точной дозы. Описываемые здесь химические структурные элементы могут применяться либо самостоятельно,либо в комбинации с обычным фармацевтическим носителем, инертным наполнителем и т.п. (например,маннитом, лактозой, крахмалом, стеаратом магния, сахаристым натрием, тальком, целлюлозой, кросскармелозой натрия, глюкозой, желатином, сахарозой, углекислым магнием, и т.п.). При необходимости фармацевтическое соединение может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ таких, как смачивающие вещества, эмульгаторы, растворители, рН буферизаторы и т.п. (например, уксуснокислый натрий, лимоннокислый натрия, производные соединения циклодекстрина, сорбитан монолаурат, ацетат триэтаноламина, олеат триэтаноламина и т.п.). Вообще, в зависимости от назначенного способа введения фармацевтическое соединение будет содержать приблизительно от 0,005 до 95% химического структурного элемента по массе; в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения приблизительно от 0,5 до 50%. Фактические способы подготовки таких форм дозировки известны, или будут очевидны специалистам, например, см. Remington's Phannaceutical . Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Кроме того, описываемые здесь химические структурные элементы могут быть назначены совместно, и фармацевтические соединения могут включать другие лекарственные средства, фармацевтические препараты, адъюванты и т.п. Подходящие дополнительные активные препараты включают, например: терапии, которые замедляют прогрессию сердечной недостаточности нейрогормональной стимуляцией сердца методом угнетения экспрессии и пытаются предотвращать кардиальную коррекцию (например,АСЕ ингибиторы или -блокаторы); терапии, которые улучшают кардиальную функцию, стимулируя сократительную способность сердца (например, положительные инотропные препараты такие, как адренергический агонист добутамин или ингибитор фосфодиэстеразы милринон); и терапии, которые снижают кардиальное конечно-диастолическое давление (например, мочегонные средства такие, как фуросемид). Другие подходящие дополнительные активные препараты включают сосудорасширяющие средства, дигитоксин, противокоагулирующие средства, антагонисты минералокортикоидов, блокаторы рецептора ангиотензина, нитроглицерин, другие инотропы, и любую другую терапию, используемую для лечения сердечной недостаточности. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения соединения принимают форму пилюли или таблетки, и таким образом соединение будет содержать, наряду с активным ингредиентом,растворитель, например, лактозу, сахарозу, вторичный кислый фосфорнокислый кальций, и т.п.; смазку,например, стеарат магния и т.п.; и связующий компонент, например, крахмалит, аравийскую камедь, поливинилпирролидин, желатин, целлюлозу, производные целлюлозы и т.п. В случае другой твердой форме дозировки, порошок, marume, раствор или суспензия (например, в пропиленкарбонате, растительном масле или триглицериде) заключены в желатиновую капсулу. Жидкие фармацевтически назначаемые соединения могут, например, быть приготовлены путем растворения, диспергирования и т.д. по крайней мере, одного химического структурного элемента и произвольных фармацевтических адъювантов в носителе (например, воде, соляном растворе, водный декст- 11016138 розе, глицерине, гликолях, этиловом спирте и т.п.) с целью образования раствора или суспензии. Инъекции могут быть приготовлены в обычных формах, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий,эмульсий, либо в твердых формах, которые могут быть растворены или суспендированы в жидкости перед инъекцией. Процентное содержание химических структурных элементов в таких перентеральных соединениях во многом зависит от их специфической природы, а также от активности химических структурных элементов и потребностей субъекта. Однако применяется процентное содержание активного ингредиента в диапазоне от 0,01 до 10% в растворе, и это процентное содержание будет более высоким,если соединение является твердым веществом, которое будет впоследствии разбавлено до приведенного выше процентного содержания. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения соединение будет включать 0,2-2% активного препарата в растворе. Фармацевтические соединения описываемых здесь химических структурных элементов могут также назначаться в дыхательный тракт в виде аэрозоли или раствора для небулайзера, или в виде микротонкого порошка для вдыхания, одного или в комбинации с инертным носителем, например лактозой. В таком случае частицы фармацевтического соединения имеют диаметры меньше чем 50 мкм; в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения меньше 10 мкм. Вообще, для применения описываемых здесь химических структурных элементов в методе скрининга на связывание миозина, миозин присоединяется к носителю и соединение по настоящему изобретению добавляется к пробе. В другом случае описываемые здесь химические структурные элементы могут присоединяться к носителю и добавленному миозину. Классы соединений, среди которых новые связующие вещества, можно найти среди специфических антител, искусственных связующих веществ,идентифицированных на экранах библиотек химических веществ, аналогов пептида и т.д. Особый интерес представляет анализ скрининга кандидатов в препараты, которые имеют низкую токсичность для клеток человека. Для этой цели может использоваться широкая разновидность анализов, включая реакцию связывания белок-белок с мечением ин-витро, анализы сдвига электрофорезной подвижности, иммунологические анализы для связывания белка, функциональные анализы (анализы фосфорилирования и т.д.) и т.п., см., например, патент США 6495337, включенный в данную работу в качестве ссылки. Приведенные ниже примеры служат для более полного описания способа применения вышеописанного изобретения. Следует понимать, что эти примеры никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения, а скорее представлены для иллюстративных целей. Все включенные ссылки приводятся полностью. Пример 1. Этап 1. В емкость с круглым дном наливали 1 экв. 3-хлор-2-фтороанилина (3 А), 1-метил-2-пирролидинон(приблизительно 1,5 М 3 А в NMP), 2,2 экв. цианистого натрия и 1,35 экв. бромида никеля(II) при комнатной температуре в атмосфере N2. Концентрация снижалась вдвое введением дополнительного NMP в атмосфере N2 и раствор медленно нагревали до 2005 С и перемешивали в течение 4 дней в атмосфереN2. Реакционной смеси давали остыть до комнатной температуры. Реакционная смесь разбавлялась 30 объемами метил-трет-бутилового эфира и фильтровалась через целит. Затем слой целита промывался 10 объемами метил-трет-бутилового эфира. Органические соединения промывались 40 объемами соляного раствора, 240 объемами воды и 40 объемами соляного раствора. Связанные органические соединения сушили над сульфатом натрия и подвергали концентрации с получением твердого вещества коричневого цвета, которое сушилось в вакууме (30 ртутного столба) при температуре 40 С в течение 8 ч с получением соединения по формуле 3 В (выход 71%). Этап 2. Раствор 3 В в дихлорметане (приблизительно 1,5 М 3 В в DCM) при комнатной температуре в атмосфере азота охлаждался до 0 С, и 2,0 экв. 1 М диизобутилалюмогидрида лития (DH3AL-H) в DCM добавлялось по каплям в течение 3,5 ч с поддержанием температуры внутримолекулярной реакции 0 С. После введения DH3AL-H реакционная смесь по каплям с энергичным перемешиванием добавлялась к 40 объемам охлажденного раствора (0 С) 15%-ной сегнетовой соли, и 10 объемам DCM с поддержанием температуры внутри молекулярной реакции ниже 10 С. Емкость ополаскивалась 10 объемами DCM, и раствору давали нагреться до комнатной температуры при перемешивании в течение 4 ч. Слои разделялись, и водные слои реэкстрагировались 20 объемами DCM. Связанные органические слои промывались- 12016138 в 20 объемах воды. Органический слой сушился на сульфате натрия и подвергался концентрации с получением коричневой пены, которая сушилась в вакууме (30 ртутного столба) при комнатной температуре с получением 3 С (выход 92%). Этап 3. Этапы 3 А/В. Раствор 1 экв. 3 С - тетрагидрофурана (приблизительно 1,4 М 3 С в ТГФ) и 1,05 экв. метилпиперазин-1-карбоксилата перемешивали при температуре окружающей среды в течение 3 часов. К реакционной смеси добавлялся 1,5 экв. триацетоксиборогидрида натрия частями в течение 40 мин. с поддержанием температуры внутримолекулярной реакции ниже 45 С. Реакционная смесь перемешивалась в течение ночи при комнатной температуре. К реакционной смеси по каплям добавлялось 5 объемов воды в течение 1 часа с поддержанием температуры внутримолекулярной реакции ниже 30 С. Затем добавлялся этилацетат (ЕЮАс, 5 объемов) и слои разделялись. Водные слои реэкстрагировались 5 объемами EtOAc. Связанные органические слои промывались насыщенным раствором кислого углекислого натрия и твердый кислый углекислый натрий добавлялся, чтобы довести рН до 8 (с помощью индикаторной бумагиpHydrion paper). Слои разделялись, и органический слой промывался 5 объемами соляного раствора. Органический слой сушился на сульфате натрия, и на этапе сушки добавлялся активированный уголь. Органические соединения фильтровались через целит и слой целита промывался 4 раза EtOAc. Органические соединения подвергались концентрации и сушились в течение ночи на роторном испарителе(rotavap) (30 ртутного столба, при комнатной температуре) с получением маслообразного продукта янтарно-коричневого цвета. Этап 3 С. Все расчеты основаны на количестве 3 С (R=0). К 3 объемам метанола (на основе 3 С, R=0) в атмосфере N2 над ванной из льда/соляного раствора/ацетона добавлялось 3 экв. хлорида ацетила по каплям в течение 3 ч с поддержанием температуры внутримолекулярной реакции ниже 0 С. Затем раствор перемешивался в течение еще 1 ч при температуре ниже 0 С. Раствор 1,0 экв. неочищенного соединения 3D (с этапов 3 А/3 В, описанных выше) в МеОН(приблизительно 3,6 М на основе 3 С, R=0) добавлялся по каплям в течение 30 мин с поддержанием температуры внутримолекулярной реакции ниже 15 С. Реакции позволяли разогреться до комнатной температуры в течение ночи. Твердые вещества фильтровались на следующий день и промывались 20,5 объемами МеОН, 5 объемами 1:1 (метил-трет-бутиловый эфир):МеОН и 5 объемами метил-трет-бутилового эфира. Затем твердые вещества вносились в 5 объемов EtOAc и по необходимости добавлялся насыщенный раствор кислого углекислого натрия и твердый кислый углекислый натрий, чтобы довести рН водного слоя до 8 (с помощью индикаторной бумаги pHydrion paper). Слои разделялись и водный слой экстрагировался 5 объемами EtOAc. Связанные органические слои промывались 5 объемами соляного раствора, высушивались на сульфате натрия, и подвергались концентрации с получением светлого оранжевого твердого вещества, которое сушилось в вакууме (30 ртутного столба) при температуре 40 С с получением соединения 3D (50% выход). Этап 4. К раствору 3D в ацетоне (приблизительно 2,7 М 3D в ацетоне) по каплям добавляли 1,0 экв. 5 изоцианато-2-метилпиридина в течение 9 мин. При добавлении образовывался объемистый осадок, и реакция перемешивалась в течение 1 ч. Реакционная смесь нагревалась с обратным холодильником в течение 2 ч и охлаждалась до комнатной температуры в течение 2,5 ч. Затем реакционная смесь нагревалась с обратным холодильником в течение 1 ч и охлаждалась до комнатной температуры в течение ночи. Реакционная смесь фильтровалась и промывалась 1 объемом ацетона, затем три раза 2 объемами этилацетата. Твердые вещества сушились в вакууме (30 ртутного столба) при температуре 60 С в течение ночи с получением белого порошка (выход 86%) метил 4-[(2-фторо-3[(6-метил(3-пиридиламино]карбониламинофенил)метил]пиперазинкарбоксилата. Материал обрабатывался повторно следующим образом.- 13016138 Метил 4-[(2-фторо-3[(6-метил(3-пиридиламино]карбониламино-фенил)метил]пиперазинкарбоксилат, описанный выше, растворяли в ацетоне (приблизительно 0,2 М) в атмосфере N2. Затем реакционная смесь нагревалась с обратным холодильником в течение 2,5 ч и охлаждалась до комнатной температуры в течение ночи. Реакционная смесь фильтровалась и промывалась 1 объемом ацетона, затем три раза 2 объемами этилацетата. Твердые вещества сушились в вакууме (30 ртутного столба) при температуре 60 С в течение ночи с получением метил 4-(2-фтор-3-(3-(6-метилпиридин-3-ил)уреидо)бензил)пиперазин-1-карбоксилата в виде белого порошка (выход 79%). Материал обрабатывался повторно следующим образом. Метил 4-[(2-фторо-3[(6-метил(3-пиридиламино]карбониламинофенил)метил]пиперазинкарбоксилат, описанный выше, растворяли в ацетоне (приблизительно 0,2 М) в атмосфере N2. Затем реакционная смесь нагревалась с обратным холодильником и охлаждалась до комнатной температуры в течение ночи. Реакционная смесь фильтровалась и промывалась 1 объемом ацетона, затем еще три раза 2 объемами этилацетата. Твердые вещества сушились в вакууме (30 ртутного столба) при температуре 60 С в течение ночи с получением метил 4-[(2-фторо-3[(6-метил(3-пиридиламино]карбониламинофенил)метил]пиперазинкарбоксилата в виде белого порошка (выход 73%).MS 402 (М+Н). Пример 2. Анализы на распознавание цели. Анализы специфичности: специфичность к кардиальному миозину оценена путем сравнения влияния химического структурного элемента на актин-стимулируемую аденозинтрифосфатазу панели изоформ миозина: сердечной мышцы, скелетной и гладкой мышц при единственной концентрации 50 мкМ или при разных концентрациях химического структурного элемента. Пример 3. Ин-витро модели зависимой от дозы модуляции аденозинтрифосфатазы кардиального миозина. Анализ восстановленного кардиального саркомера: чувствительность к дозе измерялась с помощью анализа аденозинтрифосфатазы, связанной с пируваткиназой, лактатдегидрогиназой в буферном кальциевом растворе, при содержании следующих реагентов (представленные концентрации являются концентрациями заключительного анализа): калиевые трубки (12 мМ), MgCl2 (2 мМ), АТФ (1 мМ), дитиотреитол (1 мМ), альбумин бычьей сыворотки (0,1 мг/мл), никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный (0,5 мМ), фосфоенолпируват (1,5 мМ), пуриваткиназа (4 Ед./мл), лактатдегидрогиназа (8 Ед./мл),и антивспениватель (90 част./млн). Уровень рН доводится до 6,80 при температуре 22 С путем введения гидроксида калия. Для получения концентрации свободного кальция 110-4 М к 110-8 М уровни кальция регулируются системой буферизации, содержащей 0,6 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты, и изменением концентрации кальция. Компоненты белка, специфичные к этому анализу, включают подфрагмент-1 бычьего кардиального миозина (обычно 0,5 мкМ), бычий кардиальный актин (14 мкМ), бычий кардиальный тропомиозин(обычно 3 мкМ) и бычий кардиальный тропонин (обычно 3-8 мкМ). Точные концентрации тропомиозина и тропонина определяются эмпирически, титрованием при достижении максимальной разницы активностей аденозинтрифосфатазы при измерении в присутствии 2 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты и при измерении в присутствии 0,1 мМ CaCl2. Точная концентрация миозина в анализе также определяется эмпирически, титрованием при достижении желательной активности гидролиза АТФ. Она изменяется в зависимости от приготовления белка, вследствие изменения доли активных молекул в каждом препарате. Чувствительность к дозе обычно измерялась при концентрации кальция, соответствующей 25% или 50% максимальной активности аденозинтрифосфатазы (рСа 25 или рСа 50), поэтому в предварительном эксперименте тестировалась реакция активности аденозинтрифосфатазы на концентрацию свободного кальция в диапазоне от 110-4 до 110-8 М. Затем анализируемая смесь доводилась до pCa50 (обычно 310-7 М). Анализы выполняются сначала подготовкой серии разбавлений тестового соединения, при этом в состав каждой из анализируемых смесей входят калиевые трубки, MgCl2, альбумин бычьей сыворотки, дитиотреитол, пуриваткиназа, лактатдегидрогиназа, подфрагмент 1 миозина, антивспениватель,этиленгликольтетрауксусная кислота, CaCl2 и вода. Анализ начинается с добавления равного объема раствора, в состав которого входят калиевые трубки, MgCl2, альбумин бычьей сыворотки, дитиотреитол,АТФ, никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный, фосфоенолпируват, актин, тропомиозин, тропонин, антивспениватель и вода. Гидролиз АТФ контролируется по поглощению при длине волны 340 нм. Получаемая кривая чувствительности к дозе описывается 4-параметрическим уравнением у=низ кривой+верх кривой-низ кривой)/(1+ЕС 50/Х)Hill. АС 1.4 определяется как концентрация, при которой активность аденозинтрифосфатазы в 1,4 раза выше низа кривой чувствительности к дозе. Анализ кардиальной миофибриллы: для оценки влияния химических структурных элементов на активность аденозинтрифосфатазы кардиального миозина полной длины в контексте нативного саркомера проводились анализы покрытых кожей миофибрилл. Кардиальные миофибриллы получали гомогенизацией сердечной ткани в присутствии неионного детергента. При такой обработке удаляются мембраны и- 14016138 большинство растворимых эндоплазматических белков, но остается нетронутым аппарат кардиального саркомера актомиозина. Препараты миофибриллы сохраняют способность гидролизовать АТФ при контроле Са. Активность аденозинтрифосфатазы таких препаратов миофибриллы в присутствии и отсутствии химических структурных элементов анализируется при концентрациях Са по всему диапазону чувствительности к кальцию, но при этом предпочтения отдаются следующим концентрациям кальция: 25,50 и 100% максимального уровня. Миофибриллы можно приготовить либо из свежей, либо из быстрозамороженной ткани, при ее быстрой разморозке. Ткань измельчается на мелкие куски и ресуспендируется в релаксирующий буфер, в состав которого входят следующие реагенты (представленные концентрации являются концентрациями заключительного анализа): трис-HCl (10 мМ), MgCl2 (2 мМ), KCl (75 мМ), этиленгликольтетрауксусная кислота (2 мМ), NaN3 (1 мМ), АТФ (1 мМ), фосфокреатин (4 мМ), BDM (50 мМ), дитиотреитол (1 мМ),бензамидин (1 мМ), фенилметилсульфонилфторид (0,1 мМ), лейпептин (1 ug/мл), пепстатин (1 ug/мл), и Тритон Х-100 (1%). Уровень рН доводится до 7,2 при температуре 4 С дополнительным введением HCl. После доведения концентрации ЭДТК до 10 мМ ткань измельчается вручную при температуре 4 С в холодной комнате и гомогенизируется с помощью большого роторно-статорного гомогенизатора (OmniMixer). После перемешивания в течение 10 с материал гранулируется центрифугированием (5 мин, 2000g макс. 4 С). Затем миофибриллы повторно ресуспендируются в стандартный буфер, в состав которого входят следующие реагенты (представленные концентрации являются концентрациями заключительного анализа): трис-HCl (10 мМ) рН 7,2 при температуре 4 С, MgCl2 (2 мМ), KCl (75 мМ), этиленгликольтетрауксусная кислота (2 мМ), NaN3 (1 мМ), Тритон Х-100 (1%), при этом используется гомогенизатор ткани стекло-стекло (Kontes) до получения однородной массы, обычно 4-5 перемещений. Гранулы миофибриллы промываются несколько раз краткой гомогенизацией при использовании статорно-роторного гомогенизатора в 10 объемах стандартного буфера после центрифугирования. Для удаления детергента миофибриллы промывали несколько больше раз стандартным буфером без Тритона X-100. Затем миофибриллы трижды подвергались гравитационной фильтрации при использовании нейлонного сита с ячейкой 600, 300, и, наконец, 100 мкм для получения однородной смеси и гранулировались. Наконец,миофибриллы ресуспендировали в буфер хранения, в состав которого входят следующие реагенты(представленные концентрации являются концентрациями заключительного анализа): калиевые трубки(12 мМ), MgCl2 (2 мМ) и дитиотреитол (1 мМ). Перед быстрым замораживанием в жидком азоте и хранением при температуре -80 С добавляли до 10% (об./мас.) твердой сахарозы при перемешивании. Чувствительность к дозе измерялась с помощью анализа аденозинтрифосфатазы, связанной с пируваткиназой, лактатдегидрогиназой в буферном кальциевом растворе, при содержании следующих реагентов (представленные концентрации - заключительные концентрации анализа): калиевые трубки(12 мМ), MgCl2 (2 мМ), АТФ (0,05 мМ), дитиотреитол (1 мМ), альбумин бычьей сыворотки (0,1 мг/мл),никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный (0,5 мМ), фосфоенолпируват (1,5 мМ), пуриваткиназа (4 Ед./мл), лактатдегидрогиназа (8 Ед./мл), и антивспениватель (90 част./млн). Уровень рН доводится до 6,80 при температуре 22 С дополнительным введением гидроксида калия. Для получения концентрации свободного кальция от 110-4 до 110-8 М уровни кальция регулируются системой буферизации,содержащей 0,6 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты, и изменением концентрации кальция. Концентрация миофибриллы в заключительном анализе обычно составляет от 0,2 до 1 мг/мл. Чувствительность к дозе обычно измерялась при концентрации кальция, соответствующей 25, 50 или 100% максимальной активности аденозинтрифосфатазы (рСа 25, рСа 50, рСа 100), поэтому в предварительном эксперименте тестировалась реакция активности аденозинтрифосфатазы на концентрацию свободного кальция в диапазоне от 110-4 до 110-8 М. Затем анализируемая смесь доводилась до pCa50(обычно 310-7 М). Анализы выполняются сначала подготовкой серии разбавлений тестового соединения, при этом в состав каждой из анализируемых смесей входят калиевые трубки, MgCl2, альбумин бычьей сыворотки, дитиотреитол, пуриваткиназа, лактатдегидрогиназа, кардиальные миофибриллы, антивспениватель, этиленгликольтетрауксусная кислота, CaCl2 и вода. Анализ начинается с добавления равного объема раствора, в состав которого входят калиевые трубки, MgCl2, альбумин бычьей сыворотки, дитиотреитол, АТФ, никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный, фосфоенолпируват, антивспениватель и вода. Гидролиз АТФ контролируется по поглощению при длине волны 340 нм. Получаемая кривая чувствительности к дозе описывается 4-параметрическим уравнением у=низ кривой+верх кривой-низ кривой)/(1+ЕС 50/Х)Hill. АС 1.4 определен как концентрация, при которой активность аденозинтрифосфатазы в 1,4 раза выше низа кривой чувствительности к дозе. Пример 4. Анализы миоцита. Препарат из миоцитов желудочка сердца взрослых крыс. Анестезия взрослых самцов крыс Sprague-Dawley проводилась с использованием газовой смеси изофлурана и кислорода. Сердца быстро иссекались, промывались и канюлировалась восходящая аорта. На сердцах начиналась непрерывная ретроградная перфузия при давлении перфузии 60 см вод.ст.- 15016138 Сначала для перфузии применялся свободный от Ca2+ раствор Krebs, в состав которого входит: 110 мМ(вся Sigma). Эта среда не рециркулируется и непрерывно выделяется газ О 2. Приблизительно после 3 мин перфузия продолжается с применением модифицированного буфера Krebs, в который добавлено 3,3% коллагеназы (169 мк/мг активности, Класс II, Wortbington Biochemical Corp. Фрихолд, шт. Нью Джерси) и 25 мкМ кальция заключительной концентрации, пока ткани сердца не побледнеют и не обмякнут. Сердце удаляется из канюлей, предсердия и сосуды разгружаются и желудочки рассекаются на малые части. Миоциты диспергируются при слабом перемешивании ткани желудочков в свежей коллагеназе,содержащей раствор Krebs до того, как она будет слегка продавлена через нейлоновое сито с ячейкой 200 мкм в трубке объемом 50 кубических сантиметров. Получаемые миоциты ресуспендировали в модифицированный раствор Kerbs, содержащий 25 мкМ кальция. При добавлении раствора кальция с интервалом 10 минут, пока концентрация кальция не достигала 100 мкМ, миоциты становились толерантными к кальцию (100 мМ в основном растворе). После 30 мин супернатант сливали и 30-50 мл буфера Tyrode(137 мМ NaCl, 3,7 мМ KCl, 0,5 мм MgCl, 11 мМ глюкозы, 4 мм Hepes, и 1,2 мм CaCl2, рН 7,4) добавляли в клетки. Клетки выдерживали в течение 60 мин при температуре 37 С до начала экспериментов и использовали в течение 5 ч процесса выделения. Препараты из клеток используются только, если клетки сначала прошли проверку по критериям контроля качества и соответствуют стандартному критерию(150% от основного уровня) и проверке на изопртеренол (ISO; 250% от основного уровня). Кроме того, в последующих экспериментах используются только те клетки, основной уровень сократительной способности которых находится в диапазоне от 3 до 8%. Эксперименты по сократительной способности миоцита желудочков взрослых особей. Специфичные количества буфера Tyrode, содержащего миоциты, помещались в камеры перфузии(серия 20 RC-27NE; Компания "Варнер инструментс") с обогревом. Миоциты прикреплялись к камерам,нагретым до температуры 37 С, и затем происходила перфузия клеток при использовании буфера Tyrode,нагретого до температуры 37 С. Миоциты стимулировались на частоте 1 Гц платиновыми электродами(20% выше порога). В экспериментах по сократительной способности использовались только клетки с четкой исчерченностью и находящиеся в покое. Для определения основной сократительной способности миоциты рассматривали через 40 х объектив и использовали камеру с переменной частотой кадров (60240 Гц), изображения переводили в цифровую форму и выводили на экран компьютера на скорости осуществления выборки 240 Гц [плату захвата изображения, программу захвата цели и программное обеспечение анализа сократительной способности клетки можно приобрести в компании IonOptix (Милтон)]. Спустя минимальный пятиминутный основной период сократительной способности осуществлялась перфузия на миоцитах в течение 5 мин с использованием тестовых соединений (0,01-15 мкМ). После этого для определения характеристик вымывания соединений для перфузии использовали свежий буферTyrode. Используя стратегию выделения краев, непрерывно регистрировались сократительная способность миоцитов и скорости сокращения и расслабления. Анализ сократительной способности. Три или больше индивидуальных миоцитов проверялись на химический структурный элемент при использовании двух различных миоцитных препаратов или больше. Для каждой клетки усреднялись и сравнивались двадцать или больше временных повышений сократительной способности при основном составе (определяли как 1 мин до инфузии химического структурного элемента) и после дополнительного введения химического структурного элемента. Это усредненное временное повышение анализировалось для определения изменений продолжительности диастолической фазы, и при использовании программы анализа Ionwizard (IonOptix) определялось фракционное укорочение (% продолжительности диастолической фазы), и максимальные скорости сокращения и расслабления (um/с). Объединяли анализ индивидуальных клеток. Увеличение фракционного укорочения относительно основного указывает на активацию сократительной способности миоцита. Анализ временного повышения кальция. Загрузка зонда Fura: проницаемую для клеток Fura-2 (молекулярные зонды) растворяли в равных количествах плуроника (молекулярные зонды) и FBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Исходный раствор Fura в количестве 1 мкМ выполняли в буфере Tyrode, содержащем 500 мм пробенецида(Sigma). С целью нагружения клеток этот раствор добавляли к миоцитам при комнатной температуре. Спустя 10 мин буфер удалялся, клетки промывались буфером Tyrode, содержащим пробенецид, и выдерживались при комнатной температуре в течение 10 мин. Промывание и выдерживание повторялись. В течение 40 мин нагружения одновременно выполнялись измерения сократительной способности и кальция. Изображение. Клетки заливались тестовым соединением. Определялись отношения совместного временного повышения сократительной способности и кальция при исходном состоянии и после введения соединения. Изображение клетки оцифровывалось и, как описано выше, определялась сократительная способность с использованием красного фильтра, чтобы избежать помех от флуоресцентных измерений кальция. Программу захвата цели, программное обеспечение анализа и аппаратные средства ЭВМ для анализа вре- 16016138 менного повышения кальция можно приобрести в компании IonOptix. Аппаратура для измерения флюоресценции включает ксеноновую дуговую лампу и источник света с системой возбуждения по двум осям и гипервыключателем для переключений в диапазоне длин волн от 340 до 380 на частоте 100 Гц с помощью гальванически-управляемого зеркала. Световод с жидкостным наполнением подает световой поток с системой возбуждения по двум осям на микроскоп, и определяется эмиссионная флюоресценция с использованием фотоэлектронного умножителя. Интерфейс флуоресцентной системы трассирует сигнал фотоэлектронного умножителя и с использованием программы захвата цели IonWizard регистрируются отношения. Анализ. Для каждой клетки усреднялось и сравнивалось десять или больше отношений временного повышения сжимаемости и кальция в основном состоянии и после введения соединения. Усредненное временное повышение сократительной способности анализировались с помощью программы анализа Ionwizard для определения изменения продолжительности диастолической фазы, и фракционного укорочения (относительное уменьшение (%) продолжительности диастолической фазы). Усредненное временное повышение кальция анализировалось с помощью программы анализа Ionwizard для определения изменений отношений продолжительностей диастолической и систолической фаз и 75% интервал к основному(Т 75). Длительность. Для определения длительности реакции миоциты стимулировались тестовым соединением в течение 25 мин после 2-минутного периода промывки. Реакция сократительной способности сравнивалась на 5 и 25 мин после введения соединения. Пороговый потенциал. Миоциты стимулируются полем, напряжение которого больше порогового на 20%. В этих экспериментах пороговое напряжение (минимальное напряжение, чтобы задать ритм клетки) определяется эмпирически, ритм клетки задается при этом пороговом значении, и затем вливается тестовое соединение. После того как активность становится стабильной напряжение уменьшается на 20 секунд и затем включается повторно. Чередование ионных каналов соответствует повышению или понижению порогового потенциала действия. Частота, Гц. Сократительная способность миоцитов определяется при 3 Гц следующим образом: 1 мин. основной момент времени, затем перфузия тестового соединения в течение 5 минут, затем промывка в течение 2 минут. После того как сократительная способность клетки возвращалась полностью в исходное состояние частота уменьшалась до 1 Гц. После начального периода акклиматизации клетка стимулируется тем же самым соединением. Как вид крыса проявляет отрицательную частоту силы при 1 Гц, при 3 Гц FS клетки должна быть ниже, но клетка должна все еще реагировать, увеличивая свое фракционное укорочение в присутствии соединения. Добавка изопротеренола. Для того чтобы продемонстрировать, что соединение действует через другой механизм, а не через адренергический стимулирующий изопротеренол, в клетки загружалась Fura-2 и производились совместные измерения отношений временного повышения сократительной способности и кальция. Затем миоциты последовательно стимулировались 5 мкм или меньшим количеством тестового соединения, буфера,2 нМ изопротеренола, буфера, и сочетанием тестового соединения и изопртеренола. Пример 5. Ин-витро модель зависимой от дозы модуляции аденозинтрифосфатазы кардиального миозина. Бычьи и крысиные кардиальные миозины выделяли из соответствующих тканей сердца. Миозины скелетной и гладкой мышцы, используемые в исследовании специфичности, выделяли из скелетной мышцы кролика и мускульного желудка цыпленка, соответственно. Все миозины, используемые в анализах, преобразуются в растворимую форму с одной головкой (S1) с помощью ограниченного протеолиза химотрипсином. Другие компоненты саркомера: комплекс тропонина, тропомиозин и актин выделяли из бычьих сердец (кардиальный саркомер) или грудной мышцы цыпленка (скелетный саркомер). Активность миозинов контролировалась путем измерения степени гидролиза АТФ. Миозинаденозинтрифосфатаза очень сильно активируется филаментами актина. Оборот АТФ определяется в связанном ферментативном анализе при использовании пируваткиназу (РК) и лактатдегидрогеназу (LDH). В этом анализе каждая АДФ, получаемая в результате гидролиза АТФ, переводится в АТФ с помощью РК при одновременном окислении молекулы никотинамид-аденин-динуклеотида восстановленного с помощью LDH. Окисление никотинамид-аденин-динуклеотида восстановленного можно удобно контролировать путем уменьшения спектра поглощения на длине волны 340 нм. Чувствительность к дозе измерялась с помощью анализа аденозинтрифосфатазы, связанной с пируваткиназой, лактатдегидрогиназой в буферном кальциевом растворе, при содержании следующих реагентов (представленные концентрации - заключительные концентрации анализа): калиевые трубки(12 мМ), MgCl2 (2 мМ), АТФ (1 мМ), дитиотреитол (1 мМ), альбумин бычьей сыворотки (0,1 мг/мл), никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный (0,5 мМ), фосфоенолпируват (1,5 мМ), пуриваткиназа(4 Ед./мл), лактатдегидрогиназа (8 Ед./мл), и антивспениватель (90 част./млн). Уровень рН доводится до 6,80 при температуре 22 С дополнительным введением гидроксида калия. Для получения концентрации свободного кальция от 110-4 до 110-8 М уровни кальция регулируются системой буферизации, содержащей 0,6 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты, и изменением концентрации кальция. Компоненты белка, специфичные к этому анализу, включают подфрагмент-1 бычьего кардиального миозина (обычно 0,5 мкМ), бычий кардиальный актин (14 мкМ), бычий кардиальный тропомиозин(обычно 3 мкМ), и бычий кардиальный тропонин (обычно 3-8 мкМ). Точные концентрации тропомиозина и тропонина определяются эмпирически, титрованием при достижении максимальной разницы активностей аденозинтрифосфатазы при измерении в присутствии 1 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты и при измерении в присутствии 0,2 мМ CaCl2. Точная концентрация миозина в анализе также определяется эмпирически, титрованием при достижении желательной активности гидролиза АТФ. Она изменяется в зависимости от приготовления белка, вследствие изменения доли активных молекул в каждом препарате. Чувствительность к дозе обычно измерялась при концентрации кальция, соответствующей 50% максимальной активности аденозинтрифосфатазы (pCa50), поэтому в предварительном эксперименте тестировалась реакция активности аденозинтрифосфатазы на концентрацию свободного кальция в диапазоне от 110-4 до 110-8 M. Затем анализируемая смесь доводилась до pCa50 (обычно 310-7 М). Анализы выполняются сначала подготовкой серии разбавлений тестового соединения, при этом в состав каждой из анализируемых смесей входят калиевые трубки, MgCb, альбумин бычьей сыворотки, дитиотреитол,пуриваткиназа, лактатдегидрогиназа, подфрагмент 1 миозина, антивспениватель, этиленгликольтетрауксусная кислота, CaCl2 и вода. Анализ начинается с добавления равного объема раствора, в состав которого входят калиевые трубки, MgCl2, альбумин бычьей сыворотки, дитиотреитол, АТФ, никотинамидаденин-динуклеотид восстановленный, фосфоенолпируват, актин, тропомиозин, тропонин, антивспениватель и вода. Гидролиз АТФ контролируется по поглощению при длине волны 340 нм. Получаемая кривая чувствительности к дозе описывается 4-параметрическим уравнением у=низ кривой+верх кривой-низ кривой)/(1+ЕС 50/Х)Hill. АС 1.4 определяется как концентрация, при которой активность аденозинтрифосфатазы в 1,4 раза выше низа кривой чувствительности к дозе. Способность соединения активировать кардиальный миозин оценивается влиянием соединения на актин-стимулированную аденозинтрифосфатазу подфрагмента S1. Филаменты актина в анализе декорируются тропонином и тропомиозином, и концентрация Садоводится до значения, которое привело бы к 50% активации относительно максимального уровня. S1 аденозинтрифосфатаза измеряется в присутствии ряда разбавлений соединения. Концентрация соединения, необходимая для активации на 40% выше степени аденозинтрифосфатазы, измеренной под контролем (эквивалентный объем диметилсульфоксида), отмечена в отчете как АС 40. Пример 6. Ин-виво анализ фракционного укорочения. Животные. Для исследований эффективности болюса и инфузии используются самцы крыс Sprague Dawley из Лаборатории Чарльза Ривера (275-350 г). Далее описываются животные с сердечной недостаточностью. Они размещены по два в клетке и имеют доступ к корму и воде ad libitum. Перед экспериментами проводится минимальная трехдневная акклиматизация. Эхокардиография. Животным делали анестезию изофлураном и поддерживали их в наркотическом состоянии в течение всей процедуры. Основная температура тела поддерживалась на уровне 37 С с помощью электрогрелки. После введения анестезии животных брили и волосы удаляли специальным устройством с удалением всех следов меха в области грудной клетки. Затем область грудной клетки подготавливалась с использованием 70% ЕТОН, и применялся гель для ультразвука. С помощью ультразвуковой системы GESystem Vingmed (медицинские системы Дженерал Электрик) на стенке грудной клетки размещали зонд на 10 МГц и получали изображение в проекции вертикальной оси на уровне сосочковых мышц. Двумерное М-модное изображение левого желудочка получали до и после введения болюса, содержащего соединение. Ин-виво фракционное укорочение конечно-диастолический диаметр - конечносистолический диаметр)/конечно-диастолический диаметр 100) определяется путем анализа М-модных изображений с применением программного обеспечения GE EchoPak. Эффективность болюса и инфузии. Как описано выше для протоколов болюса и инфузии фракционное укорочение определяется при использовании эхокардиографии. Для протоколов болюса и инфузии пять преддозовых М-модных изображений принимаются с 30-секундным интервалом перед инъекцией болюса или перед инфузией соединений. После инъекции М-модные изображения принимаются с интервалом, равным 1 и 5 мин, и потом до 30 мин. Инъекция болюса (0,5-5 мг/кг) или инфузия осуществляется через катетер в вену хвоста. Параметры инфузии определяются по фармакокинетическим профилям соединений. Для инфузии через- 18016138 катетер в вену хвоста животные получили 1-минутную нагружающую дозу, за которой немедленно следовала 29 минутная доза инфузии. Нагружающая доза рассчитывалась следующим путем: (целевая концентрацияустановившийся объем распределения). Концентрация поддерживающей дозы определялась следующим образом: (целевая концентрацияклиренс). Соединения составляются в 25% векторе кавитрон для протоколов инфузии и болюса. Для определения концентрации соединений в плазме берутся пробы крови. Пример 7. Гемодинамика нормальных животных и животных с сердечной недостаточностью. Животным делали анестезию изофлураном и поддерживали их в наркотическом состоянии, а затем брили для проведения катетеризации. Разрез сделан в области шеи и правую сонную артерию очищали и выделяли. 2 French Millar Micro-tip Pressure Catheter (Миллар Инструмент (Millar Instruments), Хьюстон,Техас) канюлировали в правую сонную артерию и пропускали за аорту и в левый желудочек. Непрерывно считывалось конечное диастолические давление, max +/- dp/dt, систолическое давление и частота сердечных сокращений, при этом вводилось соединение или вектор. Измерения регистрировались и анализировались с использованием программ PowerLab и Chart 4 (ADInstruments, Mountain View, CA). Измерения гемодинамики выполнялись при выбранной концентрации вводимого соединения. Пробы крови брались для определения концентрации соединений в плазме. Пример 8. Модель окклюзии левой коронарной артерии при конгестивной сердечной недостаточности Животные. В данном эксперименте использовали самцов крыс Sprague Dawley SD (220-225 г; Чарльз Ривер). Животные имели свободный доступ к воде и готовому корму для грызунов в стандартных лабораторных условиях. Комнатная температура поддерживалась на уровне 20-23 С, и режим освещения в комнате был циклическим: 12 ч свет и 12 ч затемнение. Перед исследованиями животные акклиматизировались к условиям лаборатории в течение 5-7 дней. Перед операцией животным не давали есть в течение ночи. Процедура окклюзии. Животным делали анестезию кетамином/ксилазином (95 и 5 мг/кг) и их интубировали с помощью модифицированного внутривенного катетера 14-16 калибра. Уровень анастезии проверялся надавливанием на палец лапы. Температура тела поддерживалась на уровне 37 С при использовании греющего одеяла. Область операции клишировалась и зачищалась. Животное помещалось в положение лежа на правом боку и первоначально помещалось на вентилятор с максимальным давлением при вдохе 10-15 см водного столба и при частоте дыхания 60-110 дыханий в минуту. Животным с помощью вентилятора подавался 100% кислород. Область операции очищалась хирургической щеткой и спиртом. Разрез делали между 4 и 5 ребром. Чтобы добраться до межреберных мышц аккуратно рассекали подлежащие мышцы так,чтобы не затронуть боковую грудную вену. В грудную клетку проникали между 4 и 5 ребрами, и для обеспечения визуализации сердца разрез расширяли. Чтобы оголить сердце открывали перикард. Вокруг левой коронарной артерии около ее начала, в месте контакта с левым краем артериального конуса, на расстоянии примерно 1 мм от вставки ушка левого предсердия с помощью тонкой иглы пропускали шелковую нить 6-0. Левая коронарная артерия перевязывалась нитью, которая затягивалась узлом вокруг артерии ("LCL"). Контрольным животным делали то же самое, за исключением того, что нить не затягивали узлом. Разрез закрывали тремя слоями. Крысе делали искусственную вентиляцию легких, пока она не начинала дышать самостоятельно. Крысы экстубировались и приходили в себя на электрогрелке. Для послеоперационной аналгезии животные получали бупренорфин (0,01-0,05 мг/кг SQ). После пробуждения они возвращались в свою клетку. Животные контролировались ежедневно на наличие признаков инфекции или заболеваний. Инфицированные или умирающие животные умерщвлялись. Животных взвешивали один раз в неделю. Анализ эффективности. Приблизительно спустя восемь недель после операции по поводу инфаркта крысы сканировались в поисках симптомов инфаркта миокарда с применением эхокардиографии. В экспериментах на определение эффективности использовались только животные с пониженным фракционным укорочением по сравнению с контрольными крысами. Во всех экспериментах участвуют четыре группы, контрольная симуляция + вектор, контрольная симуляция + соединение, LCL + вектор и LCL + соединение. Через 1012 недель после LCL крысам делали инфузию при выбранной концентрации вводимого соединения. Как и прежде, пять преддозовых М-модных изображений принимаются с 30-секундным интервалом перед инфузией соединения, и М-модные изображения принимаются с интервалами от 30 с до 10 мин и каждую минуту или с интервалом 5 мин после этого. Фракционное укорочение определяется по М-модным изображениям. Сравнения преддозового фракционного укорочения и лечения с помощью соединения выполняются с помощью ANOVA и post-hoc Student - Newman -Keuls. Животным позволяли восстановиться и в течение 7-10 дней животным снова делали инфузию соединений при использовании гемодинамического протокола для определения изменений гемодинамики соединений при сердечной недостаточности у животных. В конце инфузии крыс умерщвляли и взвешивали их сердца.- 19016138 При тестировании в соответствии с описанием, данным в примерах 2-8, показано, что описываемые здесь химические структурные элементы обладают требуемой активностью. При том что настоящее изобретение описано со ссылкой на особые примеры осуществления, специалисты должны понимать, что допустимы различные изменения и различные эквиваленты без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Кроме того, могут выполняться различные модификации для того, чтобы приспособить специфическую ситуацию, материал, композицию, технологию, этап технологии или этапы к цели, объему и сущности настоящего изобретения. Все модификации не выходят за границы объема настоящего изобретения. Все патенты и публикации процитированные выше тем самым включены в список противопоставленных документов. Пример 9. Сократительная способность сердца ин-витро и ин-виво на крысиной модели сердечной недостаточности. Анализ миофибриллы используется для идентификации соединений (активаторов миозина), которые непосредственно активируют аденозинтрифосфатазу кардиального миозина. Затем определялся клеточный механизм действия, ин-виво кардиальная функция крыс Sprague Dawley (SD), и эффективность соединения для крыс SD с сердечной недостаточностью. При использовании стратегии выделения краев и временного повышения кальция с использованием кардиальных миоцитов взрослых крыс, нагруженных зондом Fura-2, количественно определялась сократительная способность клеток. Клеточная сократительная способность увеличивалась относительно базового значения в течение 5 мин воздействия активного соединения (0,2 пМ), при этом не изменялось временное повышение кальция. Сочетание активного соединения с изопротеренолом (d - адренергический агонист) должно приводить только к дополнительному увеличению сократительной способности без дальнейшего изменения временного повышения кальция, что говорит о том, что активное соединение не ингибирует путь PDE. Количественно определялась ин-виво функция сокращения у крыс SD под анестезией при использовании эхокардиографии (Ммода) и одновременно измерялось давление. Крысам SD делается инфузия вектора или активного соединения (0,25-2,5 мг/кг/ч). Активное соединение должно увеличить фракционное укорочение (FS) и фракцию выброса (EF) дозозависимым образом без существенных изменений периферического кровяного давления или частоты сердечных сокращений за исключением самой большой дозы. Крысы с определенной сердечной недостаточностью, вызванной левым коронарным лигированием, или крысы с ложным лечением могут иметь сходные и значительные увеличения FS и EF при лечении активным соединением(0,7-1,2 мг/кг/ч). Подводя итог вышеизложенному можно сказать, что активное соединение увеличивает сократительную способность сердца, не увеличивая временное повышение кальция, и эффективно для крысиной модели сердечной недостаточности, что указывает на то, что активное соединение может оказать полезный терапевтический эффект при лечении сердечной недостаточности человека. Пример 10. Фармакология. Фармакология по крайней мере одного химического структурного элемента, описанного здесь, исследована на выделенных кардиальных миоцитах взрослых крыс, крысах под анестезией, и на моделях сердечной недостаточности у бодрствующих собак, вызванной инфарктом миокарда, совмещенным с быстрой желудочковой стимуляцией. Активное соединение увеличивает сократительную способность кардиального миоцита (ЕС 20=0,2 М), но не увеличивает величину или изменяет кинетику временного повышения кальция при концентрациях до 10 М в миоцитах нагруженных Fura-2. Активное соединение(30 М) не ингибирует фосфодиэстеразу типа 3. У крыс под анестезией активное соединение увеличивает эхокардиографическое фракционное укорочение с 455,1% до 564,6% после 30-минутной инфузии при 1,5 мг/кг/ч (n=6, р 0,01). У собак с сердечной недостаточностью в сознании активное соединение (0,5 мг/кг болюса, затем 0,5 мг/кг/ч i.v. в течение 6-8 ч) увеличивают фракционное укорочение на 747%, минутный сердечный выброс на 459%, и ударный объем на 10119%. Частота сердечных сокращений уменьшается на 274% и левое предсердное давление падает от 222 мм рт.ст. до 102 мм рт.ст. (р 0,05 всего). Кроме того, ни среднее артериальное давление, ни коронарный кровоток значительно не изменяются. Диастолическая функция не нарушается при этой дозе. Нет значительных изменений в группе обработанной вектором. Активное соединение улучшает кардиальную функцию и поэтому полагают, что соединения этого класса могут быть полезны больным с сердечной недостаточностью. Пример 11. Фармацевтическая композиция. Фармацевтическое соединение для внутривенного назначения готовится следующим образом. 1 мг/мл (как свободная основа) раствора IV с вектором, являющимся лимонной кислотой (50 мМ),при этом рН с помощью NaOH доводится до 5,0. Все другие компоненты кроме активного соединения соответствуют требованиям USP/Ph. Eur. Подходящий сосуд заполняется WFI приблизительно на 5% основного объема раствора. Лимонная кислота (10,51 г) взвешивается, добавляется в сосуд и перемешивается, чтобы получить 1 М лимонной кислоты. Активное средство (1,00 г) взвешивается и растворяется в 1 М раствора лимонной кислоты. Получаемый раствор переливается в большой подходящий сосуд и WPT добавляется приблизительно до 85% основного объема раствора. Уровень рН основного раствора измеряется и с помощью 1 N NaOH доводится до 5,0. Раствор с помощью WFI доводится до своего заключительного объема (1 л). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение,представляющее собой метил пиридиламино]карбониламинофенил)метил]пиперазинкарбоксилат 4-[(2-фторо-3[(6-метил(3 или его фармацевтически приемлемую соль. 2. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или адъювант и соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль. 3. Способ лечения сердечной недостаточности у млекопитающего, который включает назначение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по п.1,или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение или его фармацевтически приемлемую соль. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что сердечная недостаточность является конгестивной сердечной недостаточностью. 5. Способ по п.3, отличающийся тем, что сердечная недостаточность является систолической сердечной недостаточностью.