Новые пептиды – аналоги гормона высвобождения гормона роста человека

007841 Область применения настоящего изобретения Настоящее изобретение касается новых пептидов - аналогов гормона высвобождения гормона роста человека, процесса получения этих пептидов, а также их терапевтического использования. Предпосылки настоящего изобретения Высвобождение и синтез гормона роста человека (GH, соматотропина) находятся под постоянным контролем двух взаимно антагонистических гормонов гипоталамуса - гормона, подавляющего высвобождение гормона роста (GIH, соматостатина) и гормона высвобождения гормона роста человека. Лечение на основе введения гормона высвобождения гормона роста человека (hGH-RH) можно использовать для большинства пациентов с нехваткой гормона роста человека. Было установлено, что самым коротким фрагментом, целиком сохраняющим биологическую активность эндогенного hGH-RH, содержащего 44 аминокислотных остатка, является N-концевой аналог hGH-RH (1-29)-NH2. Этот пептид - hGH-RH (l-29)NH2 можно получить синтетически; синтетический GH-RH (l-29)-NH2 (под наименованием ацетат серморелина) одобрен для использования при лечении малорослых детей, также исследуется его применение для лечения нарушений нейросекреции, в качестве адъюванта для овуляции, индуцированной гонадотропином у бесплодных женщин, а также для лечения связанных со СПИДом катаболических нарушений. Однако было обнаружено, что hGH-RH (l-29)-NH2 сравнительно нестоек к ферментному расщеплению. Основные выявленные метаболиты характеризуют расщепление связи между Arg11-Lys12 и Lys12 Val13, вызванное трипсиноподобными ферментами (L.A. Frohman, T.R. Downs, E.P. Heimer, A.M. Felix J.Clin. Invest. 1989, 83, 1533-1540). Недавно установили, что при расщеплении трипсином аналога hGH-RH(1-29)-NH2, гидролиз пептидных связей во всех основных аминокислотных остатках, включая Сконцевую аминную связь, происходит у сайтов карбоксильных групп; в то же время у аналога, отличающегося тем, что вместо остатков Lys присутствуют остатки Orn, гидролизуются только связи, соседствующие с остатком Arg (Е. Witkowska, A. Orlowska, В. Sagan, M. Smoluch, J. Izdebski J. Peptide Sci. 2000,6 (Suppl.), 189; E. Witkowska, A. Orlowska, B. Sagan, M. Smoluch, J. Izdebski J. Peptide Sci. 2001, 7, 166172). Этот факт согласуется с необычайно высокой in vivo активностью аналогов, в которых Orn находится на позициях 12 и 21 (J. Izdebski, J. Pinski, J.E. Horwath, G. Halmos, K. Groot, A.V. Schally, Proc. NatlAcad. Sci. USA, 1995, 92, 4872-4876). Делались попытки решить проблему нестабильности hGH-RH (1-29)-NH2 путем замещения Arg, находящегося на 29 позиции аминокислотной последовательности, на Agm (4-гуанидилбутиламин) (Bajuszet al., in Peptides 1982, Blaha and Melon, Eds.; W. De Gruyter, Berlin-New York, pp. 643-647), или путем замещения Tyr на 1 позиции на Dat (дезаминотирозин), a Lys на 12 позиции на D-Lys, Arg или Orn (Международные заявки на патентыWO 94/11396 and WO 94/11397). Однако результаты этих попыток были неудовлетворительны, а все еще сохраняется необходимость аналогов, которые сочетают в себе увеличенную способность высвобождать гормон роста с повышенной стойкостью к ферментному расщеплению; эти параметры должны позволить снизить дозы лекарственных средств и/или сделать их введение менее частым. Краткое описание настоящего изобретения Заявителями было установлено, что введение в аналог гормона высвобождения гормона роста человека отобранных аминокислот не только создает аналог с более высокой биологической активностью и большей способностью высвобождать гормон роста, но оказывает также благотворное влияние на стойкость пептидов в отношении ферментов. Отобранные аминокислоты включают D-Arg на позиции 29, а также аминокислоты, содержащие в своей боковой цепи гуанидиновую группу, на тех позициях, которые в природных пептидах занимают Lys или Arg. Согласно настоящему изобретению новые пептиды - аналоги гормона высвобождения гормона роста человека имеют последовательность аминокислот следующей формулы (I):R29 представляет собой D-Arg, hArg, Gab или Gap. Новые пептиды являются мощными и селективными стимуляторами высвобождения гормона роста,а также обладают высокой стойкостью по отношению к воздействию ферментов. Новые пептиды или их фармацевтически приемлемые соли можно вводить пациенту или в чистом виде, или в качестве активного ингредиента фармацевтических препаратов. Таким образом, настоящее изобретение касается также фармацевтического препарата, содержащего по крайней мере один из новых пептидных аналогов гормона высвобождения гормона роста человека,имеющих последовательность аминокислот формулы (I):R29 представляет собой D-Arg, hArg, Gab или Gap; или его фармацевтически приемлемую соль, и по крайней мере один носитель и/или наполнитель. Новые пептиды полезны для предупреждения и лечения нарушений, связанных с нехваткой hGH-RH. Настоящее изобретение обеспечивает также способ лечения состояний, связанных с нехваткой гормона роста, включающий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективной дозы пептида - аналога hGH-RH формулы (I), в которой R11, R12, R20, R21 и R29 имеют указанные выше значения. Подробное описание настоящего изобретения Новые пептиды - аналоги гормона высвобождения гормона роста человека, имеют последовательность аминокислот формулы (I)R29 представляет собой D-Arg, hArg, Gab или Gap. Предпочтительные пептиды настоящего изобретения включают:(8) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-Gap-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-Gap-NH2. Пептидами, особенно предпочтительными по своей биологической активности и устойчивости к действию пищеварительных ферментов, являются:Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg20-Orn-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg29-NH2. Новые пептиды полезны для предупреждения и лечения нарушений, связанных с действием гормона высвобождения гормона роста человека, и поэтому их можно применять для лечения малорослости детей, нарушений у лиц пожилого возраста, в целях увеличения массы тела и содержания минеральной составляющей костей, в целях заживления ран, для лечения ожогов кожи и переломов костей; а также в качестве нестероидного анаболика в случае слабости при хронических заболеваниях и в целях диагностики. Согласно способу по настоящему изобретению при лечении нарушений, связанных с действием гормона высвобождения гормона роста человека, нуждающемуся в такого рода терапии пациенту вводят терапевтически эффективное количество пептида, представляющего собой аналог hGH-RH и имеющий последовательность аминокислот формулы (1). Дозировки и режим введения, которые может установить специалист на основе известных терапевтических и профилактических способов лечения нехватки гормона высвобождения гормона роста, определяются конкретным нарушением, возрастом пациента, его массой и состоянием. При лечении наруше-2 007841 ний такого рода единичная доза обычно составляет от 0,01 до 2 мг на 1 кг массы тела. Дневную дозу можно вводить в виде одной или нескольких дозировочных единиц, исключение составляют такие формы с контролируемым высвобождением, как депо или имплантанты. Формы с контролируемым высвобождением вводят каждые 15 или 30 дней, или каждые три месяца. Пептиды по настоящему изобретению обычно вводят пациенту в любой пригодной фармацевтической форме и любым приемлемым способом типа внутривенного, подкожного, внутримышечного,орального введения, интраназальной или пульмонарной ингаляции. Новые пептиды можно вводить в чистом виде или, необязательно, в сочетании с другими терапевтическими средствами, используемыми при лечении нарушений, связанных с нехваткой гормона высвобождения гормона роста, при условии, что они не оказывают друг на друга негативного воздействия. Такие соединения можно вводить одновременно, как единый препарат, или как разные препараты, или один после другого в том порядке и через такие интервалы, которые определяются специалистом. Медики-профессионалы обязаны знать, какие лекарственные средства и их сочетания следует выбрать. Фармацевтические средства по настоящему изобретению содержат по крайней мере одно активное вещество, представляющее собой пептид, являющийся аналогом hGH-RH и имеющий последовательность аминокислот формулы (I), или его фармацевтически приемлемую соль, а также по крайней мере один носитель и/или наполнитель. Фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут быть получены в любых фармацевтических формах, которые хорошо известны квалифицированным в этой области людям (например,из издания Remmington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, 1990). Фармацевтические препараты, пригодные для инъекций и инфузий, включают стерильные водные,водно-органические и неводные растворы, суспензии, сухие вещества и таблетки для получения растворов, а также имплантанты. В суспензионных препаратах для того, чтобы гарантировать равномерное распределение активного ингредиента в жидкой фазе, используют носители, и они включают в себя: полисорбаты, лецитин, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, пептизаторы, типа фосфоранов, полифосфоранов и цитратов водорастворимых полимеров таких, как карбоксиметилцеллюлоза,метилцеллюлоза, поливинилпирролидон, смолы или желатин. Препараты для инъекций могут содержать фармацевтически приемлемые носители или наполнители, такие как регуляторы рН, буферы, тонизирующие средства и консерванты. Сухие вещества используются для приготовления растворов или суспензий путем их растворения подходящим растворителем. Для удобства пациента, а также для достижения требуемых характеристик высвобождения вещества производные пептида удобно вводить в виде инъекционных препаратов пролонгированного действия с контролируемым высвобождением (типа кристаллических полимерных микрокапсул, содержащих активнодействующее вещество). Другим примером препарата с задержкой высвобождения во времени является имплантант на основе полимера, полученный растворением биологически разлагаемого полимера и пептидов по настоящему изобретению в смешиваемом с водой растворителе с образованием жидкой композиции. При инъекции этот полимер образует депо, из которого указанное активное вещество медленно высвобождается. Фармацевтические формы, пригодные для орального введения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, большие таблетки или капсулы, содержащие фармацевтически приемлемые твердые носители, такие как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, водный силикат магния, стеариновая кислота, стеарат магния, бифосфат кальция, или смолы. Таблетки или гранулы могут иметь покрытия или они могут быть обработаны иным способом, гарантирующим единичной дозе предпочтительную отсрочку времени высвобождения. Для формирования таких защитных слоев или покрытий можно использовать ряд различных веществ, которые содержат полимерные кислоты, а также смеси полимерных кислот с другими веществами, такими как шеллак, цетиловый спирт или ацетат целлюлозы. Фармацевтический препарат, содержащий в качестве активного вещества пептид, также может находиться в формах, пригодных для введения (типа аэрозолей или порошков для ингаляции). Типичный аэрозольный препарат, помимо водного раствора активного вещества, может содержать: буферы, изотонические вещества, консерванты, и, необязательно, другие наполнители, допускающие введение активного вещества дозирующим спреем или капельницей. Новые пептиды по настоящему изобретению можно получить с помощью одного из известных методов химического синтеза, типа классического синтеза в растворе или твердофазного синтеза. При синтезе в растворе надлежащим образом защищенные концевые N-аминопроизводные аминокислот с защищенными боковыми цепями (если присутствуют реакционноспособные боковые цепи) или пептидные фрагменты конденсируют с соответствующим образом защищенными карбоксильными производными аминокислот или пептидных фрагментов. Обычно -амино функцию защищают в форме уретана, типа кислотнолабильной трет-бутилоксикарбонильной группы (Воc), бензилоксикарбонильной группы (Z, CBz), или их замещенных аналогов; или в форме защитной 9-фторенилметоксикарбонильной группы (Fmoc), которая лабильна в основных условиях. Карбоксильные функцию могут быть защищены в виде сложных эфиров, например метилового эфира, нестабильного в присутствии нуклеофильных ос-3 007841 нований, трет-бутилового эфира, нестабильного в кислотной среде, или бензилового эфира, который нестабилен при гидрогенных условиях. Карбоксильные группы в защищенных структурах активируют азидным способом, методом смешанных ангидридов, методом активированных сложных эфиров, методами фосфониевых или уроновых солей, или с помощью карбодиимидного способа, используя соединения, которые катализируют реакцию, не вызывая рацемизации (типа N-гидроксисукцинимида, 1 гидроксибензотриазола, 1-гидрокси-7-азабензотриазола или 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3 бензотриазина). Обзор способов конденсации, а также защитных группы, обычно используемых в химии пептидов, приведен в работах: Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, vol.3, E.Gross, J. Meienhofer, Eds.(Academic Press, New York, 1981); Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition (Wiley, New York,1991). В твердофазном синтезе пептидов, предложенном Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149), используют нерастворимую в реакционной среде полимерную подложку, содержащую функциональную группу, к которой может быть присоединена первая аминокислота. Такая полимерная матрица служит как перманентная С-концевая защитная группа. Синтез начинается прикреплением к линкеру первой Nзащищенной аминокислоты. После снятия защиты с аминной функции дополнительно вводят другую активированную защищенную аминокислоту. Удлинение цепи осуществляется последовательными стадиями снятия защиты и связывания. По окончании чистый N-концевой пептид отделяют от смолы, при этом снимается защита с боковых функциональных групп цепи. Нерастворимая подложка легко отфильтровывается от раствора пептида. Полимерами, пригодными в качестве подложки, являются целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметакрилаты, хлорметилированный сополимер дивинилбензола и полистирола, 4-метилбензгидриламиновая смола (МВНА смола), бензгидриламиновая смола (ВНА) и им подобные. Синтез пептидов на полимерной подложке проводят в растворителях, растворяющих используемые производные аминокислот, а также являющихся нейтральными в условиях реакции. Предпочтительны растворители, которые также имеют хорошие характеристики по набуханию, такие как диметилформамид, дихлорметан, N-метилпирролидон, ацетонитрил, диметилсульфоксид, а также их смеси. После того как аминокислота отделена от полимерной подложки, ее очищают, для этого используют, например,жидкостную хроматографию высокого разрешения (ВРЖХ). Новые пептиды - аналоги GH-RH по настоящему изобретению, содержащие в боковых аминокислотных цепях группу гуанидина, предпочтительно получают методом твердофазного синтеза. Он осуществляется: введением подходящих заместителей лизина, 2,4-диаминомасляной кислоты или 2,3 диаминопропионовой кислоты на соответствующие позиции в пептидной цепи, присоединенной к полимерной подложке, снятием защиты с боковых аминогрупп и взаимодействием свободных амино-групп с гуанидирующим агентом, удалением всех остальных защитных трет-бутилоксикарбонильных групп, а также отделением синтезированного пептида от подложки с последующей его очисткой и необязательным превращением указанного пептида в фармацевтически приемлемую соль. Реакцию гуанидирования проводят с использованием избытка гуанидирующего агента (типа N,N'бис(третбутилоксикарбонил)-S-метилизотиомочевины) в присутствии промотора реакции, такого как 4(диметиламино)пиридин. Для достижения высокой степени чистоты, требуемой для фармацевтических нужд, синтезированные пептиды очищают, предпочтительно методом жидкостной хроматографии высокого разрешения(ВРЖХ). Новые пептиды могут быть выделены из реакционной смеси в виде фармацевтически приемлемых солей различных неорганических и органических кислот и оснований. Новые пептиды могут образовывать фармацевтически приемлемые соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота,бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, или с органическими кислотами, типа уксусной, пропионовой, малеиновой, фумаровой, малоновой, янтарной, винной, лимонной, аскорбиновой, яблочной, щавелевой, коричной, бензойной, метансульфоновой, этансульфоновой, п-толуолсульфоновой кислоты, а также с другими кислотами. Эти соли также могут быть получены взаимодействием карбоксильных групп пептида с щелочными металлами, гидроксидами и алканоатами щелочных металлов, а также с органическими основаниями типа триметиламина, диэтиламина, этаноламина, пиперидина, холина и т.п. Соли могут быть получены известными способами путем взаимодействия вещества в виде свободного основания или кислоты с одним или более эквивалентами соответствующего основания или кислоты; реакция протекает в растворителе, или в среде, в которой указанные соли нерастворимы. Предпочтительным вариантом настоящего изобретения являются уксуснокислые соли новых пептидов - аналогов hGH-RH. Определение биологической активности Для анализа биологической активности новых пептидов по настоящему изобретению исследовали их влияние на уровень плазмы гормона роста и других питуарных гормонов крыс, а также провели сравнение этого влияния с воздействием hGH-RH (l-29)-NH2, используемым в качестве эталона. Исследуемыми веществами были hGH-RH (l-29)-NH2, полученный от Sigma Chemical Co., а также пептиды - аналоги hGH-RH, синтезированные по процессу по настоящему изобретению.-4 007841 Мужские особи крыс Wistar (240-260 г) содержались при регулируемом световом режиме (14 ч при освещении, 10 ч в темноте) и неограниченном обеспечении питанием и водой. Животных случайным образом распределили по экспериментальным группам, они получали физиологический раствор (0,9%NaCl; 0,3 мл), hGH-RH (l-29)-NH2 в дозе 50 или 150 мкг/кг массы тела, а также пептид по настоящему изобретению в дозе 1 или 3 мкг/кг массы тела. Подкожно крысам делали одну инъекцию эталонного пептида или каждого из испытанных новых аналогов, растворенных в 0,3 мл физиологического раствора. В день эксперимента крысам сделали анестезию внутрибрюшинной инъекцией кетамина (120 мг/кг), а для сбора крови югулярную вену постоянно канюлировали. Спустя 30 мин испытуемым животным сделали подкожную инъекцию. Контрольной группе крыс делали инъекцию только физиологическим раствором. Кровь отбирали из югулярной вены испытуемых животных за 1 мин до проведения подкожной инъекции исследуемого вещества (образец 0) и спустя 15 и 30 мин после этого. При каждом отборе производилось замещение эквивалентным объемом гепаризированного физиологического раствора (10 Международных единиц/мл). По окончании эксперимента животных умерщвляли анестезирующей передозировкой кетамина. Образцы крови отцентрифугировали, а образцы плазмы (приблизительно 0,3 мл) отделили и сохраняли при -20 С вплоть до проведения исследования методами радиоиммунологического анализа. В 0,05 мл образцах аликвоты плазмы определяли концентрации гормона роста (GH), пролактина(PRL), лютеинизирующего гормона (LH), фолликулостимулирующего гормона (фоллитропина) (FSH) и тиротропина (TSH); для этого применяли наборы, предоставленные Biotrak (American Life Science, England). Чувствительность определения у крыс составляла соответственно 0,16 0,08, 0,08, 0,09 и 0,05 нг/канюлю. Статистический анализ был проведен с помощью Statsoft Statistica PL for Windows. Вначале проверяли критерий нормальности по тесту Колмогорова-Смирнова и Shapir-Wilka. Статистические различия между группами определялись методом анализа вариантов ANOVA. Для сравнения использовали многостадийный критерий размаха выборки Duncan. Однако, если обнаруживалось, что отклонения существенно разнородны, то сравнения между группами проводили непараметрическим анализом дисперсии рангов Kruskal-Wallis. Отдельные различия уровней гормона оценивали их коррекцией, вычисляя результирующую концентрацию гормона для каждой из крыс. Результирующую концентрацию каждого гормона вычисляли в виде разности концентрации этого гормона спустя 15 мин после инъекции соединения и концентрации перед инъекцией соединения (15-0), а также в виде разности концентраций указанного гормона спустя 15 мин и 30 мин после инъекции (15-30). Влияние соединений на высвобождение гормона роста определяли, сравнивая среднее значение результирующей концентрации гормона роста (15-0) после инъекции hGH-RH (l-29)-NH2 в дозах 50,0 мкг и 150,0 мкг на кг массы тела, а также инъекции 1,0 и 3,0 мкг аналогов на 1 кг массы тела. Результаты,полученные для выбранного соединения (1), приведены в табл. 1 и 2. Существенную разницу между исследуемыми группами определяли с помощью Lillitor модификации теста Kruskal-Wallis. Таблица 1. Влияние подкожного введения пептидов hGH-RH и их аналогов на высвобождение гормона роста у мужских особей крыс Результаты приведены как среднее значениеSEM Р 0,01 от эталона - физиологического раствораР 0,01 от эталона - физиологического раствора-5 007841 Таблица 2. Изменение концентрации гормона роста после подкожного введения аналогов hGH-RH Приведенные результаты выражены как среднее значение изменений гормона роста (нг/мл). Изменения в плазме гормона роста (GH) выражаются в виде результирующей концентрации гормона роста и ее вычисляли для каждой из крыс. Величину (15-0) вычисляли в виде разности концентрации гормона роста спустя 15 мин после инъекции соединения и концентрации этого гормона перед инъекцией соединения (0 мин). Величину (15-30) вычисляли в виде разности концентраций указанного гормона спустя 15 мин и 30 мин после инъекции исследуемого соединения.Р 0,01 от эталона - физиологического раствора Полученные результаты показывают, что проанализированные аналоги hGH-RH обладают стимулирующим воздействием на высвобождение гормона роста крыс по сравнению с эталонным физиологическим раствором. Самое сильное стимулирующее воздействие продемонстрировало соединение, обозначенное (1). Максимальный стимулирующий эффект наблюдался спустя 15 мин после момента введения. Это эффект наблюдался в течение 30 мин после введения. Влияние соединения (1) на результирующую концентрацию гормона роста сравнивали с результирующей концентрацией этого гормона спустя 15 мин после введения hGH-RH (l-29)-NH2, доза которого была в 50 раз более высокой. Относительная эффективность соединения (1) базируется на дозах в 1,0 мкг и 3,0 мкг, а также на 50 и 150 мкг дозахhGH-RH (l-29)-NH2 на 1 кг массы тела. Относительная эффективность этого нового аналога спустя 15 мин после инъекции была соответственно в 70 и 38 раз выше, чем hGH-RH (1-29)-NH2. В ходе исследования было также установлено, что новые соединения по настоящему изобретению действуют избирательно, и что на концентрацию в периферической крови крыс других питуитарных гормонов - пролактина, литропина, фоллитропина и тиреотропина они не оказывают никакого влияния. В тесте с трипсином изучалась также ферментативная устойчивость полученных соединений. Образец пептида (1,2 мг) растворили в буфере, имеющем рН 8,5 (2,9 мл, 0,05 М раствор ацетата аммония) и в течение 20 мин инкубировали при 37 С. Потом добавили раствор трипсина (100 мкл, 0,02 мг/мл, Serva, 36 Международных единиц/мг). Полученный раствор инкубировали при 37 С в течение 60 мин. Извлекли аликвоту (500 мкл), разбавили ее 0,5 М уксусной кислотой (1 мл), а потом подвергли лиофилизации. Полученное вещество проанализировали методом ВРЖХ, применяя для этого системуKnauer с колонкой Eurospher 100 C18 (4,6x250 мм, 5 мк). Использовали следующие системы растворителей: А - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в воде, В - 80% раствор ацетонитрила в А; линейный градиент 25-70% В; скорость прохождения 1 мл/мин, выявление проводили при 220 нм. Результаты расщепления пептидов приведены в табл. 3.-6 007841 Таблица 3. Расщепление трипсином аналогов RH-GHTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Glu-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- Lys -Leu-LeuGln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 Результаты, приведенные в табл. 3, показывают, что все испытанные аналоги hGH-RH обладают намного большей стойкостью к расщеплению трипсином, чем являющийся эталоном hGH-RH (l-29)-NH2. Таким образом, по истечении 30 мин в условиях, приводящих к полному расщеплению эталонного пептида, другие пептиды или сохраняются без изменения (пептид (1), (2) и (8, или подвергаются лишь незначительному гидролизу. Новые гормоны по настоящему изобретению характеризуются высокой активностью высвобождения гормона роста. Они действуют селективно и не влияют на уровень других питуитарных гормонов пролактина, литропина, фоллитропина и тиреотропина. Особенно предпочтительный пептид имеет следующую последовательность аминокислот: Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-hArg-Orn-Val-LeuAla-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg-NH2, и он демонстрирует намного более сильное влияние на гормон высвобождения гормона роста, чем эталонный hGH-RH (1-29)-NH2, что допускает максимальное стимулирующее воздействие спустя 15 мин. Одновременно новые соединения по настоящему изобретению обладают значительно более сильной стойкостью к действию пищеварительных ферментов, чем известные синтетические аналоги hGH-RH; это делает новые соединения особенно полезными для применения в фармацевтических препаратах, используемых при лечении и предупреждении нарушений, связанных с нехваткой гормона роста. Определения и условные обозначения Приведенные ниже определения и объяснения указаны для терминов, используемых в настоящем документе (включая как описание изобретение, так и формулу изобретения). Определения Используемая номенклатура и аббревиатура аминокислот приведена в соответствии со стандартными правилами Международного союза теоретической и прикладной химии, ИЮПАК (IUРАС-IUВ); например: R.M. Schultz, M.N. Liebman Proteins: Composition and Structure, Chapter 2, in: Textbook of Biochemistry, 3rd Edition, T.M. Devlin, Ed.; Wiley-Liss, New York, 1992; and European J. Biochem. 138 (1984), 937. Используемые трехбуквенные аббревиатуры имеют следующее обозначение:Val = валин (Вал) Все последовательности пептидов, указанные в приведенном выше описании, примерах, а также в формуле изобретения, обозначены стандартными условными обозначениями, в которых указанная последовательность начинается N-концевой аминокислотой, а завершается С-концевой аминокислотой. Если иного не оговорено, то все аминокислоты имеют L-конфигурацию. Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на приведенные частные, но не лимитирующие примеры. Примеры Стандартная методология синтеза пептидов А. Образование пептидной цепи. В целях защиты -амино функциональных групп использовались группы трет-бутилоксикарбонила(Воc); боковые цепи были защищены следующими группами: Asp - циклогексильной; Orn - бензилоксикарбонильной; Ser и Thr - бензильной; Tyr- 2-бромбензилоксикарбонильной группой. Для получения аналогов, содержащих остаток hArg, лизиновые остатки в форме производного BocLys(Fmoc) вводили в надлежащие позиции пептидной цепи. Для получения аналогов, содержащих остатки Gab и/или Gap, остатки 2,4-диаминомасляной кислоты и остатки 2,3-диаминопропионовой кислоты вводили в надлежащие позиции пептидной цепи в форме производных Вос-Dab(Fmoc) и Boc-Dap(Fmoc) соответственно. В целях получения аналогов, содержащих остаток Оrn, в надлежащие позиции пептидной цепи в процессе синтеза вводили производное Вос-Оrn (Z). Смолу МВНА (4-метилбензилгидриламиновая смола, Bachem California or Novabiochem, приблизительно 0,5 мэкв/г) после 30-минутного набухания в дихлорметане (DCM) обработали 5% раствором диизопропилэтиламина (DIFA) в DCM (1x1 мин, 1x20 мин) и промывали DCM (6x1 мин). Защищенные пептидильные смолы синтезировали, используя на каждой стадии стандартную методику и следуя приведенному ниже протоколу:(а) Удаление группы Воc с помощью 55% раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в DCM (1x1 мин, 1x20 мин);(ж) Связывание Вос-аминокислоты (1,2 ммол) карбодиимидным способом, используя N,N'диизопропилкарбодиимид (DIC), 1,2 ммол в DCM; время взаимодействия - 2 ч. В случае Boc-Gln и BocAsn в реакционную смесь дополнительно вводили 1,2 ммол N-гидроксибензотриазола (HOBt);(з) Промывка DCM (6x1 мин). Б. Введение групп гуанидина Для того, чтобы из остатка Lys удалить группу Fmoc, защищенную пептидильную смолу обрабатывали в 50% растворе пиперидина/DMF (1x10 мин, 1x2 ч), а потом эту смолу промывали диметилформамидом (DMF) (3x1 мин), 50% раствором DMF/DCM (3x2 мин), 50% раствором метанол/DCM, а такжеDCM (3 х 2 мин). После этого в течение 4 суток в DMF происходило взаимодействие указанной пептидильной смолы с N,N'-бис(трет-бутилоксикарбонил)-S-метилизомочевиной (5-кратный молярный избыток) в присутствии 4-(диметиламино)пиридина (70 мг) в DMF. Полученную пептидильную смолу промывали DMF (3x1 мин) и DCM (3 х 1 мин). Группы Воc были удалены с помощью 55% раствора TFA/DCM(1 х 1 мин, 1x20 мин, 1 х 40 мин) при последующей промывке DCM (3x1 мин), промывкой 50% DMF/DCM(2x1 мин), и промывкой DCM (2x1 мин). В. Отделение пептида от смолы Пептидильную смолу обработали жидким фтористым водородом (HF) в присутствии анизола. Реакция осуществлялась при 0 С в течение 1 ч. После этого при пониженном давлении удалили HF, а остаток промыли холодным диэтиловым эфиром, экстрагировали 50% раствором уксусной кислоты, а потом подвергли лиофилизации. Г. Очистка пептида Пептиды очищали методом ВРЖХ, используя для этого систему Knauer с колонкой Vertex, Nucleosil-300 C18 (8x200 мм, 5 мк). Применяли следующие системы растворителей: А - 0,1% раствор TFA в воде; В - 80% раствор MeCN в А. Элюирование проводили при следующем градиенте: 20-55% В в течение 30 мин, а затем в изократическом режиме 55% В в течение 30 мин при скорости 2 мл/мин. Фракции ана-8 007841 лизировали на колонке Vertex, Nucleosil-300 C18 (4x250 мм, 5 мк), погон при градиенте 25-10% в течение 30 мин; скорость 1 мл/мин. Выявление осуществляли при 220 нм. Однородные фракции (единичные пики на хроматограммах) были объединены, разбавлены водой и подвергнуты лиофилизации с получением хроматографически однородного продукта. Структуры пептидов определяли анализом масс-спектров(ESI-Ms) на спектрофотометре Finnigan MAT 95S (Bremen, Germany). Пример 1. Получение Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-SerAla-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg-NH2 [соединение (1)] Из 3,1 г МВНА смолы (4-метилбензгидриламиновая смола, Novabiochem, 0,49 мэкв/г) после присоединения должным образом защищенных производных аминокислоты по упомянутой выше общей методике синтеза пептидов (часть А) получили в результате полностью защищенную пептидильную смолу: Dat-Ala-Asp(OcHex)-Ala-Ile-Phe-Thr(OBzl)-Asn-Ser(OBzl)-Tyr(2-Br-Z)-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)-ValLeu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp(OcHex)-Ile-Nle-Asp(ОсНех)-Lys(Fmoc)смола. В результате последующей процедуры, согласно упомянутой выше общей методологии синтеза пептидов (часть В), после удаления всех защитных групп Fmoc, а также полного гуанидирования при последующем снятии защиты со всех групп Воc, была получена смола: Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-hArg-hArgVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg-NH2-смола. Эту смолу подвергли воздействию жидкого фтористого водорода (200 мл HF) в присутствии анизола (15 мл) по упомянутой выше общей методологии синтеза пептидов (часть С), это дало 4,5 г сырого пептида, имеющего 50% чистоту (согласно оценкам ВРЖХ). Указанный сырой пептид (20 мл образец) очищали методом ВРЖХ по упомянутой выше общей методологии синтеза пептидов (часть D). В результате получили 4,3 мг пептида, указанного в заглавии, его чистота (согласно методу ВРЖХ) составила 92,3%; масс-спектр: для C157H258N47O43, М = 3492.0; регистрировалось m/z:[М+5 Н]5+: вычислено 699.4, найдено 699.4. Пример 2. Получение соединений (2)-(8) При использовании надлежащим образом защищенных аминокислот по методике, полностью аналогичной приведенной выше, были синтезированы следующие пептиды:-9 007841 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Новые пептиды - аналоги гормона высвобождения гормона роста, имеющие последовательность аминокислот формулы (I):R29 представляет собой D-аргинин, гомоаргинин, 4-гуанидин-2-аминомасляную кислоту или 3 гуанидин-2-аминомасляную кислоту; а также их фармацевтически приемлемые соли. 2. Пептид по п.1, выбранный из группы, включающейDat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg20-Orn-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg29-NH2. 5. Процесс получения пептидов - аналогов гормонов, высвобождения гормона роста, имеющих последовательность аминокислот формулы (I)R29 представляет собой D-аргинин, гомоаргинин, 4-гуанидин-2-аминомасляную кислоту или 3 гуанидин-2-аминомасляную кислоту; а также их фармацевтически приемлемых солей с использованием метода твердофазного синтеза, включающего введение подходящих заместителей лизина, 2,4 диаминомасляной кислоты или 2,3-диаминопропионовой кислоты на соответствующие позиции в пептидной цепи, присоединенной к полимерной подложке, снятие защиты с боковых аминогрупп, взаимодействие свободных аминогрупп с гуанидирующим агентом, удаление всех остальных защитных третбутилоксикарбонильных групп, а также отделение синтезированного пептида от указанной подложки с последующей его очисткой и, необязательное превращение указанного пептида в фармацевтически приемлемую соль.- 10007841 6. Процесс по п.5, отличающийся тем, что в качестве указанной полимерной подложки используют 4-метилбензгидриламиновую смолу. 7. Процесс по п.5 или 6, отличающийся тем, что в качестве гуанидирующего агента используютN,N'-бис(трет-бутилоксикарбонил)-S-метилизотиомочевину в присутствии 4-(диметиламинопиридина). 8. Процесс по п.5 или 6, отличающийся тем, что синтезированный пептид отделяют от указанной подложки с помощью фтористого водорода. 9. Процесс по п.5, отличающийся тем, что синтезированный пептид очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. 10. Фармацевтический препарат, содержащий активное вещество, один или более носителей и/или один или более наполнителей, отличающийся тем, что указанное активное вещество представляет собой по крайней мере один из аналогов гормона высвобождения гормона роста, имеющий последовательность аминокислот формулы (I)R29 представляет собой D-аргинин, гомоаргинин, 4-гуанидин-2-аминомасляную кислоту или 3 гуанидин-2-аминомасляную кислоту; или их фармацевтически приемлемую соль. 11. Способ лечения нарушений, связанных с нехваткой гормона роста человека, включающий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективной дозы пептида - аналогаhGH-RH, имеющего последовательность аминокислот формулы (I)R29 представляет собой D-аргинин, гомоаргинин, 4-гуанидин-2-аминомасляную кислоту или 3 гуанидин-2-аминомасляную кислоту; или их фармацевтически приемлемой соли.