Растительный промотор и содержащие его фрагмент днк и вектор экспрессии

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к растительным промоторам, которые используются для разработки новых разновидностей растений с применением генной рекомбинантной технологии и растительной инженерии, функциональной модификации и т.п., кроме этого они используются для такой инженерии растительных клеток, как функциональная модификация клеток растительной культуры, продуцирующих ценные метаболиты, фрагментам ДНК, в которых полезные гены лигированы с промоторами в таком состоянии, что такие полезные гены могут экспрессироваться, а также к векторам,содержащим фрагменты ДНК. Кроме этого, настоящее изобретение относится к введенным в растения, в том числе в трансгенные растения,регенированные из клеток растений, или растительные клетки указанным фрагментам ДНК или векторам, содержащими данные фрагменты ДНК. Кроме этого, настоящее изобретение относится к способу клонирования указанных растительных промоторов. Описание уровня техники Усовершенствование растений с использованием методов генной инженерии недавно было реализовано на практике [Science, 244, 12931299 (1989)]. Главным образом, значительный прогресс был достигнут в области трансформационной системы с использованием Ti плазмиды и Ri плазмиды, которые содержатся в почвенных бактериях, Agrobacterium tumefaciens иAgrobacterium rhizogenes, вследствие чего такая система может применяться не только на табаке,Arabidopsis и петунии, которые ранее подвергались трансформации, но и таких двудольных растениях, как фасоль Azuki [Тезисы, представленные на конференцию NIHON SHOKUBUTUSOSHIKIBAIYOU GAKKAI (Японская ассоциация культур растительных тканей), с.124 (1990)] и на таких однодольных, как рис [The PlantJournal, 6, 271-282 (1994)]. Кроме этого, для однодольных растений, примером которых является рис, на практике был реализован метод,заключающийся в приготовлении протопласта с последующим переносом гена путем электропорации [Nature, 338, 274-276 (1989)]. Кроме этого, имеется много примеров, в которых гены непосредственно переносятся в растения с использованием специального метода маркирующей вакцинации [The Plant Journal, 6, 275-281(1991)]. Что касается промоторов, индуцирующих тканеспецифичную экспрессию полезных веществ или энзимов, то к настоящему времени выделены гены, которые экспрессируются конкретно в соответствующих тканях семян [SHOKUBUTU SAIBOU KOUGAKU (Plant Cell Technology), 3, 568-576 (1991)], соответствующих тканях листьев и цветов [Science, 250, 931-936(1991)], клубневидных корнях и корневых клубеньках [Science, 250, 948-954 (1990)], и экспрессия под действием таких промоторов была проанализирована в трансгенных растениях. Однако большинство промоторов, используемых до настоящего времени для таких векторных систем, представляют собой промоторы,происходящие из Ti плазмиды, содержащейся в Аgrоbacterium tumefaciens, и промоторы, происходящие из генов мозаичного вируса цветной капусты (CaMV). Такие промоторы конституционно экспрессируют вне зависимости от ростовых фаз и тканей трансгенных растений и не подвержены контролю. Кроме этого, уровень экспрессии характеризуется низкими значениями. Более того, ни один из промоторов, содержащих экспрессионно-регуляторные участки,индуцирующие ткань-специфичную экспрессию, не индуцирует ее на таком сайте и на такой стадии, которые требуются для реконституции ксилоглюкана стенки растительной клетки. Кроме этого, в области клеточной инженерии растений, даже при попытках получить полезный вторичный метаболит в растительных клетках, предназначенный для использования в культурах растительной ткани, известно много случаев, когда экспрессия энзимного гена в биосинтетической системе метаболита подавляется в связи с наличием растительного гормона, существенного для клеточного роста, вследствие чего подавляется продуцирование метаболита[Physioloqia Plantarum, 80, 379-387 (1990)]. В связи с этим, чрезвычайно трудно оптимизировать биосинтез вторичного метаболита клетками в присутствии растительного гормона, необходимого для клеточного роста. Далее, необходимо использовать метод двухстадийной культивации, в котором рост клеток и биосинтез вторичного метаболита осуществляются в различных условиях [Nippon NOUGEIKAGAKU KAISHI (Journal of Agricultural Chemistry Society ofJapan, 60, 849-854 (1986)]. Можно считать, что такое подавление вызывается регуляцией промотора энзимного гена в биосинтетической системе сигналом от растительного гормона и т.п., направленным на подавление экспрессии. В соответствии со сказанным, считается,что биосинтез вторичного метаболита может быть облегчен в условиях клеточного роста путем переноса в клетки химерного гена, в котором упомянутый выше промотор заменен на промотор, индуцирующий обильную экспрессию полезного вещества или энзима в течение периода клеточного роста. Несмотря на это, в данной области техники не известен какой-либо промотор, существенно индуцирующий экспрессию полезного вещества или энзима, особенно в течение периода клеточного роста. Поэтому, если иметь в распоряжении такой промотор, существенно индуцирующий экспрессию 3 полезного вещества или энзима, особенно в течение периода клеточного роста, то можно ожидать осуществления биосинтеза вторичного метаболита при росте клеток и значительного улучшения продуктивности по ценному вторичному метаболиту. Таким образом, в области растительной инженерии и клеточной инженерии растений желательна разработка промоторов, которые способны индуцировать тканеспецифичную экспрессию или контролировать экспрессию с помощью растительного гормона и т.п. Цели изобретения Цель настоящего изобретения заключается в разработке растительного промотора, способного индуцировать тканеспецифичную экспрессию, главным образом на таком сайте и на такой стадии, которые требуются для реконституции ксилоглюкана стенки растительной клетки, и способного контролировать экспрессию в присутствии растительного гормона и т.п., создании фрагмента ДНК, содержащего такой промотор,вектора, содержащего указанный фрагмент ДНК, и использовании указанного фрагмента ДНК или вектора для трансформации растения или растительных клеток, а также в разработке способа клонирования указанного растительного промотора. Краткое изложение сущности изобретения Авторы изобретения обратили внимание на тот факт, что экспрессия гена эндоксилоглюкан-трансферазы (ЕХТ) растительного происхождения и генов такого семейства является тканеспецифичной, и направили свои усилия на разработку промотора, способного контролировать экспрессию, и его вектора. Авторы изобретения также ожидали, что такой промотор может использоваться для улучшения растительных клеток и растений. Затем, авторы изобретения предприняли попытки клонирования области, содержащей промотор, которая предположительно находится в обратном направлении от растительного ЕХТ гена. Однако весьма трудно клонировать промотор ЕХТ гена известным методом гибридизации бляшек в связи с присутствием семейства генов, включающих псевдогены, и понижением бляшко-образующей способности бляшек, полученных приготовлением фага, имеющего фрагмент, содержащий область,расположенную в обратном направлении от ЕХТ гена и его генного семейства, и инфицирования им хозяина. Далее авторы настоящего изобретения провели широкое исследование. В результате авторы изобретения достигли успеха в клонировании промотора ЕХТ гена и проанализировали промоторный участок с целью установления его нуклеотидной последовательности. Такой промоторный участок отщепляли и лигировали в глюкуронидазный (GUS) ген, происходящий из Е.соli, и полученный в результате химерный ген переносили в растительные клетки. 4 Было установлено, что GUS ген интенсивно экспрессирует в клетках, в которые был перенесен ген. В том случае, когда, в соответствии с таким же способом, определяли нуклеотидную последовательность промоторных участков генного семейства ЕХТ гена и ее лигировали с GUS геном, происходящим из Е. coli, и полученный в результате химерный ген переносили в растительные клетки, были получены результаты,подтверждающие интенсивную экспрессиюGUS гена. Кроме этого, методом Нозерн-гибридизации было подтверждено, что ЕХТ ген, содержащий такой промотор, экспрессирует тканеспецифическим образом, особенно на таком сайте и на такой стадии, которые требуются для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, и что существует каждый из ЕХТ гена и его генного семейства, которые содержат промотор, экспрессирующий в течение фазы логарифмического роста или стационарной фазы культивации клеток. Таким образом было сделано настоящее изобретение. Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к растительному промотору, индуцирующему тканеспецифичную экспрессию, и характеризуется тем, что растительный промотор способен контролировать экспрессию гена, кодирующего энзим, выполняющий функцию по осуществлению реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки,и, главным образом, обладает промоторной активностью на участке, требующемся для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, или обладает промоторной активностью на стадии, требующейся для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки. Второй аспект настоящего изобретения относится к растительному промотору по первому аспекту настоящего изобретения и характеризуется тем, что он содержится в любой нуклеотидной последовательности, выбранной изSEQ ID1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 в перечне последовательностей. Третий аспект настоящего изобретения относится к растительному промотору первого аспекта изобретения и характеризуется тем, что он способен гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью по второму аспекту изобретения и обладает промоторной активностью в растениях и растительных клетках или в трансгенных растениях, регенерированных из растительных клеток. Четвертый аспект настоящего изобретения относится к фрагменту ДНК, содержащему растительный промотор по первому, второму или третьему аспектам, и характеризуется тем, что его лигируют с растительным промотором в состоянии, способном к экспрессии полезного гена. Пятый аспект настоящего изобретения относится к вектору и характеризуется тем, что 5 этот вектор содержит растительный промотор по первому, второму или третьему аспектам или фрагмент ДНК по четвертому аспекту. Шестой аспект настоящего изобретения относится к использованию фрагментов ДНК по четвертому аспекту или векторов по пятому аспекту для трансформации растений или растительных клеток с целью контроля морфологии растения. Седьмой аспект изобретения относится к способу клонирования растительного промотора и характеризуется тем, что ген, кодирующий энзим, выполняет функцию по осуществлению реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, и особенно тем, что используется ген, кодирующий эндоксилоглюкан-трансферазу или ее функциональный эквивалент эндоксилоглюкан-трансферазу или ее функциональный эквивалент. Подробное описание изобретения Под термином "промотор", используемом в тексте, подразумевается промотор, который содержит область ТАТА-блока или ТАТА-блок подобные участки, которые находятся на 20-30 пар оснований в обратном направлении от сайта инициации транскрипции (+1) и которые ответственны за инициирование транскрипции РНКполимеразой из точной позиции. Однако он необязательно ограничен именно передним или задним положениями таких участков и может содержать любую другую область, которая требуется для ассоциации белка помимо РНК полимеразы для регуляции экспрессии, кроме упомянутых выше участков. Иногда в описании используется термин"промоторная область" и такой термин подразумевает область, содержащую промотор, описанный в тексте. Под используемым в тексте термином"промоторная активность" подразумевается способность и функциональная возможность продуцирования генного продукта ценного гена вне или внутри хозяина (растения, растительных клеток или трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток), в том случае, когда ценный ген лигируют с сайтом в прямом направлении от промотора с целью экспрессии и затем полученный в результате ген переносят в организм хозяина. Как правило, промоторная активность обозначается как положительная или отрицательная, либо как сильная или слабая, при лигировании гена, кодирующего белок, способный легко анализироваться (ген-репортер), с сайтом в прямом направлении от промотора с целью осуществления экспрессии, переносе полученного в результате промотора в организм хозяина и последующем измерении уровня экспрессии белка. Так например, когда ценный ген лигируют с сайтом в прямом направлении от промотора с целью экспрессии и затем полученный в результате ген переносят в организм хозяина, под 002757 6 тверждение экспрессии генного продукта ценного гена вне или внутри хозяина демонстрирует тот факт, что промотор обладает промоторной активностью в трансплантированном хозяине. Фраза "ген, кодирующий энзим, обладающий функцией, позволяющей осуществлять реконструкцию ксилоглюкана стенки растительной клетки" подразумевает ген, кодирующий энзим, специфически экспрессированный при реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, и особенно она относится к гену,кодирующему эндо-ксилоглюкан трансферазу(ЕХТ) и генное семейство ЕХТ гена. Примерами членов генного семейства ЕХТ гена могут служить BRUI ген [Plant Physiology, 104, 161-170(1991)], и XRP ген, полученный в настоящем изобретении. Фраза "сайт, требуемый для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки",используемая в тексте, относится к сайту, где ген, кодирующий энзим, обладающий функцией, позволяющей осуществлять реконструкцию ксилоглюкана стенки растительной клетки, подвергается специфической экспрессии и до тех пор, пока ген, кодирующий энзим, обладающий функцией, позволяющей осуществлять реконструкцию ксилоглюкана стенки растительной клетки, специфически экспрессируется, сайт, на котором происходит экспрессия, представляет сайт, требуемый для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, как это отмечается в тексте. Так например, иногда сайт специфической экспрессии ЕХТ гена, являющегося одним из генов, кодирующих энзим, обладающий функцией, позволяющей осуществлять реконструкцию ксилоглюкана стенки растительной клетки,отличается от сайтов генного семейства ЕХТ гена даже в одном и том же растении. Однако все из них входят в сайт, требуемый для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, упоминаемый в настоящем описании. Фраза "стадия роста растения для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки", используемая в тексте, обозначает стадию, на которой происходит специфическая экспрессия гена, кодирующего энзим, обладающий функцией, способствующей осуществлению реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, и до тех пор, пока ген,кодирующий энзим, обладающий функцией,позволяющей осуществлять реконструкцию ксилоглюкана стенки растительной клетки, подвергается специфической экспрессии, стадия, на которой происходит такая экспрессия, входит в понятие стадии, требуемой для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, как это упоминается в тексте. Так например, иногда конкретная стадия экспрессии ЕХТ гена, являющегося одним из 7 генов, кодирующих энзим, обладающий функцией, позволяющей осуществлять реконструкцию ксилоглюкана стенки растительной клетки,отличается от соответствующих стадий для семейства генов типа ЕХТ гена даже в одном и том же растении. Однако все из них охватываются понятием стадии, требуемой для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, упоминаемой в тексте описания. Так например, в культуральных клетках митотические клетки преобладают в фазе логарифмического роста и при этом интенсивно происходит синтез и реконструкция клеточной стенки. В стационарной фазе клетки активно удлиняются и, вследствие этого, требуется реконструкция клеточной стенки. Таким образом,реконструкция клеточной стенки требуется в обеих фазах. Как описывается ниже в примере 10, стадия экспрессии в культуральных клетках ЕХТ гена табачного происхождения полностью отличается от стадии для XRT гена, родового гена ЕХТ гена табачного происхождения. Другими словами, ЕХТ ген табачного происхождения интенсивно экспрессируется в логарифмической фазе, тогда как экспрессия в стационарной фазе снижается примерно в 12 раз. Напротив, XRT ген, родовой ген ЕХТ гена табачного происхождения, интенсивно экспрессируется в стационарной фазе. Таким образом, стадия специфической экспрессии энзимов с одинаковой энзиматической активностью контролируется промотором гена, кодирующего энзим. В этих случаях примеры стадии реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, упоминаемой в тексте, также включают логарифмическую фазу и стационарную фазу. Используемый в тексте термин "функциональный эквивалент" обозначает следующее. Встречающийся в природе белок является объектом различных мутаций в его аминокислотных последовательностях, таких как делеция, инсерция, присоединение и замена аминокислот путем модификаций сформированного белка, происходящих в живом организме, и в ходе процесса очистки, помимо полиморфизма и мутаций гена, кодирующего такой белок. Несмотря на это, известно о существовании молекулы, обладающей физиологической и биологической активностями, практически эквивалентными активности белка без мутаций. Такая молекула, имеющая другую структуру, но обладающая практически эквивалентной функцией,обозначается как функциональный эквивалент. То же самое справедливо в случае, когда вышеупомянутые мутации искусственно вводятся в аминокислотную последовательность белка. Множество мутантов, полученных в таких случаях, могут интерпретироваться как функциональные эквиваленты, если они демонстрируют биологическую активность, практически эквивалентную активности белка без мутаций. 8 Так например, отмечалось, что метиониновый остаток, присутствующий на N-окончании белка, экспрессированного Е. соli, во многих случаях удаляется действием метионин аминопептидазы. Однако иногда оба белка, содержащие и не содержащие метиониновый остаток,образуются в зависимости от конкретного типа белка. Несмотря на это, во многих случаях наличие или отсутствие метионинового остатка не оказывает влияния на активность белков. Кроме того, известно, что полипептид, полученный заменой определенного цистеинового остатка интерлейкина-2 (IL-2) на сериновый остаток,сохраняет активность интерлейкина-2 (Science,224, 1431-1433). Более того, при получении белков методами генной инженерии белок часто экспрессирует в виде слитого белка. Так например, Nтерминальную пептидную цепочку, производную от другого белка, присоединяют к Nокончанию целевого белка с целью повышения уровня экспрессии целевого белка. Кроме этого,соответствующую пептидную цепочку присоединяют к N-окончанию или С-окончанию целевого белка для облегчения его очистки с использованием носителя, обладающего аффиностью к присоединенной пептидной цепочке после экспрессии. Кроме этого, известно, что для каждой аминокислоты в гене имеется от одного до шести кодонов (наборы из трех нуклеотидов), которые определяют одну конкретную аминокислоту. В соответствии с этим, может существовать большое число генов, кодирующих конкретную аминокислотную последовательность, хотя число таких генов зависит от аминокислотной последовательности. В природе гены не всегда существуют в стабильном состоянии и их нуклеиновые кислоты часто претерпевают мутации. Такой случай представляет ситуацию, когда мутация, происходящая в гене, не индуцирует какого-либо изменения в закодированной аминокислотной последовательности (так называемая молчащая мутация) и в этом случае можно сказать, что образуется другой ген, кодирующий ту же аминокислотную последовательность. Поэтому, даже если выделен ген, кодирующий некоторую определенную аминокислотную последовательность, нельзя исключать возможность того, что большое число типов генов, кодирующих ту же аминокислотную последовательность, могут образовываться при прохождении через живой организм, содержащий такой ген. Не составляет труда искусственно приготовить большое число генных типов, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность, в результате применения разнообразных методов генной инженерии. Так например, при получении белка методами генной инженерии, в тех случаях, когда определенный кодон, используемый в гене, ко 9 дирующем целевой белок, не часто применяется в используемом хозяине, иногда наблюдаются низкие уровни экспрессии. Для такого случая была предпринята попытка усиления экспрессии целевого белка путем искусственной замены указанного кодона на другой кодон, который более популярен для хозяина, без влияния на кодируемую аминокислотную последовательность. Разумеется, вполне возможно искусственно получить большое число генов, кодирующих определенную аминокислотную последовательность, с использованием такого способа. Соответственно, даже такие искусственно полученные различные гены охватываются сферой настоящего изобретения, поскольку они кодируют аминокислотные последовательности,которые могут быть установлены из нуклеотидных последовательностей, раскрытых в настоящем изобретении. Кроме этого, многие полипептиды, которые подвергаются, по крайней мере, одной модификации одной или более аминокислот путем делеции, инсерции, присоединения и замены в аминокислотной последовательности целевого белка, обладают активностью, функционально эквивалентной активности целевого белка. Гены, кодирующие такие полипептиды, также входят в понятие "функциональный эквивалент" настоящего изобретения, независимо от того,выделены ли они из природных источников или получены искусственным путем. Во многих случаях гены, кодирующие функциональные эквиваленты, обладают гомологией. Поэтому гены, способные гибридизироваться с ЕХТ геном, используемым в настоящем изобретении, и кодирующие полипептид, обладающий такой же функцией, также входят в сферу функциональных эквивалентов настоящего изобретения. Примеры упомянутых в тексте "полезных генов" включают гены, кодирующие белки, способные к экспрессии в растениях или растительных клетках, либо в трансгенных растениях,регенерируемых из растительных клеток, гены антисмысловых РНК, происходящие из растения или растительных клеток, или трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток, гены, кодирующие связывающие белки транскрипционных факторов, происходящих из растений или растительных клеток, либо из трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток, или "ловушки", имеющие последовательности или аналогичные последовательности сайтов связывания транскрипционных факторов, и рибозимы, расщепляющие мРНК, происходящие из растений или растительных клеток, или трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток. Примерами генов, кодирующих белки,способные к экспрессии в растениях или растительных клетках, или трансгенных растениях,регенерированных из растительных клеток, мо 002757 10 гут служить гены растения, однако, настоящее изобретение не ограничивается такими генами и охватывает также гены, происходящие из таких микроорганизмов, как бактерии, дрожжи, актино-мицеты, грибки, аскомицеты, базидомицеты и т.п., а также гены, происходящие из таких живых организмов, как животные и т.п., в том случае, если они способны к экспрессии в растениях или растительных клетках, или в трансгенных растениях, регенерированных из растительных клеток. Используемый в тексте термин "ловушки" относится к ДНК-генам, кодирующим связывающие белки транскрипционных факторов,происходящих из растений или растительных клеток, или трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток, или ДНК,имеющим последовательности или аналогичные последовательности связывающих сайтов транскрипционных факторов, которые подавляют действие транскрипционных факторов при переносе в клетки в качестве "ловушек". Используемый в тексте термин "рибозимы" относится к молекулам, расщепляющим мРНК определенных белков с целью ингибирования трансляции таких определенных белков. Рибозимы могут быть сконструированы для генных последовательностей, кодирующих определенные белки. Примерами рибозим, упомянутых в тексте, могут служить любые рибозимы, способные расщеплять мРНК для определенных белков с целью ингибирования трансляции таких определенных белков независимо от их типа, такие как рибозимы молотоглавого типа, рибозимы шпилькообразного типа, рибозимы дельта-типа и т.д. Если растение имеет энзим, обладающий функциями, способствующими реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, любое такое растение может использоваться в настоящем изобретении. Примерами таких растений могут служить такие двудольные растения,как фасоль Azuki, соя культурная, Arabidopsis,томаты, картофель, Brassica, подсолнечник,хлопок, табак и т.п., и однодольные растения,такие как пшеница, рис, кукуруза, сахарный тростник и т.п., причем среди таких растений особенно применимы те, которые содержат ЕХТ энзим и ЕХТ-аналогичные энзимы, которые экспрессируются тканеспецифичным образом. ЕХТ ген представляет собой домоводческий ген растений и поэтому существует большое число семейств таких генов. Что касается ДНК-фрагментов, содержащих промоторные участки таких генов семейства, то клонирование промотора ЕХТ гена трудно осуществимо традиционным методом гибридизации бляшек из-за присутствия большого числа генов семейства,включающих псевдогены, и понижения бляшкообразующей способности бляшек, получаемых при приготовлении фага, имеющего фрагмент обратно-направленного участка от ЕХТ 11 гена или генов его семейства, и инфицировании таким фагом хозяина. Однако при решении двух указанных проблем, гибридизация применима к любым растениям, включающим двудольные растения и однодольные растения, с использованием кДНК ЕХТ гена и генов его семейства в качестве зонда и геномной ДНК в качестве мишени, а также возможно выделение в результате подробного исследования методом PCR. В качестве зонда может использоваться кДНК ЕХТ гена и генов его семейства растения,отличного от целевых разновидностей. Однако для более эффективной гибридизации предпочтительно выбирать в качестве зонда кДНК из растения той же разновидности, что мишень. Авторы настоящего изобретения выделили кДНК ЕХТ гена из фасоли Azuki (Vigna anqularis), сои (Glycine mах), Arabidopsis (Arabidopsis(Zea mays). Среди таких молекул кДНК, полные или неполные нуклеотидные последовательности для фасоли Azuki, сои, Arabidopsis, помидор и пшеницы, а также рестрикционная карта для риса и рестрикционная карта для кукурузы описаны в ЕР-0562836 А 1 (1993), а неполная нуклеотидная последовательность для табака описана в JP 7-79778 А. Кроме этого, неполные нуклеотидные последовательности для риса и кукурузы представлены в SEQ ID9 и SEQ ID10 перечня последовательностей. кДНК семейных генов могут быть выделены с использованием кДНК полной длины или неполной кДНК ЕХТ гена в качестве зонда. Так например, кДНК семейных генов могут быть выделены из большого числа растений с использованием в качестве зонда последовательности, консервированной между всеми упомянутыми выше кДНК ЕХТ гена и ксилоглюканазным геном Tropaeolum majus [The Plant Journal, 3, 701-711 (1993)]. Кроме этого, кДНК семейных генов могут быть выделены из большого числа разновидностей растений путем синтеза праймера на основе консервативной области и последующего осуществления PCR [Consensus(1993)]. Далее в качестве иллюстрации приводится подробное разъяснение настоящего изобретения на примере фасоли Azuki. кДНК библиотека, полученная по способу,описанному в ЕР-0562836 А 1 (1993) с использованием семян фасоли Azuki (WATANABESHUSHI Co., Ltd.), может быть использована для поиска клонов трансформированных семейными генами ЕХТ гена. кДНК библиотеку получали, например, приготовлением РНК из фасоли Azuki с последующей очисткой поли(А)Roche Co., Ltd.) и затем, например, проводили обработку обратной транскриптазой с использо 002757 12 ванием поли(А) +РНК и олиго-dT праймера с целью получения кДНК. кДНК библиотеку получали из кДНК с использованием набора кДНКSynthesis Kit System Plus (Amersham). Такую кДНК библиотеку применяли для гибридизации бляшек с использованием в качестве зонда кДНК ЕХТ гена с получением, например, 96 положительных бляшек, отобранных из 5 х 104 бляшек. Такие бляшки амплифицировали по методу лизиса в чашках (T.Maniatis et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, второе издание, глава 2, стр.60-66, опубликовано ColdSpring Harbor Laboratory Press в 1989), с последующей дот-гибридизацией для классификации бляшек на основе интенсивности сигнала. Фаги, выделенные из двух бляшек, демонстрировали интенсивность сигнала, отличную от интенсивности для ЕХТ гена фасоли Azuki, и ДНК, вставленные в такой фаг, экстрагировали. Такие ДНК расщепляли в присутствии рестрикционного энзима EcoR I (TAKARASHUZO Co., Ltd.) и длины ДНК-фрагментов идентифицировали электрофорезом на агарозном геле. Идентифицированные ДНКфрагменты длиной 730 п.o., 430 п.о. и 1090 п.о. очищали и субклонировали по EcoR I сайтуpUC18 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.). Полученные в результате плазмиды обозначали, соответственно, как pVX44-1, pVX44-2 и pVX45-1. Такие плазмиды использовали для определения нуклеотидных последовательностей ДНКфрагментов по методу Сэнгера с использованием набора для дидезокси-секвенирования BcaBEST (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) и были получены результаты, указывающие на клонирование двух генов с высокой гомологией к ЕХТ гену (ЕХТ фасоли Azuki). Часть их нуклеотидных последовательностей представлены вSEQ ID11 и SEQ ID12 в перечне последовательностей (ЕХТ 2 фасоли Azuki и ЕХТ 3 фасоли Azuki). Упомянутую выше кДНК библиотеку использовали для гибридизации бляшек с применением одной из вышеуказанных консервативных последовательностей (SEQ ID13) в качестве зонда с получением, например, 8 позитивных бляшек, отобранных из 8 х 103 бляшек. ДНК,вставленные в фаговые векторы бляшек, экстрагировали, и, например, могут быть получены ДНК-фрагмент (размером около 1.2 кб) с высокой гомологией с ЕХТ геном, а также с генами его семейства, BRUI ген [Plant Physiology, 104,161-170, (1994)] и meri-5 ген [The Plant Cell, 3,359-370. (1991)]. Часть нуклеотидной последовательности такой ДНК показана в SEQ ID14 в перечне последовательностей (XRP 1 фасолиAzuki). Кроме этого, упомянутая выше кДНК библиотека может использоваться, например, дляPCR с применением упомянутых выше консервативной последовательности олиго-dТ праймера. В результате может быть получен ДНК 13 фрагмент гена семейства, отличного от, например, ЕХТ фасоли Azuki, EXT 2 фасоли Azuki,ЕХТ 3 фасоли Azuki и XRP 1 фасоли Azuki. Часть такой нуклеотидной последовательности ДНК показана в SEQ ID15 в перечне последовательностей (XRP 2 фасоли Azuki). В других растениях, помимо фасоли Azuki,гибридизация бляшек с использованием одной из упомянутых выше консервативных последовательностей (SEQ ID13) в качестве зонда может применяться для получения кДНК гена семейства. Так например, коммерчески доступная кДНК библиотека табака применяется для гибридизации бляшек с применением одной из вышеупомянутых консервативных последовательностей (SEQ ID13) в качестве зонда с получением 30 позитивных бляшек, выбранных из примерно 3 х 104 бляшек. ДНК, вставленные в фаговые векторы указанных бляшек, экстрагировали и в результате может быть получен, например, ДНК фрагмент (размером около 1.2 кб) с высокой гомологией к ЕХТ гену, а также к(1991)]. Часть такой нуклеотидной последовательности ДНК показана в SEQ ID16 в перечне последовательностей (XRP 1 табака). Далее, например, может быть получена геномная ДНК библиотека фасоли Azuki путем получения геномной ДНК из листьев фасолиAzuki традиционным способом, частичного ее переваривания с использованием рестрикционного энзима Sau3A I, лигирования продукта частичного переваривания с векторным GEM-II с использованием Системы клонирования полусайтовых спейсеров Xho I (Promega Biotec) с последующей упаковкой с использованием набора для упаковки in vitro (Stratagene) и последующего инфицирования хозяина полученным в результате фрагментом. Такая библиотека может применяться, например, для гибридизации с использованием кДНК ЕХТ гена, описанного в ЕР-0562836 AI (1993) в качестве зонда для поиска фагов, имеющих фрагмент ДНК, содержащий промоторную область такого гена. Так например, 10 положительных бляшек получали из примерно 1 х 105 бляшек и ДНК, вставленные в фаговые векторы бляшек, экстрагировали с получением ДНК-фрагментов со средней длиной порядка 15 кб. Такие фрагменты ДНК использовали для Саузерн-гибридизации с применением ДНК-фрагмента, содержащего кДНК ЕХТ гена в качестве зонда, с последующим субклонированием целевого фрагмента в плазмидный вектор для анализа неполной нуклеотидной последовательности. В результате, например, может быть получена информация, подтверждающая тот факт, что фрагменты ДНК, вставленные в фаговые векторы всех бляшек, имеют последовательность, аналогичную последовательности ЕХТ гена. 14 Такие исследования могут служить подтверждением тому, что клонирование областей,содержащих промоторы ЕХТ гена и генов его семейства, является легко осуществимой операцией. Однако фактически возникают две указанные ниже проблемы и клонирование любого промотора ЕХТ гена с помощью традиционной гибридизации бляшек оказывается неудачным. Первая проблема состоит в том, что существует большое число семейных генов, включающих псевдогены, которые трудно дифференцировать путем традиционной гибридизации. В соответствии с этим, для осуществления клонирования клонов геномной ДНК, которые являются действительными копиями целевых кДНК-клонов, необходимо проанализировать и определить все нуклеотидные последовательности соответствующих геномных ДНК после грубого скрининга клонов геномной ДНК, которые могут быть копиями. С другой стороны,необходимо отыскать нуклеотидную последовательность, которая может различать соответствующие гены в семействе генов путем анализа множества семейных генов из кДНК и далее осуществить гибридизацию с использованием ее олиго зонда, специфичного к нуклеотидной последовательности (SSOP) с целью определения клона геномной ДНК. Вторая проблема состоит в сильном репрессорном действии, которое индуцируется на перенос фрагментов ДНК, содержащих промоторные области ЕХТ гена и генов его семейства,а также в снижении бляшкообразующей способности, которая наблюдается при инфицировании фагов в бактерию-хозяина (Е.coli). Фактически трудно отыскать вышеозначенные фаги,содержащие промоторные области ЕХТ гена,поскольку образовавшиеся бляшки чрезвычайно малы по сравнению с нормальными фагами. Такая проблема первоначально возникла в ходе повторных исследований методом проб и ошибок, направленных на выделение целевой промоторной области, и, вследствие этого, возникает неопределенная ситуация до тех пор, пока клонирование не произойдет в действительности. Далее, авторы изобретения провели интенсивные исследования, направленные на решение указанных выше проблем, результатом которых стало впервые осуществленное успешное клонирование области, содержащей промотор ЕХТ гена, после постепенного поочередного решения проблем с использованием множества методов генной инженерии, включая усовершенствованный метод PCR. Далее, в тексте на ЕХТ ген и его семейные гены коллективно ссылаются, как на гены ЕХТсемейства. Клонирование промотора В тех случаях, когда существует влияние упомянутой выше репрессии бляшкообразующей активности, невозможно клонировать про 15 моторную область ЕХТ гена даже после повторного скрининга полных геномных ДНКбиблиотек. Теоретически возможно получить короткие геномные фрагменты, невосприимчивые к репрессии, и затем осуществить клонирование с минимизированным влиянием репрессии. Для этой цели требуется, во-первых, осуществить полное переваривание геномных ДНК с множеством рестрикционных энзимов с последующей геномной Саузерн гибридизацией и затем установить, какой размер ДНК-фрагмента,имеющего терминальный сайт, какого рестрикционного энзима содержит целевую промоторную область ЕХТ гена. Неполная геномная ДНК-библиотека определенного таким образом размера ДНК может быть получена полным перевариванием геномных ДНК с определенным таким образом рестрикционным энзимом и регенерацией с агарозного геля фрагментов периферической ДНК,имеющей в среднем определенный размер ДНКфрагмента. В результате может быть получена неполная геномная ДНК-библиотека, которая сокращена примерно более чем в десять раз по сравнению с исходной полной библиотекой геномной ДНК. Так например, геномные ДНК, полученные из листьев фасоли Azuki традиционным способом, подвергают перевариванию, например, с рестрикционными энзимами BamH I,EcoR I и Hind III (все: TAKARA SHUZO Co.,Ltd.), с последующей геномной Саузерн гибридизацией для индикации образования 2 или 3 полос, причем наиболее интенсивная полоса может идентифицироваться при размере более 15 кб при BamH I переваривании, около 8,5 кб при EcoR I переваривании, около 8,5 кб приHind III переваривании и при примерно 5,5 кб при EcoR I-Hind III двойном переваривании. Среди таких полос полосу, идентифицированную при примерно 5,5 кб в результате EcoREXIox (Novagen), с последующей упаковкой с помощью in vitro упаковочного набора (Stratagene) и инфицированием бактерии-хозяина, в результате чего удается получить неполную геномную ДНК-библиотеку с ДНКфрагментами, размером примерно 5,5 кб, в среднем, которые имеют EcoR I и Hind III сайты на обоих концах, и которая более сокращена по сравнению с полной геномной ДНК-библиотекой. Такую сжатую библиотеку подвергают гибридизации с использованием ЕХТ гена в качестве зонда, как описано выше, с целью поиска фага, имеющего фрагмент ДНК, содержащий промоторную область такого гена. Так например, 8 положительных бляшек, отобранных из 1,3 х 105 бляшек, подвергали гибридизации с использованием олигонуклеотида VAN-U7 (SEQID17), синтезированного на основе 5' 002757 16 некодирующей области с низкой гомологией к кДНК семейства генов, отличных от ЕХТ гена, в качестве зонда, в результате чего подтверждали тот факт, что, например, 4 из 8 бляшек представляют собой ДНК-фрагменты, содержащие кДНК ЕХТ гена. EXIox может быть подвергнут автоматическому субклонированию, поскольку инфицирование таким ДНК-фрагментом бактерии-хозяина, имеющего P1Cre ген,способствует превращению области, автоматически субклонированной в организме хозяина, в плазмиду PUC типа путем автоматического субклонирования. Секвенирование ДНК с использованием плазмид, в которые вставлен фрагмент ДНК, с последующим сравнением ДНК-фрагмента с кДНК последовательностью ЕХТ гена, позволяет установить факт содержания фрагментом ДНК промотора ЕХТ гена. Части нуклеотидной последовательности ДНК, идентифицированного таким образом фрагмента, представлены в SEQ ID18 (в обратном направлении от ЕХТ кодирующей области) и в SEQ ID19 (в прямом направлении от ДНК-фрагмента) в перечне последовательностей. Далее, в тексте на 5'-обратное направление транскрипции от EcoR I сайта ссылаются, как наJM109/pVXG303 и его депонировали 15 марта 1995 года (дата первоначального депонирования) в Национальном Институте Биологических наук и технологии человека, Агентство промышленной науки и технологии, Министерство промышленной торговли и промышленности (13, Higashi 1-Chome, Tsukuba-Shi, Ibaragi-ken 305,Япония) под каталожным номеромFERM ВР-5390 в соответствии с Будапештским договором. Промоторная-обратнонаправленная область может быть получена клонированием HindIII фрагмента размером около 8,5 кб, который идентифицирован, как описано выше. Для этой цели геномные ДНК фасоли Azuki полностью переваривали с рестрикционным энзимом HindIII и затем фрагменты ДНК регенерировали разделением с помощью электрофореза на 0,7% агарозном геле тем же способом, что описан выше. Аналогичным образом, в результате полного переваривания ZAPII (Stratagene) с рестрикционным энзимом Spe I (TAKARA SHUZOCo., Ltd.) с последующей реакцией заполнения в присутствии dCTP и dTTP, получали полунаполненный сайт. Реакция наполнения Hind III фрагмента (средний размер примерно 8,5 кб) в 17 присутствии АТР и GTP, проводимая как описано выше, сопровождалась лигированием в полунаполненный сайт ZAPII, в результате чего была реализована попытка получения геномной ДНК-библиотеки. Однако размер такой ДНК является маргинальным для упаковки и, вследствие этого,можно ожидать, что титр ее библиотеки будет невысоким. Фактически, титр такой библиотеки слишком низок для осуществления эффективного скрининга. Этот размер также слишком мал для использования такого фагового вектора замененного типа, как DASHII (Stratagene). Фактически, титр библиотеки, которую получают лигированием регенерированного Hind III фрагмента (средний размер: около 8,5 кб) с Hind III сайтом DASHII, слишком мал для проведения эффективного скрининга. Единственный метод, который мог бы использоваться для такой цели, представляет собой осуществление скрининга из полной геномной ДНК библиотеки с использованием CEMII(Promega Biotec) с применением кДНК ЕХТ гена в качестве зонда. Однако можно ожидать, что не удастся получить какой-либо фрагмент, содержащий целевой промотор ЕХТ гена, в связи с влиянием бляшкообразующей репрессии, а также присутствием большого числа семейных генов, как описано выше. Далее было предположено, что использование заново клонированного геномного фрагмента в качестве зонда приведет в результате к более интенсивной гибридизации фрагментом,содержащим целевой промотор, чем в случае использования кДНК. Поэтому, желательно осуществить гибридизацию бляшек с использованием геномного ДНК-фрагмента в качестве зонда и затем провести скрининг как можно большего числа бляшек. В результате такого скрининга, например,получают 20 положительных сигналов из 2 х 105 бляшек, и последующий скрининг позволяет выделить положительные клоны. Однако размер бляшки, полученной на основе фагового вектора со вставленным фрагментом, содержащим целевой промотор, настолько мал, что небольшая примесь других бляшек приводит к исключительному образованию ДНК, происходящих из загрязняющих фагов, при экстракции фаговых ДНК в результате преимущественной пролиферации загрязняющих фагов с большей скоростью размножения, как в методе лизиса в чашах,так и в методе культивирования. Фактически, возникновения таких проблем не ожидалось вообще до осуществления скрининга. Бляшка, соответствующая сигналу, может быть получена осуществлением повторного вторичного скрининга, когда осуществляют тонкое распыление разбавленного раствора первичного фага, или дополнительным осуществлением третичного скрининга. Неожиданно, при 18 третичном скрининге, при тщательном изучении пластины, удалось детектировать бляшку,которая была значительно мельче других негативных бляшек в положении, соответствующем сигналу, который не мог быть идентифицирован на первый взгляд. Затем, с полученной таким образом очень мелкой бляшкой обращались очень осторожно, чтобы предотвратить загрязнение другими бляшками, с тем, чтобы пролиферировать только фаг, происходящий от такой бляшки. Экстракция ДНК-фрагмента, вставленного в фаговый вектор, позволила получить,например, фрагмент ДНК, длиной около 11 кб. Кроме этого, клон, содержащий целевой ЕХТ ген, может быть эффективно скринирован в ходе вторичного скрининга путем осуществления конкурентной гибридизации с использованием в качестве зонда олигонуклеотида VANU7 (SEQ ID17), синтезированного на основе 5'-незакодированной области с пониженной гомологией к кДНК генов семейства, отличных от ЕХТ гена. Переваривание ДНК-фрагмента, например рестрикционным энзимом Hind III (TAKARASHUZO Co., Ltd.), с последующей Саузерн гибридизацией с использованием в качестве зонда вышеупомянутой геномной ДНК ЕХТ гена фасоли Azuki позволили обозначить укороченный фрагмент ДНК, содержащий промоторную область такого гена. Такой фрагмент вставляли в рестрикционный сайт плазмиды, и плазмиду со вставленным фрагментом можно переносить в организм соответствующего хозяина. Кроме того, анализ секвенирования ДНК с использованием плазмиды со вставленным фрагментом ДНК с последующим сравнением фрагмента ДНК с кДНК последовательностью ЕХТ гена позволяет сделать вывод о содержании промотора ЕХТ гена во фрагменте ДНК. Более того,такой фрагмент может использоваться для субклонирования в качестве фрагмента, содержащего целевую промоторную обратнонаправленную область. Полученный таким образом субклонированый ДНК-фрагмент, имеющий HindSHUZO Co., Ltd.), что позволяет определить последовательность нуклеотидов. На фиг. 1 изображена рестрикционная карта такого фрагмента. Эта нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID20 в Перечне последовательностей. Плазмиду, интегрированную с фрагментом, содержащим целевую промоторную обратнонаправленную область, в сайтах Hind III иpVXP101, обозначали и указывали как Escherichia coli JM109/pVXP101 и депонировали 23 февраля 1995 г. (дата начального депонирования) в Национальном институте биологических наук и технологии человека, Агентство про 19 мышленной науки и технологии, Министерство промышленной торговли и промышленности (13, Higashi 1-Chome, Tsukuba-Shi, Ibaragi-ken,305, Япония) под каталожным номеромFERM ВР-5389 в соответствии с Будапештским договором. Описанные выше методы не всегда применимы к клонированию ДНК-фрагмента, содержащего целевую промоторную область. Так например, это имеет место в том случае, когда фрагмент оказывает фатальное или рострегрессирующее действие на бактерию-хозяина. Фактически, упомянутый выше фаг, содержащий промотор ЕХТ гена, образует бляшку, которая слишком мала для ее обнаружения и применения в скрининге. Далее, PCR метод был рассмотрен как альтернативный способ клонирования ДНКфрагмента, содержащего промоторную область ЕХТ гена.PCR метод, предназначенный для амплификации такой неизвестной последовательности, включает обратную PCR [The Plant Journal,7, 157-164 (1995)] и PCR с применением кассеты(1990)]. Однако традиционная обратная PCR эффективна лишь для амплификации ДНК-цепей длиной до примерно 1 кб в том случае, когда в качестве матрицы используют геномную ДНК высшего животного или растения. Аналогичным образом, PCR с использованием кассеты эффективна лишь для амплификации фрагментов длиной до примерно 1 кб. Кроме того, селекция рестрикционного энзима для самолигирования ограничена в обратной PCR, когда использование рестрикционного энзима, распознающего 4 кб, жизненно важно для получения амплифицированного фрагмента. В PCR с использованием кассеты требуется осуществить тестирование большого числа кассет с большим числом рестрикционных энзимных сайтов, распознающих 6 п.о., вследствие чего требуются большие трудозатраты. Кроме этого, существует низкая вероятность того, что даже рестрикционный энзимный сайт, распознающий 4 п.о., не говоря уже о рестрикционном энзимном сайте, распознающем 6 п.о., существует для ДНК-фрагмента, содержащего АТобогащенную смещенную последовательность,подобную промоторной области, вследствие чего амплификация длиной ДНК-мишени требуется как в обратной PCR, так и в PCR с использованием кассеты. Далее, авторы изобретения обнаружили, что традиционный способ,применяемый для амплификации только коротких ДНК-цепей, может быть усовершенствован таким образом, чтобы его можно было применять для эффективной амплификации ДНК длиной более примерно 2 кб, в результате оптимизации условий аутолигирования и использова 002757Co., Ltd.) в обратной PCR. Кроме этого, авторы настоящего изобретения обнаружили, что методы двухстадийнойPCR, в которой реакционный раствор в первойPCR разбавляют для использования в качестве матрицы во второй PCR с целью эффективного амплифицирования целевого ДНК-фрагмента,позволяют решить указанные выше проблемы. Так например, геномные ДНК, полученные из листьев фасоли Azuki, подвергают полному перевариванию с использованием рестрикционного энзима Hind III с последующим аутолигированием в присутствии Т 4 ДНК лигазы (TAKARA SHUZO Co., Ltd.). Поскольку эффективность реакции аутолигирования сильно зависит от объема такой реакционной системы, предпочитают поддерживать объем реакционной системы таким образом, чтобы получить концентрацию ДНК менее 4 мкг/мл.PCR проводят с использованием полученной таким образом циклической геномной ДНК в качестве матрицы. Примерами используемого праймера могут служить последовательности праймера VAN-UH1 (SEQ ID21), праймера(SEQ ID23), праймера VAN-L16 (SEQ ID24), праймера VAN-UH3 (SEQ ID25) и праймера VAN-L3 (SEQ ID26), которые синтезированы на базе последовательностей (SEQ ID18 и SEQ ID19) упомянутой выше геномной ДНК pVXG303 ЕХТ гена. Методы двухстадийной PCR оказались действенными для эффективного амплифицирования целевого ДНК-фрагмента. Так например,ДНК-фрагмент размером около 1,8 кб может быть амплифицирован осуществлением первойPCR с использованием упомянутых выше праймера VAN-UH1 (SEQ ID21) и праймераVAN-L (SEQ ID22) и использованием полученного в результате продукта реакции в качестве матрицы для второй PCR с применением праймера VAN-UH2 (SEQ ID23) и праймераVAN-L3 (SEQ ID26). Однако амплификация оказывается неэффективной, если первую PCR проводят тем же способом, что описан выше, и тогда вторуюPCR проводят с использованием в качестве праймеров праймера VAN-UH2 (SEQ ID23) и праймера VAN-L16 (SEQ ID24), или праймера VAN-UH3 (SEQ ID25) и праймера VANL3 (SEQ ID26). Другими словами, эффективность амплификации зависит от выбора праймеров. В соответствии с этим, предпочтительно найти наиболее подходящую комбинацию праймеров из нескольких полученных комбинаций. Реакцию PCR можно проводить, следуя руководству к набору TaKaRa LA PCR (TAKARA SHUZO Co., Ltd.), за исключением температуры реакции и условий цикличности. Так,первую PCR проводят с использованием 50 мкл 21 реакционного раствора при 94 С (0,5 мин), 55 С(1,0 мин) и 72 С (2 мин), осуществляя 30 циклов, и затем при тех же условиях проводят вторую PCR. В этой связи желательно приготовить несколько разбавленных растворов реакционного раствора первой PCR для установления наилучшего количества, которое следует добавлять во вторую PCR. Амплифицированный продукт размером около 1,8 кб может быть клонирован в, например, Hinc II сайт pUC119 (TAKARA SHUZOCo., Ltd.). Сравнение нуклеотидных последовательностей на обоих окончаниях фрагмента с последовательностями (SEQ ID18 и SEQ ID19) упомянутой выше геномной ДНК ЕХТ гена, которую предварительно частично клонировали, позволяет установить, является ли указанный фрагмент ДНК-фрагментом, содержащим промотор ЕХТ гена, который сохранен из предыдущей последовательности. На фиг. 2 изображена рестрикционная карта такого фрагмента. Нуклеотидная последовательность фрагмента показана в SEQ ID27 в перечне последовательностей. Плазмида, интегрированная с таким продуктом PCR, обозначена как pVXPН 3, тогда как E.coli JM109 штамм, трансформированный pVXP-Н 3, обозначен и указан, какEscherichia coli JM109/pVXP-Н 3 и депонирован 17 февраля 1995 г. (дата первоначального депонирования) в Национальном Институте биологической науки и технологии человека, Агентство промышленной науки и технологии. Министерство промышленной торговли и промышленности (1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-Shi,Ibaragi-ken, 305, Япония) под каталожным номером FERM-5388 в соответствии с Будапештским соглашением.SEQ ID1 и SEQ ID2 в перечне последовательностей демонстрируют нуклеотидные последовательности в обратном направлении от гена, кодирующего N-терминальную аминокислотную последовательность ЕХТ, которая состоит из SEQ ID18 и SEQ ID19,совместно с SEQ ID27 в перечне последовательностей. В результате анализа нуклеотидной последовательности и сравнения SEQ ID1 с SEQID2 в перечне последовательностей было установлено, что обе последовательности полностью аналогичны друг другу, за исключением лишь двух отличий во всех областях в прямом направлении от 782 остатка A SEQ ID1 и в прямом направлении от остатка A SEQ ID2. Два таких отличия включают различие в числе сохраняющихся остатков А в прямом направлении от 829 остатка A SEQ ID1 и в прямом направлении от 921 остатка A SEQ ID2 (16 оснований в SEQ ID1 и 14 оснований в SEQ.ID2) и различие между 947 остатком Т последовательности SEQ ID1 и 1037 остатком С в SEQ ID2. Это наблюдение позволило установить, что такая общая область содержит 22 участок, регулирующий специфическую экспрессию на сайте, и стадии, которые требуются для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки. ДНК-фрагмент, содержащий промоторную область гена семейства, может быть клонирован путем решения проблем тем же образом, что в способе клонирования ДНК-фрагмента, содержащего промоторную область ЕХТ гена. Более того, сравнение полученного в результате клонированного фрагмента с некоторыми из таких семейных генов, которые действительно специфически экспрессировали на таком сайте и на такой стадии, которые требуются для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, позволяет идентифицировать область,необходимую для тканеспецифической экспрессии в растениях. Кроме того, таким же образом может быть идентифицирована область, необходимая для особенно интенсивной экспрессии в фазе логарифмического роста культивируемых клеток. Измерения, касающиеся сайта экспрессии и стадии экспрессии - Нозерн гибридизация Для анализа экспрессии под действием промотора, сайт экспрессии и стадия экспрессии в растениях фасоли Azuki могут быть измерены Нозерн гибридизацией с использованием в качестве зонда ЕХТ генной кДНК фасоли Azuki. Кроме того, стадия экспрессии в клетках табачной культуры также может быть измерена Нозерн-гибридизацией с использованием в качестве зонда ЕХТ генной кДНК табака. ЕХТ генная кДНК фасоли Azuki и ЕХТ генная кДНК табака могут быть клонированы с помощью методов, описанных, например, в ЕР 0562836 А 1 (1993) и JP 7-79778 А. Экстракция РНК из растений фасоли Azuki и таких растительных тканей, как клетки табачной культуры, может быть осуществлена, например, гуанидин тиоцианатным методом или фенол-SDS методом. Экстрагированные таким образом полные РНК могут быть подвергнуты,например, анализу путем электрофореза на агарозном геле с последующим переносом на мембрану и гибридизацией с использованием такой мембраны. Титр полной РНК может быть приготовлен на том же уровне, например, сравнением рРНК титров в электрофорезе на агарозном геле, что позволяет корректно сравнивать титры экспрессированной ЕХТ генной мРНК. Так например, при использовании растений фасоли Azuki, выращиваемых в течение 40 дней после посева, полные РНК, которые экстрагировали из стеблей, почек и листьев гуанидин тиоцианатным методом, подвергали электрофорезу на агарозном геле с последующей Нозерн гибридизацией с использованием в качестве зонда ДНК, имеющей последовательность, специфичную к ЕХТ генной кДНК, которая отличается от других семейных генных кДНК. В этом случае фильтр, полученный после 23 гибридизации, промывали при таких интенсифицированных условиях, что упомянутый выше зонд, имеющий последовательность, специфичную к ЕХТ генной кДНК, может конъюгироваться только с мРНК ЕХТ гена-мишени без конъюгации с другими генами мРНК семейства,в результате чего возникала возможность детекции только экспрессии целевого ЕХТ гена. Такая экспрессия может быть также подтверждена размером мРНК. Сравнение титров ЕХТ генной мРНК в каждой растительной ткани позволяет установить, что ЕХТ генная мРНК экспрессируется во всех сайгах и интенсивно экспрессирует,особенно в стеблях, где активно протекает реконструкция ксилоглюкана стенки растительной клетки. Кроме этого, при использовании побегов фасоли Azuki, полную РНК, которую экстрагировали из каждого разреза эпикотиля длиной в 1 см, подвергали анализу с помощью электрофореза на агарозном геле с последующей Нозерн гибридизацией при использовании ЕХТ генной кДНК в качестве зонда. Таким образом, можно установить, что экспрессия наиболее интенсивна в таком участке, где происходит обильный рост эпикотиля, а именно на участке, где активно протекает реконструкция ксилоглюкана стенки растительной клетки. Сайт экспрессии для каждого гена семейства может быть точно установлен Нозерн гибридизацией с использованием зонда, специфичного к соответствующим семейным генам в соответствии с описанным выше способом. Каждую из клеток культуры табака BY2NIHON HAKKOU KOUGAKUKAI (Japan Fermentation Technology Society) в 1972 г], культивированную в течение 1, 4, 6, 8 и 10 дней, собирали фильтрацией с отсосом, немедленно подвергали быстрому замораживанию с использованием жидкого азота и затем выдерживали при-80 С до начала операции по экстракции РНК. Полная РНК, экстрагированная из таких клеток фенол-SDS методом, может быть подвергнута анализу с помощью электрофореза на агарозном геле с последующей Нозерн гибридизацией с использованием ДНК, имеющей последовательность, специфичную к кДНК табачного ЕХТ гена, в качестве зонда. Сравнение экспрессии позволяет сделать вывод, что экспрессия протекает в любой момент времени и она особенно интенсивна в фазе логарифмического роста (4 дня). Также удалось обнаружить, что в отличие от этого, табачный XRP1 ген, ген семейства,интенсивно экспрессируется в стационарной фазе и не так интенсивно экспрессируется в фазе логарифмического роста. Идентификация сайта экспрессии и стадия экспрессии методом RT-PCR Метод RT (обратная транскриптаза)-PCR может использоваться для простого анализа экспрессии, контролируемой про-моторами генов семейства ЕХТ. 24 Так например, стебли, почки и листья растений фасоли Azuki, выращиваемых в течение 40 дней после посева, собирали по отдельности,немедленно подвергали быстрому замораживанию с использованием жидкого азота и затем хранили при -80 С до начала операции по экстракции РНК. Полные РНК экстрагировали из таких тканей, например, гуанидин тиоцианатным методом. Каждую из полных РНК можно использовать в качестве матрицы для RT-PCR с применением набора TaKaRa РНК PCR (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) с целью идентификации сайта экспрессии. В этом случае, сайтэкспрессионная специфичность, контролируемая промотором генов семейства, может быть идентифицирована с использованием последовательности, специфичной к соответствующему гену семейства в качестве праймера. Так например, при использовании растений фасоли Azuki, выращиваемых в темноте в течение 5 дней после посева, каждые 1 см секции эпикотиля собирали по отдельности, немедленно подвергали быстрому замораживанию с использованием жидкого азота и затем хранили при -80 С до начала операции по экстракции РНК. Каждая из полных РНК, которые экстрагировали из таких тканей, например гуанидин тиоцианатным методом, может использоваться в качестве матрицы для RT-PCR с применением набора TaKaRa РНК PCR (TAKARA SHUZOCo., Ltd.) с целью более подробной идентификации специфичности сайта экспрессии и стадии экспрессии. Так например, каждую из клеток культуры табака BY2, культивированную в течение 0, 1, 2,4, 6, 8 и 10 дней, собирали фильтрацией с отсосом, немедленно подвергали быстрому замораживанию с использованием жидкого азота и затем хранили при -80 С до начала операции по экстракции РНК. Каждая из полных РНК, экстрагированных из таких клеток фенол-SDS методом, может использоваться в качестве матрицы для RT-PCR с применением TaKaRa РНК PCR набора (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) для идентификации стадии экспрессии. В этом случае специфичность стадии экспрессии, контролируемая каждым промотором генов семейства,может быть идентифицирована с использованием последовательности, специфичной к каждому табачному ЕХТ гену и его гену семейства в качестве праймера. Прямой перенос гена и измерение GUSактивности - транзитный анализ Последовательность полной длины или часть последовательности, содержащей упомянутый выше промотор, отрезали и лигировали с большим числом генов-репортеров с целью получения химерных генов. Промоторная активность может быть измерена прямым переносом такого химерного гена в растительные клетки. Под термином "ген-репортер" понимается ген, который лигируется в прямом направлении 25 от промоторной области целевого гена с целью изучения промоторной активности гена или действия цис-элементов. Кодирующая область энзимного гена, происходящего из Е.соli, главным образом используется в качестве репортера, поскольку клетки, подлежащие трансформации химерным геном, не должны обладать такой же или аналогичной энзиматической активностью. Примерами такого гена-репортера в случае растений могут служить гены GUS E.coli, хлорамфеникол ацетилтрансфераза (CAT), галактозидаза (lacZ), неомицин фосфотрансфераза (NPTII), люцифераза и т.п., среди которыхGUS Е.соli был недавно использован особенно успешно.(4-MUG, WAKO Pure Chemicals Industries, Ltd.) в качестве субстрата, проводя измерение специфической флуоресценции, испускаемой его продуктом, 4-метил-умбеллифероном (4-MU, nacalai tesque). Измерение 4-MU может быть легко осуществлено, поскольку это вещество обладает высокой устойчивостью и низким фоном флуоресценции. Кроме этого, в том случае, когда в качестве субстрата используют 5-бром-4-хлор 3-индолилD-глюкуронид (Х-Глюк, Молекулярные зонды), продукт представляет собой нерастворимый индиго-голубой пигмент, называемый индиготином, и, таким образом, с использованием его свойства можно легко исследовать локализацию GUS активности в клетках или тканях. Сравнение промоторной активности может быть осуществлено с использованием, например, промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, который содержится в pBI121 (Clontech) и pBI 22i(Clontech). Транскрипция может эффективно обрываться присоединением транскрипционнотерминальной последовательности в прямом направлении от гена-репортера. Транскрипционно-терминальная последовательность может происходить из ЕХТ гена или из другого гена. Кроме этого, эффективность транскрипции может быть увеличена соединением с поли-А присоединенной последовательностью в прямом направлении от вставленной последовательности. Поли-А присоединенная последовательность может происходить их ЕХТ гена или другого гена, примерами которых могут служитьJournal, 3, 835-846 (1984)] и Agrobacterium нопалин синтетаза [The Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573 (1982)]. Такая химерная генная кассета может быть вставлена в соответствующий вектор и амплифицирована в Е.соli в виде плазмиды с целью прямого переноса в живой организм. 26 Примерами метода введения вектора, содержащего такой химерный ген, в живой организм могут служить метод микроинъекций(1986)], полиэтиленгликолевый метод [Nature,296, 72-74 (1982)], метод особого мечения [Nature, 327, 70-73 (1987)], метод слияния протопласта с кассетной ДНК или РНК-содержащими мелкими клетками, клетками, лизоимом и т.п. [Ргосеedings of the National AcademyNational Academy of Sciences of the USA, 82,5824-5828 (1985)] и так далее. Быстрая транскрипционная экспрессия перенесенного таким образом гена в клетках в течение нескольких начальных дней может быть использована для транзитного анализа продукта экспрессии в экстракте клеток, которые культивировали в течение 1-2 дней после переноса. Примерами плазмидного вектора, который может быть амплифицирован в E.coli, могут служить промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты, GUS ген Е.coli-происхождения иpBI121 (Clontech), имеющая кассету транскрипционно-терминационной последовательности,происходящую из нопалин синтетазы. С целью удаления промоторнои области 35S мозаичного вируса цветной капусты в плазмиде, такую плазмиду подвергают перевариванию с рестрикционными энзимами Hind III и Xba I (TAKARA SHUZO Co., Ltd.), с последующим электрофорезом на агарозном геле для отрезания целевого фрагмента, отличного от 35S промоторной области. ДНК-фрагмент, содержащий промоторную область ЕХТ гена, может быть перенесен в такой очищенный сайт. Полученный таким образом фрагмент ДНК, содержащий промоторную область ЕХТ гена, и вектор, содержащий химерный ген GUS гена, могут быть перенесены в клетки табакаBY2 с использованием, например, метода электропорации. С целью переноса в клетки культуры табака BY2 с использованием метода электропорации клетки культуры табака BY2 могут быть превращены в несодержащие клеточных стенок протопласты путем обработки, например, энзимным раствором (рН:5.5), содержащим 1% целлюлазы-ONOZUKA (Yacult Honsha Co.,Ltd.), 0.1% пектолиазы Y23 (SEISHIN Corporation), и 0.4M маннита при 30 С в течение 2 ч. Суспензию полученных 2 х 106 протопластов клеток культуры табака BY2 в электропорационном буферном растворе (70 мМ КСl,1,5 мМ MES и 0.3 М маннита) смешивали с 3 пмол. векторной ДНК и 10% PEG6000/электропорационный буферный раствор. На полученную в результате смесь воздействовали электрическим импульсом (300 V, 125 мкF) с использованием импульсного устройства Gene 27 ДНК в растительные клетки. Затем клетки инкубировали в Linsmaier-Skoog культуральной среде [Physiologia Plantarum, 18, 100 (1965)],содержащей 0,2 мг/л 2,4-D в виде ауксина, 1% сахарозы и 0,4M маннита при 26 С в течение 12 дней после переноса. Клетки экстрагировали,и количество GUS продукта экспрессии в экстракте могло быть измерено флуоресцентным анализом. Так например, смесь регенерированных клеток в 200 мкл экстракционного буферного раствора [50 мМ фосфатного буфера (рН 7.0), 10 мМ ЕДТА, 0,1% Тритона Х-100, 0,1% Саркозила и 10 мМ 2-меркаптоэтанола], помещенную в пробирку Эппендорфа, подвергали ультразвуковой обработке, и супернатант, выделенный центрифугированием, использовали для анализа на GUS активность и анализа на содержание белка с целью определения GUS удельной активности.GUS активность анализировали измерением специфической флуоресценции (длина волны возбуждения: 365 нм; длина волны флуоресценции: 455 нм), испускаемой, например, 4-MU,продуктом, образующемся при использовании в качестве субстрата 4-MUG. Так например, 45 мкл экстракционного буферного раствора и 25 мкл 4 мМ 4-MUG добавляли для реакции с каждыми 30 мкл экстракта, помещенного в 96 луночный титрометрический микропланшет. Через 5, 35 и 95 мин реакцию прекращали добавлением 50 мкл реакционно-терминационного раствора (1 М Nа 2 СО 3). Затем специфическую флуоресценцию, (длина волны возбуждения: 365 нм; длина волны флуоресценции: 455 нм),испускаемую 4-MU, измеряли с помощью флуоресцентного планшет-ридера с целью анализа 4MU, продукта, образующегося при использовании в качестве субстрата 4-MUG. Кроме того, количество белка определяли по методике, пример которой приведен ниже. Так, 2, 5, 10, 15, 20 и 30 мкл 1/5-разбавленного раствора экстракта или 800 мкг/мл BSA стандартного раствора (20 мкл экстрактного буферного раствора, смешанного с 80 мкл 2 мг/млBSA) помещали в 96-луночный титрометрический микропланшет и добавляли, соответственно, 158, 155, 150, 145 и 130 мкл дистиллированной воды и 40 мкл аналитического реагента из набора Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories), доводя объем каждой системы до 200 мкл. После медленного перемешивания и выстаивания в течение 20 мин при комнатной температуре в смеси проводили измерения на планшет-ридере (длина волны: 590 нм) в течение 60 мин с целью определения содержания белка. Во время проведения указанных выше анализов измеряли интенсивность флуоресценции стандартных растворов 4-MU и строили график, нанося количество 4-MU (пмоль) на ось Х и интенсивность флуоресценции - на ось Y. Из угла наклона полученной кривой определяли количество 4-MU, в расчете на единицу флуо 002757 28 ресценции. Кроме этого, результаты, полученные на образцах, представляли в виде графика,на котором по оси Х откладывали время (в минутах), а по оси Y - интенсивность флуоресценции, с целью определения прироста скорости интенсивности флуоресценции и последующего определения скорости разложения 4-MUG, которая равна активности GUS. Кроме этого,удельная активность GUS может быть получена из количества белка. Таким образом было установлено, что ДНК-фрагмент, содержащий промоторную область ЕХТ гена, обладает большей активностью,чем активность промотора 35S мозаичного вируса цветной капусты, который, как известно,интенсивно экспрессируется в растениях. Трансформация растений или растительных клеток Полученный таким образом ДНКфрагмент, содержащий промоторную область ЕХТ гена, и вектор, содержащий вставленный химерный ген GUS гена, могут быть перенесены в растения и растительные клетки с целью получения трансформантов. Предпочтительно, чтобы вектор, в который вставлен химерный ген, содержал селективный маркерный ген с целью облегчения селекции трансформированных растений или растительных клеток. Так например, ген, обладающий свойством антибиотической устойчивости (антибиотически устойчивый ген), может использоваться в качестве маркерного гена. Примерами такого гена могут служить гены, обладающие устойчивостью к G418, гигромицину, блеомицину, канамицину, гентамицину и хлорамфениколу. В том случае, когда антибиотически устойчивый ген интегрируется в вектор, трансформированные растения или растительные клетки, а именно растение или растительные клетки, в которые перенесена такая кассета, могут быть легко селекционированы путем выбора растений или растительных клеток, которые растут в культуре, содержащей антибиотик. Примерами метода введения вектора, содержащего вставленный химерный ген, непосредственно в растения могут служить микроинъекционный метод, полиэтиленгликольный метод, метод мечения частиц, метод протопластного слияния с векторсодержащими мелкими клетками, клетками, лизозимом и т.п., метод электропорации и т.д. Кроме этого, химерный ген может быть перенесен в растения с использованием в качестве вектора растительного вируса. Так например, мозаичный вирус цветной капусты может использоваться в качестве растительного вируса. В этом случае вирусный геном вначале подвергают инсерции в вектор происхожденияE.coli для получения рекомбинанта и затем такую кассету вставляют в вирусный геном. Такая кассета может быть вставлена в растения путем отрезания модифицированного таким образом 29 вирусного генома от указанного рекомбинанта с использованием рестрикционных энзимов с последующей инокуляцией генома в растения(Molecular Biology of Plant Tumors, pp. 549-560,изд. Academic Press, в 1932 г и патент США 4407956). Помимо этого, такая кассета может быть перенесена в растения с использованием свойства бактерии рода Agrobacterium при инфицировании растения, состоящего в том, что часть ее плазмидной ДНК переносится в геном растения. Бактерии из рода Agrobacterium, Aqrobacterium tumefaciens, инфицируют растение с возникновением корневого рака и Agrobacteriumrhizogenes инфицирует растение с возникновением корневых волосков, что связано с переносом области, называемой областью переноса ДНК в бактериальной плазмиде под названиемTi плазмида или Ri плазмида, в растение для интеграции в растительный геном при бактериальном инфицировании растения. Кроме этого,имеется другая область, называемая virобластью в Ti плазмиде или Ri плазмиде, которая существенна для Т-ДНК области, подлежащей переносу в растение и последующей интеграции в растение. Vir-область, как таковая, не переносится в растения и, кроме этого, такая virобласть может воздействовать на плазмиду, отличную от той, что содержит Т-ДНК область[Nature, 303, 179-189 (1983)]. Если целевая ДНК, подлежащая интеграции в растительный геном, вставляется в Т-ДНК область на Ti плазмиде или Ri плазмиде, то целевая ДНК может интегрироваться в растительный геном, когда бактерии рода Agrobacterium инфицируют растение. Затем, часть, вызывающую корневой рак или корневые волоски, в ТДНК области на Ti плазмиде или Ri плазмиде удаляют без ущерба для целевой функции переноса и полученную в результате плазмиду можно использовать в качестве вектора. В настоящем изобретении можно использовать большое число таких векторов. Так например, при использовании рВI121 (Clontech), называемого бинарным вектором, сайт GUS гена, связанный с промотором 35S мозаичного вируса цветной капусты в рВI121, заменяется на ДНК фрагмент,содержащий промоторную область ЕХТ гена, и химерный ген с GUS геном для использования в переносе указанного химерного гена в растение. В этом случае одновременное использование вектора, содержащего беспромоторный GUS ген(pBI101, Clontech) в качестве отрицательного контроля, pBI121 (Clontech) и т.п., позволяет провести сравнение с типом экспрессии промотора 35S мозаичного вируса цветной капусты. Поскольку такой вектор не имеет vir-области,необходимо, чтобы бактерии рода Agrobacterium содержали другую плазмиду, имеющую 30 Более того, такой вектор может быть амплифицирован не только в бактериях рода Agrobacterium, но также в E.coli. Соответственно,рекомбинантные операции с Ti плазмидой могут осуществляться с использованием E.coli. Кроме этого, такой вектор содержит антибиотически устойчивый ген, и трансформант может легко селектироваться, когда E.coli, бактерии родаAgrobacterium и растения подвергаются трансформации. Такая трансформация применима к любым разновидностям растений при условии, что растение может инфицироваться бактериями родаAgrobacterium и имеет регенерационную систему. Большинство двудольных растений может подвергаться трансформации с использованием бактерий рода Agrobacterium и, в особенности,все растения, являющиеся в природных условиях хозяевами бактерий рода Agrobacterium, могут быть трансформированы in vitro. Хотя однодольные растения, включая хлебные злаки, в природных условиях не являются хозяевами бактерий рода Agrobacterium, растения ржи[Nature, 338, 274-276 (1989)] и т.п. могут быть трансформированы in vitro. Трансформацию можно проводить (1) с использованием протопластов и (2) с использованием частей тканей или необработанных клеток. Для использования способа (1) требуется создать систему регенерации растения из трансформированных протопластов. Для использования метода (2) необходимо трансформировать части тканей или необработанных клеток с использованием бактерий рода Agrobacterium и затем создать систему их регенерации в растении. Трансформированное растение может быть подвергнуто селекции путем выращивания в культуральной среде, содержащей агент, который может представлять собой вышеупомянутый трансформационный маркер. Способ регенерации растения из растительных клеток, хотя и может зависеть от природы растения, обычно заключается в получении каллюса из суспензии трансформированных протопластов в случае (1), или из части тканей или необработанных клеток, которые трансформируются на планшете в случае (2), с последующим образованием побегов. Кроме этого,культуральная среда, используемая для регенерации, может содержать, помимо большого числа аминокислот, такие гормоны, как ауксин или цитокинин. Факт инсерции целевой кассеты в геном трансформированного растения может быть подтвержден Саузерн гибридизацией или аналогичным методом, тогда как факт образования мРНК гена-репортера в растении может быть установлен Нозерн гибридизацией или подобным методом. 31 При использовании растения, в которое вставлен химерный ген, полученный как описано выше, такой химерный ген может переноситься в следующее поколение растения путем скрещивания. Так например, плазмида, содержащая фрагмент ДНК, имеющий промоторную область ЕХТ гена и химерный ген с GUS геном, предусматриваемые настоящим изобретением, могут быть сконструированы в pBI121 (Clontech). Далее, сконструированная таким образом плазмида может использоваться для трансформации соответствующего штамма рода Agrobacterium,такого как Agrobacterium tumefaciens LBA4404 штамм [Nature, 303, 179-180 (1983); полученный от Clontech], с последующим инфицированием таким трансформантом целевого растения с целью его трансформации. Так например, семена Arabidopsis (полученные от Notlingham Arabidopsis Stock Center:NASC) аспетически культивируют на MSO планшете [MURASHIGE-Skoog смесь неорганических солей (WAKO Pure Chemicals Industries.,Ltd), смешивают с 2% сахарозы, 3 мг/л тиамин гидрохлорида, 5 мг/л никотиновой кислоты и 0,5 мг/л гидрохлорида пиридоксина, устанавливают рН 6,3, дополнительно смешивают с 0,2% геллановой смолы, обрабатывают в автоклаве и высевают на чашах] в соответствии с традиционной методикой, и затем нарезанные секции корней используют для культивирования каллюса на CIM планшете (0,5 мг/л 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 мг/л кинетина добавляют на MSO планшет). Каждую из Agrobacterium, трансформированных с помощью плазмиды, содержащей вышеупомянутый химерный ген, и Agrobacterium,трансформированную рВI121 и pBI101, подвергают культивированию и разбавленную смесь распределяют по пробиркам. Затем секции корней, которые образовали каллюс, замачивают в такой смеси и сокультивируют на CIM планшете в течение нескольких дней. После того, как каждый бактериальный штамм достаточно разрастается до визуально наблюдаемого состояния, его убивают специфичным к бактериям антибиотиком и секции корней культивируют дополнительно в течение нескольких дней наChemicals Industries, Ltd.)] до конечной концентрации 5 мкг/мл, IAA (3-индолуксусная кислота,WAKO Pure Chemicals Industries, Ltd.) до конечной концентрации 0,15 мкг/мл и Клафоран(Хехст) до конечной концентрации 500 мкг/мл]. Полученные в результате секции окончательно культивируют на SIMCS планшете (SIMC планшет, содержащий канамицин) и каждую неделю несколько раз трансплантируют на новый планшет. Трансформированные разрезанные секции продолжают расти с образованием вздутой массы, тогда как нетрансформирован 002757 32 ные секции становятся коричневыми. Трансформант культивировали до образования розеточных листьев и нижнюю часть трансформанта отрезали скальпелем, поскольку она не содержала каллюсной части, и переносили на RIM планшет (IAA добавляли до конечной концентрации 0,.5 мкг/мл к MSO планшету). Через 8-10 дней культивацию продолжали в твердоволокнистом мини-боксе (NITTO BOUSEKI Co.,Ltd.), погруженном в неорганическую солевую культуральную среду [Hyponecks (Hyponecks,Япония)], 1000-кратно разбавленный водой]. После цветения и стручкования растение трансплантировали в почву, смоченную неорганической солевой культуральной средой для получения семян. Такие семена стерилизовали и затем высевали и проращивали на MSK планшете (наMSO планшет добавляли канамицин до конечной концентрации 500 мг/л) с получением трансформанта. Факт осуществления трансформации может быть установлен экстракцией ДНК из такого трансформанта традиционным способом,расщеплением ДНК с помощью рестрикционных энзимов Hind III и EcoR I с использованием Саузерн гибридизации с применением в качестве зонда промоторной области, полученной перевариванием pVXP-Н 3 с рестрикционными энзимами Hind III и EcoR I. Так например, в том случае, когда описанный выше способ осуществляют на (1) WS штамме, который не подвергается трансформации, (2) на трансформанте, в который перенесен химерный ген и (3) на трансформанте, в который перенесен лишь вектор рВI121, специфический сигнал примерно в 1.8 кб, помимо эндогенных сигналов, общих для(1)-(3), наблюдается в образце (2), переваренном с рестрикционными энзимами Hind III и EcoR I,вследствие чего устанавливается факт того, что ДНК, содержащая промотор ЕХТ гена, интегрирована в (2). В том случае, когда полученный таким образом трансформант анализируют на GUS активность с использованием X-Gluc в качестве субстрата, локализация GUS активности в клетках или тканях может быть легко установлена с использованием свойства продукта, называемого индиготином, нерастворимого индигоголубого пигмента. Так например, молодые растения, полученные посевом стерилизованных семян на MSK планшет (на MSO планет добавляли канамицин до конечной концентрации 50 мг/л) с последующим проращиванием, помещали, как таковые, в воду, содержащую 2 мМ DTT и после деаэрации при пониженном давлении переносили в GUS реакционный раствор [1 мМX-Gluc, 50 мМ фосфатный буферный раствор(рН 7.0) и 20% метанола] с целью проведения реакции при 37 С в течение 0,5-4 ч. После завершения реакции добавляли этанол для остановки реакции и удаляли такие пигменты, как хлорофилл, и растения промыва 33 ли два или три раза этанолом, выстаивали в течение промежутка времени от трех часов до ночи, и затем переносили в чашу Петри, заполненную водой. Растения помещали на предметное стекло микроскопа и, после добавления 1-2 капель 70% водного глицерина с целью закрепления, с последующим дополнительным добавлением глицерина, прижимали предметным стеклом с целью микроскопического изучения. В том случае, когда описанную выше методику осуществляли на (1) штамме WS, который не подвергается трансформации, (2) трансформанте, в который перенесен химерный ген, и (3) трансформанте, в который перенесен только раствор рВI121, можно наблюдать, что части ткани, которые растут с удлинением в (2), окрашиваются в голубой цвет, тогда как ткани в(3) окрашиваются, хотя и неровно. Далее приведен пример способа, который может использоваться как способ получения промотора, который способен гибридизироваться с растительным промотором настоящего изобретения и, кроме этого, обладает промоторной активностью в, по крайней мере, одном объекте,выбранном из растений, растительных клеток и трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток. Вначале хромосомную ДНК, полученную из источника целевого гена, переносили в организм хозяина путем лигирования с плазмидой или фаговым вектором, в соответствии с традиционным способом, с получением библиотеки. Такую библиотеку культивировали на планшете и выращенные колонии или бляшки переносили на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану, на которой ДНК иммобилизовали путем денатурации. Мембрану нагревали в растворе,содержащем зонд, меченый 32P и т.п., (примерами такого зонда могут служить нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 в перечне последовательностей, или некоторые их гены) с целью гибридизации ДНК на мембране с зондом. Так например, ДНК-иммобилизованную мембрану подвергали гибридизации с зондом при 65 С в течение 20 ч в растворе, содержащем 6 х SSC,1% лаурил сульфата натрия, 100 мкг/мл ДНК сермоновой спермы и 5 х раствора Денхардта(содержащего альбумин коровьей сыворотки,поливинилпирролидон и фиколл, каждый с концентрацией 1%). После гибридизации, неспецифическую адсорбцию отмывали, а клон, гибридизированный с зондом, идентифицировали ауторадиографически или аналогичным способом. Такой процесс повторяли до тех пор, пока не получали единственный гибридизированный клон. В полученный таким образом клон вставляли целевой растительный промотор. Нуклеотидную последовательность полученного в результате гена определяли, например, описанным ниже способом с целью под 002757 34 тверждения того, что такой ген является целевым растительным промотором. В случае нуклеотидного секвенирования клона, полученного гибридизацией, при использовании в качестве рекомбинанта E.coli культивировали в испытательных пробирках или т.п., и плазмиду экстрагировали традиционным способом. После расщепления с рестрикционными энзимами вставленный фрагмент извлекали и подвергали субклонированию в вектор М 13 фага с последующим нуклеотидным секвенированием дидезокси методом. В том случае, когда рекомбинант представляет собой фаг, нуклеотидное секвенирование может осуществляться с использованием таких же стадий. Основные экспериментальные методы для такой культивации до нуклеотидного секвенирования описаны в справочнике "Molecular Cloning, A LaboratorySpring Harbor Laboratory Press в 1989) и т.д. С целью подтверждения того, что полученный ген представляет собой целевой растительный промотор, установленную нуклеотидную последовательность сравнивали с последовательностью растительного промотора настоящего изобретения и с нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQID1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 в перечне последовательностей, с целью установления структуры гена. В том случае, когда полученный ген не содержит полной промоторной области растения,готовят праймер синтетической ДНК на основе полученного гена, и далее нуклеотидная последовательность всей растительной промоторной области, которая гибридизируется с промотором настоящего изобретения, может быть определена амплифицированием дефицитной области с помощью PCR и дополнительным скринингом ДНК-библиотеки с использованием полученного генного фрагмента в качестве зонда. Далее, на основе нуклеотидной последовательности растительного промотора настоящего изобретения может быть осуществлена модификация части нуклеотидной последовательности с помощью, по крайней мере, одной операции,выбранной из замены, инсерции и делеции, которые индуцируются сайт-направленным мутагенезом гена, содержащего нуклеотидную последовательность, что позволяет изменить функцию растительного промотора настоящего изобретения, в результате чего получают растительные промоторы, аналогичные растительным промоторам настоящего изобретения. Примерами известных способов осуществления такого сайт-направленного мутагенеза могут служить двух-нитевой дуплекс-метод [Methods in Enzymology, 154, 350-367 (1987)], урацилсодержащий ДНК-метод [Methods in Enzymology, 154, 367-382 (1987)], нитритный методof the USA, 79, 7258-7262 (1982)], и, кроме это 35 го, метод кассетного мутагенеза [Gene, 34, 315323 (1985)]. Кроме этого, на основе нуклеотидной последовательности растительного промотора настоящего изобретения конструируют химерный промотор [Proceedings of the National Academyof Sciences of the USA, 88, 7266-7270 (1991)] путем лигирования или замены гена, содержащего нуклеотидную последовательность, или части гена, геном известных растительных промоторов или т.п., или частью такого гена, в результате чего получают растительный промотор, обладающий промоторной активностью на таком сайте и стадии, которые требуются для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, аналогичный промоторам настоящего изобретения. Лигирование полученного таким образом растительного промотора в прямом направлении от него с помощью полезного гена в действующем состоянии с последующим анализом промоторной активности тем же способом, что используется для промоторов настоящего изобретения, позволяет подтвердить факт функционирования растительного промотора в, по крайней мере, одном из объектов, выбранных из растений, растительных клеток и трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток. Кроме этого, может быть идентифицирован сайт экспрессии, специфически контролируемый растительным промотором. В том случае, когда растительный промотор, получаемый в настоящем изобретении,вводится в любой объект, выбранный из растений, растительных клеток и трансгенных растений, регенерированных из растительных клеток,такой промотор может вводиться в виде вектора, который сохраняется экстрахромосомально,или вектора, который интегрируется интрахромосомально. Такие экстрахромосомально сохраняемые векторы и интрахромосомально интегрированные векторы известны в данной области, и введение в растения и трансгенные растения, регенерированные из растительных клеток, может осуществляться, например, методом микроинъекций, полиэтиленгликолевым методом, методом мечения частиц, методом слияния протопласта с векторсодержащими мелкими клетками, клетками, лизозимом и т.п., методом электропорации и т.д. Кроме этого, вектор может быть превращен в химерный ген, в котором ген, кодирующий несколько аминокислот на Nконце энзима, обладающего функцией реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, в прямом направлении от растительного промотора, лигируют в обратном направлении от полезного гена в действующем состоянии. Использование ЕХТ гена или семейства генов ЕХТ, получаемых в настоящем изобретении, или полинуклеотидов полной последовательности или их неполных последовательностей, способных гибридизироваться с промото 002757 36 рами, лигирование полезного гена в прямом направлении его транскрипции в действующем состоянии с последующим введением в растения и растительные клетки, позволяет индуцировать генную экспрессию специфическим образом, на таком сайте и стадии, которые требуются для реконструкции ксилоглюкана стенки растительной клетки, подобно промоторам настоящего изобретения, в результате чего регулируется морфология растения. Так например,такой контроль может осуществляться лигированием гена, кодирующего антисмысловую РНК, "приманку" и т.п. или рибозим, с целью его функционирования в прямом направлении от промотора настоящего изобретения с последующим введением в растения, растительные клетки и трансгенные растения, регенерированные из растительных клеток. Карликовые растения могут быть получены регулированием морфологии растения, тогда как стерильные мужские растения могут быть получены регулированием элонгации пыльцевой трубки. Кроме того, качество пищи или корма может быть улучшено для растений, удлиняющиеся/растущие стебли которых, представляющие собой участки, требуемые для реконструкции ксилоглюкана клеточной стенки растения, используются в качестве пищи. Кроме этого, индукция специфической генной экспрессии в фазе логарифмического роста или стационарном состоянии клеточной культивации позволяет, например, контролировать клеточную пролиферацию и повышать продуктивность по ценным вторичным метаболитам. Более того, в соответствии с настоящим изобретением, растительные промоторы, обладающие промотирующей активностью на таком участке и стадии, которые требуются для реконструкции ксилоглюкана клеточной стенки растения, могут быть клонированы с использованием генов, кодирующих энзимы, обладающие функцией, способствующей осуществлению реконструкции ксилоглюкана клеточной стенки растения, и, особенно, генов, кодирующих ЕХТ или его функциональный эквивалент. Следующие ниже примеры дополнительно и более подробно иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его объем. Пример 1. Выделение генов семейства ЕХТ 2 фасоли Azuki и ЕХТ 3 фасоли Azuki эндо-ксилоглюкан трансферазы (ЕХТ).Takara (WATANABE SHUSHI Co., Ltd.) проращивали в соответствии со способом, описанным в Physioloqia Plantarum, 82, 490-497 (1991). Через неделю после прорастания стебли и листья на грунтовом участке отрезали с получением около 2 г растительной ткани. Этот объект немедленно замораживали в жидком азоте и измельчали в ступке в присутствии жидкого азота с получением порошка, который суспен 37 дировали в 20 мл денатурированного раствора[7 М тиоцианата гуанидина, 25 мМ цитрата натрия (рН:7.0), 0,1 М меркаптоэтанола и 2% лаурилсаркозината натрия]. Полученную в результате суспензию дробили в Polytron, смешивали с 10 мл денатурированного раствора и 30 мл раствора фенол/хлороформ [смесь воды, насыщенной кислотным фенолом, и системы хлороформ/изоамиловый спирт (49:1) в соотношении 1:1] при интенсивном перемешивании и подвергали центрифугированию для отделения водного слоя, который смешивали с изопропиловым спиртом, 1/10 объема 3 М ацетат натрия и 1/300 объема уксусной кислоты и затем центрифугировали с получением примерно 4 мг РНК в виде осадка. Такой осадок растворяли в 2 мл адсорбционного буферного раствора [20 мМ Трис-НСl(рН:7,5), 2 мМ ЕДТА, 1 М NaCl и 0,5% SDS] и адсорбировали на oлиго (dT)-целлюлозной колонке типа 7 (Pharmacia), которую элюировали элюирующим буферным раствором [10 мМ Трис-НСl (рН:7,5) и 1 мМ ЕДТА] с выделением около 25 мкг поли (А) +РНК.(А) +РНК, полученной в примере 1-(1) с использованием набора для синтеза кДНК System-Plus(Amersham) в соответствии со способом, описанным в Gene, 25, 263-269 (1983) с применением в качестве вектора gt10 (Stratagene). кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki [ЕР-0562836 А 1 (1993)] метили [-32P]dCTP с использованием набора для рандомизированного праймерного мечения(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) с получением зонда для гибридизации. Удельная активность такого зонда составляла 7,5 х 108 срm/мкг. Метод гибридизации бляшек с использованием такого зонда применяли на сконструированной выше кДНК-библиотеке. Так например, бляшки образовывались в количестве 1 х 104 бляшек на чашку и переносились на мембрану. После денатурации, нейтрализации и иммобилизации мембрану подвергали прегибридизации в прегибридизационном буферном растворе (6 х SSC, 0,1% SDS,5 х раствора Денхардта и 10 мкг/мл ДНК лососевой спермы) при 50 С в течение 2 ч. Затем добавляли гибридизационный буферный раствор для получения зонда в количестве 2 х 105 - 106/мл и гибридизацию проводили в течение 15 ч при 50 С. После завершения гибридизации мембрану дважды промывали промывным раствором,содержащим 6 х SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре в течение 20 мин. Мембрану экспонировали в течение ночи при -80 С в кассете,в которую помещали чувствительную к действию рентгеновских лучей пластину (Kodak) с целью получения ауторадиографии. В результате отбора из 5 х 104 бляшек было получено 96 положительных бляшек. Каждую из таких бля 002757 38 шек подвергали вторичному скринингу и использовали в следующем эксперименте.(3) Классификация бляшек и выделение кДНК ЕХТ 2 фасоли Azuki и кДНК ЕХТЗ фасолиAzuki, генов семейства ЕХТ гена. Метод лизиса в чашках (T.Maniatis с сотр.,"Molecular Cloning. A laboratory Manual", Второе изд., глава 2, стр. 60-66; опубликовано ColdSpring Harbor Laboratory Press в 1989) применяли на полученных выше бляшках для получения большого количества фаговых частиц, которые использовали для дот-гибридизации с применением в качестве зонда кДНК ЕХТ гена фасолиAzuki, используемой в примере 1-(2). После гибридизационных стадий, осуществленных тем же способом, что описан выше, фильтры промывали в условиях градиентного усиления 6 хSSC, 4x SSC, 2x SSC и 0.1x SSC при 50 С и затем 0,1x SSC при 65 С с целью осуществления классификации на основе интенсивностей сигналов. В результате бляшки классифицировали на 6 типовых групп. Среди таких групп два типа бляшек, дающих интенсивности сигнала, отличные от интенсивностей ЕХТ гена фасоли Azuki,получали из групп, где сигналы детектировались после промывки 0,1x SSC при 50 С, но не детектировались после промывки 0,1x SSC при 65 С. Фаги выделяли из таких бляшек и вставленные ДНК экстрагировали. Длины ДНКфрагментов идентифицировали расщеплением указанных ДНК с рестрикционным энзимомEcoR I с последующим электрофорезом на агарозном геле. В результате около 730 п.о. и около 430 п.о. детектировали из одного типа бляшек и около 1090 п. о.- из другого типа бляшек. Каждый из таких ДНК-фрагментов подвергали очистке с последующим субклонированием в EcoRI сайт pUC18 (ТАKARA SHUZO Co., Ltd.) и полученные в результате плазмиды обозначали как pVX-44-1, pVX-44-2 и pVX-45-1, соответственно. В том случае, когда такие плазмиды подвергали нуклеотидному секвенированию ДНКфрагментов в соответствии с упомянутым выше методом Сэнгера [Science, 241, 1205-1210(1981)] с использованием набора для дидезокси секвенирования BcaBEST (TAKARA SHUZOCo., Ltd.), ген (ЕХТ 2 фасоли Azuki), обладающий высокой гомологией с ЕХТ геном фасолиAzuki, клонировали из pVX-44-1 и pVX-44-2, и,кроме этого, другой тип гена (ЕХТ 3 фасолиAzuki), обладающий высокой гомологией с ЕХТ геном фасоли Azuki, клонировали из pVX-45-1. Неполные нуклеотидные последовательности этих генов представлены в SEQ ID11 и SEQAzuki, гена семейства ЕХТ гена. кДНК-библиотеку конструировали из поли(А) +РНК, полученной в примере 1-(1) с использованием набора для синтеза кДНК (TAKARASHUZO Co., Ltd.) в соответствии со способом,описанным в Gene, 25, 263-269 (1983), с исполь 39 зованием ZAPII (Stratagene) в качестве вектора. Для получения зонда смешанный синтетический олигонуклеотид (27 mer, SEQ ID13), соответствующий аминокислотной последовательности (SEQ ID28) DEIDFEFLG, одной из последовательностей, являющейся часто консервативной для белков, которая воздействует на ксилоглюканы, метили [-32P]ATP с использованием набора для мечения 5'-конца ДНКMEGALABEL (TAKARA SHUZO Co., Ltd.). Удельная активность такого зонда составляла около 1 х 108 cpm/мкг. Метод гибридизации бляшек с использованием зонда применяли на вышесконструированной кДНК-библиотеке тем же способом, что и в примере 1, где гибридизацию проводили в течение 15 ч при 50 С. Затем мембрану дважды промывали 2 х SSC в течение 20 мин при 50 С и подвергали ауторадио-графии. Бляшки образовывались на пластинах размерами 10 х 14 см в количестве около двадцати тысяч бляшек на пластину. В результате поиска среди примерно ста тысяч бляшек не удалось детектировать положительные сигналы. При одновременном проведении положительного контроля путем образования бляшек фа-говых частиц,интегрированных с кДНК ЕХТ фасоли Azuki в количестве 50 бляшек на квадратную пластину,с последующей гибридизацией в тех же условиях, были детектированы отчетливые положительные сигналы, соответствующие каждой из бляшек. В отличие от этого, неожиданным оказался факт, что не детектировалось положительных сигналов, когда фаговый раствор (содержащий около десяти тысяч бляшек) кДНК-библиотеки смешивали с фаговым раствором в положительном контрольном эксперименте таким образом,чтобы образовывалось около 50 бляшек на квадратную пластину. Такой инцидент не имел места в случае гибридизации бляшек с использованием кДНК-фрагмента с длиной более 100 оснований и, таким образом, проблема, повидимому, возникает в том случае, когда олигомер длиной 20-30 оснований используют в качестве зонда. Предполагается, что образование положительных сигналов блокируется определенным взаимодействием с бляшками, происходящими из большого числа других сосуществующих фагов даже в присутствии положительных клонов. В результате образования бляшек в количестве 500-1000 бляшек на пластину, т.е. с плотностью, недостаточной для избежания проблемы, с последующим поиском на массиве из 8 х 103 бляшек, было получено 8 положительных бляшек. В ходе двойного инфицирования с фагом-хелпером М 13 и с бактерией-хозяином F' штамма ZAPII может подвергаться автоматическому субклонированию, при котором область клонирования в хозяине автоматически превращается в pBluescript SK(-) (Stratagene). 40 Из упомянутых выше 8 бляшек таким образом получали плазмиды и их подвергали расщеплению с рестрикционным энзимом EcoR I(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) с последующим электрофорезом на агарозном геле с целью идентификации длин ДНК-фрагментов. Из таких фрагментов один необязательно селектированный фрагмент размером 1,2 кб интегрировали в 3 типа плазмид, которые обозначали какpVM104, pVM106 и pVM109, соответственно. В том случае, когда такие плазмиды подвергали нуклеотидному секвенированию ДНКфрагментов в соответствии с упомянутым выше методом Сэнгера с использованием набора для дидезокси секвенирования BcaBEST (TAKARA SHUZO Co., Ltd.), клонировали два типа генов, обладающих высокой гомологией с ЕХТ геном фасоли Azuki, а также с BRU1 геном[pVM106 и pVN109 представляли собой идентичный ген]. Неполная нуклеотидная последовательность pVM106 (XRP1 фасоли Azuki) одного из таких генов представлена в SEQ ID14 в перечне последовательностей. Пример 3. Выделение кДНК XRP2 фасолиAzuki, гена семейства ЕХТ гена, методом PCR. Примерно 10000 pfu (бляшкообразующих единиц) растворафага (33 мкл), полученного их грунтовых частей фасоли Azuki тем же способом, что описан в примере 2, подвергали двойной экстракции фенол/хлороформным раствором с последующим осаждением этанолом с получением очищеннойфаговой ДНК. Используя такую полную ДНК в качестве матрицы, проводили реакцию PCR с применением Амплификационного набора (TAKARA SHUZOCo., Ltd.), используя смешанный синтетический олигонуклеотид (последовательность ID13) в качестве смыслового праймера и, в качестве антисмыслового праймера, олиго (dТ)18 праймер, в котором dTTP связана с 18 основаниями. Реакцию проводили при 94 С (1 мин), 55 С (1 мин) и 72 С (1 мин), повторяя такой цикл 25 раз, и полученный в результате реакционный раствор выдерживали в течение 7 мин при 72 С. Затем, используя 1 мкл такого реакционного раствора в качестве матрицы, осуществляли вторую PCR с использованием смешанного синтетического олигонуклеотида (SEQ ID13) в качестве смыслового праймера и олиго(dT)18 праймера в качестве антисмыслового праймера,повторяя выше упомянутый цикл 25 раз. После завершения реакции реакционную смесь анализировали методом электрофореза на 3% агарозном геле с целью подтверждения того, что ДНК фрагменты размерами 260 п.о., 350 п.о., 450 п.о.,500 п.о., 600 п.о., 750 п.о., 800 п.о. и 1300 п.о. амплифицированы специальным образом. Такие фрагменты регенерировали и затупляли концы с помощью ДНК дефосфорилирующего набораSHUZO Co., Ltd.) и полученный в результате продукт субклонировали по Hinc II сайтуpUC119 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.). В том случае, когда такие плазмиды подвергали нуклеотидному секвенированию ДНК-фрагментов в соответствии с методом Сэнгера с использованием набора для дидезокси секвенированияBcaBEST (TAKARA SHUZO Co., Ltd.), клонировали 2 типа генов, обладающих гомологией с ЕХТ геном фасоли Azuki. Один из них был идентичен pVM106 и pVN109 из примера 2.Heполная нуклеотидная последовательность другого гена (XRP2 фасоли Azuki) представлена в SEQ ID15 в перечне последовательностей. Пример 4. Выделение кДНК XRP1 табака,гена семейства ЕХТ гена. Использовали кДНК-библиотеку (Stratagene) с ZAP в качестве вектора и для получения зонда, смешанный синтетический олигонуклеотид (27 mer, SEQ ID13), соответствующий аминокислотной последовательности(SEQ ID28) DEIDFEFLG, coxpaняемой в белках, оказывающих воздействие на ксилоглюкан, метили [-32P]ATP с использованием набора для мечения ДНК по 5'-окончанию MEGALABEL (TAKARA SHUZO Co., Ltd.). Гибридизацию бляшек с использованием такого зонда проводили в упомянутой выше кДНКбиблиотеке тем же способом, что и в примере 2. В результате поиска на массиве из примерно 3 х 104 бляшек было получено 30 позитивных бляшек. В результате двойного инфицирования с М 13 фагом-хелпером и с бактерией-хозяином F' штамма, ZAP (Stratagene) может подвергаться автоматическому субклонированию, при котором область клонирования в хозяине автоматически превращается в pBluescript SK(-) (Stratagene). Из упомянутых выше 30 бляшек таким способом получали плазмиды и их подвергали расщеплению с рестрикционным энзимом EcoRI с последующим электрофорезом на агарозном геле с целью идентификации длин ДНКфрагментов. Среди таких фрагментов 2 типа плазмид, содержащих ДНК-фрагменты, размерами 1,5 кб и около 0,9 кб обозначили какpTM3D и pTM11D, соответственно. В том случае, когда такие плазмиды подвергали нуклеотидному секвенированию ДНКфрагментов в соответствии со способом Сэнгера с использованием набора для дидезокси секвенирования BcaBEST (TAKARA SHUZO Co.,Ltd.), клонировали 2 типа генов, обладающих гомологией с ЕХТ-геном фасоли Azuki, а также упомянутым выше BRU1 геном и meri-5 геном. Неполная нуклеотидная последовательностьpTM11D одного из таких типов (табачныйXRP1) представлена в SEQ ID16 в перечне последовательностей. Пример 5. Выделение клонов геномной ДНК семейства генов ЕХТ.(1) Получение геномной ДНК из листьев фасоли Azuki. Семена Vigna angularis ohwi et Ohashi, cv.Physiologia Plantarum, 82, 490-497 (1991), с получением около 10 г листвы. Такие листья (около 10 г) измельчали в ступке в присутствии жидкого азота с получением белого порошка. Примерно 2,5 г порошка листьев немедленно помещали в 50 мл полистирольную пробирку и экстрагировали 10 мл мочевино-фенольного буферного раствора для экстракции ДНК [0.05 М Трис-НСl (рН:7.6), 0.02 М ЕДТА, 5% фенола, 8 М мочевины, 0,35 М NaCl и 2% лаурилсаркозината натрия], смешанного с 25% SDS при 65 С в течение 1 ч. Экстракт смешивали с 2-кратным объемом смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), осторожно перемешивали в течение 15 мин и затем центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 2000 об/мин. После центрифугирования супернатант переносили в новую пробирку, снова смешивали с 2-кратным объемом смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), осторожно перемешивали в течение примерно 15 мин и затем центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 2000 об/мин. Супернатант после такого центрифугирования переносили в новую пробирку, смешивали с 2-кратным объемом этанола и осторожно перемешивали. Затем осажденную белую геномную ДНК раскручивали с использованием пипетки Пастера и переносили в новую пробирку. В такую пробирку добавляли 1,5 мл ТЕ буферного раствора [10 мМ Трис-НСl (рН:8.0) и 1 мМ ЕДТА] и полученную в результате смесь выдерживали в течение ночи при 55 С с целью растворения ДНК. Анализ 1 мкл образца, полученного 10-кратным разбавлением такого раствора ДНК, методом электрофореза на 0,4% агарозном геле позволил установить, что раствор содержит высокомолекулярную ДНК с концентрацией около 100 нг/мл. Другими словами, из примерно 2,5 г листьев было получено 150 мкг геномной ДНК.(2) Конструирование библиотеки геномных ДНК. Изучали условия, подходящие для неполного переваривания полученной выше геномной ДНК с рестрикционным энзимом Sau3A I. Например, 10 ед/мкл Sau3A I (TAKARA SHUZOCo., Ltd.) разбавляли разбавительным буферным раствором для установления его концентрации в 50 мкл реакционного раствора (1 мкг ДНК) в интервале 1-0,035 ед/мкг ДНК, затем проводили реакцию при 37 С в течение 30 мин и затем реакционную смесь смешивали с 1 мкл 0.5 ЕДТА с целью остановки реакции. После завершения 43 реакции 20 мкл образец анализировали методом электрофореза на 0,4% агарозном геле с целью установления того, что наиболее обильно произошло образование молекул размером 15-20 кб при условиях использования концентрации 0,1 ед/мкг ДНК. Реакцию масштабировали в таких условиях и к 20 мкг ДНК, частично переваренной в таких условиях, добавляли 5 мкл 10 х заполняющего буферного раствора [0.5 М Трис-НСl(рН:7.2), 0,1 М сульфата магния, 1 мМ DTT, 500 мкг/мл ацетилированной BSA, 10 мМ dATP и 10 мМ dGTP] и 10 ед. фрагмента Кленова. После доведения общего объема до 50 мкл дистиллированной водой в течение 30 мин проводили реакцию при 37 С. После завершения реакции реакционный раствор смешивали с 50 мкл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1),осторожно перемешивали и затем центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 12000 об/мин. Супернатант переносили в новую пробирку и осаждали этанолом. Осадок растворяли в 20 мкл ТЕ буферного раствора [10 мМ ТрисНСl (рН:8,0) и 2 мМ ЕДТА]. Затем 0,5 мкг и 1,5 мкг образцы полученной в результате частично заполненной, частично Sau3A I-переваренной геномной ДНК лигировали с 1,0 мкг GEM11 плечом (Promega Biotech) с использованием набора для лигирования TaKaRa Версия 1 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.). Другими словами, 0,5 мкг и 1,5 мкг частично заполненной, частичноSau3A I-переваренной геномной ДНК смешивали с раствором, содержащим 1,0 мкг GEM11 плеча (Promega Biotech), и после выпаривания досуха смесь растворяли в 5 мкл лигирующего буферного раствора, смешивали с 5 мкл раствора В из набора для лигирования TaKaRa версия 1 и затем подвергали лигированию в течение 10 мин при 26 С. Лигированный образец подвергали двойной фенольной экстракции с последующим осаждением этанолом. Затем все количество подвергали упаковке с использованием invitro упаковочного набора (Stratagene) с последующим инфицированием E.coli LE392, бактерии-хозяина, с получением геномной ДНКбиблиотеки фасоли Azuki. Измеренный титр такой библиотеки составил 2,1 х 105 pfu/мл.(3) Скрининг библиотеки и выделение гена. Используя такую библиотеку, кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki [ЕР-0562836 А 1 (1993)] размером 1,1 кб метили [-32P]dCTP с использованием набора для мечения BcaBEST(TAKARASHUZO Co., Ltd.) с целью получения зонда для гибридизации бляшек. Другими словами, 25 нг упомянутого выше фрагмента ДНК и 2 мкл случайного праймера помещали в пробирку, разбавляли дистиллированной водой до объема 5 мкл и подвергали нагреванию при 95 С в течение 3 мин с последующей быстрым охлаждением на льду. В смесь добавляли 2,5 мкл буферно 002757 44 го раствора 10-кратной концентрации, 2,5 мкл смешанного раствора dNTP, 5 мкл меченойdCTP, дистиллированную воду до объема 24 мкл и 1 мкл ДНК-полимеразы ВсаВЕSТ (ТАКАРА SHUZO Co., Ltd.) и полученный в результате раствор инкубировали при 52 С в течение 10 мин. Энзим дезактивировали термоденатурацией при нагревании до 95 С в течение 3 мин с последующим быстрым охлаждением на льду. Все количество материала использовали для гибридизации. Удельная активность такого зонда составляла 7,2 х 108 срm/мкг. Гибридизацию бляшек проводили тем же способом, что описан в примере 1, за исключением того, что предгибридизацию и гибридизацию осуществляли при 65 С. После гибридизации мембрану промывали промывным раствором, содержащим 2 х SSC и 0,1% SDS, при комнатной температуре в течение 20 мин и дополнительно промывали промывным раствором, содержащим 0,1xSSC и 1%SDS при 50 С в течение 30 мин. Фаги инокулировали на 10 квадратных пластинах с тем, чтобы получить бляшки с концентрацией 1 х 104 бляшек на пластину. В результате скрининга 1 х 105 фагов, полученных на всех 10 пластинах, было получено 10 положительных бляшек. Далее,каждую из таких бляшек использовали для вторичного скрининга. Фаговую ДНК экстрагировали с каждой бляшки, полученной во втором скрининге методом лизиса в чашках. Такую фаговую ДНК подвергали перевариванию с рестрикционными энзимами Sac I, EcoR I, Hind III,BamH I и Pst I (все: TAKARA SHUZO Co., Ltd.),с последующей Саузерн гибридизацией с использованием того же зонда, что упоминался выше. Саузерн гибридизацию проводили в соответствии со способом, описанным в "MolecularCold Spring Harbor Laboratory Press в 1989 г.). Так например, каждый из образцов ДНК подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле с последующей денатурацией щелочью и Саузерн блоттингом на нейлоновой мембране (Hybond-N, Amersham) в течение ночи. После иммобилизации ДНК в результате облучения ультрафиолетовым трансиллюминатором (254 нм) в течение 5 мин мембрану подвергали предгибридизации в 5 мл предгибридизационного буферного раствора (5 х раствора Денхардта, 6 хSSC, 0,1% SDS и 10 мкг/мл ДНК лососевой спермы) в течение 2 ч при 65 С. Затем добавляли зонд и в течение ночи проводили гибридизацию при 65 С. После гибридизации мембрану дважды промывали промывным раствором, содержащим 2 х SSC и 0.1% SDS, при комнатной температуре в течение 10 мин и затем промывали дважды тем же промывным раствором при 50 С в течение 30 мин. После высушивания мембрану экспонировали в течение ночи при-80 С в кассете с пленкой (Kodak), чувствительной к рентгеновскому излучению, для поучения ауторадиографии. Из полученного ауторадиографического отпечатка 10 фагов классифицировали на 3 типа. Из ДНК фрагментов, вставленных в такие 3 типа фаговых векторов, ДНК-фрагмент, который детектируется при использовании в качестве зонда ЕХТ гена фасоли Azuki, подвергали субклонированию в плазмидный вектор с целью анализа неполной нуклеотидной последовательности. Полученный результат показал, что ДНК-фрагмент, вставленный в фаговые векторы всех бляшек, содержит ген, аналогичный ЕХТ гену, а именно ген семейства. Однако ЕХТ гена обнаружено не было. Пример 6. Клонирование ДНК-фрагмента,содержащего "промоторную прямонаправленную" область ЕХТ гена фасоли Azuki из неполной геномной ДНК-библиотеки фасоли Azuki. Геномную ДНК, экстрагированную из листьев фасоли Azuki, тем же способом, что описан в примере 5, подвергали перевариванию с рестрикционными энзимами EcoR I и Hind III,двойному перевариванию с EcoR I-Hind III и электрофорезу на 0,7% агарозном геле с последующим переносом на нейлоновую мембрану и Саузерн гибридизацией с использованием в качестве зонда кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki, полученного тем же способом, что описан в примере 5-(3). Саузерн гибридизацию проводили в соответствии со способом, описанным в примере 5(3), за исключением того, что после гибридизации мембрану трижды промывали промывным раствором, содержащим 2 х SSC и 0,1% SDS,при комнатной температуре в течение 20 мин,дважды промывали тем же промывным раствором при 50 С в течение 20 мин и затем дважды промывали промывным раствором, содержащим 0,1x SSC и 0,1x SDS при 50 С в течение 20 мин. Полученный результат позволил обнаружить, что примерно 3 полосы детектируются на каждой линии и наиболее интенсивная полоса проявляется для EcoR I перевара при примерно 8,5 кб, для Hind III при примерно 8,5 кб и дляEcoR I-Hind III двойного перевара при примерно 5.5 кб. Затем, 30 мкг ДНК, которую подвергли полному двойному перевариванию с EcoR IHind III, подвергали электрофорезу на 0,7% агарозном геле, извлекали полосу вокруг примерно 5,5 кб на агарозном геле, лигировали с EcoR IHind III сайтом EXIox (Novagene) и упаковывали с использованием in vitro упаковочного раствора (Stratagene) с последующим инфицированном E.coli ER1647 бактерии-хозяина с получением неполной библиотеки геномной ДНК фасоли Azuki, состоящей, в основном, из 5,5 кб ДНК-фрагментов, содержащих EcoR I-Hind III сайт на обоих концах. Титр такой библиотеки составлял 1,9 х 106 pfu/мл. 46 Далее, гибридизацию бляшек с использованием в качестве зонда кДНК ЕХТ гена проводили тем же способом, что описан в примере 5. Затем из 1,3 х 105 бляшек получали положительные бляшки. Эти бляшки суспендировали в SM буферном растворе и каждую бляшку подвергали вторичному скринингу. Во втором скрининге упомянутую выше кДНК ЕХТ гена фасолиAzuki, а также олигонуклеотид VAN-U7 (последовательность ID17), синтезированный на основе 5'-некодирующей области, обладающей низкой гомологией с изозимом кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki, использовали в качестве зонда,соответственно. В том случае, когда в качестве зонда использовали кДНК ЕХТ гена фасолиAzuki, гибридизацию бляшек и операцию промывки проводили тем же способом, что использовали выше. В том случае, когда использовали синтетический олигонуклеотид VAN-U7, гибридизационный зонд метили [-32P]ATP с использованием набора для мечения по 5'-концуMEGALABEL (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) по 5'-концу. Удельная активность такого зонда составляла около 2x108 имп./мин/мкг. Гибридизацию бляшек с использованием такого зонда проводили тем же способом, что описан в примере 2, за исключением того, что предгибридизацию и гибридизацию проводили при 47 С. После гибридизации мембрану промывали дважды промывным раствором, содержащим 6 хSSC и 0,1% SDS, при комнатной температуре и затем дважды промывали тем же промывным раствором при 47 С в течение 20 мин. Полученный результат позволил установить, что из 10 положительных бляшек 4 бляшки представляли собой ДНК-фрагменты, содержащие кДНК ЕХТ гена. Фаги со вставками из таких фрагментов подвергали автоматическому субклонированию путем инфицирования Е.coli ВМ 25.8, бактериихозяина, имеющего PlCre ген, когда область,автоматически субклонированная в хозяине,превращается в плазмиду pUC-типа. Полученную таким образом плазмиду обозначили какJM109/pVX303 и его депонировали 15 марта 1995 г. (дата первоначального депонирования) в Национальном Институте биологических наук и технологии человека, Агентство промышленной науки и технологии, Министерство промышленной торговли и промышленности (1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-Shi, Ibaragi-ken, 305, Япония) под каталожным номером FERM ВР-5390,в соответствии с Будапештским договором. Такую плазмиду подвергали нуклеотидному секвенированию ДНК-фрагментом в соответствии со способом Сэнгера с использованием набора для дидезокси секвенирования BcaBEST(TAKARA SHUZO Co., Ltd.). Неполные нуклеотидные последовательности такой плазмиды 47 представлены в SEQ ID18 и SEQ ID19 в Перечне последовательностей. Сравнение таких последовательностей с последовательностью кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki позволило установить, что указанный фрагмент содержит промотор ЕХТ гена фасоли Azuki. Пример 7. Клонирование ДНК фрагмента,содержащего промоторную область ЕХТ гена фасоли Azuki, с помощью обратной PCR.PVXG303 в примере 6 представляет собой плазмиду размером около 9,5 кб, имеющуюEcoR I/Hind III фрагмент, происходящий из геномной ДНК размером 5,5 кб, содержащей промоторную область ЕХТ гена фасоли Azuki. В качестве контроля для самолигирования и обратной PCR такую плазмиду переваривали с рестрикционным энзимом Hind III и затем самолигировали при концентрации ДНК 10 нг/мкл,3,3 нг/мкл, 2 нг/мкл и 1 нг/мкл, соответственно. После лигирования по 5 мкл каждого образца переносили в E.coli JM109 и эффективность самолигирования оценивали по числу образовавшихся колоний. Полученный результат показывает, что эффективность самолигирования повышается при использовании разбавленных концентраций ДНК. Однако в случае, когда полимеразные цепные реакции (PCR) с лигирующими растворами, используемыми в качестве матриц, осуществляли с использованием праймера VAN-UH1 (SEQ ID21) в качестве смыслового праймера и праймера VAN-L (SEQ ID22) в качестве антисмыслового праймера,наблюдалось ингибирование, когда повышенный объем лигирующего раствора добавлялся в реакционную систему с целью увеличения количества матрицы и, кроме этого, уменьшалась степень регенерации с разбавлением концентрации ДНК при осуществлении осаждения этанолом с целью понижения количества матрицы в реакционной системе. Эти результаты позволили установить, что эффективное получение целевой циклической ДНК возможно в том случае,когда концентрация ДНК и реакционный объем при лигировании поддерживаются равными 3,3 нг/мкл и 300 мкл, соответственно.(2) Обратная PCR в присутствии Hind III фрагмента ДНК фасоли Azuki, используемого в качестве матрицы. Один мкг геномной ДНК, полученной из листьев фасоли Azuki тем же способом, что описан в примере 5, полностью переваривали с рестрикционным энзимом Hind III, однократно экстрагировали раствором фенол/хлороформ с целью дезактивации энзима и затем подвергали осаждению этанолом. Этанол-осажденную ДНК смешивали с 268 мкл дистиллированной воды,30 мкл 10 х лигирующего буферного раствора и 2 мкл Т 4 ДНК-лигазы (TAKARA SHUZO Co.,Ltd.) и затем подвергали аутолигированию, проводя реакцию в течение ночи при 16 С. При 48 использовании в качестве матрицы 0,1 мкг полученной циклической геномной ДНК, PCR с использованием набора TaKaRa LA PCR (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) проводили с применением праймера VAN-UH1 (SEQ ID21) в качестве смыслового праймера и праймера VAN-L(SEQ ID22) в качестве антисмыслового праймера. Реакцию осуществляли 30-кратным повторением цикла при 94 С (0,5 мин), 55 С (1 мин) и 72 С (2 мин). Однако в такой реакции не наблюдали какой-либо амплификации. Затем,при использовании в качестве матрицы 1 мкл такого реакционного раствора, реакции PCR осуществляли таким же способом путем повторения упомянутого выше цикла 30 раз с применением: 1) праймера VAN-UH2 (SEQ ID23) в качестве смыслового праймера и праймераVAN-L16 (SEQ ID24) в качестве антисмыслового праймера,2) праймера VAN-UH3 (SEQ ID25) в качестве смыслового праймера и праймераVAN-L3 (SEQ ID26) в качестве антисмыслового праймера,3) праймера VAN-UH2 (SEQ ID23) в качестве смыслового праймера и праймераVAN-L3 (SEQ ID26) в качестве антисмыслового праймера, и 4) праймера VAN-UH3 (SEQ ID25) в качестве смыслового праймера и праймераVAN-L16 (SEQ ID24) в качестве антисмыслового праймера. Анализы реакционных растворов после реакций с помощью электрофореза на 1% агарозном геле позволили установить, что ДНКфрагмент размером около 1,8 кб специфически амплифицируется в комбинации с 3). В других комбинациях трудно идентифицировать целевые фрагменты из-за амплификации большого числа неспецифических ДНК-фрагментов. ДНК-фрагмент, полученный в праймерной комбинации 3), извлекали из геля и подвергали дефосфорилированию концов с использованием набора для дефосфорилирования ДНК (TAKARA SHUZO Co., Ltd.), фосфорилированию продукта PCR с использованием набора для мечения по 5'-концу MEGALABEL (TAKARASHUZO Co., Ltd.) no 5'-концу и затем субклонированию по Hinc II сайту pUC119 (TAKARASHUZO Co., Ltd.). Выбирали три плазмиды и их подвергали нуклеотидному секвенированию ДНК-фрагментов в соответствии с методом Сэнгера с использованием набора для дидезокси секвенирования BcaBESТ (TAKARA SHUZOCo., Ltd.). Поскольку неполное нуклеотидное секвенирование показало, что нуклеотидные последовательности были идентичными для всех плазмид, полную нуклеотидную последовательность устанавливали с использованием одной из таких последовательностей. Неполная нуклеотидная последовательность плазмиды представлена в SEQ ID27 в 49 Перечне последовательностей. Кроме этого, на фиг. 2 показана рестрикционная карта указанного ДНК-фрагмента. Плазмиду, содержащую указанный ДНК-фрагмент, обозначали какpVXP-Н 3, тогда как E.coli JM109 штамм, трансформированный указанной pVXP-Н 3, называли и обозначали как Escherichia coli JN109/pVXPH3 и его депонировали 17 февраля 1995 г (дата начального депонирования) в Национальном Институте биологических наук и технологии человека, Агентство промышленной науки и технологии, Министерство промышленной торговли и промышленности (1-3, Higashi 1-Chome,Tsukuba-Shi, Ibaragi-ken, 305, Япония) под каталожным номером FERM ВР-5388 в соответствии с Будапештским договором. Пример 8. Клонирование ДНК-фрагмента,содержащего промоторную обратнонаправленную область ЕХТ гена фасоли Azuki, из библиотеки геномной ДНК фасоли Azuki.(1) Конструирование библиотеки геномных ДНК. Исследовали условия, подходящие для неполного переваривания геномной ДНК, полученной в примере 5, с рестрикционным энзимомSau3A I. Так например, 10 ед./мкл Sau3A I (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) разбавляли разбавленным буферным раствором для установления его концентрации в 50 мкл реакционного раствора(1 мкл ДНК) в диапазоне 1-0,035 ед./мкг ДНК,после чего проводили в течение 30 мин реакцию при 37 С и реакционную смесь смешивали с 1 мкл 0,5 М ЕДТА с целью остановки реакции. После завершения реакции 20 мкл образец анализировали электрофорезом на 0,4% агарозном геле с целью установления того, что при условиях использования концентрации 0,1 ед./мкг ДНК наиболее обильно образуются молекулы размером 15-20 кб. При таких условиях осуществляли масштабирование реакции. Далее, 160 мкг ДНК, частично переваренной при этих условиях, использовали для пробного фракционирования молекул размерами 1520 кб в результате осуществления градиентного центрифугирования по плотности с NaCl. Так например, градиенты плотности в 1,25-5 М NaCl готовили в пробирках для центрифугирования,присоединенных к HITACHI PPS40-T Rotor,медленно загружали по 200 мкл каждой из ДНКHITACHI SCP70H в течение 3 ч при скорости вращения 35000 об/мин. После центрифугирования образцы в количестве по 250 мкг распределяли по пробиркам Эппендорфа. Анализы 20 мкл аликвот, отобранных из каждой 3-ей пробирки, с помощью электрофореза на 0,4% агарозном геле показали, что фракции 18-21,по-видимому, содержат молекулы ДНК соответствующих размеров. В связи с этим, 0,3 мкг, 0.6 мкг и 1,2 мкг ДНК из фракции 20 смешивали с 1,0 мкг раствора GEM11 плеча (PromegaBiotech) с получением 8 мкл раствора, который после добавления 8 мкл Раствора II и 16 мкл раствора I из набора для лигирования TaKaRa Версии 2 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) подвергали лигированию в течение 10 мин при 26 С. Каждый из образцов после лигирования подвергали двойной экстракции фенолом и осаждению этанолом. Затем все количество подвергали упаковке с использованием in vitro упаковочного набора (Stratagene) с последующим инфицированием E.coli LE392 бактерией-хозяином с целью получения библиотеки геномных ДНК фасоли Azuki. Титр такой библиотеки составлял 1,1x105 pfu/мл.(2) Скрининг библиотеки. Фрагмент геномной ДНК, полученный в примере 6, метили [-32P]dCTP с использованием набора для мечения BcaBEST (TAKARASHUZO Co., Ltd.) с получением зонда для гибридизации. Гибридизацию бляшек с использованием такого зонда осуществляли на упомянутой выше библиотеке геномных ДНК тем же способом, что описан в примере 5. После гибридизации мембрану трижды промывали промывным раствором, содержащим 2 х SSC и 0,1%SDS, при комнатной температуре в течение 20 мин и дополнительно промывали промывным раствором, содержащим 1 х SSC и 0,1% SDS, в течение 20 мин при 50 С. Фаги инокулировали на 20 квадратных пластинах с получением бляшек с концентрацией 1 х 104 бляшек на пластину. В результате скрининга на массиве из 2 х 105 фагов, полученных со всех 20 пластинок, был получен 21 положительный фаг. Далее, каждую из таких бляшек подвергали вторичному скринингу с целью выделения положительных клонов. Вторичный скрининг осуществляли инокуляцией фагового раствора, который отбирали из каждой из 21 пололжительных бляшек, полученных при первичном скрининге, который осуществляли максимально тонко с целью получения примерно 300 бляшек на квадратную пластину с последующей гибридизацией бляшек. Во втором скрининге фрагмент геномной ДНК, полученный в примере 6 тем же способом,что и в первичном скрининге, а также олигонуклеотид VAN-U7 (SEQ ID17), синтезированный на основе 5'-не кодирующей области,обладающей низкой гомологией с такими генами семейства, как гены других изозимов (ЕХТ 2 фасоли Azuki и ЕХТЗ фасоли Azuki) последовательности кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki использовали в качестве зонда, соответственно. В том случае, когда в качестве зонда использовали фрагмент геномной ДНК, гибридизацию бляшек и промывку осуществляли тем же способом, что и при первом скрининге. В случае использования синтетического олигонуклеотида VAN-U7,использовали ту же методику, что и в примере 6. Из 10 бляшек с положительными сигналами, полученными во втором скрининге, одну 51 бляшку с интенсивным сигналом выбирали для проведения третичного скрининга. Однако такая бляшка с интенсивным сигналом оказалась лишь одной в примерно 1000 бляшек даже во втором скрининге. Более того, такая единственная бляшка была очень мелкой. С целью осуществления чистой пролиферации такой бляшки,третичный скрининг проводили путем инокуляции на 6 круглых пластинах (диаметр 90 мм) с тем, чтобы получить 100-200 бляшек на пластину. Их использовали для гибридизации и промывки тем же способом, что и при вторичном скрининге. В результате, чрезвычайно мелкая бляшка игольчатого типа детектировалась в положении, не соответствующем бляшке, обнаруживаемой при беглом просматривании сигнала,но соответствующем сигналу, обнаруживаемому при тщательном изучении пластины. Фаговую ДНК экстрагировали с использованием такой бляшки при тщательном применении метода лизиса в чашках. ДНК-фрагменты, вставленные в фаговый вектор указанной бляшки, экстрагировали и затем получали фрагмент ДНК,длиной примерно в 11 кб. В результате осуществления двойного переваривания такого ДНК-фрагмента EcoR IHind III и Саузерн гибридизации с использованием в качестве зонда фрагмента геномной ДНК ЕХТ гена фасоли Azuki, полученного в примере 6, может быть определен укороченный фрагмент ДНК, содержащий промоторную область такого гена. Нуклеотидное секвенирование с использованием плазмиды со вставкой из такого фрагмента ДНК и сравнение указанного фрагмента с последовательностью кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki позволило определить, содержит ли такой фрагмент ДНК промотор ЕХТ гена фасоли Azuki. На фиг. 1 изображена рестрикционная карта указанного фрагмента. Кроме этого,неполная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента представлена в SEQ ID20 в перечне последовательностей. Плазмиду,интегрированную с таким фрагментом в сайтыpVXP101, обозначали и указывали как Escherichia coli JM109/-pVXP101 и его депонировали 23 февраля 1995 г. (дата первоначального депонирования) в Национальном институте биологических наук и технологии человека, Агентство промышленной науки и технологии, Министерство промышленной торговли и промышленности (1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-Shi,Ibaragi-ken, 305, Япония) с каталожным номеромFERM ВР-5389 в соответствии с Будапештским договором. Пример 9. Нозерн гибридизация с использованием молодого растения фасоли Azuki.(1) Получение полной РНК. Ткани, взятые из стеблей, почек, котиледонов и листьев растений фасоли Azuki в воз 002757-80 С до начала операций по экстракции РНК. Полные РНК экстрагировали из каждой из замороженных тканей гуанидин тиоцианатным/ фенольным методом. Так например, 1 г замороженных клеток помещали в пробирку, содержащую 2,5 мл гуанидин тиоцианатного раствора(200 мл раствора, полученного растворением 100 г тиоцианата гуанидина и 1.47 г дигидрата цитрата натрия в воде, выдерживали при 4 С и перед использованием добавляли 7 мкл меркаптоэтанола и 5 мг лаурилсаркозината натрия на 1 мл), измельчали с помощью устройства Polytron для осуществления экстракции, смешивали с 2.5 мл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт(25:24:1), осторожно перемешивали в течение 15 мин и затем центрифугировали в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Затем отделившийся водный слой смешивали с 2,5 мл смеси фенолхлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) при интенсивном перемешивании и полученную в результате суспензию центрифугировали с целью отделения водного слоя. Такую операцию повторяли дважды. Далее, полученный в результате водный слой смешивали с 2,0 мл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) при интенсивном перемешивании и полученную в результате суспензию центрифугировали для отделения водного слоя, который смешивали с 3 М ацетата натрия и этанолом и затем центрифугировали с получением осажденной РНК. Этот осадок полностью растворяли в 2 мл трисSDS раствора [50 мМ трис-НСl (рН:9,0) и 1%SDS] и помещали в пробирку, содержащую 2 мл насыщенного водой фенола, при интенсивном встряхивании системы. Полученную в результате суспензию центрифугировали для отделения водного слоя, к которому, при интенсивном перемешивании, последовательно добавляли 2 мл насыщенного водой фенола и 2 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1) и полученную в результате суспензию центрифугировали с целью отделения водного слоя. Далее, полученный водный слой смешивали с 2 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1) при интенсивном перемешивании и полученную в результате суспензию центрифугировали для отделения водного слоя, который смешивали с 3 М ацетата натрия и этанолом и затем проводили центрифугирование для получения осажденной РНК. Этот осадок полностью растворяли в 0,5 мл стерилизованной воды и концентрацию устанавливали равной 1 мг/мл по измерению поглощения света. Полученный в результате раствор смешивали с 1/4 объема 10 М хлористого лития при перемешивании, выстаивали в течение 2 ч при 4 С и затем центрифугировали с получением осадка. Этот осадок полностью растворяли в 1 мл стерилизованной воды, смешивали с 3 М ацетата натрия и этанолом и затем(2) Нозерн гибридизация. Фрагмент кДНК ЕХТ гена фасоли Azuki[EP-0562836 A1 (1993)] метили [-32P]dCTP с использованием набора для меченияBcaBEST(TAKARA SHUZO Co., Ltd.) с целью получения зонда для Нозерн гибридизации. Нозерн гибридизацию осуществляли следующим ниже способом с использованием метода, описанного в "Molecular Cloning, A laboratory Manual", Второе изд., глава 7, стр.7.397.52 (T.Maniatis et al., опубликовано Cold SpringHarbor Laboratory Press в 1989 г). Так например,экстрагированную полную РНК подвергали электрофорезу с использованием обработанного формальдегидом агарозного геля (1%) с последующей нейтрализацией в растворе ацетата аммония и Нозерн блоттингом на нейлоновой мембране (Hybond-N) в течение ночи. После фиксации РНК в результате облучения ультрафиолетовым трансосветителем (254 нм) в течение 5 мин, мембрану подвергали предгибридизации в 20 мл предгибридизационного буферного раствора [50% формальдегида, 0.65 МNaCl, 0,1M Na-PIPES (pH:6,8), 5x раствора Денхардта, 0,1% SDS, 5 мМ ЕДТА и 100 мкг/мл ДНК лососевой спермы] в течение 3 ч при 42 С. Затем 32 Р-меченый зонд, полученный описанным выше методом, добавляли к 20 мл предгибридизационного буферного раствора [50% формальдегида, 0,65 М NaCl, 0,1 М Na-PIPES(pH:6.8), 5x раствора Денхардта, 0,1% SDS, 5 мМ ЕДТА и 10% сульфата декстрана]. К раствору такого зонда добавляли мембрану, полученную предгибридизацией, и в течение ночи при 42 С проводили гибридизацию. После гибридизации мембрану трижды промывали промывным раствором, содержащим 2 х SSC и 0,1% SDS в течение 20 мин при 50 С. После сушки мембрану экспонировали в течение ночи при -80 С в кассете с рентгеночувствительной пленкой (Kodak) с получением ауторадиографии. Полученный результат позволил установить, что экспрессия ЕХТ гена наблюдается специфически в стеблях и что ген экспрессируется главным образом в части, которая растет с удлинением. Пример 10. Нозерн гибридизация с использованием культивируемых клеток табака.(1) Получение полной РНК. Культурированные клетки табака BY2, которые культивировали в течение 1, 4, 6 и 10 дней, соответственно, собирали на фильтрационной воронке Бюхнера путем фильтрации с отсосом. Отсасывание продолжали еще в течение 10-30 с после фильтрования культуральной среды на воронке с целью полного удаления жидкой культуральной среды. После удаления культуральной среды примерно 1 г клеток быстро выделяли и взвешивали, немедленно замо 002757 54 раживали в жидком азоте и затем выдерживали при -80 С до начала операций по экстракции РНК. Замороженные клетки помещали в пробирку, содержащую 2 мл экстракционного раствора [200 мМ Трис-НСl (рН:9,0), 100 мМ NaCl,10 мМ ЕДТА, 0,5% SDS и 14 мМ 2 меркаптоэтанола] и 2 мл насыщенного водой фенола, измельчали с помощью устройстваPolytron в течение 5 мин для осуществления экстракции, смешивали с 2 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1) и интенсивно дополнительно перемешивали на устройствеPolytron. Полученную в результате суспензию центрифугировали с целью отделения водного слоя. Далее, полученный водный слой последовательно смешивали с 2 мл насыщенного водой фенола и 2 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1) при энергичном перемешивании и полученную в результате суспензию центрифугировали для отделения водного слоя. Описанную процедуру повторяли два раза. Полученный в результате водный слой смешивали с 2 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (49:1) при энергичном перемешивании и полученную в результате суспензию центрифугировали для отделения водного слоя, который смешивали с 3 М ацетата натрия и этанолом и затем центрифугировали с получением около 0,7 мг осажденной РНК.(2) Нозерн гибридизация. кДНК ЕХТ гена табака (JP 7-79778 А) и кДНК-фрагмент (SEQ ID16) гена табака семейства XRP1, описанного в примере 4, соответственно метили [-32P]dCTP с использованием набора для мечения BcaBEST(TAKARASHUZO Co., Ltd.) с целью получения зонда для Нозерн гибридизации. Нозерн гибридизацию осуществляли тем же способом, что описан в примере 9-(2). Полученные результаты представлены на фиг. 3. На фиг. 3 проиллюстрированы результаты экспрессии ЕХТ и XRP, причем экспрессия мРНК ЕХТ табака показана в верхнем ряду, экспрессия мРНК XRP табака показана в среднем ряду, а количества рРНК показаны в нижнем ряду. Из результатов, представленных на фиг. 3,можно видеть, что экспрессия ЕХТ гена табака наблюдается на первый день после культивации, достигая пика на четвертый день. Напротив, XRP1 ген табака, ген семейства ЕХТ гена,описанный в примере 4, интенсивно экспрессирует на первый день культивации и через 6 дней. В это же время строили кривую роста для культивируемых клеток табака BY2 путем измерения числа клеток и упакованного клеточного объема (PCV). Число клеток получали обработкой культивируемых клеток табака BY2 энзимным раствором (рН:5,5), содержащим 1% целлюлозы-ONOZUCA (Yacult Honsa Co., Ltd.),0,1% пектолиазы Y23 (SEISHIN Corporation) и 0,4 М маннита при 30 С в течение 2 ч с целью их 55 превращения в несодержащие клеточных стенок протопласты с последующим подсчетом числа протопластов с использованием счетчика кровяных телец. Значение PCV получали центрифугированием культивируемой суспензии (10 мл) клеток табачной культуры BY2, отобранной в 15 мл калиброванную пробирку для центрифугирования, со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин, с использованием качающегося ротора с последующим измерением объема тромбоцитов. Далее, среднее значение (n=5) наносили на график, представленный на фиг. 4. Другими словами, фиг. 4 иллюстрирует рост клеточной культуры табака BY2, причем по вертикальной оси отложены значения PCV (%) и числа клеток, а по горизонтальной оси отложено время (дни). Результаты, проиллюстрированные на фиг. 3 и 4, показывают, что табачный ЕХТ ген экспрессируется в любое время и наиболее интенсивная экспрессия наблюдается в ранний период фазы логарифмического роста. Также показано, что табачный XRPI ген семейства ЕХТ, описанный в примере 4, интенсивно экспрессируется в фазе индукции и в стационарной фазе. Пример 11. Транзитный анализ с использованием клеток табачной культуры.(1) Конструирование плазмиды для переноса. С использованием pBI121 (Clontech),имеющей промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты, GUS ген E.coli и кассету с транскрипционно-терминационной последовательностью, происходящую из нопалин синтетазы, EcoR I сайт такой плазмиды вначале удаляли путем дефосфорилирования указанной плазмиды с использованием набора для дефосфорилирования ДНК (ТАKARA SHUZO Co., Ltd.) после полного переваривания с рестрикционным энзимом EcoR I и трансформации вE.coli JM109 штамм после аутолигирования. Полученную в результате плазмиду обозначали как pBI221EL, a E.coli JM109 штамм, трансформированный с помощью pBI221EL, называлиEscherichia coli JM109/-pBI221EL. С целью удаления промоторной области 35S мозаичного вируса цветной капусты в плазмиде, ее подвергали перевариванию с рестрикционными энзимами Hind III и Xba I и затем целевой фрагмент очищали от фрагментов, не относящихся к 35S промоторной области, с помощью электрофореза на агарозном геле с последующим вырезанием. Далее, с использованием pVXG303, полученной в примере 6, применяемой в качестве матрицы, проводили PCR с использованием праймера VAN-UHE (SEQ ID29) в качестве смыслового праймера и праймера VAN-LX(SEQ ID30) в качестве антисмыслового праймера. Реакцию осуществляли 10-кратным повторением цикла, включающего нагревание при 94 С (1 мин), 55 С (2 мин) и 72 С (3 мин). 56 Полученный в результате фрагмент извлекали путем выделения элекрофорезом на 2,5% агарозном геле, лигировали в Hind III и Xba I сайты упомянутой выше pBI221EL и трансформировали в штамм E.coli JM109. Такую плазмиду обозначали какpEXTEGUS, а штамм E.coli JM109, трансформированный pEXTEGUS, обозначали как Escheri-chia coli JM109/ pEXTEGUS. Далее, pEXTEGUS подвергали дефосфорилированию с использованием набора для дефосфорилирования ДНК (TAKARA SHUZO Co.,Ltd.) после полного переваривания с рестрикционным энзимом Hind III. Полученный в результате ДНК-фрагмент подвергали полному перевариванию с рестрикционным энзимом EcoR I,терминальному дефосфорилированию путем ВАР обработки и очистки электрофорезом на агарозном геле. С другой стороны, pVXP-Н 3, полученную в примере 7, подвергали дефосфорилированию концов после полного переваривания с рестрикционным энзимом Xba I (TAKARA SHUZO Co.,Ltd.) с последующим полным перевариванием с рестрикционным энзимом EcoR I. ДНК-фрагмент размером примерно 960 п.о., содержащий промоторную область от Xba I сайта до EcoR I сайта ЕХТ гена фасоли Azuki,подвергали очистки электрофорезом на агарозном геле, лигированию с упомянутым вышеpEXTEGUS ДНК-фрагментом и трансформации в штамм E.coli JM109. Такую плазмиду обозначали как pEXTXGUS, а штамм E.colipEXTEGUS подвергали полному перевариванию с рестрикционными энзимами Hind III и EcoR I, лигировали с ДНК-фрагментом, содержащим промотор, полученный полным перевариванием pVXP-Н 3, приготовленным в примере 1, с рестрикционными энзимами HindE.coli JM109. Такую плазмиду обозначали как(2) Перенос гена электропорацией. Метод электропорации применяли для переноса в культивируемые клетки табака BY2 каждой из pEXTEGUS, pEXTXGUS иpEXTGUS, полученных как описано выше, а также не содержащей промотора pBI101 (Clontech; обозначенный как pGUS на фиг. 5), имеющей только кассету гена GUS и рВI221(Clontech), имеющей промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты и GUS ген, которые использовали в качестве контроля. Вначале культивируемые клетки табакаONOZUKA (Yakult Honsha Co., Ltd.), 0,1% пектолиазы Y23 (SEISHIN Corporation) и 0,4 М маннита при 30 С в течение 2 ч с целью их превращения в несодержащие клеточной стенки протопласты. Суспензию из 2 х 106 протопластов культивируемых клеток табака BY2 в электропорационном буферном растворе (70 мМ КСl, 5 мМ MES и 0,3 М маннита, рН 5,8) смешивали с 3 пмолями каждой плазмидной ДНК и системой 10% ПЭГ 6000/электропорационный буферный раствор при перемешивании. Электрический импульс (300 V, 125 мкF) с использованиемGene Pulser II (Bio Rad Laboratories) применяли на полученной в результате смеси для переноса ДНК в растительные клетки. Клетки инкубировали в культуральной среде Линсмайера-Скуга [Physiologia Plantarum 18, 100 (1965)], содержащей 0,2 мг/л 2,4-D в качестве ауксина, 1% сахарозы и 0,4 М маннита,в течение 40 ч после переноса при 26 С. Клетки регенерировали экстракцией и смесь регенерированных клеток в 200 мкл экстракционного буферного раствора [50 мМ фосфатного буфера(рН 7,0), 10 мМ ЕДТА, 0,1% тритона Х-100,0,1% саркозила и 10 мМ 2-меркаптоэтанола] помещали в пробирку Эппендорфа и подвергали ультразвуковой обработке на льду в течение 30 с с использованием ультразвукового устройстваW-225 (Heat-systems-Ultrasonics), регулируя значение выходного контроля на 1,5 и рабочий цикл на 50%. Затем супернатант, выделенный центрифугированием, использовали для анализа на GUS активность и анализа на количество белка.(3) Измерение промоторной активности. Реакцию проводили путем добавления 45 мкл экстракционного буферного раствора и 25 мкл 4 мМ 4-MUG субстрата к каждой 36 мкл порции экстракта, помещенного в 96-луночный титрометрический микропланшет, предназначенный для исследования флуоресценции. Через 5, 35 и 95 мин реакцию обрывали путем добавления 50 мкл реакционно-терминаторного раствора (1 М Na2CO3). Затем измеряли удельную флуоресценцию, испускаемую 4-MU, продуктом реакции, при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны флуоресценции 455 нм, с помощью флуоресцентного планшет-ридера [Fluoroscan II (Labosystems)]. Количество белка определяли по описанной ниже методике. Для этого 2, 5, 10, 15, 20 и 30 мкл 5-кратно разбавленного раствора экстракта или стандартного раствора BSA с концентрацией 800 мкг/мл (20 мкл экстрактного буферного раствора смешивали с 80 мкл 1 мкг/мл BSA) помещали в 96-луночный микротитрометрический планшет и добавляли, соответственно, 158, 155, 150, 145, 140 и 130 мкл дистиллированной воды и 40 мкл аналитического реагента из набора для анализа белка Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories). После медленного перемешивания и последующего выстаивания в те 002757 58 чение 20 мин при комнатной температуре в смеси производили измерения с помощью планшетридера (длина волны: 590 нм) в течение 60 мин с целью определения количества белка.GUS активность измеряли следующим образом. Во время проведения описанных выше анализов измеряли интенсивности флуоресценции стандартных растворов 4-MU и полученные результаты подвергали графической обработке в координатах "количество 4-MU (пмоль)" по оси Х и "интенсивность флуоресценции" по оси Y. Далее, из угла наклона полученной кривой получали количество 4-MU в расчете на единицу флуоресценции и результаты, полученные на образцах, наносили на график, откладывая по оси Х время (мин), а по оси Y - интенсивность флуоресценции, с целью получения значения увеличения скорости прироста флуоресценции и получения значения скорости разложения 4MUG, равной активности GUS. Кроме этого, из полученных значений количества белка расчитывали удельную активность GUS. Полученные результаты представлены на фиг.5. Другими словами, на фиг.5 проиллюстрированы результаты измерения ЕХТ промоторной активности с использованием трансформированных клеток культуры табака BY2, причем диаграмма, представленная на рисунке, демонстрирует GUSудельную активность (пмоль 4 MU/мин/мг белка) при переносе каждой плазмиды, а под диаграммой приведена рестрикционная карта промоторной области каждой плазмиды. Из данных, представленных на фиг. 5, следует, что фрагмент ДНК, содержащий промоторную область ЕХТ гена, обладает более высокой активностью, чем активность промотора 35S мозаичного вируса цветной капусты, который, как отмечалось выше, должен интенсивно экспрессировать в растениях. Пример 12. Детекция тканевой специфичности с использованием трансформированного(1) Конструирование плазмиды для переноса. С целью получения плазмид для переноса,как показано на фиг. 6 и 7, бинарный векторpBI-HI-35SIG [Plant and Cell Physiology, 31, 805813 (1990)], содержащий кассету с транскрипционно-терминационной последовательностью, происходящей из нопалин синтетазы, и, в качестве гена-маркера, ген, устойчивый к гигромицину (НРТ) и канамицину (NPTII), и GUS ген, содержащий интрон происхождения E.coli,и промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты, соответственно, переваривали рестрикционными энзимами Hind III и SnaB I (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) и затем очищали, вырезая целевой фрагмент, отличный от 35S промоторной области, с помощью электрофореза на агарозном геле. Затем, каждую из pEXTGUS,полученную в примере 11, и упомянутую выше 59 энзимами Hind III и SnaB I, после чего очищали вырезанием фрагмента, содержащего промоторную область ЕХТ фасоли Azuki, с помощью электрофореза на агарозном геле. Эти фрагменты подвергали лигированию на Hind III и SnaB I сайтах упомянутой выше pBI-HI-35SIG и затем трансформировали в штамм E.coli JM109. Такие плазмиды для переноса обозначали какpBVEG121, соответственно. Кроме этого, как показано на фиг. 8 и 9,Hind III и SnaB I фрагменты беспромоторнойpBI101 (Clontech), имеющие только GUS генную кассету, и рВI121 (Clontech), имеющие промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты, подвергали субклонированию, используя описанные выше методы, на Hind III и SnaB I сайтах pBI-HI-35SIG, с получением плазмид для контрольных экспериментов. Полученные таким образом плазмиды обозначали как pBI-H101 и pBI-H-121, соответственно, а штаммы(2) Трансформация Agrobacterium для инфицирования. Каждую из упомянутых выше плазмид смешивали с Agrobacterium tumefaciens EHA101 компетентными клетками [SHOKUBUTU SAIBOU KOUGAKU (Plant Cell Technology, 4, (3),193-203, (1992)], на смесь воздействовали электрическим импульсом (2,5 kV, 25 мкF, 200 ) с использованием импульсного устройства GenePulser II (Bio-Rad Laboratories) и проводили культивацию в течение 2 дней при 30 С для переноса плазмиды в штамм Agrobacterium. Штаммы Aqrobacterium, трансформированные такими плазмидами, обозначали как Agrobacterium tumefaciens EHA101/pBVEG101, Agrobacterium tumefaciens EHA101/pBVEG121, Agrobacterium tumefaciens EHA101/pBI-H-101 и Agrobacterium tumefaciens EHA101/pBI-H-121, соответственно.Center: NASC) дезинфицировали на поверхности 20% гипохлорита, затем высевали на MSO планшет [неорганическую солевую смесьIndustries, Ltd), смешанную с 2% сахарозы, 3 мг/л тиамин гидрохлорида, 5 мг/л никотиновой кислоты и 0,5 мг/л пиридоксин гидрохлорида,устанавливали рН 6,3, дополнительно смешивали с 0,2% гелановой смолы, обрабатывали в автоклаве и высевали на пластинах], подвергали низкотемпературной обработке при 4 С в течение 2 дней и затем культивировали при 22 С 60 при непрерывном облучении светом в 3000 люкс. Трансплантацию на новый MSO планшет осуществляли через 1 и 2 недели после посева,соответственно, и на второй день после трансплантации через 2 недели после посева 3-4 стебля связывали в пучок и отрезали для получения секций корней длиной 1 см. Эти секции корней помещали бок о бок на CIM планшет(0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,05 мг/л кинетина добавляли на MSO планшет) и культивировали в течение 2 дней при 22 С при непрерывном освещении светом в 3000 люкс. После этого секции корней, культивируемых в течение 2 дней, погружали на 30 с в раствор, полученный культивацией каждого из штаммов Agrobacterium, полученных в (2), в течение 2 дней при 30 С с последующим 5 кратным разбавлением MS раствором, промакали для удаления избытка воды, помещали рядом друг с другом на новый CIM планшет и затем культивировали в течение 2 дней. Спустя два дня, инфицированные секции переносили наSIMC планшет [к MSO планшету добавляли 5 мг/л N6-(2-изопентил)аденина, 0,15 мг/л индолуксусной кислоты и 0,3 г/л карбенициллина],культивировали в течение 2 дней и затем трансплантировали на SIMCS планшет (к SIMC планшету добавляли 50 мг/л канамицина и 20 мг/л гигромицина). Растения повторно трансплантировали на новый SIMCS планшет один или два раза в течение каждой недели. После того, как наблюдалась регенерация побегов и растения обрастали полными розеточными листьями размером около 5 мм, части растения отрезали от каллюса и легко вставляли в RIM планшет (0,5 мг/л индолуксусной кислоты добавляли к MSO планшету). Каждое из укоренившихся растений подвергали окончательной трансплантации на минеральную шерсть(4) Детекция тканевой специфичности. Семена, полученные в пункте (3), высевали на MSKH планшет (50 мг/л канамицина и 20 мг/л гигромицина добавляли к MSO планшету) с целью селекции устойчивых линий. Устойчивые линии подвергали окончательному трансплантированию на минеральную шерсть и культивировали в жидкости [Hyponecks (Hyponecks,Япония) 1000-кратно разбавленный водой]. Образец собирали путем вырезки части надпочвенного участка растений, находящегося в стадии цветения и начального образования стручков, примерно через 30 дней после посева. Секции отрезанных растений замачивали в фиксирующем растворе (20% параформальдегида,0.1 М фосфатного буфера, 1 мМ ЕДТА, рН 7,0) в течение 1 ч при комнатной температуре, дважды промывали 0,1 М фосфатным буфером и затем замачивали в растворе субстрата [2 мМ Х-Глюк,50 мМ фосфатного буфера (рН 7,0), 0,5% Три