Применение 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты

Данное изобретение относится к применению 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний печени, преимущественно хронических заболеваний печени. 014077 Данное изобретение относится к новым применениям 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты (норУДХК). Урсодеоксихолевая кислота (УДХК), встречающаяся в природе желчная кислота, которая может быть обнаружена в малых количествах в желчи и крови людей, является широко применимым лекарственным препаратом для лечения болезней печени, при этом одним из наиболее важных областей назначения УДХК является растворение желчных камней и лечение первичного билиарного цирроза (ПБЦ) первичного склерозирующего холангита (ПСХ). УДХК явялется встречающейся в природе желчной кислотой с цитопротективным, мембраностабилизирующим и антиапоптозным эффектами. Более того,УДХК снижает в сыворотке уровни билирубина, трансаминаз и алкалиновой фосфатазы как маркера холестаза (TraunerGraziadei 1999, BeuersPaumgartner 2002). Исследования УДХК на пациентах, страдающих от заболеваний печени, особенно ПБЦ пациентов,показали, что введение УДХК увеличивает скорость оттока желчи от гепатоцитов, тем самым борясь с холестазом и разбавляя и ингибируя токсические желчные кислоты, которые главным образом отвечают за повреждение гепатоцитов. Более того, УДХК также способна ингибировать иммунный ответ в печени,снижая иммунологическое повреждение желчных протоков и печени. УДХК, как отмечалось выше, является постоянно применяемой для лечения ПСХ и ПБЦ. ПСХ, который поражает главным образом мужчин, является воспалительным заболеванием желчных протоков, которое может приводить к холестазу (блокированию транспорта желчи к желчному пузырю). Блокирование желчных протоков приводит к аккумулированию желчной кислоты в печени и желчи, повреждениям печени и в конечном итоге приводит к печеночной недостаточности. Большинство пациентов, страдающих от ПСХ, демонстрируют также хроническое воспаление толстой кишки (например, язвенный колит). Воспаление желчного протока может также поражать окружающую ткань печени и приводить к рубцеванию малых или больших желчных протоков, которое будет приводить к сужению желчных путей. Следовательно, такое сужение приводит к нарушенной секреции желчной жидкости,приводящее к разрушению печени. Вследствие этого может развиться цирроз печени и холангиокарцинома. Также ПБЦ представляет собой воспалительное заболевание желчных протоков, которое повреждает вначале более мелкие желчные протоки и которое, в конечном счете, приводит к циррозу печени. В отличие от ПСХ, ПБЦ поражает индивидуумов женского пола и не коррелирует с воспалительными заболеваниями толстой кишки. Наиболее эффективный способ лечения ПБЦ и ПСХ представляет собой трансплантацию печени. До сегодняшнего момента только перспективное фармакологическое лечение обоих заболеваний включало применение УДХК. В настоящее время УДХК представляет собой только лекарственное средство,одобренное для лечения холестатичеких заболеваний печени (PaumgartnerBeuers 2002). УДХК применяется при ПБЦ в дозе 12-15 мг/кг/день (в общем, 1000-1500 мг), при введении перорально один или два раза в день. Это применение одобрено Управлением по продовольствию и лекарствам США. Колхицин добавляли к лечению УДХК. Колхицин назначали в дозе 0,6 мг дважды в день из-за его потенциального противовоспалительного и антифиброзного эффектов. Некоторые исследования показывали умеренные улучшения в тестах на печени с применением колхицина. Тем не менее, не было обнаружено преимуществ по отношению к гистологии печени или выживания больных ПБЦ. Метотрексат, иммуносупрессорный агент, является другим лекарственным препаратом, который был протестирован в ПБЦ. Он вводился в дозе 15 мг в неделю. В небольших исследованиях метотрексат облегчал симптомы, печеночные анализы крови и изменения гистологии при применении на протяжении нескольких лет. Тем не менее,метотрексат вызывает тяжелые побочные эффекты, включая супрессию костного мозга, ухудшение заболевания печени и потенциально летальный фиброз легких. УДХК имеет ограниченную эффективность при ПСХ и не показала пролонгированной выживаемости (без от трансплантации печени TraunerGrazi- adei 1999, PaumgartnerBeuers 2002). Текущие исследования тестируют, может ли высокая доза УДХК быть более эффективной. В особенности УДХК снижает риск рака толстой кишки у больных с ПСХ и язвенным колитом. Основываясь на гипотезе, что ПСХ имеет иммунологическую причину, тестировались кортикстероиды и другие иммуносупрессоры. Пероральные кортикостероиды давали начальное улучшение в биохимическом профиле. Тем не менее,отсутствие доказательств о продолжительном преимуществе, а также деминерализация кости, явилось аргументом против применения такого способа лечения. Другие лекарственные средства, такие как азатиоприн, циклоспорин, которые тестировались в комбинации с кортикостероидами и УДХК, никогда не исследовались отдельно в терапии ПСХ. Метотрексат и D-пеницилламин также показали свою неэффективность. Таким образом, фармацевтическая терапия для ПСХ до сих пор нуждается в оптимизации(TraunerGraziadei 1999, BeuersPaumgartner 2002). Эндоскопическое лечение ПСХ пациентов с симптоматическими доминантными стриктурами, камнями в желчном пузыре или инородными веществами рассматривается как существенная альтернатива в дополнении к медицинскому лечению. ПСХ пациенты, подвергающиеся эндоскопическому лечению,имели повышенную выживаемость, которая была намного выше, чем это предполагалось из моделей выживаемости. Ортотопическая трансплантация печени является эффективной терапией для ПСХ и до настоящего-1 014077 времени единственной альтернативой, спасающей жизнь на последней стадии заболевания. После трансплантации, тем не менее, ПСХ имеет тенденцию к рецидиву у 15-30% пациентов, и существует также высокая частота рецидива билиарных стриктур, хронического отторжения и рефлюкс-холангита. К сожалению, применение иммуносупрессоров не улучшает выживаемость и рецидив заболевания. Таким образом, существует неотложная необходимость в эффективном лекарственном лечении, предотвращающем прогрессирование заболевания ПСХ, а также рецидив после трансплантации печени (TraunerGraziadei 1999, BeuersPaumgartner 2002). Хотя УДХК, которая является хорошо переносимой за исключением редких случаев диареи и почесухи (TraunerGraziadei 1999, BeuersPaumgartner 2002), преимущественно использовалась для лечения холестатических заболеваний печени, эффективность УДХК при ПСХ и у пациентов с заболеваниями печени, такими как прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 3, является очень ограниченной (TraunerGraziadei 1999, Jacquemin, Hermans, et al. 1997, Jacquemin 2000, Ismail,Kalicinski, et al. 1999). В европейском патенте ЕР 0652773 В 1 описано применение производных нор-и гомо-желчных кислот, необязательно конъюгированных с таурином, глицином или аланином, в качестве усилителей абсорбции для медикаментов энтеральным или непарэнтеральным путями. Эти производные демонстрировали липофильные и детергентные свойства и не метаболизируются кишечной бактериальной флорой. Европейский патент ЕР 0624595 В 1 раскрывает димерные нор-производные желчных кислот для применения медикамента, особенно подходящего для лечения гиперлипидемии. Вещества, раскрытые в данном патенте, состоят из двух отдельных производных желчной кислоты, которые ковалентно связаны друг с другом. Патент США 4892868 раскрывает 22-метил-нор-урсодеоксихолевую кислоту и 23-метилурсодеоксихолевую кислоту для применения в лечении расстройств гепатобилиарной функции, с отдельной ссылкой на холестерольный метоболизм и продукцию желчи (например, для лечения холестаза). Объект данного изобретения обеспечивает альтернативные фармацевтические агенты для лечения заболеваний печени, преимущественно хронических заболеваний печени, которые являются более эффективными, чем известные лекарства, такие как урсодеоксихолевая кислота, и демонстрируют меньше побочных эффектов, чем метотрексат. Таким образом, данное изобретение относится к применению 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний печени, преимущественно хронических заболеваний печени. Неожиданно обнаружили, что медикамент или фармацевтическая композиция, включающая 24-норурсодеоксихолевую кислоту, С 23 аналог с укороченной боковой цепью встречающейся в природе С 24 желчной кислоты урсодеоксихолевой кислоты (УДХК), и/или ее фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры, может успешно применяться для лечения различных заболеваний печени, потому что эти аналоги влияют на физиологические свойства желчных кислот (Hofmann 1999, Schmassmann, Hofmann, et al. 1990, Yoon, Hagey, et al. 1986, Cohen, Hofmann, et al. 1986). Хотя оба вещества структурно очень похожи, оба вещества демонстрируют различные характеристики при введении млекопитающим(см., например, Yoon YB, Hagey LR, et al., 1986). 24-нор-урсодеоксихолевая кислота, а также ее соли и сложные эфиры приводят к индукции билиарной секреции бикарбонатов, которая разбавляет токсический состав желчи и защищает эпителиальные клетки желчного протока от окислительного стресса, так как бикарбонат является сильным акцептором реактивных видов кислорода. Это приводит к восстановлению барьерной функции холангиоцитов и будет останавливать протекающий перихолагнит и последующий перидуктальный фиброз путем минимизации повреждения клеток желчных протоков в просвете желчного протока. Более того, обнаружено, что 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры имеют также противовоспалительный и антифиброзный эффекты. В отличие от 24-нор-деоксихолевой кислоты и ее солей и сложных эфиров, урсодеоксихолевая кислота улучшает только перидуктальный фиброз лобулярных желчных протоков и увеличивают уровни в сыворотке аланин аминотрансферазы (ALT) и индуцирует инфаркты желчного происхождения. Тем не менее, урсодеоксихолевая кислота не улучшает заболевание малых портоков. Противоположные эффекты обеих желчных кислот в отношении поражения печени могут быть связаны с отличиями в уровне секреции желчи, а именно в том, что 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры стимулируют первичную секрецию протоков, тогда как урсодеоксихолевая кислота стимулирует секрецию канальцев, расположенных выше пораженных протоков. Введение 24-нор-деоксихолевой кислоты и ее солей и сложных эфиров вызывает детоксификацию желчной кислоты путем гидроксилирования, сульфатации и глюкуронидации, приводящих к лучшей растворимости в воде и, таким образом, менее токсичным метаболитам желчной кислоты, которые разбавляют токсичные желчные кислоты в протоковой желчи и вызывают протоковое образование желчи,насыщенной бикарбонатом, который снимает окислительный стресс. Образование желчи, насыщенной бикарбонатом 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и ее солей и-2 014077 сложных эфиров имеет также терапевтические назначения при холангиопатиях человека (например,ПСХ, ПБЦ, хроническое отторжение трансплантата печени, негнойный деструктивный холангит), как холегепатическое шунтирование, приводящее к длительному потоку молекул через эпителий желчных протоков, который помогает управлять токсическим/окислительным стрессом в измененных желчных протоках. Например, сулиндак, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП или NSAID),который также подвергается холегепатическому шунтированию у людей, показал улучшение печеночных ферментов у ПБЦ пациентов с неполным ответом на лечение УДХК. Способы для приготовления 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и ее солей и сложных эфиров известны для специалиста в данной области и могут преимущественно быть приготовленными с помощью способа, описанного в Schteingart CD и Hofmann AF (J. Lip. Res. 29 (1988): 1387-1395). Конечно, лекарственное средство согласно данному изобретению может быть использовано у людей, а также млекопитающих (например, свиньи, лошади, приматов, крупного рогатого скота, кошки,собаки). Заболевание печени, которое должно лечиться лекарственным средством согласно данному изобретению, представляет собой холестатическое заболевание печени, преимущественно первичный склерозирующий холангит (ПСХ), первичный билиарный цирроз (ПБЦ) или прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз, в частности или прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 1, 2 и 3, кистозный фиброз, холестаз, вызванный лекарственным средством, или нехолестатическое заболевание печени, такое как хронический вирусный гепатит (В, С, D), алкогольный и неалкогольный стеатогепатит, аутоиммунный гепатит, гемохроматоз, болезнь Вильсона и дефицит альфа-1 антитрипсина. Более того, лекарство, включающее 24-нор-деоксихолевую кислоту и ее соли, и сложные эфиры, может использоваться для профилактики/химиопрофилактики карциномы печени, преимущественно гепатоцеллюлярной карциномы и холангиокарциномы. Также хроническое отторжение трансплантата и негнойный деструктивный холангит может лечиться указанным лекарственным средством. В особенности заболевания, которые являются результатом или имеют следствием повреждение желчных протоков, могут лечиться лекарственным средством, включающим 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту и ее соли и сложные эфиры. Нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП), такой как ибупрофен, снижает портальное и лобулярное воспаление в печени (которе приведет к перидуктальному фиброзу и протоковой пролиферации) и формирование гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК или НСС) (Pikarsky, Porat, et al. 2004). так как 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры проявляют также противовоспалительные свойства, 24-нор-урсодеоксихолевая кислота может использоваться отдельно или в комбинации с другими противовоспалительными препаратами, такими как НПВП (например, ибупрофен, сулиндак (Bolder, Trang, et al., 1999. Согласно другому преимущественному варианту осуществления данного изобретения заболевание печени представляет собой первичный склерозирующий холангит (ПСХ). Более того, заболевание печени представляет собой преимущественно первичный билиарный цирроз (ПБЦ). 24-норурсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры может применяться особенно для лечения ПСХ и ПБЦ. Лекарственное средство, включающее 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту и/или ее соли или сложные эфиры могут особенно применяться для лечения первичного склерозирующего холангита (ПСХ) и первичного билиарного цирроза (ПБЦ). Согласно преимущественному варианту осуществления данного изобретения 24-норурсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры могут быть сформулированы для перорального или внутривенного введения, где формуляции дополнительно содержат фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители и/или разбавители. Твердые дозированные формы для перорального введения могут включать таблетки, преимущественно шипучие или жевательные таблетки, капсулы, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах, 24-нор-урсодеоксихолевая кислота может смешиваться с обычно применяемыми соединениями, такими как сахароза, маннитол, сорбитол, крахмал и производные крахмала, лактоза, смазывающие вещества (например, стеарат магния), дезинтегранты и буферирующие агенты. Таблетки и пилюли могут также быть приготовлены вместе с энтеросолюбильными покрытиями для того, чтобы предотвратить воздействие на 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту желудочных кислот и ферментов. Как таблетки немедленного высвобождения, эти композиции могут дополнительно содержать микрокристаллическую целлюлозу и/или дикальция фосфат. Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, включающие инертные разбавители, обычно применяемые в области техники, такие как вода. Эти дозированные формы могут содержать микрокристаллическую целлюлозу для придания объема, альгиновую кислоту или натрия альгинат как суспендирующий агент, метилцеллюлозу как усилитель вязкости и подсластители/ароматизаторы. При введении с помощью назального аэрозоля или ингаляции, композиции согласно данному изобретению могут быть приготовлены как растворы в солевом растворе с применением бензилового спирта или других соответствую-3 014077 щих консервантов, стимуляторы абсорбции для усиления биодоступности, фторуглероды и/или другие солюбилизаторы или диспергирующие агенты. Суппозитории для ректального введения 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты могут быть приготовлены путем смешивания соединений или композиций с соответствующим нераздражающим наполнителем, таким как масло какао и полиэтиленгликоли, которые являются твердыми при комнатной температуре, но становятся жидкими при ректальной температуре, из условия, что они будут растворяться в прямой кишке и высвобождать 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту и необязательно другие активные соединения, присутствующие в указанных суппозиториях. Препараты для инъекции, например стерильные инъецируемые водные или масляные суспензии,могут быть также сформулированы согласно известному уровню техники с применением соответствующих диспергирующих агентов, увлажнителей и/или суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может также быть стерильным инъецируемым раствором или суспензией в нетоксическом парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. Среди приемлемых разбавителей и растворителей, которые могут использоваться, вода и изотонический раствор натрия хлорида. Стерильные нелетучие масла также обычно применяются в качестве растворителя или среды суспендирования. Согласно данному изобретению дозированные формы, включающие 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту, могут дополнительно включать типичные наполнители, преимущественно фармацевтически приемлемые соединения органических или неорганических носителей, которые не реагируют с активным соединением. Соответствующие фармацевтически приемлемые носители включают, например, воду,солевые растворы, спирт, масла, преимущественно растительные масла, полиэтиленгликоли, желатин,лактозу, амилозу, стеарат магния, поверхностно-активные вещества, парфюмерное масло, жирнокислотные моноглицериды и диглицериды, жирные кислоты, расторенные в петролейном эфире, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и подобное. Фармацевтические препараты могут быть стерилизованы и, если необходимо, смешаны с вспомогательными агентами, такими как смазочные вещества, консерванты, стабилизаторы, увлажнители, эмульсификаторы, соли для влияния на осмотическое давление,буферы, красители, вкусовые и/или ароматические соединения и подобное, которые не опасно реагируют с активными соединениями. Для парентерального введения отдельные приемлемые разбавители состоят из растворов, преимущественно масляных или водных растворов, а также суспензий, эмульсий или имплантатов. Различные системы доставки являются известными и могут быть использованы для введения 24 нор-урсодеоксихолевой кислоты, включая, например, инкапсулирование в липосомы, эмульсии, микрочастицы, микрокапсулы и микрогранулы (например, европейский патент ЕР 1317925). Необходимая доза может быть введена как одноразовая или в форме длительного высвобождения. Биодоступность 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты может быть увеличена путем микронизации формуляций с применением типичных методик, таких как мелкое дробление, помол и сушка распылением в присутствии приемлемых наполнителей или агентов, таких как фосфолипиды или поверхностноактивные вещества. Согласно изобретению 24-нор-урсодеоксихолевая кислота может быть сформулирована в форму фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира. Фармацевтически приемлемые соли 24-норурсодеоксихолевой кислоты включают преимущественно ионы металлов, в частности соли щелочных металлов, или другие фармацевтически приемлемые соли. Пригодные фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических кислот, таких как хлороводородная,бромоводородная, йодоводородная, азотная, угольная, серная и фосфорная кислота, или органических кислот, таких как алифатического, циклоалифатического, ароматического, гетероциклического, карбонового и сульфонового классов органических кислот, таких как муравьиная, уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, глюконовая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, глюкуроновая, малеиновая, фумаровая, пировиноградная, аспарагиновая, глютаминовая, бензойная, этансульфоновая, оаминобензойная, мендалевая, метансульфоновая, салициловая, р-гидроксибензойная, фенилуксусная,метансульфоновая, бензолсульфоновая, пантотеновая, толуолсульфоновая, 2-гидроксиэтансульфоновая,альгиновая, сульфаниловая, стеариновая, р-гидроксимасляная, циклогексиламиносульфоновая, галактаровая и галактуроновая кислота и подобное. Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли включают металлические соли, приговленные из лития, алюминия, кальция, магния, калия, натрия и цинка, или органические соли, приготовленные из первичных, вторичных и третичных аминов и циклических аминов. Все соли 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты могут быть получены способами, известными из уровня техники (например, путем реакции 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты с соответствующей кислотой или основанием). Сложные эфиры 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты представляют собой нетоксические сложные эфиры, преимущественно алкил сложные эфиры, такие как метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый, изобутиловый или пентиловый сложные эфиры или ариловые сложные эфиры. Эстерификация карбоновых кислот, таких как 24-нор-урсодеоксихолевая кислота, проводят с помощью различных общепринятых технологий, включая реагирование карбоксильной группы с соответствующим спиртом. Эти реакции известны специалисту в данной области. Способы для получения лекарственного средства согласно данному изобретению, включая 24-нор-4 014077 урсодеоксихолевую кислоту, и сформулированного для введения, как отмечалось в данном описании,могут быть найдены, например, в "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations" (Sarfaraz KNiazi, CRC Press LLC, 2004). Лекарственное средство включает преимущественно эффективное количество 24-норурсодеоксихолевой кислоты и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. Согласно преимущественному варианту осуществления данного изобретения медикамент включает 10-8000 мг, преимущественно 25-5000 мг, более преимущественно 50-1500 мг, в частности 250-500 мг 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты. В среднем 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и/или ее фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры могут преимущественно быть введены пациенту в количестве 25 мг - 5 г, преимущественно 100 мг - 2,5 г, в частности 80,0 мг - 1,5 г в день. Тем не менее, пациенту преимущественно вводят 1 г 24 нор-урсодеоксихолевой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров. Также отмечено, что 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и/или ее фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры могут быть введены в индивидуума в количестве 1-100 мг/кг/день, преимущественно 5-50 мг/кг/день, более преимущественно 10-25 мг/кг/день, в частности 12-15 мг/кг/день. Указанные количества вводят однократно или преимущественно в более чем одной дозе (по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 10 дозах) в день. Лекарственное средство или фармацевтическая композиция согласно данному изобретению может вводиться на протяжении более чем одной недели, преимущественно более чем четыре недели, более преимущественно более чем шесть недель, наиболее преимущественно более чем один год, в частности в течение всей жизни. 24-нор-урсодеоксихолевая кислота может вводиться не только в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями и в дозированных формах как описано в данном описании, но, конечно, также в комбинации с одним или более дополнительными активными ингредиентами (например, урсодеоксихолевая кислота, НПВП, например, сулиндак и ибупрофен), для которых также известно, что они эффективны против такого же или сходного заболевания, которое необходимо вылечить (например, урсодеоксихолевая кислота), или против другого заболевания, которое может быть преимущественно результатом заболевания печени. Согласно данному изобретению для лечения и/или профилактики заболеваний печени, описанных в данном описании, может использоваться не только нор-УДХК, но также и другие желчные кислоты,имеющие любую другую модификацию боковой цепи, которая предотвращает эффективное Nациламидирование (может быть проанализировано любым соответствующим способом, известным из уровня техники, особенно с помощью способов, описанных Johnson, M., et al. Anal. Biochem., (1989) 182:360-365; Yoon, Hagey, et al. 1986), таких как следующие, но не ограничиваясь ими: увеличенная длина (например, нор и динор-желчные кислоты), добавление алкильной группы (особенно метил-, этил-,порпил-, бутил-, пентил- и гексилгруппы) к альфа или бета углероду. Эти УДХК-производные приводят к фармацевтическим и терапевтическим свойствам, подобным тем, которые характерны для нор-УДХК,особенно для лечения и профилактики ПБЦ и ПСХ. Данное изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими фигурами и примерами, не ограничиваясь ими. Фиг. 1. норУДХК излечивает склерозирующий холангит у Mdr2-/- мышей. (А) Гистология печени(НЕ окрашивание) в контрольных Mdr2-/- мышах, получающих диетическое питание (КО), Mdr2-/- мышей, получающих УДХК с пищей (КО+УДХК), и Mdr2-/- мышей, получающих норУДХК с пищей(КО+норУДХК) (Увеличение х 10). Выраженное заболевание большого желчного протока в КО (стрелки), которое существенно снижается в КО+УДХК (стрелки) и отсутствует в КО+норУДХК. (В) Склерозирующий холангит в КО с перидуктальным фиброзом, измененные эпителиальные клетки желчного протока и смешанный воспалительный инфильтрат. Эти признаки улучшались в КО+УДХК и отсутствовали в КО+норУДХК (Увеличение х 40). (С) Окрашивание Сириус красным, показывающее существенный фиброз с перидуктальными нитями коллагена (красный) в КО. Умеренное уменьшение фиброза в КО+УДХК и даже более выраженное уменьшение в КО+норУДХК (Увеличение for b, с х 40); bd, желчный проток. Фиг. 2. норУДХК существенно уменьшает содержание гидроксипролина в печени в Mdr2-/-. Содержание гидроксипролина в печени у дикого типа (WT), контрольных Mdr2-/-мышей, получающих диетическое питание (КО), Mdr2-/-мышей, получающих УДХК с пищей (КО+УДХК), и Mdr2-/- мышей, получающих Нор-УДХК с пищей (КО+норУДХК). Содержание гидроксипролина в печени существенно повышается в КО по сравнению с WT и снижается до базовых уровней в КО+норУДХК. Значения представляют собой среднееSEM (стандартная ошибка среднего) из n=5 на группу. р 0,05, WT против КО; КО против КО+норУДХК. Фиг. 3. норУДХК существенно уменьшает инфильтрацию портальными нейтрофилами/кровоизлияние в Mdr2-/-. Иммуногистохимия для CDlIb (красный, окрашенные нейтрофилы) контрольной Mdr2-/- мыши, получающей диетическое питание (КО), Mdr2-/- мыши, получающей УДХК с пищей (КО+УДХК), и Mdr2-/-мыши, получающей норУДХК с пищей (КО+норУДХК) (А) интерлобулярных и (В) лобулярных желчных протоков. (С) Количественная оценка CDlIb-позитивных клеток на 20-5 014077 портальных областей. норУДХК существенно уменьшает количество CDlIb-позитивных клеток в Mdr2-/-. Значения представляют собой среднееSEM (стандартная ошибка среднего) из n=3 на группу; р 0,05. Фиг. 4. норУДХК ингибирует экспрессию молекулы адгезии портального сосудистого эндотелия(VCAM) в Mdr2-/- мышах. Иммуногистохимия для VCAM (красный) в интерлобулярных (А) и лобулярных (В) желчных протоках контрольной Mdr2-/- мыши, получающей диетическое питание (КО), Mdr2-/мыши, получающей УДХК с пищей (КО+УДХК), и Mdr2-/- мыши, получающей норУДХК с пищей(КО+норУДХК). (А) Нет наблюдаемого различия в экспрессии портальной VCAM между КО и КО+УДХК, где КО+норУДХК демонстрирует существенно более низкую экспрессию в пролифератах желчного протока. (В) На уровне лобулярных желчных протоков как УДХК, так и норУДХК снижают экспрессию холангиоцеллюлярной VCAM. Фиг. 5. норУДХК ингибирует пролиферацию гепатоцитов и холангиоцитов у Mdr2-/- мышей. Иммуногистохимия для Ki-67 (красный) в гепатоцитах (А) и холангиоцитах (В) контрольной Mdr2-/- мыши,получающей диетическое питание (КО), Mdr2-/- мыши, получающей УДХК с пищей (КО+УДХК), иMdr2-/- мыши, получающей норУДХК с пищей (КО+норУДХК). (А) Множество Ki-67 позитивных гепатоцитов в КО и КО+УДХК и рассеянное позитивное ядро в КО+норУДХК. (В) Множество Ki-67 позитивных холангиоцитов в КО, несколько позитивных холангиоцитов (стрелки) в КО+УДХК и О+норУДХК, соответственно. (С) Количество Ki-67 позитивных гепатоцитов на 30 HPFs и (D) количество Ki-67 позитивных холангиоцитов на 20 портальных областей. Только норУДХК существенно снижает количество пролиферирующих гепатоцитов и холангиоцитов. Значения представляют собой среднее КО+УДХК; КО против КО+норУДХК. Фиг. 6. Положительная зависимость между выходом бикарбоната желчи и выделением желчи вMdr2-/-. Выход бикарбоната желчи нанесен на график против выделения желчи у контрольных Mdr2-/мышей, находящихся на диете (контроль, неокрашенные кружки), Mdr2-/- мыши, получающие с пищей УДХК (УДХК, неокрашенные треугольники), и Mdr2-/- мыши, получающие с пищей норУДХК (норУДХК, окрашенные кружки). Отмечена положительная зависимость между выходом бикарбоната и выделением желчи, а также группирование животных, получающих лечение норУДХК, демонстрирующих самый высокий выход бикарбоната в верхнем правом углу. Фиг. 7. Предположительные терапевтические механизмы норУДХК у Mdr2-/-мышей. норУДХК поглощается гепатоцитами и секретируется в проточек и желчные протоки, где она поглощается холангиоцитами, что приводит к протоковой секреции бикарбоната. норУДХК секретируется обратно в сосудистое сплетение около желчных протоков и шунтируется обратно в гепатоциты (холегепатическое шунтирование). норУДХК вызывает экспрессию Sult2al etc. и Mrp3 и Mrp4, которые детоксифицируют желчные соли и делают их пригодными для почечного выведения. Фиг. 8. Химическая структура норУДХК (3-альфа, 7-альфа-дигидрокси-24-нор-5-бета-холан-23 оевая кислота). Примеры 1. У мышей с направленным нарушением Mdr2 (Abcb4) гена, кодирующего каналикулярную фосфолипидную флиппазу развивается склерозирующий холангит с макроскопическими и микроскопическими признаками, очень сходными с таковыми, наблюдаемыми при склерозирующем холангите человека, например, первичном склерозирующем холангите, ПСХ) (Fickert, Zollner, et al. 2002, Fickert, Fuchsbichler, etal. 2004). Повреждение желчного протока у этих мышей связано с дефективной билиарной секрецией фосфолипидов, приводящей к возросшей концентрации свободных немицеллярных желчных кислот,которые впоследствии вызывают повреждение эпителиальной клетки желчных протоков (холангиоцита),перихолангит, перидуктальный фиброз с протоковой пролиферацией и в конечном итоге склерозирующий холангит (Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004, Lammert, Wang, et al. 2004). Кроме возможности изучения новых стратегий лечения ПСХ эта модель может касаться тестовых способов лечения для широкого спектра заболеваний печени человека, являющихся результатом MDR3 мутаций (человеческий ортологMdr2) от неонатального холестаза до заболеваний печени взрослого (JansenSturm 2003). В настоящее время УДХК является единственным препаратом, одобренным для лечения холестатических заболеваний печени (PaumgartnerBeuers 2002). Хотя эффективность УДХК при ПСХ и у пациентов с заболеваниями печени, обусловленными MDR3 мутациями (например, прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 3), ограничена (TraunerGraziadei 1999, Jacquemin,Hermans, et al. 1997, Jacquemin 2000, Ismail, Kalicinski, et al. 1999). Укорочение боковой цепи УДХК может повысить ее терапевтическую эффективность, так как эта модификация существенно влияет на физиологические свойства желчных кислот (Hofmann 1999, Schmassmann, Hofmann et al. 1990, Yoon, Hagey,et al. 1986, Cohen, Hofmann, et al. 1986). норУДХК, С 23 аналог УДХК с укороченной боковой цепью, является эффективным желчегонным агентом у различных грызунов (например, хомяк, крыса, морская свинка), подвергающаяся экстенсивному холегепатическому шунтированию и вызывающая билиарную секрецию бикарбоната на уровне желчного протока (Yoon, Hagey, et al. 1986, Cohen, Hofmann, et al. 1986). В отличие от УДХК, эффекты норУДХК на холестаз никогда ранее не исследовались. Для изуче-6 014077 ния гипотезы о том, что холегепатическое шунтирование нетоксической желчной кислоты может быть успешным в лечении холангиопатий, исследовали эффекты норУДХК у Mdr2-/- мышей как модели склерозирующего холангита (Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004). В этом примере исследовали положительные эффекты норУДХК при лечении заболеваний печени человека, вызванных MDR3 мутациями, и холангиопатий человека, таких как склерозирующий холангит (например, ПСХ). 1.1. Материалы и методы 1.1.1. Эксперименты на животных.Md2-/- мыши (исходная линия FVB/N) были получены из Лаборатории Jackson (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Мышей поместили с 12-часовым светотемновым циклом и неограниченным доступом к воде и стандартной диетой для мышей (Sniff, Soest, Germany). 1.1.2. Кормление желчной кислотой Mdr2-/- мышей. Двух-месячные Mdr2-/- (временной отрезок, когда склерозирующий холангит в полной мере проявился у этих животных (Fickert, Zollner, et al. 2002) получали либо диету с добавкой норУДХК (0,5%,вес/вес) или УДХК в качестве клинического препарата сравнения (0,5%, вес/вес) в течение 4 недель и сравнивались с контролями: Mdr2-/-, получающими стандартную диету, и диким типом. 1.1.3. Гистология печени. Для общепринятой световой микроскопии печени были фиксированы в 4% нейтральном забуференном растворе формальдегида и помещены в парафин. Срезы (4 мкм толщиной) были окрашены НЕ и красителем Сириус красный, соответственно. Срезам присвоили коды, и они были исследованы патоморфологом (Н. D.), неосведомленным о лечении животных. 1.1.4. Стандартная биохимия сыворотки. Образцы сыворотки хранили при -70 С, пока анализ аланинтрансаминазы (АЛТ) и алкалин фосфотазы (АР) с помощью стандартной клинической химии провели на анализаторе Hitachi 717 (BoehringerMannheim, Mannheim, Germany). Для определения общих уровней желчных кислот в сыворотке применялся серийный анализ 3-альфа-гидростероид дегидрогеназы (Ecoline S+; DiaSys, Holzheim, Germany). 1.1.5. Иммуногистохимия альфа-SMA. Иммуногистохимию альфа-SMA (антигладкомышечный) проводили на обработанных микроволнами (0,01 ммоль/л цитратного буфера рН 6,0) парафиновых срезах (4 мкм толщиной) с применением альфа-SMA моноклонального антитела мыши (разведение 1:500, Sigma, St. Louis, МО). Связывание антитела определяли с использованием ABC системы (Dako, Glostrup, Denmark), применяя -амино-9-этилкарбазол (АЕС; Dako) в качестве субстрата. 1.1.6. Иммуногистохимия маркера пролиферации Ki-67. Иммуногистохимию Ki-67 проводили на обработанных микроволнами (0,01 ммоль/л цитратного буфера рН 6,0) парафиновых срезах (4 мкм толщиной) с применением анти-Ki-67 поликлонального антитела кролика (разведение 1:750, Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK). Связывание антитела определяли с использованием ABC системы (Dako), применяя АЕС (Dako) в качестве субстрата. Количество пролиферирующих гепатоцитов вычисляли путем подсчета позитивных ядер в 30 полях зрения микроскопа под большим увеличением в срезах 3 животных в каждой группе. Количество пролиферирующих эпителиальных клеток желчных протоков рассчитывали путем подсчета позитивных ядер в 20 портальных областях в срезах 3 животных в каждой группе. 1.1.7. Иммуногистохимия маркера нейтрофилов CD-lib. Для подсчета нейтрофилов CD lib-позитивных клеток определили, как описано ранее (Fickert,Fuchsbichler, et al. 2004) с модификацией: связывание антитела определяли с применением системы ABC(Dako), используя АЕС (Dako) как субстрат. Количество нейтрофилов было вычислено путем подсчета позитивных клеток в 20 портальных областях в срезах 3 животных в каждой группе. 1.1.8. Иммуногистохимия молекулы адгезии сосудистого эндотелия (VCAM). Иммуногистохимию VCAM проводили на фиксированных в ацетоне срезах замороженных тканей с применением анти-CD106 моноклональных антител крысы (VCAM-I, разведение 1:30, PharMingen, SanDiego, CA, USA) и связывание антитела определяли с использованием системы ABC (Dako), применяя АЕС (Dako) в качестве субстрата. 1.1.9. Иммуногистохимия аддуктов 4-гидроксиноненаль-белок. Срезы печени депарафинизировали и затем инкубировали с иммуночистым супрессором пероксидазы (Pierce, Rockford, IL) в течение 30 мин и затем провели блокирование протеина (DAKO, Carpenteria,CA) в течение 2 ч. После этого провели инкубацию в течение ночи с первичным анти-4 гидроксиноненаль антителом (Calbiochem, San Diego, CA) при комнатной температуре и связывание антитела определяли с применением системы ABC (Dako) с АЕС (Dako) в качестве субстрата. 1.1.10. Определение гидроксипролинового содержимого в печени. Для количественной оценки фиброза печени в нашей модели определяли гидроксипролиновое содержимое печени. Правую долю печени гомогенизировали в 6-нормальной HCl (200 мг ткани печени/4 мл HCl) и гидролизировали при 110 С в течение 16 ч. После фильтрования 50 мкл добавили к 450 мкл 2,2% NaOH, растворенного в цитратно-ацетатном буфере (50 г лимонной кислоты х H2O, 12 мл уксусной-7 014077 кислоты, 120 г натрия ацетата 3H2O, 34 г NaOH в 1 л дистиллированной воды; рН 6,0). После добавления 250 мкл перхлорной кислоты и 12 мин инкубации при комнатной температуре добавили 250 мкл раствора р-диметиламинобензальдегида и инкубировали при 60 С в течение 20 мин. Содержание гидроксипролина измеряли при 565 нм с применением гидроксипролиновой стандартной кривой. 1.1.11. мРНК анализ и ПЦР ключевых генов фиброза. Выделение РНК, синтез кДНК и Taqman ПЦР в реальном времени проводили, как описано ранее (Wagner, Fickert, et al. 2003). Применяли следующие праймеры и 5' FAM, 3' TAMRA меченые зонды: Collal fwd (прямая последовательность): caatgcaatgaagaactggactgt (Seq ID No. 1), Collal rev (обратная последовательность): tcctacatcttctgagtttggtga (Seq ID No. 2) и зонд Collal: cagaaagcacagcactcgccctcc (Seq ID No. 3); TIMP-I fwd:(Seq ID No. 8) и зонд MMP-2: cagatggacagccctgcaagttccc (Seq ID No. 9). 1.1.12. Измерение выделения желчи. Выделение желчи измеряли гравиметрически и нормализовали вес печени как описано выше (Fickert, Zollner, et al. 2001). Концентрацию фосфолипидов в желчи определяли с применением коммерчески доступного набора (Phospholipid В; Wako, Neuss, Germany) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию холестерола в желчи определяли с применением коммерчески доступного набора (Cholesterol liquicolor; Human, Wiesbaden, Germany) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию глутатиона в желчи (GSH) определяли после осаждения протеина в 5% метафосфорной кислоты с применением Набора для Анализа Глутатиона (Calbiochem, San Diego, US) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию желчных кислот в желчи анализировали с применением анализа 3-альфагидроксистероид дегидрогеназы (Ecoline St, DiaSys) в соответствии с инструкцией производителя. 1.1.13. Статистический анализ. Данные записывались как среднее арифметическое +/- SD (стандартное отклонение). В каждой группе изучалось от 4 до 6 животных. Статистический анализ проводили с применением t-теста Стьюдента или ANOVA с поправкой Бонферрони при сравнении трех или более групп. Значение р 0,05 принималось как значимое. 1.2. Результаты 1.2.1. норУДХК существенно улучшает повреждение печени, уменьшает фиброз и лечит склерозирующий холангит у Mdr2-/- мышей. Уровни АЛТ и АР в сыворотке (как биохимические маркеры повреждения печени и холестаза) были существенно повышены у Mdr2-/-, получающих стандартную диету, по сравнению с контролями дикого типа (табл. 1). Таблица 1. Биохимия сыворотки и уровни желчной кислоты при различных экспериментальных условиях Примечание. Значения выражены как среднее + SD от n = 5 на группу. АЛТ, аланин трансаминаза; АР, алкалин фосфатаза; SBA, желчные кислоты сыворотки, WT, мыши дикого типа; КО, Mdr2 нокаутные мыши, КО+УДХК, Mdr2 нокаутные мыши, получающие УДХК с пищей; КО+норУДХК, Mdr2 нокаутные мыши, получающие норУДХК с пищей. р 0,05, КО против КО+УДХК и КО против КО+норУДХК (ANOVA с поправкой Бонферрони) р 0,05, КО+УДХК против КО+норУДХК (ANOVA с поправкой Бонферрони) норУДХК существенно улучшала уровни АЛТ и АР в сыворотке по сравнению с Mdr2-/-, получающими стандартную диету (табл. 1). Параллельно Mdr2-/-, получающими стандартную диету, выявляли ярко выраженный склерозирующий холангит (фиг. 1) с дуктулярной пролиферацией и фиброзом печени,что отражалось в существенно увеличенном содержании гидроксипролина в печени (фиг. 2). Mdr2-/-, получающими норУДХК с пищей, демонстрировали нормальные желчные протоки больших и средних размеров с отсутствием или только ограниченным перидуктальным фиброзом (фиг. 1); дуктуральная пролиферация полностью отсутствовала (не показано). В соответствии с гистологическими изменениями норУДХК существенно снижала содержание гидроксипролина в печени у Mdr2-/- (фиг. 2), что наблюдалось наряду со значительным уменьшением экспрессии печеночного коллагена 1 и 3 мРНК (табл. 2). Лечение УДХК Mdr2-/- в качестве клинического препарата сравнения и общепринятое стандартное лечение холестатических заболеваний печени (включая ПСХ) исследовали одновременно. В отличие от норУДХК, УДХК существенно повышает активность АЛТ и АР у Mdr2-/- (табл. 1) и 2 из 5 животных показывали инфаркты желчного происхождения в соответствии с предыдущими наблюдениями (Fickert,Zollner, et al. 2002). Установлено, что УДХК снижает перидуктальный фиброз лобулярных и интерлобулярных желчных протоков (фиг. 1), но она показывала лишь тенденцию в снижении содержания гидроксипролина в печени без достижения статистической значимости (фиг. 2). Эти сведения точно определяют, что норУДХК (но не УДХК) существенно уменьшает повреждение печени, перихолангит и перидуктальный фиброз у Mdr2-/-, что в конечном итоге приводит к излечению склерозирующего холангита. 1.2.2. норУДХК уменьшает воспаление, окислительный стресс и клеточную пролиферацию у Mdr2-/мышей. Так как портальное воспаление может представлять главный фактор развития перидуктального фиброза у Mdr2-/- (Pikarsky, Porat, et al. 2004), было анализировано снижение портального воспаления с норУДХК. Mdr2-/-, получающие стандартную диету, имели существенно увеличенное количество портальных нейтрофилов по сравнению с контролями дикого типа (фиг. 3). норУДХК также улучшала перихолангит у Mdx2-/-, что отражается в существенно уменьшенном количестве портальных нейтрофилов по сравнению с Mdr2-/-, получающими стандартную диету (фиг. 3). Эти видимые противовоспалительные эффекты норУДХК были наряду с существенно более низкой экспрессией VCAM в эпителиальных клетках желчных протоков интерлобулярных и лобулярных желчных протоков у Mdr2-/-, получающих УДХК с пищей (фиг. 4). Так как прежде было показано, что воспаление запускает также пролиферацию в печени у Mdr2-/- (Pikarsky, Porat, et al. 2004), было проанализировано, оказывает ли на этот факт влияние норУДХК. Mdr2-/-, получающие стандартную диету, показали существенно повышенное количество Ki-67 позитивных гепатоцитов и холангиоцитов по сравнению с контролями дикого типа (фиг. 5). норУДХК существенно снижала степень пролиферации гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков практически до уровней, наблюдаемых у контролей дикого типа (фиг. 5). УДХК не имела значительных эффектов на портальное воспаление (фиг. 3), экспрессию VCAM (фиг. 4) и пролиферацию гепатоцитов(фиг. 5). Однако УДХК снижала пролиферацию эпителиальных клеток желчных протоков в больших желчных протоках (фиг. 5). Кроме того, эти данные означают, что противовоспалительный и антипролиферативный эффекты норУДХК превосходят таковые у УДХК. 1.2.3. норУДХК вызывает билиарную секрецию бикарбоната у Mdr2-/- мышей. Для определения того, может ли образование насыщенной бикарбонатом желчи, вызванное холегепатическим шунтированием норУДХК, быть ответственным за наблюдаемые терапевтические эффекты, были исследованы выделение желчи и составы (табл. 3). Таблица 3. Выделение желчи и билиарная экскреция желчных кислот, холестерола, фосфолипидов и глутатиона при различных экспериментальных условиях Примечание. Значения выражены как среднее + SD. КО, Mdr2 нокаутные мыши; КО+УДХК, Mdr2 нокаутные мыши, получающие УДХК с пищей; КО+норУДХК, Mdr2 нокаутные мыши, получающие норУДХК с пищей. р 0,05, КО против КО+УДХК (ANOVA с поправкой Бонферрони)p0,05, КО против КО+норУДХК (ANOVA с поправкой Бонферрони) По сравнению с контрольными Mdr2-/-, получающие диету, и УДХК с пищей, норУДХК существенно вызывает билиарную секрецию бикарбоната совместно с предположением, что норУДХК подвергается относительному холегепатическому шунтированию у Mdr2-/- (Bolder, Trang, et al. 1999). УДХК, но не норУДХК, стимулировала билиарную экскрецию желчных кислот. Не наблюдались значительные эффекты на продукцию желчной кислоты, холестерола, фосфолипидов и глутатиона в желчи. Эти сведения показывают, что норУДХК приводит к промыванию поврежденных желчных протоков менее токсичной желчью, насыщенной бикарбонатом у Mdr2-/-. 1.2.4. норУДХК вызывает фазу II путей детоксификации и альтернативные экскреторные пути для желчных кислот у Mdr2-/- мышей. Для анализа гипотезы о том, что индукция фазы I/II путей биотрансформации и альтернативных путей выкачивания потенциально токсичных желчных кислот может также вносить свой вклад в наблюдаемые благоприятные эффекты норУДХК у Mdr2-/-, были исследованы экспрессия ключевых ферментов метаболизма(табл. 4) и состав желчных кислот в сыворотке, печени и желчи у Mdr2-/-, получающих норУДХК с пищей. Таблица 4. ПЦР в реальном времени для подсчета относительных уровней экспрессии ключевых метаболических ферментов и транспортных белков при различных экспериментальных условиях. Примечание. Значения выражены как среднее + SD; n=5 в каждой группе, и.о., не обнаружено; КО,Mdr2 нокаутные мыши; КО+УДХК, Mdr2 нокаутные мыши, получающие УДХК с пищей; КО+норУДХК,Mdr2 нокаутные мыши, получающие норУДХК с пищей. р 0,05, КО против КО+УДХК и КО против КО+норУДХК (ANOVA с поправкой Бонферрони)p0,05, КО+УДХК против КО+норУДХК (ANOVA с поправкой Бонферрони) Особое внимание было уделено Sult2al и Mrp4, так как сульфатация и транспорт сульфатированных- 10014077 соединений взаимосвязан с формированием направлено регулируемого пути для экскреции сульфатированных стероидов и желчных кислот (Schuetz, Strom, et al. 2001). норУДХК не имела значительных эффектов на экспрессию мРНК систем гепатоцеллюлярного захвата (Ntcp, Oatpl) и каналикулярного оттока(Bsep, Mrp2) для желчных кислот и органических анионов (данные не показаны). Хотя норУДХК приводила к устойчивой индукции ферментов детоксификации фазы I и II (табл. 4) с более выраженными эффектами на экспрессию Sult2al. Кроме того, норУДХК сильно увеличивала экспрессию альтернативных базолатеральных систем оттока, таких как Mrp4 и, в меньшей степени, Mrp3 (табл. 4, фиг. 7). Эффекты УДХК были менее выражены (табл. 4, фиг. 7). Эта управляемая индукция путей биотрансформации и систем оттока с помощью норУДХК сопровождалась появлением глюкуронидов, а также сульфатов желчной кислоты, отражая функциональные аспекты наблюдаемых изменений экспресии. 1.3. Обсуждение Может быть показано, что норУДХК лечит склерозирующий холангит у Mdr2-/-мышей, по хорошо описанной модельной системе для ПСХ, в течение 4 недель. Кроме того, может быть продемонстрировано, что норУДХК является существенно более эффективной, чем УДХК. Развитие склерозирующего холангита у Mdr2-/- напрямую зависит от недостаточной билиарной фосфолипидной секреции и одновременно повышенных уровней немицеллярно связанных токсических желчных кислот в желчи, вызывающих повреждение желчных протоков и перихолангит (Fickert, Zollner,et al. 2002, Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004). Индукция билиарной секреции бикарбоната Mdr2-/- у мышей,получающих норУДХК с пищей, представленная в данном примере, строго согласуется с холегепатическим шунтированием норУДХК (Hofmann 1977, Yoon, Hagey, et al. 1986). Повышенная билиарная секреция бикарбоната (i.) разводит токсическое содержимое желчи у Mdr2-/- и (U) защищает эпителиальные клетки желчных протоков от окислительного стресса, так как бикарбонат является сильным акцептором реактивных видов кислорода. норУДХК останавливает, таким образом, существующий перихолангит и последующий перидуктальный фиброз у Mdr2-/- путем минимизации повреждения эпителиальных клеток желчных протоков из просвета желчного протока. Это приводит к восстановлению барьерной функции холангиоцитов, что означает, что наблюдаемые противовоспалительный и антифиброзный эффекты норУДХК у Mdr2-/-являются вторичными. Несмотря на это, ясно, что норУДХК имеет также непосредственный противовоспалительный и антифиброзный эффекты. Обнаруженные факты данного примера показывают, что ингибирование перидуктального фиброза при комбинации с модулированием содержимого желчи (например, увеличение содержания гидрофильных желчных кислот наряду с увеличением концентрации бикарбоната внутри протока) существенно облегчает повреждение печени у Mdr2-/-. В отличие от норУДХК, УДХК улучшает только перидуктальный фиброз лобулярных желчных протоков, но не увеличивает уровни АЛТ в сыворотке и не индуцирует инфаркты желчного происхождения у Mdr2-/-. В предыдущих исследованиях с более коротким временем лечения пришли к выводу, что это в первую очередь связано с холеретическими эффектами УДХК в присутствии нерешенной билиарной обструкции по сравнению с фактами, обнаруженными у CBDL мышей, получающих УДХК с пищей(Fickert, Zollner, et al. 2002). В отличие от этого предыдущего предположения, обнаружена лишь тенденция к повышению потока желчи у Mdr2-/-, получающих УДХК- и даже более выраженно у получающих норУДХК с пищей в данном исследовании с использованием более низких доз. Несмотря на то, что УДХК не улучшает заболевание малых протоков у Mdr2-/-, это не исключает возможности повышения билиарного давления на уровне канальцев Геринга у Mdr2-/-, получающих УДХК с пищей, что могло приводить к наблюдаемым инфарктам желчного происхождения. Противоположные эффекты обеих желчных кислот по отношению к повреждению печени связаны с отличиями в уровне билиарной секреции, например, норУДХК стимулирует в первую очередь протоковую секрецию, тогда как УДХК стимулирует секрецию желчи канальцев, расположенных выше пораженных протоков. Причинная связь между портальным и лобулярным воспалением, приводящая к перидуктальному фиброзу и дуктулярной пролиферации, а также к формированию гепатоцеллюлярной карциноме (НСС или ГЦК) у Mdr2-/-, была недавно продемонстрирована (Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004, Pikarsky, Porat, etal. 2004). В данном исследовании норУДХК нормализовала пролиферацию гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков. Pikarsky et al. показали уменьшение воспаления и связанного формирования ГЦК с применением нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП) ибупрофена в данной модели (Pikarsky, Porat, et al. 2004). Терапевтические эффекты НПВП и норУДХК могут быть комбинированы и даже усиливаться сулиндаком, НПВП, который подвергается холегепатическому шунтированию у крыс (Bolder, Trang, et al. 1999). Натуральные желчные кислоты эффективно подвергаются N-ацил амидированию (конъюгированию) в амидной связи с глицином или таурином и далее секретируются в желчный каналец. В отличие от этого нор (С 23) желчные кислоты проявляют отличия в их биотрансформации и физиологических свойствах при сравнении с их натуральными (С 24) гомологами. Показано, что норУДХК приводит к организованной и устойчивой индукции Sult2al (трансфераза, которая предпочтительно сульфатирует стероиды и желчные кислоты) и Mrp4 (транспортер сульфатированных стероидов и желчных кислот) (Schuetz, Strom,et al. 2001, Zelcer, Reid, et al. 2003). Функциональные аспекты обнаруженных фактов подтверждаются- 11014077 появлением сульфатов и глюкуронидов желчной кислоты в моче Mdr2-/-, получающих норУДХК с пищей. Приспособительная индукция детоксификации желчных кислот с помощью норУДХК путем фазы I(гидроксилирование) и II (сульфатация, глюкуронидация) метаболизма может привести к лучшей водорастворимости и тем самым менее токсичным метаболитам желчных кислот, котороые должны выводиться с помощью альтернативных гепатоцеллюлярных выкачивающих насосов (например, Mrp4) после их почечной экскреции, как показано в данном примере. Индукция таких механизмов с помощью норУДХК была более выраженой, чем для УДХК (в данном примере) или лигандов-агонистов CAR, о которых сообщалось ранее (Assem et al. 2004). Это исследование показало, что норУДХК сильно индуцирует детоксификацию желчных кислот, вызванную Sult2al, и выводит с помощью приспособительной сверхэкспрессии Mrp4, тогда как сама по себе норУДХК подвергается продолжительному холегепатическому шунтированию. Это имеет двойной благоприятный эффект путем (i) вытеснения и разведения токсических желчных кислот в протоковой желчи и (ii) индуцирования образования протоковой желчи, насыщенной бикарбонатом, которое уменьшает окислительный стресс. Образование желчи, насыщенной бикарбонатом, с помощью норУДХК имеет также терапевтические назначения при холангиопатиях человека (например, ПСХ, ПБЦ, хроническое отторжение трансплантата печени, негнойный деструктивный холангит), так как холегепатическое шунтирование приводит к длительному потоку молекул через эпителий желчных протоков, который помогает управлять токсическим/окислительным стрессом в измененных желчных протоках. Например, сулиндак, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП или NSAID), который также подвергается холегепатическому шунтированию у людей, показал улучшение печеночных ферментов у ПБЦ пациентов с неполным ответом на лечение УДХК. Существуют две представляющие интерес параллели в метаболизме норУДХК между мышами и людьми, которые противопоставляются предыдущим наблюдениям на других грызунах и экспериментальных животных (например, крысы с желчной фистулой, хомячки, морские свинки). Во-первых, оба вида, мыши и люди, демонстрируют сопоставимую почечную экскрецию норУДХК. Кроме того, также было обнаружено, что основным метаболитом норУДХК у мышей был глюкуронид, что также было обнаружено у людей. Во-вторых, в отличие от крыс (Yoon, Hagey, et al. 1986) предполагаемая желчегонная эффективность норУДХК у мышей и людей приблизительно в три раза выше, чем нормальное выделение желчи у обоих видов. Хотя норУДХК индуцировала выделение желчи у крыс в намного большей степени (160 мл/мин/кг). Тем не менее, взятые вместе эти обнаруженные факты должны показать, что эффекты норУДХК у Mdr2-/- могут быть прямо экстраполированы на холестатические заболевания печени людей. В заключение должно быть показано, что норУДХК излечивает склерозирующий холангит у Mdr2-/норУДХК представляет собой эффективное соединение для холестатических заболеваний печени, в частности для ПСХ людей и заболеваний печени, связанных с мутациями MDR3. Ссылки:Yoon et al. Gastroenterology 1986; 90 (4): 837-852. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний печени. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что заболевание печени представляет собой холестатическое заболевание печени, преимущественно первичный склерозирующий холангит (ПСХ), первичный билиарный цирроз (ПБЦ) или прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз, в частности прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 1, 2 и 3, кистозный фиброз, холестаз, вызванный лекарственным средством.- 12014077 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что лекарственное средство сформулировано для перорального, парентерального, подкожного, внутривенного, внутримышечного, назального, местного или ректального введения. 4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что медикамент содержит эффективное количество 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты, ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. 5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что медикамент содержит 10-8000, преимущественно 25-5000, более преимущественно 50-1500, в частности 250-500 мг, 24-норурсодеоксихолевой кислоты и/или по меньшей мере ее одну фармацевтически приемлемую соль и/или сложный эфир.