Иммуно-адъювантная эмульсия

012376 Настоящее изобретение относится к области вакцин, в частности изобретение относится к области вакцин, содержащих адъювантную эмульсию. В уровне техники существует множество вакцин, которые содержат один или несколько адъювантов. В частности, в патенте US 6299884 описана адъювантная композиция, содержащая эмульсию "масло в воде", в которой размер капелек масла составляет от 100 до 1000 нм. Эта эмульсия получена с помощью гомогенизатора высокого давления (микрофлюидизатора),использующего в ходе получения высокую механическую энергию для создания достаточно больших сдвиговых усилий, чтобы уменьшить размер капель масла. Согласно этим рекомендациям, если минимальный разброс размеров полученных капель составляет 100 нм, среднее значение существенно больше и в лучшем случае составляет около 170 нм, более типично около 500 нм. Желательно располагать композицией, альтернативной той, которая предложена в данном патенте,которую можно было бы получить более простым способом (не требующим особой технологии сдвига) и при низких затратах энергии, воспроизводимым и вполне надежным; кроме того, адъювантная композиция должна действенно усиливать вакцины, позволяя, в частности, усилить получаемый иммунный ответ или уменьшить дозу присутствующего антигена, не обнаруживая при этом признаков токсичности, которые повредили бы ее безопасному введению. Для достижения этой цели настоящее изобретение направлено на адъювантную эмульсию "масло в воде", отличающуюся тем, что она содержит, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное поверхностно-активное вещество (ПАВ), являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром,неионное гидрофобное ПАВ, тем, что является термообратимой, и тем, что 90% суммарного объема капель масла образовано каплями размером меньше 200 нм. Согласно изобретению такая эмульсия может быть получена способом обращения фаз путем изменения температуры, что дает очень большое преимущество с точки зрения промышленности. Такой способ предоставляет все гарантии безопасности и рентабельности, требуемые в фармацевтической промышленности. Кроме того, благодаря этому способу можно получить монодисперсную эмульсию с очень малым размером капелек масла, что делает полученную таким путем эмульсию особенно стабильной и легко фильтруемой через стерилизующие фильтры, у которых предел пропускания составляет 200 нм. Согласно частной характеристике 90% полного объема капелек масла (или d90) имеют размер меньше 160 нм и даже меньше 150 нм. Согласно частному варианту изобретения эмульсия по изобретению дополнительно содержит альдитол; он позволяет получить обращение фаз при температуре ниже той, которая была бы необходима для этой же композиции, не содержащей альдитол, что позволяет снизить стоимость производства, а также опасность ухудшения естественных свойств при нагревании компонентов эмульсии. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления неионное гидрофобное ПАВ по изобретению является сложным эфиром сорбитана или сложным эфиром маннида. Такие ПАВ обладают тем преимуществом, что их можно совершенно безопасно использовать в растворах для инъекций. Согласно частному варианту изобретения эмульсия дополнительно содержит алкилполигликозид и такой криозащитный агент, как сахар, в частности додецилмальтозид и/или сахарозу. Так можно получить лиофилизуемую эмульсию, которая после лиофилизации и восстановления влагосодержания приобретает свои свойства, в частности гранулометрические, т.е. лиофилизованная, а затем восстановленная эмульсия всегда является монодисперсной и образована капельками масла, у которых 90% суммарного объема капель масла образовано каплями размером меньше 200 нм. Это особенно важно в области вакцин, которые должны иногда, из соображений стабильности (либо некоторых антигенов, либо некоторых адъювантов) храниться в лиофилизованной форме. Объектом изобретения является также способ получения иммуногенной композиции, согласно которому по меньшей мере один вакцинный антиген смешивают с эмульсией "масло в воде", отличающийся тем, что эмульсию "масло в воде" получают способом обращения фаз путем изменения температуры. Согласно одному варианту осуществления способ по изобретению включает по меньшей мере одну стадию получения эмульсии "масло в воде" путем охлаждения обратной эмульсии "вода в масле", которая содержит, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, неионное гидрофобное ПАВ. Благодаря такому способу, очень выгодному с промышленной точки зрения, получают стабильную иммуногенную композицию, очень эффективную даже при очень низкой дозе антигенов. Кроме того, благодаря используемому способу получения все капельки масла в эмульсии получаются одного и того же очень малого размера; действительно, когда проводят измерение гранулометрических свойств (размер и распределение по размеру), отмечается, что имеется монодисперсная эмульсия с кривой распределения типа гауссовой, очень узкой, с центром при очень малом значении, обычно около 80-90 нм. Согласно частному варианту осуществления способа по изобретению обратную эмульсию "вода в масле" получают, смешивая сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное ПАВ, которое представляет собой полиоксиэтиленалкиловый эфир, и неионное гидрофобное ПАВ, чтобы получить сначала грубую эмульсию "масло в воде", и затем нагревают эту эмульсию, по меньшей мере, до температуры-1 012376 обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию. Преимуществом такого образа действия является уменьшение времени, в течение которого разные компоненты эмульсии будут находиться при повышенной температуре. Согласно другому варианту осуществления способ по изобретению включает следующие стадии: по отдельности нагревают до температуры, по меньшей мере, равной температуре обращения фаз, с одной стороны, водную фазу, содержащую водный растворитель и полиоксиэтиленалкиловый эфир, а с другой стороны, масляную фазу, содержащую сквален и гидрофобное ПАВ, и затем смешивают обе фазы, чтобы получить обратную эмульсию "вода в масле". Согласно частному варианту осуществления изобретения каждую из водной и масляной фазы до смешения нагревают раздельно до температуры ниже температуры обращения фаз. Затем обе фазы смешивают, чтобы получить эмульсию "вода в масле"; затем все это нагревают до температуры, равной, по меньшей мере, температуре обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию "вода в масле". Согласно частному варианту осуществления способ получения по изобретению дополнительно включает стадию лиофилизации. Так способ согласно изобретению может использоваться для получения иммуногенных композиций, содержащих антигены, которые из соображений стабильности должны храниться в лиофилизованной форме. Многие другие преимущества настоящего изобретения будут выявлены в ходе следующего описания. В описании изобретения параметры d50 и d90, упоминаемые в настоящем патенте, являются объемными значениями; величина d50 относится к 50% полного объема капель. Под эмульсией "масло в воде" в контексте изобретения понимают дисперсию масляной фазы в водной фазе, которая может быть образована либо водой, либо раствором соли, обычно буферированным. Согласно частному варианту осуществления изобретения водная фаза эмульсии образована буфером,таким как фосфатно-солевые буферные растворы Дульбекко (D-PBS, без кальция и магния). Под "адъювантной" эмульсией понимают иммуно-адъювантную эмульсию, т.е. эмульсию, способную изменять ответ иммунной системы, вызванный введением антигена, по сравнению с ответом, получаемым в отсутствие эмульсии; этот ответ иммунной системы может выражаться в выработке антител или в активизации определенных клеток, в частности, антигенпрезентирующих клеток (например, дендритных клеток), Тлимфоцитов, В-лимфоцитов. Эта клеточная активация может быть подтверждена присутствием маркеров активизации на поверхности клеток или по высвобождению цитокинов. Модификация иммунного ответа,вызванного адъювантной эмульсией, может иметь количественную природу, т.е. получают усиление индуцированного ответа, или качественную природу, т.е. получают ответ другой природы или направления, или также получают дополнительный ответ. Под адъювантной эмульсией понимают также эмульсию, которая позволяет снизить количество вводимых антигенов при одном и том же индуцированном ответе. Под иммуногенной композицией в контексте настоящего изобретения понимают композицию, содержащую по меньшей мере один антиген, которая может быть введена человеку или животному, чтобы вызвать ответ иммунной системы. Этот ответ может быть гуморальным (выработка антител) или клеточным (пролиферация и/или активация иммунных клеток) ответом. Иммуногенная композиция может быть композицией, направленной на профилактику или лечение, или на то и другое. Иммуногенная композиция, полученная согласно изобретению, может быть введена любыми способами, используемыми или рекомендуемыми обычно для вакцин: парентерально, через слизистую и т.д., и может находиться в различных формах, в частности в жидкой или лиофилизованной. Она может быть введена с помощью шприца или с помощью безыгольного инъектора для внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекции либо с помощью назального спрея. Под антигеном в контексте настоящего изобретения понимают любые антигены, которые можно использовать в вакцине, идет ли речь о целом возбудителе или звене антигена, неважно какой природы; действительно, антиген может быть пептидом, белком, гликопротеином, полисахаридом, гликолипидом,липопептидом и т.д. Адъювантная эмульсия согласно изобретению особенно подходит для вирусных антигенов; действительно, особенно хорошие результаты получены с антигенами цитомегаловируса человека, вируса иммунодефицита человека и гриппа. Что касается антигенов вируса гриппа, можно использовать антигены,полученные из одного штамма вируса или смеси разных штаммов. Можно использовать антигены, полученные из вируса, выращенного традиционными способами на яйцах или на клетках. Следует отметить,что благодаря изобретению можно было и на одном штамме, и на смеси штаммов получить удовлетворительный ответ иммунной системы при сильно сниженном количестве антигенов, присутствующих в дозе вакцины. Это может представлять особенно большой интерес в случае получения вакцины против пандемии гриппа, когда за очень короткий срок нужно произвести очень большое количество вакцинных доз. Согласно изобретению эмульсия "масло в воде" содержит сквален, который представляет собой масло, получаемое из печени акулы; это масло, грубая химическая формула которого имеет вид C30H50,содержит 6 двойных связей, и это масло может быть метаболизовано и имеет свойства, позволяющие использовать его в инъецируемых фармацевтических продуктах. Существует также сквален растительного происхождения, экстрагируемый из оливкового масла. В частности, хорошие результаты получены-2 012376 при использовании сквалена, поставляемого компанией Fluka, имеющего животное происхождение. Количество сквалена, используемого для получения концентрированной эмульсии, выгодно составляет от 5 до 45%; затем эту концентрированную эмульсию разбавляют в процессе приготовления иммунногенных композиций для получения иммунизирующих доз, в которых количество сквалена будет составлять от 0,5 до 5%. Это разбавление можно проводить простым смешением адъювантной эмульсии по изобретению и суспензии, содержащей антиген. Согласно изобретению эмульсия содержит неионное гидрофильное ПАВ, у которого значение гидрофильно-липофильного баланса, или ГЛБ, выше или равно 10, и которое относится к химической группе полиоксиэтиленалкиловых эфиров (РАЕ), называемых также полиоксиэтилированными жирными спиртами или полиоксиэтиленгликолевыми эфирами н-спиртов. Эти неионные ПАВ получают химической конденсацией жирного спирта и этиленоксида. Они имеют общую химическую формулу типаCH3(CH2)х-(О-СН 2-СН 2)n-ОН, в которой n означает число звеньев этиленоксида и составляет обычно от 10 до 60, и х+1 является углеродным числом, представляющим функцию используемых жирных спиртов. Обычно эти продукты являются смесями полимеров с близкой длиной углеводородных цепей. Эмульсия согласно изобретению содержит обычно один гидрофильный РАЕ. Подходит также смесь нескольких РАЕ, если полное значение ГЛБ 10. Полиоксиэтилированные эфиры жирных спиртов, подходящие для целей изобретения, могут находиться в жидкой или твердой форме при температуре окружающей среды. Из твердых соединений предпочтительны соединения, которые сразу растворяются в водной фазе или которые не требуют существенного нагревания. Если число звеньев этиленоксида достаточно, для целей изобретения особенно подходят полиоксиэтилированные эфиры лаурилового, миристилового, цетилового, олеинового и/или стеаринового спиртов. Их можно найти, в частности, в серии продуктов, известных под товарными наименованиями Brij(продукты, поставляемые фирмой ICI America's Inc.), Eumulgin (продукты, поставляемые фирмой Cognis) или Simulsol (продукты, поставляемые фирмой SEPPIC). Особенно предпочтительная эмульсия согласно изобретению в качестве неионного гидрофильного ПАВ содержит полиоксиэтиленалкиловый эфир, выбранный из группы, включающей цетеарет-12 (выпускаемый под названием Eumulgin B1), цетеарет-20 (Eumulgin B2), стеарет-21 (Eumulgin S21), цетет-20 (Simulsol 58 или Brij 58), цетет-10 (Brij 56), стеарет-10 (Brij 76), стеарет-20 (Brij 78), олет 10 (Brij 96 или Brij 97), олет-20 (Brij 98 или Brij 99). Число, добавленное к каждому химическому названию, соответствует числу звеньев этиленоксида в химической формуле. Хорошие результаты получены с продуктом BRIJ 56. Особенно подходящим соединением, предпочтительным ввиду его полусинтетического происхождения, является полиоксиэтилированный(12 моль) цетостеариловый эфир, поставляемый фирмой COGNIS под названием Eumulgin B1. Это соединение является смесью СН 3(СН 2)15-(O-CH2-CH2)12-OH и СН 3(СН 2)17-(O-СН 2-СН 2)12-ОН. Согласно изобретению адъювантная эмульсия содержит также неионное гидрофобное ПАВ; имеется в виду ПАВ, которое может использоваться в фармацевтической промышленности; из ПАВ, подходящих в этом отношении, можно назвать сложные эфиры сорбитана, а также сложные эфиры маннида; причем эфиры сорбитана получены реакцией жирной кислоты и смеси частичных эфиров сорбита и его моно- и диангидридов; имеются в виду моно-, ди- или триэфир, или даже смесь; это гидрофобные ПАВ,у которых суммарный гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) ниже 9, предпочтительно ниже 6. Их можно найти, в частности, в серии ПАВ, выпускаемых фирмой ICI America's Inc. под названием SPAN,или фирмой COGNIS под названием Dehymuls, или фирмой ICI под названием ARLACEL; в качестве примеров особенно хорошо подходящих ПАВ можно назвать моноолеат сорбитана, выпускаемый под названием Dehymuls SMO или SPAN 80. Из ПАВ, образованных сложными эфирами маннида, можно назвать моноолеат маннида, выпускаемый фирмой SIGMA, или фирмой SEPPIC под названием Montanide 80. Благодаря выбору этих особых ПАВ из всех ПАВ, предлагаемых предшествующим уровнем для приготовления эмульсий, в настоящее время было найдено, что можно с большой выгодой получать адъювантную эмульсию "масло в воде", используя способ обращения фаз. С этой целью количество сквалена и каждого из используемых ПАВ благоприятно выбирают так,чтобы получить смесь, фазовая диаграмма которой содержит фазу с нулевой средней кривизной (типа микроэмульсии или ламеллярной фазы), у которой поверхностное натяжение чрезвычайно низкое. В случае использования сквалена отмечается, что полученные эмульсии являются стабильными, монодисперсными и с очень малым размером капелек масла (d90 меньше 200 нм), когда суммарное значение ГЛБ разных используемых ПАВ составляет от 8,5 до 10, в частности от 8,6 до 9,6. Для определения соответствующих концентраций гидрофильных и гидрофобных ПАВ в составе эмульсии можно воспользоваться следующей формулой: в которой ГЛБm соответствует ГЛБ смеси и составляет предпочтительно от 8,5 до 10, в частности от 8,6 до 9,6;-3 012376 ГЛБе соответствует ГЛБ гидрофобного ПАВ,М соответствует массовой доле гидрофобного ПАВ в смеси, образованной из гидрофобного ПАВ и полиоксиэтиленалкилового эфира (РАЕ),ГЛБРАЕ соответствует ГЛБ РАЕ. Было отмечено, что при использовании сквалена в концентрации, составляющей от 5 до 45%, получали, очень выгодным образом, эмульсию, у которой температура обращения фаз ниже 95 С. Для такой эмульсии можно использовать полиоксиэтиленалкиловый эфир в концентрации, составляющей от 0,9 до 9%, и неионное гидрофобное ПАВ в концентрации, составляющей от 0,7 до 7%; причем остальная часть эмульсии образована водным растворителем. Согласно частному варианту осуществления изобретения иммуногенная композиция дополнительно содержит альдитол, в частности, такой как глицерин, эритрит, ксилит, сорбит или маннит. Хорошие результаты были получены, в частности, с маннитом, выпускаемым фирмой Roquette Frres. Количество альдитола, используемое в процессах получения, может варьировать от 1 до 10%, в частности от 2 до 7. Согласно частному варианту осуществления изобретения адъювантная эмульсия дополнительно содержит криозащитный агент, который позволяет лиофилизировать полученную эмульсию; из криозащитных агентов особенно предпочтителен сахар, в частности сахароза. Кроме того, эмульсия согласно изобретению может содержать алкилполигликозид, который является ПАВ с сахаром в головной части молекулы; речь может идти, в частности о децил-D-галактозид уронате натрия, или, согласно предпочтительному варианту, додецилмальтозиде, который может быть приобретен у фирмы ROCHE. Благодаря способу получения эмульсии по изобретению путем обращения фазы, получаемого в результате изменения температуры, очень легко и с высокой воспроизводимостью получают эмульсию"масло в воде", у которой размер капелек масла очень однородный; значение d90 (по объему) ниже 200 нм, предпочтительно ниже 150 нм, и даже близко к 100 нм, тогда как значение d50 ниже 100 нм или даже ниже 90 нм. Большинство эмульсий, полученных способом по изобретению, позволяют достичь значений d50 около 80 нм при значениях d90 около 100 нм (измерения, проведенные на счетчике CoulterLS230). Таким образом, можно проводить стерилизующую фильтрацию полученной эмульсии, при условии, что она достаточно разбавлена. Эмульсии, у которых размер капель однородный и очень маленький, стабильны во времени. Так,можно отметить, что эмульсия, полученная согласно изобретению и хранившаяся при 4 С, через 2 года сохранила монодисперсный профиль со значением d50=90 нм и значением d90=116 нм, что доказывает очень высокую стабильность эмульсии. Измерение размера капель можно осуществить разными средствами, в частности с помощью лазерных дифракционных гранулометров, таких как приборы Beckman Coulter серии LS (в частности, LS230),или приборы Malvern серии Mastersizer (в частности, Mastersizer 2000). Принцип измерения этих приборов основан на анализе интенсивности света, рассеиваемого частицами в зависимости от угла (датчики больших, средних и малых углов), когда образец облучают лазерным лучом. Это анализ проводят с помощью математических моделей, выбираемых в зависимости от размера и природы используемого материала. В случае измерения размеров субмикронных частиц нужно применять особую оптическую модель(теория Ми), учитывающую показатели преломления образца (здесь 1,495 для сквалена) и его окружения(здесь 1,332 для воды); нужно также уметь обнаруживать слабые интенсивности, испускаемые очень малыми частицами, что требует оптимизации анализа: дополнительный детекторный элемент для измерения при больших углах дифференциального рассеяния интенсивностей поляризованного излучения (система PIDS от Coulter, которая позволяет проводить измерения до 40 нм),система обнаружения (Malvern), объединяющая 2 длины волны, синего и красного цвета. Источник синего цвета более низкой длины волны, в сочетании с датчиками рассеяния на больших углах и обратного рассеяния, улучшает характеристики анализа в субмикронном диапазоне. В зависимости от используемых устройств измерения можно немного изменять как функцию компонентов устройства и используемых программ обработки данных. Так одна и та же эмульсия согласно изобретению была проанализирована на 2 приборах и дала следующие результаты: на LS230, со следующими параметрами: ИК-частица=1,495; ИК-среда=1,332; степень поглощения=0; d50=80-90 нм и d90=120-130 нм; на Mastersizer 2000, со следующими параметрами: ИК-частица=1,495; ИК-среда=1,332; степень поглощения=0; потемнение=4-7%; оптическая модель "General purpose"; d50=90-100 нм и d90=140-150 нм. Способ согласно изобретению может быть осуществлен следующим образом: получают грубую концентрированную эмульсию "масло в воде" путем введения водной фазы (буферированный раствор,возможно с добавлением альдитола, содержащий полиоксиэтиленалкиловый эфир) в масляную фазу(сквален и неионное гидрофобное ПАВ). Или, наоборот, введением масляной фазы в водную фазу. Таким образом получают некалиброванную эмульсию "масло в воде", которая быстро обнаруживает свою нестабильность. Эту эмульсию перемешивают и нагревают до получения обращения фаз, т.е. до получения эмульсии "вода в масле". Переход или обращение фаз можно прослеживать путем кондуктометрии. Действительно, при повышении температуры проводимость увеличивается до обращения фаз; в этот момент-4 012376 наблюдается относительно резкое падение проводимости. Температура, при которой происходит изменение кривизны кривой, отслеживающей проводимость,соответствует переходу одного типа эмульсии в другой; это и есть температура обращения фаз. В реальности эта температура является скорее температурным интервалом, чем одним очень точным значением; действительно, можно считать, что эта температура является температурой, определенной с точностью в 1 или 2 градуса, чтобы вся эмульсия подверглась явлению обращения фаз. Как только эта температура обращения фаз достигнута, таким образом, в присутствии эмульсии "вода в масле", нагревание прекращают и смесь охлаждают. Охлаждение можно проводить пассивно, просто оставляя эмульсию самопроизвольно остывать до температуры окружающей среды, или более активно, осуществляя, например, закалку эмульсии на ледяной бане. При прохождении через температуру обращения фаз эмульсия "вода в масле" снова обращается, чтобы дать эмульсию "масло в воде", у которой размеры капелек масла на этот раз очень однородные и маленькие; эмульсия, полученная в таком случае, очень стабильна. Ее можно хранить в этом состоянии в ожидании разбавления раствором, содержащим вакцинный антиген. Эта эмульсия является термообратимой, что означает, что если ее снова довести до температуры выше температуры обращения фаз, она снова превратится в эмульсию "вода в масле". Следует отметить,что контрольные кривые проводимости для одной и той же эмульсии совпадают, каково бы ни было число тепловых обращений, которым она подвергалась, и что полученные эмульсии всегда имеют один и тот же гранулометрический профиль. Согласно изобретению рецептура эмульсии благоприятно выбирается так, чтобы иметь температуру обращения фаз ниже 95 С, в частности составляющую от 45 до 80 С,и также, в частности, от 50 до 65 С. Этот диапазон температур выгоден, так как нет опасности, что эмульсия изменит состояние, когда она хранится при относительно высокой температуре (37 С). Кроме того, как и в способе получения термообратимой эмульсии, нагревание компонентов не слишком значительно, что способствует сохранению структурной целостности компонентов. Когда температура обращения фаз эмульсии повышена, в частности, когда она выше или близка к 80 С, ее можно с успехом понизить, добавляя в состав эмульсии альдитол, который обычно выбирают из сорбита, маннита, глицерина, ксилита или эритрита. Когда альдитол используют в интервале концентраций от 1 до 10% (вес./вес.),в частности в интервале концентраций от 2 до 7% (вес./вес.), удается снизить температуру обращения фаз эмульсии примерно на 10 С. Температуру обращения фаз эмульсии можно также понизить, если заменить водную фазу, состоящую только из воды, буферированным водным раствором соли. Обычно используют буфер TRIS, или фосфатный буфер, такой как PBS или буфер Дульбекко PBS без Са 2+ и Mg2+. Способу, который был описан выше, имеются альтернативы. Действительно, можно, как это было описано выше, смешать обе фазы, водную и масляную, чтобы получить грубую эмульсию, которую затем нагревают, а потом охлаждают. Альтернативно, обе полученные фазы можно до смешения нагреть по отдельности до температуры чуть выше температуры обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию "вода в масле", которая будет охлаждаться до получения субмикронной эмульсии "масло в воде". Можно также немного нагреть каждую из фаз до проведения смешения, что приведет к эмульсии"масло в воде", а затем нагреть эту эмульсию до обращения фаз перед тем, как перейти к охлаждению. Все эти операции могут быть осуществлены в отдельных емкостях для приготовления партии, но можно также использовать поточный процесс. Поточный процесс получения эмульсии может состоять, в частности, в смешении при высокой температуре двух фаз, водной и масляной, приготовленных заранее по отдельности, в термостатированном статическом смесителе, за которым по линии идет охлаждение в теплообменнике-холодильнике, соединенном с выходом статического смесителя, затем конечную эмульсию согласно изобретению собирают в подходящую емкость (колбу или реактор). С успехом используют статический смеситель, состоящий из последовательности смесительных элементов, образованных крестообразными ножами, наклонными относительно оси трубы, в которую они вставлены. Энергия, необходимая для смешения, поступает от насосов, которые продвигают жидкости, и смешение проводится без подвижных деталей, посредством элементов смешения путем последовательного разделения, перемещения и объединения составляющих смеси. Поточный процесс получения осуществляют следующим образом: отдельно готовят водную фазу(буферированный раствор, содержащий полиоксиэтиленалкиловый эфир) и масляную фазу (сквален и неионное гидрофобное ПАВ) в двух колбах или реакторах. Эти две фазы нагревают при перемешивании до температуры чуть выше температуры обращения фаз. Затем эти две фазы вводят в термостатированный статический смеситель с помощью двух насосов, скорость подачи которых регулируется так, чтобы получить состав эмульсии согласно изобретению. Обратная эмульсия "вода в масле" получается при прохождении двух фаз через статический смеситель. Затем обратная эмульсия охлаждается в линии путем прохождения через теплообменник-холодильник, соединенный с выходом статического смесителя. В таком случае эмульсия "вода в масле" будет инвертироваться в теплообменнике-холодильнике с получением эмульсии "масло в воде", которую собирают в колбу или реактор, и характеристики которой идентичны характеристикам эмульсии, полученной в периодическом процессе. Адъювантную эмульсию согласно изобретению используют затем для получения иммуногенной композиции. Простой способ осуществления состоит в смешении раствора, содержащего по меньшей-5 012376 мере один вакцинный антиген, с эмульсией, полученной согласно одному из описанных выше вариантов осуществления. Полученная иммуногенная композиция находится в виде эмульсии "масло в воде" или в виде термообратимой эмульсии "масло в воде", когда количество сквалена, выраженное в массе, составляет по меньшей мере 5% от массы всей иммуногенной композиции. Альтернативно, можно смешать антиген с водной фазой или масляной фазой до приготовления эмульсии. Такой образ действия предполагает, разумеется, что речь идет об антигенах, которые будут совместимы с процессом термоинверсии. Растворы антигена могут дополнительно содержать минеральные соли и один или несколько буферов, а также любое другое соединение, обычно используемое в вакцинах, такое как стабилизаторы, консерванты или, при необходимости, также другие адъюванты. Для получения лиофилизуемой эмульсии сначала готовят жидкую концентрированную эмульсию,как было описано выше, но в качестве водной фазы выбирая предпочтительно воду, а не буферный раствор, затем разбавляют эту эмульсию раствором, содержащим альдитол, сахар и алкилполигликозид,например, раствором, содержащим маннит, сахарозу и додецилмальтозид. Полученную эмульсию затем разделяют на образцы (например, по 0,5 мл) и подвергают циклу лиофилизации, который может быть проведен следующим образом: загрузка образцов при +4 С,около 2 ч замораживание при заданной температуре -45 С,от 14 до 19 ч первый период сушки при заданной температуре 0 С,от 3 до 30 ч второй период сушки при заданной температуре +25 С. Полученную эмульсию можно в таком случае хранить в ожидании ее использования для приготовления иммуногенной композиции, т.е. до соединения с композицией, содержащей вакцинные антигены. Эту стадию получения иммуногенной композиции можно проводить путем введения лиофилизованной эмульсии в водный раствор, содержащий антигены. Полученную таким путем иммуногенную композицию можно затем хранить в жидком состоянии или подвергать новому циклу лиофилизации, чтобы хранить в виде лиофилизата, если природа антигенов это позволяет. Альтернативно, можно сразу разбавить концентрированную эмульсию водным раствором, содержащим одновременно вакцинные антигены, а также альдитол, сахар и алкилполигликозид, и подвергнуть затем полученную композицию лиофилизации. Такой образ действия предполагает, разумеется, что речь идет об антигенах, которые будут совместимы с процессом лиофилизации. Следующие примеры иллюстрируют разные варианты осуществления изобретения. Пример 1. Получение адъювантной эмульсии согласно изобретению. В химическом стакане смешивали 3,71 г Eumulgin B1 и 33,9 г 10% раствора маннита в буфереPBS, которые гомогенизировали при перемешивании и температуре около 30 С. В другом сосуде смешивали 2,89 г Dehymuls SMO и 19,5 г сквалена, которые перемешивали с помощью магнитной мешалки. Когда в каждом сосуде были получены гомогенные фазы, водную фазу вводили в масляную фазу,которую продолжали перемешивать при 30 С. Когда введение было закончено, полученную грубую эмульсию нагревали при сохранении перемешивания до тех пор, пока температура не достигла 58-60 С. Затем нагревание прекращали, но продолжали перемешивать, пока температура не достигала температуры окружающей среды. В этом случае получали эмульсию "масло в воде", у которой средний размер капелек масла составлял около 80 нм (измерение проведено на LS230) и которая имела следующий состав (по массе): 32,5% сквалена,6,18% полиоксиэтилированного (12) цетостеарилового эфира,4,82% моноолеата сорбитана,6% маннита. Пример 2. Вакцинная композиция против СПИДа. Готовили вакцинные композиции, содержащие в качестве антигена инактивированный белок ТАТIII В. Белок ТАТ нейтрализовали реакцией алкилирования в щелочной среде с использованием йодацетамида в следующих условиях: число микромолей йодацетамида=200 число микромолей ТАТ+число микромолей DTT. Этот инактивированный белок и способ его получения подробно описаны в заявкеWO 99/33346, где он идентифицирован под термином карбоксиметилированный ТАТ. Этот рекомбинантный антиген ТАТ хранится в растворе в присутствии буфера TRIS 50 мМ, рН 7,5, при температуре 70 С. Вакцинные композиции для введения готовили из концентрированных растворов, чтобы получить иммунизирующие дозы 200 мкл, имеющие следующие количественные составы: для композиции, содержащей только антиген: 20 мкг ТАТ в буфере TRIS 50 мМ, NaCl 100 мМ при рН 7,5; для композиции согласно изобретению: 20 мкг ТАТ,5 мг сквалена,0,75 мг Dehymuls SMO,-6 012376 0,94 мг Eumulgin B1,0,91 мг маннита. Брали 2 группы по 6 самок мышей BALB/c в возрасте 8 недель, которым подкожно вводили полученные композиции из расчета одна доза в 200 мкл на мышь; инъекции проводили в день 0 и на 21 день. На 14 день отбирали образцы крови из ретроорбитального синуса для оценки первичного ответа и на 34 день для оценки вторичного ответа. Определение содержания специфических IgG1 и IgG2a проводили с помощью стандартизованных тестов ELISA. Мышей умерщвляли на 37 день; отбирали их селезенку и выделяли спленоциты. Полученные результаты, в том, что касается гуморальных ответов, собраны в таблице ниже, причем содержание IgG выражено в произвольных единицах ELISA (log10). Для каждой группы мышей значение,указанное в таблице, является среднегеометрическим титром значений, полученных для каждой из мышей. Полученные результаты показывают, что эмульсия согласно изобретению позволяет в целом повысить гуморальный ответ и, кроме того, как правило, облегчает ответ Т-хелпера типа 1, так как ответIgG2a повышался сильнее, чем ответ IgG1. Что касается клеточного ответа, было подтверждено посредством количественного анализа методом ELISPOT, после повторной стимуляции рекомбинантным белком ТАТ отобранных спленоцитов,определенное повышение числа клеток, продуцирующих интерферон , когда спленоциты были получены от мышей, иммунизованных препаратом по изобретению (486 точек на 106 клеток против 39 на 106 клеток для препарата, содержащего только антиген). Также количественный анализ цитокинов во всплывшей части культуры показал одновременно самую большую секрецию интерферона(5028 пг/мл против 1940 пг/мл) и интерлейкина-5 (5365 пг/мл против 2394 пг/мл). Пример 3. Получение вакцинной композиции против инфекций цитомегаловируса человека. Готовили вакцинные композиции, содержащие в качестве вакцинного антигена рекомбинантный белок, производный от оболочечного гликопротеина штамма Towne цитомегаловируса (CMV), называемый gB, последовательность нуклеотидов и белков в котором описана в патенте US 5834307. Этот рекомбинантный белок получают от рекомбинантного СНО, зараженного плазмидой, называемойpPRgB27clv4, которая содержит модифицированный ген gB. Действительно, для облегчения продуцирования этого рекомбинантного белка от линии СНО, ген gB сначала модифицируют, удаляя часть гена,который кодирует трансмембранную область белка gB, соответствующую последовательности аминокислот, находящейся от валина 677 до аргинина 752, и вводя 3 точечных мутации, чтобы место расщепления, существующее в естественном gB, было удалено. В результате рекомбинантный белок, произведенный от рекомбинантного СНО, соответствует усеченному белку gB, лишенному точки расщепления и трансмембранной зоны, называемому gBdTM. Структура плазмиды pPRgB27clv4 и получение усеченного белка gB (gBdTM) от линии рекомбинантного СНО описаны в документе US 6100064. Очистку усеченного белка gB проводят на иммуноаффинной хроматографической колонке, используя моноклональные антитела 15D8, описанные RasmussenL et al. (J. Virol. (1985) 55: 274-280). Из маточной композиции с 0,975 мг/мл антигена gB, полученной таким путем и содержащейся в фосфатном буфере, из концентрированной эмульсии согласно изобретению, такой как описано в примере 1, и эмульсии предшествующего уровня, полученной микрофлюидизацией, готовили дозы 50 мкл иммунизирующих композиций, имеющих следующие составы: 2 мкг gB в цитратном буфере при рН 6 (группа, называемая "только gB"); 2 мкг gB; 1,075 мг сквалена; 0,133 мг Montane VG85 и 0,125 мг Tween 80 в цитратном буфере при рН 6 (группа, называемая "с эмульсией предшествующего уровня"); 2 мкг gB; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Dehymuls SMO; 0,235 мг Eumulgin B1 и 0,230 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4 (группа, называемая "с эмульсией по изобретению"). Брали 3 группы по 10 самок мышей Outbred OF1 в возрасте 8 недель, которых иммунизировали 2 раза подкожно, в день 0 и на 21 день, одной из композиций, указанных выше (каждая группа мышей получала 2 раза одну и ту же композицию). На 20 и 34 день из ретроорбитального синуса отбирали образцы крови, которые использовали для определения концентраций антител типа IgG1 и IgG2a, специфических для антигена gB. Количественно определение проводили с помощью тестов ELISA; полученные результаты сведены ниже в таблице и выражены в log10 титров ELISA. Указанные значения являются средними величинами,полученными для каждой группы мышей. Эти результаты показывают эффективность эмульсии согласно изобретению, которая дает возможность получить одновременно большую индукцию антител как типа IgG1, так и типа IgG2a, и, кроме того, по сравнению с эмульсией предшествующего уровня, получить искомый результат в отношении вакцины против цитомегаловируса человека, который состоит в том, чтобы направить иммунный ответ к ответу ТН 1 (индикатором которого является содержание IgG2a), сохраняя на достаточном уровне ответ типа ТН 2 (индикатором которого является содержание IgG1). Пример 4. Вакцинная композиция против гриппа. Брали антигены вируса гриппа, полученные способом, описанным в примерах заявки WO 9605294,за исключением того, что используемым штаммом вируса был штамм А/Новая Каледония H1N1. Исходя их этих препаратов антигенов, из концентрированной эмульсии согласно изобретению, полученной в примере 1, и суспензии алюминия, поставляемой REHEIS под названием А 100 Н Rehydra,получали иммунизирующие дозы 50 мкл, которые имели состав, указанный ниже, где количество антигенов гриппа выражено в весе гемагглютинина (НА): либо 1 мкг НА в буфере PBS,либо 5 мкг НА в буфере PBS,либо 1 мкг НА и 60 мкг гидроксида алюминия,либо 1 мкг НА; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Dehymuls SMO; 0,235 мг Eumulgin B1; 0,21 мг маннита; все в буфере PBS. Брали 8 групп по 5 самок мышей BALB/c в возрасте 8 недель, которым в день 0 вводили полученные композиции согласно следующему распределению: одна группа получала подкожно композицию, содержащую 1 мкг НА,одна группа получала ту же композицию, содержащую 1 мкг НА, внутрикожно,одна группа получала подкожно композицию, содержащую 5 мкг НА,одна группа получала ту же композицию, содержащую 5 мкг НА, внутрикожно,одна группа получала подкожно композицию, содержащую 1 мкг НА и 60 мкг алюминия,одна группа получала ту же композицию, содержащую 1 мкг НА и 60 мкг алюминия, внутрикожно,одна группа получала подкожно композицию, содержащую 1 мкг НА и эмульсию согласно изобретению,одна группа получала композицию, содержащую 1 мкг НА и эмульсию согласно изобретению, подкожно. На 14, 28, 41, 56 и 105 день у каждой мыши отбирали пробы крови. Сыворотку привитых мышей исследовали, с одной стороны, методом ELISA, чтобы оценить содержание в ней всех индуцированных антител к штамму гриппа A/H1N1 трехвалентной вакцины (титры антител выражены как log10 произвольных единиц ELISA с пределом обнаружения 1,3 log10), а с другой стороны, методом IHA (ингибирование гемагглютинации), чтобы определить содержание в ней функциональных антител против штамма гриппа A/H1N1. Титры антител выражены в арифметических величинах, обратных разведению, с пределом обнаружения, равным 5. Полученные результаты приведены ниже в таблицах, в которых указанные значения представляют собой средние титры для мышей каждой группы. Титры по ELISA Эти результаты демонстрируют выгоду от настоящего изобретения; действительно, гидроксид алюминия, который является хорошо известным адъювантом, использовавшимся долгое время в предшествующем уровне, не позволяет повысить иммуногенность антигенов гриппа так же быстро и в такой же степени, как композиция согласно изобретению; установлено также, что композиция согласно изобретению была особенно эффективна как в случае подкожного, так и внутрикожного введения. Пример 5. Вакцинная композиция против гриппа. Хотелось оценить на мышах выгоду от настоящего изобретения в отношении уменьшения количества вакцинного антигена, когда речь идет о противогриппозной вакцине, содержащей в качестве антигенов 3 штамма вируса гриппа и которую вводят внутрикожно. С этой целью концентрированную эмульсию из примера 1 разбавляли буфером PBS, чтобы получить эмульсию с 5% сквалена, которую также разбавляли наполовину композицией, содержащей антигены. Так, брали композицию, содержащую вирус гриппа, происходящий из 3 разных штаммов вирусов,полученных путем, описанным в патентной заявке WO 9605294, причем здесь 3 штамма являются штаммом А/Новая Каледония (H1N1), штаммом А/Вайоминг (H3N2), штаммом В/Цзянсу. Такая трехвалентная вакцинная композиция является классической композицией вакцины против гриппа и соответствует вакцине, выпускавшейся в северном полушарии во время эпидемии гриппа 2004 г. Количество антигенов к каждому штамму вирусов оценивали по количеству в них гемагглютинина НА. Полученные иммунизирующие дозы объемом 50 мкл имели составы, указанные ниже: 0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS при рН 7,4; 1,31 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS при рН 7,4; 5,25 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS при рН 7,4; 10,5 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS при рН 7,4; 21 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS при рН 7,4; 0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Dehymuls SMO; 0,235 мг Eumulgin B1 и 0,230 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4; 1,31 мкг НА из каждого штамма вирусов; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Dehymuls SMO; 0,235 мг Eumulgin B1 и 0,230 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4; 5,25 мкг НА из каждого штамма вирусов; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Dehymuls SMO; 0,235 мг Eumulgin B1 и 0,230 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4. Брали 8 групп по 10 самок мышей BALB/c в возрасте от 6 до 8 недель, которым вводили внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) одну из полученных композиций, из расчета одна композиция на группу. Через 3 недели после иммунизации отбирали образцы крови и методом ELISA определяли в каждой группе количество IgG, индуцированных против каждого штамма вирусов; и, кроме того, в каждой группе проводили тест на ингибирование гемагглютинина против каждого штамма вирусов. Полученные результаты представлены далее в таблице в виде средних по каждой из групп; результаты по ELISA выражены в log10 произвольных единиц, а результаты по IHA представляют собой среднеарифметические титры, обратные разведению. Эти результаты подтверждают особую выгоду от изобретения для снижения количества антигенов; действительно, благодаря эмульсии по изобретению можно было при таком же иммунном ответе очень-9 012376 существенно снизить количество антигенов, присутствующих в иммунизирующей дозе. Пример 6. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа в привитой популяции. Хотелось испытать эффективность эмульсии по изобретению в случае вакцины против гриппа, которую вводили индивидам, организм которых уже был в контакте с антигенами вируса гриппа, как это часто случается, либо потому, что индивид уже был в контакте с вирусом гриппа, либо потому, что его прививали ранее вакциной против гриппа. Согласно информации, опубликованной C.W. Porter в журнале Vaccine, 2003, 21:940-5, для проведения этого теста в качестве животной модели можно использовать мышей BALB/c, предварительно привитых внутримышечно трехвалентной вакциной. Таким образом, готовили иммунизирующие дозы в 50 мкл, содержащие либо только буфер PBS,либо трехвалентную вакцину кампании 2004, т.е. вакцину, содержащую штамм А/Новая Каледония(H1N1), штамм А/Вайоминг (H3N2) и штамм В/Цзянсу, из расчета 5 мкг НА из каждого штамма, в буфере PBS при рН 7,4. Брали 6 групп по 7 мышей BALB/c; 3 группы иммунизировали внутримышечно дозами, содержащими только буфер, и 3 другие -трехвалентной вакциной. Кроме того, из концентрированной эмульсии примера 1 и упомянутой выше вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004, готовили иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы: только буфер PBS; 0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Dehymuls SMO; 0,143 мг Eumulgin B1 и 0,138 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4. Каждую из полученных таким путем композиций использовали для иммунизации на 34 день внутрикожно (во внутреннюю поверхность ушей) как группы мышей, получивших предварительно только буфер PBS, так и группы мышей, получивших дозу трехвалентной вакцины. На 56 день отбирали образцы крови у каждой мыши и посредством теста на ингибирование гемагглютинина определяли количество антител, выработанных против штамма H1N1 (А/Новая Каледония). Полученные результаты сведены ниже в таблице, они показывают средние значения, полученные для каждой группы мышей, при соблюдении одного и того же протокола иммунизации. Эти результаты показывают всю выгоду от изобретения даже у индивидов, уже имеющих вводимый антиген. Действительно, при использовании этой модели, в противоположность наблюдениям C.W. Potter, который смог продемонстрировать лишь слабый адъювантный эффект Iscom, когда их использовали для иммунизации мышей, предварительно зараженных гриппом или предварительно вакцинированных антигенами гриппа, в настоящем случае видно, что эмульсия согласно изобретению позволяет значительно повысить индуцированный ответ, как в случае с невакцинированными мышами, так и с мышами,которые уже были привиты вакциной против гриппа. Пример 7. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа, содержащая низкие дозы антигенов. Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (H1N1), штамм А/Вайоминг (H3N2) и штамм В/Цзянсу),получали иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы: 0,1 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 0,4 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 1,6 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 0,1 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Dehymuls SMO; 0,143 мг Eumulgin B1 и 0,138 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4;- 10012376 0,4 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Dehymuls SMO; 0,143 мг Eumulgin B1 и 0,138 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4. Брали 6 групп по 8 самок мышей BALB/c в возрасте 8 недель, которым в день 0 вводили внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) дозу 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу). В каждой группе на 29 день половине мышей снова вводили внутрикожно вторую дозу, имеющую ту же природу, что и первая введенная доза. На 22 и 43 день отбирали образцы крови, чтобы определить количество индуцированных антител. Определение количества антител проводили по методу ELISA для антител, индуцированных к 22 дню и 43 дню, против совокупности введенных штаммов: H1N1, H3N2 и В, и по методу IHA только против штамма H1N1, и на 22, и на 43 день. Полученные результаты сведены ниже в таблице, где приведенные титры являются средними, полученными для каждой группы мышей. Что касается результатов на 43 день, средние значения получали отдельно внутри одной и той же группы, для мышей, получивших 2 дозы вакцины, и для мышей, получивших только одну дозу. Эти результаты показывают, что благодаря эмульсии по изобретению даже при низких дозах антигенов получены очень существенные гуморальные ответы. Так, можно отметить, что наилучшими результатами являются результаты, полученные с дозой 0,4 мкг НА из каждого штамма вирусов и эмульсией согласно изобретению; эти результаты неожиданно оказались даже лучше результатов, полученных при использовании дозы в 6,3 мкг одного НА. Кроме того, следует отметить, что даже у индивидов, не получавших повторную дозу, иммунная система продолжала индуцировать антитела, тогда как для индивидов, получивших вакцинные антигены без адъюванта, этого не происходило. Пример 8. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа. Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (H1N1), штамм А/Вайоминг (H3N2) и штамм В/Цзянсу),готовили иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы: 0,1 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS,0,4 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS,1,6 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS,6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS,0,1 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Dehymuls SMO; 0,143 мг Eumulgin B1 и 0,138 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4, 0,4 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Dehymuls SMO; 0,143 мг Eumulgin B1 и 0,138 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4. Брали 6 групп по 8 самок мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель, которым в день 0 вводили внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) дозу 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу). На 23 день отбирали образцы крови, чтобы определить количество индуцированных антител. Определение количества антител осуществляли методами ELISA и IHA для антител, индуцированных к совокупности введенных штаммов: H1N1, H3N2 и В.- 11012376 Полученные результаты сведены ниже в таблице, причем приводимые титры являются средними значениями, полученными для каждой группы мышей. Здесь снова полученные результаты показывают всю выгоду от эмульсии по изобретению, благодаря которой можно очень существенно снизить количество присутствующих антигенов. Действительно,можно в целом считать, что всего с 0,1 мкг НА, дополненного эмульсией согласно изобретению, получают такие же хорошие результаты, как с НА в количестве 6,3 мкг. Пример 9. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа, содержащая эмульсию по изобретению или эмульсию предшествующего уровня. Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (H1N1), штамм А/Вайоминг (H3N2) и штамм В/Цзянсу),получали иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы: 0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 0,3 мкг НА; 0,21 мг сквалена; 0,031 мг Dehymuls SMO; 0,040 мг Eumulgin B1 и 0,039 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4 (0,7% эмульсия); 0,3 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Dehymuls SMO; 0,143 мг Eumulgin B1 и 0,138 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4 (2,5% эмульсия); 0,3 мкг НА; 0,645 мг сквалена; 0,075 мг Tween 80; 0,075 мг Span 85 (эмульсия предшествующего уровня, полученная микрофлюидизацией). Брали 5 групп по 8 самок мышей BALB/c в возрасте 8 недель, которым в день 0 внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) вводили дозу 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу). Для оценки количества индуцированных антител проводили забор крови на 21 день, по которому методом IHA (ингибирование гемагглютинации) определяли активность против штамма A/H1N1, штамма A/H3N2 и штамма В. Результаты, полученные для каждой группы мышей, представлены ниже в таблице. Эти результаты показывают, что с эмульсией, полученной согласно изобретению, благодаря очень простому способу получения путем обращения фаз в результате изменения температуры, получен адъювант, который так же хорош, и даже немного лучше, чем эмульсия предшествующего уровня, полученная при использовании очень высоких сдвиговых усилий. Пример 10. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа, содержащая эмульсию по изобретению в разных концентрациях. Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вируса кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (H1N1), штамм А/Вайоминг (H3N2) и штамм В/Цзянсу),готовили иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующий состав: 0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS; 0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,12 мг сквалена; 0,018 мг Dehymuls SMO; 0,023 мг Eumulgin B1 и 0,022 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4(0,4% эмульсия); 0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,299 мг сквалена; 0,044 мг Dehymuls SMO; 0,057 мг Eumulgin B1 и 0,055 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4 (1% эмульсия);- 12012376 0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Dehymuls SMO; 0,143 мг Eumulgin B1 и 0,138 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4 (2,5% эмульсия). Брали 5 групп по 8 самок мышей BALB/c в возрасте 8 недель, которым внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) вводили в день 0 дозу в 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу). Для оценки количества индуцированных антигенов проводили заборы крови на 21 день, по которым методом ELISA определяли количество антител анти-H1N1, анти-H3N2 и анти-В, и методом IHA (ингибирование гемагглютинации) определяли активность к штамму A/H1N1, штамму A/H3N2 и штамму В. Полученные результаты представлены ниже в таблице в виде средних для каждой из групп; результаты по ELISA выражены в log10 произвольных единиц ELISA, а результаты по IHA являются среднеарифметическими титрами, обратными разведению. Эти результаты еще раз подтверждают, что какой бы штамм ни оценивался, эмульсия согласно изобретению позволяла получить очень существенный ответ иммунной системы при очень низкой дозе антигенов. Пример 11. Получение лиофилизуемой композиции. Действуют, как в примере 1, но вместо буфера используют воду; затем полученную эмульсию разбавляют водным раствором, содержащим маннит, сахарозу и додецилмальтозид, чтобы получить эмульсию со следующим конечным составом: 5% сквалена,0,95% полиоксиэтилированного цетостеарилового эфира,0,75% моноолеата сорбитана,3% маннита,2% додецилмальтозида,6% сахарозы. Эту эмульсию лиофилизовали и хранили 3 месяца при 4 С; затем после восстановления влагосодержания было установлено, что ее свойства сохранились, в частности, ее монодисперсность, при значениях d50 и d90, близких к измеренным до лиофилизации. Эту эмульсию можно развести наполовину раствором, содержащим вакцинные антигены, чтобы получить вакцинную композицию. Пример 12. Сравнение адъювантного эффекта эмульсии согласно изобретению и ПАВ, присутствующего в эмульсии. Хотелось оценить активность адъювантной эмульсии по изобретению в сравнении с активностью ПАВ Eumulgin B1, присутствующего в эмульсии. Для этого проводили тест на мышах с помощью антигенов к вирусу гриппа. С этой целью брали антигены вируса гриппа, полученные способом, описанным в примерах заявкиWO9605294, за исключением того, что используемым штаммом вируса был штамм А/Новая КаледонияH1N1. Брали также вакцинную композицию, содержащую 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (H1N1), штамм А/Вайоминг (H3N2) и штамм В/Цзянсу). Из концентрированной эмульсии, полученной согласно изобретению и описанной в примере 1, Eumulgin B1 и антигенных композиций вируса гриппа готовили иммунизирующие дозы в 100 мкл, которые имели следующие составы: 1 мкг НА из штамма H1N1 в буфере PBS при рН 7,4; 5 мкг НА из штамма H1N1 в буфере PBS при рН 7,4; 1 мкг НА из штамма H1N1; 2,5 мг сквалена; 0,37 мг; Dehymuls SMO; 0,48 мг Eumulgin B1 и 0,46 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4; 1 мкг НА из штамма H1N1 и 0,48 мг Eumulgin B1 в буфере PBS при рН 7,4; 0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS при рН 7,4; 1,66 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере PBS при рН 7,4; 0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов; 2,5 мг сквалена; 0,37 мг Dehymuls SMO; 0,48 мг Eumulgin B1 и 0,46 мг маннита в буфере PBS при рН 7,4; 0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов и 0,48 мг Eumulgin B1 в буфере PBS при рН 7,4.- 13012376 Брали 8 групп по 8 самок мышей BALB/c, которых иммунизировали внутримышечно путем единственной инъекции в день 0. На 21 и 35 день отбирали образцы крови, чтобы путем количественного анализа по методу ELISA оценить полное содержание в них индуцированных антител против штамма гриппа A/H1N1 или против каждого из штаммов трехвалентной вакцины. Титры антител, указанные ниже в таблице, выражены в log10 произвольных единиц ELISA с пределом обнаружения 1,3 log10. Результаты, полученные в этом испытании, подтверждают то, что уже было получено в предыдущих испытаниях, а именно, что эмульсия согласно изобретению позволяет существенно снизить дозу антигена при одном и том же ответе иммунной системы; действительно, лучший ответ получен при использовании эмульсии согласно изобретению и полном содержании НА 1 мкг, чем при использовании дозы с полным содержанием НА 5 мкг, но без адъюванта. Кроме того, обнаружено, что используемое ПАВ действительно не имеет адъювантного действия при использовании его одного, тогда как эмульсия согласно изобретению является сильным адъювантом по отношению ко всем протестированным штаммам. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Адъювантная эмульсия "масло в воде", отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере,сквален, водный растворитель, неионное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, неионное гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9, тем, что она является термообратимой, и тем, что 90% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 200 нм. 2. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что 90% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 160 нм. 3. Эмульсия по одному из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что 90% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 150 нм. 4. Эмульсия по одному из пп.1-3, отличающаяся тем, что 50% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 100 нм. 5. Эмульсия по одному из пп.1-4, отличающаяся тем, что 50% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 90 нм. 6. Эмульсия по одному из пп.1-5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит по меньшей мере один альдитол. 7. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что неионное гидрофобное ПАВ содержит сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннида. 8. Эмульсия по одному из пп.1-7, отличающаяся тем, что полиоксиэтиленалкиловый эфир является полиоксиэтилированным(12) цетостеариловым эфиром. 9. Эмульсия по одному из пп.1-8, отличающаяся тем, что альдитол выбран из глицерина, эритрита,ксилита, сорбита, маннита. 10. Эмульсия по одному из пп.1-9, отличающаяся тем, что неионным гидрофобным ПАВ является моноолеат сорбитана. 11. Эмульсия по одному из пп.1-10, отличающаяся тем, что количество сквалена составляет от 5 до 45%. 12. Эмульсия по одному из пп.1-11, отличающаяся тем, что количество ПАВ на основе полиоксиэтиленалкилового эфира составляет от 0,9 до 9%. 13. Эмульсия по одному из пп.1-12, отличающаяся тем, что количество неионного гидрофобного ПАВ составляет от 0,7 до 7%. 14. Адъювантная эмульсия по одному из пп.1-13, отличающаяся тем, что она содержит 32,5% сквалена,6,18% полиоксиэтилированного(12) цетостеарилового эфира,- 14012376 4,82% моноолеата сорбитана,6% маннита. 15. Эмульсия по одному из пп.1-14, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит алкилполигликозид. 16. Эмульсия по одному из пп.1-15, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит криозащитный агент. 17. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для внутримышечного введения. 18. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для внутрикожного введения. 19. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для подкожного введения. 20. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для введения при гриппе. 21. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для введения при СПИДе. 22. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для введения против патологий, обусловленных цитомегаловирусом человека. 23. Способ получения иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один вакцинный антиген и эмульсию "масло в воде", отличающийся тем, что масло представляет собой сквален и тем, что эмульсию "масло в воде" получают способом обращения фаз в результате изменения температуры. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере одну стадию получения эмульсии "масло в воде" путем охлаждения обратной эмульсии "вода в масле", которая содержит, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, неионное гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что обратную эмульсию "вода в масле" получают, смешивая сквален, водный растворитель, неионное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, и неионное гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9, чтобы сначала получить грубую эмульсию "масло в воде", и затем нагревают эту эмульсию, по меньшей мере, до температуры обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию. 26. Способ по п.24, согласно которому нагревают по отдельности до температуры, по меньшей мере, равной температуре обращения фаз, с одной стороны, водную фазу, содержащую водный растворитель и ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, и, с другой стороны, масляную фазу, содержащую сквален и гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9, затем смешивают обе фазы, чтобы получить обратную эмульсию "вода в масле". 27. Способ по п.24, согласно которому нагревают по отдельности до температуры ниже температуры обращения фаз эмульсии, с одной стороны, водную фазу, содержащую водный растворитель и ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, и, с другой стороны, масляную фазу, содержащую сквален и гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9,затем смешивают обе фазы, чтобы получить эмульсию "масло в воде",затем полученную эмульсию "масло в воде" нагревают до температуры, по меньшей мере, равной температуре обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию "вода в масле". 28. Способ по одному из пп.23-27, отличающийся тем, что температура обращения фаз составляет от 45 до 80 С. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что температура обращения фаз составляет от 50 до 65 С. 30. Способ по одному из пп.23-29, отличающийся тем, что он дополнительно включает по меньшей мере одну стадию лиофилизации. 31. Иммуногенная композиция, отличающаяся тем, что она может быть получена способом по одному из пп.23-30.