Способ получения органической кислоты из лигноцеллюлозной массы

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ МАССЫ Баккер Роберт Рерд Христофор, Де Йонг Эд, Мас Рональд Хубертус Вильхемус,Вестхейс Руд Александер, Виссер Диана,Винкелар Хендрик Мартинус, Янсен Микель Леонардус Аугуст (NL)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СТИХТИНГ ДИНСТ ЛАНДБАУВКЮНДИГ ОНДЕРЗУК (NL)(57) Изобретение относится к способу получения продукта ферментирования из лигноцеллюлозной биомассы, к реактору для осуществления способа и к использованию реактора для получения продукта ферментирования. 016378 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способу получения органических кислот как продукта ферментирования из лигноцеллюлозной биомассы, где лигноцеллюлозную биомассу предварительно обрабатывают с использованием щелочного агента. Кроме того, настоящее изобретение относится к реактору для осуществления способа по настоящему изобретению. Уровень техники Исходные материалы лигноцеллюлозной биомассы могут использоваться для процессов ферментирования, в частности, для биоэтанола и молочной кислоты. Обычные способы преобразования лигноцеллюлозных материалов в большие количества химикалиев, таких как молочная кислота, требуют предварительной обработки, ферментативного гидролиза и микробного ферментирования. Лигноцеллюлозная биомасса представляет собой недорогой и широкодоступный возобновляемый источник углерода, который не имеет конкурирующей пищевой ценности. Лигноцеллюлоза состоит в основном из целлюлозы и гемицеллюлозы; полимеров, состоящих главным образом из гексозных Сахаров и пентозных Сахаров,которые погружены в матрицу из фенольного полимера лигнина. . Главный путь получения ферментируемых Сахаров из лигноцеллюлозы проходит через ферментативный гидролиз под действием целлюлолитических и гемицеллюлолитических ферментов. Механическая и химическая предварительная обработка лигноцеллюлозы необходима для уменьшения размеров частиц, для модификации и/или для удаления лигнина и увеличения тем самым доступности полисахаридов для ферментативного гидролиза (Claassen et al. (1999) Microbib Biotechnol. 52:741755). Разнообразные виды химической предварительной обработки биомассы исследованы при изучении и разработке промышленной технологии превращения лигноцеллюлозы в этанол (Mosier et al. (2005) Bioresour. Technol. 96:673-686). Щелочная предварительная обработка лигноцеллюлозной биомассы с помощью извести (Са(ОН)2) при умеренных температурах (100 С), как показано, представляет собой перспективный путь предварительной обработки для усиления ферментативного гидролиза и может отличаться высокой ферментативной деградируемостью без значительной делигнификации или ксиланового деградирования лигноцеллюлозного субстрата (Chang et al (1998) Appl. Biochem. Biotechnol 74:13-5159). Тем не менее, эта щелочная предварительная обработка при относительно высоком значении рН (10) не является привлекательной, поскольку при этих рН активность распространенных целлюлолитических и ксиланолитических ферментов, необходимых для деполимеризации (теми)целлюлозы, является низкой. По этой причине, понижение рН является главным условием для достижения эффективного ферментативного гидролиза полисахаридов. Один из подходов к удалению гидроксида кальция заключается в промывке обработанной известью биомассы перед ферментативным гидролизом (Chang et al. (1998)Appl. Biochem. Biotechnol. 74:13-5159); однако это приводит к использованию больших количеств воды. Другой путь понижения рН предварительно обработанного материала заключается в нейтрализации гидроксида кальция кислотами, такими как серная кислота и уксусная кислота, или с помощью СО 2. Однако это приводит к образованию малоценных солей, таких как гипс или карбонат кальция, в качестве побочного продукта. По этой причине эта проблема высоких значений рН (10) лигноцеллюлозного материала после предварительной обработки известью и перед ферментативным гидролизом еще не решена соответствующим образом. Настоящее изобретение предусматривает способ получения органической кислоты как продукта ферментирования из лигноцеллюлозной биомассы, реактор для осуществления способа по настоящему изобретению и применение реактора для осуществления способа по настоящему изобретению, где щелочная природа биомассы, предварительно обработанной, щелочью используется в способе одновременного сахарообразования и ферментирования для контроля рН в течение ферментирования. Описание изобретения В одном из аспектов, настоящее изобретение предусматривает способ получения органической кислоты как продукта ферментирования из лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:a) предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы щелочным агентом с получением предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы с рН в пределах между приблизительно 8,0 и приблизительно 14,0;b) одновременного сахарообразования и ферментирования (SSF) предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы со стадии а) в биореакторе, при этом уменьшение рН, вызываемое образованием органической кислоты, компенсируется добавлением предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы, необязательно, в сочетании со щелочью, для адаптирования рН приблизительно ниже 8,0 и/или для поддержания рН при конкретном значении рН ниже 8,0, делая возможной оптимальную активность микроорганизма (микроорганизмов) и/или добавляемых ферментов; иc) необязательного извлечения продукта ферментирования. Термин "органическая кислота как продукт ферментирования" определяется в настоящем документе как продукт, который получают посредством ферментирования с помощью одного или нескольких микроорганизмов, при этом продукт представляет собой органическую молекулу, содержащую, по меньшей мере, одну карбоксигруппу. В одном из вариантов осуществления продукт ферментирования, который получают с помощью способа по настоя-1 016378 щему изобретению, выбирают из группы, состоящей, но не ограничиваясь этим, из молочной кислоты,лимонной кислоты, итаконовой кислоты, янтарной кислоты, фумаровой кислоты, гликолевой кислоты,пировиноградной кислоты, уксусной кислоты, глютаминовой кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, глюконовой кислоты и их сочетаний. В особенно предпочтительном варианте осуществления, продукт ферментирования представляет собой молочную кислоту. Альтернативно или в сочетании с предыдущими предпочтительными вариантами осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления лигноцеллюлозную биомассу выбирают из группы,состоящей, но не ограничиваясь этим, из травы, дерева, багассы, соломы, бумагы, растительного материала (соломы, сена и тому подобное) и их сочетаний. В одном из вариантов осуществления лигноцеллюлозная биомасса представляет собой пшеничную солому, стебли кукурузы, ячменную солому, рисовую солому, ржаную солому или солому от любого культивируемого растения. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительными вариантами осуществления, в другом варианте осуществления лигноцеллюлозная биомасса сушится на воздухе и имеет по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 89,5, 90 или 95% (мас./мас.) сухого вещества. В другом варианте осуществления, лигноцеллюлозную биомассу не сушат, то есть может использоваться свежая биомасса. Альтернативно, или в сочетании с предыдущими предпочтительными вариантами осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, лигноцеллюлозная биомасса подвергается предварительному экстрагированию перед предварительной обработкой для удаления неферментируемых растворимых компонентов, таких как белки, аминокислоты или растворимые неорганические компоненты, содержащиеся в биомассе, которые могут отрицательно влиять на следующие далее гидролиз и ферментирование. В другом предпочтительном варианте осуществления, ферментируемые растворимые компоненты могут удаляться из лигноцеллюлозной биомассы. Термин "предварительное экстрагирование" определяется в настоящем документе как любая обработка, удаляющая растворимые компоненты из лигноцеллюлозной биомассы. Альтернативно или в сочетании с предыдущими предпочтительными вариантами осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления предварительная обработка лигноцеллюлозной биомассы предваряется механическим измельчением лигноцеллюлозной биомассы или объединяется с ним,и/или встраивается в него. Механическое измельчение осуществляют для изменения распределения размеров частиц лигноцеллюлозной биомассы таким путем, чтобы эффективность предварительной обработки и следующих далее процессов увеличивалась, и чтобы щелочной агент тщательно перемешивался с лигноцеллюлозной биомассой. В предпочтительном варианте осуществления, механическое измельчение включает, но, не ограничиваясь этим: помол, механическую переработку и экструзию. Стадия а). Предварительная обработка лигноцеллюлозной биомассы щелочным агентом. Предварительная обработка лигноцеллюлозной биомассы требуется для разламывания лигноцеллюлозной матрицы, удаления или модифицирования лигнина и увеличения площади поверхности целлюлозы. Термин "предварительная обработка" определяется в настоящем документе как любой способ,осуществляемый перед гидролизом, имеющий целью увеличение степени гидролиза после гидролизации лигноцеллюлозы. Предварительную обработку лигноцеллюлозной биомассы предпочтительно осуществляют до тех пор, пока, по меньшей мере приблизительно 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85% углеводных компонентов в предварительно обработанной биомассе не будут преобразованы с помощью одного или нескольких гидролитических ферментов в один или несколько мономерных сахаров в течение разумного периода времени, такого например, как приблизительно 24 ч. В сочетании с предыдущими предпочтительными вариантами осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к предварительной обработке лигноцеллюлозной биомассы щелочным агентом с получением предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы с рН, находящимся в пределах между приблизительно 8,0 и приблизительно 14,0, предпочтительно, между приблизительно рН 8,0 и рН 12,5 или 12,0. Таким образом, соответствующее количество одного или нескольких щелочных агентов добавляют к биомассе и инкубируют в течение соответствующего периода времени и при соответствующей температуре, как указано ниже в настоящем документе. В течение щелочной предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы, рН может понижаться приблизительно от 0,5 приблизительно до 2,0 единиц из-за высвобождения кислот, содержащихся в лигноцеллюлозной биомассе. В предпочтительном варианте осуществления предварительно обработанная щелочью лигноцеллюлозная биомасса в соответствии с настоящим изобретением имеет значение рН, находящееся в пределах между приблизительно 8,5 и приблизительно 12,5, более предпочтительно находящееся в пределах между приблизительно 9,0 и приблизительно 12,0, еще более предпочтительно находящееся в пределах между приблизительно 9,5 и приблизительно 12,0, наиболее предпочтительно значение рН приблизительно равно 11,8. Альтернативно или в сочетании с предыдущими предпочтительными вариантами осуществления в другом предпочтительном варианте осуществления, щелочной агент, который должен использоваться на стадии а) способа по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей, но не ограничиваясь-2 016378 этим, из гидроксида кальция (Са(ОН)2), оксида кальция (СаО), аммиака (NH3), гидроксида натрия(NaOH), гидроксида калия (КОН), мочевины или их сочетаний. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления отношение щелочной агент : лигноцеллюлозная биомасса находится в пределах между приблизительно 1:100 и приблизительно 20:100, более предпочтительно между приблизительно 2,5:100 и приблизительно 17,5:100, а наиболее предпочтительно между приблизительно 5:100 и приблизительно 15:100. Отношение щелочной агент лигноцеллюлозная биомасса может выбираться таким образом, чтобы улучшить ферментативную деградируемость и ферментируемость целлюлозы и гемицеллюлозы. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления предварительную обработку лигноцеллюлозной биомассы щелочным агентом осуществляют при соответствующей температуре. Наиболее пригодная температура для осуществления стадии (а) по настоящему изобретению представляет собой температуру, приводящую к самым малым затратам на производство продукта ферментирования, предпочтительно без влияния на эффективность ферментирования для любого выбранного типа и концентрации биомассы, выбранных других условий предварительной обработки (например,рН и периода времени) и выбранных условий для SSF (например, микроорганизма (микроорганизмов),температуры, фермента (ферментов. В предпочтительном варианте осуществления пригодная для использования температура находится в пределах между приблизительно 50 С и приблизительно 115 С,более предпочтительно между приблизительно 60 С и приблизительно 95 С, более предпочтительно между приблизительно 70 С и приблизительно 90 С, еще более предпочтительно между приблизительно 80 С и приблизительно 90 С, а наиболее предпочтительно равна приблизительно 85 С. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, предварительную обработку лигноцеллюлозной биомассы щелочным агентом осуществляют в течение периода времени, находящегося в пределах между приблизительно 2 ч и приблизительно 20 ч, более предпочтительно между приблизительно 4 ч и приблизительно 16 ч, более предпочтительно между приблизительно 5 ч и приблизительно 12 ч, более предпочтительно между приблизительно 6 ч и приблизительно 10 ч, а наиболее предпочтительно в течение периода времени приблизительно 8 ч. Наиболее пригодный для использования период времени для осуществления стадии (а) по настоящему изобретению представляет собой период времени, приводящий к самым малым затратам на производство продукта ферментирования, предпочтительно без влияния на эффективность ферментирования, для любого выбранного типа и концентрации биомассы, выбранных других условий предварительной обработки (например, рН и температуры) и выбранных условий для SSF(например, микроорганизма (микроорганизмов), температуры, фермента (ферментов. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, предварительно обработанная щелочью лигноцеллюлозная биомасса по настоящему изобретению подвергается воздействию одной или нескольким из следующих стадий перед SSF: стадии охлаждения, стадии промывки и/или стадии обезвоживания. В более предпочтительном варианте осуществления предварительно обработанная щелочью лигноцеллюлозная биомасса охлаждается приблизительно до 80 С, более предпочтительно приблизительно до 70 С,более предпочтительно приблизительно до 60, более предпочтительно приблизительно до 50 С, более предпочтительно приблизительно до 40 С, а наиболее предпочтительно приблизительно 30 С. Термин"обезвоживание" или "дегидратация" как используется в настоящем документе, определяется как удаление свободной воды из биомассы. В другом предпочтительном варианте осуществления стадию обезвоживания осуществляют посредством использования фильтрования, прикладывая при этом давление к предварительно обработанной биомассе, где прикладываемое давление находится в пределах между 0 и приблизительно 100 бар. Другие способы обезвоживания будут известны специалистам в данной области техники. В другом более предпочтительном варианте осуществления, стадию промывки осуществляют для удаления ингибиторов ферментирования, таких как органические кислоты (например, уксусной кислоты). В предпочтительном варианте осуществления стадию промывки осуществляют посредством добавления воды после обезвоживания, со следующей далее стадией обезвоживания. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу со стадии (а) добавляют в способ одновременного сахарообразования и ферментирования (SSF) со стадии (b), описанной ниже, более предпочтительно способом загрузки исходных материалов, для нейтрализации подкисления, которое вызывается микробным ферментированием на стадии (b). Термин "нейтрализовать" или "нейтрализация" определяется в настоящем документе как адаптация и/или поддержание рН смеси для SSF при рН равном или более низком приблизительно, чем 8,0, например, адаптирование и/или поддержание рН до/при конкретном рН приблизительно 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 или 8,0, в зависимости от оптимума рН для гидролитического фермента (ферментов) и/или микроорганизма (микроорганизмов). Таким образом, в способе SSF со стадии(b) , описанной ниже, предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу добавляют к смеси SSF для компенсации понижения рН, вызываемого образованием органической кислоты, поддер-3 016378 живая рН на постоянном уровне. Специалист в данной области техники будет знать, как выбрать уровень рН, который должен поддерживаться в смеси для SSF. Стадия b). Одновременное сахарообразование и ферментирование. Термин "одновременное сахарообразование и ферментирование" (SSF) определяется в настоящем документе, как одновременный ферментативный гидролиз полимерных углеводов предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы с получением ферментируемых сахаридов и дальнейшее преобразование сахаридов в продукт ферментирования с помощью одного или нескольких микроорганизмов. Настоящее изобретение относится к SSF предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы в биореакторе, при этом предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу добавляют к смеси SSF, предпочтительно, способом загрузки исходных материалов, для нейтрализации подкисления, которое вызывается микробным ферментированием на стадии (b). Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, способ SSF со стадии (b) работает в режиме хемостата, в котором предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу используют в качестве питательного вещества. "Режим хемостата" определяется в настоящем документе как устройство биореактора для поддержания по существу постоянными параметров ферментирования, таких как концентрация питательного вещества и pH. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, SSF включает стадии: i) необязательной фазы предварительного гидролиза; ii) ферментативного гидролиза с помощью гидролитического фермента для получения ферментируемых сахаридов и iii) микробного ферментирования с использованием одного или нескольких микроорганизмов, которые способны преобразовывать сахариды со стадии ii) в продукт ферментирования. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления в другом предпочтительном варианте осуществления, SSF необязательно включает фазу предварительного гидролиза, где часть предварительно обработанной щелочью биомассы, у которой рН адаптируется до желаемого уровня посредством добавления одной или нескольких кислот, преобразуется в ферментируемые сахара, с получением соответствующей окружающей среды для микроорганизма (микроорганизмов), для начала микробного преобразования биомассы в органические кислоты. Альтернативно, или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, фазу предварительного гидролиза осуществляют в течение периода, достаточного для увеличения концентрации ферментируемых сахаров в реакторе до значения, находящегося в пределах между 0,5 и 10, более предпочтительно между 1 и 5 г/л. Альтернативно, или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, SSF включает фазу ферментативного гидролиза с помощью одного или нескольких препаратов гидролитических ферментов для получения сахаридов. Сахариды, которые могут быть получены посредством ферментативного гидролиза, могут включать, например, глюкозу, маннозу, фруктозу, лактозу, галактозу, рамнозу, ксилозу, арабинозу, галактуроновую кислоту и их олигомерные сахариды (сочетания). Ферментативный гидролиз полимерных углеводов в соответствии со способом по настоящему изобретению необходим для образования субстрата, который может использоваться микроорганизмом(микроорганизмами) на стадии ферментирования. Гидролитический фермент для использования в способе по настоящему изобретению, то есть тот, который добавляют в соответствующем количестве в способSSF на стадии (b), может представлять собой, но, не ограничиваясь этим, группу, содержащую препараты целлюлазы, препараты гемицеллюлазы, целлобиазу, препараты ксиланазы, амилазу и пектиназу. Такие ферментативные препараты являются коммерчески доступными и могут быть получены, например,от Genencor International B.V. (Leiden, The Netherlands). Пригодная для использования величина активности гидролитического фермента для использования в способе по настоящему изобретению представляет собой величину активности гидролитического фермента, приводящую к наименьшим производственным затратам на продукт ферментирования, при этом поддерживая хорошую или оптимальную ферментативную активность, для выбранного типа и концентрации биомассы, выбранных условий предварительной обработки (например, рН, периода времени и температуры) и выбранных условий для SSF (например,микроорганизма (микроорганизмов) и температуры). Пригодная для использования величина активности гидролитического фермента может находиться, например, в пределах приблизительно от 0,01 приблизительно до 50, более предпочтительно, приблизительно от 5 приблизительно до 40 единиц для фильтровальной бумаги (FPU), хотя могут использоваться и более высокие активности гидролитических ферментов. Альтернативно, или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, ферментативный гидролиз в течение SSF в соответствии со способом по настоящему изобретению дает гидролизат, который содержит очень низкие концентрации или даже пренебрежимо малые концентрации соединений, ингибирующих ферментирование.-4 016378 В предпочтительном варианте осуществления, концентрации фурфурала, 5-hmf и фенольных соединений, которые образуются при SSF, меньше чем 0,2 г/л. Количество таких соединений может измеряться с использованием стандартных способов, таких как анализ с помощью ВЭЖХ. Один или несколько микроорганизмов для использования в способе по настоящему изобретению,то есть те, которые добавляют в смесь для SSF на стадии (b) , выше, до SSF и/или в течение него, могут представлять собой бактерии, грибки (включая дрожжи), археи или водоросли. В предпочтительном варианте осуществления, бактерии выбирают из термотолерантного штамма Bacillus. В другом предпочтительном варианте осуществления, микроорганизм выбирают из группы, состоящей, но, не ограничиваясь этим, из: Acetobacteraceti, A. hansenii, A. Liquefaciens, A. mesoxydans, A. pasteurianus, A. suboxydans, A.invention are Acetobactestpecie,sBacillus coagulans, B. racemilacticus, B. laevolacticup Corynebacteriumglutamicum Escherichi coli, Gluconobactespecies Pseudomonaspecieslactic acid bacteria, Aspergillusniger, Aspergilluserreusand Saccharomyceserevisiae. Соответствующая плотность инокулума микроорганизма (микроорганизмов) для использования в способе по настоящему изобретению представляет собой плотность микроорганизма (микроорганизмов),приводящую к наименьшим производственным затратам на продукт ферментирования, обеспечивая при этом хороший рост, способности к метаболизму и ферментированию, при выбранном типе и концентрации биомассы, выбранных условиях предварительной обработки (например, рН, периоде времени и температуре) и выбранных условиях для SSF (например, ферменте (ферментах) и температуре). В предпочтительном варианте осуществления плотность микроорганизма (микроорганизмов) составляет приблизительно от 0,1 до приблизительно 50, более предпочтительно приблизительно от 2 приблизительно до 20,еще более предпочтительно приблизительно от 5 до приблизительно 10 г микроорганизма (микроорганизмов)/кг предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, общая концентрация твердых продуктов при SSF находится в пределах приблизительно от 5% приблизительно до 50%, например приблизительно от 5% до приблизительно 40%, 30% или 25%, наиболее предпочтительно приблизительно от 40% до приблизительно 50%. Оптимальная температура для осуществления SSF зависит от температурного оптимума микроорганизма (микроорганизмов) и/или фермента или смеси ферментов. Специалист в данной области техники-6 016378 будет знать, как определить оптимальную температуру для осуществления SSF. Оптимальная температура, которая должна использоваться в сочетании с одним или несколькими микроорганизмами и/или ферментами, может устанавливаться посредством анализа активности микроорганизма (микроорганизмов) и/или фермента (ферментов) при различных условиях температуры с использованием известных способов. В предпочтительном варианте осуществления, температура в течение SSF находится в пределах приблизительно от 20 до приблизительно 80 С, более предпочтительно в пределах приблизительно от 25 до приблизительно 60 С, а наиболее предпочтительно в пределах приблизительно от 30 до приблизительно 50 С. Альтернативно или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления в другом предпочтительном варианте осуществления рН в течение SSF устанавливают и/или поддерживают так, чтобы он находился между приблизительно 2,0 и 10,0, более предпочтительно между приблизительно 4,0 и 8,0, более предпочтительно между приблизительно 5,0 и 7,0, а наиболее предпочтительно рН в течение SSF устанавливают и/или поддерживают таким, чтобы он был равен приблизительно 6,0. рН может контролироваться (например, автоматически) посредством добавления предварительно обработанной щелочью биомассы и, необязательно, щелочи в форме раствора или суспензии, например, с помощью насоса или устройства для подачи, у которого выход управляется с помощью контроллера (компьютера), на основе желаемого значения рН и значения рН, как определяют с помощью стандартного рНэлектрода. Альтернативно, или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, рН в течение SSF может контролироваться посредством добавления предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы, без необходимости в дополнительном источнике щелочи и без больших флуктуации рН. В другом предпочтительном варианте осуществления, рН в течение SSF может контролироваться посредством добавления предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы и щелочного агента. В предпочтительном варианте осуществления, SSF может включать фазу предварительного гидролиза, фазу загрузки исходных материалов с контролем рН посредством добавления предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы и фазу загрузки с контролем рН посредством добавления щелочи. В предпочтительном варианте осуществления, фаза загрузки исходных материалов сопровождается фазой загрузки, и/или она следует за ней, в которой добавляют щелочь для компенсации уменьшения рН, вызываемого образованием органической кислоты, поддерживая рН на постоянном уровне. В предпочтительном варианте осуществления, щелочь выбирают из группы, состоящей, но, не ограничиваясь этим, из гидроксида кальция (Са(ОН)2, оксида кальция (СаО), аммиака (NH3) , гидроксида натрия (NaOH), гидроксида калия (КОН), карбоната натрия, мочевины и их сочетаний. Альтернативно, или в сочетании с предыдущим предпочтительным вариантом осуществления, в другом предпочтительном варианте осуществления, продукт ферментирования получают в количестве по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно 100% от теоретического максимума. Теоретический максимум может вычисляться в соответствии со следующим уравнением: где DM = общее количество сухого вещества предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы (г);F = доля полисахаридов (г) на грамм предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы;HF = коэффициент гидролиза для преобразования молекулярной массы полисахаридов в конечные моносахариды;FF = коэффициент ферментирования 1,00 г продукта ферментирования на г моносахаридов. Стадия с). Извлечение. Термин "извлечение" определяется в настоящем документе как любой способ или сочетание способов, в которых продукт ферментирования по настоящему изобретению получают из смеси для SSF со стадии (b) в более чистой и/или более концентрированной форме, например, с получением продуктов ферментирования с более низкой концентрацией других компонентов или с меньшим числом других компонентов, по сравнению со смесью для SSF со стадии (b). В другом аспекте настоящее изобретение относится к реактору, содержащему контейнер для предварительной щелочной обработки лигноцеллюлозной биомассы, необязательно или временно соединенный с биореактором для одновременного сахарообразования и ферментирования (SSF) предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы, где реактор предназначен для использования в способе по настоящему изобретению, и где: 1) контейнер содержит:iii) необязательные средства для предварительного экстрагирования растворимых компонентов из лигноцеллюлозной биомассы; 2) биореактор содержит:i) автоматический контроль рН иii) вход для предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы из контейнера,который контролируется с помощью автоматического контроля рН. В предпочтительном варианте осуществления, смесительное устройство способно подмешивать щелочной агент в предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу. В другом предпочтительном варианте осуществления, нагревательное устройство способно нагревать смесь щелочного агента и предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы до необходимой температуры процесса. В предпочтительном варианте осуществления, смесь нагревают с помощью электрического нагрева или с помощью пара. В предпочтительном варианте осуществления, соединительное устройство или средства соединения между контейнером и биореактором представляют собой насос, предпочтительно, шнековое подающее устройство, чтобы сделать возможной автоматическую подачу в биореактор предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы. Соединительное устройство или средства соединения не должны присутствовать обязательно или не должны физически соединяться в течение фазы предварительной обработки, но предпочтительно оказываются на месте, добавляются или присоединяются, по меньшей мере, до и/или в течение фазы SSF. Таким образом, соединительное устройство или средства соединения могут присутствовать временно или необязательно. В другом варианте осуществления соединительное устройство или средства соединения между контейнером и биореактором присутствуют постоянно. В предпочтительном варианте осуществления, щелочь может выбираться из щелочей, которые описаны выше. В другом предпочтительном варианте осуществления, биореактор содержит один или несколько из следующих узлов: вход для автоматического введения щелочи, который контролируется посредством автоматического контроля рН; вход для одного или нескольких ферментов или смеси (смесей) ферментов для одного или нескольких микроорганизмов и/или кислоты или основания, например, серной кислоты или Са(ОН)2, более предпочтительно, 3 М серной кислоты или 20% мас./об. Са(ОН)2; выход для отбора образцов и/или мониторинга; автоматический контроль температуры и/или узел мешалки. В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию реактора по настоящему изобретению, как описано выше, для получения органической кислоты из лигноцеллюлозной биомассы в соответствии со способом по настоящему изобретению. В настоящем документе и в формуле изобретения, глагол "содержать" и его склонения используют в его неограничивающем смысле, чтобы обозначить, что предметы после этого слова включаются, но предметы, не рассмотренные конкретно, не исключаются. В дополнение к этому, упоминание элемента в единственном числе не исключает возможности того, что присутствует несколько элементов, если только контекст не требует четко, чтобы присутствовал один и только один элемент. Таким образом, единственное число обычно означает "по меньшей мере один". Описание фигур Фиг. 1. Схематическое представление одновременного сахарообразования и ферментирования обработанной известью пшеничной соломы с получением молочной кислоты. Фиг. 2. Контроль рН (А) в течение одновременного сахарообразования и ферментирования обработанной известью пшеничной соломы с помощью препарата коммерческого фермента GC 220 и Bacilluscoagulans DSM 23 14 (В). Участки между прерывистыми линиями представляют собой фазу предварительного гидролиза (I), фазу загрузки исходных материалов (II) с контролем рН посредством добавления щелочного LTWS и ферментов, и фазу загрузки (III) с контролем рН посредством добавления суспензии Са(ОН)2. Дополнительный препарат фермента GC220 добавляют в моменты времени, показанные стрелками.(В) Фиг. 3. Профили глюкозы при одновременном сахарообразовании и ферментировании обработанной известью пшеничной соломы посредством препарата коммерческого фермента GC 220 и Bacillus coagulans DSM 2314. Участки между прерывистыми линиями представляют собой фазу предварительного гидролиза (I), фазу загрузки исходных материалов (II) и фазу загрузки (III). Дополнительный препарат фермента GC220 добавляют в моменты времени, показанные стрелками. Фиг. 4. Нерастворимая фракция и гидролизованная растворимая фракция(г) (вычисленные по разности между начальными количествами и анализируемыми количествами нерастворимых веществ) полисахарида глюкана (А), ксилана (В) и арабинана (С) в различные моменты времени в течение одновременного сахарообразования и ферментирования обработанной известью пшеничной соломы. Фигура также представляет процент полисахарида, гидролизованного с получением растворимых про-8 016378. Столбики ошибки обозначают отклонения для анализа по двум измерениям. Примеры Пример 1. Исходные материалы и предварительная обработка. Пшеничную солому выбирают в качестве модельных исходных материалов лигноцеллюлозы и покупают на ферме на Северо-востоке Нидерландов. Пшеничную солому сушат на воздухе (89,5%(масс/масс) сухого вещества) и измельчают через 2-мм сито. Предварительную обработку известью осуществляют посредством заполнения двух 15-л миксеров (Terlet, The Netherlands), обоих, 1650 г измельченной пшеничной соломы, 13 кг водопроводной воды и 165 г гидроксида кальция. Эту суспензию пшеничной соломы нагревают и выдерживают при 85 С в течение 16 ч при непрерывном перемешивании при 30 об/мин. Затем суспензию обработанной известью пшеничной соломы (LTWS) охлаждают до 30 С,дегидратируют посредством помещения LTWS в хлопковый мешок, и прессования суспензии с использованием ручного поршневого пресса при давлении до 9,7 кг/м 2. После дегидратирования, получаютLTWS в количестве 11,45 кг со средним содержанием сухого вещества 27,0% (масс/масс) и рН 11,8, и она служит как субстрат для дальнейших экспериментов. Химическую композицию LTWS определяют, как описано van den Oever et al. (Van den Oever et al (2003) J. Mater. Sci. 38:3697-3707). Пример 2. Получение фермента. Для этого исследования используют препарат фермента GC 220 (Genencor-Danisco, Rochester, USA),содержащий активность целлюлазы, целлобиазы и ксиланазы 116, 215 и 677 ед./мл, соответственно,(Kabel et al (2006) Biotechnol. Bioeng. 93(1) : 5663). Препарат имеет удельный вес 1,2 г/мл и содержит 4,5 мг/мл глюкозы, 2,9 мг/мл маннозы и 0,8 мг/мл галактозы. Пример 3. Микроорганизм и предварительное культивирование. Штамм бактерий Bacillus coagulans DSM 2314 (доступный от DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrabe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) используют как микроорганизм, продуцирующий молочную кислоту. Бактериальные клетки поддерживают в 10%(мас./мас.) глицериновом исходном растворе и хранят при -80 С. Химикалии, если не указано иного, покупают от Merck (Darmstadt, Germany). Планшеты с гельритом приготавливают с помощью среды, содержащейCaCl22H2O, 0,1 г. Глюкозу и гельрит растворяют в исходном растворе А (сконцентрированном в 4 раза). рН этого исходного раствора доводят до 6,4 с помощью 2 М хлористо-водородной кислоты и кипятят его в автоклаве в течение 15 мин при 125 С. Остальные питательные вещества растворяют в исходном растворе В (сконцентрированном в 1,33 раза), который также доводят до рН 6,4 с помощью 2 М хлористоводородной кислоты, но стерилизуют на фильтре (фильтр из ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм,Minisart, Sartorius). После стерилизации, приготавливают среду посредством объединения исходных растворов А и В и заливают планшеты с гельритом. Бактерии культивируют на планшетах с гельритом в течение 48 ч при 50 С. Изолированную колонию используют для засева 100 мл бульона со сходной композицией и препарата, как описано выше, однако без добавления гельрита. Культуру инкубируют статически в течение 24 ч при 50 С, и она служит в качестве инокулума для 1400 мл бульона. Эту культуру также инкубируют статически в течение 12 ч при 50 С, и она служит как 10% (об./об.) предварительная культура для экспериментов SSF. Пример 4. Одновременное сахарообразование и ферментирование.SSF осуществляют для LTWS в 20 л ферментере (Applikon, Schiedam, The Netherlands) при контроле рН и температуры (биоконтроллер ADI 1020) . В начале SSF, ферментер заполняют 6,0 кг водопроводной воды и 1400 г дегидратированной LTWS с содержанием DM (сухого вещества) 27,0% (мас./мас.). Затем к суспензии LTWS добавляют следующие питательные вещества: экстракт дрожжей, 150 г (Duchefa);(NH4)2HPO4, 30 г; (NH4)2SO4, 52,5 г; MgCl26H2O, 0,3 г и CaCl22H2O, 1,5 г. Затем суспензию LTWS нагревают до 50 С и доводят рН до 6,0 с помощью 101 г 3 М серной кислоты (30 г H2SO4). Способ SSF преобразования LTWS в молочную кислоту состоит из трех фаз; I) фазы предварительного гидролиза предварительно загруженной LTWS, II) фазы загрузки исходных материалов с автоматическим введением LTWS из шнекового подающего устройства и III) фазы загрузки с контролем рН с помощью суспензии гидроксида кальция и без введения LTWS. Схематическое представление экспериментальной установки показано на фиг. 1. Предварительный гидролиз инициируют посредством добавления 40 мл препарата фермента (88 мг фермент/г DM субстрата) к суспензии LTWS, и его инкубирования в течение двух часов при 50 С при непрерывном перемешивании при 250 об./мин. Фазу загрузки исходных материалов инициируют посредством добавления в ферментер 1500 мл предварительной культуры В.coagulans DSM 2314. Молочную кислоту, производимую бактериями, нейтрализуют посредством автоматического добавления 8623 г дегидратированной LTWS (DM 27,0%) в ферментер через подающее устройство (K-Tron Soder Feeders, Canada) и регулируют посредством рН среды, которую устанавливают при 6,0. В течение фазы загрузки исходных материалов, препарат фермента в количестве 280 мл (общая-9 016378 загрузка фермента 98 мг/г DM субстрата) добавляют в ферментер пропорционально скорости добавленияLTWS. В течение фазы загрузки, рН контролируют при 6,0 посредством добавления 20,0% (мас./об.) суспензии гидроксида кальция. Извлекают образцы для анализа сухого вещества, субстрата и побочных продуктов. Пример 5. Аналитические методы Для анализа мономерных Сахаров, образцы ферментационного бульона центрифугируют (3 мин при 17400 г), рН супернатанта доводят до 5,0 с помощью карбоната бария, используя индикатор рН (бромфенол голубой) с последующим фильтрованием жидкости. Анализ осуществляют с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии с использованием колонки Carbopack PA1 (температура колонки 30 С) и импульсного амперометрического детектора (ED50)(Dionex, Sunnyvale, CA). Перед инжекцией систему уравновешивают с помощью 25,5 мМ NaOH в течение 10 мин при скорости потока 1,0 мл/мин. Для разделения мономерных сахаров при инжекции подвижную фазу заменяют на деионизованную воду в течение 30 мин. Добавление гидроксида натрия после выхода из колонки используют для детектирования нейтральных мономерных сахаров. Определение растворимых олигомерных сахаров осуществляют с помощью центрифугирования в течение 5 мин при 3000 об./мин (Centaur 2, Beun de Ronde, The Netherlands) предварительно взвешенных образцов и сушки вымораживанием супернатанта в течение ночи. Лепешку взвешивают, гидролизуют с помощью серной кислоты и определяют нейтральные мономерные сахара в соответствии со способом,как описано van den Oever et al. (Van den Oever et al (2003) J. Mater. Sci. 38:3697-3707). Для вычислений,применяют среднюю молекулярную массу олигомеров от глюкана и ксилана 166 и 132 г/мл, соответственно, что приводит к коэффициенту гидролиза 1,08 и 1,14, соответственно. Для анализа нерастворимых полимерных сахаров, образцы по 25 г центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об./мин (Centaur 2, Beun de Ronde, The Netherlands), супернатант удаляют и лепешку промывают посредством повторного суспендирования в 25 мл свежей деминерализованной воды, после стадии центрифугирования в течение 5 мин при 3000 об./мин (Centaur 2, Beun de Ronde, The Netherlands). Последовательность повторного суспендирования и центрифугирования повторяют три раза. После последнего удаления супернатанта, лепешки сушат вымораживанием в течение ночи. Лепешки взвешивают(значения используют для вычисления количества сухого вещества (DM, полимерный материал гидролизуют с помощью серной кислоты и нейтральные сахара анализируют в соответствии со способом, как описано van den Oever et al. (Van den Oever et al (2003) J. Mater. Sci. 38:3697-3707). Для вычисления применяют молекулярную массу глюкана и ксилана 162 и 132 г/моль, соответственно, что приводит к получению коэффициента гидролиза полимера с получением мономера 1,11 и 1,14, соответственно. Анализ органических кислот осуществляют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления в соответствии с процедурой, описанной Maas et al. (Maas et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:861-868). Хиральную чистоту (%) молочной кислоты определяют с помощью дериватизации всех лактатов с использованием метанола, после чего оба энантиомера метиллактата разделяют на хиральной газохроматографической колонке и детектируют с использованием пламенно-ионизационного детектора. Хиральную чистоту выражают как площадь пика главного энантиомера, деленную на сумму площадей пиков обоих энантиомеров. Пример 6. Вычисления. Теоретическое максимальное производство молочной кислоты(LAtheor.max (г) ) вычисляют в соответствии со следующим уравнением [Уравнение 1]. Где DMsubstrate = общее количество сухого вещества субстрата LTWS (г) ; Fpolysacch = доля полисахаридов по отношению к субстрату (г/г) ; HFmonosacch/polysacch = коэффициент гидролиза полисахаридов,включение воды дает 1,11 г гексозы из 1,0 0 г глюкана и 1,14 г пентозы из ксилана и арабинана (г/г), и FF= коэффициент ферментирования, 1,0 0 г молочной кислоты на г мономерного сахара. Эффективность ферментативного гидролиза (%, мас./мас.) относится к количеству гидролизованных полисахаридов (г) (вычисляемому по разности между начальными количествами и анализируемыми количествами нерастворимых продуктов), деленному на количество полисахаридов (г), изначально присутствующих в субстрате. Эффективность ферментирования (%, мас./мас.) выражается как количество полученной молочной кислоты (г), деленное на количество мономерных сахаров (г), потребляемых бактериями. Общую эффективность SSF (%, мас./мас.) вычисляют с помощью количества полученной молочной кислоты (г), деленного на теоретическое максимальное количество молочной кислоты (г), определенное, как описано в уравнении 1. Пример 7. Одновременное сахарообразование и ферментирование LTWS с получением молочной кислоты. Композиция полисахаридов обработанной известью пшеничной соломы (LTWS) состоит главным образом из глюкана, ксилана и арабинана, 33,0, 19,0 и 2,0% (мас./мас.), соответственно, в то время как остальная масса состоит из лигнина, золы, экстрагируемых веществ и уроновых кислот. Некоторые из растворимых компонентов пшеничной соломы частично удаляются посредством разделения твердые- 10016378 продукты/жидкость (дегидратирования) LTWS. Настоящее исследование сосредотачивается на преобразовании глюкана, ксилана и арабинана, которые являются главными полисахаридами, присутствующими в LTWS, и составляют до 99,8% (мас./мас.) от полимерных сахаров в целом. Предыдущая работа показала, что препарат целлюлазы GC 220, используемый для сахарообразования из полисахаридов, функционирует оптимально при 50 С и рН 5,0 (рукопись направлена в печать), в то время как условия роста дляBacillus coagulans DSM 2314 представляют собой 54 С и рН 6,5 (WO 2004/063382). В настоящем исследовании, как ферментативный гидролиз, так и ферментирование происходит одновременно, в одном и том же реакторе, в компромиссных условиях, которые устанавливаются при 50 С и рН 6,0.SSF LTWS с получением молочной кислоты исследуют в 20 л контролируемом перемешиваемом ферментере. Предыдущие результаты показывают, что когда этот способ осуществляют без предварительного гидролиза начального количества LTWS, концентрация мономерных сахаров является низкой и приводит, по этой причине, к относительно низкому производству молочной кислоты. Как следствие,скорость добавления исходных материалов щелочного субстрата для нейтрализации образующейся молочной кислоты является низкой (результаты не показаны). Чтобы начать ферментирование с достаточным начальным количеством ферментируемых сахаров (2 г/л), вводят предварительный гидролиз 378 гLTWS и препарат фермента (88 мг на г DM LTWS) в приблизительно 6 литровый объем при рН 6,0 в течение двух часов. Это приводит к получению концентраций глюкозы, ксилозы и арабинозы 2,0, 0,4 и 0,3 г/л, соответственно (фиг. 3 А). Вторую фазу (II) инициируют посредством введения 1500 мл предварительной культуры В. coagulans DSM 2314. Незначительное количество молочной кислоты, производимой в предварительной культуре, вызывает небольшое уменьшение рН и автоматически нейтрализуется посредством добавленияLTWS (фиг. 2 А, В). После фазы задержки в течение четырех часов, концентрация растворенного кислорода быстро уменьшается от 100% до условий с ограничением по кислороду ниже 1% (результаты не показаны). В этот момент присутствует концентрация глюкозы, ксилозы и арабинозы 3,3, 0,7 и 0,3 г/л,соответственно (фиг. 3 А). Эти сахара потребляются одновременно, при этом глюкоза расходуется быстрее, чем ксилоза и арабиноза. Одновременно с потреблением этих мономерных сахаров образуется молочная кислота, которая нейтрализуется посредством автоматического добавления щелочной LTWS. Посредством добавления щелочного субстрата в течение фазы загрузки исходных материалов, рН поддерживается при 6,0 с точностью при 6,00,1 (фиг. 2 А, В). В конце фазы II, в ферментер добавляют дегидратированную LTWS в общем количестве 10023 г (2706 г DM LTWS) и 320 мл препарата фермента. Детектируется концентрация молочной кислоты 20,5 г/л супернатанта (фиг. 3 В), соответствующая 342 г молочной кислоты в целом. Хиральную чистоту L(+) молочной кислоты определяют как 99,4%, что близко к величине, полученной с помощью ксилозы как единственного источника углерода (WO 2004/063382). В конце фазы I, в среде детектируется низкая концентрация уксусной кислоты, которая увеличивается до 1,5 г/л в течение фазы II, но остается постоянной в течение фазы III (результаты не показаны). Это указывает на то, что уксусная кислота вероятнее всего не является продуктом ферментирования, образующимся с помощью В. coagulans. Уксусная кислота может высвобождаться при солюбилизации и гидролизе гемицеллюлозы в течение химической предварительной обработки (Palmqvist et al. (1999) Biotechnol. Bioeng. 63 (1) : 4655). С помощью процедуры дегидратации LTWS, часть уксусной кислоты легко отделяется от субстрата посредством удаления выжатой воды. Очевидно, остальное количество уксусной кислоты вводится в ферментер вместе с субстратом. Также, в ферментационном бульоне детектируются микроскопические следы других органических кислот, таких как янтарная кислота и муравьиная кислота (0,5 г/л). Фазу III инициируют посредством замены контроля рН от добавления щелочной LTWS на суспензию 20%(мас./об.) гидроксида кальция. Для поддержания рН при 6,0, добавление суспензии гидроксида кальция осуществляют относительно быстро, но через несколько часов переходят, однако, на более низкую скорость добавления, что указывает на уменьшение объемного производства молочной кислоты (фиг. 2 В,3 В). Для исключения ограничения (например, посредством дезактивации) ферментов, дополнительную дозу препарата фермента (80 мл) добавляют в ферментер после 23,5 ч инкубирования. Это немедленно приводит к небольшому ускорению скорости добавления гидроксида кальция, указывая на увеличение производства молочной кислоты и на ограничение ферментативной активности (фиг. 3 В). Тем не менее,через 29,7 ч инкубирования, понижение скорости добавления гидроксида кальция наблюдается опять. По этой причине, добавляют вторую дополнительную дозу препарата фермента (240 мл) и это приводит на этот раз к небольшому аккумулированию глюкозы и ксилозы, 1,5 и 1,0 г/л (фиг. 3 А), соответственно,указывая на то, что вместо ферментативного гидролиза скорость ограничивается микробным преобразованием. После 32 ч инкубирования, получают концентрацию молочной кислоты 37,1 г/л, с хиральной чистотой L(+)-молочной кислоты 99,4%. Продолжение способа SSF до полного периода инкубирования 55 ч приводит к небольшому увеличению концентрации молочной кислоты, 40,7 г/л супернатанта (37,8 г молочной кислота/кг ферментационного бульона), при общем объемном производстве молочной кислоты 0,74 г/л/ч. На этой стадии анализ показывает хиральную чистоту L(+)-молочной кислоты 97,2%. Это небольшое понижение чистоты молочной кислоты, вероятно, является результатом инфицирования другими нежелательными микроорганизмами, продуцирующими молочную кислоту. Поскольку используе- 11016378 мый субстрат не является стерильным, а также химическая предварительная обработка и ферментирование осуществляются в открытой системе при нестерильных условиях, возможно микробное загрязнение в течение способа SSF. Пример 8. Эффективность преобразования. Эффективность ферментативного гидролиза полимерного материала, присутствующего в LTWS,показана на фиг. 4. Нерастворимую полимерную фракцию определяют в различные моменты времени в течение эксперимента SSF. В конце предварительного гидролиза (2 ч) 37 8 г LTWS, 36% нерастворимого глюкана (фиг. 4 А), 55% ксилана (фиг. 4 В) и 62% арабинана (фиг. 4 С) преобразуются в растворимые сахариды, включая мономерные сахара и олигомерные сахара. После фазы загрузки исходных материалов(13 ч), добавление 2706 г LTWS приводит к преобразованию 42% глюкана, 57% ксилана и 63% арабинана в продукты, включающие растворимые сахариды и молочную кислоту. Между 13 и 32 часами инкубирования, наблюдают дополнительный гидролиз полимерных сахаров. Однако в течение последних 23 ч SSF, осуществляется небольшой гидролиз полисахаридов и это соответствует уменьшению производства молочной кислоты в течение этой фазы. Через 55 ч, 398 г глюкана, 130 г ксилана и 11 г арабинана по-прежнему присутствуют как нерастворимый полимерный материал. Для этих значений, эффективность гидролиза начального глюкана, ксилана и арабинана, присутствующих в LTWS, вычисляются как 55, 75 и 80%, соответственно. Мономерные сахара, получаемые из LTWS, частично преобразуются в молочную кислоту (711 г) под действием В. coagulans и составляют 81% (мас./мас.) теоретического максимума, указывая на образование других продуктов, таких как микробная биомасса и двуокись углерода. Общий выход преобразования, равный 43% (мас./мас.) от теоретического максимума, вычисляется в соответствии с уравнением 1. Судьба полисахаридов, изначально присутствующих в LTWS, после 55 ч инкубирования, показана в таблице I. Часть полисахаридов, присутствующих в LTWS, остаются как нерастворимые полисахариды (37% мас./мас.) в то время как малая их часть преобразуется в растворимые олигомерные (5% мас./мас.) и мономерные (3% мас./мас.) сахара. Другая часть начальных полисахаридов, присутствующих в LTWS, не извлекается в форме сахаридов или молочной кислоты и, по этой причине описываются как 'неучтенные'. Таблица. Судьба полисахаридова, изначально присутствующих в обработанной известью пшеничной соломе, после 55 ч одновременного сахарообразования и ферментирования. Представленные значения представляют собой средние значения на основе парных аналитических измерений. глюкан, ксилан и арабинан в целом; часть начальных полисахаридов, остающихся присутствующими как нерастворимые полиса с часть начальных полисахаридов не извлекается и по этой причине обозначается как "неучтенные". Пример 9. Нейтрализация кислоты с помощью щелочного субстрата. Молочную кислоту (342 г), произведенную в течение фазы загрузки исходных материалов (II), нейтрализуют с помощью предварительно обработанной щелочью пшеничной соломы. В течение этой фазы в ферментер добавляют некоторое количество LTWS, 2328 г. Вместе с этим субстратом в ферментер добавляют некоторое количество гидроксида кальция, 230 г, и его учитывают в отношении 0,67 г гидроксида кальция на г молочной кислоты. Молочную кислоту (369 г), произведенную в течение фазы загрузки (III), нейтрализуют с помощью 163 г гидроксида кальция, что дает отношение 0,44 г молочной кислоты на г гидроксида кальция. Обсуждение Лигноцеллюлозные исходные материалы рассматриваются как потенциальные привлекательные субстраты для получения большого количества химикалиев. Предварительная обработка биомассы является необходимой для разламывания лигноцеллюлозной матрицы, ферментативный гидролиз является необходимым для гидролиза полимерных углеводов. Предварительная обработка известью, как показано, усиливает ферментативную перевариваемость полисахаридов, присутствующих в лигноцеллюлозах (Chang et al (1998) Appl. Biochem. Biotechnol. 74: 13-5159; Kaar and Holtzapple (2000)Biomass and Bioenergy 18: 1-899), и приводит, по сравнению с другими способами предварительной обработки, к небольшому образованию ингибиторов. Однако перед ферментативным гидролизом, главным является доведение рН до уровня, оптимального для ферментативной активности. В настоящем исследовании, понижение рН посредством промывки или нейтрализации делается ненужным посредством ис- 12016378 пользования щелочного характера LTWS для нейтрализации молочной кислоты, производимой посредством микробного ферментирования в течение способа SSF. Результаты показывают, что самая большая часть полисахаридов в LTWS ферментативно преобразуется, и получаемые сахара ферментируются одновременно, в основном, с получением молочной кислоты, под действием В. coagulans DSM 2314. Между 10 и 30 ч инкубирования, бактерии используют мономерные сахара, как только они появляются в среде, что приводит к установлению относительно низких концентраций мономерных сахаров (2 г/л). Это показывает, что в течение этого периода, ферментативный гидролиз является стадией, контролирующей скорость. Самое высокое производство молочной кислоты наблюдают в течение фазы загрузки исходных материалов и начальных часов фазы загрузки, и оно быстро уменьшается приблизительно после 20 ч инкубирования, как показано на фиг. 3 В. Дополнительное добавление препарата фермента показывает небольшое улучшение объемного производства молочной кислоты, но в пределах нескольких часов оно опять возвращается к относительно низкой скорости производства. Второе дополнительное добавление фермента не влияет значительно на производство молочной кислоты (фиг. 3 В). Это добавление новых ферментов приводит к самому умеренному высвобождению гемицеллюлозных сахаров (ксилозы, арабинозы), но дополнительного гидролиза глюканов не происходит. Это показывает, что остальные глюканы являются слишком неподатливыми или недоступными для дальнейшего гидролиза, что приводит к уменьшению производства молочной кислоты. Другое возможное объяснение уменьшения производства молочной кислоты представляет собой ингибирование ферментов и/или бактерий посредством увеличения концентрации молочной кислоты. Концентрацию молочной кислоты 40,7 г/л супернатанта (37,8 г молочной кислоты/кг ферментационного бульона) с относительно высокой хиральной чистотой определяют после 55 ч инкубирования, что соответствует общему выходу молочной кислоты 43% от теоретического максимума. Кроме того, определяют эффективности как ферментативного сахарообразования, так и ферментирования. Эти вычисления показали, на основе анализа остатков в конце способа SSF (55 ч), что ферментативно гидролизуется 55% глюкана, 75% ксилана и 80% арабинана, присутствующих в LTWS, что хорошо согласуется с результатами, полученными ранее. Для улучшения выхода необходимо уменьшить неподатливость или улучшить доступность полимерных сахаров в LTWS посредством оптимизации процедуры предварительной обработки. Концентрации растворимых моносахаридов и олигосахаридов в среде являются относительно низкими, что может ожидаться в способе SSF. Определяют выход ферментирования 81%, и это чуть лучше, чем результаты, полученные Otto (выше), который сообщал о получении 35 г/л молочной кислоты из 50 г/л ксилозы как единственного источника углерода. Поскольку других растворимых продуктов ферментирования не детектируется, остальные 19% полученных из LTWS мономерных Сахаров,скорее всего, преобразуются в бактериальную биомассу и некоторое количество двуокиси углерода в течение аэробной части ферментирования. В течение фазы загрузки исходных материалов (II) возможна компенсация уменьшения рН, вызываемого производством молочной кислоты, посредством добавления щелочных исходных материалов,показывая, что обработка известью может хорошо сочетаться с получением широкого набора органических кислот из лигноцеллюлозной биомассы. В течение этой фазы, отношение гидроксида кальция в добавляемой LTWS по отношению к получаемой молочной кислоте определяют как 0,67 г/г. Теоретическая стехиометрическая нейтрализация 1,00 г молочной кислоты требует 0,41 г гидроксида кальция. По этой причине, только 61% гидроксида кальция, изначально добавляемого к пшеничной соломе, используют для нейтрализации молочной кислоты. С другой стороны, в течение фазы загрузки (III), вычисляют отношение щелочь/кислота, равное 0,44 г/г, соответствующее 93% добавленной суспензии гидроксида кальция, используемой для нейтрализации молочной кислоты. Низкая эффективность добавления гидроксида кальция, добавляемого вместе с LTWS для нейтрализации молочной кислоты в течение фазы II,имеет три возможных объяснения. Во-первых, часть гидроксида кальция может использоваться в течение химической предварительной обработки пшеничной соломы, такой как нейтрализация уксусной кислоты или других органических кислот, и/или на необратимое связывание с лигнином. Во-вторых, гидроксид кальция мог бы медленно высвобождаться из нерастворимых волокон пшеничной соломы и по этой причине мог бы частично использоваться для нейтрализации молочной кислоты в фазе загрузки исходных материалов. Наконец, кроме производства молочной кислоты, другие реакции подкисления могут вносить вклад в уменьшение рН и по этой причине требовать щелочного субстрата. Например, потребление и диссоциация источника азота аммония микроорганизмом в виде аммиака и протонов (Guebel (1992)Biotechnol. L et al. 14(12): 1-19398). Результаты настоящего сообщения показывают, что возможно использование лигноцеллюлозных материалов для получения молочной кислоты. Лигноцеллюлозная биомасса является относительно недорогим субстратом, и это положительно влияет на стоимость исходных материалов для получения молочной кислоты. Тем не менее, в сравнении с традиционными относительно "чистыми" исходными материалами с хорошо определенной композицией, использование гетерогенных лигноцеллюлозных субстратов потребует более интенсивной последующей переработки (DSP) для извлечения и очистки молочной кислоты из сложного ферментационного бульона. Стоимость исходных материалов и затраты на работуDSP вносят значительный вклад в общие затраты на получение молочной кислоты (Akerberg and Zacchi(2000) Bioresour. Technol. 75: 119-126). Перевесит ли уменьшение стоимости используемых лигноцеллюлозных исходных материалов потенциальное увеличение затрат на DSP, к настоящему времени не анализировалось. В итоге, обработанная известью пшеничная солома преобразуется в L(+)-молочную кислоту под действием В. coagulans в течение способа одновременного сахарообразования и ферментирования в 20 л лабораторном масштабе. Пентозные и гексозные сахара, полученные из полимерного материала, одновременно используются В. coagulans, что приводит к получению конечной концентрации молочной кислоты 40,7 г/л супернатанта, что соответствует 43% (мас./мас.) от теоретического выхода. Насколько известно авторам, это первое доказательство того, что способ, имеющий объединенные щелочную предварительную обработку лигноцеллюлозной биомассы и контроль рН при ферментировании органической кислоты, приводит к значительному сокращению потребления извести и к исключению необходимости в рециклировании извести. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения органической кислоты как продукта ферментирования из лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:a) предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы щелочным агентом с получением предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы с рН в пределах между приблизительно 8,0 и приблизительно 14,0;b) одновременного сахарообразования и ферментирования (SSF) предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы со стадии а) в биореакторе, при этом уменьшение рН, вызываемое образованием органической кислоты, компенсируется добавлением предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы, необязательно, в сочетании со щелочью, для адаптирования рН приблизительно ниже 8,0 и/или для поддержания рН при конкретном значении рН ниже 8,0, делая возможной оптимальную активность микроорганизма (микроорганизмов) и/или добавляемых ферментов; иc) необязательного извлечения продукта ферментирования. 2. Способ по п.1, в котором SSF на стадии b) включает стадии:i) необязательной фазы предварительного гидролиза;ii) ферментативного гидролиза с помощью гидролитичесого фермента для получения ферментируемых сахаридов иiii) микробного ферментирования с использованием одного или нескольких микроорганизмов, которые способны преобразовывать сахариды со стадии ii) в продукт ферментирования. 3. Способ по п.1 или 2, в котором SSF на стадии b) работает в режиме хемостата, в котором предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу используют как питательное вещество. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу добавляют в SSF со стадии b) способом загрузки исходных материалов. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором предварительная обработка лигноцеллюлозной биомассы предваряется механическим измельчением лигноцеллюлозной биомассы или объединяется с ним, и/или встраивается в него. 6. Способ по п.5, в котором механическое измельчение выбирают из группы, состоящей из помола,механической переработки и экструзии. 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором предварительно обработанную щелочью лигноцеллюлозную биомассу перед SSF подвергают воздействию одной или нескольким из следующих стадий:c) стадии обезвоживания. 8. Способ по п.7, в котором обезвоживание осуществляют посредством использования фильтрования, прикладывая при этом давление к предварительно обработанной биомассе, где прикладываемое давление находится в пределах между 0 и приблизительно 100 бар. 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором температура в течение SSF находится в пределах между приблизительно 20 и приблизительно 80 С. 10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рН в течение SSF контролируется в пределах между приблизительно 2,0 и приблизительно 10,0. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рН в течение SSF контролируют посредством добавления предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы и щелочи. 12. Способ по п.11, в котором SSF включает фазу предварительного гидролиза, фазу загрузки исходных материалов с контролем рН посредством добавления предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы и фазу загрузки с контролем рН посредством добавления щелочи. 13. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором лигноцеллюлозную биомассу выбирают из группы, состоящей из травы, дерева, багассы, соломы, бумаги, растительного материала и их сочета- 14016378 ний. 14. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором щелочной агент, используемый на стадии а), выбирают из группы, состоящей из гидроксида кальция (Са(ОН)2), оксида кальция (СаО), аммиака(NH3), гидроксида натрия (NaOH), карбоната натрия, гидроксида калия (KOH), мочевины и их сочетаний. 15. Способ по любому из пп.2-14, в котором гидролитический фермент со стадии b) выбирают из группы, состоящей из препаратов целлюлазы, препаратов гемицеллюлазы, целлобиазы, препаратов ксиланазы, амилазы и пектиназы. 16. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором органическую кислоту выбирают из группы, состоящей из молочной кислоты, лимонной кислоты, итаконовой кислоты, янтарной кислоты,фумаровой кислоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, уксусной кислоты, глютаминовой кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, глюконовой кислоты и их сочетаний. 17. Способ по любому из предыдущих пунктов, где микроорганизм представляет собой бактерии,грибки, археи или водоросли. 18. Способ по п.17, в котором микроорганизм выбирают из Acetobacterspecies, Bacillus coagulans, В.racemilacticus, В. laevolacticus, Corynebacteriunglutamicuni Escherichiacoll, Gluconobactespecies Pseudomonas speciedactic acid bacteria, Rhizopus oryzae, Aspergillumiger, Aspergilluterreus и Saccharomyceserevisiae. 19. Реактор, содержащий контейнер для щелочной предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы, соединенный с биореактором для одновременного сахарообразования и ферментирования(SSF) предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы, где реактор предназначается для использования в способе по любому из пп.1-18, и где: 1) контейнер содержит:iii) необязательные средства для предварительного экстрагирования растворимых компонентов из лигноцеллюлозной биомассы; 2) биореактор содержит:i) средства автоматического контроля рН иii) вход для предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы из контейнера,который контролируется с помощью средства автоматического контроля рН. 20. Реактор по п.19, в котором средства соединения между контейнером и биореактором представляют собой насос, предпочтительно шнековое подающее устройство, чтобы сделать возможным автоматическое введение предварительно обработанной щелочью лигноцеллюлозной биомассы в биореактор. 21. Реактор по п.19 или 20, в котором биореактор содержит один или несколько из следующих узлов: 1) вход для автоматического введения щелочного агента, который контролируется с помощью автоматического контроля рН; 2) вход для фермента, микроорганизма и/или кислоты или основания; 3) выход для отбора образцов и/или мониторинга и/или 4) автоматический контроль температуры; 5) узел мешалки. 22. Применение реактора по любому из пп.19-21 для получения органической кислоты из лигноцеллюлозной биомассы способом по пп.1-18.