Улучшенные синтетические липидные смеси для препарата синтетического сурфактанта

007928 Настоящее изобретение относится к синтетическим сурфактантам, состоящим из фосфолипидов и искусственных пептидов, способным снижать поверхностное натяжение на границе раздела фаз воздухжидкость. Более конкретно настоящее изобретение относится к синтетическим сурфактантам, содержащим определенные фосфолипидные смеси и искусственные пептидные аналоги белка SP-C белка природного сурфактанта для лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) и других заболеваний, связанных с нарушениями функции легочного сурфактанта. Предпосылки изобретения Легочный сурфактант понижает поверхностное натяжение, возникающее на границе раздела фаз воздух-жидкость внутренней стенки альвеолы, таким образом предохраняя легкие от коллапса в конце выдоха. Недостаток сурфактанта является нарушением функции, которое часто поражает недоношенных новорожденных детей и вызывает RDS, заболевание, которое можно эффективно лечить природными сурфактантами, полученными из легких животных. Основными составляющими этих препаратов сурфактантов являются фосфолипиды, такие как 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, обычно известный как дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), фосфатидилглицерол (PG) и гидрофобные белки В и С (SP-B и SP-C) сурфактанта. Гидрофильные белки SP-A и SP-D сурфактанта, которые представляют собой коллагеновые лектины С-типа (Са 2+-зависимые) и предположительно главным образом действуют в защитной системе хозяина, обычно не включают в препараты сурфактантов из-за использования органических растворителей при процедуре экстракции. В современной терапевтической практике используют модифицированные препараты природного сурфактанта, полученные из тканей животных. Эти препараты обычно состоят из упомянутых выше компонентов, за исключением гидрофильных белков,которые удаляют при экстракции органическими растворителями. По причине недостатков препаратов сурфактанта из тканей животных, таких как сложность процессов обработки и стерилизации и возможная индукция иммунных реакций, были сделаны попытки изготовления искусственных сурфактантов. В строгом смысле слова, искусственные сурфактанты являются смесями только фосфолипидов или смесями фосфолипидов и других синтетических липидов. Синтетические сурфактанты являются искусственными сурфактантами с добавлением гидрофобных белков, или выделенных из тканей животных либо полученных с помощью рекомбинантных технологий, или синтетических пептидных производных таких белков. Свойства и активность синтетических сурфактантов в значительной степени зависят не только от белковых/пептидных компонентов, но также от состава фосфолипидной смеси. Описание изобретения Было обнаружено, что дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) в смеси со специфическими пальмитоилолеилфосфолипидами является идеальным носителем для искусственных пептидов, обычно используемых в синтетических сурфактантах в качестве аналогов природных белков SP-C и/или SP-B сурфактанта. Более конкретно, было обнаружено, что синтетические сурфактанты, содержащие аналоги SPC, описанные в WO 00/47623, в комбинации с DPPC и пальмитоилолеилфосфолипидом, предпочтительно выбранным из пальмитоилолеилфосфатидилглицерола (POPG) или смеси POPG с пальмитоилолеилфосфатидилхолином (РОРС), в массовом соотношении в диапазоне от 80:20 до 60:40, понижают поверхностное натяжение и вязкость препаратов, полученных из них. Вопреки тому, что описывается в литературе, было также неожиданно обнаружено, что добавление пальмитиновой кислоты (РА) является бесполезным и, более того, в некоторых случаях может снизить in vivo активность сурфактанта. Соответственно, настоящее изобретение относится к синтетическим сурфактантам, содержащим смеси, по существу состоящие из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) и пальмитоилолеилфосфатидилглицерола (POPG) или его смеси с пальмитоилолеилфосфатидилхолином (РОРС) в массовом соотношении в диапазоне от 80:20 до 60:40, и искусственных пептидных аналогов природных белков SP-C и/или SP-B сурфактанта. Сурфактант по изобретению не содержит пальмитиновой кислоты. Массовое соотношение между DPPC и POPG предпочтительно находится в диапазоне от 75:25 до 65:35, более предпочтительно 68:31. В случае смесей DPPC:POPG:POPC предпочтительно используют фосфолипиды в массовом соотношении 60:20:20 или 68:15:16. Любой искусственный пептидный аналог природных белков SP-C и/или SP-B сурфактанта может быть преимущественно применен, как, например, описанные в WO 89/06657, WO 92/22315 и WO 95/32992. Предпочтительным является применение аналогов SP-C, имеющих следующую общую формулу (I), где аминокислоты представлены с помощью однобуквенного кодаZ является S, возможно замещенной ацильными группами, содержащими 12-22 атома углерода, которые присоединены к боковой цепи через эфирную или тиоэфирную связь соответственно;является аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из М, I, L, nL; а является целым числом от 1 до 19;b является целым числом от 1 до 19; с является целым числом от 1 до 21;d является целым числом от 0 до 20; е равно 0 или 1;fe,(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd является последовательностью, содержащей максимум 22 аминокислоты,предпочтительно от 10 до 22. Еще более предпочтительным является применение пептидов формулы (II)(II) гдеявляется аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из М, I, L, nL,и где серин может быть возможно ацилирован, например, пальмитоилом. Описанный ниже пептид (SP-C33) в неацилированной форме является наиболее предпочтительным по данному изобретению(SP-C33) Пептиды формулы (I) могут быть приготовлены посредством стандартного синтеза пептидов или рекомбинантных технологий, как описано в WO 00/47623. Ацилированные пептиды предпочтительно синтезируют путем взаимодействия пептидов с ацилхлоридом в чистой трифторуксусной кислоте в течение 10 ч при комнатной температуре с последующим гашением 80% водным этанолом. Активность синтетических сурфактантов по изобретению по снижению поверхностного натяжения оценивали как in vitro, так и in vivo. В частности, in vivo результаты четко показывают, что синтетические сурфактанты по настоящему изобретению способны увеличивать дыхательный объем, который в свою очередь является показателем способности расширения легких, в значительно большей степени,чем сурфактанты, полученные из смесей DPPC, PG и РА, обычно используемые в уровне техники. Синтетические сурфактанты по изобретению могут содержать SP-B или полимиксины, в частности полимиксин В, в качестве аналогов SP-B. Сурфактант может быть приготовлен путем смешивания растворов и суспензий пептидов и фосфолипидов и последующего высушивания смеси. При необходимости высушенную смесь можно ресуспендировать, диспергировать или вводить как таковую субъектам, которые нуждаются в лечении недостаточности сурфактанта. В случае аэрозольного введения будет необходимо комбинировать мелкие частицы сурфактанта с подходящим инертным пропеллентом. Другие виды введения, такие как вапоризация или пульверизация стабильных растворов/суспензий сурфактанта, также находятся в рамках настоящего изобретения. Следующие примеры иллюстрируют изобретение более детально. Примеры Экспериментальная часть. Материалы. 1,2-Дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин(DPPC),1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3 фосфохолин (РОРС), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерол (POPG), яичный фосфотидилглицерол (PG), пальмитиновая кислота (РА) и сульфат полимиксина В (РхВ) были использованы для приготовления следующих липидных смесей в массовых соотношениях: DPPC/PG/PA, 68:22:9;SP-C33 и липиды в массовых соотношениях пептид/липид 0,02:1 смешивали в растворе хлороформ/метанол 98:2 (об./об.), растворители выпаривали и полученные пептид/липидные пленки затем гидратировали в 150 мМ NaCl путем повторяющейся обработки ультразвуком при концентрации липидов 80 или 35 мг/мл. Пробы сурфактанта, используемые для анализа на пульсационном пузырьковом сурфактометре (pulsating bubble surfactometer), разводили в солевом растворе до рабочих концентраций(10 мг/мл сурфактанта). В некоторых экспериментах добавляли РхВ до конечной концентрации 2%(мас./мас.) от концентрации липидов. Сурфактант, который содержал SP-C33 в DPPC/PG/PA (68:22:9),обеспечивал очень вязкие суспензии при концентрации 80 мг/мл и вызывал трудности при введении экспериментальным животным. Два хорошо известных модифицированных природных сурфактанта, Куросурф (Curosurf, ChiesiFarmaceutici) и Сурванта (Survanta, Abbott) вводили согласно инструкциям изготовителя. Куросурф сус-2 007928 пендировали при концентрации 80 мг/мл и вводили 2,5 мл на кг массы тела; Сурванта суспендировали при концентрации 25 мг/мл и вводили 4 мл на кг массы тела. Эксперименты по пульсации пузыря. Динамические поверхностные свойства сурфактанта SP-C33, с добавлением и без добавления 2%(мас./мас.) РхВ, оценивали с помощью пульсационного пузырькового сурфактометра. Для этих экспериментов сурфактант суспендировали в солевом растворе при концентрации 10 мг/мл и анализировали при 37 С. Чувствительность по отношению к ингибированию тестировали путем добавления 40 мг/мл альбумина к суспензии сурфактанта. Сообщение пузыря с окружающим воздухом создавали в пластиковой испытательной камере, содержащей приблизительно 20 мкл жидкой пробы. Радиус пузыря колебался со скоростью 40 циклов/мин от максимального 0,55 до минимального 0,40 нм, что соответствовало 50% циклическому поверхностному давлению. Значения поверхностного натяжения для минимального и максимального размера пузыря (min, max) регистрировали через 5 мин пульсаций. Эксперименты in vivo. Смеси сурфактанта испытывали на недоношенных новорожденных кроликах, полученных при помощи гистерэктомии в гестационном возрасте 27 дне (беременность 31 день). Животных подвергали трахеотомии при рождении, помещали в боксы для плетизмографии при 37 С и параллельно вентилировали 100% кислородом с частотой 40 вдохов/мин и 50% временем вдоха. Обработанные животные получали 2,5 мл/кг или 4 мл/кг упомянутого выше сурфактанта через трахеальную канюлю. Новорожденных, которые не получали препарат сурфактанта, использовали в качестве контроля. После введения сурфактанта пиковое давление вначале поднимали до 35 см Н 2O (3,4 кПа) на 1 мин, чтобы облегчить распределение поверхностно-активного вещества в легких, затем понижали до 25 см Н 2O (2,45 кПа). Затем животных вентилировали при пиковом давлении 25 см Н 2O (2,45 кПа) в течение 15 мин, после чего давление понижали сначала до 20 см Н 2O (1,96 кПа) на 5 мин, затем до 15 см Н 2 О (1,47 кПа) на 5 мин и снова поднимали до 25 см Н 2 О (2,45 кПа) на 5 мин. Дыхательные объемы измеряли в 5 мин интервалы с помощью пневмотахографа, соединенного с каждым боксом для плетизмографии. В конце установленного периода вентиляции животных умерщвляли посредством внутримозговой инъекции лидокаина. Брюшную полость животных вскрывали и изучали положение диафрагмы для получения свидетельств пневмоторакса. Пример 1. Поверхностная активность SP-C33 in vitro в различных липидных смесях. Динамические поверхностные свойства 2% (мас./мас.) SP-C33 в DPPC/PG/PA (68:22:9),DPPC/POPC/POPG (60:20:20), DPPC/POPC/POPG (68:16:15) и DPPC/POPG (68:31) оценивали при помощи пульсационного пузырькового сурфактометра, который показал, что min2 мН/м после 5 мин пульсации для всех смесей и mах 40 мН/м для всех смесей, кроме SP-C33 в DPPC/PG/PA (68:22:9), mах которого был равен 48 мН/м. Пример 2. Оптимальная эффективность in vivo без РА. Чтобы оценить релевантность липидной композиции, авторы изобретения сравнили in vivo эффективности SP-C33 в смесях DPPC/PG/PA (68:22:9), DPPC/POPG/PA (68:22:9) и DPPC/POPG (68:31). SPC33 в DPPC/POPG (68:31) показал более высокую эффективность, чем две другие смеси. Данные продемонстрировали значительное увеличение дыхательных объемов после лечения с помощью SP-C33 вDPPC/POPG (68:31). Они также продемонстрировали, что в случае постоянного содержания DPPC и жирных кислот присутствие РА понижает эффективность лечения. Негативное воздействие РА на in vivo активность сурфактанта, основанного на SP-C33, в дальнейшем подтверждается эффективностью (VT=12 при 15 мин, VT=14 при 25 мин) SP-C33 в DPPC/POPC/POPG/PA (57:19:19:5), которая немного ниже, чем эффективность SP-C33 в DPPC/POPC/POPG (60:20:20). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Синтетический сурфактант, состоящий из искусственного пептида и фосфолипидов, где искусственный пептид представляет собой аналог SP-C формулы (I)Z является S, возможно замещенной ацильными группами, содержащими 12-22 атома углерода, которые присоединены к боковой цепи через эфирную связь;является аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из М, I, L, nL; а является целым числом от 1 до 19;b является целым числом от 1 до 19; с является целым числом от 1 до 21;d является целым числом от 0 до 20; е равно 0 или 1;(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd является последовательностью, содержащей максимум 22 аминокислоты,предпочтительно от 10 до 22; в комбинации с дипальмитоилфосфатидилхолином (DPPC) и пальмитоилолеилфосфолипидом, выбранным из пальмитоилолеилфосфатидилглицерола (POPG) или его смеси с пальмитоилолеилфосфатидилхолином (РОРС), в массовом соотношении в диапазоне от 80:20 до 60:40. 2. Синтетический сурфактант по п.1, где искусственный пептид является аналогом SP-C формулы(II) гдеявляется остатком, выбранным из группы, состоящей из М, I и nL. 3. Синтетический сурфактант по п.2, где искусственный пептид представляет собой(SP-C33) 4. Синтетический сурфактант по пп.1-3, где искусственный пептид находится в комбинации с DPPC и POPG в массовых соотношениях в диапазоне от 75:25 до 65:35. 5. Синтетический сурфактант по п.4, где искусственный пептид находится в комбинации с DPPC иPOPG в массовом соотношении 68:31. 6. Синтетический сурфактант по пп.1-3, где искусственный пептид находится в комбинации сDPPC, POPG и РОРС в массовом соотношении от 60:20:20 до 68:15:16. 7. Способ изготовления синтетического сурфактанта по пп.1-6, включающий стадии: а) смешивания раствора или суспензии пептида и фосфолипидов; и б) сушки смеси. 8. Синтетический сурфактант по пп.1-6 в форме раствора, дисперсии, суспензии или сухого порошка. 9. Применение синтетического сурфактанта по пп.1-6 для лечения заболеваний, связанных с нарушением функции легочного сурфактанта. 10. Применение по п.9, где заболевание представляет собой респираторный дистресс-синдром