Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека (fsh)

МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩИЕ АЛЬФА- И БЕТА-ЦЕПИ ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА (FSH) Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую - и -цепь фолликулостимулирующего гормона человека (FSH) соответственно, которые модифицированы в отношении использования кодонов в клетках CHO. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей такие последовательности нуклеиновых кислот,и к клеткам-хозяевам, содержащим такие рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот,а также к их применению при получении рекомбинантного FSH человека. В заключение,настоящее изобретение также относится к способу получения клеток-хозяев, экспрессирующих фолликулостимулирующий гормон человека, посредством трансфицирования клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую - и -цепь фолликулостимулирующего гормона человека(FSH) соответственно, где последовательность нуклеиновой кислоты модифицирована в отношении использования кодонов в клетках CHO, по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты FSH человека дикого типа. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты,содержащей такие последовательности нуклеиновых кислот, и к клеткам-хозяевам, содержащим такие рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, а также к их применению при получении рекомбинантного FSH человека. В заключение, настоящее изобретение также относится к способу получения клеток-хозяев, экспрессирующих фолликулостимулирующий гормон человека посредством трансфицирования клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Фолликулостимулирующий гормон (FSH) продуцируется гонадотропными клетками передней доли гипофиза и высвобождается в кровоток. FSH действует вместе с лютеинизирующим гормоном (LH) при регуляции созревания ооцитов у женщин и сперматогенеза у мужчин. Как FSH, так и LH принадлежат к семейству гетеродимерных гликопротеинов, которые состоят из двух нековалентно связанных - и цепей, которые кодируются отдельными генами. В то время как последовательности аминокислот -цепиFSH и LH являются идентичными, последовательности аминокислот -цепи у двух белков отличаются. Как -, так и -цепи являются гликозилированными. -цепь FSH имеет два потенциальных аспарагинсвязанных сайта гликозилирования в положениях 52 и 78, в то время как -цепь FSH имеет два потенциальных аспарагинсвязанных сайта гликозилирования в положениях 7 и 24 (Olijve et al. (1996) Mol. Hum.FSH человека используют для лечения женщин с отсутствием овуляции, для стимулирования мультифолликулярного развития (суперовуляции) и при подготовке к искусственному оплодотворению, такому как IVF (оплодотворение in vitro), GIFT (перенос гаметы в маточную трубу) или ZIFT (перенос зиготы в маточную трубу). Кроме того, FSH человека используют для стимулирования созревания фолликул у женщин с низкой выработкой FSH или с его отсутствием и для стимулирования сперматогенеза у мужчин с врожденным или приобретенным гипогонадотропным гипогонадизмом. Первоначально, FSH для медицинских использований очищали из постменопаузальной мочи человека. Однако этот очищенный FSH имеет тот недостаток, что он также содержит LH и другие загрязняющие белки человеческого происхождения. Кроме того, использование такого природного источника накладывает ограничения на доступность и однородность продукта. С развитием технологии рекомбинантных ДНК стало возможным продуцирование FSH человека в культурах клеток, трансфицированных последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих - и цепи. Последовательности ДНК, кодирующие - и -цепи, и способы получения рекомбинантного FSH человека описываются, например, в WO 88/10270, WO 86/04589 и в EP 0735139. В настоящее время на рынке в Германии имеются два коммерческих продукта рекомбинантногоFSH человека, а именно GONAL-F и PUREGON, оба из которых получают посредством экспрессии ДНК дикого типа, кодирующих - и -цепи в клетках CHO. Однако по-прежнему сохраняется необходимость в оптимизации экспрессии цепей FSH для улучшения выхода и скорости экспрессии FSH для данного количества клеток. Таким образом, в основе настоящего изобретения лежит проблема создания последовательности нуклеиновой кислоты и рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, с помощью которых рекомбинантный FSH человека может быть получен в больших количествах в эукариотических клетках. В соответствии с настоящим изобретением эта и другие задачи решены посредством признаков,представленных в независимом пункте формулы изобретения. Преимущественные варианты осуществления охарактеризованы в зависимых пунктах формулы изобретения. В соответствии с настоящим изобретением молекулы нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих - и -цепи FSH человека, которые адаптированы в отношении использования кодонов в клетках яичников китайских хомячков (CHO), используют для трансфицирования клеток CHO и приводят к значительному увеличению продуцированияFSH в трансфицированных клетках CHO. В контексте настоящего изобретения термин "увеличение продуцирования FSH" относится к ситуации, когда при экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты в клеткехозяине, в клетке-хозяине продуцируется большее количество FSH по сравнению с ситуацией, когда немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FSH с такой же последовательностью аминокислот, экспрессируется в таком же типе клеток-хозяев при сходных условиях, таких,например, как сравнимые процедуры трансфицирования, сравнимые векторы экспрессии и тому подобное. Генетический код является избыточным, поскольку 20 аминокислот определяются с помощью 61 триплетного кодона. Таким образом, большинство из 20 протеиногенных аминокислот кодируются с помощью нескольких основных триплетов (кодонов). Однако кодоны, которые описывают конкретную аминокислоту, не используются с такой же частотой в конкретном организме, но имеются предпочтительные кодоны, которые используются часто, и редкие кодоны, которые используются не так часто. Упоминаемые различия в использовании кодонов связываются с понижением селективного эволюционного давления и, в частности, эффективности трансляции. Одна из причин более низкой эффективности трансляции редко встречающихся кодонов могла бы заключаться в том, что соответствующие пулы аминоацил-tPHK обеднены и по этой причине не являются более доступными для синтеза белка. Кроме того, различные организмы предпочитают различные кодоны. Таким образом, например,экспрессия рекомбинантных ДНК, происходящих из клеток млекопитающих, в клетках E.coli часто происходит только субоптимально. По этой причине замена редко используемых кодонов на часто используемые кодоны может улучшить экспрессию в некоторых случаях. Для многих организмов последовательность ДНК большого числа генов является известной, и имеются таблицы, из которых может быть получена частота использования конкретных кодонов в соответствующем организме. Посредством использования упоминаемых таблиц последовательности белков могут быть относительно точно транслированы обратно, с образованием последовательностей ДНК, которые содержат кодоны, предпочтительные в соответствующем организме для различных аминокислот белка. Таблицы для использования кодонов могут, среди прочего, быть найдены на следующих интернет-адресах:http://www.entelechon.com/endex.phpid=tools/index. Имеются также программы, доступные для обратной трансляции последовательности белка, например последовательности белка - или -цепи FSH человека, с образованием вырожденной последовательности ДНК, подобные, например, программам на сайте Термин "последовательность нуклеиновой кислоты" для целей настоящего изобретения относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептиды, такие как пептиды, белки и тому подобное. Эти молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены из ДНК, РНК или их аналогов. Однако молекулы из нуклеиновых кислот, получаемые из ДНК, являются предпочтительными. Специалист в данной области, несомненно, знает, что модификация исходной нуклеотидной последовательности описывает процесс оптимизации по отношению к использованию кодона. Если кодирующая последовательность чужого фермента дикого типа подбирается, например, для использования кодона клеток CHO, внесенные изменения могут легко идентифицироваться посредством сравнения модифицированной последовательности и исходной последовательности (см. фиг. 1 а и 1b). Кроме того, обе последовательности будут кодировать одну и ту же последовательность аминокислот. Последовательность аминокислот -цепи FSH человека показана в SEQ ID No. 5 и последовательность аминокислот -цепи FSH человека показана в SEQ ID No. 6. Эти последовательности аминокислот соответствуют последовательности аминокислот - и -цепи FSH человека дикого типа, депонированным под номером доступа J 00152 в базе данных EMBL и под номером доступа NM 000510 в базе данныхNCBI соответственно. В случае -цепи FSH человека исходная последовательность нуклеиновой кислоты показана в SEQID No. 3, а в случае -цепи FSH человека исходная последовательность нуклеиновой кислоты показана вSEQ ID No. 4. В соответствии с настоящим изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая-цепь FSH человека, модифицируется по отношению к использованию кодона в клетках CHO по меньшей мере в 30 положениях, предпочтительно по меньшей мере в 40 положениях, особенно предпочтительно по меньшей мере в 50 положениях, также особенно предпочтительно по меньшей мере в 60 или 70 положениях, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 75 положениях по сравнению с исходной последовательностью. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением последовательность нуклеиновой кислоты,кодирующая -цепь FSH человека, модифицируют по отношению к использованию кодона в клеткахCHO по меньшей мере в 25 положениях, предпочтительно по меньшей мере в 30 положениях, более предпочтительно по меньшей мере в 40 положениях, особенно предпочтительно по меньшей мере в 50 положениях, также особенно предпочтительно в 60 положениях, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 65 положениях по сравнению с исходной последовательностью. Наиболее предпочтительно модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID No. 1, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в SEQ ID No. 1, по меньшей мере на 98% по всей кодирующей области. В SEQ ID No. 1 кодирующая область начинается с нуклеотида 56 и простирается до нуклеотида 442. Наиболее предпочтительно оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID No. 2, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в SEQ ID No. 2, по меньшей мере на 98% по всей кодирующей области. В SEQ ID No. 2 кодирующая область начинается с нуклеотида 19 и простирается до нуклеотида 366. Термины "немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты", "последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа" или "исходная последовательность нуклеиновой кислоты" для целей настоящего изобретения относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, которая предназначена для использования для (сверх)экспрессии в клетке-хозяине и которая не адаптирована в отношении использования кодона в клетке-хозяине, но представляет собой действительную последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующую белок. Термины "модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты" или "оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты" для целей настоящего изобретения относятся к последовательности, которая модифицирована для экспрессии в клетке-хозяине посредством адаптирования последовательности немодифицированной/исходной последовательности нуклеиновой кислоты в отношении использования кодона клетки-хозяина. Модифицированная или оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок, имеющий такую же последовательность аминокислот, что и белок, кодируемый немодифицированной последовательностью. Идентичность последовательностей определяют с помощью ряда программ, основанных на различных алгоритмах. В настоящем изобретении алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman дают особенно надежные результаты. Для сравнения последовательностей используют программу PileUp(1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489), которые содержатся в пакете программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Значения идентичности последовательностей, приведенные в настоящем документе в процентах,определяют с помощью программы Gap по всей области последовательности со следующими настройками: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10000 и Average Mismatch: 0.000. Если не указано иначе, указанные настройки используют как стандартные настройки для сравнения последовательностей. Без намерения ограничиваться гипотезами, предполагается, что кодоноптимизированные последовательности ДНК позволяют более эффективную трансляцию и мРНК, полученные с их помощью, возможно, имеют более продолжительные периоды полужизни в клетке и по этой причине являются чаще доступными для трансляции. Специалисты в данной области хорошо знакомы с методиками, которые позволяют преобразовывать исходную начальную последовательность нуклеиновой кислоты в модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептиды идентичных аминокислот, но с различным использованием кодонов. Это может достигаться, например, с помощью методик мутагенеза на основе цепной полимеразной реакции, с помощью обычных известных процедур клонирования, с помощью химического синтеза и тому подобное. Также целью настоящего изобретения является рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты,содержащая модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, где модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID No. 1 и нуклеотидной последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 90%, с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, как показана в SEQ ID No. 1, и где модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем промотора, который является активным в клетке-хозяине. Термин "промотор, который является активным в клетке-хозяине" предназначается для обозначения того, что промотор в рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты позволяет экспрессировать последовательность нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, в которой экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты является желательной. Активность промотора обычно определяется присутствием факторов транскрипции, которые способны связываться с промотором и активировать транскрипцию. Промоторы, которые являются пригодными для экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих, хорошо известны специалистам в данной области и включают вирусные промоторы, такие как CMV, SV40, HTLV или главный поздний промотор аденовируса и другие промоторы, такие как промотор EF-1- или промотор UbC. Термин "клетка-хозяин" для целей настоящего изобретения относится к любой клетке, которая обычно используется для экспрессии, то есть для транскрипции и трансляции последовательностей нук-3 022993 леиновых кислот для продуцирования, например, полипептидов. В частности, термин "клетка-хозяин" или "организм" относится к прокариотам, низшим эукариотам, клеткам растений, насекомых или к системам культур клеток млекопитающих. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, еще более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, которая имеет использование кодона, сходное с клетками CHO, а наиболее предпочтительно эта клетка-хозяин представляет собой клеткуCHO. Линия клеток-хозяев CHO, используемая для экспрессии модифицированной последовательности и для продуцирования рекомбинантного FSH человека, представляет собой производную линию клетокCHO-K1 и имеет дефицит активности дигидрофолатредуктазы (dhfr). Линии клеток получают из DSMZ(Cat. No. ACC 126) и адаптируют для суспензии и условий отсутствия сыворотки в культуре. Линия клеток CHO, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, и вторую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, была депонирована с 28 марта 2007 г. в DSMZ, Braunschweig, под номером депозита DSMACC2833. Термин "рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты" в значении, используемом в настоящем изобретении, предназначается для включения в него всех видов молекул нуклеиновых кислот, которые способны вводиться в клетку-хозяина и осуществлять экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты. Термин включает, среди прочего, векторы плазмид и вирусные векторы, такие как аденовирусный, лентивирусный и ретровирусный вектор, при этом векторы плазмид являются предпочтительными. Примеры пригодных для использования векторов плазмид, которые могут использоваться для экспрессирования белков в клетках млекопитающих, хорошо известны и включают, например, ряд векторовpCI, pSI (Promega), векторы pcDNA, pCEP4, pREP4, pSHOOTER, pZeoSV2 (Invitrogen), pBlast,pMono, pSELECT, pVITRO и pVIVO (In Vivogen). Кроме промотора и последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна экспрессироваться, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты обычно содержит другие функциональные элементы, такие как последовательности полиаденилирования, гены прокариотической и/или эукариотической селекции, которые позволяют идентификацию положительно трансформированных прокариотических и/или эукариотических клеток, и источник репликации. Специалист в данной области знает, какие элементы, которые он должен выбирать для конкретной цели, и какой вектор плазмиды является пригодным для экспрессии конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в конкретной клетке-хозяине. Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью стандартных способов молекулярной биологии, которые описаны в литературе(см., например, в Sambrook and Russell (2001) Molecularcloning - a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY,USA). Предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит как модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, так и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, выбирается из оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей -цепь FSH человека, которую выбирают из группы, состоящей из кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID No. 2, последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 85%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в SEQ ID No. 2, с кодирующей областью немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как показано в SEQ ID No. 3, и из последовательности нуклеиновой кислоты,имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 70%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в SEQ ID No. 3. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, может находиться под контролем того же промотора, что и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепьFSH человека, например, посредством участка внутренней посадки рибосомы (IRES), или она может находиться под контролем отдельного промотора. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, находится под контролем отдельного промотора. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оптимизированную -цепь FSH человека, находится под контролем промотора SV40, а последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, находится под контролем промотора CMV. Наиболее предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID No. 7. Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит рекомбинант-4 022993 ную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, и которая дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, которую выбирают из модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID No. 2 и нуклеотидных последовательностей,имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 85%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в SEQ ID No. 2, и кодирующей областью немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в SEQ ID No. 3, и последовательностей нуклеиновых кислот, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 70%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в SEQ ID No. 3. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, может присутствовать в той же рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, что и оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, или она может вводиться в клеткихозяева на отдельной рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека, присутствует в той же рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, что и оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека. Клетка-хозяин может выбираться из системы культур клеток млекопитающих, таких как клеткиNIH3T3, клетки CHO, клетки COS, клетки 293, клетки Jurkat, клетки ВНК и клетки HeLa. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, которая имеет использование кодона, сходное с клеткой CHO, а наиболее предпочтительно эта клетка-хозяин представляет собой клетку CHO. Также объектом настоящего изобретения является культура клеток, содержащая клетки-хозяева,содержащие рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь, может выбираться из группы, состоящей из немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты и модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как определено выше, в подходящей культурной среде. Культуру клеток получают посредством культивирования клеток-хозяев в подходящей культурной среде в условиях, которые поддерживают рост клеток-хозяев. Термин "культивирование клеток" должен пониматься как означающий, что клетки поддерживаются in vivo при условиях, которые делают возможными пролиферацию, нормальный метаболизм клеток и образование рекомбинантного белка. Это означает, что клетки снабжаются всеми необходимыми питательными веществами, а также кислородом, и поддерживаются при соответствующем pH и при соответствующей осмолярности. Клетки могут культивироваться любым пригодным для этого образом. Предпочтительно клетки культивируют как суспензионные культуры, например, в колбах или во вращающихся колбах. Термин "культивирование" включает периодическое культивирование, культивирование с подпиткой, а также перфузионные культуры и другие соответствующие способы культивирования."Культивирование в суспензии" означает, что клетки не прилипают к поверхности, а распределяются в культурной среде."Периодическое культивирование", как используется в настоящем изобретении, представляет собой способ культивирования, при котором культурная среда не добавляется и не удаляется во время культивирования."Способ с подпиткой", как используется в настоящем изобретении, представляет собой способ культивирования, при котором культурную среду добавляют во время культивирования, но культурная среда не удаляется."Перфузионное культивирование" в рамках настоящего изобретения представляет собой способ культивирования, при котором среда культивирования удаляется и новую культурную среду добавляют во время культивирования. Культурная среда предпочтительно имеет только низкое содержание сыворотки, например максимальное содержание (об./об.) сыворотки 1%; наиболее предпочтительно среда не содержит сыворотки. Примеры соответствующих культурных сред представляют собой минимальные среды, такие как RPMI 1640, DMEM, F12, ProCHO5 или eRDF, которые могут смешиваться друг с другом и с добавками, в соответствии с потребностями клеток. В дополнение к глюкозе и аминокислотам среда может содержать хелаторы, такие как ауринтрикарбоновая кислота (АТА), неорганические соли, такие как фосфатные соли,полиамины и их предшественники, такие как путресцин, гормоны, такие как инсулин, антиоксиданты,такие как аскорбиновая кислота, и смеси витаминов, предшественники липидов, такие как этаноламин, и защищающие клетки вещества, такие как Pluronic F68. Специалисты в данной области знают, какую культурную среду используют для культивирования конкретного типа клеток. Предпочтительно культурная среда представляет собой ProCHO5. Также объектом настоящего изобретения является способ, в котором клетки-хозяева в соответствии с настоящим изобретением сначала культивируют в подходящей культурной среде в течение определенного периода времени, а затем супернатант культуры клеток собирают."Супернатант культуры клеток" представляет собой культуральную среду для клеток, которая находится в контакте с клетками в течение определенного периода времени и которую затем отделяют от клеток. Супернатант культуры клеток содержит рекомбинантный белок, продуцируемый клетками. Клетки могут отделяться от супернатанта с помощью обычных методик разделения, таких как фильтрование и центрифугирование. В долговременных культурах супернатант клеток-хозяев в соответствии с настоящим изобретением содержит концентрации FSH по меньшей мере 500 нг/мл, предпочтительно по меньшей мере 1000 нг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 1500 нг/мл и наиболее предпочтительно по меньшей мере 2000 нг/мл. Рекомбинантный FSH человека может быть очищен от супернатанта культур клеток с помощью одной или нескольких стадий очистки. Подходящие способы очистки известны специалистам в данной области и включают ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, хроматографию на гидроксиапатите, афинную хроматографию и гельпроникающую хроматографию. Способы очистки рекомбинантного FSH человека описаны, например, в WO 00/63248, WO 2006/051070 и WO 2005/063811. Для введения в качестве лекарственного средства очищенный рекомбинантный FSH человека смешивают с одним или несколькими наполнителями с получением композиции, которую можно вводить пациентам. Соответствующие композиции для рекомбинантного FSH человека описываются, среди прочего, в EP 0853945, EP 1285665, EP 0974359, EP 1188444 и EP 1169349. Клетку-хозяина по настоящему изобретению получают посредством трансфицирования клетки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которая содержит либо только модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, либо также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая -цепь, могут присутствовать на отдельных рекомбинантных молекулах нуклеиновых кислот, которые вводят в клетку-хозяина либо одновременно, либо последовательно. Подходящие способы трансфицирования известны специалистам в данной области и включают в себя, например, осаждение с фосфатом кальция, трансфицирование, опосредуемое DEAE-декстраном,электропорацию и липофекцию. Могут также использоваться коммерчески доступные наборы для трансфицирования, такие как SuperFect, PolyFect, Effectene (Qiagen), TransFast, ProFection, Transfectam (Promega) и TransPass (NEB). Предпочтительно клетки трансфицируют в то время, когда они находятся в суспензии, и они трансфицируются в условиях отсутствия сыворотки. Для получения рекомбинантного FSH человека в промышленном масштабе клетки обычно стабильно трансфицируют, что означает, что успешно трансформированные клетки отбирают после трансфицирования посредством агента селекции, который уничтожает нетрансфицированные клетки, в то время как трансфицированные клетки, содержащие ген устойчивости, продолжают расти. Подходящие реагенты включают антибиотики, такие как зеоцин, неомицин и пуромицин, и другие лекарственные средства, такие как метотрексат. Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих далее примеров, которые не должны пониматься как ограничивающие. Примеры 1. Клонирование рекомбинантной молекулы из нуклеиновой кислоты, содержащей оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие - и -цепь FSH человека. Используют основную цепь вектора pUC18, которая уже содержит сайт полиаденилирования SV40 и сайт сплайсирования, и кассету гена dhfr, состоящую из промотора RSV, гена дигидрофолиатредуктазы мыши и сайта полиаденилирования и сплайсирования SV40. Ген дигидрофолиатредуктазы делает возможной селекцию положительно трансфицированных клеток и амплификацию трансфицированного гена с помощью лекарственного средства метотрексата. Немодифицированные последовательности - и -цепей FSH человека получают из Fiddes andGoodman (1979) Nature 281: 351-356, и Jameson et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2(9): 806-815 соответственно. Эти последовательности оптимизируют, при этом кодирующие области адаптируют для использования кодона в часто используемых генах CHO. Кроме того, вводят дополнительный стоп-кодон для обеспечения эффективного завершения трансляции. Оптимизированные нуклеотидные последовательности для - и -цепи показаны в SEQ ID No. 1 и 2 соответственно, и сравнение последовательности дикого типа и модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты показано на фиг. 1 а и 1b. Сравнение последовательностей показывает, что модифицированная и немодифицированная последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие -цепьFSH человека, идентичны на 80%, в то время как модифицированная и немодифицированная последова-6 022993 тельности нуклеиновых кислот, кодирующие -цепь FSH человека, идентичны на 85%. Модифицированные последовательности инсертируют по отдельности в две копии основной цепиpUC18 посредством разрезания их с помощью ферментов рестрикции SacII и NcoI и последующего лигирования. Промотор CMV и промотор SV40 амплифицируют из соответствующего шаблона ДНК с помощью следующих праймеров, одновременно вводя сайт рестрикции AscI и PacI (подчеркнут в следующих праймерах): Праймер Asc-CMV-F 5' - GGC GCG ССТ ТТТ GCT CAC ATG GCT CG - 3'(SEQ ID No. 8) Праймер Pac-CMV-R 5' - ССТ ТАА ТТА AGA GCT GTA ATT GAA CTG GGA GTG - 3' (SEQ ID No. 9) Праймер Asc-SV40-F 5' - GGC GCG CCG CAT ACG CGG АТС TG - 3' (SEQ ID No. 10) Праймер Pac-SV40-R 5' - CCT TAA TTA AGT TCG AGA CTG TTG TGT CAG AAG A - 3' (SEQ ID No. 11) Промотор CMV вводят в плазмиду, содержащую -цепь FSH человека, посредством разрезания плазмиды с помощью ферментов рестрикции AscI и PacI и лигирования, и промотор SV40 вводят в плазмиду, содержащую -цепь FSH человека, посредством разрезания плазмиды с помощью ферментов рестрикции AscI и PacI и лигирования. Наконец, кассету экспрессии для -цепи FSH человека, содержащую промотор SV40, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь, и сигнал полиаденилирования SV40 амплифицируют с помощью следующих праймеров, одновременно вводя сайт рестрикции NotI, как на 5', так и на 3' конце амплификата (подчеркнуто в следующих праймерах): Праймер beta-NotI-F 5' - GCG GCC GCA TAC GCG GAT CTG С - 3' (SEQ ID No. 12) Праймер beta-NotI-R 5' - GCG GCC GCT CAC TCA TTA GGC ACC CCA GG - 3' (SEQ ID No. 13) Затем амплификат вставляют в разрезанную с помощью NotI плазмиду, содержащую -цепь FSH человека. Полученная плазмида, содержащая как оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь, так и оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь, показана на фиг. 2. Последовательность плазмиды с обеими оптимизированными последовательностями нуклеиновых кислот показана в SEQ ID No. 7. 2. Транзиентная трансфекция клеток CHO рекомбинантными молекулами нуклеиновых кислот, содержащими различные сочетания - и -цепей FSH человека. Плазмиды, содержащие либо оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь, либо оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую цепь, в сочетании с соответствующей -цепью или -цепью дикого типа, или содержащие обе оптимизированные последовательности, получают, как описано в 1), выше. ДНК смешивают со средой ProCHO5(Lonza), содержащей 8 мМ глютамина без НТ (5-гидрокситритамина), до получения общего объема 200 мкл. Затем 20 мкл реагента SuperFect (Qiagen) добавляют к раствору ДНК и перемешивают. Затем эту смесь инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Аликвоты, содержащие 1,68106 клеток CHO, центрифугируют (5 мин, 800 об/мин, 18-25C), супернатант удаляют и клетки повторно суспендируют в 1,1 мл культурной среды ProCHO5, содержащей 8 мМ глютамина без НТ. Затем суспензию переносят в смесь ДНК, затем смесь ДНК инкубируют в течение 5-10 мин, перемешивают и переносят в лунки 6-луночного планшета. Клетки инкубируют в течение 3 ч при 37C, это инкубирование приводит к прилипанию клеток. Супернатант удаляют, клетки промывают три раза 1 мл PBS, а затем добавляют свежую культурную среду (2 мл ProCHO5, содержащую 8 мМ глютамина без НТ). После 2 дней инкубирования при 37C супернатант удаляют и центрифугируют. Супернатант концентрируют (коэффициент концентрирования 16,67) и концентрацию FSH определяют с помощью устройства для считывания ELISA (Anogcn). Результаты этого измерения показаны на фиг. 3. Результаты показывают, что введение модифицированной -цепи в сочетании с -цепью дикого типа приводит к уменьшению экспрессии почти на 50% по сравнению с сочетанием двух цепей дикого типа. В противоположность этому введение модифицированной -цепи в сочетании с -цепью, как дикого типа, так и модифицированной, приводит к транзиентной экспрессии FSH, которая усиливается с коэффициентом 1,5-3 по сравнению с сочетанием -цепи дикого типа и -цепи дикого типа. По этой причине,в частности, использование модифицированной -цепи приводит к значительному усилению экспрессииFSH после транзиентного трансфицирования, в то время как модифицированная -цепь не влияет положительно на продуцирование FSH. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Сравнение немодифицированных и модифицированных последовательностей нуклеиновыхa) сравнение последовательностей модифицированной и немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей -цепь FSH человека,pXM17ss6: часть плазмиды, содержащая модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека (SEQ ID No. 2),wtFSH: немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепьb) Сравнение последовательностей для модифицированной и немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей -цепь FSH человекаQuery: немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека (SEQ ID No. 4),Subject: модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая -цепь FSH человека (SEQ ID No. 1). Инициирующие кодоны и стоп-кодоны показаны выделенными буквами. Фиг. 2. Карта рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей как модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека, так и модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую -цепь FSH человека. Фиг. 3. Анализ экспрессии различных сочетаний - и -цепей после транзиентной экспрессии в клетках CHO. Показана относительная экспрессия FSH по отношению к клеткам, экспрессирующим сочетание и -цепей дикого типа.-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (FSH), которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 98% кодирующей области нуклеотидной последовательности SEQID No. 1, где нуклеотидная последовательность SEQ ID No. 1 модифицирована в соответствии с кодонами, предпочтительными для использования в клетках яичников китайских хомячков (CHO). 2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (FSH), которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 2 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 98% кодирующей области нуклеотидной последовательности SEQID No. 2, где нуклеотидная последовательность SEQ ID No. 2 модифицирована в соответствии с кодонами, предпочтительными для использования в клетках яичников китайских хомячков (CHO). 3. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, раскрытую в п.1, под контролем промотора, который является активным в клетке-хозяине. 4. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, раскрытую в п.2. 5. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 3 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 70% кодирующей области нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 3, где нуклеотидная последовательность SEQ ID No. 3 представляет собой немодифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь FSH человека. 6. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.4 или 5, в которой дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем отдельного промотора. 7. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-6, в которой нуклеотидная последовательность, раскрытая в п.1, и/или дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем вирусного промотора. 8. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, в которой нуклеотидная последовательность, раскрытая в п.1, находится под контролем промотора SV40. 9. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, в которой дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем промотора CMV. 10. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-9, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 7. 11. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-10. 12. Клетка-хозяин по п.11, представляющая собой клетку млекопитающего. 13. Клетка-хозяин по п.11 или 12, представляющая собой клетку яичника китайского хомячка(CHO). 14. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п.3 и дополнительную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности, раскрытой в п.2, и нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 3, указанной в п.5. 15. Линия клеток яичников китайских хомячков, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую кодирующую область нуклеотидной последовательности, представленнойSEQ ID No. 1, и кодирующую область нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID No. 2,и имеющая номер депозита DSM ACC2833. 16. Культура клеток, содержащая клетку-хозяина по любому из пп.11-14 или линию клеток по п.15 в подходящей культуральной среде. 17. Способ получения рекомбинантного FSH человека, включающий культивирование клеткихозяина по любому из пп.11-14 или линии клеток по п.15 в подходящей культуральной среде и сбор супернатанта культуры клеток. 18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию очистки рекомбинантного FSH человека от супернатанта культуры клеток. 19. Способ получения клетки-хозяина по любому из пп.11-13, включающий трансфицирование клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-10. 20. Способ получения клетки-хозяина по п.14, включающий трансфицирование клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по п.3 и дополнительной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности, раскрытой в п.2, и нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 3, указанной в п.5. 21. Применение нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1 и/или SEQ ID No. 2 для получения рекомбинантного FSH человека.