Синтетические аналоги природного легочного сурфактантного белка sp-b и их применение

СИНТЕТИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ ПРИРОДНОГО ЛЕГОЧНОГО СУРФАКТАНТНОГО БЕЛКА SP-B И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение относится к аналогам природного легочного сурфактантного белка SP-B для создания реконструированного сурфактанта в смеси с липидным носителем. Также изобретение относится к применению аналогов белка SP-B для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) у недоношенных детей или взрослых(ARDS), синдрома мекониевой аспирации (MAS) и бронхолегочной дисплазии (BPD). Область изобретения Настоящее изобретение относится к аналогам пептидов природного сурфактантного белка SP-B и их применению в получении препаратов для профилактики и/или лечения респираторного дистресссиндрома (RDS) и других респираторных расстройств. Предшествующий уровень техники Человеческое легкое состоит из большого числа маленьких воздушных мешочков, называемых альвеолами, в которых происходит газообмен между кровью и воздушными пространствами в легких. У здоровых индивидуумов этот обмен опосредуется присутствием белоксодержащего сурфактантного комплекса, который предохраняет легкие от коллапса в конце выдоха. Комплекс легочного сурфактанта состоит, главным образом, из липида и содержит незначительные количества различных белков. Отсутствие достаточных уровней этого комплекса приводит к дисфункции легкого. Этот синдром называется респираторным дистресс-синдромом (RDS от англ. RespiratoryDistress Syndrome) и обычно поражает недоношенных младенцев. Указанный синдром эффективно лечат препаратами модифицированного природного сурфактанта,экстрагированного из легких животных. Основными компонентами этих препаратов сурфактанта являются фосфолипиды, такие как 1,2 дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, широко известный как дипальмитоилфосфатидилхолин(DPPC), фосфотидилглицерин (PG) и сурфактантные гидрофобные белки В и С (SP-B и SP-C), которые,как известно, способны воздействовать на поверхностную активность указанных препаратов. Вследствие недостатков препаратов сурфактанта из животных тканей, таких как сложные процессы производства и стерилизации и возможная индукция иммунных реакций, были разработаны синтетические сурфактанты, имитирующие состав модифицированных природных сурфактантов. Указанные синтетические сурфактанты известны как реконструированные сурфактанты. Однако оказалось, что разработка клинически активных реконструированных сурфактантов является сложной, поскольку выделение значительных количеств природных гидрофобных белков SP-B и SP-C является дорогостоящим и трудоемким. Более того, производство этих белков методами рекомбинантных ДНК требует значительных усилий в плане конструирования и получения оптимальных экспрессирующих систем хозяин/вектор. В дополнение к этому, требуются значительные усилия для разработки эффективных стратегий выделения для разделения и очистки интересующего экспрессируемого белка от нежелательного материала. В частности, белок SP-B характеризуется высокой молекулярной массой, чрезвычайной гидрофобностью и большим количеством остатков цистеина, которые значительно осложняют его промышленное производство посредством выделения из природных материалов или его экспрессию посредством стратегий рекомбинантных ДНК. Поэтому медицинское сообщество нуждается в простых, легких в получении синтетических аналогах белка SP-B, способных имитировать все свойства природного белка. Более конкретно, существует потребность в синтетических аналогах белка SP-B, которые, при смешивании с синтетическими аналогами природного белка SP-C и с липидным носителем, увеличивают способность препаратов реконструированного сурфактанта эффективно поддерживать раскрытое состояние альвеол в конце выдоха. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к полипептиду для получения синтетического легочного сурфактанта, являющемуся аналогом природного сурфактантного белка SP-B и имеющему аминокислотную последовательность CWLCRALIKR-SEQ-PQLVCRLVLRC, который отличается тем, что петлевой мотивSEQ имеет аминокислотную последовательность FNRYLT или YNGK. В одном воплощении полипептида по изобретению петлевой мотив имеет аминокислотную последовательность FNRYLT. В более конкретном воплощении полипептида по изобретению указанный полипептид содержит внутримолекулярную дисульфидную связь между двумя остатками цистеина в положениях 1 и 27 и/или между двумя остатками цистеина в положениях 4 и 21. В другом воплощении полипептида по изобретению петлевой мотив имеет аминокислотную последовательность YNGK. В более конкретном воплощении полипептида по изобретению указанный полипептид содержит внутримолекулярную дисульфидную связь между двумя остатками цистеина в положениях 1 и 25 и/или между двумя остатками цистеина в положениях 4 и 19. Кроме того, настоящее изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему полипептид по изобретению в смеси с липидным носителем. В одном воплощении реконструированный сурфактант по изобретению дополнительно содержит синтетический пептидный аналог природного сурфактантного белка SP-C. В частности, в реконструированном сурфактанте по изобретению липидный носитель содержит смесь фосфолипидов. Настоящее изобретение также относится к применению полипептида по изобретению для изготов-1 023499 ления лекарственного средства для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома(RDS) у недоношенных детей. Наконец, изобретение относится к применению полипептида по изобретению для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, связанного с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, выбранного из группы, состоящей из RDS у взрослых (ARDS), синдрома мекониевой аспирации (MAS) и бронхолегочной дисплазии (BPD). Описание графических материалов На чертеже представлена аминокислотная последовательность человеческого белка SP-B. Определения Респираторную функцию после обработки in vivo экзогенными сурфактантными препаратами определяют путем измерения двух параметров: 1) дыхательного объема, который является показателем растяжимости легкого и 2) объема газа в легких, который является показателем расширения воздушного пространства или раскрытого состояния альвеол в конце выдоха и вследствие этого способности образовывать стабильную фосфолипидную пленку в альвеолах в конце выдоха. Белок SP-B, который также был определен как "SP18", представляет собой димерный белок 17 кДа,в котором мономерная цепь представляет собой полипептид из 79 остатков и имеет три внутрицепьевые дисульфидные связи, соединяющие Cys8 с Cys77, Cys11 с Cys71, и Cys35 с Cys46. В своей природной форме человеческая субъединица SP-B существует в виде гомодимера с дисульфидной связью, имеющего внутрицепьевую дисульфидную связь по Cys 48. Последовательность мономерной цепи человеческогоSP-B представлена на фигуре. Используемый в данной заявке термин "реконструированный сурфактант" означает липидный носитель, к которому были добавлены полипептидные аналоги сурфактантных белков, полученные с использованием рекомбинантной технологии или способов синтеза. Термин "липидный носитель" означает смесь фосфолипидов и возможно другие липидные компоненты, например нейтральные липиды, такие как триацилглицерины, свободные жирные кислоты и/или холестерин. Термины "полипептид" и "пептид" используются в данной заявке взаимозаменяемо для обозначения линейного ряда из не более чем примерно 60 аминокислотных остатков, связанных друг с другом посредством пептидных связей между альфа-амино- и карбоксильной группами соседних остатков. Термин "полипептидные аналоги природного сурфактантного белка SP-B" включает пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, в которой по сравнению с природными белками одна или более аминокислот отсутствуют или заменены другими аминокислотами, при условии, что полипептиды в смеси с липидным носителем демонстрируют активность легочного сурфактанта. Термин "полипептидные аналоги природного сурфактантного белка SP-C" включает полипептиды,имеющие аминокислотную последовательность, в которой по сравнению с природными белками одна или более аминокислот отсутствуют или заменены другими аминокислотами, при условии, что полипептиды в смеси с липидным носителем демонстрируют активность легочного сурфактанта. Полипептиды, демонстрирующие консервативные замены, представляют собой полипептиды, в которых один аминокислотный остаток заменен другим, биологически подобным остатком. Примеры консервативных замен включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим, или замену одного полярного остатка другим, таким как между аргинином и лизином или между глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Термин "консервативная замена" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной родительской аминокислоты, при условии, что полученный полипептид также демонстрирует необходимую активность сурфактанта. Кроме того, термин "консервативная замена" включает замены, отличные от предыдущих замен,при условии, что полученный полипептид сохраняет вторичную структуру, а также необходимую активность сурфактанта родительского полипептида. Аминокислотные последовательности представлены в соответствии с трехбуквенным кодом аминокислотой, которая несет свободную аминогруппу на левом конце (аминоконец), и аминокислотой, которая несет свободную карбоксильную группу на правом конце (карбоксильный конец). Все аминокислотные остатки, идентифицированные в данной заявке, имеют природную Lконфигурацию, и последовательности, идентифицированные в данной заявке, представлены в соответствии со стандартными аббревиатурами аминокислотных остатков, как показано в последующей Таблице соответствия. Подробное описание изобретения Полипептиды по изобретению включают N-концевую последовательность 8-17 и С-концевую последовательность 67-78 белка SP-B, связанных через аминокислотную последовательность, способную образовывать петлевой мотив (turn motif), выбранный из группы, состоящей из FNRYLT и YNGK. Указанные полипептиды также включают модификации, например, где некоторые из аминокислотных остатков последовательностей природного белка SP-B были заменены и/или отсутствуют. В другом случае они могут также включать дополнительные аминокислотные остатки на аминоили карбоксильном конце. Указанные модификации могут служить для усиления экспрессии полипептида или могут служить в качестве "линкерной" последовательности, но предпочтительно не уменьшают или не влияют каким-либо иным образом на биологическую активность полипептида по настоящему изобретению. В одном воплощении полипептиды по изобретению могут находиться в форме молекулы с дисульфидной связью, где внутримолекулярная дисульфидная связь находится между остатком Cys в положении 4 и остатком Cys в С-концевой части. Предпочтительно, указанные полипептиды могут находиться в форме молекулы с дисульфидной связью, где внутримолекулярная дисульфидная связь находится между двумя остатками Cys в положениях 1 и 27 и/или между двумя остатками Cys в положениях 4 и 21. Предпочтительно, указанные полипептиды могут находиться в форме молекулы с дисульфидной связью, где внутримолекулярная дисульфидная связь находится между двумя остатками Cys в положениях 1 и 25 и/или между двумя остатками Cys в положениях 4 и 19. Предпочтительные полипептиды представлены ниже: Полипептиды (Ic) и (Id) в форме молекул с дисульфидной связью, где внутримолекулярные дисульфидные связи находятся между остатками Cys, ниже обозначены как полипептиды ox-(Ic) и ox-(Id). Полипептиды по изобретению при смешивании с липидным носителем, содержащим фосфолипиды,образуют реконструированный сурфактант, способный уменьшать поверхностное натяжение до значений, близких к нулю. Авторы изобретения также обнаружили, что в модели RDS, где недоношенного новорожденного лечили без применения положительного давления в конце выдоха (PEEP), полипептиды по изобретению при смешивании с конкретными синтетическими аналогами белка SP-C и с подходящим липидным носи-3 023499 телем, улучшают респираторную функцию, выраженную посредством дыхательных объемов, в степени,сопоставимой с той, которая достигается после введения модифицированного природного сурфактанта. Более того, оказалось, что указанный препарат реконструированного сурфактанта увеличивает объем газа в легких, что является показателем раскрытого состояния альвеол в конце выдоха. Полипептиды по изобретению могут быть синтезированы любыми способами, известными специалистам в области полипептидов. Многие доступные способы можно найти в J.M. Steward and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, и J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol.2, p. 46,Academic Press (New York), 1983, для твердофазного пептидного синтеза и Е. Schroder and K. Kubke, "ThePeptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965, для классического синтеза в растворе. Полипептиды по изобретению также могут быть получены с использованием способа твердофазного синтеза, первоначально описанного Merrifield в J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Другие способы синтеза полипептида можно найти, например, в М. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John WileySons, 2d Ed., (1976), а также в других справочниках, известных специалистам в данной области техники. Соответствующие защитные группы для использования в таких синтезах можно найти в вышеупомянутых руководствах, а также в J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press,New York, NY (1973). В целом, эти способы включают последовательное добавление одного или более аминокислотных остатков или соответствующим образом защищенных аминокислотных остатков к растущей пептидной цепи. Используя твердофазный синтез в качестве примера, защищенную или дериватизированную аминокислоту присоединяют к инертной твердой подложке через ее незащищенную карбоксильную или аминогруппу. Защитные группы для амино- или карбоксильной группы затем избирательно удаляют и добавляют следующую аминокислоту в последовательности, имеющую комплементарную (амино- или карбоксильную) группу, соответствующим образом защищенную, и подвергают взаимодействию в условиях, подходящих для образования амидной связи с остатком, уже присоединенным к твердой подложке. Защитную группу для амино- или карбоксильной группы затем удаляют из вновь добавленного аминокислотного остатка и затем добавляют следующую аминокислоту (соответствующим образом защищенную) и т.д. После того, как все желаемые аминокислоты были соединены в соответствующей последовательности, оставшиеся защитные группы для концевых и боковых групп (и твердую подложку) удаляют последовательно или одновременно с получением конечного полипептида. Неочищенный полипептид, как правило, очищают с помощью ВЭЖХ и выделяют с помощью лиофилизации. Полипептид может быть получен в форме фармацевтически приемлемой соли. Возможно, полученная соль может быть превращена в другой тип соли с помощью колонки, упакованной подходящей ионообменной смолой в соответствии с методикой, хорошо известной специалисту. Полипептиды по изобретению также могут быть получены с использованием методов рекомбинантных нуклеиновых кислот, хорошо известных в данной области техники. Поэтому последовательности ДНК, кодирующие полипептиды по изобретению, рекомбинантные экспрессирующие векторы, способные экспрессировать их, и соответствующие способы включены в настоящее изобретение. Последовательность ДНК, кодирующая полипептид по изобретению, может быть синтезирована химическими способами, хорошо известными специалисту. Затем сегмент ДНК может быть лигирован в экспрессирующий вектор, и хозяин, трансформированный им, может быть использован для производства полипептида. При химическом синтезе кодирующей последовательности, любые желаемые модификации могут быть получены просто путем замены соответствующих оснований на основания, кодирующие природную аминокислотную последовательность. Рекомбинантные экспрессирующие векторы, способные экспрессировать полипептид по изобретению, и способы их применения для производства полипептидов по изобретению включены в настоящее изобретение. Рибонуклеиновокислотные (РНК) эквиваленты описанных выше сегментов ДНК также включены в данное изобретение. Важной и хорошо известной особенностью генетического кода является его избыточность. То есть,для большинства аминокислот, используемых для получения белков, более чем один кодирующий нуклеотидный триплет (кодон) может кодировать или обозначать конкретный аминокислотный остаток. Поэтому множество различных нуклеотидных последовательностей может кодировать конкретную аминокислотную последовательность. Такие нуклеотидные последовательности рассматриваются функционально эквивалентными, поскольку они могут привести к продуцированию одной и той же аминокислотной последовательности во всех организмах. Полипептиды по изобретению могут быть смешаны с фармацевтически приемлемым липидным но-4 023499 сителем с образованием реконструированного сурфактанта. Предпочтительно массовые соотношения между полипептидом и липидным носителем находятся в диапазоне от около 1:5 до около 1:5000, предпочтительно от около 1:10 до около 1:2000 и более предпочтительно от около 1:50 до около 1:1000. В более предпочтительном воплощении массовое соотношение полипептид : липидный носитель находится в диапазоне от около 1:5 до около 1:1000, предпочтительно от около 1:7 до около 1:500 и более предпочтительно от около 1:10 до около 100. Предпочтительно липидный носитель включает фосфолипиды, которые содержатся в препаратах природного легочного сурфактанта, например фосфатидилхолины (PC), такие как дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) и пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), и фосфатидилглицерины (PG), такие как пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG) и дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG). Другие фосфолипиды, которые могут быть предпочтительно использованы, представляют собой фосфатидилинозитолы (PI), фосфатидилэтаноламины (РЕ), фосфатидилсерины и сфингомиелины (SM). В конкретном воплощении липидный носитель может содержать дополнительные компоненты, например, нейтральные липиды, такие как триацилглицерины, свободные жирные кислоты и/или холестерин. Реконструированный сурфактант может содержать один или более полипептидов по изобретению или может дополнительно содержать синтетический пептидный аналог природного сурфактантного белка SP-C, такого, как раскрытые в WO 95/32992, WO 00/47623 и WO 03/097695. Реконструированные сурфактанты, содержащие полипептид по изобретению, могут быть получены смешиванием раствора или суспензии указанного полипептида, возможно раствора или суспензии другого пептида и липидного носителя, затем последующей сушкой смеси. В других случаях они могут быть получены лиофилизацией или сушкой распылением в соответствии со способами, известными в данной области техники. Введение указанного препарата реконструированного сурфактанта может быть осуществлено способом, известным специалисту в данной области техники, предпочтительно посредством интратрахеальной инстилляции (инфузия или болюс). В другом случае введение может быть осуществлено посредством аэрозолизации или распыления. Препараты предпочтительно вводят в форме раствора, дисперсии, суспензии или сухого порошка. Предпочтительно, препараты содержат реконструированный сурфактант, растворенный или суспендированный в подходящем растворителе или среде для ресуспендирования. Предпочтительно препараты поставляют в виде суспензии в забуференном физиологическом растворе в одноразовых стеклянных флаконах. Предпочтительно концентрация реконструированного сурфактанта (выраженная в виде содержания фосфолипида) варьирует от примерно 2 до примерно 160 мг сурфактанта на мл, предпочтительно от 10 до 100 мг/мл, более предпочтительно от 20 до 80 мг/мл. Указанные препараты могут дополнительно содержать электролиты, такие как соли кальция, магния и/или натрия (например, хлорид кальция или хлорид натрия). Препараты в форме водной суспензии можно также вводить посредством распыления. В случае использования аэрозольного введения, реконструированный сурфактант поставляют в мелкодисперсной форме вместе с пропеллентом. Полезные пропелленты, такие как гидрофторалканы,типично представляют собой газы в условиях окружающей среды, которые конденсируются при давлении. Аэрозоль упакован в контейнер, снабженный подходящим клапаном, чтобы ингредиенты могли быть сохранены под давлением до высвобождения. Препараты, полученные с полипептидами по изобретению, применимы для лечения или профилактики респираторного дистресс-синдрома (RDS) у недоношенных детей или при лечении или профилактики других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, включая RDS у взрослых (ARDS), синдром мекониевой аспирации (MAS) и бронхолегочную дисплазию (BPD). Они также могут быть полезны для профилактики и/или лечения других респираторных расстройств, таких как пневмония, бронхит, COPD (хроническая обструктивная болезнь легких), астма и кистозный фиброз, а также для лечения серозного среднего отита (экссудативного отита). Следующий пример иллюстрирует изобретение более подробно. Пример 1. Синтез и очистка полипептида ox-(Ic). Полипептид ox-(Ic) получали стандартными способами SPPS (твердофазный пептидный синтез),основанными на Fmoc-химии, в соответствии со схемой 1, описанной ниже. После твердофазного синтеза неочищенный пептид без дисульфидных мостиков отщепляли от смолы стандартными способами, затем дисульфидные мостики формировали селективно посредством двух различных стадий окисления. Для селективного образования дисульфидных мостиков выбрали определенный тип защиты для боковых групп четырех цистеинов в процессе синтеза. В способе, показанном на схеме 1, Cys1 и Cys27 вводили в виде Fmoc-Cys(Trt)-OH во время SPPS, в то время как Cys4 и Cys21 связывали в виде соответствующих Аст-производных. Первый дисульфидный мостик формировали посредством окисления воздухом, и пептид, имеющий один мостик, очищали с помощью систем ВЭЖХ и выделяли лиофилизацией. Второй дисульфидный мостик формировали посредством окисления йодом, и конечный пептид очищали с помощью системы ВЭЖХ и выделяли лиофилизацией. Чистоту конечного полипептида проверяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой, используя колонку C18, и она оказалась равной 92%. Его молекулярную массу определили с помощью ИЭР-МС. Выход: 1,73 г (2,4%). Пример 2. Синтез и очистка полипептида ox-(Id). Полипептид ox-(Id) получали сходным образом в соответствии со схемой 2, изложенной ниже. Схема 2-6 023499 Введение дисульфидных мостиков между Cys1 и Cys27 и между Cys4 и Cys21, очистку и выделение осуществляли, как изложено в примере 1. Чистоту конечного полипептида проверяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой, используя колонку C18, и она оказалась равной 86%. Его молекулярную массу определили с помощью ИЭР-МС. Выход: 0,81 г (2,4%). Обозначения АА-ОН - аминокислота; ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Полипептид для получения синтетического легочного сурфактанта, являющийся аналогом природного сурфактантного белка SP-B и имеющий аминокислотную последовательность CWLCRALIKRSEQ-PQLVCRLVLRC, который отличается тем, что петлевой мотив SEQ имеет аминокислотную последовательность FNRYLT или YNGK. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что петлевой мотив имеет аминокислотную последовательность FNRYLT. 3. Полипептид по п.2, содержащий внутримолекулярную дисульфидную связь между двумя остатками цистеина в положениях 1 и 27 и/или между двумя остатками цистеина в положениях 4 и 21. 4. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что петлевой мотив имеет аминокислотную последовательность YNGK. 5. Полипептид по п.4, содержащий внутримолекулярную дисульфидную связь между двумя остатками цистеина в положениях 1 и 25 и/или между двумя остатками цистеина в положениях 4 и 19. 6. Реконструированный сурфактант, содержащий полипептид по любому из пп.1-5 в смеси с липидным носителем. 7. Реконструированный сурфактант по п.6, дополнительно содержащий синтетический пептидный аналог природного сурфактантного белка SP-C. 8. Реконструированный сурфактант по п.6 или 7, где липидный носитель содержит смесь фосфолипидов. 9. Применение полипептида по пп.1-5 для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) у недоношенных детей. 10. Применение полипептида по пп.1-5 для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, связанного с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, выбранного из группы, состоящей из RDS у взрослых (ARDS), синдрома мекониевой аспирации (MAS) и бронхолегочной дисплазии (BPD).