Гены и белки и их применение

1 Область изобретения Данное изобретение относится к идентификации бактериальных генов и белков и их применению. Более конкретно оно относится к их применению в терапии, для иммунизации и скрининга лекарственных средств. Предпосылки изобретенияStreptococcus группы В (GBS), также известный как Streptococcus agalactiae, является возбудителем различных состояний. В частности, GBS вызывает следующие инфекции. Инфекция, возникающая в раннем неонатальном возрасте Эта инфекция обычно начинается in utero и вызывает у младенцев тяжелую септицемию и пневмонию, которые являются летальными, если их не лечить, и даже при лечении уровень смертности соответствует 10-20%. Инфекция, возникающая в позднем неонатальном возрасте Эта инфекция встречается в период вскоре после рождения и примерно до 3 месячного возраста. Она вызывает септицемию, которая в 90% случаев осложняется менингитом. Также возникают другие очаговые инфекции, включая остеомиелит, септический артрит, абсцесс и эндофтальмит. Инфекции у взрослых Данные инфекции, по-видимому, становятся все более распространенными и наиболее часто возникают у женщин, которые только что родили ребенка, у пожилых людей и людей с нарушенной иммунологической реактивностью. Инфекции характеризуются септицемией и очаговыми инфекциями, включая остеомиелит,септический артрит, абсцесс и эндофтальмит. Инфекция мочевых путейGBS является причиной инфекций мочевых путей и при беременности составляет примерно 10% всех инфекций. Ветеринарные инфекцииGBS вызывает хронический мастит у коров. Это, в свою очередь, приводит к снижению продукции молока и поэтому имеет важное экономическое значение.GBS-инфекции можно лечить антибиотиками. Однако предпочтительна иммунизация. Поэтому желательно разработать иммуноген,который можно было бы использовать в терапевтически эффективной вакцине. Краткое изложение сути изобретения Данное изобретение основано на идентификации серии генов у GBS, а также у родственных организмов, продукты которых могут быть локализованы на наружной поверхности организма и поэтому могут использоваться в качестве мишеней для иммунотерапии. Согласно одному аспекту данного изобретения, пептидом является пептид, кодируемый опероном, включающим в себя любой из генов,обозначенных здесь как pho1-13, pho3-21, pho215, pho3-18, pho3-22, pho3-3, pho3-17, pho2-2, 004444Streptococcus группы В, или его гомолог или его функциональный фрагмент. Такой пептид пригоден для терапевтического применения, например, когда он выделен. Термин функциональные фрагменты используется здесь для обозначения части гена или пептида, которая сохраняет активность целого гена или пептида. Например, функциональный фрагмент пептида можно использовать в качестве антигенной детерминанты, пригодной для вакцины или для продукции антител. Фрагмент гена можно использовать для кодирования активного пептида. Альтернативно, фрагмент гена может иметь применение в генной терапии, нацеленной на ген дикого типаin vivo, чтобы вызвать терапевтический эффект. Согласно данному изобретению пептид может включать в себя различные аминокислотные последовательности, обозначенные здесь в виде SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15,17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 и 35, или их функциональные фрагменты. Вследствие внеклеточной локализации или локализации на поверхности клеток пептиды данного изобретения могут быть подходящими кандидатами для получения терапевтически эффективных вакцин против GBS. Подразумевается, что термин терапевтически эффективная включает профилактическое действие вакцин. Например, вакцина может содержать пептид согласно изобретению, или средства для его экспрессии, для лечения инфекции. Вакцину можно вводить особям женского пола либо перед, либо во время беременности, чтобы защитить мать и новорожденного от инфекции, вызванной GBS. Согласно другому аспекту данного изобретения пептиды или гены можно использовать для скрининга потенциальных антимикробных лекарственных средств или для определения вирулентности. Следующим аспектом данного изобретения является применение любого названного здесь продукта для лечения или предотвращения состояния, связанного с инфекцией штаммом стрептококков группы В. Несмотря на то, что данный белок описан для использования при лечении пациентов, в объеме данного изобретения также рассматриваются ветеринарные применения продуктов изобретения. В частности, пептиды или вакцины могут быть использованы при лечении хронического мастита, особенно у коров. Описание изобретения Данное изобретение описывается в отношении штамма М 732 стрептококков группы В. Однако, вероятно, что все штаммы GBS и многие другие бактериальные штаммы содержат родственные пептиды или белки, обладающие 3 гомологией аминокислотной последовательности с пептидом М 732. Вероятно, организмы,которые содержат данные пептиды, включают,но не ограничиваются ими, S. pneumoniae, S.pyogenes, S. suis, S. milleiri, Streptococci группы С и группы G и Enterococci. Вакцины для каждого из указанных организмов могут быть разработаны таким же образом, как описано дляGBS. Предпочтительно пептиды, которые могут быть пригодны для получения вакцин, обладают сходством последовательности более чем на 40% с идентифицированными здесь пептидами. Более предпочтительно пептиды обладают сходством последовательностей более чем на 60%. Наиболее предпочтительно пептиды обладают сходством последовательностей более чем на 80%, например 95% сходством. Охарактеризовав ген согласно данному изобретению, можно использовать последовательность гена для того, чтобы определить гомологи в других организмах. Таким образом,можно установить, имеют ли другие организмы сходные продукты наружной поверхности. Гомология последовательностей может быть установлена поиском в существующих базах данных, например, EMBL или Genbank. Пептиды или белки согласно данному изобретению могут быть очищены и выделены способами, известными в данной области. В частности, идентифицировав последовательность гена, можно будет применить рекомбинантные технологии, чтобы экспрессировать гены в подходящем хозяине. Можно идентифицировать и использовать в терапии активные фрагменты и гомологи. Например, пептиды или их активные фрагменты можно использовать в качестве антигенных детерминант в вакцине, чтобы вызвать иммунный ответ. Они также могут быть использованы для получения антител для пассивной иммунизации или для применения в диагностике. Подходящие антитела включают моноклональные антитела или их фрагменты,включая одноцепочечные fv-фрагменты. Способы получения антител будут очевидны для специалистов в данной области. Специалистам в данной области известно получение вакцин на основе аттенуированных микроорганизмов. Композиции вакцин могут быть приготовлены при необходимости или желании с подходящими носителями или адъювантами, например, квасцами, и использованы в терапии для того, чтобы обеспечить эффективную иммунизацию против стрептококков группы В или других родственных микроорганизмов. Приготовление композиций вакцин будет очевидным для специалистов. В более широком смысле, и как хорошо известно специалистам в данной области, для терапевтического применения можно выбрать подходящее количество активного компонента данного изобретения, так же как могут быть 4 выбраны подходящие носители или наполнители (эксципиенты) и пути введения. Указанные факторы будут выбраны или определены по известным критериям, таким как природа/тяжесть состояния, которое будут лечить, тип или здоровье субъекта и т.д. Продукты данного изобретения идентифицировали следующим образом. Неполную библиотеку генов хромосомной ДНК GBS (штамм М 732) готовили, используя плазмидные векторы pFW-phoA1, pFW-phoA2 иpFW-phoA3 (Podbielski, A. et al. 1996. Gene 177: 137-147). Указанные плазмиды имеют маркер конститутивной устойчивости к антибиотику спектиномицину, связанной с аденилтрансферазой, который придает высокий уровень резистентности к спектиномицину и поэтому легко поддается селекции. Кроме того, указанные векторы содержат укороченный (без лидера) генphoA щелочной фосфатазы Escherichia coli. Три вектора отличаются только в отношении рамки считывания, в которой находится безлидерный ген phoA, при сравнении расположенного в рамке считывания выше по течению сайта фермента рестрикции BamHI. Поскольку в указанном укороченном гене phoA E.coli отсутствует соответствующая лидерная последовательность для экспорта этого фермента через бактериальную мембрану, внеклеточная активность щелочной фосфатазы отсутствует в том случае,когда эти плазмиды размножаются в мутантеphoA E.coli (например, штамме DH5). Хромогенный субстрат щелочной фосфатазы ХР (5 бром-4-хлор-3-индолилфосфат) не проникает в интактные бактериальные клетки и поэтому можно регистрировать только экспортированную или связанную с поверхностью активность щелочной фосфатазы. В том случае, когда присутствует экспортированная или связанная с поверхностью активность щелочной фосфатазы хромогенный субстрат ХР расщепляется, давая голубой пигмент, и соответствующие колонии бактерий можно идентифицировать по их голубой окраске. Плазмидную ДНК полностью расщеплялиBamHI и дефосфорилировали, используя щелочную фосфатазу креветок. Геномную ДНКGBS частично расщепляли Sau3AI, фракционировали по размеру в градиенте сахарозы, и фрагменты размером 1 т.п.н. лигировали в приготовленные векторы pFW-phoA. В качестве хозяина для клонирования был выбран штаммDH5 E. coli, так как в нем отсутствует функциональный ген phoA. Рекомбинантные плазмиды отбирали на агаре Луриа, содержащем 100 мкг/мл спектиномицина и 40 мкг/мл хромогенного субстрата ХР. Трансформанты E. coli, несущие плазмиды, содержащие встроенную ДНКGBS, которая комплементирует последовательность сигнала экспорта безлидерного гена phoA,идентифицировали по голубому окрашиванию 5 колоний. Таким образом, было проверено примерно 30000 различных рекомбинантных плазмид, содержащих инсерцию ДНК GBS, и для дальнейшего исследования выбрали 83 рекомбинантные плазмиды, которые комплементировали безлидерный phoA. Из этих экспериментов отобрали несколько клонов, каждый из которых содержал плазмиду, содержащую в себе ген (или его часть),который был комплементен безлидерномуphoA. Идентифицировав ген в каждом клоне, затем можно получить последовательность гена полной длины следующим образом. Используя идентифицированный и секвенированный фрагмент гена, конструировали олигонуклеотидные праймеры для секвенирования геномной ДНК. Указанные праймеры были сконструированы так, чтобы образовывать последовательность во внешнем направлении относительно полученной последовательности. Считав один раз, полученную последовательность проверяли, чтобы выяснить, были ли достигнуты 5'- и 3'-концы гена. Наличие указанных характеристик определяли при сравнении с гомологичными последовательностями, и для 5'конца по наличию стартового кодона AUG (или подходящего эквивалента), которому предшествует консенсусная последовательность ShineDalgarno, и для 3'-конца по наличию кодона терминации транскрипции (стоп-кодона). При идентификации полноразмерного гена конструировали праймеры для амплификации продукта полной длины. Использованные праймеры включали в себя сайты узнавания ферментами рестрикции (NcoI на 5'-конце и Есо 0109I на 3'-конце), обеспечивая возможность последующего клонирования продукта в используемой системе экспрессии лактококков. Используя праймеры, проводили ПЦР, и продукты клонировали в клонирующем вектореpCR 2.1 (In Vitrogen). После подтверждения наличия клонированного фрагмента ДНК вырезали, используя ферменты рестрикции NcoI и Есо 0209I. Вектор, в который встраивали указанный фрагмент, представлял собой модифицированную версию pNZ8048 (Kuipers, О.P. et al. (1998)J. Biotech 64: 15-21). Указанный вектор, несущий ориджин репликации лактококков, маркер резистентности к хлорамфениколу, индуцируемый промотор низина и сайт множественного клонирования изменяли заменой сайта множественного клонирования двумя 10 Х Hisметками, фланкированными на самом 5'-конце сайтом NcoI, разделенными в середине сайтом множественного клонирования(включая Есо 0109I-сайт), и стоп-кодоном (кодоном терминации) на 3'-конце His-меток. Интересующий ген встраивали так, чтобы 10 Х His-метка была в 3'-положении относительно кодирующего района. После трансформацииL. lactis (штамм NZ9000 - Kuipers, О.P. et al.,(1998), см. выше) рекомбинантной плазмидой получали 400 мл жидкой культуры и индуцировали трансляцию белка добавлением к культуре низина. После 2 часов инкубации клетки собирали и лизировали разбиванием шариками. Полученный в результате лизат очищали центрифугированием, затем пропускали через металлоаффинную колонку (Talon, Clonetech). Колонку многократно промывали перед тем, как связанные белки элюировали имидазолом. Чтобы идентифицировать фракции, содержащие меченный His рекомбинантный белок,аликвоту из каждой фракции анализировали вSDS-ПААГ, выполняли вестерн-блоттинг и исследовали с помощью анти-Нis-антител. Затем полученный рекомбинантный белок использовали для иммунизации новозеландских белых кроликов с доиммуной сывороткой, собранной перед иммунизацией. После повторной иммунизации кроликов забивали и собирали сыворотку. Указанную сыворотку использовали в вестерн-блоттах, ELISA и моделях иммунной защиты животных. Используя сыворотку, полученную при исследовании животных, проводили исследование иммуносорбции.PBS. Аликвоты суспензии объемом 50 мкл использовали для того, чтобы покрыть лунки 96 луночного планшета (Nunc Immuno-Sorb). Планшет оставляли при 4 С в течение ночи,давая возможность для адсорбции бактерий на планшете. Планшеты дважды промывали PBS,затем блокировали 3% БСА в PBS в течение 1 ч при 37 С. Планшеты снова промывали. Делали серийные 10-кратные разведения сыворотки вPBS, и по 50 мкл каждого из этих разведений добавляли в лунки планшета, в повторах. Планшет накрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37 С. Планшет промывали, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл вторичных антикроличьих антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой, в концентрации 1:5000. После инкубации при 37 С в течение часа планшет снова промывали. В каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата (PNPP) и давали реакции возможность продолжаться в течение 30 мин перед тем,как регистрировали поглощение при 405 нм. Также проводили исследования иммунной защиты животных, чтобы тестировать эффективность защиты иммунизированных кроликов.GBS M732 выращивали в ТНВ до момента достижения середины лог-фазы - примерно 5 ч. Клетки считали в камере для подсчета, и бактерии разбавляли до получения концентрации 2x107 бактерий в мл в сыворотке, полученной до иммунизации, или тестируемой сыворотке. 50 мкл смеси инъецировали внутрибрюшинно мы 7 шам 0-1-дневного возраста. Следили за выживаемостью мышей в течение 48 ч. Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Пример 1. Первый клон содержал последовательность гена, обозначенную здесь как SEQ ID NO. 1, с аминокислотной последовательностью, обозначенной SEQ ID NO. 2, и был классифицирован как pho1-13. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности pho1-13. Гомологи продукта гена pho1-13 GBS можно идентифицировать в Streptococcus pyogenes, S. pneumoniae, S. salivarius, Escherichiacoli, Yersinia enterocolitica, Aquifex aeolicus,Helicobacter pylori и Haemophilius influenzae. Гомологи из S. pyogenes и S. pneumoniae идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. Во всех других случаях указанные выше гомологи могут быть идентифицированы в виде протеолитических субъединиц АТФ-зависимой протеазы Сlр. Результатом каталитической активности протеаз Сlр является гидролиз белков до небольших пептидов в присутствии АТФ и магния (Giffard, P.M. et al. 1993. J. Gen. Microbiol. 139: 913-920). Кроме того, показано, что компонент ClpP протеаз Clp индуцируется как часть реакции теплового шока(Kroh, Н.Е. and L.D. Simon. 1990. J. Bacteriol. 172:6062-6034), и возможно, что эта субъединица или полный каталитический домен может быть ассоциирован с поверхностью бактерий. Исследования по иммунизации, проведенные как описано выше, дали следующие результаты. Обработка Количество животных,выживших за период времени (ч) 24 48 7 0 13 0 17 9 Пример 2. Был отобран второй клон, содержащий плазмиду, названную phol-14. Эта плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности показаны в SEQ ID NO. 3 и 4, соответственно. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности phol-14. Гомологи продукта гена phol-14 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcuspneumoniae. Указанные гомологи идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или 8 генных продуктов. Кроме того, два возможных гомолога также были идентифицированы в Shigella flexneri (SpaR) и Yersinia pseudotuberculosis(YscT). Два последних указанных гомолога являются родственными белками, предположительно заякоренными в бактериальной мембране (Bergman, Т. et al. 1994. J. Bacteriol. 176: 2619-2626). Было показано, что у S. flexneri продукт гена spaR важен для инвазии эпителиальных клеток (Sasakawa, С. et al. 1993. J. Bacteriol. 175: 2334-2346). Кроме того, продукт гена spaR также необходим для поверхностной презентации антигенов инвазивной плазмиды. Аналогичный белок Y. pseudotuberculosis является компонентом системы секреции Yop и также важен для вирулентности у этого организма. Пример 3. Был отобран третий клон, содержащий плазмиду, названную phol-5. Эта плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности показаны в виде SEQ ID NO. 5 и 6. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности phol-5. Гомологи продукта гена phol-5 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcus pyogenes и Staphylococcus carnosus (sceA). Гомолог изS. pyogenes идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. Кроме того, немного информации имеется о функции продукта гена sceA S. carnosus. Продукт гена sceA проявляет некоторое сходство последовательности с белком Lactobacillus gasseri,стимулирующим агрегацию. На основании анализа продукта гена sceA, эта молекула содержит высоко консервативную сигнальную последовательность, и, по-видимому, секретируется или ассоциирована с поверхностью бактериальной клетки. Пример 4. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-3. Эта плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности показаны в SEQ ID NO. 7 и 8. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-3. Гомологи продукта гена pho3-3 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcus mutans(rmiC), (cpsM) S. pneumoniae и S. pyogenes. Гомолог из S. pyogenes идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генного продукта. Гомолог из S. pneumoniae может быть идентифицирован в виде dTDP-4-кето-6 дезоксиглюкозо-3,5-эпимеразы. В двух других случаях указанные выше гомологи могут быть 9 идентифицированы в виде dTDP-4-кето-Lрамнозоредуктазы (rmlC). У S. mutans ген, кодирующий этот фермент, rmlC, является частью локуса rml. Локус rml состоит из трех генов,которые проявляют значительное сходство с ферментами, вовлеченными в биосинтез dTDPрамнозы, непосредственного предшественника рамнозного компонента в полисахаридной капсуле S. mutans (Tsukioka, Y. et al. 1997. J. Bacteriol. 179: 1126-1134). Аналогичный локус также был идентифицирован у S. pneumoniae (Coffey,T.J. et al. 1998. Mol. Microbiol. 17: 73-83). Характерно, что почти все стрептококки имеют рамнозу в полисахаридах, связанных с их клеточными стенками (Schleifer, K.H. and R. KilperBlz. 1987. Syst. Appl. Microbiol. 10: 1-19), и весьма вероятно,чтоdTDP-4-кето-Lрамнозоредуктаза может быть ассоциирована с наружной поверхностью стрептококков. Пример 5. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 2-10. Эта плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная последовательность показана в виде SEQ ID NO. 9. На основании этой последовательности идентифицированы кодирующие районы, расположенные выше и ниже,и рассчитанные аминокислотные последовательности показаны в виде SEQ ID NO. 10 и 11. Было проведено сравнение аминокислотных последовательностей рhо 2-10. Гомологи продукта гена pho2-10 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcusoccidentalis (hatI) и Escherichia coli (trkD). Гомологи из S. pyogenes и Е. faecalis идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. У дрожжей D.occidentalis генhakl является гомологом гена trkD E. coli(Banuelos, M.A. et al. 1995. EMBO J. 14:30213027). Ген trkD E. coli является частью системы поглощения калия kup. Конкретный идентифицированный здесь гомолог является белком,участвующим в системе поглощения калия kup. Система kup у E. coli представляет собой конститутивную систему поглощения калия. Белок системы kup, участвующий в поглощении калия, содержит высоко гидрофобный N-конец,который по расчетам, по меньшей мере, в 12 раз перекрывает мембрану. Kuр не является гомологом других известных последовательностей мембранных белков. Нет свидетельств связывания АТФ, и предполагают, что системой управляет хемоосмотический градиент (Schleyer, M.and E.P. Bakker, 1993. J. Bacteriol. 175: 69256931) . Пример 6. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную pho2-15. Эта плазми 004444 10 да содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в SEQ ID NO. 12 и 13. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 2-15. Гомологи продукта гена pho2-15 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcuspyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis и Escherichia coli (gatC и SgcC). Гомологи из S. pyogenes, S. pneumoniae и Е. faecalis идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. Продукты генов gatC и sgcC E. coli могут быть идентифицированы в виде продукта, являющегося IICкомпонентом зависимых от фосфоенолпирувата сахарофосфотрансферазных систем (PTS), основной системы активного транспорта углеводов. В системах PTS компонент IIC обычно вовлечен в связывание внеклеточных углеводов и образует комплекс с компонентом IID, создавая мембранный канал (Nobelmann, В. and J.W. Lengeler. 1995. Biochim. Biophis. Acta 1262: 69-72). Пример 7. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 2-2. Эта плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в SEQ ID NO. 14 и 15,соответственно. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности pho2-2. Гомологи продукта гена pho2-2 GBS могут быть идентифицированы в Enterococcus faecalis,Escherichia coli (malK и afuC), Bacillus subtilisfaecalis, S. pyogenes и S. pneumoniae идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. Во всех других случаях гомологи представляли собой АТФсвязывающие транспортные белки, которые являются частью транспортеров типа ABC. Многие из компонентов транспортеров типа ABC связаны с мембраной или поверхностью клеток,так как эти системы вовлечены в транспорт макромолекул из внеклеточного окружения во внутриклеточный компартмент. Пример 8. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-14. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в SEQ ID 11 При сравнении аминокислотной последовательности рhо 3-14 не смогли обнаружить гомологов ни в каких опубликованных базах данных. Один гомолог продукта гена pho3-14 GBS идентифицировали в Streptococcus pyogenes, но указанный гомолог идентифицировали на основании данных о геномной последовательности,и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генного продукта. Используя этот гомолог из S. pyogenes для поиска в опубликованных базах данных, дополнительной информации не получили. Так как продукт рhо 3-14 был комплементен безлидерному гену phoA, можно сделать вывод, что указанный белок (или его часть) наиболее вероятно может быть локализован вне клетки. Пример 9. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-17. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQID NO. 18 и 19. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-17. Гомологи продукта гена pho3-17 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcusmutans и Lactococcus lactis, при этом показано сходство с N-ацетилмурамидазой. Также выявлено сходство с не идентифицированным геномN-ацетилмурамидаза является аутолизином, который вовлечен в деление клеток. Используя эту ограниченную информацию вместе с тем фактом, что рhо 3-17 был комплементен безлидерному гену phoA, можно сделать вывод,что продукт рhо 3-17 наиболее вероятно может иметь внеклеточную локализацию. Пример 10. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-18. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQID NO. 20 и 21. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-18. Гомологи продукта гена pho3-18 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcuspyogenes и Streptococcus pneumoniae. Указанные гомологи идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. Используя указанные гомологи из S. pyogenes и S. pneumoniae для поиска в опубликованных базах данных, наблюдали некоторое сходство с белками наружной поверхности и белками, пронизывающими мембрану. Так как продукт ORF3-18 комплементен безлидерному гену phoA, можно 12 сделать вывод, что этот белок (или его часть) наиболее вероятно может быть локализован вне клетки. Пример 11. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-1. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQID NO. 22 и 23. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-1. Гомологи продукта гена pho3-l GBS могут быть идентифицированы в Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilispyogenes, S. pneumoniae и Е. faecalis идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. Функция продукта генаyutD у В. subtilis не известна. Однако можно отметить, что ген yutD локализован в хромосоме В. subtilis в районе, содержащем гены, вовлеченные в синтез клеточной стенки. Тот факт,что эта последовательность ДНК комплементна безлидерному гену phoA, означает, что указанный генный продукт локализован вне клетки. Пример 12. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-21. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQID NO. 24 и 25. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-21. Гомологи продукта гена pho3-21 GBS могут быть идентифицированы в Streptococcuspyogenes, Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus fermentum (bspA) и Lactobacillus reuteri (cnb). Гомологи из S. pyogenes и S. pneumoniae идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. У L. fermentum продукт гена bspA был идентифицирован как основной белок, локализованный на поверхности клеток,который имеет некоторое сходство последовательности с семейством III бактериальных белков, связывающих растворенные вещества(Turner M.S. et al. 1997. J. Bacteriol. 179: 33103316). У L. reuteri продукт гена cnb был идентифицирован как коллаген-связывающий белок,который обладает некоторым сходством последовательности с компонентом бактериальных транспортеров ABC, связывающим растворенные вещества (Roos, S, et al. 1996. FEMS Microbiol. Lett. 144: 33-38). Пример 13. 13 Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-22. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQID NO. 26 и 27. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-22. Гомологи продукта гена pho3-22 GBS могут быть идентифицированы в Enterococcus faecalis, Streptococcus equisimilis (IppC), Pseudomonas fluorescens (oprI) и Streptococcus thermophilus(orf142). Гомолог из Е. faecalis идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. У S. equisimilis продукт генаlppC был идентифицирован как липопротеид,который гомологичен белку Е(Р 4) наружной мембраны Haemophilias influenzae (Gase, K. et al. 1997. Med. Microbiol. Immunol. 186: 63-73). ГенoprI из Р. fluorescens также кодирует главный липопротеид наружной мембраны (Cornelis, P. etal. 1989. Mol. Microbiol. 3: 421-428). У S. thermophilus продукт orf142 предположительно был идентифицирован как липопротеид, экспонированный на поверхности клеток, который может действовать как рецептор бактериофагов TP-J34 и Sfi21 (Neve, H. et al. 1998. Virology 241: 61-72). Продукт ORF3-22 проявлял большое сходство с указанными выше гомологами, особенно на Nконце. Наиболее вероятно, что данный район необходим для комплементации безлидерного гена phoA, и, следовательно, служит лидерной последовательностью. Пример 14. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-23. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидные и рассчитанные аминокислотные последовательности генов показаны в виде SEQID NO. 28 и 29. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-23. Гомологи продукта гена pho3-23 GBS могут быть идентифицированы у Streptococcuspyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis и Streptococcus mutans (perM). Гомологи из S. pyogenes, S. pneumoniae и Е. faecalis идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. У S. mutans продукт гена реrМ предположительно был идентифицирован как пермеаза, но никакой другой информации относительно функции данного белка нет. Учитывая,что кодирующий район рhо 3-23 комплементен безлидерному гену phoA, можно сделать вывод,что продукт гена рhо 3-17 наиболее вероятно может быть локализован вне клетки. 14 Пример 15. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-24. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQID NO. 30 и 31. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-24. Гомологи продукта гена pho3-24 GBS могут быть идентифицированы у Streptococcusmutans (dltB), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Lactobacillus casei (dltB) и Bacillus subtilis (dltB). Гомологи из S. pneumoniae, S. pyogenes и Е. faecalis идентифицировали на основании данных о геномной последовательности, и не было никаких доступных ссылок относительно идентичности гена или генных продуктов. У S. mutans, L. casei и В. subtilis продукт гена dltB был идентифицирован как основной мембранный белок, который вовлечен в транспорт активированного Dаланина через клеточную мембрану. Продукт генаF.C. Neuhaus. 1992. J. Bacteriol. 174: 4707-4717). Полагают, что у L. casei и В. subtilis продукт гена dltB содержит, по меньшей мере, 9 пронизывающих мембрану доменов, что свидетельствует о том, что белок или его части экспонированы на наружной стороне клетки. Пример 16. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-29. Эта плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQ ID NO. 32 и 33. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-29. Гомологи продукта гена pho3-29 GBS могут быть идентифицированы в Borrelia burgdorferi (p23 или ospC), Bacillus brevis (owp) и Pseudomonas aeruginosa (oprI). Хотя указанные гомологи не родственны друг другу, все они представляют собой главные белки наружной поверхности. У В. burgdorferi продукт гена ospC был идентифицирован как белок с молекулярной массой 23 кДа, который является иммунодоминантным антигеном на поверхности этой бактерии (Padula, S.J. et al. 1993. Infect. Immun. 61: 5097-5105) . Продукт гена owp В. brevis является одним из двух основных белков клеточной стенки, вовлеченным в формирование структуры поверхностного слоя (Tsuboi, A. 1988. J. Bacteriol. 170: 935-945). Наконец генoprI P. aeruginosa кодирует предшественник основного липопротеида наружной мембраны 15 Пример 17. Был отобран следующий клон, содержащий плазмиду, названную рhо 3-50. Указанная плазмида содержала ген (или его часть), который был комплементен безлидерному phoA. Нуклеотидная и рассчитанная аминокислотная последовательности гена показаны в виде SEQID NO. 34 и 35. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности рhо 3-50. Гомологи продукта гена pho3-50 GBS могут быть идентифицированы у ряда стрептококков (penA, pbp2B, pbpB2), Borrelia burgdorferiHelicobacter pylori (pbp2). Во всех случаях указанные выше гомологи могут быть идентифицированы как пенициллин-связывающие белки(РВР). Гены,кодирующие пенициллинсвязывающие белки, часто локализованы в кластере генов, связанных с синтезом клеточной стенки (Pucci, M.J. et al. 1997. J. Bacteriol. 179: 5632-5635). Кроме того, PBS обычно интегрированы в клеточную стенку бактерий с некоторыми или со всеми белками, экспонированными на наружной поверхности бактерий. Список последовательностей ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 1-13, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:2, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его 36 функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 2. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 1-14, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:4, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 3. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 1-5, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6,или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 4. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-3, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8,или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 5. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 2-10, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 10, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 6. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 2-10, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:11, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 7. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 2-15, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:13, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связан 37 ных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 8. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 2-2, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:15, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 9. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-14, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:17, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 10. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-17, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:19, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 11. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-18, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:21, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 12. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-1, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:23, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 13. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-21, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:25, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 38 14. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-22, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:27, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 15. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-23, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:29, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 16. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-24, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:31, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 17. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-29, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:33, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 18. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 3-50, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы В, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO:35, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 19. Полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.1-18 для терапевтического применения. 20. Полинуклеотид по п.19, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей,обозначенных здесь как SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 и 34,или их функциональные фрагменты. 21. Вакцина для профилактики состояний,связанных с бактериальной инфекцией, вызванной Streptococcus группы В, содержащая пептид по любому из пп.1-18. 22. Применение пептида по любому из пп.1-18 для скрининга потенциальных антимикробных лекарственных средств. 23. Применение пептида по любому из пп.1-18 для определения вирулентности. 24. Применение полинуклеотида по пп.1920 для скрининга потенциальных антимикробных лекарственных средств. 25. Применение полинуклеотида по пп. 1920 для определения вирулентности. 26. Применение пептида по любому из пп.1-18 для производства лекарственного препарата для применения при лечении или профилактике состояний, связанных с бактериальной 40 инфекцией, где инфекция представляет собой стрептококковую инфекцию группы В. 27. Применение полинуклеотида по пп.1920 для производства лекарственного препарата для применения при лечении или профилактике состояний, связанных с бактериальной инфекцией, где инфекция представляет собой стрептококковую инфекцию группы В. 28. Применение по п.26 или 27, где инфекция представляет собой очаговую инфекцию. 29. Применение по п.26 или 27, где инфекция представляет собой инфекцию мочевых путей. 30. Антитело, специфически связывающееся с пептидом по любому из пп.1-18.