(4r,5s,6s,7r)-гексагидро-1-[5-(3-аминоиндазол)метил]-3-бутил-5,6-дигидрокси-4,7-бис[фенилметил]-2н-1,3-диазепин-2-он и его применение в качестве ингибитора вич-протеазы.

1 Область техники Настоящее изобретение относится к 1-(3 аминоиндазол-5-ил)-3-бутилциклическим мочевинам, которые используются в качестве ингибиторов ВИЧ-протеазы, к содержащим их фармацевтическим композициям и наборам для диагностики, и к способам их применения для лечения вирусной инфекции или в качестве тестстандартов или реагентов. Уровень техники Два различных ретровируса, вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 (ВИЧ-1) или типа 2 (ВИЧ-2) этиологически связаны с иммуносуппрессивным заболеванием, синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД). У ВИЧ-сероположительных субъектов вначале асимптотически, но обычно развивается СПИДсвязанный комплекс (ССК), а затем СПИД. У заболевших проявляется сильное подавление иммунитета, которое делает их ослабленными и предрасположенными к крайне опасным оппортунистическим инфекциям. Заболевание СПИД является конечным результатом того, что вирус ВИЧ-1 или ВИЧ-2 развивается по своему собственному жизненному циклу. Жизненный цикл вириона начинается с того, что вирион прикрепляется к иммунной клетке лимфоцита Т-4 человека-хозяина путем связывания гликопротеина на поверхности защитной оболочки вириона с гликопротеиномCD4 на лимфоцитной клетке. После прикрепления вирион сбрасывает свою гликопротеиновую оболочку, проникает в мембрану клеткихозяина и раскрывает ее РНК. Фермент вириона,ревертаза (обратная транскриптаза) контролирует процесс транскрипции РНК в односпиральную ДНК. Вирусная РНК распадается и создается вторая спираль ДНК. Новая двуспиральная ДНК интегрируется в гены клеток человека, и эти гены участвуют в репродукции клеток. С этого момента клетка человека осуществляет свой репродуктивный процесс, используя свою собственную РНК-полимеразу для того,чтобы транскрибировать интегрированную ДНК в вирусную РНК. Вирусная РНК транслируется в полипротеин-предшественник слияния вставкаgag-pol. Полипротеин затем разлагается ферментом ВИЧ-протеазы, образуя зрелые вирусные протеины. Таким образом, ВИЧ-протеаза является ответственной за регуляцию каскада расщеплений, который приводит к созреванию вирусных частиц в вирус, обладающий полной инфицирующей способностью. Обычная реакция иммунной системы человека, убивающая вторгшиеся вирионы, ослаблена, поскольку большая часть жизненного цикла вириона проходит в латентном состоянии внутри иммунной клетки. Кроме того, вирусная ревертаза - фермент, используемый при образовании новых частиц вириона, не является сильно специфичной и вызывает ошибки транскрипции, которые приводят к непрерывному измене 001154 2 нию гликопротеинов на поверхности вирусной защитной оболочки. Эта потеря специфичности снижает эффективность иммунной системы,поскольку антитела, специально выработанные против одного гликопротеина, могут быть бесполезными против другого, что тем самым снижает число антител, способных бороться с вирусом. Вирус продолжает репродуцировать в то время как реакция иммунной системы продолжает ослабевать. Постепенно ВИЧ держит в полной власти иммунную систему организма,позволяя развиваться оппортунистическим инфекциям, что без вмешательства антивирусных агентов, иммуномодуляторов или и тех и других может привести к смерти. Существуют, по меньшей мере, три критические точки в жизненном цикле вируса, которые были выделены как возможные мишени для антивирусных лекарств: (1) первоначальное присоединение вириона к лимфоциту Т-4 или сайту макрофага, (2) транскрипция вирусной РНК в вирусную ДНК (ревертазу, РТ), и (3) образование новой вирусной частицы во время репродукции (например, протеазы ВИЧ аспарагиновой кислоты или ВИЧ-протеазы). Геномы ретровирусов кодируют протеазу,которая является ответственной за протеолитическое превращение одного или нескольких предшественников полипротеина, таких как роl и gag генные продукты (см. Wellink, Arch. Virol. 98 1 (1988. Ретровирусные протеазы чаще всего превращают gag-предшественник в протеины ядра, а также превращают роl-предшественник в ревертазу и ретровирусную протеазу. Правильный процессинг предшественников полипротеинов ретровирусной протеазой является необходимым для сборки инфекционных вирионов. Было показано, что мутагенез invitro, который продуцирует протеазо-дефектный вирус, ведет к продуцированию незрелых ядерных форм, которые не обладают инфицирующей способностью [см. Grawford et at., J. Virol. 53 899 (1985); Katoh et al., Virology 145 280(1985)]. Поэтому ингибирование ретровирусной протеазы предоставляет привлекательную мишень для антивирусной терапии [см.Mitsuya, Nature 325 775 (1987)]. Способность ингибировать вирусную протеазу обеспечивает способ блокирования вирусной репликации и тем самым способ лечения вирусных заболеваний, таких как СПИД, который может иметь меньшие побочные эффекты,быть более эффективным и вызывающий меньшую резистентность к лекарствам по сравнению с современными способами лечения. В результате три ингибитора ВИЧ-протеазы - саквинавир (Roche), ритонавир (Abbott) и индинавир(Merck) выпущены в продажу, а ряд потенциальных ингибиторов протеазы находятся на стадии клинических испытаний, например, VX-478 3 Как очевидно из клинических испытаний имеющихся в продаже ингибиторов протеазы,широкое множество соединений изучалось в качестве возможных ингибиторов ВИЧпротеазы. Особое внимание привлекли к себе одноядерные циклические мочевины, например,в заявках РСТ WO 94/19329 и WO 93/07128 Lamet al. подробно описаны циклические мочевины формулы и способы получения этих мочевин. Хотя представленные соединения подпадают под описание Lam et аl., они специально не описаны. Дополнительные циклические мочевины описаны Lam et al. J. Chem. Med. 1996, 39, 35143525. Хотя в этой публикации описан широкий круг циклическимочевин, в ней не описаны индазолметилсодержащие соединения. Несмотря на современный успех ингибиторов протеазы, было обнаружено, что ВИЧбольные могут стать резистентными к одному ингибитору протеазы. Следовательно, желательно разработать дополнительные ингибиторы протеазы для дальнейшей борьбы с ВИЧинфекцией. Краткое описание изобретения Соответственно, одним объектом настоящего изобретения являются новые ингибиторы протеазы. Другим объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, обладающие ингибирующей протеазу активностью,содержащие фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного из соединений по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, или его пролекарственной формы. Другим объектом настоящего изобретения является новый способ лечения ВИЧ-инфекции,который включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества, по меньшей мере,одного из соединений по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, или его пролекарственной формы. Другим объектом настоящего изобретения является новый способ лечения ВИЧ-инфекции,который включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективной комбинации из (а) одного из соединений по настоящему изобретению и (b) одного или нескольких соединений, выбранных из группы, включающей ингибиторы ВИЧревертазы и ингибиторы ВИЧ-протеазы. 4 Другим объектом настоящего изобретения является способ ингибирования ВИЧ, присутствующего в образце жидкости тела, который включает обработку образца жидкости тела эффективным количеством соединения по настоящему изобретению. Еще одним объектом настоящего изобретения является набор или контейнер, содержащий, по меньшей мере, одно из соединений по настоящему изобретению в количестве, эффективном для использования в качестве стандарта или реагента в тесте или анализе на определение способности потенциального фармацевтического средства ингибировать ВИЧ-протеазу, рост ВИЧ или и то и другое. Эти и другие объекты, которые станут ясны из нижеследующего подробного описания,были открыты благодаря сделанному авторами изобретения открытию того, что соединения формулы I или их фармацевтически приемлемые соли, или их пролекарственные формы являются эффективными ингибиторами протеазы. Подробное описание предпочтительных осуществлений. Так, в первом варианте настоящее изобретение предлагает новое соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, или его пролекарственную форму. Во втором варианте настоящее изобретение относится к новой фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, или его пролекарственной формы. В третьем варианте настоящее изобретение относится к новому способу лечения ВИЧинфекции, который включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, или его пролекарственной формы. В четвертом варианте настоящее изобретение относится к новому способу лечения ВИЧинфекции, который включает введению пациенту, нуждающемуся в этом, комбинации терапевтически эффективного количества(b) по меньшей мере, одного соединения,выбранного из группы, включающей ингибиторы ВИЧ-ревертазы и ингибиторы ВИЧпротеазы. В другом предпочтительном варианте ингибитор ревертазы является нуклеозидным ингибитором ревертазы. В другом более предпочтительном варианте нуклеозидный ингибитор ревертазы выбирают из AZT, 3 ТС ddI, ddC и d4T, и ингибитор протеазы выбирают из саквинавира, ритонавира,индиназира, VX-478 нельфинавира, KNI-272,CGP-61755 и U-103017. В еще более предпочтительном варианте нуклеозидный ингибитор ревертазы выбирают из AZT и 3 ТС, и ингибитор протеазы выбирают из саквинавира, ритонавира и индинавира. В еще более предпочтительном варианте нуклеозидным ингибитором ревертазы являетсяAZT. В другом еще более предпочтительном варианте ингибитором протеазы является индинавир. В пятом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтическому набору, используемому для лечения ВИЧ-инфекции, который содержит терапевтически эффективное количество:(b) по меньшей мере, одного соединения,выбранного из группы, включающей ингибиторы ВИЧ-ревертазы и ингибиторы ВИЧпротеазы, в одном или нескольких стерильных контейнерах. В шестом варианте настоящее изобретение относится к новому способу ингибирования ВИЧ, присутствующего в образце жидкости тела, который включает обработку образца жидкости тела эффективным количеством соединения формулы I. В седьмом варианте настоящее изобретение относится к новому набору или контейнеру,содержащему соединение формулы I в количестве, эффективном для использования в качестве стандарта или реагента в тесте или анализе на определение способности потенциального фармацевтического средства ингибировать ВИЧпротеазу, рост ВИЧ или и то, и другое. Определения Используемые здесь термины и выражения имеют значения, указанные ниже. Следует понимать, что соединения по настоящему изобретению содержат асимметрично замещенный атом углерода и могут быть выделены в оптически активной или рацемической форме. В данной области хорошо известны способы получения оптически активных форм, такие как разделение рацемических форм или синтез из оптически активных исходных материалов. В объем изобретения входят все хиральные, диастереомерные, рацемические формы и все геометрически изомерные формы структуры, за исключе 001154 6 нием тех случаев, когда особо указана специфичная стереохимия или изомерная форма. Термин "ингибитор ВИЧ-ревертазы", как он использован здесь, относится как к нуклеозидным, так и к ненуклеозидным ингибиторам ВИЧ-ревертазы (РТ). Примеры нуклеозидных РТ-ингибиторов включают, но не ограничены ими, AZT, ddC, ddI, d4T и 3 ТС. Примеры ненуклеозидных РТ-ингибиторов включают, но не ограничены ими, вивирадин (Pharmacia and Upjohn U90152S), производные TIBO, BI-RG-587,невирапин, L-697 661, LY 73497 и Ro 18 893(Roche). Термин "ингибитор ВИЧ-протеазы", как он используется здесь, относится к соединениям,которые ингибируют ВИЧ-протеазу. Примеры включают, но не ограничены ими, саквинавирUpjohn). Дополнительные примеры включают циклические ингибиторы протеазы, описанные в WО 93/07128, WO 94/19329, WO 94/22840 и заявке РСТ US 96/03426. Как используется здесь термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к производным описанных соединений, в которых родительское соединение модифицировано приготовлением его кислотной или основной соли. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничены ими, соли минеральных или органических кислот и основных остатков, таких как амины; соли неорганических или органических щелочей и кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты, и подобные. Фармацевтически приемлемые соли включают обычные нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли, родительского соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, такие обычные нетоксичные соли включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как хлористо-водородная,бромисто-водородная, серная, сульфаминовая,фосфорная, азотная, и т.п.; и соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная,пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, памоевая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глютаминовая, бензойная,салициловая,сульфаниловая,2 ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая,щавелевая, изотионовая и подобные. Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению могут быть синтезированы из родительского соединения, которое содержит основную или кислотную группу, обычными химическими методами. Обычно такие соли могут быть получены взаимодействием 7 свободных кислотных или основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или органическом растворителе, или в их смеси; обычно неводные среды, такие как эфир,этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, являются предпочтительными. Перечень подходящих солей можно найти в работеRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.,Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, которая включена сюда в качестве ссылки. Термин "фармацевтически приемлемые" относится к тем соединениям, материалам, композициям и/или дозированным формам, которые являются с медицинской точки зрения пригодными для контакта с тканями человека и животных не вызывая токсического действия раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, учитывая разумное соотношение польза/риск. Термин "пролекарства" включает любые ковалентно связанные носители, которые высвобождают активное родительское лекарственное средство, соответствующее формуле I или другим формулам соединений по настоящему изобретению, in vivo, когда такие пролекарства введены млекопитающему. Пролекарства соединения по настоящему изобретению, например, соединения формулы (I), получают модификацией присутствующих в соединении функциональных групп таким образом, что модификации разлагаются либо при обычных манипуляциях, либо in vivo, с образованием родительского соединения. Пролекарства включают соединения по настоящему изобретению, в которых гидрокси или аминогруппа связана с любой группой так, что когда пролекарство вводят млекопитающему, оно разлагается, образуя,соответственно, свободный гидроксил или свободную аминогруппу. Примеры пролекарств включают, но не ограничены ими, ацетатные,формиатные или бензоатные производные спиртовых или аминовых функциональных групп в соединениях формулы I; фосфатные эфиры, диметилглициновые эфиры, аминоалкилбензиловые эфиры, аминоалкильные эфиры и эфиры карбоновых кислот спиртовых функциональных групп в соединениях формулы I; и т.п. Дополнительные примеры включают соединения, в которых две гидроксигруппы соединения формулы"стабильная структура" используются для того,чтобы указать, что соединение достаточно прочно для того, чтобы выдержать процесс выделения с требуемой степенью чистоты из реакционной смеси и формулирования с получением эффективного терапевтического агента. На 001154 8 стоящее изобретение предлагает только стабильные соединения. Термин "замещенный" указывает, что один или несколько водородов у атома, к которому относится выражение "замещенный", замещены какой-либо из указанной группы (групп), при условии, что нормальная валентность указанного атома не превышена и что замещение приводит в результате к стабильному соединению. Если заместителем является кетогруппа (т.е.=O), то замещены два водорода у одного атома. Выражение "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству соединения по настоящему изобретению или такое количество комбинации соединений, которое эффективно для ингибирования ВИЧинфекции или для лечения симптомов BИЧинфекции у носителя. Комбинация соединений предпочтительно является синергетической комбинацией. Синергизм, как описано, например, Chou and Talalay, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55 (1984), встречается тогда, когда эффект(в данном случае ингибирование репликации ВИЧ) вводимых соединений в комбинации больше, чем суммарное действие вводимых соединений по отдельности. В общем случае синергeтический эффект наиболее явно заметен при субоптимальных концентрациях соединений. Синергизм может быть выражен в более низкой цитотоксичности, повышенном антивирусном эффекте, или некоторых других благоприятных эффектах при использовании комбинации по сравнению с использованием индивидуальных компонентов. Другие характерные признаки изобретения будут ясны из последующих примеров, которые приведены для иллюстрации изобретения, а не для ограничения его объема. Примеры Сокращения, использованные в примерах,определяются следующим образом: "C" означает градус Цельсия, "d" - дублет; "dd" - двойной дублет; "экв" - эквивалент, "г" - грамм или граммы, "мг" - миллиграмм или миллиграммы,"мл" - миллилитр или миллилитры, "Н" - водород или водороды, "ч" - часы, "m" -мультиплет,"М" - молярность, "мин" - минуты, "МГц" - мегагерц, "МС" - масс-спектроскопия, "ЯМР" спектроскопия ядерно-магнитного резонанса,"t" - триплет, "ТСХ" - тонкослойная хроматография. Пример 1. Получение (4R,5S,6S,7R)гексагидро-1-[5-(3-аминоиндазол)метил]-3 бутил-5,6-дигидрокcи-4,7-бис[фенилметил]-2 Н 1,3-диазапин-2-она (1). Соединение А может быть получено известными способами. Например, получение со 9 единения А показано на схеме в статье Rossanoet at. (Tetr. Lett. 1995, 36(28), 4967, 4968), которая включена сюда в качестве ссылки. Еще один способ получения соединения А показан в примере 6 патента США 5.530.124, которое включено сюда в качестве ссылки. Часть А. К суспензии соединения 1 (10,0 г; 27,3 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (100 мл) добавляли метилтрифлат (3,4 мл, 30 ммоль). После кипячения с обратным холодильником в течение ночи реакционную смесь промывали насыщенным раствором NаНСО 3, насыщенным раствором NaCl, сушили (Na2SO4) и упаривали, оставляя 12,5 г желтого масла. Колоночная хроматография (флэш SiO2, 25% EtOAc/гексан) давала 7,86 г соединения 2 в виде бледно-желтого масла, которое кристаллизовалось при стоянии (выход 75%), Т.пл. 97-100 С, МН+ = 381. Часть В. К раствору соединения 1 (10,0 г,26,3 ммоль) в безводном ДМФ (30 мл) добавляли гидрид натрия (1,58 г, 65,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин, после чего по каплям добавляли раствор 1-йодбутана (9,68 г,52,6 ммоль) в безводном ДМФ (10 мл). После добавления продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до 0 С и добавляли метанол (5 мл), чтобы погасить избыток гидрида натрия. Смесь распределяли между этилацетатом (200 мл) и водой (150 мл). Органическую фазу отделяли и промывали водой (4100 мл),рассолом (100 мл) и сушили над сульфатом натрия. Очистка методом флэш-хроматографии К раствору соединения 2 (5,0 г, 11,5 ммоль) в ацетонитриле (40 мл) добавляли 4 фтор-3-цианбензилбромид (3,68 г, 17,25 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холо 001154 10 дильником в течение ночи. После удаления растворителя при пониженном давлении остаток очищали, используя колоночную хроматографию (35% смесь EtOAc/гексан), чтобы получить циклическую мочевину 3 в виде белого твердого вещества (4,5 г, выход 71%): MS (NH3CI/DDIP) (М+Н+) 556,3 (100%); 1H ЯМР (300 мГц, CDCl3, 25C)7,41 (m, 1H), 7,28 (m, 7 Н),7,13 (d, J=9,2 Гц, 2 Н), 7,05 (t, J=8,8 Гц, 1H), 6,95(t, J=7,0 Гц, 3 Н). Часть D. (4R,5S,6S,7R)-гексагидро-1-[5-(3 аминоиндазол)метил]-3-бутил-5,6-дигидрокси 4,7-бис[фенилметил]-2 Н-1,3-диазапин-2-он (I). К раствору соединения 3 (4,5 г, 8,11 ммоль) в н-бутаноле (20 мл) добавляли гидразин гидрат (0,81 г, 16,2 ммоль). Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 6 ч. Растворитель и избыток гидразина удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в безводном метаноле (20 мл) с последующим растворением в 4 М НСl в диоксане (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Удаляли метанол и остаток распределяли между этилацетатом (80 мл) и насыщенным бикарбонатом натрия (50 мл). Органическую фазу отделяли, промывали водой (250 мл) и сушили над безводным сульфатом натрия. Очистка методом флэшхроматографии дает соединение I (3,0 г, выход 72%) в виде белого твердого вещества: Т.пл. 129-131 С; MS (NН 3-CI/DDIP) (М+Н+) 528,3(t, J=7,0, 3 Н). Применение Соединения формулы I обладают ингибирующей ВИЧ-протеазу активностью и потому являются полезными в качестве антивирусных агентов для лечения ВИЧ-инфекции и связанных с ней заболеваний. Соединения формулы I обладают ингибирующей ВИЧ-протеазу активностью и являются эффективными в качестве ингибиторов роста ВИЧ. Способность соединений по настоящему изобретению ингибировать вирусный рост или инфицирующая способность продемонстрирована в стандартном тесте на вирусный рост или инфицирующую способность, например, при использовании теста, описанного ниже. Соединения формулы I по настоящему изобретению являются также полезными для ингибирования ВИЧ в образце ex vivo, содержащем ВИЧ или предположительно зараженным ВИЧ. Следовательно, соединения по на 11 стоящему изобретению могут быть использованы для ингибирования ВИЧ, присутствующего в образце жидкости тела (например, в образцах сыворотки или семенной жидкости), которая содержит или предполагается, что содержит или заражена ВИЧ. Соединения, предлагаемые изобретением,также полезны в качестве стандартных или ссылочных соединений для использования в тестах или анализах для определения способности агента ингибировать репликацию вирусного клона и/или ВИЧ-протеазы, например, в фармацевтических исследовательских программах. Следовательно, соединения по настоящему изобретению могут быть использованы как контрольные, или ссылочные соединения в таких анализах и как стандарт контроля качества. Соединения по настоящему изобретению могут быть предоставлены в коммерческом наборе или контейнере для использования в качестве такого стандартного или ссылочного соединения. Поскольку соединения по настоящему изобретению проявляют специфичность к ВИЧпротеазе, соединения по настоящему изобретению могут быть также использованы как диагностические реагенты в диагностическом анализе для обнаружения ВИЧ-протеазы. Так, ингибирование активности протеазы в тесте (таком как описанный здесь) соединением по изобретению будет показателем присутствия ВИЧпротеазы и ВИЧ-вируса. Как используется здесь, "мкг" означает микрограмм, "мг" означает миллиграм, "г" означает грамм, "мкл" означает микролитр, "мл" означает миллилитр, "л" означает литр, "нМ" означает наномолярный, "мкМ" означает микромолярный, "мМ" означает миллимолярный,"М" означает молярный и "нм" означает нанометр. "Sigma" обозначает Sigma-Aldrich Corp., StLouis, МО. Анализ ВИЧ РНК Плазмиды ДНК и транскрипты РНК in vitro. Плазмиду pDAB 72, содержащую как gag-,так и pol-последовательности ВН 10 (bр 1131816), клонированные в PTZ 19R, получали поErickson-Viitanen et al. AIDS Research and Human Retroviruses 1989, 5, 577. Плазмиду линеаризировали Bam HI перед образованием транскриптов РНК in vitro, используя набор Riboprobe Gemini System II kit (Promega) с Т 7 РНК полимеразой. Синтезированную РНК очищали обработкой не содержащей РНК-азу ДНК-азой(Promega),экстракцией смесью фенолхлороформ и осаждением из этанола. Транскрипты РНК растворяли в воде и хранили при-70 С. Концентрацию РНК определяли по A260. Зонды. Биотинилированные ловящие зонды очищали ЖХВР после синтеза на Applied Biosystem(Foster City, CA) синтетизаторе ДНК добавлени 001154 12 ем биотина к 5' терминальному концу олигонуклеотида,используя реагент биотинфосфорамидит по Cocuzza, Tet. Lett. 1989, 30,6287. gаg-биотинилированный ловящий зонд (5 биотин-CTAGCTCCCTGCTTGCCCATACTA 3') был комплементарен нуклеотидам 889-912 НХВ 2, и pol-биотинилированный ловящий зонд(5'-биотин-CCCTATCATTTTTGGTTTCCAT 3') бьл комплементарен нуклеотидам 2374-2395 НХВ 2. Конъюгированные со щелочной фосфатазой олигонуклеотиды, использованные в качестве репортерных зондов, готовили по Syngene(5' CTGTCTTACTTTGATAAAACCTC 3') был комплементарен нуклеотидам 2403-2425 НХВ 2.gag-репортерный зонд (5' CCCAGTATTTGTCTACAGCCTTCT 3') был комплементарен нуклеотидам 950-973 НХВ 2. Все позиции нуклеотидов являлись позициями по банку данных о генетических последовательностях GenBank,доступны через программный пакет GeneticsNucleic Acids Research 1984, 12, 387). Репортерные зонды готовили в виде 0,5 мкМ исходных растворов в 2SSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрата натрия), 0,05 М Трис рН 8,8, 1 мг/млBSA (альбумина бычьей сыворотки). Биотинилированные ловящие зонды готовили в виде 100 мкМ исходных растворов в воде. Покрытые стрептавидином планшеты. Покрытые стрептавидином планшеты получали от Du Pont Biotechnology Systems (Boston, MA). Исходные растворы клеток и вирусов. Клетки МТ-2 и МТ-4 хранили в средеRPMI 1640, дополненной 5% плодной телячьей сывороткой (ПТС) для клеток МТ-2 или 10% ПТС для клеток МТ-4, 2 мМ L-глютамина и 50 мкг/мл гентамицина (все препараты от Gibco).RF (репликативную форму) ВИЧ-1 культивировали в клетках МТ-4 в той же среде. Исходные растворы вируса готовили спустя примерно 10 дней после острого инфицирования клеток МТ 4 и хранили в виде аликвот при -70 С. Инфекционные титры исходных растворов ВИЧ-1 (RF) составляли 1-3107 БОЕ (бляшкообразующих единиц)/мл по данным анализа бляшкообразования на клетках МТ-2 (см. ниже). Каждую аликвоту исходного раствора вируса, использованную для инфицирования, оттаивали только один раз. Для оценки антивирусной эффективности инфицируемые клетки повторно культивировали за одни сутки перед инфицированием. В день инфицирования клетки ресуспендировали до концентрации 5105 клеток/мл в RPMI 1640,5% ПТС для объемного инфицирования в объеме и до концентрации 2106 клеток/мл в модифицированной по Дюльбекко среде Игла с 5% ПТС для инфицирования в титрационном мик 13 ропланшете. Добавляли вирус и продолжали культивирование в течение 3 суток при 37 С. Анализ ВИЧ РНК. Клеточные лизаты или очищенную РНК в 3 М или 5 М GED смешивали с 5 М GED и ловящим зондом до конечной концентрации изотиоцианатгуанидиния 3 М и конечной концентрации биотинолигонуклеотида 30 нМ. Гибридизацию проводили в запаянных 96-луночных планшетах для культур тканей с U-образным дном (Nunc или Costar) в течение 16-20 ч при 37 С. Реакционные смеси после гибридизации РНК разбавляли в три раза деионизированной водой до конечной концентрации изотиоцианатгуанидиния 1 М и аликвоты (150 мкл) переносили в ячейки покрытого стрептавидином микротитрационного планшета. Связыванию ловящего зонда и гибрида ловящий зонд-РНК с иммобилизованным стрептавидином позволяли идти в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего планшеты промывали 6 раз буфером для промывки планшетов ELISA от DuPont (забуференный фосфатом солевой раствор (ФБС),0,05% Твин-20). Вторую гибридизацию репортерного зонда в иммобилизованный комплекс ловящего зонда и гибридизированной РНКмишени проводили в промытой покрытой стрептавидином ячейке добавлением 120 мкл гибридизационного коктейля, содержащего 4SSC, 0,66% Triton100, 6,66% деионизированного формамида, 1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки и 5 нМ репортерного зонда. После гибридизации в течение одного часа при 37 С планшет снова промывали 6 раз. Активность иммобилизованной щелочной фосфатазы определяли добавлением 100 мкл 0,2 мМ 4-метилумбеллиферилфосфата (MUBP, JBL Scientific) в буфере(2,5 М диэтаноламин, рН 8,9 (JBL Scientific), 10 мМ MgCl2, 5 мМ дигидрата ацетата цинка и 5 мМ N-гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусной кислоты). Планшеты инкубировали при 37 С. Измеряли флуоресценцию на 450 нм,используя микропланшетный флуорометр (Dynatec) с возбуждением на 365 нм. Оценка действия соединения на инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-2 с использованием микропланшета. Оцениваемые соединения растворяли в ДМСО и разводили в культуральной среде до концентрации в два раза более высокой, чем тестируемая, и максимальной концентрации ДМСО 2%. Дальнейшие трехкратные серийные разведения соединения в культуральной среде проводили непосредственно в микротитрационном планшете с U-образным дном (Nunc). После разведения соединения добавляли клетки МТ-2(50 мкл) до конечной концентрации 5105 на мл (1105 на ячейку). Клетки инкубировали с соединением в течение 30 мин при 37 С в инкубаторе с СО 2. Для оценки антивирусной способности соответствующее разведение исходного 14 раствора вируса ВИЧ-1 (РФ) (50 мкл) вводили в ячейки с культурой, содержащие клетки и разведения испытуемых соединений. Конечный объем в каждой ячейке составлял 200 мкл. Восемь ячеек на планшет оставляли неинфицированными, добавляя вместо вируса 50 мкл среды,тогда как восемь ячеек инфицировали при отсутствии какого-либо антивирусного соединения. Для оценки токсичности соединения параллельные планшеты культивировали без вирусной инфекции. Спустя 3 дня культивации при 37 С в увлажненной камере внутри инкубатора с CO2 все,кроме 25 мкл среды на ячейку, извлекали из ВИЧ-инфицированных планшетов. К осевшим клеткам и оставшейся среде в каждой ячейке добавляли 37 мкл 5 М GED, содержащего биотинилированный ловящий зонд, до конечной концентрации 3 М GED и 30 нМ ловящего зонда. Гибридизацию ловящего зонда с ВИЧ РНК в клеточном лизате проводили в том же самом луночном микропланшете, использованном для культивирования вируса путем заклеивания планшета приспособлением для заклеивания планшетов (Costar) и инкубации в течение 16-20 ч в инкубаторе при 37 С. Затем в каждую ячейку добавляли дистиллированную воду для трехкратного разведения реакционной смеси гибридизации и 150 мкл этой разведенной смеси переносили в покрытый стрептавидином микротитрационный планшет. Количество ВИЧ РНК определяли, как описано выше. Для каждого микротитрационного планшета строили стандартную кривую, полученную добавлением известных количеств транскрипта pDAB 72 in vitro РНК в ячейки, содержащие лизированные инфицированные клетки, для того, чтобы определить количество вирусной РНК, полученное во время инфицирования. Для того чтобы стандартизовать вирусный инокулят, использованный при оценке соединений на антивирусную активность, делали выборку разведений вируса, которая давала в результате величину IС 90 (концентрация соединения, требуемая для снижения концентрации ВИЧ РНК на 90%) для дидеоксицитидина (ддЦ) при концентрации 0,2 мкг/мл. При следовании этой методике величины IС 90 для других антивирусных соединений, и более и менее активных, чем ддЦ, воспроизводились при использовании нескольких исходных растворов ВИЧ-1(РФ). Эта концентрация вируса соответствовала 3105 PFU (измеренной анализом на бляшкообразование на клетках МТ-2) на анализируемую ячейку и обычно давало примерно 75% от максимальной концентрации вирусной РНК,достижимой для любого вирусного инокулята. При анализе ВИЧ РНК значения IС 90 определяли как процент снижения чистого сигнала (сигнал от образцов с инфицированными клетками минус сигнал от образцов с неинфицированными клетками) при анализе РНК относительно 15 чистого сигнала от инфицированных необработанных клеток того же культурального планшета (средний для восьми ячеек). О хороших результатах отдельных опытов по инфицированию и анализа РНК судили по трем критериям. Требовалось, чтобы вирусное инфицирование давало в анализе РНК сигнал, который был бы равен или превышал сигнал, генерируемый от 2 нг транскрипта pDAB 72 In vitro РНК. ВеличинаIС 90 для ддЦ, определенная в каждом опыте,должна быть между 0,1 и 0,3 мкг/мл. Наконец,уровень плато вирусной РНК, полученной при эффективном ингибиторе протеазы, должен быть ниже, чем 10% от уровня, полученного при неингибированном инфицировании. Соединение считается активным, если найдено, что егоIС 90 ниже, чем 1 мкМ. При испытаниях антивирусной активности все манипуляции с микротитрационными планшетами, следующие за начальным добавлением 2 х концентрированного раствора соединения в один ряд ячеек, проводили с использованиемPerkin Elmer/Cetus ProPette. Доза и препаративные формы Антивирусные соединения по изобретению могут быть введены для лечения вирусных инфекций любыми способами, которые обеспечивают контакт активного агента с сайтом воздействия агента, т.е. с вирусной протеазой в организме млекопитающего. Они могут вводиться любыми обычными способами, применяемыми для введения фармацевтических средств, либо в качестве индивидуальных терапевтических агентов или в комбинации с терапевтическими агентами. Они могут вводиться в чистом виде, но предпочтительно вводятся с фармацевтическим носителем, выбранным на основании выбранного способа введения и обычной фармацевтической практики. Вводимая доза должна, конечно, варьироваться в зависимости от известных факторов,таких как фармакодинамическая характеристика конкретного агента, способ и путь его введения; возраст, здоровье и вес реципиента; природа и тяжесть симптомов; вид сопутствующего лечения; частота лечения; желаемый эффект. Можно ожидать, что ежесуточная доза активного ингредиента должна составлять от примерно 0,001 до примерно 1000 мг на килограмм веса тела,причем предпочтительная доза должна составлять от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг. Дозированные формы композиции, подходящие для введения, содержат от примерно 1 мг до примерно 100 мг активного ингредиента на единицу. В этих фармацевтических композициях активный ингредиент должен обычно присутствовать в количестве 0,5-95 мас.% в расчете на общую массу композиции. Активный ингредиент может вводиться перорально в виде твердых дозированных форм, таких как капсулы,таблетки и порошки, или в виде жидких дозированных форм, таких как эликсиры, сиропы и 16 суспензии. Он может также вводиться парентерально в виде стерильных жидких дозированных форм. Желатиновые капсулы содержат активный ингредиент и порошкообразные носители, такие как лактоза, крахмал, производные целлюлозы,стеарат магния, стеариновая кислота и т.п. Такие же разбавители могут быть использованы для приготовления прессованных таблеток. И таблетки и капсулы могут производиться в виде форм с длительным высвобождением, чтобы обеспечить непрерывное высвобождение лекарства в течение нескольких часов. Прессованные таблетки могут быть покрыты сахаром или пленкой для того, чтобы замаскировать любой неприятный привкус и для защиты таблетки от воздействия атмосферы, или кишечную оболочкой для селективной дезинтеграции в желудочно-кишечном тракте. Жидкие дозированные формы для перорального введения могут содержать красители и вкусовые добавки для улучшения восприятия пациентом. В общем случае вода, подходящее масло,солевой рассол, водная декстроза (глюкоза) и родственные растворы сахаров и гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоли,являются подходящими носителями для парентеральных растворов. Растворы для парентерального введения предпочтительно содержат водорастворимую соль активного ингредиента,подходящие стабилизирующие агенты и, если требуется, буферные вещества. Подходящими стабилизирующими агентами являются антиоксиданты, такие как бисульфит натрия, сульфит натрия или аскорбиновая кислота, или по одному, или в комбинации. Используются также лимонная кислота и ее соли и натриевая соль ЭДТА. Кроме того, парентеральные растворы могут содержать консерванты, такие как бензальконийхлорид, метил- или пропилпарабен и хлорбутанол. Подходящие фармацевтические носители описаны в Remington's PharmaceuticalSciences, supra, стандартном справочнике в этой области. Используемые фармацевтические дозированные формы для введения соединений по изобретению проиллюстрированы. Капсулы Большое число единичных капсул можно получить путем наполнения каждой состоящей из двух частей стандартной твердой желатиновой капсулы по 100 мг активного ингредиента в порошке, 150 мг лактозы, 50 мг целлюлозы и 6 мг стеарата магния. Мягкие желатиновые капсулы Смесь активного ингредиента в пищевом масле, таком как соевое масло, хлопковое масло или оливковое масло, можно приготовить и ввести в желатин с помощью нагнетательного поршневого насоса с образованием мягких желатиновых капсул, содержащих 100 мг активно 17 го ингредиента. Затем капсулы должны быть промыты и высушены. Таблетки Большое число таблеток можно приготовить обычными способами таким образом, чтобы дозированная единица содержала 100 мг активного ингредиента, 0,2 мг коллоидной двуокиси кремния, 5 мг стеарата магния, 275 мг микрокристаллической целлюлозы, 11 мг крахмала и 98,8 мг лактозы. Можно использовать подходящие покрытия для того, чтобы улучшить вкус или исключить абсорбцию. Суспензия Водную суспензию для перорального введения можно приготовить таким образом, чтобы каждые 5 мл содержали 25 мг тонкоразмельченного активного ингредиента, 200 мг карбоксиметилцеллюлозы натрия, 5 мг бензоата натрия,1,0 г раствора сорбита U.S.Р. и 0,025 мг ванилина. Раствор для инъекции Парентеральную композицию, пригодную для введения инъекцией, можно приготовить смешением 1,5 мас.% активного ингредиента в 10 об.% растворе пропиленгликоля в воде. Раствор стерилизуют общепринятыми способами. Комбинация компонентов (а) и (b) Каждый компонент терапевтического агента по изобретению может быть независимо представлен в любой дозированной форме, описанной выше, и может быть также введен различными путями, как описано выше. В последующем описании следует понимать, что компонент (b) представляет один или несколько агентов, описанных выше. Так, если компоненты (а) и (b) должны вводиться для лечения одновременно или независимо, каждый агент компонента (b) также может быть введен одновременно или независимо. Компоненты (а) и (b) по настоящему изобретению могут быть сформулированы вместе в виде единой дозированной единицы (т.е. объединены в одной капсуле, таблетке, порошке,жидкости и т.д.), т.е. в виде комбинированного продукта. Когда компоненты (а) и (b) не сформулированы вместе в виде единой дозированной единицы, компонент (а) можно вводить одновременно с компонентом (b) или в любом другом порядке, например, компонент (а) по изобретению можно вводить первым с последующим введением компонента (b), или же их можно вводить в обратном порядке. Если компонент(b) содержит более одного агента, например,один РТ-ингибитор и один ингибитор протеазы,эти агенты можно вводить совместно или в любом другом порядке. Если компоненты не вводятся одновременно, предпочтительно, чтобы введение компонента (а) и (b) проводили с интервалом не более одного часа. Предпочтительным путем введения компонентов (а) и (b) является пероральный. Термины "пероральный агент", "пероральный ингибитор", "пероральное 18 соединение" или подобные, как они использованы здесь, означают соединения, которые могут вводиться перорально. Хотя предпочтительно, чтобы и компонент (а), и компонент (b) вводились одним и тем же путем (т.е., например,оба перорально) или в одинаковой дозированной форме, если требуется, они могут вводиться различными путями (т.е., например, один компонент комбинированного продукта может вводиться перорально, а другой компонент может вводиться внутривенно) или в различных дозированных формах. Как понятно специалисту в данной области, доза при комбинированной терапии по изобретению может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как фармакодинамическая характеристика конкретного агента и способ и путь его введения; возраст, здоровье и вес реципиента; природа и тяжесть симптомов; вид сопутствующего лечения; частота лечения и желаемый эффект, как описано выше. Надлежащая доза компонентов (а) и (b) по изобретению должна быть легко определима квалифицированным врачом на основании настоящего описания. В порядке общих указаний,обычная суточная доза составляет от примерно 100 мг до примерно 1,5 г каждого компонента. Если компонент (b) представляет более чем одно соединение, то типичная суточная доза может составить от примерно 100 мг до примерно 1,5 г каждого агента компонента (b). В порядке общих указаний, если соединения компонента(а) и компонента (b) вводятся в комбинации, то количество каждого компонента в дозе может быть снижено до примерно 70-80% относительно обычной дозы компонента, когда он вводится один как единственный агент для лечения ВИЧинфекции. Комбинированные продукты по изобретению могут быть сформированы таким образом,что хотя активные ингредиенты объединены в одну дозированную единицу, физический контакт между ними сведен к минимуму. Для того чтобы минимизировать контакт, например, при пероральном введении продуктов, один активный ингредиент может быть изготовлен с кишечным (enteric) покрытием. С помощью кишечного покрытия одного из активных ингредиентов можно не только минимизировать контакт между соединенными активными ингредиентами, но и можно также контролировать высвобождение одного из этих компонентов в желудочно-кишечном тракте так, что один из этих компонентов не высвобождался в желудке, но высвобождался в кишечнике. В другом варианте изобретения, в котором желательно пероральное введение, предлагается комбинированный продукт, где один из активных ингредиентов покрыт материалом замедленного высвобождения, который служит для замедленного высвобождения в желудочнокишечном тракте и также служит для того, что 19 бы минимизировать физический контакт между соединенными активными ингредиентами. Кроме того компонент с замедляющим высвобождение покрытием может иметь дополнительно кишечное покрытие так, чтобы высвобождение этого компонента происходило только в кишечнике. Еще один вариант включает препаративную форму комбинированного продукта, в которой один компонент покрыт полимером, замедляющим высвобождение и/или обеспечивающим высвобождение в кишечнике, а другой компонент также покрыт полимером, таким как гидроксипропилметилцеллюлоза с низкой степенью вязкости или другими подходящими известными в данной области материалами для того, чтобы дополнительно разделить активные компоненты. Полимерное покрытие служит для того, чтобы образовать дополнительный барьер против взаимодействия с другим компонентом. В каждой препаративной форме, где предотвращен контакт между компонентами (а) и (b) путем покрытия или каким-либо другим материалом, может быть также предотвращен контакт между индивидуальными агентами компонента (b). Дозированные формы комбинированных продуктов по настоящему изобретению, в которых один активный ингредиент имеет кишечное покрытие, могут быть в форме таблеток таких,где компонент с кишечным покрытием и другой активный ингредиент смешаны вместе и затем спрессованы в таблетку, или таких, где компонент с кишечным покрытием спрессован в один слой таблетки, а другой активный ингредиент спрессован в добавочный слой. Необязательно,для дополнительного разделения двух слоев возможно наличие одного или нескольких слоев плацебо между слоями активных ингредиентов. Кроме того, дозированные формы по настоящему изобретению могут быть в виде капсул, в которых один активный ингредиент спрессован в таблетку или приготовлен в виде множества микротаблеток, частиц, гранул или других неранящих форм ("non-perils"), которые имеют кишечное покрытие. Эти микротаблетки, частицы, гранулы или неранящие формы (non-perils) с кишечным покрытием затем помещают в капсулу или спрессовывают в капсуле вместе с гранулятом другого активного ингредиента. Эти, а также и другие способы минимизации контакта между компонентами комбинированных продуктов по настоящему изобретению,независимо от того вводятся ли они в одной дозированной форме или вводятся в отдельных формах, но в одно и то же время или совместно одинаковым образом, будут легко понятны специалистам в данной области на основе настоящего описания. В предмет настоящего изобретения входят также фармацевтические наборы для лечения ВИЧ-инфекции, которые включают терапевтически эффективное количество фармацевтиче 001154 20 ской композиции, содержащей соединение компонента (а) и одно или несколько соединений компонента (b) в одном или нескольких стерильных контейнерах. Стерилизацию контейнера можно осуществить, используя обычную методологию стерилизации, хорошо известную специалистам. Компонент (а) и компонент (b) могут находиться в одном и том же стерильном контейнере или в отдельных стерильных контейнерах. Стерильные контейнеры материалов могут включать, по желанию, отдельные контейнеры или один или несколько контейнеров со многими отделениями. Компонент (а) и компонент (b) могут быть разделены или физически соединены в одну дозированную форму или единицу, как описано выше. Такие наборы могут дополнительно включать, если требуется,одно или несколько из различных обычных компонентов фармацевтических наборов, таких как, например, один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, добавочные сосуды для смешивания компонентов и т.д., что должно быть легко понятно специалистам. Инструкции, либо в виде вставок, либо в виде этикеток, указывающие количества компонентов,которые необходимо ввести, указания по введению и/или указания по смешиванию компонентов могут также быть включены в набор. Ясно, что возможны многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения в свете вышеизложенного. Поэтому должно быть понятно, что в рамках последующей формулы изобретение может осуществляться шире,чем это конкретно описано в примерах. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль, или его пролекарственная форма, где пролекарство формулы I является соединением, в котором две гидроксигруппы соединены с образованием эпоксида, -OCH2SCH2O-; -ОС(=O)O-; -OCH2O-;(СН 2 СН 2 СН 3)О-; или -OS(=O)О- группы. 2. Соединение по п.1, где соединение является соединением формулы I. 3. Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли, или его пролекарственной формы. 4. Композиция по п.3, где соединение является соединением формулы I. 5. Применение соединения формулы I, или его фармацевтически приемлемой соли, или его пролекарственной формы для изготовления лекарственного средства для лечения ВИЧинфекции где пролекарство формулы I является соединением, в котором две гидроксигруппы соединены с образованием эпоксида, -OCH2SCH2O-;-ОС(ОСН 3)(СН 2 СН 2 СН 3)O-; или -OS(=O)Oгруппы. 6. Применение по п.5, где соединение является соединением формулы I. 7. Применение комбинации (а) и (b) для приготовления лекарственного средства для лечения ВИЧ-инфекции, где(а) является соединением формулы I, или его фармацевтически приемлемой солью, или его пролекарственной формой где пролекарство формулы I является соединением, в котором две гидроксигруппы соединены с образованием эпоксида, -OCH2SCH2O-;(b) представляет собой, по меньшей мере,одно соединение, выбранное из группы, включающей ингибиторы ВИЧ-ревертазы и ингибиторы ВИЧ-протеазы. 8. Применение по п.7, где соединение является соединением формулы I. 9. Применение по п.7, где ингибитор ревертазы является нуклеозидным ингибитором ревертазы. 10. Применение по п.9, где нуклеозидный ингибитор ревертазы выбирают из AZT, 3 ТС,ddI, ddC и d4T, и ингибитор протеазы выбирают из саквинавира, ритонавира, индинавира, VX478, нельфинавира, KNI-272, CGP-61755 и U103017. 11. Применение по п.10, где нуклеозидный ингибитор ревертазы выбирают из AZT и 3 ТС, и ингибитор протеазы выбирают из саквинавира,ритонавира и индинавира. 12. Применение по п.11, где нуклеозидным ингибитором ревертазы является AZT. 13. Применение по п.11, где ингибитором протеазы является индинавир. 14. Фармацевтический набор для лечения ВИЧ-инфекции, который включает терапевтически эффективное количество(b) по меньшей мере, одного соединения,выбранного из группы, включающей ингибиторы ВИЧ-ревертазы и ингибиторы ВИЧ-протеазы в одном или в нескольких стерильных контейнерах. 15. Набор по п.14, в котором компонент (а) является соединением формулы I.