Противоопухолевые вещества, выделенные из слизистой кишечника, и способ их выделения

Изобретение относится к медицине, в чаСТНОСТИ К ПРОТИВООПУХОЛСВЬТМ ВСЩССТВЗМ РВ слизистой кишечника и способу их выделения.Известны различные противоопухолевые вещества, выделенные из слизистой тонкого КИШСЧНИКЗ.Известен грубый экстракт из тонкого кишечника теплокровных Животных П].Его недостаток состоит в том, что он подавляет разрастание клеток только тонкого кишечника ЯСИВОТНЪТХ, ИЗ КОТОрЫХ ВЬПДСЛСН.Известна фракция грубого экстракта тонкого кишечника теплокровного животного зайца [2].Ее недостаток состоит в том, что она 111 то ингибирует только деление опухолевых КЛСТОК ПСЧСНИ И ПОЧСК.Известно противоопухолевое вещество из класса кейлонов, выделенное из тонкого кишечника Мышей [3], которое является трипептидом со следующей структурой: р-С 1 и-Н 1 з-С 1 п-ОН.Его недостатком является то, что оно подавляет разрастание только клеток толстой КИШКИ.Известен лабораторный способ выделения экстрактов из эпителия пищеварительного тракта [1] в котором используются небольшие эксПСрИМСНТЗЛЬНЬТС ЯСИВОТНЬТС, КОТОрЫХ обезглавливают или наркотизируют. После этого эпителий механически собирают, например, посредством отделения исходной биомассы. После ЭТОГО СЬТРЬС ПОДВСрГШОТ ТОЛЬКО ОСНОВНЬТМ ЭТНпам экстракции.Данный способ является малоэффективным, так как полученный продукт термически неустойчив, недостаточно очищен и неидентифицируем с точки зрения своей химической природы в результате чего этот продукт имеет низкую биологическую активность.Известен способ выделения веществ из слизистой тонкого кишечника с морфогенной активностью [4] в том числе противоопухолевых веществ.Способ состоит в препарировании кишечного эпителия только что декапитированных животных, например свиней, которые голодали 24 ч перед декапитацией.Используют также и отмытый материал в результате обработки тонких кишок на мясокомбинатах. Этот отмытый материал содержит кишечный эпителий, отделенный до мускульного слоя, и другие вещества, которые являются излишним балластом в процессе выделения веществ с морфогенной активностью. Далее эта масса гомогенизируется с добавлением 1-2 объСМОВ ВОДЫ ДЛЯ ПОЛУЧСНИЯ ВОДНОГО экстракта,который затем центрифугируется с частотой 10000-12000 об/мин при низких температурах. Полученный супернатант фракционируется по молекулярной массе через диафлофильтрацию. Далее низкомолекулярный фильтрат очищается посредством последовательных экстракций сиспользованием аппарата противоточного деления. Нефильтруемый высокомолекулярный остаток после сефадексного обессоливания фракционируется через ионнообменную хроматографию, через ионнообменную колонну ДЕАЕЦеллюлоза с элуент нарастающей концентрацией хлорида натрия и после этого промывается 1 Ы-ным раствором МаОН. После получения отчета о спектрофотометрической абсорбции на 280 нм или белковой концентрации (например по методу Лоури), фракции собираются в зависимости от их максимальных показателей. После диализа фракции лиофилизируются для сохранения. Выделенные фракции тестируются на наличие морфогенного эффекта биологическим способом по спровоцированным изменениям в количестве энтероцитов; радиометрически - по ДНК-синтезу и по классической гистологичеСКОЙ картине ТОНКОКИШСЧНОГО ЗПИТСЛИЯ ОПЪТТных животных (например, мыши), в который было инжектировано определенное количество тестируемой фракции. Таким образом выделяются фракции с подчеркнутой морфогенной ЗКТИВНОСТЬЮ.Недостаток данного способа состоит в том,что из-за балластных примесей конечные продукты, имеющие низкую биологическую активность, не дифференцированы, из-за чего трудно выделить конечные продукты, обладающие ярковЬ 1 раЖеннЬ 1 ми противоопухолевыми свойстВЗМИ И, КрОМС ТОГО, КОНСЧНЬТС ПРОДУКТЬТ ИМСЮТ общеклеточную активность. Недостаток данного способа также в том, что конечные продукты чувствительны к протеолитическому воздействию кишечных ферментов, которые содержаться в исходной биомассе. Это уменьшает производительность, так как в процессе первоначальной обработки часть биополимеров разлагается под воздействием ферментов. Еще один недостаток данного способа в том, что во время водяной экстракции высокомолекулярные полимеры из ядер клеток не оседают, из-за чего сильно выражен общетоксический эффект конечных продуктов. Кроме того, недостатком способа является то, что из-за одновременного выделения некоторых конечных биоактивных фракций из общей смеси, полученные продукты, по результатам спектрофотометрического отчета,являются смесями веществ с различной биологической активностью. Это также ведет к снижению полезного эффекта. Кроме того, фракции невозможно идентифицировать по молекулярному весу, то есть невозможно определить их химическую природу.Технической задачей предложенного изобретения является получение новых противоопухолевых веществ с расширенными возможностями, повышенной эффективностью, чистотой и биологической активностью относительно опухолевых клеток и уменьшенной активностью относительно здоровых, а также нахождение способа выделения противоопухолевых веществИЗ СЛИЗИСТОЙ ТОНКОГО КРЦЦСЧНИКЗ И ПрИМСНСНИС ВЬЩСЛСННЬТХ ПРОТИВООПУХОЛСВЬТХ ВСЩССТВ ДЛЯ подавления роста легочной карциномы Льюиса и подавления роста плоскоклеточной карциномы Ю-София-лиъши 7.Новое противоопухолевое вещество, выделеъшое из слизистой тонкого кишечника, представляет собой два нуклеопептида - ингибирующие энтероцитогенины (ИЭГ), где - ИЭГ 1 пептид с молекулярной массой 4,45 О+0,180 кДа,СВЯЗЗННЪТЙ С ДВУМЯ гуаниловыми остатками И содержащий 2 Т 11 г (треонин), 4 6111 (глутаминовую кислоту), 5 (Ну (глицин), 2 Азр (аспарагиновую кислоту), 2 Зег (серин), 4 А 1 а (аланин), 2 Уа 1 (валин), 1 Пе (изолевцин), 1 Тгу (триптофан),3 Ьуз (лизин), 1 Н 15 (хисгидин), 1 Ат; (аргинин),2 Ьеи (левцин), 3 Рго (пролин).-ИЭГ 2 - гексапептид с молекулярной массой 0,95+0,12 О кДа, связанный с одним гуаниловЬ 1 м остатком и следующей аминокислотной последовательностью - Аг-Агд-Аэр-Азр-НтзАг 3-МН 2.Способ выделения противоопухолевых ВСЩССТВ, ВЬЩСЛСННЬТХ ИЗ СЛИЗИСТОЙ КИШСЧНИКЗ,заключается в следующем.Отделяют кишечный эпителий декапитированиых Животных, получештую массу гомогенизируют с добавлением уксусной кислоты до конечной ее концентрации 2% от общей массы. Полученный гомогенат подвергают клеточной деструкции посредством типового механического дезинтегрирования с добавлением трех обьемов 96%-го этилового спирта при одновременном быстром подогревании до 70 С и последующем охлаждении до 15 С. После этого полученная масса расслаивается на осадочный балластный слой и надосадочный слой - супернатант, который в дальнейшем подвергают вЬ 1 сокооборотному сепарированию. Отделенную после сепарирования легкую фракцию фильтруют до получения прозрачного раствора у которого рН коррегируется до 6,5 - 7, а затем подвергают дополнительно ультрафильтрации в рамках от 6 до 1 кДа. Полученный ультрафильтрат леофилизируют для длительного хранения. При необходимости работы с леофилизатом его дополнительно очищают способом гельфильтрации.Технический результат предложенного способа заключается в улучшенной экстракции белков за счет разрушения клеточных мембран уксусной кислотой, которая добавляется при гомогенизации.Кроме того, техническим результатом является повышение устойчивости белковой массы, полученной после дезинтегратора за счет добавления этилового спирта в процессе дезшттеграции.Полученные данным способом противоопухолевые вещества обладают способностью воздействия на опухолевые клетки различных органов ТСПЛОКрОВНЪТХ ЯСИВОТНЪТХ ПрИ ЭТОМ ПрО 000349цесс воздействия необратим, а также обладают повышенной чистотой и биологической активНОСТЬЮ ПО ОТНОШСНШО К ОПУХОЛСВЫМ клеткам И ПОНИЖСННОЙ ТОКСИЧНОСГЬЮ ПО ОТНОШСНШО К здоровым клеткам.Изобретение поясняется следующими схемами:на фиг. 1 - принципиальная схема осуществления заявленного способа;на фиг. 2 - график зависимости роста подавления опухолевых клеток от объема экстракта;на фиг. 3 - график, иллюстрирующий биологическую активность ИЭГ 1 при НР 1 С очищении;на фиг. 4 - хроматограмма, иллюстрирующая аминокислотный состав ИЭГ 1.Пример осуществления способа выделения противоопухолевых веществ из слизистой кишечника (фиг. 1).Согласно способу выделения противоопуХОЛСВЬТХ ВСЩССГВ ИЗ СЛИЗИСТОЙ ТОНКОГО КИШСЧника отделение кишечного эпителия произвоДИГСЯ у ТОЛЬКО ЧТО ДСКЗПИТИрОВЗННЬТХ СВИНСЙ,которые голодали 24 ч перед декапитацией. Используются отходы от переработки на мясокомбииатах тонкого кишечника свиней, которые содержат кишечный эпителий и другие балластные вещества. Этот материал представляет собой клеточную массу из слизистой тонкого кишечника с преобладающим содержанием клоНЗЛЬНЬТХ КЛСТОК ИЗ ТОНКОКИШСЧНЬТХ КрИПТ. Эта клеточная масса собирается не позднее 3 ч поСЛС ДСКЗПИТЗЦИИ ИЗ ВТОрЫХ ВЗЛИКОВ МЗШИНЬТ ДЛЯ последовательного вальцевания тонкого кишечника, при этом щель между валиками составляет от 2-х до 4-х мм. Эффективно использование машины типа Битерлинг, в которой кишки очищаются для их последующего использования в производстве колбас. Настройка щели между ВТОрЬТМИ валиками ЭТОЙ МЗШИНЫ В ДИЗПЗЗОНС ОТ 2 до 4 мм не мешает машине выполнять ее основные функции. При этом одновременно согласно данному способу выделенная на этих валиках клеточная масса из слизистой тонкого кишечника является самой подходящей для последующего выделения ИЭГ 1 и ИЭГ 2.Полученная после отпрепарирования масса смешивается в реакторе, куда добавляется чистая концентрированная уксусная кислота с конечной концентрацией 2% от общей клеточной массы. Эта масса подвергается клеточной деструкции в дезинтеграторе, например типа Рани 1251 Н посредством механического дезинтегрирования.Полученный гомогенат из дезинтегрированной биомассы смешивается в реакторе с 3-мя объемами 96% этилового спирта с одновременным быстрым подогреваъшем до температуры 70 С и с последующим охлаждением до 15 С,затем оставляется для осаждения находящихся в ней полимеров.Тяжелая фракция не используется в дальнейшей обработке и удаляется.Супернатант (легкая фракция) подвергается высокооборотному сепарированию, например в сепараторе типа БРПХ 207 фирмы Альфа Лавал при оборотах тарелок 380 рад/с.Полученная легкая фракция после сепарирования фильтруется через ЗАЯЦ - фильтр типа ОРИОН-40 до получения прозрачного раствора,у которого рН коррегируется до 6,5 -7,0.Для более качественной ультрафильтрации возможно удаление из этого раствора этилового спирта и липидных примесей посредством вакуумного концентрирования.После этого раствор ультрафильтруется,например на ультрафильтрационной установке туша ЛАБ-38-4,5 в пределах от 6 до 1 кДа.Полученный ультрафильтрат лиофилизуется. Лиофилизат можно сохранять при температуре -10 С, сохраняя его биологическую активность до 5 лет.Если необходимо, лиофилизат растворяется в бидистиллированной воде в соотношении: 0,1 г (лиофилизат)/0,5 мл (вода), после чего дополнительно сепарируегся и очищается препаративно в хроматографической колонне с ЗЕРНАВЕХ С-25 меашш. При этом образуются две биоактивные фракции - противоопухолевые вещества ИЭГ 1 и ИЭГ 2, каждая из которых содержит некоторое количество примесей.Примеси удаляются посредством точного хроматографического сепарирования и очищения по молекулярной массе ИЭГ 1 и ИЭГ 2 типа РРЬС. На фиг.1 жирная линия показывает максимальное количество ИЭГ 1 при объеме эллюента около 31 мл при РРЬС очищении ИЭГ 1 посредством фракционирования через фильтрацию при использовании геля ЗЕРНАВЕХ 6-25 Меашш. Однако, ИЭГ 1 с этим максимумом имеет низкую биологическую активность. Второй максимум, который находится в зоне около 25 мл, однако, совпадает с горизонтальной частью тонкой линии - А, которая показывает максимум биологической активности ингибирования при воздействии ИЭГ 1 над мышиными лимфомными клетками 15517836, относительно контрольной группы необработанных клеток. Из-за этой причины в качестве конечного продукта берется ИЭГ 1 из зоны второго максимума с биологической активностью, а это составляет более 70% ИЭГ 1.После этого выполняется НРЬС с использованием Зогьах.В качестве конечного результата получены противоопухолевые вещества - нуклеопептиды: ИЭГ 1- пептид с молекулярной массой 4,450 + 0,180 кДа и ИЭГ 2-гексапептид с молекулярной массой 0,950 + 0,120 кДа.Определение молекулярного веса очищенных согласно способу биоактивных фракций ИЭГ 1 и ИЭГ 2 выполняется посредством НРЬС в колонне с использованием силикагеля Зогьах.Определено, что молекулярная масса ИЭГ 1 4,450+0,180 кДа, а молекулярная масса ИЭГ 2 0,950 +0,120 кДа.Посредством ультрафиолетового спектрального анализа определяются по двум максимумам поглощения для каждого ИЭГ: для ИЭГ 1 - 220 и 248 ши; для ИЭГ 2 - 220 и 245 ши. Наличие гуанозина в качестве остатка, который идентифрщируется максимумами на 248 нм (два гуаниловых остатка) и на 245 нм (один гуаниловь 1 й остаток), подтверждает нуклеопептидную природу двух ИЭГ. Наличие пептидов и в 2-х ИЭГ подтверждается другим максимумом на 220 нм.Аминокислотньцй анализ ИЭГ подтверждает наличие: - 2 Т 11 г (Треонин), 4 6111 (глутаминовая кислота), 4 А 1 а (аланин), 2 Уа 1 (валин), 1 Пе(изолевцин), 1 Тгу ( триптофан),3 Ьуз (лизин), 1 Н 1 ( хистидин), 1 Ат; (аргит-Шн), 2 Ьеп (левцин),3 Рго (пролин), что видно по пикам графика на фиг.4. Самым высоким является содержание С 1 и-13,33%, затем следует Ьуз- 10,95%, после чего по нисходящей следуют: Зет, Тге, Азр, (Ну,А 1 а, Уа 1, Пл, Ьеи, Н 15, Аг. ИЭГ 2 аналогично идентифт/Щируется как Аг-АгЗ-Азр-Азр-Нйз Ага-МН; ИЭГ 1 и/или ИЭГ 2 применяются в качестве ингибиторов биосинтетических процессовДНК-, РНК- и синтеза протеинов тонкого кишечника. Каждая фракция, полученная в результате очищения 2-х конечных продуктов ИЭГ, тестируется биологически на мышах. С этой целью 3 мг содержания пептидов соответствующей фракции вводятся подкожно мышам одновременно с тестирующим реагентом, например изотопный маркер 3 Н - тимидин и 14 С уридин при использоваъши 2-х канального ясидкого сцинтиллятора. После 7 ч животные подвергаются декапитации.Исследуются четыре тонкокишечных участка - дуоденум, йеюнум, средняя часть и илеум. Как видно из табл.1, иллюстрирующей влияние ИЭГ 1 и ИЭГ 2 на биосинтетические и морфогенные процессы в тоших кишках, ИЭГ 1 за 7 ч своего воздействия уменьшает количество энтероцитов в среднем на 16,5% относительно контролируемых животных, ИЭГ 2 - на 17,25%. Оба ИЭГ подавляют синтез нуклеиновых кислот, особенно в средней части тонкого кишечника в илеуме.% ИЭГ 1 Двенадцати перстная КИШ- 74 75 66 82 ка Тонкая кишка 94 67 84 95 Средняя часть 52 62 58 76 пдвздшная 57 68 69 81 кишкаВ методике, изложенной в [5], которую можно использовать и для ИЭГ 1 и ИЭГ 2, доказывается, что оба ИЭГ повышают цитозольный уровень Сад в гладкомышечных клетках, используя при этом внутриклеточные депо Сад. Таким образом, они подключают цепь молекуЛЯрНЫХ МСХЗНИЗМОВ, обеспечивающих ИХ ВЛИЯние на гладкомускульную подвижность и ускорение клеточной смерти, через которое достигается дополнительное ингибирование клеточного роста.Противоопухолевый эффект использования ИЭГ 1 определяется 111 что для подтверждения возможности использования ИЭГ 1 в качестве ингибитора развития клеточных культур из нормальных И ЗЛОКЗЧССТВСННЫХ КЛСТОЧНЫХ ЛИний. Результаты исследования приведены в табл. 2Таблица 2 Клеточная линия 1 С 50 (мг/мл) МК- тест КВР-тест Нормальные клеточные линии 3 Т 3 123,9 187,5 1:12 223,2 264,5 ВНК больше 300 больше 300 СНО 213,2 256,4 МВСК 192,6 247,4 Уего 156,7 197,3 Злокачественъше клеточные линии 1.5178 У 192,8 212,6 Нер 2 290,4 300 НеЬа 291,5 268,5 КВ 196,15 276,3 МЕТН-А 206,2 226,3 А 38 212,3 246,5 198,9 234,8Используются 6 видов нормальных клеточных лиьшй:ВНК - почечные от золотистого сирийского хомяка;/его - почечные от африканской зеленой обезьяны;7 видов злокачественных клеточных линий:НеЬа - человеческие из эпителиоидной карценомы на шейке матки;5 р 2, МЕТН-А, А 38 - различные МИСЛ 0 МНЪ 1 С МЫШИНЫС, где линии, обозначенные символом - явлшотСЯ СУСПСНЗИОННЫМИ КЛСТОЧНЫМИ ЛИНИЯМИ, а обозначенные символом - продолжительными ПИНИЯМИ.ВСС ЭТИ ЛИНИИ ИСПОЛЬЗОВЗНЫ ПрИ КЛСТОЧной плотности тестирования от 4104 /мл до 15-104 /мл. Цитоксический эффект ИЭГ 1 над клеточными культурами количественно определяется в двух тестах: ЫР-тест и КВР-тест для определения токсической активности. Результаты этих тестов в табл. 2 показывают подчеркнутую зависимость эффекта от концентрации ИЭГ 1. При этом 1 С 5 О- показатели, т.е. концентрация ИЭГ 1, ингибирующая до 50% разрастаНИС В СООТВСТСТВУЮЩИХ КЛСТОЧНЫХ ЛИНИЯХ, находится в диапазоне от 123, 9 мг/мл до 300 мг/мл.Цитотоксический эффект проявляется и суммарно и во времени. Этот эффект у клеточных культур устанавливается через типовой тест разрастания и подтверждается как тенденция результатов тршового клонирующего теста,т.е. ИЭГ 1 уменьшает скорость клонирования клеточных культур способом 1 п что. Этот эффект является результатом более поздних во времеьш внутриклеточных необратимых повреясдений и вызванных нарушений кальциевой внутриклеточной гомеостазы.При экспериментальном способе 1 п что 1 п ч 1 чо для подавления легочной карциномы Люиса (ЬЬСа) в стадии 111 что опухолевые клетки легочной карценомы Люиса ЫзСа обрабЗТЫВЗЮТСЯ ПРОТИВООПУХОЛСВЫМИ ВСЩССТВЗМИ ИЭГ 1 с дозой от 350 до 1050 мг/мл. Эти опухолевые клетки низкодифференцированны и проИСХОДЯТ ИЗ СПОНТЗННО ПОЯВИВШСЙСЯ В ЛСГКИХ мышей из линии ДВА/2 опухоли, которая впоследствии пересаживается. ЦСа - это опухоль,сравнительно устойчивая к большей части цитостатикам, ОбЬТЧНО ИСПОЛЬЗУСМЫМ В КЛИНИКС, ЧТО объясняется ее раъшим метастазированием на 7 й день.Полученная опухолевоклеточная фракция этих клеток инжектируется способом 1 п ч 1 чо подкожно в оргаьшзмы здоровых мышей, при этом индекс подавления опухолевого роста,ПОЯВИВШИЙСЯ В ЭТИХ МЫЦЩХ, ЯВЛЯСТСЯ СЗМЬПИ большим - 88,2% по сравнению с опухолевым ростом у необработанных мышей, когда упомянутая выше доза ИЭГ 1 -1050 мг/мл. Согласно международно принятым нормам, если индекс подавления равен или больше 50%, то считается достоверным, что использованное вещество обладает противоопухолевой активностью. Средний вес опухолей, развитых из трансплантируемых опухолевых клеток карценомы Люиса 11 Са, обработанных минимальной дозой ИЭГ 1 350 мг/мл, достигает 1,5 г и у каждого из шести животных этой опытной труппы не развивается опухоль. При опухолях, развитых из клеток,обработанных оптимальной дозой ИЭГ 1 1050