Композиция липосом для введения млекопитающему, в том числе человеку

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки КОМПОЗИЦИЯ ЛИПОСОМ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ МЛЕКОПИТАЮЩЕМУ, В ТОМ ЧИСЛЕ ЧЕЛОВЕКУ Изобретение относится к композиции для введения млекопитающим, в том числе человеку,которая используется для лизиса пораженных, патогенных клеток и включает пустые липосомы,соединенные со структурными белковыми элементами и специфическими связывающими элементами. При введении пациенту липосомы взаимодействуют с мембраной клетки-мишени или с мембраной микроорганизма с образованием выходных отверстий, через которые внутриклеточное содержимое клетки-мишени или микроорганизма высвобождается во внеклеточную среду.(71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец: СЕРРАНО ХИЛ ДАНИЭЛЬ (ES) 016023 Область изобретения Композиция для введения млекопитающему или человеку имеет область своего применения как терапевтический агент, как действующий агент, способный взаимодействовать с деформированной клеткой или патогенным микроорганизмом с целью нарушения осмотического баланса и достижения высвобождения внутриклеточного содержимого во внеклеточную среду. Данная композиция предназначена в качестве противоопухолевого агента для лечения рака, который также может применяться для лечения заболеваний, вызванных клетками, бактериями, вирусами,одноклеточными или многоклеточными организмами, у которых их внешняя оболочка сформирована липидной мембраной, например клеточная мембрана эукариотических клеток, или те, что покрывают вирус СПИДа (ВИЧ). Предпосылки данного изобретения В отношении клеток, апоптоз относится к активному процессу с морфологическими изменениями,при котором клеткам суждено погибнуть в течение определенного промежутка времени; термин некроз относится к произвольному и катастрофическому процессам, которые часто происходят как последствие воздействия токсинов или травматического повреждения, вызванного в клеточной мембране с острой потерей клеточной функции и регуляции, приводя к чрезмерному осмотическому процессу и оканчиваясь гибелью или лизисом клеточной мембраны с тем, что внутриклеточное содержимое высвобождается во внеклеточную среду. Опухоли возникают вследствие наследования накопленных мутаций, происходящих в клетке и передающихся в последующих клеточных делениях. Степень мутации зависит от генетической нестабильности каждой опухоли, и когда опухоль достаточно большая, чтобы быть клинически определяемой, количество мутаций настолько велико, что клетки являются самопроизвольно устойчивыми к действию некоторых химиотерапевтических лекарственных средств. На момент диагностирования опухоли количество устойчивых клеток пропорционально ее размеру и свойственной ей степени мутации. Устойчивость опухолевых клеток к химиотерапии определяется кинетическими параметрами их роста и путем возникновения спонтанных мутаций. Хотя пролиферативные опухолевые клетки подвергаются действию большинства химиотерапевтических агентов, эффект на опухолевые клетки с малой активностью является практически нулевым, и учитывая, что большинство опухолей диагностируются на завершающей стадии их развития, с низкой фракцией роста, они оказываются не очень чувствительными к действию химиотерапевтических лекарственных средств. Целью химиотерапевтических лечебных мероприятий является вызвать повреждение раковых клеток, прежде всего в ДНК, и индуцировать апоптоз. Сделать это необходимо для того, чтобы убедиться,что активное лекарственное средство настолько, насколько возможно достигло своей молекулярной цели внутри пораженной клетки. Любое внешнее или внутреннее условие, которое мешает или препятствует этой цели, может вызвать клеточную устойчивость. Практически все химиотерапевтические лечебные средства, основанные на цитостатических агентах, для которых показано, что они подвергаются воздействию in vitro с помощью некоторого механизма устойчивости, проникают в клетку пассивной диффузией. Следовательно, чем выше внутриклеточная концентрация лекарства, тем больше его количество, которое проникнет в клетку и тем больше его эффективность. Внутриклеточные механизмы устойчивости имеют наибольшее влияние на неудачу химиотерапевтических лечебных мероприятий. Таким образом, снижение концентрации лекарственного средства на уровне его мишени является результатом того, среди прочих причин, что оно вытесняется сквозь клеточную мембрану с помощью транспортных белков, инкапсулирования молекул химиотерапевтического лекарственного средства в цитоплазматические везикулы и различиями в транспорте между ядром и цитоплазмой, а также воздействием на внутриклеточный метаболизм лекарственного средства путем инактивации путем окисления и/или конъюгации с грануляцией (GSH (восстановленная форма глутатиона,и его последующего исключения из клетки с помощью химических насосов. Большинство цитотоксических лекарственных средств, используемых в качестве противоопухолевых, вызывают изменения в структуре ДНК, которые должны вызывать клеточный апоптоз, тем не менее, повышение способности ДНК к восстановлению сводит на нет эффект лекарственных средств. Генp53 должен инициировать клеточный апоптоз, тем не менее, показано, что во многих раковых клетках этот ген является мутированным, или даже исчезает, с тем результатом, что хотя видоизмененные клетки повреждены с помощью действия цитотоксических лекарственных средств, апоптоз не происходит и клетки продолжают делиться. Цитостатики представляют собой противоопухолевые агенты, которые наиболее часто применяются в настоящее время в химиотерапии и действуют путем того, что вызывают разрывы и/или изменения в ДНК раковых клеток, что вызывает апоптоз, и клетка погибает за исключением вышеупомянутых случаев. Их относительно низкая специфичность приводит к побочным эффектам в силу того, что кроме воздействия на раковые клетки они также разрушают клетки слизистой желудка и атакуют клетки иммунной системы, что приводит к тяжелой нейтропении у пациентов и оставляют их уязвимыми по отношению к любой оппортунистической инфекции или болезни, которая может их убить.-1 016023 Новые лекарственные средства, основанные на моноклональных антителах и липосомах, разработали для минимизации побочных эффектов у пациентов. Моноклональные антитела в противоопухолевых лекарственных средствах могут только быть связанными со специфическим предварительно идентифицированным антигеном в раковых клетках, которые необходимо удалить, следовательно, активный ингредиент, связанный с антителом, будет воздействовать только на раковые клетки, которые имеют этот антиген. Учитывая это, побочные эффекты, указанные выше, практически исчезают. Даже более оптимальным является применение пегилированных липосом со специфическими к опухоли моноклональными антителами, с которыми связывается активный ингредиент противоопухолевого лекарственного средства. Липосомы представляют собой везикулы, сделанные из фосфолипидов с составом, очень сходным с клеточной мембраной, что позволяет липосоме сливаться с клеточной мембраной и обеспечивает проникновение активного ингредиента, содержащегося в липосоме, внутрь клетки. С использованием медикаментов, вводимых посредством липосом, активность противоопухолевого агента в крови сохраняется в течение более длительного периода времени, его введение является постепенным, и побочные эффекты у пациентов, которым вводят такое лекарство, проявляются еще реже. Тем не менее и несмотря на улучшенное качество жизни и выживаемость, это химиотерапевтическое решение является дорогим и его результаты являются ограниченными против механизмов устойчивости раковых клеток, в результате чего система общественного здравоохранения использует их редко, и хотя в некоторых случаях современная химиотерапия является эффективной, например, при детской лейкемии,большинство пациентов с метастазом и солидными опухолями умирали. Следовательно, существует необходимость разработки нового типа химиотерапии, которая избегает механизма устойчивости к современным противоопухолевым лекарственным средствам, разработка которого будет означать спасение для миллионов людей во всем мире. Объект изобретения Одним объектом изобретения является предложение композиции для введения млекопитающему или человеку с целью борьбы с заболеванием, вызванным видоизмененными клетками, бактериями, вирусами или другими организмами, чья наружная оболочка представляет липидную мембрану. Другим объектом изобретения является лечение рака с нулевым профилем токсичности и механизмом действия, существенно отличающимся от того, что применяется в общепринятых лечебных мероприятиях. Краткое изложение изобретения Липосомы также использовались в качестве структур без классического активного ингредиента с различными активностями (антигипертензивная, противовоспалительная и т.д.), хотя их применение в качестве пустых липосом без активного ингредиента против видоизмененных клеток, особенно раковых клеток, не известно. До данного изобретения совместное использование пегилированных липосом и моноклональных антител в отсутствие противоопухолевых лекарственных средств никогда не рассматривалось для применения в лечении рака и заболеваний, вызванных вирусами, бактериями или другими агентами, и особенно для того, чтобы вызывать сброс внутриклеточного содержимого видоизмененной клетки или микроорганизма во внеклеточную среду, ее лизис и гибель. Говоря в общем, изобретение включает композиции и способы лечения видоизмененных клеток. Более специфически, изобретение включает композиции без химиотерапевтического содержимого, хотя изготовленные из липосом, моноклональных антител и структурных белков, введение которых человеку или животному с повреждениями клеток вызывает нарушение целостности клетки, сброс внутриклеточного содержимого поврежденной клетки во внеклеточную среду и их лизис. Таким путем избегают механизмов клеточной устойчивости. Данное изобретение также обеспечивает способ введения композиции человеку или животному,страдающему от клеточного заболевания, такого как рак - включая карциномы, лейкемии, миеломы, нейробластомы, саркомы, а также раки легкого, мозга, яичника, толстой кишки или груди, но не ограничиваясь указанным. В общем, данный способ состоит из введения индивидууму такого количества композиции, которое представляет эффективное количество, способное инициировать литический процесс в плазматической мембране, видоизмененных клетках и, в соответствующем случае, патогенных микроорганизмов. Эффективные количества определяются после постановки медицинского диагноза. Примеры композиций, которые вызывают разрыв клетки, включают моноклональные антитела,специфичные к заболеваниям, которые лечат, связанные с липосомами или везикулами, которые включают структурные белки, расположенные на их внешних поверхностях, разграничивая отверстия значительного размера, которые при взаимодействии липосом с поврежденной клеткой остаются открытыми для того, чтобы вызывать плазматический сброс во внеклеточную среду, а также лизис и гибель поврежденной клетки. Согласно данному изобретению моноклональные антитела могут быть замещены спиртами или гликопротеинами, которые также являются специфическими к клетке или микроорганизму, который необходимо разрушить. Следовательно, композиция обеспечивается для введения млекопитающему или человеку с целью борьбы с болезнью, вызванной видоизмененными клетками, бактериями, вирусами или другими орга-2 016023 низмами, чья наружная оболочка представляет собой липидную мембрану. Также обеспечивается лечение заболевания, имеющее нулевую токсичность и механизм действия которого существенно отличается от применимого в традиционных способах лечения против поврежденных клеток. Механизм действия предложенного лечения, не имеющего никаких химических терапевтических агентов, избегает механизмов устойчивости, которые проявляются клетками-мишенями, например, раковыми клетками, в отличие от традиционных противоопухолевых агентов. Композицию для введения млекопитающему или человеку получают, известным способом, используя липосомы, структурные белки и специфические связывающие элементы. Введение композиции млекопитающему или человеку, пораженному заболеванием, инициирует литический процесс в клетках-мишенях или микроорганизмах, которые должны быть разрушены, и высвобождение внутриклеточного содержимого во внеклеточную среду через большие отверстия, созданные в начальную фазу в липидной мембране липосомы белком и существенно поддерживаемые в качестве дренажных отверстий, после взаимодействия липидной мембраны с плазматической мембраной клетокмишеней или микроорганизмов, на которые направлено действие. Более специфически, данное изобретение обеспечивает композицию для лечения рака, которая включает липосому, которая является преимущественно однослойной, на структуре которой определяют большое отверстие, с интеграцией со структурным белком, и ее мембрана включает антитела, специфические для поврежденной клетки, которую необходимо обработать, так что связывание везикул с соответствующими рецепторами опухолевых клеток будет позволять слияние мембран везикул и специфических клеток. Как только происходит связывание липосом с клетками-мишенями и слияние их мембран,отверстия, присутствующие на липосомах, формируют дренажные отверстия, которые соединяют цитоплазму с внеклеточной средой; таким образом, модифицируется осмотическое давление и инициируется литический процесс, приводящий к клеточной смерти. Согласно данному изобретению композиция, разработанная для введения млекопитающему или человеку, для разрушения видоизмененной или поврежденной клетки или патогенного микроорганизма,включает пустую однослойную липосому, чья структура представляет отверстие, разграниченное структурным белковым элементом и чья мембрана включает специфические связывающие элементы, например, выбранные из моноклональных антител, по необходимости, зависящие от клетки, которую необходимо разрушить, так что при введении пациенту композиция представляет собой эффективный действующий агент, способный к взаимодействию с мембраной клетки-мишени или мембраной микроорганизма, и при слиянии с ней, поддерживая отверстие в липосоме до значительной степени с целью нарушения осмотического баланса клетки и в дополнении обеспечивая то, что отверстие используется в данный момент в качестве дренажного отверстия для высвобождения внутриклеточного содержимого во внеклеточную среду. По сути, пустая однослойная липосома, присутствующая в композиции, обеспечивает специфическую липидную композицию, адаптированную в отношении клетки-мишени или микроорганизма, который необходимо разрушить. Согласно данному изобретению талин является предпочтительным в качестве липосомного структурного модифицирующего элемента для применения указанной композиции. Средства лечения, основанные на применении предложенной композиции, используют, как и традиционные средства лечения, моноклональные антитела или другие специфические связывающие элементы и липосомы, несмотря на отсутствие затруднений, связанных с активными ингредиентами, включенными в липосомы, будучи безвредными для организма, так как они содержат только фосфолипиды и белки. При неопластическом заболевании летальный эффект композиции на опухолевые клетки основан на отверстии и поддержании дренажного отверстия в клеточной мембране, которые освобождают опухолевые клетки от их содержимого после взаимодействия липосомы, связанной со структурным белком,преимущественно талином, который создает большое отверстие в липосоме. Размер отверстия может быть предварительно выбран и является, кроме того, постоянным в липосоме; следовательно, при слиянии липосом и мембран поврежденных клеток создаются отверстия по сути идентичного размера и поддерживаются в клеточной мембране. Также связывание множества липосом с мембраной опухолевой клетки создает соответствующие отверстия, которые будут вызывать немедленный лизис клеток и их смерть. В свете вышесказанного основные преимущества данной композиции по сравнению с противоопухолевыми лекарственными средствами, используемыми в настоящее время, для введения млекопитающему или человеку для лечения видоизмененных клеток, становятся очевидными. Эти преимущества включают высокую специфичность, целью которой является уменьшение или устранение побочных эффектов; нулевая устойчивость, проявляемая мембранами видоизмененных клеток или мембранами микроорганизмов к предложенному липосомному взаимодействию в сравнении с химиотерапевтическими композициями, используемыми до настоящего момента; ее полная безвредность, в силу отсутствия элементов токсической или радиоактивной природы; ее высокая селективность с использованием специфичных связывающих элементов, особенно применение моноклональных антител для лечения рака, и ее высокая летальная сила при соединении липосомных везикул с мембранами патогенных микроорганиз-3 016023 мов или мембранами клеток-мишеней. Специфические связывающие элементы: моноклональные антитела, гликопротеины или спирты,встроенные в мембрану липосом, чье действие состоит в том, чтобы направлять их по отношению к мембранам микроорганизма или клетки-мишени, должны быть выбраны достаточно селективно для того,чтобы вызвать минимальные побочные эффекты. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция липосом для введения млекопитающему, в том числе человеку, включающая по меньшей мере одну пустую липосому, способную сливаться с клеточной мембраной или с мембраной микроорганизма-мишени, избирательно присоединяясь к ним с помощью специфических якорных элементов, которые образуют достаточно стабильную связь с антигенами или другими элементами, присутствующими в клеточной мембране или мембране микроорганизма-мишени для того, чтобы сделать возможным слияние липосомы с мембраной и образовать в последней поры или отверстия с помощью порообразующего белкового элемента, связанного с липосомой, которые являются достаточно большими и стабильными для того, чтобы нарушить осмотический баланс клетки-мишени или микроорганизма и вызвать их лизис и гибель. 2. Композиция по п.1, в которой липосома является однослойной и имеет специфический липидный состав, обеспечивающий ее слияние с клеткой или микроорганизмом, которые необходимо лизировать. 3. Композиция по п.1, в которой порообразующим белковым элементом является талин. 4. Применение композиции по пп.1-3 для лечения заболеваний, ассоциированных с видоизмененными клетками или патогенными микроорганизмами. 5. Применение композиции по пп.1-3 для лечения ракового заболевания. 6. Применение композиции по пп.1-3 для лечения вирусного заболевания.