Применение бета-d-галактопиранозил-d-ксилозы для получения композиций и растворов , предназначенных для определения лактазы кишечника

1 Область техники, к которой относится изобретение Дефицит или низкая активность кишечной лактазы, которые приводят к недостаточной способности или даже к полному отсутствию способности разлагать лактозу, редко являются следствием врожденного нарушения метаболизма, хотя они и представляют собой общий синдром для взрослых людей. У большей части млекопитающих резкое снижение активности лактазы происходит с момента отнятия от груди. У людей, предки которых в течение длительного времени в значительной степени зависели от потребления молока или продуктов лактации, это снижение активности встречается менее часто. С другой стороны, дефицит или низкая активность кишечной лактазы весьма часто встречается у детей, которых кормят грудью. Настоящее изобретение относится к бескровным методам определения активности кишечной лактазы. Предпосылки создания изобретения Определение активности кишечной лактазы имеет важное значение для педиатрии и гастроэнтерологии и может быть осуществлено прямым путем, в частности из образца слизи,или косвенным путем, в частности на основе данных об уровне глюкозы в крови или данных о выдыхаемом водороде после введения некоторой дозы человеку. Недостатком метода прямого определения является его сложность и высокая стоимость,поскольку для него необходимы специальные инструменты и прошедший достаточно сложную профессиональную подготовку персонал для проведения экстракции образца, который должен подвергаться дальнейшему анализу,кроме того, сам процесс определения сопряжен с неприятными ощущениями для пациента и не лишен опасности для него. Недостатком косвенного метода определения является то, что этот метод основан на анализе крови, что требует специально подготовленных специалистов для взятия крови перед проведением такого анализа, и, кроме того, он является сложным и может приводить к ошибкам вследствие наличия глюкозы, образовавшейся при переваривании другой пищи, принятой пациентом, и эндогенной глюкозы, которая могла быть мобилизована. Другие методы определения кишечной лактазы основаны на том факте, что определенные дисахариды в зависимости от их сродства с лактазой могут использоваться в качестве субстрата для лактазы и превращаются под действием фермента в определенные моносахариды,которые легко абсорбируются кишечником и выводятся с мочой. Так, способы, описанные в патентах Испании ES-P-478590 и ES-P-482073, базируются на оценке "in vivo" и основаны на анализе в моче 3 000684O-метил-D- глюкозы после орального введения 3-O-метиллактозы. Однако недостатком этих методов является то, что для определения 3-Ометил-D-глюкозы в моче необходимо использование хроматографического анализа, для которого требуется сложное и дорогостоящее оборудование и оснащение. С другой стороны, в патенте Испании ESP-9001680 описано получение дисахарида 4-O-галактопиранозил-D-ксилозы формулы (I) для определения уровня кишечной лактазы. Этот дисахарид вводят орально, и он действует в качестве субстрата для кишечной лактазы и разлагается в кишечном тракте на ксилозу и галактозу, при этом ксилоза абсорбируется и выводится с мочой, где она может быть легко определена прямым путем с помощью простого колориметрического метода. Недостатком дисахарида, описанного в патенте Испании ES-P9001680, является то, что в результате его весьма сходного строения с лактозой он обладает повышенным сродством к лактазе. Это приводит к тому, что только часть переваренной 4-O-галактопиранозил-D-ксилозы гидролизуется с участием ферментативной активности лактазы,и, следовательно, частично неразложенная на ксилозу и галактозу часть дисахарида выводится с экскрементами. Следствием этого является высокий уровень появления ошибки, т.к. низкое содержание или даже отсутствие ксилозы в анализируемой моче может рассматриваться и как дефицит или нулевая активность кишечной лактазы, так и как дефицит гидролиза дисахарида вследствие отсутствия у него сродства к лактазе. С целью избежать таких предельных ошибок,необходимо, чтобы пациент переваривал достаточное количество дисахаридов, что в свою очередь может привести к проблемам с кишечником у пациента, таким, как понос и соответствующий дискомфорт. В патенте Испании ES-P-9001680, кроме того, описан способ получения 4-Oгалактопиранозил-D-ксилозы, включающий в целом синтез из бензилD-ксилопиранозида с последующими стадиями избирательной защиты,гликозилирования и удаления защитных групп. Наряду с большим количеством реакционных стадий использование для реакции гликозилирования дорогостоящих реактивов, таких, как трифталат серебра, и необходимость в хроматографических колонках для очистки промежуточных продуктов и конечного продукта делает этот способ дорогостоящим и обусловливает сложности для использования этой методики в промышленных масштабах. С другой стороны у Gorin и др. в статьеgularis", Can. J. Chem. 42 (1964) 2307-2319 описан синтез ряда дисахаридов, в том числе 2-O-D-галактопиранозил-D-ксилозы и 3-ОDгалактопиранозил-D-ксилозы, чисто экспериментальным методом. В этой публикации делается заключение, что продукты, представляющие собой форму переноса галактозила, при использовании различных акцепторов образуются скорее при замещении вторичных, а не первичных гидроксильных групп, при этом минимальным структурным требованием для реакции с акцептором является соседство гидроксила с замещенной гидроксильной группой. Однако в этой публикации не описано применение различных синтезированных дисахаридов. Описание изобретения Предметом настоящего изобретения, предназначенного для устранения указанных выше недостатков, присущих известным из уровня техники решениям, является применение -Dгалактопиранозил-D-ксилоз, в частности 2-O-D-галактопиранозил-D-ксилозы общей формулы 4 композиции и растворы могут содержать некоторое количество обычных фармацевтически приемлемых ингредиентов, из которых, по крайней мере, один выбран из группы, включающей стабилизаторы, защитные вещества,корригенты, лактозу, гелеобразователи, разжижающие вещества и консерванты. Растворы могут представлять собой обычные водные или физиологические растворы. Было установлено, что даже при использовании смеси трех дисахаридов (I), (II) и (III) определение активности кишечной лактазы через ксилозу, присутствующую в выделяемой моче,дает существенно улучшенные результаты по сравнению с соответствующим определением,когда вводят только дисахарид (I), что очевидно указывает на неожиданное действие, соответствующее изобретению. Получение -D-галактопиранозил-D-ксилоз, к которым относятся ранее описанные дисахариды (I), (II) и (III), включает следующие стадии: взаимодействие D-ксилозы и субстрата D-галактопиранозида в присутствии фермента-галактозидазы в соответствии с изображенной ниже реакционной схемой и 3-ОD-галактопиранозил-D-ксилозы общей формулы (III), для получения композиций и растворов, применяемых для бескровной и надежной оценки кишечной лактазы.-D-галактопиранозил-D-ксилозы, а именно, 2-OD-галактопиранозил-D-ксилоза и 3-О-D-галактопиранозил-D-ксилоза, применение которых заявлено в формуле изобретения, обладают сродством к лактазе, существенно более высоким по сравнению с дисахаридами, обычно применяемыми для этого типа анализов, что является неожиданным с точки зрения того факта, что оба соединения структурно менее похожи на лактозу, чем ранее применяемые соединения, такие, как 4-Oгалактопиранозил-Dксилоза, от которой они структурно отличаются различными положениями гидроксильных групп относительно соседней гликозидной связи в молекуле. Дисахариды формул (II) и (III) могут быть включены в обычные композиции и растворы,которые используются индивидуально либо совместно или даже при смешении с некоторым количеством обычных дисахаридов формулы (I) и/или с меньшими количествами лактозы. Такие причем концентрация D-ксилозы в 2-20 раз превышает концентрацию -D-галактопиранозида в водной среде, забуференной до значения рН 5,09,0, и при температуре от 4 до 37 С; дезактивацию -галактозидазы путем выдержки при 100 С по достижении максимального выхода образовавшихся дисахаридов (обычно через 4-8 ч), определяемого тонкослойной хроматографией или с помощью колонки с активированным углем, и выделение образовавшихся дисахаридов фильтрацией в насадочной колонке с растворителем, выбранным из воды или воды/спирта, с получением смеси дисахаридов (I),(II) и (III), которые могут быть включены в композиции или растворы как в виде смеси из трех дисахаридов, так и в виде смеси одного из дисахаридов (II) или (III) после их соответствующего выделения с дисахаридом (I), а также по отдельности. В одном из вариантов осуществления этого способа используемый -D-галактопиранозид представляет собой О-нитрофенилD-галактопиранозид, а в другом варианте лактозу. С другой стороны, -галактозидаза может происходить, например, из Escherichia coli, и 5 она поставляется на рынок фирмой SpanishCompany SIGMA-ALDRICH QUIMICA, S.A. Способ можно проводить в присутствии смешивающихся с водой сорастворителей, таких как ацетонитрил, диметилформамид или диметилсульфоксид. Фильтрующие колонки, применяемые для выделения дисахаридов, могут быть заполненыSephadex G-10 либо Biogel P2 или же активированным углем. Дисахариды (II) и (III) могут быть получены также другими обычными способами, такими, как описанные у Gorin и др. в статье "Thedisaccharides by "Sporobolomyces Singularis",Can. J. Chem. 42 (1964) 2307-2319. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлено графическое изображение динамики а) гидролиза in vivo смеси-D-галактопиранозил-D-ксилозы (I), (II) и (III) в виде процентной доли ксилозы, выделившейся с мочой, и б) активности кишечной лактазы(нм/мин/мг протеина) во время роста крыс, как это описано ниже в примерах. Варианты осуществления изобретения Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его изобретения. Пример 1. Получение смеси, состоящей из 4-OD-галактопиранозил-D-ксилозы (дисахарид I), 2-OD-галактопиранозил-D-ксилозы-галактозидазу из E.coli фирмы SIGMA (1,5 мг,560 ед.) и смесь инкубировали при 25 С в течение 5 ч 45 мин. По истечении этого промежутка времени смесь выдерживали при 100 С в течение 10 мин, концентрировали и образовавшийся остаток вносили в колонку с активированным углем, используя градиент воды-этанола от 1:0 до 85:15. Первыми элюировались моносахариды ксилоза и галактоза, а затем смесь дисахаридов(I), (II) и (III), при этом получали 2 г смеси дисахаридов (50% по отношению к эквивалентам исходного O-нитрофенилгалактопиранозида),а отношение I:II:III составляло 8,6:1,4:1,0 соответственно. Для исследования различных функций дисахаридов (I), (II) и (III) их разделяли, каждый из них очищали и анализировали с использованием ЯМР. 1 Н-ЯМР-спектр (300 МГц, D2O) фракций с дисахаридом (I), определенный с помощью спектрофотометра типа Varian XL-300,оказался идентичным с таковым ранее полученного продукта. Для получения характеристик и точного определения региохимии (химии области) связи,образованной в дисахаридах (II) и (III), фракции 6 с высоким содержанием этих соединений ацетилировали и образовавшиеся продукты выделяли с помощью полупрепаративной ЖХВР(нормальная фаза колонки SiO2, этилгексанацетат 1:1, определение по индексу рефракции). Далее определяли 1 Н-ЯМР-спектр (300 МГц,CDL3) каждого из следующих полученных производных: ацетилированное производное 2-ODгалактопиранозилD-ксилопираноза,ацетилированное производное 2-ODгалактопиранозилD-ксилопираноза,ацетилированное производное 3-ОDгалактопиранозилD-ксилопираноза,ацетилированное производное 3-ОDгалактопиранозилD-ксилопираноза. Соотношение дисахаридов (I), (II) и (III),полученных на хроматографической колонке,определяли с помощью газовой хроматографии на хроматографе, оснащенном пламенноионизационным детектором и капиллярной колонкой типа SE-54 (стационарная фаза: 5% дифенила и 95% диметилполисилоксана, длина 15 м, внутренний диаметр 0,15 мм и толщина мкм). При анализе использовали поток азота со скоростью 1 мл/мин. Использовали следующую температурную программу: начальная температура 160 С; начальное время 2 мин; возрастание температуры 5 С/мин; конечная температура 250 С. Образцы анализировали после триметилсиликатирования с помощью следующего протокола: аликвотное количество (10 мкл) выдерживали при 100 С в течение 10 мин, после чего добавляли пиридин (25 мкл), содержащий в качестве внутреннего стандарта бензилксилопиранозид (10 мМ) и N-триметилсил-имидазол (25 мкл),и продолжали выдерживать при температуре 60 С в течение 30 мин. Время удерживания пиков, соответствующих различным дисахаридам,было следующим:in vitro. Дисахариды (I), (II) и (III) и лактозу подвергали гидролизу в соответствии с методом,описанным у A. Rivera-Sagredo, F. J. Canada, О.Eur. J. Biochem., 209 (1992) 415-422, с использованием кишечной лактазы овцы при рН 6,0, при этом были получены следующие результаты для констант Михаэлиса (Кm) и максимальных скоростей (Vmax): 7 Эти данные показывают, что константы Михаэлиса дисахаридов (II) и (III) существенно ниже по сравнению с дисахаридом (I), а значение Кm дисахарида (III) оказалось даже ниже,чем у лактозы, что свидетельствует о необычно высоком сродстве дисахаридов (II) и (III) к лактазе. Пример 3: Определение ксилозы в моче после орального введения смеси дисахаридов(III) (в соотношении 8,6:1,4:1,0 соответственно) и полученную по описанной в примере 1 методике, применяли для определения активности кишечной лактазы. Для этого группу из 17 питающихся грудным молоком крыс 12-дневного возраста линии Sprague-Dawley из одного помета выдерживали без еды в течение 6 ч после отнятия от матери. По истечении этого промежутка времени собирали основную мочу каждого животного с помощью трансабдоминального давления на пузырь и сразу после этого каждой особи вводили 18,2 мг смеси дисахаридов, разбавленной в 0,3 мл дистиллированной воды,используя внутрижелудочный тонкий зонд. Начиная с этого момента, мочу собирали в течение последующих 5 ч, определяя в ней выделившуюся ксилозу с помощью колориметрического анализа, основанного на фторглюциноловой реакции, и используя основную мочу в качестве контроля. Сразу же после сбора мочи умерщвляли трех животных, у которых прямым методом определяли активность лактазы в слизи кишечника. Для этого срез тонкой кишки сушили и промывали, слизь собирали с помощью соскоба стеклом и гомогенизировали, измеряя спектрофотометрическим методом активность лактазы в гомогенизированном продукте. Остальных животных возвращали к матери и повторяли с ними эксперимент в таких же условиях через 15, 18, 21, 24 и 30 дней, после чего помет уничтожали. На фиг. 1 приведены полученные средние значения этого эксперимента, представляющие собой данные для гидролиза in vivo смеси дисахаридов (I), (II) и (III) и для активности кишечной лактазы при росте крыс. Для этого данные о выделившейся ксилозе (%) [кривая а)] представлены вместе с данными об активности лактазы (нм/мин/мг протеина) [кривая б)] по отношению к возрасту (в днях). Результаты этого эксперимента показывают, что 1) присутствие ксилозы в моче определяется на основе гидролиза введенных дисахаридов благодаря активности кишечной лактазы и 2) процесс выделения в мочу ксилозы, поступившей при оральном введении, происходит параллельно с известным физиологическим изменением активности кишечной лактазы, которая понижается в процессе развития особи. Этот эксперимент показывает, что данная методика пригодна для определения "in vivo" активности кишечной лактазы и может применяться для оценки этой 8 активности бескровным методом в диагностических целях, прежде всего на кормящихся грудью индивидуумах, у которых подозревается дефицит этого фермента. Пример 4. Группу кормящихся грудным молоком крыс 15-дневного возраста линии SpragueDawley из одного помета выдерживали без еды в течение четырех часов в метаболических боксах при 30 С. Каждой из них вводили 18,2 г дисахарида (I) в 0,5 мл дистиллированной воды. Мочу у животных собирали в течение 5 ч с помощью трансабдоминального давления на мочевой пузырь. Количество ксилозы, выделившейся с мочой в течение этого промежутка времени,оценивали спектроскопическим методом. Выделение ксилозы составило 21%, что, как следует особо отметить, составляет меньше половины по сравнению с результатом, полученным при использовании смеси продуктов (I), (II) и (III) через 15 дней. При сравнении данных этого примера с таковыми, полученными в примере 3, очевидно,что сродство дисахаридов (II) и (III) является столь высоким, что даже компенсирует "in vivo" низкое сродство дисахарида (I), когда три дисахарида вводят в виде смеси, в которой превалирует дисахарид (I). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение -D-галактопиранозил-Dксилозы, имеющей две гидроксильные группы,каждая из которых соответственно является соседней по отношению к гликозидной связи в ее молекуле и выбранной из группы, включающей 2-OD-галактопиранозил-D-ксилозу, 3-ODгалактопиранозил-D-ксилозу и их смесь, для приготовления композиции для оценки кишечной лактазы. 2. Применение -D-галактопиранозил-Dксилозы, имеющей две гидроксильные группы,каждая из которых соответственно является соседней по отношению к гликозидной связи в ее молекуле и выбранной из группы, включающей 2-OD-галактопиранозил-D-ксилозу, 3-ODгалактопиранозил-D-ксилозу и их смесь, для приготовления композиции, содержащей 4-O-галактопиранозил-D-ксилозу, для оценки кишечной лактазы. 3. Композиция для оценки кишечной лактазы, содержащая в качестве активного начала-галактопиранозил-D-ксилозу, отличающаяся тем, что в качестве -галактопиранозил-D-ксилозы содержит -D-галактопиранозил-D-ксилозу,имеющую две гидроксильные группы, каждая из которых соответственно является соседней по отношению к гликозидной связи в ее молекуле и выбранную из группы, включающей 2-O-D-галактопиранозил-D-ксилозу,3-ОDгалактопиранозил-D-ксилозу и их смесь, а также фармацевтически приемлемые количества, по крайней мере, одной добавки. 4. Композиция для оценки кишечной лактазы, содержащая 4-Oгалактопиранозил-Dксилозу, отличающаяся тем, что дополнительно включает 2-OD-галактопиранозил-D-ксилозу,3-OD-галактопиранозил-D-ксилозу и их смесь, а также фармацевтически приемлемые количества, по крайней мере, одной добавки. 5. Композиция по п.3 или 4, отличающаяся тем, что в качестве добавки она содержит добавку, выбранную из группы, включающей стабилизаторы, защитные вещества, добавки,улучшающие вкус, лактозу, гелеобразователи,разжижающие вещества и консерванты. 6. Композиция по п.3 или 4, отличающаяся тем, что представляет собой водный раствор. 7. Композиция по п.3 или 4, отличающаяся тем, что представляет собой физиологический раствор. 8. Композиция по п.3 или 4, отличающаяся тем, что в качестве добавки она содержит добавку, выбранную из группы, включающей стабилизаторы, защитные вещества, добавки,улучшающие вкус, лактозу и консерванты.