Способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний

(56) Приезжев Л.В. и др. Лазерная диагностика в биологии и медицине. Москва, Наука, Главная редакция физико-математической литературы,1989, с. 211, абз. 2-3, с. 212, абз. 3, с. 216, абз. 2,рис. 7.9 Н.А. Немконич и др. Спектроскопия молекулярного эффекта Штарка дифлавонола и неоднородное уширение его электронных спектров в мембранах эритроцитов. Оптика и спектроскопия, 2011, том 110,4, с. 581, левая кол. Изобретение относится к биомедицинской оптике и касается проблемы экспрессной и высокочувствительной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Целью изобретения является повышение точности диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики сердечно-сосудистых заболеваний,основанному на оптическом возбуждении флуоресцентных зондов в мембранах эритроцитов крови, регистрации характеристик люминесценции зондов и сравнении этих характеристик для больных и здоровых людей, используют флуоресцентные зонды с внутримолекулярным переносом протонов, обладающие дуальной люминесценцией, длительность импульса возбуждения выбирают меньше времени жизни возбужденного состояния зонда, регистрируют мгновенные спектры флуоресценции через ряд временных интервалов и по соотношению интенсивностей двух максимумов мгновенных спектров флуоресценции больных и здоровых производят диагностику заболевания. Внедрение данного способа в медицинскую практику позволит значительно сократить временные и экономические затраты на диагностику сердечно-сосудистых заболеваний. Использование способа для анализа крови может быть успешно использовано при диагностике других заболеваний. Кроме того, данный способ позволит определять степень каждого заболевания.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ ФИЗИКИ ИМЕНИ Б.И. СТЕПАНОВА НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) Изобретение относится к биомедицинской оптике и касается проблемы экспрессной и высокочувствительной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. В последнее время большое количество работ посвящено поиску экспрессных и высокочувствительных методов диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Наиболее перспективным направлением в решении этой задачи в настоящий момент считается использование оптических методов, в том числе метода флуоресцентных зондов. Указанный метод открывает принципиально новые возможности при исследовании различных биомедицинских систем благодаря тому, что флуоресценция зондов зависит от структуры и физико-химических свойств окружения, а современная аппаратура позволяет регистрировать флуоресценцию одной отдельно взятой молекулы. В последнее время синтезированы новые флуоресцентные зонды, обладающие такими преимуществами, как высокая чувствительность к микрохарактеристикам окружения, нетрадиционный спектральный отклик и простота в применении. Такие зонды все больше используются в клинической практике. Известен способ диагностики ишемической болезни сердца - стенокардии и инфаркта миокарда,основанный на использовании флуоресцентного зонда и определении по интенсивности его флуоресценции константы связывания с мембранами эритроцитов, которая отличается у больных и здоровых людей[1]. Константа связывания зонда с мембранами клеток крови определяется графически из наклона линии зависимости концентрации флуорофора в мембране от его концентрации в физиологическом растворе. Недостатком данного способа является его низкая точность, обусловленная тем, что флуоресцентные зонды имеют несколько типов центров связывания с мембраной и зависимость концентрации флуорофора в мембране от его концентрации в физиологическом растворе носит нелинейный характер. Поэтому из наклона вышеуказанной зависимости нельзя с высокой точностью определить константу связывания. Кроме того, варьирование концентрации зонда в физиологическом растворе (титрование) занимает значительное время. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ диагностики сердечнососудистых заболеваний, основанный на использовании флуоресцентного зонда и регистрации его стационарного спектра испускания в мембранах эритроцитов, по форме и положению максимума которого можно диагностировать тип сердечно-сосудистого заболевания [2]. Известный способ имеет низкую точность диагностики, обусловленную искажением спектра флуоресценции зонда из-за поглощения гемоглобина, который содержится в крови, а также тем, что используемый зонд имеет только один максимум в спектре флуоресценции. Целью изобретения является повышение точности диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, основанному на оптическом возбуждении флуоресцентных зондов в мембранах эритроцитов крови, регистрации характеристик люминесценции зондов и сравнении этих характеристик для больных и здоровых людей, используют флуоресцентные зонды с внутримолекулярным переносом протонов, обладающие дуальной люминесценцией, длительность импульса возбуждения выбирают меньше времени жизни возбужденного состояния зонда, регистрируют мгновенные спектры флуоресценции через ряд временных интервалов и по соотношению интенсивностей двух максимумов мгновенных спектров флуоресценции больных и здоровых производят диагностику заболевания. Пример. Проведены исследования разрешенных во времени (мгновенных) спектров флуоресценции зонда 4'-(диэтиламино)-3-гидроксифлавон (FET) в мембранах эритроцитов крови доноров и больных ишемической болезнью сердца. Структурная формула FET приведена на фиг. 1. Клетки (тени) эритроцитов приготавливались для экспериментов по стандартной методике, предложенной Доджем, из крови, взятой у доноров в РНПЦ гематологии и трансфузиологии и в РНПЦ кардиологии Минздрава РБ у пациентов с ишемической болезнью сердца. Консервированную кровь, охлажденную до 2-4 С, центрифугировали при 5000g в течение 10 мин, затем супернатант удаляли, а оставшиеся эритроциты еще 3 раза отмывали изотоническим раствором аналогичным образом. Полученную пасту эритроцитов помещали в гипотонический натрий-фосфатный буфер (также охлажденный до 2-4 С) и центрифугировали при 15000g в течение 20 мин. Затем супернатант сливали и осадок еще 4-5 раз отмывали от гемоглобина, используя тот же буфер. Зонд вводился в мембраны эритроцитов путм добавления его концентрированного раствора в этаноле к суспензии теней в физиологическом растворе.FET является новым флуоресцентным зондом, это соединение обладает дуальной флуоресценцией из-за одновременного существования в возбужденном состоянии двух молекулярных форм: нормальной(N) и фототаутомерной (Т). Фототаутомер образуется вследствие внутримолекулярного переноса протона после акта оптического возбуждения. Спектры флуоресценции FET в биологических мембранах имеют две хорошо разрешенные полосы флуоресценции, одна из которых соответствует испусканию нормальной формы (N), а другая - фототаутомеру (Т) флавонола. Соотношение интенсивностей спектров флуоресценции нормальной (коротковолновой) и фототаутомерной (длинноволновой) форм зависит от полярности окружения, наличия ионов и воды. Мгновенные спектры флуоресценции измерены на лазерном спектрофлуориметре (фиг. 2). В установке образец крови в термостатируемом кюветном отделении 3 возбуждается излучением азотного лазера 1 (=337,1 нм, t1/2=1,5 нс, частота повторения импульсов до 50 Гц, пиковая мощность Р=200 кВт). Излучение азотного лазера 1 направляется в кюветное отделение 3 зеркалом 10. Часть излучения азотного лазера 1 с помощью пластинки 9 ответвляется на фотоэлемент 2 (ФЭК 16), сигнал с которого осуществляет синхронизацию стробируемого вольтметра 7 (В 4-24, полоса пропускания 1 ГГц). Перестройка длины волны регистрации осуществляется двойным дифракционным монохроматором 4 (дисперсия 6 /мм),снабженным шаговым двигателем, управляемым компьютером 8 (IBM PC AT) через интерфейс 6. Сигнал флуоресценции на выходе монохроматора 4 регистрируется фотоэлектронным умножителем 5 (ФЭУ 164, временное разрешение 2 нс) и поступает на вход стробируемого вольтметра 7, а затем в компьютер 8. На фиг. 3-5 приведены мгновенные спектры флуоресценции FET, введенного в мембраны эритроцитов донора и двух больных с разной степенью заболевания ишемической болезнью сердца. Время регистрации спектра 1-0 нс (максимум импульса возбуждения), спектра 2-3 нс и спектра 3-7 нс. Исследования показали высокую спектральную чувствительность зонда FET к микрохарактеристикам мембран. Видна различная интенсивность полос испускания нормальной формы флавонола (максимум около 484 нм) и фототаутомера (максимум около 573 нм). Полученное из данных измерений отношение I484/I573 интенсивностей максимумов флуоресценции нормальной формы (I484) (максимум флуоресценции 484 нм) и фототаутомера (I573) (максимум флуоресценции 573 нм) в тенях эритроцитов отличается для разных образцов и зависит от времени регистрации. Значения отношений интенсивностей приведены в таблице. Указанный выше эффект объясняется отличием микрохарактеристик мембран эритроцитов здоровых людей и больных вследствие патологических изменений, вызванных заболеванием. Внедрение данного способа в медицинскую практику позволит значительно сократить временные и экономические затраты на диагностику сердечно-сосудистых заболеваний. Применение способа для анализа крови может быть успешно использовано при диагностике других заболеваний. Кроме того, данный способ позволит определить степень каждого заболевания. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе. 1. Соминский В.Н., Блума Р.К., Калниня И.Э. Связывание флуоресцентного зонда ДСМ с мембраной эритроцитов в норме и при некоторых заболеваниях. Биологические мембраны. 1986, т. 3,3,с. 282-286. 2. Kalnina I. and Toma M.M., Use of the fluorescent probe DSM in studies of the structural and functionalchanges of the erythrocyte membrane, J. Fluorescence. 2004, vol. 14, p. 41-47. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, основанный на оптическом возбуждении флуоресцентного зонда в мембранах эритроцитов крови, регистрации характеристик люминесценции зонда и сравнении этих характеристик для больных и здоровых людей, отличающийся тем, что используют зонд 4'-(диэтиламино)-3-гидроксифлавон с внутримолекулярным переносом протона, регистрируют мгновенные спектры флуоресценции с задержкой 7 нс и более по отношению к максимуму возбуждающего импульса и по соотношению интенсивностей мгновенных спектров флуоресценции на длинах волн 484 и 573 нм производят диагностику заболевания.