Способ поэтапного присоединения частей полиэтиленгликоля к полипептиду

005495 По настоящей заявке испрошен приоритет в соответствии со ст. 35 U.S.С.119(е), по дате подачи первоначальной временной заявки США 60/083339, полное содержание которой включено сюда в качестве ссылки. Область изобретения Настоящее изобретение относится к способу поэтапного присоединения двух или более частей полиэтиленгликоля (ПЭГ) к полипептиду, в частности к способу получения конъюгатов полиэтиленгликольинтерферон (ПЭГИФН), в которых полиольная часть ковалентно связана с Cys17, а также к использованию продуктов, полученных данным способом в терапии, прогнозе или диагностике бактериальных инфекций, вирусных инфекций, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний. Предпосылки к созданию изобретения Интерферон фибробластов человека (-ИФН) обладает противовирусной активностью и может также стимулировать природные клетки-киллеры против опухолевых клеток. Это полипептид с массой около 20.000 Да, индуцируемый вирусами и двухнитевыми РНК. Из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного с помощью технологии с использованием рекомбинантной ДНК, Derynk и др. (Nature, 285:542-547, 1980) установили полную аминокислотную последовательность протеина. Она имеет длину в 166 аминокислот.Shepard et al. (Nature, 294:563-565, 1981) описали мутацию при основании 842 (Cys-Туr в положении 141), которая уничтожала противовирусную активность интерферона, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.Mark и др. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(18):5662-5666, 1984) осуществили искусственную мутацию путем замены основания 469 (Т) на (А), вызвав замену аминокислоты Cys-Ser в положении 17. Сообщалось, что полученный в результате -ИФН был так же активен, как "нативный" -ИФН, и устойчив при длительном хранении (-70 С). Ковалентное присоединение к молекулам гидрофильного полимерного полиэтиленгликоля (ПЭГ),также известного как полиэтиленоксид (ПЭО), имеет важное применение в биотехнологии и медицине. В своей наиболее общей форме ПЭГ является линейным полимером с гидроксильными группами на каждом конце НО-СН 2-СН 2 О(СН 2 СН 2 О)nСН 2 СН 2-ОН Эта формула может быть кратко представлена как НО-ПЭГ-ОН, где имеется в виду, что -ПЭГпредставляет основную цепь полимера без концевых групп-ПЭГ- означает -СН 2 СН 2 О (СН 2 СН 2 О) nСН 2 СН 2-. ПЭГ обычно используется в виде метокси-ПЭГ-ОН (м-ПЭГ), в котором один конец является относительно инертной метоксигруппой, в то время как другой конец представляет гидроксильную группу,которая является объектом химической модификации СН 3 О-(СН 2 СН 2 О)n-СН 2 СН 2-ОН Также обычно используются разветвленные ПЭГ. Разветвленные ПЭГ могут быть обозначены какm означает число ответвлений. Число ответвлений (m) может варьироваться от трех до ста или более. Гидроксильные группы являются объектом химических модификаций. Другая разветвленная форма, такая как описанная в публикации международной патентной заявкиWO 96/21469, имеет единственный конец, который является объектом химической модификации. Этот тип ПЭГ может быть представлен как (СН 3 О-ПЭГ-)pR-X, где р равно 2 или 3, R представляет центральное ядро, такое как например, лизин или глицерин, и X означает функциональную группу, такую как например, карбоксильную, которая является объектом химической активации. Еще одна разветвленная форма, "ПЭГ с боковыми цепями", имеет реакционноспособные группы, такие как например, карбоксильная, вдоль основной цепи ПЭГ, а не на конце цепей ПЭГ. В дополнение к этим формам ПЭГ, полимер может быть также получен со слабыми или способными к расщеплению связями в основной цепи. Например, Harris в заявке на патент США 06/026716 показал, что ПЭГ может быть получен со сложноэфирными связями в полимерной основной цепи, которые являются объектом гидролиза. Этот гидролиз приводит к расщеплению полимера на фрагменты с более низкой молекулярной массой согласно схеме реакции-ПЭГ-СО 2-ПЭГ-+Н 2 О-ПЭГ-СО 2 Н+НО-ПЭГСогласно настоящему изобретению термин полиэтиленгликоль или ПЭГ включает все описанные выше производные. Сополимеры этиленоксида и пропиленоксида близки ПЭГ по своим химическим свойствам, и они могут быть использованы вместо ПЭГ во многих случаях его применения. Они имеют следующую общую формулу:HO-CH2CHRO(CH2CHRO) nCH2CHR-OH,где R обозначает Н или СН 3. ПЭГ является полезным полимером, обладающим высокой растворимостью в воде, а также высокой растворимостью во многих органических растворителях. ПЭГ также нетоксичен и не является иммуно-1 005495 генным. Когда ПЭГ присоединяют химически (присоединение ПЭГ) к нерастворимым в воде соединениям, полученный в результате конъюгат обычно растворим в воде, а также растворим во многих органических растворителях. Конъюгаты ПЭГ-белок в настоящее время используются в белок-заместительной терапии и для других терапевтических целей. Например, связанная с ПЭГ аденозиндезаминаза (ADAGEN) используется для лечения серьезных комплексных иммунодефицитных заболеваний, связанная с ПЭГ Lаспарагиназа (ONCAPSPAR) применяется для лечения острого лимфобластного лейкоза и связанной с ПЭГ -интерферон (INTRON(R) А) находится на III стадии испытаний по лечению гепатита С. Общий обзор конъюгатов ПЭГ-белок, обладающих клинической эффективностью, дан в N.L. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218, 1994. Был разработан ряд способов присоединения ПЭГ к белкам. Обычно проводят присоединение ПЭГ к реакционноспособным группам белка, используя производные ПЭГ с повышенной электрофильностью. Присоединение ПЭГ к - и -аминогруппам, имеющимся в остатках лизина, и к N-концу дает конъюгат, состоящий из смеси продуктов. Обычно такие конъюгаты включают ряд нескольких молекул ПЭГ, присоединенных к молекуле белка ("ПЭГ-меры") в количестве в пределах от нуля до числа, соответствующего числу аминогрупп в белке. Для молекулы белка, которая была однократно модифицирована, единица ПЭГ может быть присоединена к ряду различных аминных сайтов. Такой тип неспецифического присоединения ПЭГ приводил к ряду конъюгатов, которые становились почти неактивными. Понижение активности обычно вызывается экранированием активного связывающего домена белка, как в случае многих цитокинов и антител. Например, Katre и др. в патенте США 4766106 и патенте США 4917888 описывают присоединение ПЭГ к -ИФН и интерлейкину 2 (ИЛ 2) с использованием большого избытка метоксиполиэтиленгликолилового эфира N-сукцинимидилглутаровой кислоты и метоксиполиэтиленгликолилового эфира N-сукцинимидилянтарной кислоты. Оба белка продуцировались в микробных клетках-хозяевах, что делало возможной сайт-специфическую мутацию свободного цистеина в серии. Мутация была необходима при микробной экспрессии -ИФН для облегчения складывания белка. В частности, -ИФН, используемый в этих экспериментах, является товарным продуктом Betaseron, в котором остаток Cys17 заменен серином. Кроме того, отсутствие гликозилирования уменьшало растворимость продукта в водном растворе. Неспецифическое присоединение ПЭГ приводило в результате к повышенной растворимости, но главной проблемой являлся пониженный уровень активности и выход. Заявка на европейский патент ЕР 593868, названная "Конъюгаты ПЭГ-интерферон", описывает получение конъюгатов ПЭГИФН. Однако реакция присоединения ПЭГ не является сайт-специфической,и поэтому получается смесь изомеров положения конъюгатов ПЭГИФН (см. также Monkarsh и др.,ACS Symp.Ser., 680:207-216, 1997).Kinstler и др. в заявке на европейский патент ЕР 675201 продемонстрировали селективную модификацию N-концевого остатка фактора роста и развития мегакариоцитов м-ПЭГ-пропионовым альдегидом. Это позволило осуществить воспроизводимые присоединения ПЭГ и фармакокинетику от серии к серии.Gilbert и др. в патенте США 5711944 показали, что присоединение ПЭГ к -ИФН может быть проведено с оптимальным уровнем активности. В этом случае требовалась трудоемкая стадия очистки для получения оптимального конъюгата. Большинство цитокинов, как и другие белки, не обладают специфическим сайтом для присоединения ПЭГ и, кроме упомянутых выше примеров, очень возможно, что некоторые из изомеров, получаемые при реакции присоединения ПЭГ, являются частично или полностью неактивными, вызывая таким образом потерю активности конечной смеси. Сайт-специфическая реакция присоединения одной единицы ПЭГ является, таким образом, желаемой целью при получении таких белковых конъюгатов.Woghiren и др., Bioconjugate Chem., 4(5):314-318, 1993, синтезировали селективное к тиольной группе производное ПЭГ для такого сайт-специфического присоединения ПЭГ. Было показано, что устойчивое производное ПЭГ, защищенное по тиольной группе ортопиридилдисульфидной (о-П-SS-) реакционноспособной группой специфически конъюгируется со свободным цистеином в белке, папаине. Вновь образованная дисульфидная связь между папаином и ПЭГ могла быть расщеплена в мягких восстановительных условиях для регенерации нативного белка. Цитирование здесь любого документа не предполагает признания, что такой документ является ранним прототипом, или может быть рассмотрен как материал в отношении патентоспособности любого пункта настоящей заявки. Любое заявление, касающееся содержания или даты какого-либо документа, основывается на доступной заявителям информации на момент представления документа и не является признанием правильности такого заявления.-2 005495 Краткое описание изобретения Настоящее изобретение далее относится к способу поэтапного присоединения ПЭГ-частей последовательно к полипептиду, в частности к способу получения конъюгатов полиэтиленгликольИФН. Такие конъюгаты, как ожидают, показывают повышенную эффективность in vivo. Целью изобретения является достижение повышенной растворимости при нейтральных значениях рН, повышенной стабильности (пониженная агрегация), пониженной иммуногенности и отсутствия потери активности по отношению к "нативному" -ИФН. Результаты такой конъюгации могут уменьшить число доз, необходимых для ожидаемого действия, упростят и сделают стабильной препаративную форму фармацевтической композиции и увеличат продолжительность действия. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана кривая капиллярного электрофореза (КЭ) конъюгата ПЭГИФН до очистки; фиг. 2 А-2 С показывают очистку конъюгата ПЭГИФН, проведенную с помощью эксклюзионной по размерам хроматографии (супероза 12): фиг. 2 А - первое прохождение; фиг. 2 В - второе прохождение; фиг. 2 С - третье прохождение; фиг. 3 представляет хроматографию с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) конъюгата ПЭГИФН, очищенного после третьего прохождения хроматографии. Полосы 1 и 4 представляют стандарты белков определенной молекулярной массы, полоса 2 означает "нативный" -ИФН, и полоса 3 представляет конъюгат ПЭГИФН; фиг. 4 представляет кривую капиллярного электрофореза (КЭ) очищенного конъюгата ПЭГИФН,в котором -ИФН присоединен к ПЭГ использованием м-ПЭГ-о-П-SS5k; фиг. 5 представляет масс-спектр лазерной десорбции и ионизации из матрицы (MALDI-MS) очищенного конъюгата ПЭГИФН; фиг. 6 показывает сравнение антивирусной активности "нативного" -ИФН и конъюгата ПЭГ-ИФН. Клетки WISH инкубировали с указанными концентрациями образцов -ИФН в течение 24 ч до контрольного заражения цитопатической дозой вируса везикулярного стоматита. Цитопатический эффект определяли после дополнительных 48 ч при превращении с применением МТТ (3-[4,5 диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид, тиазолиловый синий); фиг. 7 представляет кривую связывания -ИФН и ПЭГ-ИФН в клетках Daudi; фиг. 8 демонстрирует фармокинетическую кривую -ИФН и ПЭГ-ИФН у мышей после внутривенного введения. Пунктирные линии указывают анализ низшего наблюдаемого количества (loq-анализ) для каждой стандартной кривой; фиг. 9 демонстрирует фармакокинетическую кривую -ИФН и ПЭГ-ИФН у мышей после подкожного введения. Пунктирные линии означают LOQ-анализ для каждой стандартной кривой. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей к полипептиду. Этот способ основывается на обнаружении того, что активированный ПЭГ с низкой молекулярной массой реагирует более полно со стерически затрудненным реакционным сайтом на белке,чем активированный ПЭГ с высокой молекулярной массой. ПЭГ-модификация дорогих терапевтических белков должна быть эффективной по стоимости, чтобы приготовление конъюгатов ПЭГ было целесообразным. Кроме того, чтобы уменьшить фильтрацию от конгломератов и оптимизировать фармакологические свойства конъюгатов ПЭГ-белок, конъюгаты должны иметь эффективный размер, эквивалентный таковому для белка с молекулярной массой в 70 кДа. Это означает, что для сайт-специфической модификации, когда присоединяется один остаток ПЭГ, предпочтительно присоединяется производное ПЭГ с молекулярной массой более, чем 20 кДа. Если сайт модификации стерически нагружен, реакционноспособная группа на большой ПЭГ-части может испытывать трудность в достижении сайта модификации, и это приведет к низким выходам. Предпочтительный способ присоединения ПЭГ к полипептиду согласно настоящему изобретению повышает выход сайт-специфического присоединения ПЭГ путем того, что сначала присоединяется небольшая гетеро- или гомобифункциональная ПЭГ-часть, которая, благодаря своему относительно меньшему размеру, может реагировать со стерически нагруженными сайтами. Последующее присоединение производного ПЭГ с большой молекулярной массой к небольшому ПЭГ приводит к высокому выходу желаемого белка с присоединенным ПЭГ. Способ поэтапного присоединения двух или нескольких ПЭГ-частей последовательно к полипептиду согласно настоящему изобретению включает присоединение гетеробифункциональной или гомобифункциональной ПЭГ-части с низкой молекулярной массой сначала к полипептиду и затем присоединение монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-части к свободному концу ПЭГ-части с низкой молекулярной массой, которая присоединена к полипептиду. После поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей последовательно к полипептиду, который предпочтительно является ИФН и в котором Cys17, расположенный в стерически нагруженном сайте, является предпочтительным сайтом присоединения ПЭГ, конъюгат ПЭГ-полипептид может быть очищен с использованием одной или более хроматографических методов."Хроматографический метод" подразумевает любую методику, используемую для разделения компонентов смеси при их нанесении на носитель (стационарная фаза), через который пропускают растворитель (подвижная фаза). Принципы разделения при хроматографии основываются на различных физических свойствах стационарной и подвижной фазы. Некоторые особые виды хроматографических методов, которые хорошо известны в литературе,включают: жидкостную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого давления (высокоэффективную), ионообменную хроматографию, абсорбционную хроматографию, аффинную хроматографию, распределительную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, обращенно-фазовую хроматографию, гель-фильтрацию, ультрафильтрацию или тонкослойную хроматографию. Термин "-ИФН", используемый здесь, означает интерферон фибробластов человека, полученный путем выделения из биологических жидкостей или полученный с помощью методик с рекомбинантной ДНК из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, предшественники и активные фракции при условии, что они содержат остаток цистеина, находящийся в положении 17 во встречающейся в природе форме. Понятие "соли", используемое здесь, относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям аминогрупп, полученным известными способами. Соли карбоксильных групп включают неорганические соли, такие как, например, натриевые, калиевые, кальциевые соли, и соли с органическими основаниями,такие, как образованные с амином, таким как, например, триэтаноламин, аргинин или лизин. Соли аминогрупп включают, например, соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, и с органическими кислотами, такими как уксусная кислота. Понятие "функциональные производные", используемое здесь, относится к производным, которые могут быть получены благодаря функциональным группам, присутствующим в боковых цепочках аминокислотных участков или в концевых N- или С-группах, в соответствии с известными способами и включаются в настоящее изобретение, когда они являются фармацевтически приемлемыми, т.е. когда они не подавляют активность белка или не придают токсичность содержащим их фармацевтическим композициям. Такие производные включают, например, сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп и N-ацилпроизводные свободных аминогрупп или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп, и образуются с ацильными группами, такими как, например, алканоильная или ароильная группы."Предшественники" представляют собой соединения, которые превращаются в -ИФН в организме человека или животного. В качестве "активных фракций" белка настоящее изобретение подразумевает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи самого соединения, одного или в комбинации с родственными молекулами или со связанными с ним остатками, например остатки сахаров или фосфатов или агрегаты полипептидной молекулы, когда такие фрагменты или предшественники проявляют такую же активность, как -ИФН, в качестве лекарственного средства. ПЭГ-часть с низкой молекулярной массой имеет формулуW-CH2CH2O(СН 2 СН 2 О)nСН 2 СН 2-Х,где W и X являются группами, которые независимо реагируют с амином, сульфгидрильной, карбоксильной или гидроксильной функциональной группой для присоединения ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду. W и X выбираются независимо предпочтительно из ортопиридилдисульфида,имидов малеиновой кислоты, винилсульфонов, иодацетимидов, аминов, тиолов, карбоксилов, активных сложных эфиров, бензотриазолкарбонатов, п-нитрофенолкарбонатов, изоцианатов и биотина. ПЭГ-часть с низкой молекулярной массой предпочтительно имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 до 5000 дальтон. Монофункциональная или бифункциональная ПЭГ-часть для присоединения к свободному концу ПЭГ с низкой молекулярной массой, который связан с полипептидом, имеет предпочтительно молекулярную массу в диапазоне примерно от 100 дальтон до 200 кДа и представляет предпочтительно метокси-ПЭГ, разветвленный ПЭГ, гидролитически или ферментативно разлагаемый ПЭГ, дополненный ПЭГ или дендримерный ПЭГ. Монофункциональный или бифункциональный ПЭГ имеет, кроме того, формулуY-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z,где Y является реакционноспособным остатком по отношению к концевой группе на свободном конце ПЭГ-части с низкой молекулярной массой, которая присоединена к полипептиду, и Z является метоксигруппой или реакционноспособной группой для образования бифункционального конъюгата. Конъюгат ПЭГ-полипептид, полученный вышеупомянутым способом поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей, может быть применен в качестве активного ингредиента для получения лекарственного средства или фармацевтической композиции для лечения заболеваний или нарушений, по отношению к которым полипептиды эффективны. Другим объектом настоящего изобретения является получение конъюгатов, по существу, в очищенной форме для того, чтобы они были пригодны для использования в фармацевтических композициях-4 005495 в качестве активных ингредиентов для лечения диагностики или прогнозирования бактериальных или вирусных инфекций, а также аутоиммунных, воспалительных заболеваний и опухолей. Нелимитирующие примеры вышеуказанных заболеваний включают септический шок, СПИД, ревматоидный артрит, красную волчанку и рассеянный склероз. Дальнейшие варианты осуществления изобретения и преимущества изобретения будут очевидны из следующего описания. Вариантом осуществления изобретения является введение фармакологически активного количества конъютатов по изобретению субъектам с риском развития одного из вышеупомянутых заболеваний или субъектам, уже имеющим такие патологии. Может быть использован любой способ введения, совместимый с действующим началом. Парентеральное введение, как, например, подкожное, внутримышечная или внутривенная инъекции предпочтительно. Доза активного ингредиента, которую следует ввести, зависит от медицинского предписания в соответствии с возрастом, весом и индивидуальной реакцией больного. Доза может быть в интервале от 10 мкг до 1 мг в день для среднего веса тела 75 кг, предпочтительная дневная доза находится в интервале от 20 до 200 мкг. Фармацевтические композиции для парентерального введения могут быть получены в виде инъецируемой формы, состоящей из активного начала и подходящего носителя. Носители для парентерального введения хорошо известны в этой области и включают, например, воду, физиологический раствор, раствор Рингера и/или декстрозу. Носитель может содержать небольшие количества наполнителей для поддержания стабильности и изотоничности фармацевтического препарата. Получение растворов может быть осуществлено согласно обычным методикам. Настоящее изобретение описано с ссылкой на конкретные варианты осуществления изобретения, но содержание описания включает все модификации и замены, которые могут быть сделаны специалистом в данной области без расширения объема и цели, определенных формулой изобретения. Изобретение далее будет описано с помощью следующих примеров, которые не должны быть рассмотрены как каким-либо образом ограничивающие настоящее изобретение. Пример 1. Получение конъюгата ПЭГИФН. Модификация -ИФН с помощью м-ПЭГ 5k-SS-П-о. Рекомбинантный -ИФН человека, устойчивый при концентрации 0,37 мг/мл в 50 мМ буфере с ацетатом натрия, рН 3,6, использовали для получения конъюгата ПЭГИФН. Примерно 1,0 мл 6 М мочевины прибавляли к 2 мл -ИФН в концентрации 0,37 мг/мл (0,74 мг, 3,710-8 моль). Прибавляли м-ПЭГ 5kSS-П-o с молярным избытком 50 моль на один моль -ИФН и оба компонента реагировали в полипропиленовой пробирке либо в течение 2 ч при 37 С, либо в течение 1 ч при 50 С. Реакционную смесь перед какой-либо очисткой анализировали с использованием кривой капиллярного электрофореза (КЭ) для определения степени образования конъюгата ПЭГИФН при реакции присоединения ПЭГ (фиг. 1). Типичный выход ПЭГИФН для этой реакции составляет 50%. Продукты реакции отфильтровывали от реакционной смеси с применением шприцевого фильтра диаметром 0,22 мм и отфильтрованный раствор затем загружали в колонку для эксклюзионной по размерам хроматографии (либо супероза 12, либо супердекс 75, Pharmacia) и элюировали буфером с рН 7,0, содержащим 50 мМ фосфат натрия, 150 мМNaCl. На фиг. 2 А представлена кривая элюирования после очистки конъюгата ПЭГИФН на колонке с суперозой 12 для вытеснительной по размерам хроматографии. Пики собирали и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (фиг. 3). Фракции,содержащие конъюгат ПЭГИФН, объединяли и концентрат затем повторно загружали в такую же колонку для вытеснительной по размерам хроматографии с целью дальнейшей очистки конъюгата ПЭГ-ИФН из-за близости пика "нативного" -ИФН (фиг. 2 В). Эту процедуру повторяли (третье прохождение),чтобы гарантировать чистоту (фиг. 2 С). Фиг. 4 и 5 представляют соответственно кривую капиллярного электрофореза и масс-спектр лазерной десорбции и ионизации из матрицы очищенного конъюгата ПЭГ-ИФН. Модификация -ИФН с помощью м-ПЭГ 30k-SS-П-o. Предоставленный рекомбинантный человеческий -ИФН устойчив в растворе в концентрации 0,36 мг/мл в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 3,6. Приблизительно 36 мг м-ПЭГ 30k-SS-П-o в 3 мл деионизованной воды прибавляли к 3 мл -ИФН в концентрации 0,36 мг/мл (1,08 мг, 4,910-8 моль) и оба продукта реагировали в полипропиленовой пробирке в течение 2 ч при 50 С. Реакционную смесь анализировали для определения степени модификации с помощью капиллярного электрофореза. Обычные выходы для этой реакции составляют 30%. Раствор затем помещают в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супероза 12, фирма Pharmacia) и элюируют с помощью буфера с рН 7,0, содержащего 50 мМ фосфата/натрия, 150 мМ NaCl. Фракции собирают и анализируют на содержание с применением электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Пример 2. Биологическая активность конъюгатов ПЭГИФН. Чтобы оценить влияние присоединения ПЭГ на противовирусную активность рекомбинантного человеческого -ИФН, амниотические клетки WISH человека предварительно инкубировали либо со свежеприготовленным -ИФН (такая же серия, как использованная для присоединения ПЭГ), либо с конъюгатом ПЭГИФН. Опосредствованную -ИФН противовирусную активность, как измеренную с помощью анализа заболеваемости клеток WISH при воздействии вируса везикулярного стоматита (VSV), определяли согласно разработанному биотесту для WISH, основанному на протоколе Novick и др., J. Immunol, 129:2244-2247(1982). Материалы, использованные в этом анализе WISH, приведены ниже: клетки WISH (АТСС/Американская коллекция типовых культур/CCL 25),штаммы вируса везикулярного стоматита (АТСС V-520-001-522), хранящиеся при -70 С,-ИФН, человеческий рекомбинантный, InterPharm Laboratories LTD (тип 32,075, партия 205035),82106 МЕд./мл, удельная активность: 222106 МЕд./мг,конъюгат ПЭГИФН, полученный в примере 1 и сохраняемый в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,4,среда для роста WISH (минимальная поддерживающая среда/МЕМ/с высоким содержанием глюкозы, с солями Earle+10% фетальной бычьей сыворотки+1,0% L-глутамина+пенициллин/стрептомицин(100 Ед./мл, 100 мкг/мл),среда для анализа WISH (MEM с высоким содержанием глюкозы, с солями Earle+5% фетальной бычьей сыворотки+1,0% L-глутамина+пенициллин/стрептомицин (100 Ед./мл, 100 мкг/мл),МТТ в концентрации 5 мг/мл в ЗФР, хранящийся при -70 С. Протокол испытания WISH следует далее. Делают двукратное разведение образцов -ИФН относительно начальной концентрации в среде для анализа WISH. Делают трехкратные разведения образцов -ИФН в среде для анализа WISH в 96-ячеечном плоскодонном планшете так, чтобы в каждой ячейке содержалось 50 мкл разведенного образца -ИФН (в некоторые контрольные ячейки помещают только 50 мкл среды для анализа WISH). Собирают клетки WISH фазы логарифмического роста с помощью раствора трипсин/этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), промывают средой для анализа WISH и доводят до конечной концентрации 0,8106 клеток/ мл. Прибавляют 50 мкл суспензии клеток WISH (4104 клеток/в ячейке) в каждую ячейку. Теперь конечная концентрация -ИФН, представленного клеткам, составляет 1. После инкубирования в течение 24 ч в инкубаторе в атмосфере 5% СО 2 добавляют 50 мкл, разбавленной 1:10 (в среде для анализа WISH) исходной культуры VSV (доза, предварительно определенная для лизирования 100% клеток WISH в течение 48 ч) во все ячейки, кроме контрольных ячеек (в такие ячейки помещают только равный объем среды для анализа). Еще через 48 ч во все ячейки добавляют 25 мкл раствора МТТ, после чего планшеты инкубируют еще в течение 2 ч в инкубаторе. Содержимое ячеек удаляют путем перевертывания планшета и в ячейки добавляют 200 мкл 100% этилового спирта. Через 1 ч снимают показания с планшетов при 595 нм с использованием программного обеспеченияSoft max Pro и спектрофотометрической системы Spectramax (фирмы Molecular Devices). Таблица 1 Противовирусная активность образцов -ИФН с присоединенным ПЭГ и с псевдоприсоединенным ПЭГ Исходные концентрации -ИФН в образцах, определенные с помощью аминокислотного анализа.ЕС 50 (эффективная концентрация, приводящая к 50%-ному эффекту) ( стандартное отклонение/С.О./) определяли с помощью программного обеспечения Microcal Origin 4.1 Как выше показано на фиг. 6 и в табл. 1, конъюгаты ПЭГИФН поддерживали уровень противовирусной активности выше уровня активности свежеприготовленной партии родительского -ИФН. Наблюдение, что конъюгат ПЭГИФН имеет приблизительно в 4 раза более высокую биоактивность, чем активность свежеприготовленного -ИФН, может также быть следствием увеличенной стабильности конъюгата ПЭГИФН по отношению к "нативному" -ИФН после прибавления среды для анализа клеток WISH.-6 005495 Пример 3. In vitro анализы относительной активности образцов ПЭГ-ИФН. Определяли относительную биоактивность ПЭГ [30 кДа]- -ИФН и ПЭГ [220 кДа]- -ИФН путем анализа WISH, используя стандартный протокол, описанный в примере 2 (табл. 2). Было проведено три независимых анализа тремя разными исполнителями в разное время. Таблица 2 Относительная противовирусная активность ПЭГИФН Дозы с ЕС 50 в сравнении со стандартом -ИФН, включенным в каждый анализ.Сравнение базируется на концентрации -ИФН в 330 мкг/мл. Исходные концентрации ПЭГ [30 кДа]- ИФН (5,41 мкг/мл) и ПЭГ [220 кДа]- -ИФН (6,86 мкг/мл) были определены с помощью аминокислотного анализа. Связывание ПЭГИФН с его рецептором на клетках оценивалось в присутствии фиксированного количества 125I-ИФН-2 а. ИФН-2 а радиоактивно метили с помощью 125I, используя метод с хлорамином Т. Связанный с 125I ИФН-2 а отделяли от свободного иода при пропускании реагентов через колонку с Сефадексом G25 и объединении содержащих белок фракций (фирма Pharmacia). 125I-ИФН-2 а количественно оценивали с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) (фирма Biosource,США) и определяли удельную активность. Собирали клетки Daudi, выросшие в экспоненциальной фазе роста, и 2106 клеток инкубировали с 0,5 нМ 125I-ИФН-2 а в течение 3 ч при комнатной температуре в присутствии различных концентраций ПЭГИФН или ИФН-2 а, разведенных в буфере для анализа,который является средой RPMI 1640, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% азида натрия. По окончании инкубирования клетки пропускали через слой фталата в виде масла и связанную с клеткой радиоактивность считали с помощью счетчика гамма-квантов. Следует добавить, что связывание ПЭГ[30 кДа]- -ИФН и ПЭГ [220 кДа]- -ИФН с рецептором было очень похожим или близким связывающей активности -ИФН, как показано на фиг. 7. Также относительная активность была определена при анализе антипролиферационного эффекта в отношении клеток Daudi (B-клетки лимфомы человека) (фиг. 3). Все интерфероны были приготовлены в концентрации 2 х от 200 нг/мл. Образцы разводили три раза вдоль по длине планшета при конечном объеме 100 мкл. Прибавляли в каждую ячейку 1105 клеток/ячейка (100 мкл) и инкубировали в общей сложности в течение 72 ч при 37 С в увлажненном СО 2 инкубаторе. Через 48 ч прибавляли насыщенный тритием (3 Н) тимидин в 20 мкл по 1 мкКю/в ячейке. В конце 72-часового инкубирования все содержимое планшета собирали с помощью устройства для сбора с планшета Tomtek. Представленные в табл. 3 результаты показывают, что после присоединения ПЭГ не наблюдали какой-либо определяемой потери активности интерферона. На самом деле, активность была несколько выше, чем для свободного -ИФН. Это может быть объяснено образованием неактивных агрегатов в свободном интерфероне или различиями в способах количественной оценки (аминокислотный анализ для образцов ПЭГ-ИФН и обращеннофазовая ВЭЖХ для -ИФН). Таблица 3 Анализ антипролиферационной активности на клетках Daudi-7 005495 Пример 4. Фармакокинетические исследования на мышах. Внутривенное введение. Мышей инъецировали 100 нг -ИФН, ПЭГ [30 кДа]- -ИФН или ПЭГ [220 кДа]-ИФН и кровь отбирали после этого в указанные моменты времени. Концентрации -ИФН в сыворотке определяли с помощью специфичного к -ИФН ELISA (Toray Industries), результаты приведены на фиг. 8. Двадцать восемь самок мышей штамма B6D2F1 (6-8 недель) (каждая весом примерно 20 г) делили на четыре группы следующим образом: группа 1 состояла из девяти мышей, однократно инъецированных 200 мкл болюса человеческого -ИФН в концентрации 500 нг/мл (конечная доза 100 нг/мышь); группа 2 (девять мышей) получала 200 мкл эквивалентного по массе ПЭГ [30 кДа]ИФН; группа 3 получала 200 мкл эквивалентного по массе ПЭГ [220 кДа]ИФН; и группа 4 является группой из трех неинъецированных мышей, служивших в качестве отрицательного контроля. Образцы крови (примерно 200 мкл/образец) собирали в девять указанных моментов времени путем введения в ретро-глазничное венозное сплетение капиллярной трубки. Образцам крови давали возможность свернуться в течение 1 ч при комнатной температуре, сгустки, перемешивая круговыми движениями, отводили от стенок и подвергали микроцентрифугированию. Выделенные при этом сыворотки хранили при -70 С до тех пор, пока были собраны все образцы. Сыворотки исследовались на присутствие биоактивного человеческого -ИФН с использованием Тоrау-анализа. Результаты показывают, что площадь под кривой (ППК) заметно возрастает в случае образцов ПЭГ-ИФН по отношению к свободному -ИФН и что ПЭГ [220 кДа]ИФН превосходит ПЭГ [30 кДа]ИФН. Подкожное введение. Мышам инъецировали подкожно -ИФН и ПЭГ-ИФН (100 нг/мышь). Фиг. 9 показывает, что общая площадь под кривой (ППК) резко увеличена в случае образцов ПЭГ-ИФН по сравнению со свободным ИФН. Фармакокинетические исследования согласуются с тем, что образцы ПЭГ-ИФН имеют больший период полувыведения и увеличенную ППК. Пример 5. Присоединение ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду. Связывание -интерферона с о-П-SS-ПЭГ 2k-гидразидом. Рекомбинантный человеческий -интерферон был использован в растворе в концентрации 0,33 мг/мл в 50 мМ натрийацетатного буфера, рН 3,8. Приблизительно 3,6 мг (40-мольный избыток по отношению к молям белка) гетеробифункционального включающего ПЭГ реагента, o-П-SS-ПЭГ 2k-гидразид, в 2 мл деионизованной воды добавляли 3 мл -ИФН в концентрации 0,33 мг/мл (0,99 мг) и оба компонента реагировали в полипропиленовой пробирке в течение 1 ч при 45 С. Реакционную смесь затем анализировали с использованием капиллярного электрофореза для определения степени модификации. Типичные выходы находились в пределах 90-97%, что зависело от чистоты -интерферона и ПЭГ реагента. Затем раствор вносили в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супердекс 75, Pharmacia) и элюировали содержащим 5 мМ фосфат натрия и 150 мМ NaCl буфером с рН 7,0. Фракции собирали и анализировали при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие -интерферон с одной присоединенной ПЭГ-частью, объединяли, используя затем для дальнейшего этапа модификации с применением ПЭГ с высокой молекулярной массой. Связывание -интерферона с (о-П-SS)2-ПЭГ 3400. Рекомбинантный человеческий -интерферон использовали в растворе в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 3,8, в концентрации 0,33 мг/мл. Приблизительно 6,1 мг (40-мольный избыток по отношению к молям белка) гомобифункционального ПЭГ реагента, (о-П-SS)2-ПЭГ 3400, в 2 мл деионизованной воды прибавляли к 3 мл -интерферона в концентрации 0,33 мг/мл (0,99 мг) и проводили реакцию в полипропиленовой пробирке 2 ч при 50 С. За ходом реакции следили с помощью невосстановительного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и конечную реакционную смесь анализировали с помощью капиллярного электрофореза для определения степени модификации. Типичные модификации для этой реакции с -интерфероном составляли 95%. Раствор затем вводили в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супердекс 75, Pharmacia) и элюировали содержащим 50 мМ фосфат натрия и 150 мМ NaCl буфером с рН 7,0. Фракции собирали и анализировали их содержание с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие -интерферон с одним присоединенным остатком ПЭГ, объединяли. К объединенным фракциям ИФН-S-S-ПЭГ 2k-гидразида примера 5 прибавляли м-ПЭГ 30k-альдегид в 20-мольном избытке по отношению к белку. Реакцию проводили при комнатной температуре (25 С) в течение 4 ч и образец помещали в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супероза 6,Pharmacia) для определения выхода модификации. Выход модификации обычно составлял 80% в зависимости от чистоты ПЭГ реагента и условий реакции. После полного описания этого изобретения специалистам в данной области понятно, что то же самое может быть осуществлено в большом диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий без отступления от объема и сути изобретения и без чрезмерного экспериментирования. Хотя это изобретение было описано в связи с конкретным вариантом его осуществления, понятно,что оно допускает дальнейшие модификации. Эта заявка предполагает распространение на любые варианты использования или адаптацию изобретений, следующих в большинстве случаев принципам изобретения и включающих и такие отклонения от настоящего раскрытия, как встречающиеся в рамках известной или привычной практики в области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным существенным признакам, указанным выше в заявленных пунктах формулы изобретения. Все указанные здесь ссылочные материалы, включая статьи в журналах и рефераты, опубликованные или неопубликованные заявки на патенты США или заявки на иностранные патенты, опубликованные патенты США или иностранные патенты или любые другие ссылки, полностью включены сюда в качестве ссылок, включая все данные, таблицы, рисунки и текст цитированных ссылок. Кроме этого,полное содержание ссылочных материалов в приведенных здесь ссылках также полностью включено в качестве ссылок. Ссылка на известные стадии методов, стадии обычных методов, известные методы или обычные методы ни в какой мере не является допущением того, что любой аспект, описание или осуществление настоящего изобретения раскрывается, изучается или предлагается в уровне техники. Приведенное выше описание конкретных вариантов осуществления изобретения настолько полно раскрывает общую природу изобретения, что другие могут, используя знания в пределах необходимой в данной области квалификации (включая содержание процитированных ссылок), легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие специальные варианты осуществления изобретения без чрезмерного экспериментирования, без отклонения от общей концепции настоящего изобретения. Поэтому, основываясь на обучении и следовании представленным здесь указаниям, предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах объема и существа эквивалентов раскрываемых вариантов осуществления изобретения. Следует также понять, что приведенная здесь фразеология или терминология используется с целью описания, а не ограничения, так что терминология или фразеология настоящего технического описания должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете представленного здесь обучения и следования представленным указаниям в комбинации со знаниями квалифицированного специалиста в данной области. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ поэтапного присоединения частей полиэтиленгликоля (ПЭГ) последовательно к полипептиду, включающий стадии взаимодействия полипептида с имеющей низкую молекулярную массу гетеробифункциональной или гомобифункциональной ПЭГ-частью, имеющей следующую формулу:W-CH2CH2O(CH2CH2O)nСН 2 СН 2-Х,где W и X являются группами, которые независимо реагируют с аминогруппой, сульфгидрильной, карбоксильной или гидроксильной функциональной группой для присоединения ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду, и взаимодействия присоединенной к полипептиду ПЭГ-части с низкой молекулярной массой с монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью для присоединения монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью к свободному концу ПЭГ-части с низкой молекулярной массой и образованием конъюгата ПЭГ-полипептид. 2. Способ по п.1, где монофункциональная или бифункциональная ПЭГ-часть имеет следующую формулу:Y-СН 2 СН 2 О(СН 2 СН 2 О)mCH2CH2-Z,-9 005495 где Y является группой, реакционноспособной по отношению к терминальной группе на свободном конце ПЭГ-части с низкой молекулярной массой, присоединенной к полипептиду, и Z является метоксигруппой или группой, реагирующей с X с образованием бифункционального конъюгата. 3. Способ по п.2, где монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью является метоксиПЭГ, разветвленный ПЭГ, гидролитически или ферментативно разлагаемый ПЭГ, дополненный ПЭГ с боковыми цепями или дендримерный ПЭГ. 4. Способ по п.1, где W и X независимо выбирают из группы, включающей ортопиридилдисульфид, имиды малеиновой кислоты, винилсульфоны, иодацетамиды, гидразиды, альдегиды,сложные сукцинимидильные эфиры, эпоксиды, амины, тиолы, карбоксилы, активированные сложные эфиры, бензотриазолкарбонаты, п-нитрофенолкарбонаты, изоцианаты и биотин. 5. Способ по п.1, где ПЭГ-часть с низкой молекулярной массой имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 до 5000 Да. 6. Способ по п.1, где монофункциональная или бифункциональная ПЭГ-часть имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 Да до 200 кДа. 7. Способ по п.1, где ПЭГ-частью с низкой молекулярной массой и/или монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью является сополимер полиэтиленгликоля. 8. Способ по п.7, где сополимер полиэтиленгликоля выбирают из группы, включающей сополимеры полиэтиленгликоль/полипропиленгликоль и сополимеров полиэтиленгликоль/поли(молочная/гликолевая кислота). 9. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию очистки конъюгата ПЭГ-полипептид, следующую за поэтапным присоединением двух ПЭГ-частей последовательно к полипептиду. 10. Способ по п.9, где указанная стадия очистки включает одну или несколько методик очистки,выбранных из группы, включающей ионообменную хроматографию, вытеснительную по размерам хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, аффинную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию. 11. Способ по любому из пп.1-10, где полипептидом является -интерферон. 12. Применение конъюгатов ПЭГ-полипептид, полученных по способу по любому из пп.1-10, в качестве лекарственного средства.