Способ ранней диагностики онкологических заболеваний

СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Изобретение относится к иммунологии и медицине, биотехнологии. Предложен способ выявления онкологических заболеваний различной этиологии на ранней стадии развития. Согласно изобретению производят выделение эффекторных клеток иммунной системы пациента и измерение индекса цитотоксичности (ИЦК) данных клеток на клеточных линиях различных видов злокачественных опухолей человека и животных и в случае, когда ИЦК данного пациента,измеренный на выбранных клеточных линиях, достоверно больше ИЦК для здоровых доноров,предварительно определнных для выбранного метода измерения ИЦК на данных клеточных линиях, то делают вывод о наличии начальной стадии онкологического заболевания, затем выявляют клеточную линию с максимальным значением ИЦК и по ее типу делают вывод о наиболее вероятном типе онкологического заболевания. Техническим результатом изобретения является создание диагностической тест-системы на основе панели клеточных линий, экспрессирующих опухолеспецифические антигены, для ранней диагностики раковых заболеваний. Зайцев Сергей Алексеевич (RU) Мызников Б.В. (RU) Изобретение относится к биотехнологии, медицине и иммунологии, конкретно - к разработке метода ранней диагностики (скрининга) онкологических заболеваний различной этиологии на начальных стадиях развития неопластической трансформации, не детектируемых другими диагностическими методами. Уровень техники Ежегодно онкологические заболевания первично выявляются у 9 млн человек во всем мире, и являются причиной смерти около 6 миллионов человек в год. Это вторая причина смертности после сердечно-сосудистых заболеваний в развитых странах и общая причина 10% всех случаев смерти в мире. Показатели заболеваемости и смертности превышают таковые при таких распространенных заболеваниях как туберкулез, малярия и СПИД вместе взятые. В настоящее время имеется положительная тенденция по снижению смертности от рака - примерно на 3,5% в год. Стабильное снижение смертности от злокачественных новообразований определяется как прогрессом в изучении, профилактике, лечении, так и выявлении рака, особенно существенным признано выявление рака на ранних стадиях, так как это значительно увеличивает шансы пациента на выздоровление. На сегодняшний день организация скрининга становится краеугольным камнем, позволяющим вовремя, на ранних стадиях диагностировать и успешно лечить злокачественные новообразования. Разработка программ скрининга и участие в них большей части населения особенно актуальна ввиду неуклонного роста онкологической заболеваемости в России. Существуют программы скрининга по отдельным видам рака - по раку шейки матки, раку легкого, раку молочной железы, раку желудка. Россия отстала от США и стран Европы не по лечению, а именно по скринингу рака. И несмотря на наличие оборудования скрининговые программы масштабно не организованы. В то же время как раз ранняя диагностика рака определяет прогноз жизни и лечение больного. Смертность от онкологических заболеваний уже сейчас снижается, особенно ярко эта тенденция видна в развитых странах - в США и Европе, где значительно выше выявление рака на ранних стадиях, когда возможно полное излечение от него. Проблема онкологических заболеваний остается приоритетной для современного общества. По прогнозам ВОЗ заболеваемость онкологическими заболеваниями и смертность от них во всем мире возрастет в 2 раза за период с 1999 по 2020 г., с 10 до 20 млн новых случаев и с 6 до 12 млн регистрируемых смертей. Так, в Российской федерации в 1998 г. было зарегистрировано 440721 новых онкобольных, а в 2008 году 490734 человек. На начало 2009 г. в онкологических диспансерах России стояло на учете 2607223 человек. Учитывая высокую актуальность проблемы раннего выявления злокачественных новообразований для снижения уровня смертности онкологических больных необходимо значительное повышение эффективности методов скрининга онкозаболеваний на начальных этапах развития. В настоящее время для этих целей представляется перспективным использования метода измерения индекса цитотоксичности клеток (ИЦК). Многочисленные работы по изучению феномена цитотоксичности клеток, проведнные в 90-е годы XX века [1-5], не привели к формированию определнного мнения у научного сообщества по возможности использования феномена ИЦК для прогностических целей. Однако более поздние работы показали [6-7], что зависимость ИЦК от стадии течения болезни для среднестатистического пациентавыглядит следующим образом: возрастание от среднего уровня ИЦК до максимального значения на 1-й(диагностируемой) стадии заболевания, с последующим снижением на 3-й и 4-й стадиях при метастазировании до исходного уровня или ниже. Однако исследователи по объективным причинам не могли изучить развитие ИЦК на 0 (недетектируемой) стадии развития онкозаболевания. Но, очевидно, что нарастание ИЦК от исходного уровня до максимального, соответствующего 1-й стадии, не может происходить мгновенно, иммунный ответ усиливается и развивается пропорционально развитию опухоли. И напряжнность иммунного ответа в середине нулевой стадии, когда опухоль ещ не детектируется другими методами, должна быть достаточной для измерения методом ИЦК, как это следует из графика. График зависимости ИЦК (условные единицы) среднестатистического пациента от стадии развития онкологического заболевания Однако до настоящего времени остатся невыясненным, сопоставим ли вклад в феномен ИЦК (и его изменения в процессе развития неопластической трансформации) двух известных на сегодня нерестриктированных по МНС механизмов цитотоксического действия лимфоцитов: НК-киллинг и гамма/дельта Т-лимфоцитопосредованный цитолиз. Количество данных типов эффекторных клеток в перефирической крови человека вполне сопоставимо и может достигать до 15%. Если предположить, что основной вклад в нарастание ИЦК при развитии опухоли вносят гамма/дельта Т-лимфоциты, тогда следует естественный вывод о возможности создания тест-системы для выявления ранних опухолей на основе панели клеточных линий, экспрессирующих опухолеспецифичные антигены. Поскольку цитотоксичность гамма/дельта Т-лимфоцитов также является антигензависимой, то измерение ИЦК на панели клеточных линий должно регистрировать повышение ИЦК только на клетках, экспрессирующих антигены,характерные для данной развивающейся опухоли. На остальных клеточных линий не будет наблюдаться повышения ИЦК выше обусловленного действием НК-клеток. Это позволит сделать достаточно однозначный вывод о начальной стадии развития конкретного опухолевого процесса у данного донора. Это предположение подтверждается следующими экспериментальными данными. Материалы и методика Клеточная линия рака молочной железы MCF-7 получена из коллекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор". В ходе проведения работы набрана группа условно-здоровых доноров (27 человек), от которых было забрано по 3-4 мл цельной периферической венозной крови для выделения ДНК (набор "Проба-ГС","ДНК-Технология", Россия) с последующим типированием на наличие аллеля HLA-A02 с использованием коммерческого набора ALLSET GOLD HLA А LOW RES SSP ("Invitrogen", США). Было выявлено 18 человек носителей аллеля. Клинический материал был получен от больных РМЖ (40 человек), находящихся в стационаре отделения 3 Городской клинической больницы 1 г. Новосибирска. Средний возраст женщин составлял 58 лет. В день операции у пациенток забирали периферическую кровь в контейнеры "Гемасин" 250/200 с гемоконсервантом Фаглюцидом ("Синтез", г. Курган), в объеме 100 мл, а при операции фрагмент опухолевого материала 1-2 см 3. Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли стандартным методом на градиенте фиккола-урографина [12]. Определение ИЦК и обработка результатов Анализ цитотоксического эффекта проводился с помощью оценки лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [13] в кондиционной среде при совместном культивировании человеческой популяции клеток (ДК+МНК) и клеточной линии MCF-7. Процедура проводилась согласно инструкции производителя набора "Promega". ИЦК вычисляли по следующей формуле: ИЦК = [Ne - Nsl]/[Nel - Nsl]100%,где Ne - количество лизированных клеток-мишеней, измеренных для данного пациента,Nsl - количество клеток-мишеней, подвергнувшихся спонтанному лизису в контроле,Nel - полное количество клеток-мишеней. Статистическая обработка результатов производилась при помощи программы "Statistica 6.0". Выводы В результате проведенного эксперимента установлено, что группы условно здоровых доноров имеют достоверно меньший ИЦК (5,6+-1,5) по сравнению с группами больных РМЖ (22,5+-7) на клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MCF7. При этом обнаружено, что индекс цитотоксичности МНК больных раком молочной железы (позитивных по HLA-A02 и позитивных по Her2) по отношению к линии MCF-7 составляет 26+-4, тогда как индекс цитотоксичности МНК больных раком молочной железы, позитивных по HLA-A02 и негативных по Her2 равен 16,5+-5. Это указывает на значительный вклад в индекс цитотоксичности антигензависимой цитотоксичности, связанной с активацией гамма/дельта Т-лимфоцитов. Таким образом, можно сделать вывод, что метод измерения ИЦК позволяет наджно дискриминировать больных раком молочной железы и условно-здоровых пациентов. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ измерения ИЦК на здоровых донорах,пациентах с подозрительной маммограммой и пациентах с установленным раком молочной железы 1-й стадии [Ohlsson-Wilhelm BM, Wang G. Circulating killer cells in women undergoing needle-directed excisional breast biopsy.// Eur J Histochem. 1994;38 Suppl 1:77-82.]. В работе с использованием нескольких клеточных линий (К 562, Daudi, MCF7, MDA-MB-435) продемонстрировано, что цитотоксичность НКкиллерных клеток у пациентов с раком молочной железы на клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MCF7 вдвое превышает данный показатель по сравнению с пациентами с доброкачественными опухолями молочной железы и втрое - по сравнению со здоровыми донорами. Описанный способ применялся только для исследования пациентов с уже подтвержднным диагнозом 1-й стадии рака молочной железы и не применялся для детекции заболевания на 0-й (не детектируемой) стадии. В других работах исследовались другие виды онкопатологий [8-11], но нигде не ставился вопрос о возможности применения панелей клеточных линий для ранней диагностики большинства новообразований. Целью работы являлось создание универсального способа ранней диагностики рака, основанной на эффекте возрастания ИЦК при развитии процесса неопластической трансформации. Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем: Из периферической крови, инфильтрата опухоли или костного мозга 1) выделяются эффекторные клетки (лейкоциты, мононуклеарные клетки, моноциты (макрофаги), Т или В-лимфоциты, дендритные клетки, НК-клетки, ЛАК-клетки); 2) выделенные клетки добавляются к клеткам-мишеням, экспрессирующим антигены различных видов рака, в совокупности перекрывающих все известные виды раковых заболеваний, в соотношении от 1:0.1 до 500:1, и проводится совместное инкубирование в течение 0,1-360 ч (в модификации метода к клеткам-мишеням могут также предварительно добавляться антитела против соответствующих опухольассоциированных антигенов для последующего измерения индекса цитотоксичности с использованием феномена антителозависимой клеточной цитотоксичности [15]); 3) измеряется ИЦК с использованием Ск 51[3], лактатдегидрогеназного теста [13], витальных красителей [9], проточной цитометрии [14] либо иных методов измерения ИЦК; 4) на основании полученных значений ИЦК делается вывод о наличии или отсутствии начальной стадии онкологического заболевания, а из анализа данных по цитотоксическим индексам на клеточных культурах, экспрессирующих конкретные опухоль-ассоциированные антигены (RACK1, EGFR, LCK и др., табл. 1, делается вывод о наиболее вероятном типе онкологического заболевания. Таблица 1. Клеточные линии, оверэкспрессирующие антигены, существенные для ранней диагностики онкологических заболеваний Данная таблица не исчерпывает возможные клеточные линии, пригодные для ранней диагностики онкологических заболеваний. Количественная величина индекса цитотоксичности зависит от метода его измерения, времени инкубации клеток-эффекторов с клетками-мишенями, соотношения концентраций мишень:эффектор, типа используемых клеточных культур и иных параметров, поэтому для каждой конкретной реализации данного метода выявления онкологических заболеваний требуется первоначальное определение средних индексов цитотоксичности здоровых доноров на выбранной панели клеточных линий, с которыми в дальнейшем и будут сравниваться измерения ИЦК обследуемого пациента. Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является использование панели клеточных линий, экспрессирующих антигены различных видов рака, что позволяет не только выявить развитие онкологического процесса на стадиях, когда затруднена детекция иными методами, но и классифицировать данный процесс. Техническим результатом изобретения является создание диагностической тест-системы для ранней диагностики онкологических заболеваний. Примеры осуществления изобретения Пример 1. Больной Л., 59 лет, первая стадия рака кишечника. ИЦК на панели клеточных линий, предоставлен-3 024436 ных ФБУН ГНЦ ББ "Вектор" и ИЦиГ СО РАН. На наличие онкологического заболевания указывают высокие уровни ИЦК на линиях K-562, НТ 29,MCF7. На то, что это рак кишечника, указывает высокий уровень ИЦК на линии MOLT-4. Пример 2. Больная, 47 лет. Первая стадия рака молочной железы. На наличие онкологического заболевания указывают высокие уровни ИЦК на линиях K-562, НТ 29,MCF7. На то, что это рак молочной железы, указывает высокий уровень ИЦК на линии HL-60(TB). Пример 3.Больной, 46 лет. Первая стадия немелкоклеточного рака лгкого. На наличие онкологического заболевания указывают высокие уровни ИЦК на линиях K-562, НТ 29,MCF7. На то, что это немелкоклеточный рак лгкого, указывает высокий уровень ИЦК на линии А 549/АТСС. Пример 4. Больной Л., 51 год, первая стадия рака простаты. На наличие онкологического заболевания указывают высокие уровни ИЦК на линиях K-562, НТ 29,MCF7. На то, что это рак простаты, указывает высокий уровень ИЦК на линии RPMI-8226. На наличие онкологического заболевания указывают высокие уровни ИЦК на линиях K-562, НТ 29,MCF7. На то, что это меланома, указывает высокий уровень ИЦК на линии CCRF-CEM. Литература ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ ранней диагностики онкологических заболеваний, включающий выделение эффекторных клеток иммунной системы пациента и измерение индекса цитотоксичности (ИЦК) данных клеток на клеточных линиях различных видов злокачественных опухолей человека и животных, в случае, когда ИЦК данного пациента, измеренный на выбранных клеточных линиях, достоверно больше ИЦК для здоровых доноров, предварительно определнных для выбранного метода измерения ИЦК на данных клеточных линиях, делают вывод о наличии начальной стадии онкологического заболевания, затем выявляют клеточную линию с максимальным значением ИЦК и по ее типу делают вывод о наиболее вероятном типе онкологического заболевания. 2. Способ по п.1, в котором, в случае когда ИЦК пациента, измеренный на линии А 549/АТСС, достоверно больше ИЦК для здоровых доноров, предварительно определнных для выбранного метода измерения ИЦК на данной клеточной линиии, делают вывод о наличии начальной стадии немелкоклеточного рака лгкого. 3. Способ по п.1, в котором, в случае когда ИЦК пациента, измеренный на линии CCRF-CEM, достоверно больше ИЦК для здоровых доноров, предварительно определнных для выбранного метода измерения ИЦК на данной клеточной линии, а ИЦК, измеренные для данного пациента на линиях HL60(TB), MOLT-4, RPMI-8226, не превышают ИЦК для здоровых доноров, делают вывод о наличии начальной стадии меланомы. 4. Способ по п.1, в котором, в случае когда ИЦК данного пациента, измеренный на линии HL60(TB), достоверно больше ИЦК для здоровых доноров, предварительно определнных для выбранного метода измерения ИЦК на данной клеточной линии, а ИЦК, измеренные для данного пациента на линияхCCRF-CEM, MOLT-4, RPMI-8226, не превышают ИЦК для здоровых доноров, делают вывод о наличии начальной стадии рака груди. 5. Способ по п.1, в котором, в случае когда ИЦК пациента, измеренный на линии MOLT-4 , достоверно больше ИЦК для здоровых доноров, предварительно определнных для выбранного метода измерения ИЦК на данной клеточной линии, а ИЦК, измеренные для данного пациента на линиях CCRFCEM, HL-60(ТВ), RPMI-8226, не превышают ИЦК для здоровых доноров, делают вывод о наличии начальной стадии рака кишечника. 6. Способ по п.1, в котором, в случае когда ИЦК пациента, измеренный на линии RPMI-8226, достоверно больше ИЦК для здоровых доноров, предварительно определнных для выбранного метода измерения ИЦК на данной клеточной линии, а ИЦК, измеренные для данного пациента на линиях CCRFCEM, HL-60(ТВ), MOLT-4, не превышают ИЦК для здоровых доноров, делают вывод о наличии начальной стадии рака простаты.