Применение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную область, для лечения пролиферативного нарушения

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ДВУХЦЕПОЧЕЧНУЮ ОБЛАСТЬ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО НАРУШЕНИЯ Изобретение относится к композициям и способам для нарушения путей репарации двухнитевого разрыва (ДНР) ДНК. Изобретение описывает новую двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, которая действует как ловушка и захватывает холокомплекс ферментов, ответственных за пути распознавания повреждения ДНР ДНК, передачи сигнала и репарации, в частности пути негомологичного соединения концов (NHEJ) репарации ДНР. Изобретение описывает применение этих молекул как самостоятельного противоракового лекарственного средства в эффективном количестве, которое вводится в ядра опухолевых клеток для запуска их смерти.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: САНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ СЬЕНТИФИК; ЭНСТИТЮ КЮРИ (FR) 016053 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к композициям и способам нарушения путей репарации двухнитевого разрыва ДНК в клетках млекопитающих. Соответственно изобретение относится к композициям и способам лечения пролиферативных нарушений. Сведения о предшествующем уровне техники Радиотерапия и химиотерапия, по отдельности или в сочетании с хирургическим вмешательством,составляют основной терапевтический арсенал против рака человека. Взаимосвязь между химиотерапией и радиотерапией широко использовалась в лечении рака. Хотя еще не совсем выяснено, биологическая основа действия цитотоксических агентов основывается на клеточных механизмах, таких как клеточный цикл или повреждение ДНК, которые также играют важную роль в клеточной гибели, вызванной воздействием радиоволн, приводя к аддитивным или даже более значительным синергическим эффектам посредством сочетания различных видов лечения в противоопухолевой терапии. Последние успехи в развитии биологических лекарств (моноклональные антитела, ингибиторы цитокинов/киназ, иммунотерапия/вакцины) подтвердили их пригодность и специфичность относительно ряда опухолей. Но они часто используются в комбинации с химическими цитотоксическими агентами. Несмотря на многочисленные успехи в развитии новых цитотоксических лекарственных средств, лекарственная резистентность к химиотерапии остается до сих пор главной клинической проблемой в лечении злокачественных опухолей. Понимание механизма лекарственной резистентности, связанной с усвоением/выведением лекарственного средства, метаболической деградацией, мутагенезом мишени, усиленной репарацией, подачей сигнала клеточной гибели (апоптоз и некроз), является особенно важным для обеспечения эффективности химиотерапии и повышения терапевтического индекса, особенно для некоторых опухолей, резистентных к лечению. В последнее десятилетие были выполнены многочисленные исследования в этой области, и сложность сигнальной трансдукции в ответ на облучение начинает определяться. В связи с чем, генами, представляющими особый интерес как мишени ионизирующих излучений, являются те, которые вовлечены в процесс регуляции механизмов летальности, вызванных излучением, таких как апоптоз или репарация ДНК. Поскольку двухнитевые разрывы (ДНР) представляют собой наиболее летальные повреждения ДНК разрушения, эффективность ионизирующего излучения снижается при увеличении эффективности репарации ДНР. Два механизма вовлечены в процесс репарации ДНР: негомологичное соединение концов (NHEJ, не зависимый от последовательности путь) и гомологичная рекомбинация (HR, зависимый от последовательности путь) (обзор от Jackson, 2002). Таргетинг генов, вовлеченных в эти два основных пути репарации ДНР, до сих пор приводил к слабой или умеренной радиочувствительности в зависимости от способов применения и раковых клеточных линий (Belenkov et al., 2002; Marangoni et al., 2000a; Ohnishi et al.,1998). Белки Ku (например, Ku70 и Ku80) и ДНК-ПКкс играют важную роль в репарации ДНР ДНК, вызванной облучением и химическими агентами. Если повреждение не может быть восстановлено вовремя,то клетка погибает. Следовательно, они представляют потенциально привлеченные молекулярные мишени для сенсибилизации клеток-мишеней и тканей к радиотерапии и химиотерапии. Многие способы были разработаны и осуществлены в попытке ингибировать эти ключевые белки (Ku70/Ku80, ДНК-ПКкс и др.), которые входят в путь NHEJ, являющийся преобладающим в клетках млекопитающих: 1) ингибиторы PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназа) (т.е. ДНК-ПКкс, ATM, ATR) (Bouton et al.,2000; DurantKarran, 2003; Willmore et al., 2004; Vauger et al., 2004); 2) негативное доминирование и пептиды (С-конец Ku80) (Marangoni et al., 2000b; Kim et al., 2002); 3) вариабельный фрагмент одноцепочечного антитела (scFv) (ДНК-ПКкс) (Li et al., 2003a); 4) РНК-аптамер (SELEX: РНК, связывающая Ku) (YooDynan, 1998); 5) антисенс (Ku70, Ku80, ДНК-ПКкс) (Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000c; Sak et al., 2002); 6) малая интерферирующая РНК (миРНК) (ДНК-ПКкс) (Peng et al., 2000). Несмотря на эти огромные усилия, комбинирование таргетинга генов, вовлеченных в пути репарации ДНК, и противораковой терапии до сих пор находится на ранней экспериментальной стадии и до сих пор клинические исследования не показали каких-либо подтвержденных преимуществ. Имеет смысл отметить, что вышеуказанные способы имеют общий признак: они нацелены на один эффектор (белок),вовлеченный в сложный каскадный путь (такой как NHEJ) с возможными обходным путем или компенсацией. Патентная заявка WO 2005/040378 описывала композиции и способы нарушения путей репарации двухнитевого разрыва ДНК в клетках млекопитающих. В частности, это относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые мешают, негеноспецифичным образом, механизмам распознавания, передачи сигнала и репарации повреждения ДНК, а также к их использованию для инициирования клеточной летальности опухолей, подвергаемых противораковому лечению. Указано, что чувствительность клеток к терапии, прямо или опосредованно повреждающей ДНК, может быть увеличена путем использования(химически модифицированных или нет) коротких молекул дцДНК, которые действуют как имитаторы поврежденных фрагментов ДНК и распознаются как участки ДНР, индуцированные терапией, повреж-1 016053 дающей ДНК (т.е. субстраты-имитаторы ДНР). Эти молекулы, также обозначаемые названием молекулы"ДНР ловушки" (сокращенно Dbait), придают или повышают чувствительность любой опухолевой клетки к противораковому лечению, повреждающему ДНК, а именно химиотерапии и радиотерапии. Молекулы Dbait действуют путем привлечения и перехвата холокомплекса ферментов репарации ДНР ДНК и,тем самым, мешают процессам распознавания повреждения ДНК, передачи сигнала и репарации. Соответственно, данная заявка относится к молекулам Dbait в комбинации с физическим(и) и/или химическим(и) агентом(и), которые могут прямо или косвенно вызывать ДНР ДНК. Сущность изобретения Изобретатели неожиданно обнаружили, что опухолевые клетки чувствительны к присутствию молекул Dbait в чистом виде в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК (т.е. химиотерапии, радиотерапии). Как показано в примерах, молекулы Dbait эффективны in vitro, а также in vivo при применении в качестве самостоятельного противоракового лечения. Соответственно, настоящее изобретение касается применения молекулы нуклеиновой кислоты для приготовления лекарственного средства для лечения пролиферативного нарушения в отсутствие какоголибо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит двухцепочечную часть по меньшей мере из 16 п.н., более чем 24 п.н., предпочтительно 32 п.н., имеет по меньшей мере один свободный конец и где указанная молекула представляет собой субстрат для связывания, по меньшей мере, белком Ku и способна активировать ДНК-ПКкс. Настоящее изобретение также касается способа лечения пролиферативного нарушения у субъекта,включающего введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную часть по меньшей мере из 16 п.н., предпочтительно из 32 п.н., имеющей по меньшей мере один свободный конец, представляющей собой субстрат для связывания, по меньшей мере, белком Ku и способной активировать ДНК-ПКкс. Настоящее изобретение также касается способа оценки эффективности лечения нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, включающего определение фосфорилирования гистона Н 2 АХ. Настоящее изобретение дополнительно касается способа повышения фосфорилирования гистона Н 2 АХ или активации гистона Н 2 АХ в клетках и/или ткани, включающего введение в указанные клетки и/или ткань нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Перечень чертежей Фиг. 1 - Вестерн-блоттинг гистона Н 2 АХ и фосфорилированного гистона Н 2 АХ (-Н 2 АХ) в различных клеточных линиях, полученных из опухолей человека (Hela, Hep2 и MO59K) и из трансформированных фибробластов (MRC5). MO59J являются ДНК-ПК дефицитными (полученные из дикого типаMO59K). AT5BI являются ATM-дефицитными (полученные из дикого типа MRC5); фиг. 2 - уровень фосфорилированного гистона Н 2 АХ (-Н 2 АХ) и фосфорилированного белка контрольной точки Chk2 (Chk2-T68p) в Нер 2 клетках через 5 ч после трансфекции различными молекуламиDbait или через 1 ч после облучения 10 Гр; фиг. 3 - анализ Вестерн-блоттинг уровня -Н 2 АХ в удаленной опухоли Нер 2; фиг. 4 - FASC анализ уровня -Н 2 АХ в удаленной опухоли Нер 2; фиг. 5 - график Каплана-Майера для ксенотрансплантата Нер 2 (HNSCC) в голых мышах; фиг. 6 - график Каплана-Майера для ксенотрансплантата LU1205 в голых мышах; фиг. 7 - график Каплана-Майера для ксенотрансплантата SK28 в голых мышах; фиг. 8 - иммунный ответ на инъекции Dbait у мышей Balb/C. Сведения, подтверждающие возможность осуществления Как описано в патентной заявке WO 2005/040378, молекулы Dbait представляют новый класс терапевтических молекул, которые могут мешать негеноспецифическим образом системам репарации ДНР ДНК в клетках млекопитающих. Эти новые молекулы, именуемые молекулами Dbait, являются субстратами для холокомплекса белков, входящих в путь NHEJ (не зависимый от последовательности путь), в частности для белков Ku и/или ДНК-ПК, и могут нейтрализировать способность клеток к репарации ДНК, тем самым повышая их чувствительность к лечению, повреждающему ДНК. Настоящее изобретение дополнительно описывает способность молекул Dbait инициировать фосфорилирование главного блюстителя целостности хромосом, гистона Н 2 АХ в отсутствие лечения, повреждающего ДНК. Такая посттрансляционная модификация Н 2 АХ опосредуется через ДНК-ПК (ДНКзависимая протеинкиназа)-опосредованный путь, но не зависима от ATM (мутированный белок атаксиителеангиэктазии)-опосредованного пути. Биологическим результатом такой неожиданной/ошибочной активации Н 2 АХ является дезорганизация систем репарации двухнитевого разрыва (ДНР) ДНК, в частности пути негомологичного соединения концов (NHEJ), вызывая тем самым клеточную летальность у опухолевых клеток, у которых более высокий уровень спонтанных (ошибки репликации) и эндогенных (окислительный стресс) ДНР, чем в нормальных клетках. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает доказательства, подтверждающие, что молекулыDbait способны инициировать клеточную/тканевую летальность опухолей человека, ксенотранспланти-2 016053 рованных голым мышам, в отсутствие любого лечения, повреждающего ДНК. Таким образом, настоящее изобретение относится к применению таких молекул в качестве самостоятельных терапевтических агентов, в особенности, для лечения пролиферативных заболеваний. Молекулы Dbait настоящего изобретения могут быть определены посредством ряда характеристик,таких как их минимальная длина, наличие по меньшей мере одного свободного конца и наличие двухцепочечной области. Как будет обсуждаться ниже, важный признак молекул Dbait состоит в том, что их точная нуклеотидная последовательность практически не оказывает влияние на их активность. Также молекулы Dbait могут содержать модифицированный и/или ненатуральный остов. Молекула Dbait предпочтительно имеет происхождение, не относящееся к человеку (т.е. ее нуклеотидная последовательность и/или структура (например, шпилька) не такая, как имеется в клетке человека), более предпочтительно синтетическое происхождение. Исходя из механизма действия молекул Dbait, последовательность молекул Dbait играет небольшую, если вообще таковая имеется, роль. В связи с чем по сравнению с молекулами, применяемыми в уровне техники для ген/белок-специфичного таргетинга (например, антисенс, антиген, миРНК, аптамер,ловушка, рибозим и др.), молекулы Dbait могут не иметь какую-либо значительную степень гомологии последовательностей или идентичность с известными генами, промоторами, энхансерами, 5'- или 3'активирующими последовательностями, экзонами, нитронами и др. Другими словами, действие молекулDbait по нарушению пути NHEJ не зависит от последовательности, и молекулы Dbait могут иметь менее 80 или 70%, даже менее 60 или 50% идентичности последовательностей с любым геном в геноме человека. Такой механизм действия, не зависящий от последовательности, является отличительным признаком молекул Dbait, который ясно отличает их от других ген-специфичных или белок-специфичных (с учетом последовательности) терапевтических агентов, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, малая интерферирующая РНК (миРНК, РНК-шпилька и микроРНК), и иммуностимулирующие CpGолигонуклеотиды, а также аптамеры/ловушки, разработанные для улавливания конкретного белка. В предпочтительном воплощении последовательность молекул Dbait имеет общую степень идентичности с последовательностями нуклеиновых кислот человека, которая составляет менее чем около 80,70, 65, 60, 55 или 50%. Способы определения идентичности последовательностей хорошо известны из уровня техники и включают, например, Blast. В частном воплощении молекула Dbait не гибридизуется при строгих условиях с геномной ДНК человека. Типичными строгими условиями являются такие, которые позволяют различить полностью комплементарные нуклеиновые кислоты от частично комплементарных нуклеиновых кислот. В предпочтительном воплощении последовательность молекул Dbait лишена CpG во избежание хорошо известных иммунологических реакций, опосредованных Toll-подобными рецепторами, если такие эффекты являются нежелательными. В частном воплощении молекулы Dbait, имеющие двухцепочечную область по меньшей мере из 32 п.о. или из 32 п.н., содержат такую же нуклеотидную последовательность, как и Dbait32 (SEQ ID No 1),Dbait32Ha (SEQ ID No 28), Dbait32Hb (SEQ ID No 29), Dbait32Hc (SEQ ID No 30) или Dbait32Hd (SEQ IDNo 31). Необязательно, молекулы Dbait имеют аналогичный нуклеотидный состав, что и Dbait32,Dbait32Ha, Dbait32Hb, Dbait32Hc или Dbait32Hd, но их нуклеотидная последовательность отличается. Затем молекулы Dbait содержат одну цепь двухцепочечной области вместе с 3 А, 6 С, 12G и 11 Т. Предпочтительно последовательность молекул Dbait не содержит какой-либо CpG динуклеотид. Рассматривая их механизм действия, длина молекул Dbait может меняться при условии, что она достаточна для надлежащего связывания комплекса белка Ku, содержащего белки Ku и ДНК-ПКис (каталитическая субъединица ДНК-ПК). Экспериментальная часть WO 2005/040378 показала, что длина молекул Dbait должна быть более 16 п.н., предпочтительно 32 п.н., для обеспечения связывания с такимKu комплексом и обеспечением активации ДНК-ПКкс. Предпочтительно молекулы Dbait содержат между 16-200 п.н., более предпочтительно 24-100 п.н., еще более предпочтительно 26-100 и наиболее предпочтительно между 32-100 п.н. Например, молекулы Dbait содержат между 24-160, 26-150, 28-140, 30120, 32-100 п.н. Под "п.н." понимается, что молекула содержит двухцепочечную область определенной длины. В частном воплощении двухцепочечная область содержит по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26,28, 30 или 32 последовательно расположенных нуклеотидов из Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQID No 28), Dbait32Hb (SEQ ID No 29), Dbait32Hc (SEQ ID No 30) или Dbait32Hd (SEQ ID No 31). В более частном воплощении двухцепочечная область состоит из 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательно расположенных нуклеотидов из Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 28), Dbait32Hb(SEQ ID No 29), Dbait32Hc (SEQ ID No 30) или Dbait32Hd (SEQ ID No 31). Молекулы Dbait изобретения должны иметь по меньшей мере один свободный конец в качестве имитатора ДНР. Указанный свободный конец может быть либо свободным тупым концом, либо 5'-/3'выступающим концом. В частном воплощении они содержат только один свободный конец. В другом частном воплощении они содержат два свободных конца. Соответственно, настоящее изобретение также затрагивает молекулы Dbait, которые являются двухцепочечными молекулами с двумя свободными кон-3 016053 цами и имеют нуклеотидную последовательность из Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha ds (SEQ ID No 28), Dbait32Hb ds (SEQ ID No 29), Dbait32Hc ds (SEQ ID No 30) или Dbait32Hd ds (SEQ ID No 31). Молекулы Dbait могут быть линейными или предпочтительно состоять из двухцепочечного участка шпильки нуклеиновых кислот. В данном случае петля может являться нуклеиновыми кислотами или другими химическими группами, известными для специалиста в данной области, предпочтительно линкером, таким как гексаэтиленгликоль или тетрадезокситимидилат (Т 4). Таким образом, в частном воплощении молекулы Dbait могут быть молекулой-шпилькой, имеющей двухцепочечную область, содержащую по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклеотидов изDbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 28), Dbait32Hb (SEQ ID No 29), Dbait32Hc (SEQ ID No 30) или Dbait32Hd (SEQ ID No 31), и петлей, являющейся гексаэтиленгликолевым линкером или тетрадезокситимидилатным линкером (Т 4). В более частном воплощении эти молекулы Dbait могут содержать двухцепочечную область, состоящую из 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклеотидов из Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 28), Dbait32Hb (SEQ ID No 29), Dbait32Hc (SEQ IDNo 30) или Dbait32Hd (SEQ ID No 31). В предпочтительном воплощении молекулы Dbait являются таковыми, что: 1) двухцепочечные молекулы Dbait способны поглощаться клетками/тканями организма в клеточное ядро при применении вместе с фармацевтически приемлемыми носителями/эксципиентами; 2) по меньшей мере один свободный конец молекул Dbait является узнаваемым холокомплексом ферментов, включенных в процессы распознавания повреждения ДНК, передачи сигнала и репарации,3) по меньшей мере один свободный конец молекул Dbait поддается указанному комплексу для включения в геномную ДНК опухолевой клетки. В частном воплощении молекулы Dbait имеют нерепликативную структуру, вследствие их структуры, такой как петля и/или остов. В этом отношении молекулы Dbait изобретения могут иметь исключительно или главным образом(около 50%) нативный фосфодиэфирный остов, или химически модифицированный фосфодиэфирный остов, или другой остов с химическими группами или комплексами химических групп, обеспечивающих модифицированные субстраты из оставшейся двухцепочечной ДНК для холокомплекса, входящего в путь NHEJ, в частности белки Ku и ДНК-ПКкс, а также путь распознавания повреждения ДНР и передачи сигнала. Преимущественно химические модификации предназначены для придания химической стабильности молекулам Dbait и/или для предохранения их от дальнейшей репликации (потенциальная причина мутагенного эффекта) при их геномной интеграции, если это происходит. В предпочтительном воплощении молекулы Dbait содержат 2'-дезоксинуклеотидный остов и необязательно содержат один или несколько (2, 3, 4, 5 или 6) модифицированных нуклеотидов и/или нуклеиновых оснований, отличных от аденина, цитозина, гуанина и тимина. Соответственно, молекулы Dbait имеют, по существу, структуру ДНК. Они также могут иметь имитаторы сахара, такие как 2'-О-алкилрибоза, 2'-О-алкил-С 4' разветвленная рибоза, циклобутилы или другие карбоциклические группы или гексит вместо пентофуранозильной группы. Предпочтительные Dbait содержат один или несколько химически модифицированный(х) нуклеотид(ов) или группу(п) на конце одной или каждой цепи. В частном предпочтительном воплощении свободный(ые) конец(ы) молекул Dbait защищен(ы) одним, двумя или тремя модифицированными фосфодиэфирными остовами на конце одной или каждой цепи. Предпочтительные химические группы, в частности модифицированный фосфодиэфирный остов, содержат фосфотиоаты. Альтернативно, предпочтительные Dbait имеют 3'-3'-нуклеотидную связь или нуклеотиды с метилфосфонатным остовом. Другие модифицированные остовы изобретения содержат фосфорамидаты, морфолинонуклеиновую кислоту, закрытую замкнутую нуклеиновую кислоту с 2'-0,4'-С метиленовым/этиленовым мостиком,пептидно-нуклеиновую кислоту (ПНК) и короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные связи между остатками сахаров или короткоцепочечные гетероатомные или гетероциклические связи внутри остатков сахаров различной длины, или любые модифицированные нуклеотиды, известные специалисту. Патент США 5677437 описывает гетероароматические олигонуклеозидные связи. Содержащие азот линкеры или группы, содержащие азот, также могут применяться для приготовления имитаторов олигонуклеотидов (патент США 5792844 и 5783682). Патент США 5637684 описывает фосфорамидаты и фосфортиоамидатные олигомерные соединения. Также предусмотренными являются олигонуклеотиды, имеющие структуру на основе морфолинового остова (патент США 5034506). В других воплощениях, таких как остов из пептидо-нуклеиновой кислоты (PNA), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида может быть замещен полиамидным остовом, причем основания связаны непосредственно или опосредованно с аза-атомами азота полиамидного остова. Другие синтетические олигонуклеотиды могут содержать замещенные остатки сахара, содержащие одну из следующих групп в положении 2': ОН, SH, ОСН 3, SCH3, F, OCN, ОСН 2 СН 2 ОСН 3, O(CH2)nNH2 или O(CH2)nCH3, где n представляет от 1 до около 10; Cl - C10-низший алкил, замещенный низшим алкилом, алкарилом или аралкилом; Cl; Br; CN;-4 016053 Молекула Dbait может содержать по меньшей мере один встроенный элемент, который препятствует репликации ДНК, репарации ДНК или процессу передачи сигнала повреждения. Указанный(е) встроенный(е) элемент(ы) может(гут) присоединяться во внутреннем положении (например, в центре) или на конце двухцепочечного фрагмента. Он(они) может содержать: а) элемент, который не может использоваться как матрица для репликации ДНК, такой как полиэтиленгликолевая цепь, предпочтительно гексаэтиленгликолевая цепь, или любая углеводородная цепь, в конечном счете, прерываемая и/или замещенная одним или более гетероатомами, например кислородом, серой, азотом, или гетероатомными или гетероциклическими группами, содержащими один или более гетероатомов; b) элемент, который представляет собой блокирующий элемент, который не доступен ДНК полимеразам или экзонуклеазам, такой как 3'-модифицированные нуклеотиды; или другой элемент, известный специалисту; с) нативный олигонуклеотид, такой как Tn, если используется в петлевом фрагменте шпильки, такой как тетрадезокситимидилат (Т 4). Указанные цепи изготавливают посредством химического синтеза, полубиосинтеза или биосинтеза и способа амплификации, за которым следуют любые способы экстракции и получения и любая химическая модификация. Как описано в патентной заявке WO 2005/040378, биоактивность молекул Dbait может быть определена с помощью анализов in vitro и с культивируемыми клетками, как описано, например, в примерах 2 и 3, и/или также с помощью анализов in vivo, как описано, например, в примерах 4 и 5. Самым простым и подходящим анализом является анализ определения активности ДНК-зависимой протеинкиназы (см. пример 2, фиг. 1.4). Этот простой анализ до сих пор предсказывает активность молекул Dbait in vivo. Однако также подходят и другие анализы, основанные на культивировании клеток, такие как анализ ингибирования незаконной интеграции при воздействии повышенного излучения (см. пример 3, фиг. 2.3 и 2.4). Фактически, молекулы Dbait настоящего изобретения должны обладать способностью активировать ДНК-ПК. В одном воплощении молекулы Dbait также способны ингибировать ошибочную интеграцию ДНК, усиливаемую излучением. В другом частном воплощении молекулы Dbait связывают Ku комплексin vitro, например, как определено с помощью анализа задержки в геле. Такой Ku комплекс содержит комбинацию из одного или нескольких белков Ku и, по меньшей мере, белка ДНК-ПКкс. В следующем частном воплощении молекулы Dbait данного изобретения проникают внутрь ядра, предпочтительно с использованием фармацевтически приемлемых носителей/эксципиентов. Наиболее предпочтительные молекулы Dbait данного изобретения совмещают некоторые или все вышеуказанные характеристики. В предпочтительном воплощении молекулы Dbait представляют собой химически модифицированные молекулы Dbait, такие как указано выше и другие, применяемые в терапии человека. В другом воплощении молекулы Dbait не являются химически модифицированными и соответствуют фрагментам нативных нуклеиновых кислот, но при этом проявляют характеристики химически модифицированных фрагментов, а именно имеют количество пар оснований и свойства, определенные в отношении указанных химически модифицированных молекул Dbait. Настоящее изобретение касается применения любой молекулы Dbait, раскрытой в описании. В предпочтительном воплощении молекула Dbait выбирается из группы, состоящей из Также может применяться комбинация из них. Соответственно, изобретение относится к способу лечения пролиферативного нарушения в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК (т.е. химио- и радиотерапии), включающему введение в клетки и/или ткань, имеющие пролиферативные нарушения, молекулDbait, таких как определено выше; тем самым индуцируя клеточную летальность указанных клеток и/или ткани. Настоящее изобретение также относится к способу повышения фосфорилирования гистона Н 2 АХ или активации гистона Н 2 АХ в клетках и/или ткани, включающему введение в указанные клетки и/или ткань молекул Dbait, таких как определено выше, тем самым повышая фосфорилирование гистона Н 2 АХ и активируя гистон Н 2 АХ. Гистон Н 2 АХ представляет собой белок, хорошо известный специалисту в данной области техники. Идентификационным номером в Swiss-Prot является Р 16104 и в Unigene Hs477879. Фосфорилирование осуществляется на Ser-139 (Li et al., 2005, для обзора).-5 016053 Настоящее изобретение в дополнении относится к способу индуцирования клеточной летальности клеток и/или ткани, имеющей пролиферативное нарушение, в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, включающему введение в указанные клетки и/или ткань молекул Dbait, таких как определено выше; тем самым вызывая клеточную летальность указанных клеток и/или ткани. В частном воплощении вышеуказанных способов на указанной стадии введения используют трансфекционный агент. Например, агент для трансфекции может выбираться из группы, состоящей из PEI(US 6013240), Superfect (Qiagene), катионных липидов, таких как Lipofectin (Invitrogen). В способах и применениях настоящего изобретения молекулы Dbait используются в эффективном количестве. В частности, количество молекул Dbait позволяет молекулам достигать ядро подвергаемой лечению клетки. Кроме того, количество является достаточным для активации ДНК-ПК и для повышения фосфорилирования гистона Н 2 АХ и для его активации. Настоящее изобретение касается применения молекул Dbait для приготовления лекарственного средства для лечения пролиферативного нарушения при отсутствии какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК. В предпочтительном воплощении указанные молекулы Dbait содержат двухцепочечную область по меньшей мере из 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30 п.н., предпочтительно 32 п.н., имеют по меньшей мере один свободный конец, и где указанная молекула Dbait является субстратом для связывания, по меньшей мере, белком Ku и способна активировать ДНК-ПКкс. Молекулы Dbait, по существу, представляют собой ДНК. Настоящее изобретение также относится к способу лечения пролиферативного нарушения у субъекта в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекул Dbait. В частности, изобретение относится к способу повышения продолжительности жизни субъекта,страдающего от рака, в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК(т.е. химио- и радиотерапии), включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекул Dbait, таких как определено выше; тем самым увеличивая продолжительность жизни указанного субъекта. Субъект может быть млекопитающим или человеком. Предпочтительно субъект представляет собой человека. В общем, "млекопитающий" относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая лабораторных, домашних, сельскохозяйственных животных и животных из зоопарков, конкретно домашних животных, таких как мыши, крысы, кролики, свиньи, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади и высшие приматы. Такой способ касается нового терапевтического агента, который может быть использован для лечения заболеваний, возникающих вследствие бесконтрольной клеточной пролиферации, в частности рака. Хотя молекулы Dbait предназначены, главным образом, для применения в противораковой терапии в качестве альтернативы традиционным способам лечения, основанным на разрушении ДНК, они могут также использоваться в антипролиферативном лечении доброкачественных заболеваний, таких как заболевания, связанные с повышенной скоростью клеточного деления (пролиферация), например псориаз или стеноз/рестеноз. Антипролиферативная активность определяется путем инъекции молекул Dbait в клетки эмбриона рыбы полосатый данио на ранней стадии. Молекулы Dbait специфично убивают внутренние клетки, делящиеся быстро, и оказывают слабое действие на периферические клетки, делящиеся медленно. Изобретение может применяться для лечения в качестве самостоятельной противоопухолевой терапии различных типов рака у млекопитающих субъектов, в особенности у человека, таких как солидные опухоли и лейкемия, в особенности радио- или химиорезистентных опухолей. Вовлеченным органом или областью может быть: легкие и бронхи, голова и шея, мозг, желудочно-кишечный тракт, поджелудочная железа, печень, колоректальный рак, мочеполовой рак, гинекологические органы, молочная железа, эндокринные органы, кожа, сетчатка, органы ЦНС, гематологические органы, метастазы из известного или неизвестного первичного очага и рудименты (тимус, например). Гистологической природой может быть эпителиальная, плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома, переходно-клеточная карцинома, фибробластного/ангиобластного происхождения (саркомы), нейрональная, глиального происхождения, эндокринная, карциноидная, гастроинтестинальная строма, эндотелиальная, гематопоэтическая и эмбриональная. Предпочтительно опухоль выбирается из группы, состоящей из глиобластомы, рака головы и шеи,толстой кишки, печени, легких, кожи, рака молочной железы и рака шейки матки. Молекулы Dbait могут быть введены любым подходящим способом, с подходящим приемлемым носителем/эксципиентом, таким как пероральное, или внутривенное или внутриопухолевое введение,или подкожные инъекции, или местное нанесение, или другие. Согласно воплощению изобретения трансфекционный агент используется в комбинации с молекулой Dbait. Исходя из протокола, использующегося в исследованиях in vivo, изобретение обеспечивает рациональную основу для создания клинического протокола применения молекул Dbait. Он будет без труда адаптирован специалистом в данной области для человека, а именно в зависимости от массы и поверхно-6 016053 сти тела пациента. Композиция настоящего изобретения содержит молекулы Dbait в эффективном количестве, чтобы включаться в ядро опухолевых клеток. Например, если применяется внутриопухолевое введение, то указанное эффективное количество составляет по меньшей мере 0,1 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 0,6 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см 3 опухоли. Эффективное количество может быть введено в режиме ежедневного лечения (например, 5 дней в неделю в течение 3 последовательных недель или 3 раза в неделю в течение 5 последовательных недель). Альтернативно, эффективное количество по меньшей мере из 0,3 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 1,8 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 3 мг на 1 см 3 опухоли может быть введено в режиме еженедельного применения в течение 5 последовательных недель, к примеру. Если применяются другие пути введения, то специалист в данной области может адаптировать количество для получения эффективного количества молекулDbait в опухоли, составляющего по меньшей мере 0,1 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 0,6 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см 3 опухоли, в особенности в протоколе ежедневного лечения, или получения эффективного количества молекул Dbait в опухоли, составляющего по меньшей мере 0,3 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 1,8 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 3 мг на 1 см 3 опухоли, в частности в протоколе еженедельного лечения. В дополнение, настоящее изобретение также относится к гистону Н 2 АХ как маркеру эффективности лечения пролиферативного нарушения (например, рака), в частности с помощью молекул Dbait, как описано здесь. Также настоящее изобретение относится к способу оценки эффективности лечения молекулами Dbait, содержащему определение скорости фосфорилирования гистона Н 2 АХ. Фосфорилирование гистона Н 2 АХ может быть определено, например, как описано в примерах. Более высокий уровень фосфорилирования гистона Н 2 АХ по сравнению с уровнем фосфорилирования без какого-либо лечения указывает на эффективность лечения. В частности, способ включает введение молекул Dbait субъекту,определение уровня фосфорилирования гистона Н 2 АХ и сравнение определенного уровня фосфорилирования гистона Н 2 АХ с и без какого-либо лечения молекулами Dbait. Конститутивный высокий уровень фосфорилированного гистона Н 2 АХ перед любым лечением в специфичной опухоли также является хорошим маркером эффективности проведения самостоятельного лечения Dbait на эту опухоль. Другие характеристики и преимущества изобретения будут представлены в следующих примерах с ссылками на приведенные чертежи и таблицы. Примеры Хотя молекулы Dbait были подробно описаны в патентной заявке WO 2005/040378, для полной ясности конструкция, синтез и приготовление молекул Dbait суммированы в примере 1. Молекулярные и клеточные исследования способности индуцировать фосфорилирование Н 2 АХ, а также демонстрация вовлеченности ДНК-ПКкс и не вовлеченности ATM-опосредованного пути приведены в примере 2. Анализы in vivo, которые показывают регрессию опухоли и пролонгированное выживание в ксенотрансплантированных опухолях человека на голых мышах, описаны в примере 3. Пример 1. Конструкция, синтез и приготовление молекул Dbait. Создавали два типа молекул Dbait: линейные или шпилечные дцДНК (двухцепочечная ДНК) фрагменты. Для шпилечных молекул Dbait использовали гексаэтиленгликолевый линкер или тетрадезокситимидилат в качестве петли. Конец(ы) стебля дцДНК может быть защищен от химического расщепления 3'-экзонуклеазами путем включения фосфоротиоатов, метилфосфонатов или 3'-3'-нуклеотидной связи. В принципе, могут применяться другие химические модификации, обеспечивающие совместимость с Ku70/Ku80 связыванием и активацию ДНК-ПКкс (MartenssonHammarten, 2002). Различные молекулы Dbait с разной длиной стебля 8 п.н. (Dbait8H), 16 п.н. (Dbaitl6H), 24 п.н. (Dbait24H) и 32 п.н. (Dbait32H), а также различные последовательности стебля с одинаковыми содержаниями GC/AT (Dbait32H, Dbait32Ha, Dbait32Hb,Dbait32Hc и Dbait32Hd) были синтезированы и исследованы. Имеет смысл отметить отсутствие CpG последовательностей в Dbait32Hc. Также был создан фрагмент гантелевидной дцДНК (Dbait32C), в котором оба конца закрыты двумя петлями из гексаэтилена, в качестве контроля. Некоторые молекулы Dbait были помечены посредством Т, меченного флуоресцеином (Dbait32H-FITC), цианином 3 (Dbait32H-Cy3),цианином 5 (Dbait32Hc-Cy5) или биотином (Dbait32H-Biot). Табл. 1, 2 и 3 обобщают последовательности и химические структуры молекул Dbait, используемых в данной работе. Молекулы Dbait описываются в перечне последовательностей под следующими регистрационными номерами:-8 016053 Таблица 1.1 Последовательности и химические структуры молекул Dbait. Заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфодиэфирным остовом. Жирные заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфоротиоатным остовом. Полукруглая сплошная линия символизирует гексаэтиленгликолевый линкер.Dbait32-T4 содержит четыре тимина (Т 4) в качестве линкера вместо гексаэтиленгликолевого линкера.Dbait32C является гантелевидной (закрытой) молекулой. Dbait32Hc-5'5' получена из Dbait32Hc, где 3'-3'связь была введена на прежний 3'-конец, тем самым представляя только два 5'-конца. Молекулы Dbait Последовательности и химические структуры Таблица 1.2 Последовательности и химические структуры различных меченных молекул Dbait, как указано. Молекулы Dbait Последовательности и химические структуры Таблица 1.3 Последовательности и химические структуры 64-п.н. Dbait64 и Dbait64L молекул. Заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфодиэфирным остовом. Жирные заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфоротиоатным остовом. Полукруглая сплошная линия символизирует гексаэтиленгликолевый линкер. Все молекулы Dbait были приготовлены с помощью автоматизированного твердофазного олигонуклеотидного синтеза (Eurogentec, Belgium). Они были очищены посредством денатурирующей обращено-фазовой ВЭЖХ. Денатурирующий капиллярный гель-электрофорез. MALDI-TOF/ЖХ-МС использовался для контроля качества. Более чем 85 или 90% олигонуклеотидов являются полноразмерными. Все образцы были лиофилизированы перед отправкой. При получении все образцы растворяли в бидистиллированной воде. Концентрации молекул Dbait рассчитывали по поглощаемости при длине волны 260 нм (Cantor etal., 1970) при денатурирующем условии (60-90 С в зависимости от тепловой стабильности молекулDbait). Концентрации флуоресцентного красителя, которым мечены молекулы Dbait, рассчитывали по поглощению при подходящей длине волны определенного красителя (FITC:= 80000 М-1 см-1 при 490 нм; Су 3:= 150000 М-1 см-1 при 550 нм; Су 5:= 250000 М-1 см-1 при 650 нм). Фрагмент гантелевидной дцДНК (Dbait32C) был приготовлен путем отжига и лигирования с помощью Т 4 ДНК лигазы (BioLabs) двух полу-шпилек, содержащих гексаэтиленгликолевый линкер и с 3'-выступающими и комплементарными концами. Исходя из термодинамических и кинетических соображений, следующие протоколы использовались для приготовления образцов молекул Dbait в соответствии с их молекулярностью: для бимолекулярных молекул Dbait (Dbait32, Dbait32-NH2, Dbait64 и Dbait64L) смесь из 1:1 основного раствора (предпочтительно с высокой концентрацией) каждой цепи в бидистиллированной воде нагревали при 90 С в течение 5 мин для полной денатурации каждой цепи. Отжиг осуществляли путем постепенного охлаждения до комнатной температуры (образцы обычно оставляли в-9 016053 водяной бане) и итоговые дуплексные молекулы хранили в аликвотах при -20 С; для мономолекулярных молекул Dbait (шпилька) раствор, содержащий 200 мкМ шпильковой молекулы Dbait в бидистиллированной воде, нагревали при 90 С в течение 5 мин для полной денатурации. Отжиг осуществляли путем охлаждения образцов в ледяной воде (0 С). Хранили аликвоты при -20 С. Пример 2. Молекулярная и клеточная биологические активности молекул Dbait perse. Патентная заявка WO 2005/040378 обеспечивала экспериментальные данные и в присутствии клеточного неочищенного экстракта, и в отсутствие любого лечения, направленного на повреждение ДНК. 1) Молекулы Dbait являются ловушками для белков Ku, вовлеченных в первый этап пути NHEJ; 2) молекулы Dbait являются конкурентами реакции соединения концов ДНК, но не перемещают связанный комплекс. Рекрутинг белков Ku предварительно требуется; 3) молекулы Dbait длиной 32 п.н. способны активировать ДНК-ПК. Простой анализ активности клеток, свободных от ДНК-ПК, показывает, что только длина (около 32 п.н.) и двухцепочечная ДНК со свободным концом молекулы Dbait требуются для активности киназы независимо от их последовательности и в некоторой степени химических модификаций. Это согласуется с ролью ДНК-ПКкс в пути NHEJ, не зависимом от последовательности ДНК механизме соединения концов. Дальнейшие эксперименты осуществлялись изобретателями для оценки, имеют ли молекулы Dbait биологическое влияние в отсутствие какого-либо повреждающего ДНК лечения. Неожиданно было обнаружено, что присутствие молекул Dbait вызывает фосфорилирование варианта гистона, Н 2 АХ, известного как блюститель геномной целостности, как фосфорилированной формы Н 2 АХ, -Н 2 АХ, формы расположенные на участках ДНР, и активирует репарацию нижележащей ДНК. Размер -Н 2 АХ в культивированных клетках или клетках, собранных в опухолях, обработанных Dbait32Hc, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и FACS. In vivo, значимая регрессия опухоли наблюдалась в трех ксенотрансплантированных опухолях человека на голых мышах. Устойчивые клеточные линии человека Нер 2 (плоскоклеточная карцинома головы и шеи, HNSCC),LU1205 и SK28 (меланомы) использовали для изучения на животных. Исследования клеток осуществляли с использованием Нер 2, HeLa S3 (эпителиальные клетки карциномы шейки матки), MO59K и MO59J(глиобластома), MRC5 и AT5BI (фибробласты). Клетки выращивали при 37 С в монослойных культурах в полной DMEM, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, инактивированную нагреванием (ФТС;Invitrogen, Cergy Pontoise, France) и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин и 100 мкг/мл пенициллин) при условиях 100% влажности, 95% воздуха и 5% СО 2. LU1205 выращивали в MCDB, содержащей 4% инактивированную нагреванием фетальной телячьей сыворотки (ФТС), 1% глутамин и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин и 100 мкг/мл пенициллин). Экспоненциально растущие клетки в 6-луночных планшетах собирали и инкубировали с 700 мл полной среды DMEM, содержащей смесь молекул Dbait и реагента Superfect (Qiagen, Courtaboeuf, France) в отношении 10 мкл Superfect на мкг ДНК. Через 5 ч при 37 С под стандартными условиями клетки промывали PBS и добавляли полную среду DMEM. Для анализа Вестерн-блоттинга клетки выращивали в чашках Петри диаметром 5 см, 2 мкг молекулDbait32Hc трансфицировали вместе с Superfect (Qiagene) в соответствии с инструкцией производителя,затем оставляли в покое в течение различного времени в среде при температуре 37 С. Через 5 ч при 37 С при стандартных условиях клетки промывали 3 раза PBS и добавляли полную среду DMEM. Клетки инкубировали один дополнительный час, промывали 3 раза и лизировали в буфере Лэммли. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, которые были блокированы 5% обезжиренным молоком (1 ч) перед инкубацией в течение ночи вместе с антителами против Н 2 АХ (Cell Signaling Technology, Denver,USA) и мышиными антителами против фосфо-Гистона Н 2 АХ (Ser139) (Upstate, Tempcula, CA, USA),кроличьими моноклональными антителами против фосфоThr68-Chk2 (Cell Signaling Technology, Denver,USA), разбавленными 1/100 в 1PBS,1% BSA. Блоты затем инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими вторичными антителами против кроличьего IgG (P0448, Dako), разведенными 1/5000 в TBST. Комплексы белок-антитело обнаруживали на пленке Hyperfilm (Amersham) и количество определяли при использовании ImageJ (Public domain). Для иммунофлуоресцентного определения -Н 2 АХ с помощью FACS, клетки выращивали в чашках Петри диаметром 5 см, 2 мкг молекул Dbait32Hc трансфицировали вместе с Superfect (Qiagene) в соответствии с инструкцией производителя, затем оставляли в покое в течение различного времени в среде при температуре 37 С. После 3 циклов промывки клетки фиксировали с 2% PFA в течение 10 мин. После одного дополнительного промывания присутствие -Н 2 АХ определяли с кроличьим антиН 2 АХ антителом (4411-РС, Trevigen), разведенным 1/100 в 1PBS, 1% BSA. Клетки промывали три раза с 1PBS,0,5% TritonX-100, затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с конъюгированными с родамином козьими антикроличьими антителами, разведенными 1/100 в lPBS, 1% BSA. Клетки анализировали с помощью проточного цитометра FACScan (FACSalibur, Beckton-Dickinson, USA). Поскольку Dbait32H/Dbait32Hc активировали киназную активность ДНК-ПКкс в исходном экстракте, изобретатели задались вопросом, будут ли они индуцировать фосфорилирование нижележащих ми- 10016053 шеней ДНК-ПКкс в живых клетках. Изобретатели анализировали, тем самым, фосфорилирование Н 2 АХ в Dbait32 Нс-трансфицированных клетках (Chowdhury et al., 2000; Paull et al., 2000). Фиг. 1 показывает, что трансфекция с помощью Dbait32Hc в большой степени стимулирует фосфорилирование Н 2 АХ во всех ДНК-ПКкс компетентных опухолевых клеточных линиях (Hela, Hep2,MO59K и измененная линия фибробластов MRC5). Однако фосфорилирование Н 2 АХ не наблюдалось в ДНК-ПКкс дефицитной опухолевой клеточной линии (MO59J, полученная от MO59K), тогда как оно есть в ДНК-ПКкс компетентной, но ATM-дефицитной измененной линии фибробластов (AT5BI, полученная в MRC5). Это показывает, что, in vitro, Dbait-зависимая активация киназы является общим процессом, который не зависит от происхождения клеточной линии. Фосфорилирование Н 2 АХ зависит от статуса ДНК-ПКкс, но не от ATM. Высокий уровень -Н 2 АХ сохранялся до 24-48 ч. Фиг. 2 показывает уровень фосфорилированной формы Н 2 АХ и контрольного протеина Chk2 посредством ATM на Thr68 (Chk2-T68p) в Нер 2 клетках через 5 ч после трансфекции различными молекулами Dbait и через 1 ч после облучения 10 Гр без трансфекции Dbait32Hc. Высокий уровень -Н 2 АХ наблюдался только в клетках, трансфицированных Dbait32Hc. Этот уровень выше в Dbait32Hc трансфицированных клетках, чем в облученных клетках. В отличие от этого уровень Chk2-T68p мало повышался вDbait32Hc трансфицированных клетках и намного больше, чем в облученных клетках. Эти результаты подтверждают, что Dbait32Hc не активирует киназу ATM. Фиг. 3 показывает уровень -Н 2 АХ в клетках, отобранных из Нер 2 опухолей, обработанных 60 мкгDbait32Hc (внутриопухолевая инъекция, с PEI в качестве агента трансфекции), и сравнивается с фоновым уровнем в Нер 2 опухолях без лечения. Опухоли удаляли через 24 ч после лечения, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 С. Перед проведением анализа клетки разделяли механическим путем, затем метили для Вестерн-блоттинга или анализа FACS (см. ниже). Необходимо отметить,что уровень -Н 2 АХ был довольно высоким даже в нелеченных опухолях, однако, уровень, наблюдаемый в опухолях, обработанных Dbait32Hc, был значительно выше. Фиг. 4 показывает анализ FACS около 10000 клеток. Высокий уровень -Н 2 АХ наблюдается в Нер 2 клетках опухоли, обработанной 60 мкг Dbait32Hc, по сравнению с нелеченной или обработанной 60 мкгDbait8H, использующегося в качестве контроля трансфекции. Пример 3. Лечение ксенотрансплантированных голым мышам опухолей человека.In vivo активность молекул Dbait в качестве новой молекулярной терапии, альтернатива традиционной терапии, направленной на повреждение ДНК, оценивали с помощью использования голых мышей,которым ксенотрансплантировали опухоли человека путем подкожной инъекции клеточных линий, резистентных к воздействию радиоволн (Нер 2, полученные из плоскоклеточной карциномы головы и шеи человека, HNSCC; и LU1205 и SK28, полученной из меланомы человека). Исследования проводили на мышах, которым ксенотрансплантировали различные опухоли человека для обеспечения доказательства концепции in vivo. Ксенотрансплантацию проводили посредством инъекций около 1 млн опухолевых клеток человека. Лечение начали, когда объем опухоли достиг около 200 мм (около 7-10 дней после инокуляции опухолевых клеток). Размер опухоли измеряли 2-3 раза в неделю. Объем опухоли рассчитывали (V=2ab2, где a=длина, b=ширина). За мышами наблюдали по меньшей мере до 150 дней. Когда объем опухоли превысил 2 см 3, животных умерщвляли в соответствии с экспериментальной этикой и время умерщвления устанавливали как время смерти (предел выживаемости, использующийся в графике Каплана-Майера). Типичные условия проведения анализа состояли во внутриопухолевой инъекции соответствующего препарата, содержащего 1-6 нмоль молекул Dbait вместе с трансфицирующим агентом полиэтиленимином (PEI, Polyplus Transfection). Для HNSCC ксенотрансплантата инъекция заключенной в готовую форму молекулы Dbait (Dbait32H или Dbait32Hc) выполнялась каждые 2 дня, 3 дня в течение 5 недель. ДляLU1205 и SK28 ксенотрансплантата заключенную в готовую форму молекулу Dbait32Hc инъецировали в течение трех последовательных дней и повторяли один раз на следующей неделе. Фиг. 5 показывает график Каплана-Майера для HNSCC ксенотрансплантатов на голых мышах. Абсолютная пролонгированная выживаемость наблюдалась для групп, подвергнутых лечению 60 мкг (3 нмоль) и 120 мкг (6 нмоль) молекул Dbait32H/Dbait32Hc, тогда как лечение 60 мкг (6 нмоль) одноцепочечного контроля (Dbait32ss) было отрицательным. Преимущество Dbait32Hc также видно для двух других ксенотрансплантатов опухолей человека(LU1205 and SK28) на голых мышах, как показано на фиг. 6 и 7. Преимущество Dbait32Hc наблюдается независимо от частоты введения заданного общего количества. Введение может быть разделено по частоте 3, 2 или, в идеале, одна инъекция в неделю. Описательный анализ опухолевого ответа выполняли для каждого лечения и каждого типа опухоли. День 1 был днем первого сеанса лечения. Всех животных наблюдали в течение по меньшей мере 150 дней или до их этического умерщвления. Среднюю продолжительность жизни определяли согласно способу Каплана-Майера. TGD рассчитывали путем вычитания среднего времени увеличения вчетверо объема опухоли контрольной группы из времени увеличения вчетверо объема опухоли индивидуальной мыши в каждой группе, подвергнутой лечению. Среднее значение TGD рассчитывали для каждой груп- 11016053 пы, используя индивидуальные измерения. Кривые общей выживаемости определяли по оценкам Каплана-Майера и сравнивали, используя непараметрический тест логарифмических рангов (Log Rank), поскольку данные не следовали нормальному распределению. Для анализа использовали программное обеспечение S-Plus 6.2 version (MathSoft Inc.,Seattle, WA) и statEL (ad Science, Paris, France). Глобальный Log Rank-тест был сначала выполнен для каждой группы с одинаковым типом опухоли. Затем лечение с помощью Dbait сравнивали с не получавшим лечение контролем. Число животных (n), относительный риск (RR) и значение Р представлены в табл. 4. Все тесты оценены достоверными при уровне значимости 0,05. С: группа с нелечеными опухолями, использующаяся как группа контроля для статистической оценкиTGD расчет и статистический анализ, описанный в Материалах и методах Излеченные мыши представляют животных, выживших более 200 дней после начала лечения Таблица 4 Статистический анализ эффективности лечения Dbait32H/Hc ксенотрансплантированных опухолей у голых мышей Статистически значимое преимущество прямого действия Dbait32H/Dbait32Hc наблюдается в ксенотрансплантированных опухолях человека. Исходя из основополагающего механизма действия молекулDbait и встречающегося повсеместно пути NHEJ во всех клетках, предполагается, что они являются применимыми для других опухолей с различной гистологией. Пример 4. Иммунный ответ на инъекций Dbait. Не было определено значимой индукции какого-либо цитокина Dbait32Hc, как бы инъекция не вводилась - внутривенно или подкожно. Изобретатели оценивали иммунный ответ после внутривенного введения (IV) или подкожного (SC) Dbait32Hc в Balb/C мышах. Уровни IL2, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12P70,IFN и TNF были измерены в образцах крови при различном временном периоде после повторных инъекций Dbait. Животные, получившие семь инъекций 120 мг (9 нмоль) Dbait в 24 дня, без развития какихлибо токсических проявлений или кожного воспаления. Изобретатели сравнивали иммунный ответ кDbait32Hc, которая не содержала какой-либо иммуногенной последовательности CpG, и Dbait32H, которая содержала четыре CpG. Только Dbait32H индуцировала быстрый ответ IL6 и более замедленный ответ IL12p70 (фиг. 8). Ссылки(1998), 37, 1336-43. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для приготовления лекарственного средства для лечения пролиферативного нарушения в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит двухцепочечную область по меньшей мере из 16 п.н., предпочтительно более чем 26 п.н., более предпочтительно 32 п.н.,имеет по меньшей мере один свободный конец и в котором указанная молекула является субстратом для связывания, по меньшей мере, посредством белка Ku и способна активировать ДНК-ПК. 2. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит между 16 и 200 п.н., наиболее предпочтительно между 32 и 100 п.н. 3. Применение по п.2, в котором указанная молекула является линейной или шпилечной молекулой нуклеиновой кислоты. 4. Применение по п.1, в котором указанная молекула является шпилечной молекулой нуклеиновой кислоты и в котором петля содержит нуклеиновую кислоту или химические группы. 5. Применение по п.1, в котором свободный конец является тупым или 5'- или 3'-выступающим. 6. Применение по п.1, в котором указанная молекула увеличивает фосфорилирование гистона Н 2 АХ. 7. Применение по п.1, в котором указанная молекула способна быть поглощенной клеткой в клеточное ядро. 8. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит фосфодиэфирный остов, или химически модифицированный фосфодиэфирный остов, или другой остов с одной или несколькими химиче- 13016053 скими группами. 9. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит 2'-дезоксинуклеотидный остов и необязательно содержит один или несколько модифицированных нуклеотидов и/или нуклеиновых оснований, отличных от аденина, цитозина, гуанина и тимина. 10. Применение по п.8, в котором указанный остов содержит метилфосфонаты, фосфорамидаты,морфолинонуклеиновую кислоту, замкнутую нуклеиновую кислоту с 2'-0,4'-С метиленовым этиленовым мостиком, пептидно-нуклеиновую кислоту (ПНК) и короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные связи между остатками сахара или короткоцепочечные гетероатомные или гетероциклические связи внутри остатков сахара различной длины. 11. Применение по п.9, в котором указанная молекула дополнительно содержит имитаторы остатков сахара, такие как 2'-О-алкилрибоза, 2'-О-алкил-С 4' разветвленная рибоза, циклобутилы или другие карбоциклические группы или гексит вместо пентофуранозильной группы. 12. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит один или несколько химически модифицированных нуклеотид(ов) на конце каждой цепи или по меньшей мере на 3'-концевой цепи. 13. Применение по п.12, в котором указанная молекула содержит один или несколько фосфоротиоатов на конце каждой цепи или по меньшей мере на 3'-концевой цепи. 14. Применение по п.1, в котором указанная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один встроенный элемент, который препятствует репликации ДНК, репарации ДНК или процессу передачи сигнала повреждения, причем указанный по меньшей мере один элемент встроен в центре или на конце двухцепочечной молекулы. 15. Применение по п.14, в котором указанная молекула содержит:a) полиэтиленгликолевую цепь, предпочтительно гексаэтиленгликолевую цепь, или любую углеводородную цепь, необязательно оборванную и/или замещенную одним или более гетероатомами, например кислородом, серой, азотом, или гетероатомными или гетероциклическими группами, содержащими один или более гетероатомов; и/илиb) элемент, который представляет собой блокирующий элемент, который не доступен ДНК полимеразам или экзонуклеазам, такой как любые 3'-модифицированные нуклеотиды, и/илиc) нативный олигонуклеотид, такой как Tn, если используется в петле шпилечного фрагмента,предпочтительно тетрадезокситимидилат (Т 4). 16. Применение по п.1, в котором указанная молекула имеет двухцепочечную область по меньшей мере из 32 п.о. или из 32 п.н., содержащая такой же нуклеотидный состав, что 17. Применение по п.16, в котором указанная молекула выбирается из группы, состоящей из 18. Применение по п.1, в котором двухцепочечная область указанной молекулы содержит по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательно расположенных нуклеотида из Dbait32Dbait32Hd (SEQ ID No 31). 19. Применение по любому из пп.1-18, в котором указанное пролиферативное нарушение представляет собой рак, предпочтительно выбранный из глиобластомы, рака головы и шеи, толстой кишки, печени, легких, кожи, молочной железы и рака шейки матки. 20. Применение по п.19, в котором лекарственное средство предназначено для введения пероральным путем или посредством внутривенной, внутриопухолевой или подкожной инъекции, интракраниально или посредством внутриартериальной инъекции или инфузии или посредством перорального пути введения. 21. Применение по п.19, в котором лекарственное средство предназначено для внутриопухолевого введения в эффективном количестве по меньшей мере 0,1 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 0,6 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см 3 опухоли в режиме ежедневного лечения или по меньшей мере 0,3 мг на 1 см 3 опухоли, предпочтительно 1,8 мг на 1 см 3 опухоли, наиболее предпочтительно 3 мг на 1 см 3 опухоли в режиме еженедельного лечения.