Энзиматический метод разделения рацемической 3-арил-4-аминомасляной кислоты

ЭНЗИМАТИЧЕСКИЙ МЕТОД РАЗДЕЛЕНИЯ РАЦЕМИЧЕСКОЙ 3-АРИЛ-4 АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ Изобретение относится к способу энзиматического разделения рацемической 3-арил-4 аминомасляной кислоты, в котором арильная группа представлена фенилом (фенибут) или парахлорфенилом (баклофен), а сложноэфирная группа представлена насыщенной или ненасыщенной алкильной группой, содержащей от 2 до 8 углеродных атомов. Патентуемый способ получения состоит из следующих этапов: (1) селективная циклизация (S)-энантиомера рацемического эфира 3-арил-4-аминомасляной кислоты в 4(S)-арил-2-пирролидон в водном растворе в присутствии химотрипсина; (2) разделение 4(S)-арил-2-пирролидона и эфира 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты экстракцией после подкисления реакционной смеси до рН 2,0; (3) выделения 4(S)-арил-2 пирролидона из органической фазы и 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты из водной фазы и их последующее превращение в R- и S-стереоизомеры 3-арил-4-аминомасляной кислоты с помощью гидролиза в кислой среде. 014980 Изобретение относится к выделению чистых R- и S-энантиомеров, входящих в рацемическую 3 арил-4-аминомасляную кислоту, методом их энзиматического разделения. Например, этим методом могут быть получены чистые R- и S-энантиомеры рацемической 3-фенил-4-аминомасляной кислоты (фенибут) или 3-пара-хлорфенил-4-аминомасляной кислоты (баклофен). Известно, что только R-энантиомер фенибута улучшает настроение, а также оказывает транквилизирующее действие (Allan et al.,Tetrahedron, 1990, 46, No7, 2511-2524). Аналогично, только R-энантиомер баклофена обладает антиспастическим действием (N. E. Bowery, Trends Pharm. Sci., 1982, 31, 411-413). Оптические антиподы этих препаратов: S-энантиомеры фенибута и баклофена, не только биологически менее активны, но даже антагонистичны своим R-антиподам, и их присутствие в рацемической смеси вынуждает увеличивать дозы препаратов. Таким образом, разработка эффективного способа оптического разделения рацемических 3-арил-4 аминомасляной кислот приведет к существенному улучшению терапевтических свойств фенибута и баклофена. Описание известных методов В литературе описано несколько методов разделения рацемической 3-арил-4-аминомасляной кислоты на R- и S-энантиомеры. Главным образом, они относятся к хроматографическим методам разделения, включающим технологически сложные стадии защиты функциональных групп соответствующей аминокислоты и последующего удаления защитных групп [I. Basova et al., SU 1432051 (1986). N. LangloisR. E. Zeile, Synthesis, 1991, 1023.]. Описано также колоночное хроматографическое разделение непосредственно 3-арил-4-аминомасляной кислоты с использованием дорогой хиральной стационарной фазы [С.Vaccher, J. Chromatogr. 1991, 542, 502-507]. Несколько методов разделения базируются на технологически сложной дробной кристаллизации диастереоизомерных солей с использованием оптически активных оснований: цинхонидина или L-(-)метилбензиламина в качестве метода разделения (М. Soborcinska etal., Pol. J. Chem., 1979, 53, 435-446. A. F. Wildervanck, et al. (US 6051734, 2000). Разделение на оптические антиподы осуществлено также с помощью комбинации химических и энзиматических реакций [R.Chenevret, M. Desjardins, Can. J. Chem., 1994, 72, 2312-2317, R. V. Muralidhar, R. R. Chirumarnilla et al.,Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent, 2001, 66, Nr 3a, 227-232]. R-Энантиомер баклофена был выделен из рацемической смеси селективным микробиологическим разложением S-энантиомера, исключающего возможность его последующей утилизации [W. Levadoux et al., D. US 5483765, 1998]. В целом, все перечисленные методы не приспособлены для масштабного производства препаратов в чистой энантиомерной форме, поскольку игнорируют технологические и особенно экономические аспекты, связанные с доступностью и ценой реагентов и матералов. В этой связи целью настоящего изобретения явилась разработка простого и эффективного метода разделения рацемической 3-арил-4-аминомасляной кислоты на R- и S-энантиомеры. Краткое изложение существа изобретения Предлагаемое изобретение обеспечивает дешевое получение оптически чистых R- и Sэнантиомеров 3-арил-4-аминомасляной кислоты. В результате исследования неожиданно обнаружено,что R- и S-энантиомеры 3-арил-4-аминомасляной кислоты могут быть получены из легкодоступных рацемических эфиров 3-арил-4-аминомасляной кислоты 2 действием на них энзимов из семейства протеаз,катализирующих гидролиз сложноэфирной групп и образование пептидной связи. Селективная циклизация S-энантиомера эфира 3-арил-4-аминомасляной кислоты в присутствии протеазы обеспечивает образование реакционной смеси, состоящей только из двух продуктов 4(S)-арил 2-пирролидона (S)-3 и эфира 3-арил-4-аминомасляной кислоты (R)-2 в R-энантиомерной форме. Нами обнаружено, что эти оба вещества могут быть легко отделены друг от друга с помощью традиционной экстракции и затем превращены в целевую 3(R)-арил-4-аминомасляную кислоту (R)-1 и 3(S)-арил-4 аминомасляную кислоту (S)-1 гидролизом в кислой среде (схема 1). Схема 1 Подробное описание изобретения В соответствии с изобретением процесс энзиматического разделения рацемической смеси с форму-1 014980 лой 2, в которой Аr представлен фенилом или пара-галозамещенным фенилом, R - алкильной группой иобозначает хиральный центр, обеспечивается каталитическим воздействием протеазы в свободной или иммобилизованной форме на рацемическую смесь 2 в водной среде или в смеси вода-органический растворитель. Упомянутые энзимы селективно катализируют превращение только S-энантиомера эфира 2 в 4(S)-арил-2-пирролидон (S)-3, не взаимодействуя при этом с R-энантиомером эфира 2. Нами обнаружено,что полученные энантиомерные продукты 4(S)-арил-2-пирролидон (S)-3 и эфир 3(R)-арил-4 аминомасляной кислоты (R)-2, благодаря различной растворимости в двухфазной системе водаорганический растворитель при низких значениях рН, могут быть эффективно отделены друг от друга экстракцией и затем превращены в энантиомерные (R)-1 и (S)-1 3-арил-4-аминомасляные кислоты с помощью гидролиза в кислой среде. Предпочтительным для проведения реакции энзиматического разделения рацемических эфиров 3 арил-4-аминомасляной кислоты 2 является использование: 1) -химотрипсина в водорастворимом или иммобилизованном состоянии для разделения эфиров 3 арил-4-аминомасляной кислоты; 2) насыщенных и ненасыщенных алифатических углеводородов с количеством углеродных атомов от 2 до 8 для получения заместителя R в эфирной группе соединения 2; 3) водного раствора или смеси вода-органический растворитель с рН в интервале 6,0-7,0 в качестве реакционной смеси; 4) тепературного режима реакции в интервале 20-40 С; 5) перемешивания или встряхивания реакционной смеси от 1 до 72 ч. Полученные таким образом смеси оптически активных 4(S)-арил-2-пирролидона (S)-3 и эфира 3(R)арил-4-аминомасляной кислоты (R)-2 могут быть разделены экстракцией. Для этой цели могут быть использованы любые несмешивающиеся с водой органические растворители (углеводороды, например гексан, бензол, толуол; галогенированные углеводороды, например хлороформ, дихлорметан; сложные эфиры, например этилацетат; кетоны, простые эфиры). Продукты реакции (R)-2 и (S)-3 могут быть изолированы из водной и органической фазы по мере необходимости с помощью таких традиционных процедур,как упаривание или кристаллизация. Нами установлено, что легко растворимые в кислой водной среде эфиры 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты (R)-2 могут быть экстрагированы при нейтральном значении рН 7 с последующим выделением из органической фазы по мере необходимости упариванием или кристаллизацией. Предпочтительными условиями для выделения чистого оптически активного 4(S)-арил-2 пирролидона (S)-3 являются: 1) подкисление реакционной смеси до рН 2,0; 2) экстракция 4(S)-арил-2-пирролидона (S)-3 органическим растворителем предпочтительно этилацетатом, дихлорметаном, толуолом или бензолом с последующим упариванием органической фазы. Для выделения чистого оптически активного эфира 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты (R)-2, после удаления 4(S)-арил-2-пирролидона (S)-3 экстракцией, предпочтительными являются два метода: 1) упаривание водной фазы; 2) нейтрализация водной фазы до рН 7,0, экстракция эфира 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты(R)-2 органическим растворителем предпочтительно этилацетатом, дихлорметаном, толуолом или бензолом с последующим упариванием органической фазы. Следущие примеры иллюстрируют, но не ограничивают экспериментальные возможности данного изобретения. Типовые методы синтеза и энзиматического разделения рацемического эфира 3-арил-4 аминомасляной кислоты 2. Способ 1.A. Хлористый тионил (0,616 мл, 8,4 мМ) добавляют к охлажденному до -16 С смеси 3-арил-4 аминомасляной кислоты 1 (5,5 мМ) в 20 мл соответствующего спирта. Полученную смесь кипятят 4 ч и упаривают при пониженном давлении, получая солянокислую соль 3-арил-4-масляной кислоты 2 (98,099,5% чистота согласно анализу ВЭЖХ).Catalysis, 1983, 22, 145]) добавляют к реакционной смеси, которую перемешивают при 20-40 С в течение 72 ч. Контроль за протеканием реакции, приводящей к образованию 4(S)-арил-2-пирролидона (S)-3, осуществляют с помощью ВЭЖХ. С. По завершении энзиматической реакции реакционную смесь подкисляют 2 н HCl до рН 2,0 и 4(S)-арил-2-пирролидон (S)-3 экстрагируют 320 мл дихлорметана. После упаривания досуха полученных таким образом органической и водной фазы получают в остатке 4(S)-арил-2-пирролидон (S)-3 и эфир 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты, которые превращают в солянокислые соли S- и R-2 014980 энантиомеров (S)-1 и (R)-1 3-арил-4-аминомасляной кислоты в результате их кипячения в 2 н HCl в течение 20 ч и последующего упаривания реакционной смеси. Их оптическая чистота определялась методом хиральной ВЭЖХ. Способ 2. Энзиматическое разделение 3-арил-4-аминомасляной кислоты (1) на стадиях А и В реализовано согласно условиям, приведенным в примере 1. С. По завершении энзиматической реакции 2 реакционную смесь подкисляют 2 н HCl до рН 2,0 и 4(S)-арил-2-пирролидон (S)-3 экстрагируют 320 мл этилацетата и упаривают досуха, получая в остатке 4(S)-арил-2-пирролидон (S)-3. Водную фазу нейтрализуют 5 н NH4OH до рН 7 и эфир 3(R)-арил-4 аминомасляной кислоты (R)-2 экстрагируют 320 мл этилацетата. Полученную таким образом органическую фазу упаривают досуха, получая в остатке эфир 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты (R)-2. Оба энантиомерных продукта превращают в солянокислые соли S- и R-энантиомеров (S)-1 и (R)-1 3-арил-4 аминомасляной кислоты в результате их кипячения в 2 н HCl в течение 20 ч и последующего упаривания реакционной смеси. Их оптическая чистота определялась методом хиральной ВЭЖХ 3. 1 активность -химотрипсина - 65-85 ед/мг в случае иммобилизованного -химотрипсина суспензия катализатора после завершения энзиматической реакции отфильтровывается, обмывается дистиллированной водой и при необходимости используется повторно. 3 мобильная фаза - HCl (рН 1,0); стационарная фаза - CROWNPAK CR(+)5a Эффективность энзиматического разделения и энантиомерный избыток R- и S-энантиомеров 3 арил-4-аминомасляной кислоты, полученных согласно способам 1 и 2, представлена в таблице. Таблица. Условия проведения процесса энзиматического разделения, выходы и энантиомерный избыток А - фосфатный буфер (рН 6,0-7,0); В - фосфатный буфер/диоксан в соотношении 10:1; С - фосфатный буфер/ацетон в соотношении 10:2.выход реакции рассчитывался по уменьшению площади пика эфира 3-арил-4-аминомасляной кислоты 2 на хроматограмме ВЭЖХ. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ разделения рацемической 3-арил-4-аминомасляной кислоты (1) согласно схеме катализированный протеазой, представленной -химотрипсином, папаином или субтилизином,где Ar выбран из группы, состоящей из фенила или р-галозамещенного фенила, и R - из насыщенной или ненасыщенной алкильной группы, содержащей от 2 до 8 углеродных атомов, состоит из следующих этапов:(1) катализируемая протеазой селективная циклизация эфира 3(S)-арил-4-аминомасляной кислоты,входящего в состав рацемического эфира 3-арил-4-аминомасляной кислоты, в 4(S)-арил-2-пирролидинон(2) подкисление реакционной среды до рН 2,0 и разделение 4(S)-арил-2-пирролидона (S)-3 и эфира 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты (R)-2 экстракцией;(3) выделения 4(S)-арил-2-пирролидона (S)-3 из органической фазы и 3(R)-арил-4-аминомасляной кислоты (R)-2 из водной фазы упариванием раствора или кристаллизацией. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что протеаза представлена -химотрипсином. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что -химотрипсин применяется в водорастворимой форме. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что -химотрипсин применяется в нерастворимой иммобилизованной форме. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используется рацемический эфир 3-фенил-4-аминомасляной кислоты. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используется рацемический эфир 3-пара-хлорфенил-4-аминомасляной кислоты. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры использут рацемические эфиры 3-арил-4-аминомасляной кислоты, полученные на основе алифатических насыщенных и ненасыщенных спиртов. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используют рацемический этиловый эфир 3-арил-4-аминомасляной кислоты. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используют рацемический н-пропиловый эфир 3-арил-4-аминомасляной кислоты. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используют рацемический изопропиловый эфир 3-арил-4-аминомасляной кислоты. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используют рацемический н-бутиловый эфир 3-арил-4-аминомасляной кислоты. 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используют рацемический аллиловый эфир 3-арил-4-аминомасляной кислоты. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что для разделения на энантиомеры используют рацемический октиловый эфир 3-арил-4-аминомасляной кислоты. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (1) в качестве растворителя используется вода. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (1) в качестве растворителя используется смесь воды со смешивающимися или несмешивающимися с водой органическими растворителями, которые могут быть алифатическими углеводородами, ароматическими углеводородами, галогеноалканами, эфирами, сложными эфирами, кетонами или их смесями. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция на этапе (1) проводится при температуре от 20 до 40 С. 17. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция на этапе (1) проводится при рН среды от 6 до 7. 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (3) экстракция эфира 3(R)-арил-4 аминомасляной кислоты (R)-2 проводится после нейтрализации водной фазы до рН 7. 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют органические растворители, которые могут быть гексаном, бензолом, толуолом, хлороформом, дихлорметаном,дихлорэтаном, этилацетатом, метилацетатом, диэтиловым эфиром или метил-трет-бутиловым эфиром. 20. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют гексан. 21. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют бензол. 22. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют толуол.-4 014980 23. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют хлороформ. 24. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют дихлорметан. 25. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют дихлорэтан. 26. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют этилацетат. 27. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют метилацетат. 28. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют диэтиловый эфир. 29. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапах (2) и (3) для экстракции используют метилтрет-бутиловый эфир. 30. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (3) полученный эфир 3(R)-арил-4 аминомасляной кислоты (R)-2 с помощью гидролиза в кислой среде превращают в R-энантиомер 3-арил 4-аминомасляной кислоты (R)-1. 31. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (3) полученный 4(S)-арил-2-пирролидон (S)-3 с помощью гидролиза в кислой среде превращают в S-энантиомер 3-арил-4-аминомасляной кислоты (S)-1.