Промотор дифференциации и кератинизации эпидермальной клетки и функциональный напиток/питание для ускорения кератинизации эпидермиса

ПРОМОТОР ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ И КЕРАТИНИЗАЦИИ ЭПИДЕРМАЛЬНОЙ КЛЕТКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ НАПИТОК/ПИТАНИЕ ДЛЯ УСКОРЕНИЯ КЕРАТИНИЗАЦИИ ЭПИДЕРМИСА Настоящее изобретение относится к функциональному питанию и напитку, которые оказывают при пероральном приеме усиливающий эффект на нормальную эпидермальную кератинизацию,и к промотору эпидермальной дифференцировки и кератинизации для использования в таком функциональном питании и напитке. Промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации согласно настоящему изобретению содержит в качестве активного компонента ферментированную молочную сыворотку, полученную при ферментации молока бактериями, включающими молочно-кислые бактерии, такие как Lactobacillus helveticus. Функциональное питание и напиток для усиления эпидермальной кератинизации согласно настоящему изобретению содержит промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации. 013926 Настоящее изобретение относится к промотору эпидермальной дифференцировки и кератинизации,функциональному питанию и напитку для ускорения кератинизации эпидермиса, которые эффективны по излечиванию различных кожных проблем, связанных с сухой или шероховатой кожей, или группы различных кожных расстройств, сопровождаемых паракератозом, таких как псориаз или ксеродерма, за счет усиления дифференциации эпидермальных клеток с целью ускорения, в свою очередь, процесса нормальной кератинизации эпидермиса. Эпидермис, который представляет собой наружный слой кожных тканей, непосредственно подвергается воздействию факторов окружающей среды и в этой связи может повреждаться различными физическими или химическими стимулами. Эпидермальные клетки непрерывно замещаются по мере появления новых в нижнем слое эпидермиса, базальном слое и затем движутся к внешнему слою. Такое замещение носит название эпидермальный оборот. В указанном процессе эпидермальные клетки подвергаются четырем стадиям дифференцировки, таким как базальные клетки, шиповатые клетки, гранулярные клетки и корнеоциты, которые в итоге подвергаются десквамации и отшелушиваются от кожной поверхности. Этот процесс обычно занимает примерно 14 дней, в течение которого базальные клетки подвергаются кератинизации в корнеоциты и еще примерно 14 дней необходимо для того, чтобы корнеоциты подверглись десквамации аналогично тому, как отшелушивается грим. Таким образом, происходит постоянное обновление эпидермиса, которое в целом представляет собой 4-6-недельный цикл. Корнеоциты здорового эпидермиса расслаиваются примерно на 15 слоев с образованием корнеального слоя (stratum corneum). Указанный слой (stratum corneum) обладает прекрасной барьерной функцией, предотвращающей испарение влаги с поверхности тела и также инвазию чужеродных веществ, таких как чужеродный антиген, или перенос чужеродного стимула внутрь тела и в этой связи играет важную роль в биофилаксии. Однако у пациентов с различными кожными расстройствами, такими как атопический дерматит, ксеродерма или псориаз, образование здорового корнеального слоя (stratum corneum) нарушено. Аномалия образования stratum corneum, включая паракератоз, вызывает подавление барьерных функций кожи, что в результате приводит к неблагоприятному для организма испарению влаги, инвазии чужеродных веществ или переносу внешних стимулов в организм, которые, по имеющимся данным, ведут к сухости кожи или вызывают индукцию или усугубление различных кожных расстройств. Кроме того, когда нарушается указанный метаболизм и кератинизация не протекает нужным образом, stratumcorneum кожи становится толще, вызывая шероховатость кожи, такую как сухость кожи или стянутость кожной поверхности. Таким образом, кератоноз представляет собой проблему также с косметической точки зрения. Для ослаблениия такого рода кожных расстройств или для поддержания здорового состояния кожи предлагаются некоторые методы излечивания кожных проблем с использованием определенного компонента. Например, в патентной публикации 1 предлагается добавлять вещество, близкое к кремниевой кислоте к косметическим средствам или подобным препаратам, с предполагаемой целью усиления эффекта эпидермальной кератинизации. В области косметики и кожных препаратов, направленных на наружное применение, были проведены исследования компонентов, имеющих такой эффект, но не было идентифицированного активного компонента, который был бы применим в контексте питания или напитка. Вполне возможно, что резонно использовать указанные выше препараты для наружного применения на коже также в питании и в напитке, но остается неясным, какой эффект может быть достигнут при их фактическом применении. Патентная публикация 1: Патент Японии 3227328. Краткое описание сущности изобретения Объектами настоящего изобретения являются функциональное питание и напиток, которые создают при пероральном приеме стимулирующий эффект с достижением нормальной кератинизации эпидермиса, а также промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации с целью использования таких функциональных питаний и напитков. В соответствии с настоящим изобретением предлагается промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации, включающей в качестве активного компонента ферментированную молочную сыворотку, полученную при ферментации молока бактериями, включающими молочно-кислые бактерии. Согласно настоящему изобретению предлагаются функциональное питание и напиток для усиления эпидермальной кератинизации, включающие указанный выше промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации. Согласно настоящему изобретению также предлагается использование ферментированной молочной сыворотки, полученной при ферментации молока бактериями, включающими молочно-кислые бактерии, для получения промотора эпидермальной дифференцировки и кератинизации, или функционального питания, или напитков для усиления эпидермальной кератинизации. Активным компонентом промотора эпидермальной дифференцировки и кератинизации, а также функционального питания и функционального напитка, направленных на усиление эпидермальной кератинизации является ферментированная молочная сыворотка, безопасность которой была подтверждена при ее пероральном приеме. Таким образом, прекрасный усиливающий эффект эпидермальной кератинизации может быть достигнут при пероральном приеме, безопасность которого подтверждена и непре-1 013926 рывный прием, как ожидается, будет обеспечивать подавление сухости или шероховатости кожи, вызванных сезонными изменениями или изменением климата, и улучшение симптомов различных кожных расстройств, характеризующихся паракератозом, таким как атопический дерматит, ксеродерма или псориаз. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана фотокопия микрофотографии, демонстрирующей результат анализа экспрессии маркера белков дифференцировки, согласно примеру 1. На фиг. 2 показана фотография, демонстрирующая стимулирующий эффект экспрессии кератина 10 на уровне мРНК, согласно процедуре, описанной в примере 1. На фиг. 3 показан график, демонстрирующий стимулирующий эффект экспрессии инволюкрина на уровне мРНК, согласно процедуре, описанной в примере 1. На фиг. 4 показан график, демонстрирующий изменение экспрессии маркера дифференцировки(кератин 10) с течением времени, в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. На фиг. 5 показан график, демонстрирующий изменение экспрессии маркера дифференцировки(инволюкрин) с течением времени, в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. На фиг. 6 показан график, демонстрирующий результаты оценки цитотоксичности в тесте, описанном в примере 1. Подробное описание изобретения Промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации согласно настоящему изобретению содержит в качестве активного компонента ферментированную молочную сыворотку, полученную при ферментации молока бактериями, включающими молочно-кислые бактерии. Молочно-кислые бактерии могут включать бактерии, принадлежащие к роду Streptococcus,Lactococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium или аналогичные, при этом Lactobacillus являются наиболее предпочтительными. Более конкретно, могут использоваться Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillushelveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus fermentum, при этом наиболее предпочтительным является Lactobacillus helveticus. Предпочтительно использовать штамм Lactobacillus helveticus, обладающий высокой внеклеточной протеиназной активностью. Например, предпочтительность штамма, характеризующегося показателем Ед/ОП 590 не ниже чем 400 при определении данного показателя в соответствии с методом Ямамото с соавт. (Yamamoto N. et al., J. Biochem. (1993), 114, 740), проводимом на основе методики Твининга с соавт. (Twining, S., Anal. Biochem. 143, 3410 (1984. Конкретно могут использоваться штаммы Lactobacillus helveticus, обладающие следующими бактериологическими свойствами. Бактериологические свойства 1. Морфологические свойства. 1) Форма клеток: палочки. 2) Подвижность: отсутствует. 3) Образование спор: отсутствует. 4) Окрашивание по Граму: положительно. 2. Физиологические свойства. 1) Образование каталазы: отрицательно. 2) Образование индола: отрицательно. 3) Восстановление нитрата: отрицательно. 4) Аэробный рост: факультативный анаэроб. 5) Образование DL (-) молочной кислоты из глюкозы при гомолактоферментации без образования газов. 6) Разложение углеводов: глюкоза: + лактоза: + манноза: + фруктоза: + галактоза: + сахароза: мальтоза: ксилоза: рамноза: целлобиоза: трехалоза: мелибиоза: раффиноза: стахиоза: маннит: -2 013926 сорбит: эскулин: салицин: Примером таких предпочтительных штаммов Lactobacillus helveticus является Lactobacillushelveticus CM-4 (депонирован Международным депозитарием запатентованных организмов, Национальный институт промышленной науки и технологии (International Patent Organism Depositary, NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi,Ibaraki, Japan), с номером доступа FERM BP-6060 15 августа 1997 г.), далее называемый как штамм СМ-4. Штамм СМ-4 был депонирован с указанным выше номером доступа в соответствии с Будапештским договором по международному признанию депонирования микроорганизмов с целью приведения патентных процедур и уже запатентован. Ферментированная молочная сыворотка может быть получена при добавлении ферментированной молочной закваски, содержащей молочно-кислые бактерии, к молоку при соответствующем подборе условий ферментации, таких как температура ферментации, и далее проводится ферментация молока в выбранных условиях. Ферментированная молочная сыворотка в качестве активного компонента может быть получена при отделении сыворотки от ферментированного молока с использованием обычных процедур отделения,таких как центрифугирование или фильтрование. Ферментированное молоко само по себе, per se без отделения или отделенное сывороткой может использоваться с применением или без применения соответствующих процедур фракционирования, концентрирования, очистки и подобных процедур, и сыворотка или ее концентрат могут быть переведены в порошковую форму путем лиофилизации или распылительной сушки. Молочно-кислые бактерии предпочтительно имеют форму предварительно культивируемой закваски, обладающей достаточно высокой активностью. Исходное число клеток может составлять предпочтительно 105-109 клеток/мл. Ферментированная молочная сыворотка в качестве активного компонента может быть также получена при совместной ферментации с молочно-кислыми бактериями и дрожжами для улучшения вкуса и приятных ощущений, когда ферментированная молочная сыворотка используется в функциональном питании и напитке, таких как пища для специфических вариантов использования в определенных состояниях здоровья, или в функциональном питании и напитке, которые оказывают эффект по усилению эпидермальной кератинизации. Штаммы используемых дрожжей конкретно не ограничиваются, и предпочтительно могут быть использованы, например, дрожжи Saccharomyces, такие как Saccharomycescerevisiae. Содержание дрожжей может быть соответствующим образом подобрано в зависимости от поставленной цели. Материал молочной закваски может представлять собой, например, молоко животного, такое как коровье молоко, молоко лошади, овечье или козье молоко; молоко, полученное из растительной пищи,такое как соевое или обработанное молоко, такое как обезжиренное, восстановленное, порошковое или конденсированное молоко. Среди указанных вариантов особенно предпочтительными являются коровье молоко, соевое молоко и обработанные варианты указанных видов молока, при этом коровье молоко и обработанный вариант коровьего молока являются особенно предпочтительными. Содержание твердых веществ конкретно не ограничивается и, например, в случае сепарированного молока твердое нежировое содержание может обычно составлять примерно 3-15 вес.% и может также составлять 6-15 вес.%, в плане их продуктивности. Ферментация может обычно проводиться в статической или перемешиваемой культуре, например,при температуре 25-45 С, предпочтительно при температуре 30-45 С в течение 3-72 ч, предпочтительно в течение 12-36 ч, и ферментация может быть остановлена, когда кислотность молочно-кислых бактерий достигнет показателя 1,5 или выше. Промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации согласно настоящему изобретению может необязательно содержать в дополнение к активному компоненту в виде ферментированной молочной сыворотки другие стандартные компоненты, обладающие стимулирующим эффектом на эпидермальную дифференцировку и кератинизацию, а также различные добавки, такие как эксципиенты, в зависимости от используемой формы. Обязательный активный компонент промотора эпидермальной дифференцировки и кератинизации согласно настоящему изобретению представляет собой ферментированную молочную сыворотку, и ее пероральная дозировка может быть выбрана таким образом, чтобы достичь желаемого эффекта с учетом длительности приема, непрерывности или других аналогичных факторов. Дневная доза обычно составляет от 1 до 1000 мл ферментированной молочной сыворотки в расчете на индивидуума, предпочтительно от 10 до 200 мл в расчете на индивидуума. Промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации согласно настоящему изобретению может приниматься даже после начала проявления симптомов паракератоза или в определенные сезоны для предотвращения развития таких симптомов либо непрерывно ежедневно, либо в перемежающемся режиме.-3 013926 Функциональное питание и напиток согласно настоящему изобретению представляют собой питание и напиток, содержащие промотор эпидермальной дифференцировки и кератинизации согласно настоящему изобретению, и могут быть представлены, например, в виде пищи для специфического варианта применения при определенных состояниях здоровья, который предлагается с профилактической целью или с целью улучшения в плане усиления эпидермальной кератинизации, или как функциональное питание и напиток, предлагаемые как оказывающие эффект по ускорению эпидермальной кератинизации. Функциональное питание и напиток согласно настоящему изобретению могут необязательно содержать добавки, такие как сахара, белки, липиды, витамины, минералы, вкусовые агенты или их смеси. Кроме того, могут содержаться компоненты молока, из которого была отделена ферментированная молочная сыворотка. В функциональном питании и напитке согласно настоящему изобретению содержание промотора эпидермальной дифференцировки и кератинизации согласно настоящему изобретению может быть соответствующим образом подобрано в зависимости от формы или вида питания и напитка. Указанное содержание может быть соответствующим образом выбрано также в зависимости от непрерывности приема функционального питания и напитка или аналогичных факторов и конкретно не ограничивается. Подходящее содержание может обычно представлять собой от 0,1 до 100 вес.%, предпочтительно от 10 до 90 вес.% с точки зрения активного компонента в виде ферментированной молочной сыворотки. Функциональное питание и напиток могут иметь форму, например, ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт или напитки с молочно-кислыми бактериями, различные обработанные виды пищи и напитка, содержащие ферментированную молочную сыворотку или их концентрат, сухие порошки, таблетки, капсулы, гранулы и т.п. Доза и время приема функционального питания и напитка согласно настоящему изобретению особенно не ограничиваются и предпочтительно принимать функциональное питание и напиток в таком количестве, чтобы в основном достигалась указанная выше доза активного компонента. Например,функциональное питание и напиток согласно настоящему изобретению могут приниматься непрерывно или в перемежающемся режиме до или после воздействия факторов окружающей среды, которые требуют ускорения эпидермальной кератинизации. Примеры Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры, которые являются лишь иллюстративными и никоим образом не ограничивают настоящее изобретение. Пример 1. Молочную среду, состоящую из сепарированного молока с 9 вес.% содержания твердых веществ,инокулируют 3%-ной закваской, содержащей СМ-4 (число клеток 5108 клеток/мл), и проводят ферментацию статических условий при температуре 37 С в течение 24 ч с получением ферментированного молока. Далее ферментированное молоко центрифугируется со скоростью 12000 G в течение 20 мин и осадок удаляют, получая ферментированную молочную сыворотку. При использовании полученной ферментированной молочной сыворотки проводят указанные ниже тесты. Тест для оценки эффекта по ускорению дифференцировки и тест на цитотоксичность 1) Метод.(а) Культивируемые эпидермальные клетки и среда для культивирования. Используют коммерчески доступные нормальные человеческие эпидермальные клетки (полученные от компании KURABO INTERNATIONAL LTD.) и культуральную среду (Humedia-KG2).(b) Культура клеток. Число клеток в культуре нормальных эпидермальных клеток человека доводят с использованием указанной среды до показателя 5,652104 клеток/мл. Высевают в культуральной чашке размером 60 мм по 5 мл клеток и проводят культивирование в статических условиях при температуре 37 С в течение 24 ч в атмосфере 95% (об./об.) воздуха - 5% (об./об.) газообразной двуокиси углерода. Затем указанную среду заменяют той же самой средой, содержащей ферментированную молочную сыворотку с конечной концентрацией 0,03, 0,1, 0,3 или 1%, или очищенный водой в качестве контроля и проводят далее ферментацию в статических условиях в течение 24 ч. С другой стороны, для анализа временных показателей среду заменяют той же самой средой, содержащей ферментированную молочную сыворотку в конечной концентрации 1%, далее проводят ферментацию в статических условиях в течение 0, 1, 2, 4, 6 или 8 дней.(с) Анализ экспрессии маркера дифференцировки с использованием иммунологического окрашивания. После культивирования в течение 24 ч в присутствии/в отсутствие 1% ферментированной молочной сыворотки, как было описано выше в (b), клетки фиксируют с использованием смеси 4% парафармельдегида-ФБР и блокируют 10%-ной сывороткой кролика в ФБР. Мышиное антитело против цитокератина 10(производство компании Dako) или мышиное антитело против инволюкрина (производство компанииYLEM) подвергают реакции при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем клетки промывают ФБР и подвергают реакции с кроличьим иммуноглобулиновым антителом против мышиного антигена, мечен-4 013926 ного пероксидазой (производство компании Dako), при комнатной температуре в течение 30 мин. Клетки снова промываются с использованием ФБР и окрашивают системой субстрат DAB-хромоген (производство компании Dako). Полученные результаты показаны на фиг. 1. На фиг. 1 приведены микрофотография (а,) в которой показаны результаты оценки экспрессии кератина 10 в отсутствие ферментированной молочной сыворотки, и микрофотография (b), в которой показаны соответствующие результаты присутствия ферментированной молочной сыворотки в конечной концентрации 1%. На микрофотографии (с) показан результат оценки экспрессии инволюкрина в отсутствие ферментированной молочной сыворотки и на микрофотографии (d) показан соответствующий результат в присутствии ферментированной молочной сыворотки в конечной концентрации 1%.(d) Анализ экспрессии маркера дифференцировки по методу ОТ-ПЦР в масштабе реального времени. После культивирования в течение 24 ч в присутствии/в отсутствие ферментированной молочной сыворотки в разных концентрациях и культивировании в течение времени, необходимого для анализа временных характеристик, где оба варианта описаны выше в (b), культуральный супернатант отсасывают, а оставшиеся клетки промывают дважды буфером Hepes. С использованием мининабора RNeasy(производство компании QIAGEN) из клеток экстрагируют суммарную РНК; 1 нг экстрагированной суммарной РНК подвергают анализу ОТ-ПЦР в масштабе реального времени с использованием набора для ОТ-ПЦР One Step SYBR RT-PCR Kit (торговое наименование, производство компании TaKaRa) в циклической системе Smart Cycler II System (производство компании CEPHEID) в соответствии с протоколом компании с использованием праймеров, приведенных в табл. 1, для количественной оценки экспрессии мРНК кератина 10, мРНК инволюкрина и мРНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы(GAPD). Полученные показатели экспрессии стандартизуют при делении на показатели экспрессии мРНК GAPD, где указанная экспрессия происходит в том же количестве в любых клетках, и полученные значения выражают в относительных единицах применительно к показателю, полученному для концентрации 0% ферментированной молочной сыворотки в среде, как было указано в приведенном выше (b)(контроль), где указанное значение было принято за 1. Полученные результаты показаны на фиг. 2-5. На фиг. 4 и 5 черные кружки обозначают результаты, полученные в присутствии ферментированной молочной сыворотки, а белые кружки указывают на результаты, полученные в отсутствие ферментированной молочной сыворотки.(е) Тест на цитотоксичность. Нормальные эпидермальные клетки человека культивируют в присутствии образца при разных концентрациях в течение 48 ч таким же образом, как было указано в приведенном выше (b), и подвергают тесту на цитотоксичность с использованием реагента Alamar Blue (производство компании NACALAITESQUE, INC) в соответствии с протоколом компании. Полученные результаты показаны на фиг. 6. Таблица 1 Из данных, приведенных на фиг. 1, видно, что уровень экспрессии кератина 10 и инволюкрина не наблюдается в отсутствие ферментированной молочной сыворотки, но наблюдается в усиленном виде при добавлении ферментированной молочной сыворотки. Из данных, приведенных на фиг. 2 и 3, видно, что уровень экспрессии кератина 10 и инволюкрина повышается в зависимости от добавленной ферментированной молочной сыворотки. Из данных, приведенных на фиг. 4 и 5, видно, что ферментированная молочная сыворотка усиливает экспрессию маркеров эпидермальной дифференцировки, кератина 10 и инволюкрина. Из данных, приведенных на фиг. 6, видно, что цитотоксичность отсутствует при добавлении ферментированной молочной сыворотки. Пример 2. Для того чтобы ферментированная молочная сыворотка, полученная в примере 1, была приемлема для питья, 90 вес.ч. ферментированной молочной сыворотки, 0,25 вес.ч. вкусовых агентов, 0,05 вес.ч. аспартама и 9,70 вес.ч. воды смешивают с получением напитка, содержащего ферментированную молочную сыворотку. Полученный напиток подвергают следующим оценочным тестам. Оценка изменения площади корнеоцита при пероральном приеме По методу отшелушивания липкой ленты в варианте использования для этого целлофановой ленты(производство компании NACHIBAN CO., LTD) корнеоциты в самом верхнем слое кожи на левой щеке удаляют, переносят на предметное стекло и фиксируют там. Фиксированные клетки окрашивают бриллиантовым зеленым-генцианом фиолетовым (BG) и на компьютере получают изображение окрашенных клеток. Анализируя картину окрашивания BG, определяют площадь корнеоцита.-5 013926 Указанный выше оценочный тест проводят из образцов, отобранных у 16 мужчин в возрасте от 24 до 43 лет со средним показателем возраста 29,4 года. Вначале тест проводят до приема образца и определяют среднее значение для группы образцов. Затем группам дают по 150 г в день напитка, содержащего ферментативную молочную сыворотку, ежедневно в течение 9 недель и указанный оценочный тест проводят по тому же способу через 9 недель, получая среднее значение показателей для всей группы. Полученные результаты показаны в табл. 2. Таблица 2 Из табл. 2 видно, что площадь корнеоцита увеличивается на 27 после 9 недель приема в группе, которая принимала напиток, содержащий ферментированную молочную сыворотку, что позволяет полагать, что длительный прием напитка, содержащего ферментированную молочную сыворотку будет стимулировать кератинизацию эпидермиса. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение ферментированной молочной сыворотки, полученной при ферментации молока бактериями, включающими Lactobacillus helveticus, для получения средства или пищевого продукта для снижения сухости или шероховатости кожи, адаптированного для перорального приема, где указанное средство или указанный пищевой продукт действуют на эпидермальные клетки, усиливая эпидермальную дифференцировку и кератинизацию. 2. Применение ферментированной молочной сыворотки по п.1, где Lactobacillus helveticus представляет собой Lactobacillus helveticus CM-4 (депонированный Международным депозитарием запатентованных организмов, Национальный институт промышленной науки и технологий (International Patent