Новые конструкты для экспрессии вируса гриппа

НОВЫЕ КОНСТРУКТЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ВИРУСА ГРИППА Изобретение представляет линейный экспрессирующий конструкт, не содержащий никаких последовательностей для амплификации и/или селекции, который содержит промотор РНКполимеразы I (polI) и сигнал терминации polI, вставленные между промотором РНК-полимеразыII (polII) и сигналом полиаденилирования, пригодный для экспрессии сегментов вирусной РНК,предпочтительно РНК вирусов гриппа. Патентоспособный конструкт полезен для эффективного и быстрого получения вирусных частиц, особенно для получения рецептур вакцин для лечения эпидемических и/или пандемических заболеваний.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: АВИР ГРИН ХИЛЗ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ РИСЕРЧ ДИВЕЛОПМЕНТ ТРЕЙД АГ (AT) 017456 Область техники Изобретение относится к новому линейному экспрессирующему конструкту для экспрессии сегментов вирусной РНК, предпочтительно вирусов гриппа, не содержащему никаких последовательностей для амплификации и/или селекции и содержащему промотор РНК полимеразы I (polI) и сигнал терминации polI, которые вставлены между промотором РНК полимеразы II (polII) и сигналом полиаденилирования. Изобретение также распространяется на использование этого экспрессирующего конструкта для получения вирусных частиц. Уровень техники РНК-содержащие вирусы с негативной цепью - это группа вирусов животных, содержащая несколько важных патогенов человека, включая вирусы гриппа, кори, эпидемического паротита, бешенства, респираторно-синцитиальный вирус, вирус Эбола и хантавирусы. Геномы этих РНК-вирусов могут быть мономолекулярными или сегментированными, одноцепочечными с (-) полярностью. На эти вирусы распространяются два основных требования: геномная РНК должна эффективно копироваться в вирусную РНК, форму, которая может быть использована для включения в вирусные частицы потомства; геномная РНК должна транскрибироваться в мРНК, которая транслируется в вирусные белки. Эукариотические клетки-хозяева обычно не имеют механизмов репликации РНК-матриц или трансляции полипептидов с РНК-матрицы с негативной цепью. Следовательно,РНК-содержащие вирусы с негативной цепью кодируют и несут РНК-зависимую РНК-полимеразу для катализирования синтеза новой геномной РНК для включения в потомков и для катализирования синтеза мРНК для трансляции в вирусные белки. Геномная вирусная РНК должна быть упакована в вирусные частицы для передачи вируса. Процесс, при котором собираются вирусные частицы потомства и осуществляются белок-белковые взаимодействия в процессе сборки, является общим для РНК-вирусов. Образование вирусных частиц обеспечивает эффективный перенос РНК-генома от одной клетки-хозяина к другой в пределах одного организма или между различными организмами-хозяевами. Вирусные семейства, содержащие в оболочке одноцепочную РНК с антисмысловым геномом, классифицируют на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и вирус болезни Борна, Togaviridae) и имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae включает в себя вирусы гриппа типов А, В и С, а также вирусы Тогото, Дхори и вирус инфекционной анемии лососевых. Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового кора (спирального нуклеокапсида), содержащего одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеиновой оболочки, покрытой изнутри матриксным белком (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из 8 линейных, одноцепочечных молекул РНК с негативной цепью, которые кодируют одинадцать (некоторые штаммы гриппа А десять) полипептидов, включая: белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ 2, РВ 1 и РА); нуклеопротеин (NP), формирующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (M1, М 2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из липидосодержащей оболочки: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу(NA); неструктурный белок (NS1) и белок ядерного экспорта (NEP). Большинство штаммов гриппа А кодируют также одинадцатый белок (PB1-F2), по-видимому, обладающий проапоптотическими свойствами. Транскрипция и репликация генома происходят в ядре, а сборка происходит путем почкования на плазматической мембране. Вирусы могут перемешивать гены во время смешанных инфекций. С помощью НА вирус гриппа адсорбируется на сиалилолигосахаридах гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. При последующем эндоцитозе вириона внутри клеточной эндосомы в молекуле НА происходят конформационные изменения, облегчающие слияние мебран и вызывающие утрату вирусом оболочки. Нуклеокапсид мигрирует в ядро, где транскрибируется вирусная мРНК. Вирусная мРНК транскрибируется с помощью уникального механизма, в котором вирусная эндонуклеаза отрезает от клеточных гетерологичных мРНК кэпированные 5'-концы, которые затем служат праймерами для транскрипции вирусных РНК-матриц вирусной транскриптазой. Транскрипты терминируются на участках от 15 до 22 оснований от концов их матриц, где олиго-U последовательности действуют как сигналы для добавления поли-А трактов. Из восьми производимых таким образом вирусных РНК-молекул, шесть моноцистронны и транслируются непосредственно в белки НА, NA, NP и белки вирусной полимеразы, РВ 2,РВ 1 и РА. Два других транскрипта подвергаются сплайсингу и каждый дает по две мРНК транслирующихся с различными рамками считывания для получения белков M1, M2, NS1 и NEP. Другими словами,восемь вирусных РНК-сегментов кодируют одинадцать белков: девять структурных и 2 неструктурных белка (NS1 и недавно идентифицированный РВ 1 -F2). Создание современных вакцин против вирусов гриппа, особенно против высокопатогенных вирусов птичьего гриппа, основывается на использовании обратной генетики, позволяющей получать вирусы гриппа из ДНК. Первый шаг разработки обратногенетической системы для конструирования РНКсодержащих с негативной цепью вирусов гриппа предусматривает трансфекцию единичного вирусного гена, смешанного с in-vitro реконструированными рибонуклеопротеиновыми (РНП) комплексами, и последующую инфекцию хэлперным вирусом гриппа. РНП-комплексы были созданы путем инкубирования-1 017456 синтетических РНК-транскриптов с выделенными из вирусов гриппа полимеразными белками (РВ 1, РВ 2 и РА) и с белком NP, а хелперный вирус был использован как внутриклеточный источник вирусных белков и других вирусных РНК (Luytjes et al., 1989, Cell, 59, 1107-1113). Neumann et al. (Virology, 1994, 202,477-479) добились образования РНП с вирусной модельной РНК в инфицированных гриппом клетках после экспрессии РНК с плазмиды с респонсивным к мышиной РНК полимеразе I промотором.Pleschka et al. (1996, J. Virol., 4188-4192) описали способ, в котором РНП-комплексы были воссозданы с помощью экспрессирующих векторов на основе плазмид. С плазмиды, содержащей укороченный промотор полимеразы I (polI) человека и рибозимную последовательность, образующую с помощью автокаталитического гидролиза конец молекулы, была получена экспрессия вирусного РНК-подобного транскрипта. PolI-зависимая плазмида была котрансфецирована в линию человеческих клеток 293 вместе с polI-респонсивными плазмидами, экспрессирующими вирусные белки РВ 1, РВ 2, РА и NP. Однако эффективность трансфекции была очень низкой, прибл. 10 трансфектантных вирусных частиц на трансфекцию. Кроме того, эта основанная на плазмидах стратегия зависела от помощи хелперного вируса. В WO 01/04333 сегментированные РНК-содержащие вирусы с негативной цепью были созданы с помощью набора из 12 экспрессирующих пламид для экспрессии геномных сегментов вирусной РНК и для экспрессии РНП-белков. Вектора, описанные в WO 01/04333, основывались на широко известных плазмидах pUC19 или pUC18. В соответствии с описанием, этой системе необходим набор из 8 плазмид,экспрессирующих все 8 сегментов вируса гриппа, вместе с дополнительным набором из 4 плазмид, экспрессирующих нуклеопротеин и субъединицы РНК-зависимой РНК полимеразы (РВ 1, РВ 2, РА и NP).WO 00/60050 охватывает набор по меньшей мере из двух векторов, содержащих промотор, функционально связанный с сегментами кДНК вируса гриппа (РА, РВ 1, РВ 2, НА, NP, NA, М), которые связаны с последовательностью терминации транскрипции и охватывает по меньшей мере два вектора содержащих промотор, функционально связанный с сегментами (PA, PB1, РВ 2, NP) ДНК вируса гриппа. Использование большого количества различных векторов пытались преодолеть с помощью плазмиды, содержащей для синтеза вирусной РНК восемь транскрипционных кассет, зависимых от РНК-полимеразы I.WO 01/83794 описывает кольцевые экспрессирующие плазмиды, которые содержат промотор РНКполимеразы I (polI) и сигнал терминации polI, вставленные между промотором РНК-полимеразы II (polII) и сигналом полиаденилирования. Такой вектор, в соответствии с применением, описывается как плазмида - обычно являющаяся самодостаточной молекула двухцепочечной ДНК, которая может включить в себя дополнительную чужеродную ДНК и которая может быть легко введена в подходящую клетку. Вызванные вирусными заболеваниями эпидемии и пандемии по-прежнему уносят человеческие жизни и влияют на мировую экономику. Грипп влечет за собой миллионы потерянных рабочих дней,миллионы обращений к врачам, сотни тысяч госпитализаций по всему миру (Couch 1993, Ann. NY. Acad.Sci 685;803), десятки тысяч скоропостижных смертей (CollinsLehmann 1953 Public Health Monographs 213:1; Glezen 1982 AmJ. Public Health 77:712) и расходы на здравоохранение в миллиарды евро (Williamset al. 1988, Ann. Intern. Med. 108:616). Если здоровые взрослые иммунизируются, то имеющиеся в настоящее время вакцины предотвращают клинические формы заболеваний в 70-90% случаев. Этот уровень снижается до 30-70% у возрастной группы старше 65 лет и падает еще ниже у проживающей в домах престарелых возрастной группы старше 65 лет (Strategic Perspective 2001: The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59). Частые изменения вирусных антигенов способствуют большому общему числу погибших,т.к. даже ежегодная вакцинация не гарантирует защиты. Так, в США общее число погибших в 1976/77 годах (16363 тысяч человек) выросло в четыре раза в 1998/99 годах (Wall Street Journal, Flu- related deathsin US despite vaccine researches, January 7, 2003). Крайне важно обеспечить вакцинацию или лечение сразу после вспышки заболевания, особенно в случае вспышки пандемических вирусных заболеваний. В свете настоятельной необходимости обеспечения эффективной защиты от вирусных заболеваний и их лечения существует большая потребность в разработке экономных, быстрых и эффективных экспрессирующих систем для продуцирования вирусов, способных преодолеть недостатки и трудности существующих в настоящее время систем. Краткое описание изобретения Изобретатели неожиданно обнаружили, что использование линейного экспрессирующего конструкта, свободного от любых традиционных плазмидных последовательностей для аплификации и/или селекции и содержащего вирусный ген, клонированный в кассету с промотором РНК-полимеразы I (polI) и сигналом терминации polI, вставленную между промотором РНК-полимеразы II и сигналом полиаденилирования, обеспечивает высокоэкономичный и эффективный инструмент для быстрого получения вирусных частиц. В отличие от плазмид, использованных в известных технологиях, нет необходимости клонирования в бактериальных клетках. Следовательно, время, необходимое для трансфекции и экспрессии вирусных частиц, может быть значительно уменьшено по меньшей мере от нескольких недель до нескольких дней. Например, линейный экспрессирующий конструкт по изобретению может быть использован для разработки вакцин против РНК-содержащих вирусов, в частности, против вирусов гриппа либо дикого типа, либо мутантных либо реассортантных штаммов. Это дает инструмент для быстрой генерации лю-2 017456 бой вирусной вакцины, необходимой в случае возникновения эпидемии или пандемии гриппа. По необходимости, линейный экспрессирующий конструкт может быть превращен в кольцевую форму с помощью коротких линкерных последовательностей. Также могут быть предусмотрены способы, в которых линейные экспрессирующие конструкты используются для получения вирусных частиц или в качестве альтернативы, в которых с замкнутого в кольцо экспрессирующего конструкта могут экспрессироваться несколько вирусных генных сегментов целого вируса, в которых по меньшей мере один из генных сегментов экспрессируется линеаризованным экспрессирующим конструктом по данному изобретению. Чертежи На фиг. 1 показана схематическая диаграмма создания линейных двунаправленных экспрессирующих конструктов:a) фрагменты F1, F2 и F3 создаются отдельно амплификацией с помощью ПЦР;b) фрагмент F4 создается перекрывающейся ПЦР с помощью олигонуклеотидов Р 4 и Р 6. Подробное описание изобретения Как уже говорилось во введении, используемые в настоящее время обратногенетические системы восстановления сегментированных РНК-вирусов требуют трансфекции большого числа различных плазмид и/или вс еще страдают от необходимости субклонирования вирусных генов и последующей амплификации в бактериальных клетках для получения достаточного количества плазмид. Плазмидная ДНК должна быть отсеквенирована, выделена из бактерий для каждого индивидуального клона и только после этого может быть использована для трансфекции клеток животных. Этот способ является трудоемким,дорогостоящим и трудноавтоматизируемым. Данное изобретение дает новую линейную экспрессирующую кассету, свободную от любых традиционных плазмидных последовательностей для бактериальной амплификации и/или селекции и содержащую вирусный ген, клонированный в кассету, которая может быть использована для экспрессии вирусных частиц, состоящую из промотора РНК-полимеразы I (polI) и сигнала терминации polI, вставленных между промотором РНК-полимеразы II и сигналом полиаденилирования."Кассета" означает кодирующую последовательность ДНК или сегмент, кодирующий экспрессируемый продукт, которые могут быть вставлены в экспрессирующий конструкт по определенным рестрикционным сайтам. Рестрикционные сайты кассеты разработаны так, чтобы обеспечить вставку кассеты в правильной рамке считывания. Патентоспособные конструкты позволяют транскрипцию кДНК в мРНК и в полноразмерную вирусную РНК с негативной (смысловой) цепью (двунаправленная транскрипция) или позволяют транскрипцию мРНК и полноразмерной кРНК с позитивной (смысловой) цепью (однонаправленная транскрипция). Для однонаправленной транскрипции ген располагается после промотора polI и промотора polII.PolII промотор производит кэпированную смысловую вирусную мРНК, а polI промотор производит некэпированную смысловую вирусную кРНК. Для двунаправленной транскрипции ген располагается между вышерасположенным промотором polII и нижерасположенным промотором polII. Транскрипция сpolII промотора дает кэпированную смысловую вирусную мРНК, а транскрипция с polI промотора дает некэпированную антисмысловую вирусную РНК. Изобретатели показали, что такой патентоспособный линейный экспрессирующий конструкт может быть эффективно использован для трансфекции клеток и экспрессии целых вирусных частиц, хотя в данной области часто описывалось то, что трансфекция животных клеток линейными фрагментами может приводить к быстрому разрушению этих фрагментов клеточными экзонуклеазами (van der Aa et al. 2005,J Gene Med. 7:208-17) или приводить к усиленному апоптозу трансфецированных клеток (Yao et al. 2001,J Biol Chem. 276:2905-13). Линейные экспрессирующие конструкты не содержат никаких последовательностей для селекции или амплификации, необходимых для амплификации плазмид в бактериальных клетках. В них нет последовательности начала репликации (ori), генов устойчивости к антибиотикам или любых других селекционные маркеров. В соответствии с конкретным воплощением изобретения линейный экспрессирующий конструкт может содержать дополнительные защитные последовательности на N- и/или С-концах конструкта. Например, защитные последовательности могут быть последовательностями пептид-нуклеиновой кислоты(ПНК), как описано в WO 00/56914. Эти ПНК являются аналогами нуклеиновой кислоты, в которых внутренний деоксирибозид-фосфатный остов заменен на химически полностью отличный, но структурно гомологичный полиамидный (пептидный) остов, содержащий 2-аминоэтил глициновые звенья. Было показано, что "хомуты" из ПНК увеличивают стабильность, в случае, когда две идентичные ПНКпоследовательности соединены гибким линкером-"шпилькой", содержащим три звена из 8-амино-3,6 диоксаоктановой кислоты. Если ПНК смешать с целевыми комплементарными гомопуриновыми или гомопиримидиновыми последовательностями ДНК, то может образоваться чрезвычайно стабильный ПНК-ДНК-ПНК триплексный гибрид (Bentin et al., 1996, Biochemistry, 35, 8863-8869, Egholm et al., 1995,Nucleic Acids Res., 23, 217-222, Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, Demidov et al.,-3 017456Proc.Natl.Acad.Sci., 1995, 92, 2637- 2641). Было показано, что он устойчив к нуклеазному и протеазному гидролизу (Demidov et al., Biochem.Pharm., 1994,48,1010-1013). В целях защиты от клеточных нуклеаз защитные последовательности могут быть любыми последовательностями нуклеиновых кислот длиной по меньшей мере в 20 нуклеотидных остатков, предпочтительно по меньшей мере в 50 нуклеотидных остатков, более предпочтительно по меньшей мере в 100 нуклеотидных остатков. Эти нуклеиновые кислоты могут быть гидролизованы нуклеазами, защищая от или замедляя, таким образом, деградацию основных последовательностей, например, промоторных последовательностей, вирусных последовательностей и последовательностей терминации экспрессии конструкта. Линейный экспрессирующий конструкт может содержать по меньшей мере один вирусный генный сегмент, вставленный между polI-промотором и сигналом терминации. Использованный в данном изобретении термин "вирусный ген" означает последовательность ДНК или кДНК или продукт амплификации ОТ-ПЦР, кодирующие или соответствующие определенной последовательности аминокислот. Термин ген также включает полноразмерные гены и их фрагменты, также как производные, содержащие модификации последовательности естественных генов. Эти модификации могут быть делециями, заменами или вставками нуклеотидов приводящими к аминокислотным заменам, также как и к молчащим мутациям, в которых изменение одного или более нуклеотидов не приводят к замене аминокислоты, кодируемой в данной позиции. Модификации могут также включать функционально-консервативные мутанты, у которых замена данного аминокислотного остатка не ведет к изменению общего типа и функции полипептида. Что включает различные мутанты, варианты с консервативной последовательностью и функционально-консервативные генные сегменты РНК-содержащих вирусов, предпочтительно генные сегменты РНК-содержащих вирусов с негативной цепью. Модификации могут быть введены методом случайного мутагенеза или сайт-направленного мутагенеза, например модификацией последовательности с помощью ПЦР. Модификация одного или более индивидуальных генных сегментов РНК-содержащего вируса позволяет создавать аттенуированные вирусы или вирусы с ограниченным репликативным потенциалом. В соответствии с изобретением термин "ограниченный репликативный потенциал" определяется как скорость репликации в интерферон-компетентных клетках-хозяевах, которая по меньшей мере меньше чем 5%, предпочтительно меньше чем 1%, предпочтительно меньше чем 0,1% скорости репликации вируса гриппа дикого типа, что определяется с помощью анализа гемааглютинации, анализа полуинфицирующей дозы культуры ткани или анализа бляшкообразования, способами, хорошо известными в данной области. Патентоспособный экспрессирующий конструкт может быть использован для экспрессии сегментированных или несегментированных РНК-геномов. Примерами несегментированных вирусов являются вирусы семейств Rhabdoviridae или Paramyxoviridae. В соответствии с изобретением экспрессирующий конструкт предпочтительно может быть использован для экспрессии сегментированных РНК-содержащих вирусов. Например, вирусные кДНК, соответствующие каждому гену в целевом вирусном геноме, вставляются в линейный экспрессирующий конструкт изобретения, что дает в результате набор линейных экспрессирующих конструктов полностью перекрывающих вирусный геном. Для амплификации этих конструктов может быть использована хорошо известная в данной области технология ПЦР, позволяющая избежать отнимающие много времени клонирование, амплификацию,секвенирование и очистку из бактериальных клеткок. В соответствии с предпочтительным воплощением вирусные сегменты получают из вирусов семейств Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae. Предпочтительней, если их получают из вирусов гриппа типов А, В и С, а также из вирусов Тогото, Дхори и вируса инфекционной анемии лососевых. В случае вируса гриппа, вирусный генный сегмент может быть выбран из группы содержащей геныPA, PB1, РВ 2, НА, NA, NP, M, NS или их части. В качестве варианта сегмент вирусного гена NS может кодировать нефункциональный белок NS1. Что может быть вызвано любой модификацией в гене NS,например, заменой, вставкой или делецией нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, если модификации гена NS ослабляют или устраняют способность продукта гена NS противодействовать клеточному ответу на интерферон. Примеры вирусов гриппа, имеющих уменьшенное, либо отсутствующее противодействие интерферону, детально описаны в патентах US 6669943 или US 6468544 и включены здесь посредством ссылки. Предпочтительное воплощение распространяется на реассортантные вирусы, в которых каждый вирусный сегмент может быть выделен из определенного вирусного штамма, например, из H1N1, из H3N2 и даже из H5N1 или из любого сезонного штамма, выявленного в качестве наиболее значимой причины возникновения гриппа. Реассортантные вирусы могут, таким образом, нести желаемую фоновую антигенную особенность, которая позволяет эффективно продуцировать их в клетке-хозяине. Например, реассортантные вирусы гриппа объединяют гены поверхностных гликопротеинов актуальных интерпандемических вирусов гемагглютинин (НА) и/или нейроминидазу (NA) с пятью или шестью или семью сег-4 017456 ментами РНК, кодирующими другие белки из аттенуированного исходного вакцинного штамма (комбинация 6/2), или реассортанты 7/1 или реассортанты 5/3, содержащими М генов различного происхождения соответственно. Эти реассортантные вирусы могут быть использованы как вирусная исходная культура для производства вирионов для изготовления вакцины. Термин "вирион" относится к вирусным частицам, которые будучи только что произведенными из клеток-хозяев трансфецированных или котрансфецированных с помощью экспрессирующей системы по изобретению являются полностью инфекционными для клеток-хозяев. Такая система производит вирусную РНК и вирусные белки (путем трансляции вирусной РНК), что, таким образом, приводит к сборке инфекционных вирусных частиц. Линейные экспрессирующие конструкты по изобретению могут также быть объединены в набор по меньшей мере из двух экспрессирующих конструктов. Например, может быть предоставлен набор из восьми линейных экспрессирующих конструктов, каждый из которых содержит сегмент с вирусным геном РА, РВ 1, РВ 2, НА, NA, NP, М и NS или их часть вируса гриппа. В ином случае, линейный экспрессирующий конструкт может быть замкнут в кольцо пептидными линкерами и/или перекрывающимися последовательностями. Возможно, могут использоваться различные другие системы для замыкания в кольцо подобные системе из 5' олигонуклеотида с удлиняющим сегментом, содержащим GGGG, и 3' олигонуклеотида с СССС последовательностью. В ином случае, после обработки ДНК полимеразой фага Т 4 в присутствие дАТФ и дТТФ (для образования липких концов) линейные конструкты могут быть замкнуты в кольцо лигированием. Настоящее изобретение также распространяется на клетки-хозяева, содержащие по меньшей мере один патентоспособный линейный экспрессирующий конструкт. В рамках изобретения термины "клетки" и "клетки-хозяева" означают культивирование индивидуальных клеток, тканей, органов, клеток насекомых, птичьих клеток, клеток млекопитающих, гибридом,первичных клеток, стабильных клеточных линий и/или клеток, измененных с помощью генетической инженерии, таких как рекомбинантные клетки, экспрессирующие вирус. К ним могут относится, например, клетки BSC-1, клетки LLC-MK, клетки CV-1, клетки СНО, клетки COS, мышиные клетки, человеческие клетки, клетки HeLa, клетки 293, клетки Vero, клетки MDBK, клетки MDCK, клетки MDOK, клеткиCRFK, клетки RAF, клетки ТСМК, клетки LLC-PK, клетки PK15, клетки WI-38, клетки MRC-5, клетки TFLY, клетки ВНК, клетки SP2/0, клетки NSO, PerC6 (человеческие клетки сетчатки), клетки куриного эмбриона или производные, клетки оплодотворенного яйца, оплодотворенные куриные яйца или их производные. Предпочтительной клеточной линией является клеточная линия Vero. Помимо широко известных способов введения последовательностей кДНК в экспрессирующие системы настоящее изобретение также предусматривает способ для простого создания линейных экспрессирующих конструктов, в которых вирусные сегменты снабжены комплементарными последовательностями, перекрывающимися с последовательностями polI-промотора и polI-терминатора. В этом случае три различных фрагмента объединяются, отжигаются и амплифицируются с помощью ПЦР. При использовании линейного экспрессирующего конструкта по изобретению нет необходимости в трансформации и амплификации плазмид в бактериальных клетках. Линейные фрагменты, каждый содержащий по меньшей мере один сегмент генома вируса гриппа или его часть, могут быть использованы для прямой трансфекции клеток-хозяев. Использование этих линейных конструктов предусматривает систему трансфекции и экспрессии вирусных частиц с помощью конструкта по изобретению, для которой для получения полной вирусной частицы необходимо только несколько дней. В общих словах, от получения изолята вируса гриппа до трансфекции может пройти от нескольких часов до 2-3 дней после получения вируса. В отличие от этого, для клонирования плазмид, как это заведено в данной области, необходимо по меньшей мере 4-5 дней без секвенирования. Трансфекция может быть осуществлена на 5-й день. При этом для оптимизации выбора корректной плазмиды необходимо протестировать несколько бактериальных клонов для каждого "нового" сегмента. Если доступны последовательности для соответствующего вирусного изолята, то секвенирование нескольких клонов каждого сегмента замедлит процесс еще примерно на один день. Таким образом, трансфекция может быть проведена самое раннее на 6-й день. Полное секвенирование без предварительной информации о последовательности добавит 2-3 дня для олигонуклеотидного синтеза. Согласно дальнейшему воплощению изобретение включает способ продуцирования линейного экспрессирующего конструкта, в котором есть сшитые вместе перекрывающейся ПЦР и очищенные стандартными способами очистки: фрагмент ДНК, содержащий вирусный сегмент, последовательность гомологичную polI-промотору и последовательность гомологичную polI-терминатору; в котором есть фрагмент ДНК, содержащий защитную последовательность, последовательность polI-промотора, последовательность сигнала полиаденилирования и перекрывающиеся последовательности, по меньшей мере,длиной в 5 нуклеотидов, предпочтительно длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов, предпочтительно длиной по меньшей мере в 12 нуклеотидов, комплементарные вирусному сегменту; и в котором есть фрагмент ДНК, содержащий защитную последовательность, CMV-промотор, последовательность polIтерминатора, и перекрывающуюся последовательность длиной по меньшей мере в 5 нуклеотидов, пред-5 017456 почтительно длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов, предпочтительно длиной по меньшей мере в 12 нуклеотидов, комплементарную вирусному сегменту. Согласно альтернативному способу фрагмент ДНК, содержащий вирусный сегмент, последовательность гомологичную polI-промотору и последовательность гомологичную polI-терминатору может дополнительно содержать по меньшей мере 5 нуклеотидов, которые вводятся в фрагмент для того, чтобы служить комплементарными последовательностями для слияния вместе посредством ПЦР двух фрагментов, содержащих polI-терминатор с CMV-промотором, и polI-промотор с сигналом полиаденилирования. Оба использованных для амплификации вирусных сегмента олигонуклеотида могут быть разработаны так, чтобы содержать последовательности, комплементарные фрагменту ДНК, содержащему CMVпромотор и polI-терминатор, и фрагменту ДНК, содержащему polI-промотор и сигнал полиаденилирования (схематично показано как F2, F3, см. фиг. 1). Таким образом, увеличиваются длины перекрывающихся участков между вирусным генным сегментом (схематично показан как F1 на фиг. 1) и фрагментом ДНК, содержащим CMV-промотор с polI-терминатором, с одной стороны, и вирусный генный сегмент и фрагмент ДНК, содержащий polI-промотор с сигналом полиаденилирования, - с другой, что должно облегчить второй этап ПЦР, в котором вирусный генный сегмент сливается с фрагментом ДНК, содержащим CMV-промотор и polI-терминатор и фрагментом ДНК, содержащим polI-промотор и сигнал полиаденилирования. Изобретение также распространяется на способ продуцирования частицы вируса с негативной цепью, включающий в себя культивирование клеток-хозяев в условиях, позволяющих продуцирование вирусных белков, вирусной РНК или кРНК. Например, линейные конструкты, содержащие все вирусные генные сегменты, используются для трансфекции клеток-хозяев. Клетки затем содержаться в культуральной среде, а вирусные частицы могут изолироваться и очищаться из культурального супернатанта. По необходимости, для увеличения чистоты экспрессирующего конструкта и для уменьшения токсичности при трансфекции в клетки-хозяева может быть включен второй этап очистки. Коммерческие наборы для очистки продуктов ПЦР обычно основываются на связывании ДНК к мембранам из окиси кремния при высоких концентрациях солей. К своему удивлению, изобретатели обнаружили, что однократно очищенные коммерческими китами для очистки фрагменты ПЦР могут демонстрировать высокую токсичность при трансфекции в клетки Vero, что может мешать высвобождению вируса. Если продукты ПЦР очищаются вторым этапом очистки, основанным на использовании анионообменной смолы, то чистота продуктов ПЦР может увеличиться, что приведет к с повышенной эффективности высвобождению вируса. В ином случае, может быть выполнен только один шаг очистки, основанный на использовании анионообменной смолы. В соответствии со специфическим воплощением смесь Taq полимеразы и высокоточной полимеразы (например, Pfu полимеразы) может быть использована для всех этапов ПЦР-амплификации. Таким образом, могут быть сведены к минимуму мутации, полученные посредством ПЦР. Более того, это избавляет от необходимости инкорпорирования дополнительных тимидиновых остатков во фрагмент ДНК,содержащий CMV-промотор, polI-терминатор и вирусный генный сегмент, и во фрагмент ДНКсодержащий polI-промотор и сигнал полиаденилирования. Таким образом, покрывается способ для генерации частиц вируса гриппа, в котором по меньшей мере один линейный экспрессирующий конструкт прямо трансфицируется в животные клетки-хозяева и в котором вышеупомянутые клетки-хозяева культивируются в условиях, в которых экспрессируется вирус гриппа, собираются и очищаются вирусные частицы. Кроме того, способом также охвачен случай, в котором вирусные частицы после аттенуирования или инактивации добавляются в качестве терапевтического или профилактического лекарственного средства в фармацевтическую композицию вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или адъювантом. Предпочтительно, если вирусные частицы используются для производства фармацевтического препарата для терапевтического или профилактического лечения инфекционных заболеваний,главным образом, используются для разработки вакцин. Способ введения включает в качестве неограничевающих примеров внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, интраназальный, эпидуральный или пероральный способы введения. Предпочтительным является интраназальный способ введения. В предпочтительном воплощении желательным может быть введение фармацевтического препарата любым подходящим способом в легкие. Так, может быть применено пульмонарное введение, например,ингалятором или распылителем или вместе с аэрозольным агентом. Фармацевтический препарат также может быть введен системой контролируемого высвобождения,такой как насос. Лекарственное средство по изобретению может содержать терапевтически эффективное количество вируса с ограниченным репликативным потенциалом и фармацевтически приемлемым носителем. "Фармацевтически приемлемый" означает утвержденный регулирующими органами, такими как FDA или-6 017456 ЕМЕА. Термин "носитель" относится к растворителю, адъюванту, связующему или наполнителю, с которыми вводится препарат. Могут использоваться солевые растворы, растворы декстрозы или глицерина в качестве жидких носителей, или связующие подобные глюкозе, лактозе, сахарозе или любому другому связующему, известному для фармацевтических препаратов в данной области. Дополнительно также могут быть включены стабилизирующие агенты для увеличения срока годности лекарственного средства Предпочтительно, к использованию предоставляются готовые инфузионные растворы. В ином случае,препарат может быть сделан в виде порошка, который прямо перед использованием растворяется в подходящих водных растворах. Количество фармацевтического препарата изобретения, который будет эффективным в лечении определенных нарушений или состояний, будет зависеть от природы нарушения или состояния и может определяться стандартными клиническими методами. Кроме того, чтобы помочь определить оптимальный диапазон дозировки, дополнительно могут быть сделаны in vitro анализы. Используемая в рецептуре точная дозировка также будет зависеть от способа введения, серьезности заболевания или нарушения и должна определяться по усмотрению лечащего врача и в соответствии с состоянием каждого пациента. Однако подходящие диапазоны дозировки для введения составляют как правило вплоть до 8 logs (1045106 БОЕ) вирусов с ограниченным репликативным потенциалом и могут вводиться либо однократно,либо многократно с необходимым интервалом. Фармацевтические препараты настоящего изобретения, содержащие 104-5106 БОЕ аттенуированных вирусов с ограниченным репликативным потенциалом, могут быть введены интранозально, интратрахеально, внутримышечно или подкожно. Эффективные дозировки могут быть экстраполированы из кривой зависимости "доза-эффект", полученной из in vitro систем или животных модельных тест систем. Термин "вакцина" является в изобретении препаратом, который при введении его пациенту может активировать защитный иммунитет к РНК-содержащим вирусам. Термин относится к препаратам, содержащим вирус, инактивированный вирус, аттенуированный вирус, расщепленный вирус или вирусный белок, подобный клеточному антигену, которые могут быть использованы для индукции защитного иммунитета у пациента. Вакцины применяются в защитной дозировке, являющейся количеством вакцины,или отдельно или в комбинации с одним или более известными повышающими иммуногенность адъювантами, которого достаточно, чтобы вызвать защитный иммунный ответ. Более полное понимание вышеописанному дает ссылка на следующие примеры. Эти примеры являются, однако, лишь вариантами способов применения одного или более воплощений настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничение сферы применения изобретения. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Пример 1. Образование линейного конструкта для экспрессии H3N2 НА. НА-сегмент вируса гриппа A H3N2, полученного из культуры клеток Vero, был амплифицирован с помощью олигонуклеотидов Р 1 и Р 2 (F1 на фиг. 1 а). Последовательно, два фрагмента ДНК (F2 и F3 на фиг. 1), полученные из pHW2000 (Hoffmann et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97:6108-13), были сшиты с НА-продуктом ПЦР с помощью перекрывающейся ПЦР (см. фиг. 1b). Первый линейный фрагмент (F2) содержит CMV-промотор и polI-терминатор, второй фрагмент (F3) содержит человеческий polIпромотор и сигнал полиаденилирования БГР (бычьего гормона роста). Для облегчения образования продуктов перекрывающейся ПЦР, олигонуклеотиды, использованные для аплификации НА, были удлинены на их 5' концах так, чтобы Р 1 содержал последовательность комплементарную polI-терминатору, а Р 2 содержал последовательность комплементарную polI-промотору (см фиг. 1 а). Подобным образом, праймеры Р 3 и Р 5, использованные для образования фрагментов F1 и F2, были удлинены на их 5' концах так,чтобы они содержали последовательности комплиментарные 5' и 3' концам НА (см. фиг. 1 а). ФрагментыF2 и F3 содержат защитные последовательности, полученные из последовательности остова pHW2000. Эти последовательности не вовлечены прямо в транскрипцию мРНК и вирусной РНК, но при этом уменьшают деградацию экзонуклеазами двунаправленной экспрессирующей кассеты. Вирусная РНК была экстрагирована из вируса гриппа A H3N2, полученного из культуры клетокVero, с помощью набора ViralAmp фирмы Qiagen и обратно транскрибирована с помощью олигонуклеотида UnM2, как описано ранее (Hoffmann et al. 2001, Arch Virol. 146:2275-89). НА-сегмент был амплифицирован с помощью олигонуклеотидов, показанных в табл. 1 смесью ДНК полимераз Pfu Turbo и Taq: Таблица 1 Нуклеотиды, соответствующие последовательности Н 3, выделены жирным курсивом; нуклеотиды,гомологичные polI-терминатору (Р 1) и polI-промотору (Р 2), показаны стандартными заглавными буквами. Продукт ПЦР НА F4 был очищен с помощью набора для очистки продуктов ПЦР Qiaquick (Qiagen). Фрагменты ПЦР F2 и F3 были амплифицированы из ДНК плазмиды pHW2000 парами праймеров Р 3+Р 4-7 017456 и Р 5+Р 6 (см табл. 2 и фиг 1 а), соответственно, с помощью смес b ДНК полимераз Pfu Turbo и Taq Продукты ПЦР F2 и F3 были очищены с помощью набора для очистки продуктов ПЦР Qiaquick (Qiagen). Таблица 2 В Р 3 и Р 5 нуклеотиды, соответствующие последовательности Н 3, показаны жирным курсивом, нуклеотиды, комплементарные pHW2000, показаны стандартными заглавными буквами. В Р 4 и Р 6 все нуклеотиды, за исключением четырх нуклеотидов на 5' концах, соответствуют pHW2000. Для получения полноразмерного продукта ПЦР (F4), содержащего НА, CMV-промотор, polIтерминатор, polI-промотор и сигнал полиаденилирования БГР, фрагменты F1, F2 и F3 были сшиты и амплифицированы перекрывающейся ПЦР праймерами Р 4 и Р 6 с помощью смеси ДНК полимераз PfuTurbo и Taq. На фиг. 1 показана схематическая диаграмма получения линейных двунаправленных экспрессирующих конструктов. На фиг. 1 а) схематически показаны фрагменты F1, F2 и F3, полученные отдельно амплификацией с помощью ПЦР. Фрагмент F1 содержит соответствующий вирусный сегмент и содержит удлиняющие сегменты,комплементарные polI-промотору и polI-терминатору. Фрагмент F2 содержит CMV-промотор и polIтерминатор, а также удлиняющий сегмент, комплементарный соответствующему вирусному сегменту. Фрагмент F3 содержит polI-промотор и сигнал полиаденилирования БГР, а также удлиняющий сегмент,комплементарный соответствующему вирусному сегменту. Олигонуклеотиды Р 1 и Р 2, использованные для амплификации фрагментов F1 с помощью ПЦР, являются комплементарными соответствующему вирусному сегменту. Р 1 содержит удлиняющий сегмент на 5' конце, комплементарный polI-терминатору,Р 2 содержит удлиняющий сегмент на 5' конце, комплементарный polI-промотору. Для ПЦР-амплификации фрагментов F2 использовались олигонуклеотиды Р 3 и Р 4, с Р 3, содержащим на 5' конце удлиняющий сегмент, комплементарный соответствующему вирусному сегменту. Для ПЦР-амплификации фрагмента F3 использовались олигонуклеотиды Р 5 и Р 6, с Р 5, содержащим на 5' конце удлиняющий сегмент, комплементарный соответствующему вирусному сегменту. Защитные последовательности получены из остова pHW2000 и не содержат последовательностей прямо вовлеченных в транскрипцию мРНК или вирусной РНК. Пример 2. Высвобождение вируса гриппа А с помощью линейного конструкта для экспрессии НА. 6 изолятов вируса гриппа A H3N2 были выращены в MDCK клетках. Сегмент НА был амплифицирован ПЦР (F1 на фиг. 1) и очищен электрофорезом в агарозном геле с помощью набора Qiaex Il(Qiagen). Фрагменты F2 и F3 были сшиты в F1, как описано в примере 1, для получения полноразмерного экспрессирующего конструкта F4. После очистки с помощью электрофореза в агарозном геле фрагментыF4 были реамплифицированы ПЦР для получения достаточных для трансфекции количеств ДНК. В результате, фрагмент ДНК F4 НА был использован вместе с набором из семи плазмид (на основеpHW2000), содержащих оставшиеся сегменты штамма delNSI вируса гриппа A H1N1, адаптированного для высвобождения вируса из клеток Vero. Фиг. 1b. Показан фрагмент F4, созданный перекрывающейся ПЦР с помощью олигонуклеотидов Р 4 и Р 6. Создание ДНК фрагмента F4 НА было проведено подобно процедуре описанной в примере 1. Для каждого вирусного изолята было очищено ДНК F4 НА в количестве 10-20 мкг, вначале с помощью набора Qiaquick kit (Qiagen), а затем с помощью набора Qiagen Endofree Plasmid kit. Когда продукты ПЦР очищались только в один этап набором для очистки продуктов ПЦР(Qiaquick, Qiagen), наблюдалась высокая токсичность трансфекции на клетки Vero, мешающая высвобождению вируса. Клетки Vero культивировались при 37 С в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% добавки Glutamax-I. Для получения вируса семь созданных производных опубликованной последовательностиpHW2000 (Hoffmann et al., см. выше), содержащих сегменты PA, PB1, РВ 2, NA, M, NP и delNSI, полученные из GHB01, а также плазмида для экспрессии белка вируса гриппа A PR8 NS1 (PCAGGS-NSI(SAM) (Salvatore et al. 2002, J Virol. 76:1206-12, были котрансфецированы вместе с соответствующим фрагментом ДНК F4 НА в клетки Vero. После трансфекции, для поддержки репликации вируса, клеткиVero культивировались в бессывороточной среде (Opti-Pro; Invitrogen) в присутствии трипсина в концентрации 5 мкг/мл. Через три-четыре дня после трансфекции наблюдался 50-100-процентный цитопатоген-8 017456 ный эффект (ЦПЭ), и свободный вирус был заморожен или далее амплифицирован в клетках Vero. Таким образом, высвобождение вируса гриппа А при замене одной двунаправленной экспрессирующей плазмиды на линейный продукт ПЦР оказалось осуществимым. Пример 3. Высвобождение вируса гриппа только с помощью линейных экспрессирующих конструктов. Восемь линейных экспрессирующих конструктов (F4) адаптированого для клеток Vero вируса гриппа A H1N1 delNSI (GHB01) были созданы амплификацией ПЦР. Восемь производных pHW2000,содержащих сегменты GHB01, послужили матрицами для ПЦР. Достаточные количества фрагментов F4 были созданы для каждого сегмента и последовательно использованы для высвобождения вируса из клеток Vero. Был создан фрагмент ДНК F4 для каждого из восьми сегментов путем прямой амплификации ПЦР каждой полной двунаправленной экспрессирующей кассеты, содержащей соответствующий сегмент вируса гриппа, из соответствующей матрицы - производного pHW2000. Амплификация ПЦР была выполнена олигонуклеотидами Р 4 и Р 6 (см. табл. 6) с помощью смеси ДНК полимераз Pfu Turbo и Taq. Таблица 3 Для каждого сегмента были созданы и очищены достаточные количества продукта ПЦР F4 (10-20 мкг), вначале с помощью набора Qiaquick kit (Qiagen), а затем с помощью набора Qiagen Endofree Plasmidkit. Клетки Vero были трансфецированы равными количествами каждой из восьми ДНК фрагментов F4 и экспрессирующей NS1 плазмиды pCAGGS-NS 1 (SAM). После трансфекции, для поддержки репликации вируса, клетки Vero культивировались в бессывороточной среде (Opti-Pro; Invitrogen) в присутствии трипсина в концентрации 5 мкг/мл. Полный цитопатогенный эффект (ЦПЭ) наблюдался через четыре дня после трансфекции. Таким образом, высвобождение вируса только из линейных двунаправленных конструктов для экспрессии вируса гриппа А оказалось осуществимым. В отличие от WO 00/56914 оба используемых для амплификации вирусных сегментов олигонуклеотида были разработаны содержащими комплементарность к F2 и F3. В силу этого, длина перекрывающихся участков между F1 и F2, так же как и между F1 и F3 увеличилась, что должно облегчать второй этап ПЦР, в котором F1 сливается с F2 и F3. Коммерческие наборы для очистки продуктов ПЦР (например, фирмы Qiagen) обычно основываются на связывании ДНК к мембранам из окиси кремния при высоких концентрациях солей. Фрагменты ПЦР, очищенные набором для очистки продуктов ПЦР "Qiagen PCR purification kit", демонстрируют высокую токсичность при трансфекции в клетки Vero, что мешает высвобождению вируса. Если продукты ПЦР очищаются вторым этапом очистки с помощью набора для очистки плазмид фирмы Qiagen (например, с помощью набора Qiagen Endofree plasmid kit), основанном на использовании анионообменной смолы, то продукты ПЦР оказываются достаточно чистыми, что помогает высвобождению вируса. В отличие от WO 00/56914 в настоящем изобретении смесь Taq полимеразы и высокоточной полимеразы (например, Pfu полимеразы) используется для всех этапов амплификации ПЦР. Таким образом, полученные с помощью ПЦР мутации могут быть сведены к минимуму. Более того, это избавляет от необходимости инкорпорирования дополнительных тимидиновых остатков в F2 и F3 (F1 и F2 описаны вWO 00/56914, фиг. 2, параграф 0021 и 0022). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Линейный экспрессирующий конструкт, не содержащий никаких последовательностей для амплификации и/или селекции, который содержит промотор РНК-полимеразы I (polI) и сигнал терминацииpolI, вставленные между промотором РНК-полимеразы II (polII) и сигналом полиаденилирования. 2. Линейный экспрессирующий конструкт по п.1, содержащий дополнительные защитные последовательности на N- и/или С-концах конструкта. 3. Линейный экспрессирующий конструкт по любому из пп.1 или 2, в котором защитные последовательности могут быть любыми последовательностями, не вовлеченными прямо в транскрипцию вирусной РНК. 4. Линейный экспрессирующий конструкт по любому из пп.1-3, содержащий по меньшей мере один сегмент вирусного гена, вставленный между polI-промотором и polI-терминатором. 5. Линейный экспрессирующий конструкт по п.4, в котором вирусный сегмент происходит из вируса гриппа типов А, В или С. 6. Линейный экспрессирующий конструкт по любому из пп.4 или 5, в котором сегмент вирусного гена выбирается из группы, состоящей из генных сегментов PA, PB1, РВ 2, НА, NA, NP, M, NS или их части вируса гриппа.-9 017456 7. Линейный экспрессирующий конструкт по любому из пп.4-6, в котором сегмент вирусного генаNS экспрессирует нефункциональный белок NS1. 8. Линейный экспрессирующий конструкт по любому из пп.4-7, в котором вирусный генный сегмент является кДНК-копией или продуктом амплификации ОТ-ПЦР вышеупомянутого сегмента. 9. Набор линейных экспрессирующих конструктов, содержащий по меньшей мере два экспрессирующих конструкта, по пп.1-8. 10. Набор из восьми линейных экспрессирующих конструктов по п.9, каждый из которых содержит по меньшей мере один вирусный генный сегмент PA, PB1, РВ 2, НА, NA, NP, M и NS или их часть вируса гриппа. 11. Клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере один линейный экспрессирующий конструкт по любому из пп.1-8. 12. Способ получения линейного экспрессирующего конструкта по любому из пп.1-8, в котором первый фрагмент ДНК, содержащий вирусный сегмент, вставленный между последовательностью,гомологичной polI-промотору, и последовательностью, гомологичной polI-терминатору,второй фрагмент ДНК, содержащий в следующем порядке защитную последовательность, последовательность сигнала полиаденилирования, последовательность polI-промотора и перекрывающуюся последовательность по меньшей мере из 12 нуклеотидов, комплементарных вирусному сегменту, и третий фрагмент ДНК, содержащий в следующем порядке защитную последовательность, CMVпромотор, последовательность polI-терминатора и перекрывающуюся последовательность по меньшей мере из 12 нуклеотидов, комплементарных вирусной последовательности,сшиты вместе с помощью перекрывающейся ПЦР и очищены. 13. Способ получения содержащего РНК с негативной цепью вириона, включающий культивирование клетки-хозяина из п.11 в условиях, которые позволяют получение вирусных белков, вирусной РНК или кРНК. 14. Способ для генерации частиц вируса гриппа, в котором по меньшей мере один линейный экспрессирующий конструкт трансфицируется напрямую в животные клетки-хозяева и в котором вышеупомянутые клетки-хозяева культивируются в условиях, в которых экспрессируется вирус гриппа, а вирусные частицы собираются и очищаются. 15. Способ по любому из пп.12 или 13, содержащий по меньшей мере два этапа очистки. 16. Способ по любому из пп.12-14, в котором вышеупомянутые вирусные частицы смешиваются,при необходимости, после аттенуирования или инактивации с фармацевтически приемлемым носителем,с получением фармацевтической композиции. 17. Применение вирусных частиц, полученных с помощью экспрессирующего конструкта по любому из пп.1-8, для производства лекарственного средства для терапевтического или профилактического лечения инфекционных заболеваний. 18. Способ вакцинирования пациентов против инфекции РНК-содержащими вирусами с негативной цепью, включающий введение пациенту интраназально или парентерально защитной дозировки фармацевтической композиции, содержащей частицы вируса гриппа, полученные способом по п.14.