Вакцинная композиция на основе ганглиозидов для подкожного введения

008905 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к вакцинным композициям для подкожного введения, содержащим ганглиозиды, пригодные для иммунологического лечения аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний и опухолей, без какого-либо дополнительного адъюванта. Описание предшествующего уровня техники Давно уже известно намерение использовать иммунологическое лечение для аутоиммунных заболеваний и опухолей, например, в патенте США 4965198 описывается применение ганглиозида GM2 для профилактики и лечения таких заболеваний. В заявке на патент ЕР-А-661061 и в патенте США 6149921 описаны вакцинные композиции для стимуляции или повышения ответной выработки антител против ганглиозида, который состоит из иммуногена и иммунологического адъюванта. Описанными иммуногенами являются VSSP (протеолипосомы очень малого размера), полученные в результате ассоциации ганглиозидов N-ацетилGМ 3 и N-гликолилGМ 3, в последующем обозначаемые как (N-AcGM3) и (N-GcGM3), с другим белковым комплексом наружной мембраны (ОМР) из Neisseriameningitidis. Такие иммуногены в последующем будут обозначаться как N-AcGM3/VSSP и N-GcGM3/VSSP; они имеют очень маленький размер и практически не видны под электронным микроскопом, растворимы в воде и обладают повышенной флотационной активностью. Для вакцинных композиций, описанных в ЕР-А-661061 и патенте США 6149921, необходимо использование адъюванта, такого как очень хорошо известный неполный адъювант Фрейнда. В заявке на патент WO-A-02145746 описаны вакцинные композиции, содержащие (А) один или более антигенов с низкой иммуногенностью; (В) VSSP с включенными ганглиозидами, в основном NAcGM3/VSSP и N-GcGM3/VSSP, и (С) в некоторых случаях один или более адъювантов. В статье Carr A. et al., опубликованной в журнале Melanoma Research, 2001, Vol. 11, pp. 219-227,описана противоопухолевая активность вакцины, содержащей ганглиозид N-AcGM3, против меланомы В 16, поддерживаемой у мышей. В данной статье также оценивалось влияние присутствия иммунологического адъюванта, особенно полного адъюванта Фрейнда или неполного адъюванта Фрейнда, такого как Montanide ISA 51. Вакцины вводили внутримышечно, и было сделано заключение, что у мышей, иммунизированных NAcGM3/VSSP с любым из адъювантов, Фрейнда или Montanide ISA 51, имела место ответная выработкаIgM и анти-N-AcGM3 IgG на 8 неделе (табл. 1). В отличие от этого, вакцина с N-AcGM3/VSSP без какого-либо адъюванта не вызывала ответной иммуногенной реакции (стр. 223, правая колонка). Следовательно, в данной области установлено, что в состав вакцин, содержащих VSSP, конъюгированные с ганглиозидами, следует включать адъюванты, в основном адъювант Фрейнда (полный или неполный) или Montanide ISA 51. Однако хорошо известно, что, когда их вводят парентерально, такие адъюванты, в частности полный адъювант Фрейнда, вызывают некоторые нежелательные побочные эффекты, такие как хроническое воспаление в месте инъекции, возможная гранулема и асептический абсцесс или язвенный некроз в тканях. Montanide ISA 51 является менее раздражающим, но также может вызвать некоторые воспалительные реакции. Было бы желательно, с точки зрения их применений для иммунологического лечения аутоиммунных, инфекционных и злокачественных заболеваний, иметь новые вакцинные композиции на основе ганглиозидов, которые вызывали бы меньшее раздражение в месте инъекции и применение которых было бы более легким и удобным для пациентов. Авторы настоящего изобретения установили, что вакцины на основе ганглиозидов с VSSP при подкожном введении можно использовать без каких-либо адъювантов, при сохранении соответствующих иммунологических свойств. Предметом настоящего изобретения являются новые вакцинные композиции, включенные в VSSP,предпочтительно N-AcGM3/VSSP и N-GcGM3/VSSP, которые не содержат какого-либо иммунологического адъюванта и вводятся подкожно. Также предметом настоящего изобретения является способ лечения пациента, нуждающегося в усилении его иммунологического ответа, включающий в себя подкожное введение вакцинных композиций с ганглиозидами, предпочтительно N-AcGM3/VSSP и N-GcGM3/VSSP, не содержащих какого-либо иммунологического адъюванта. Также предметом настоящего изобретения являются вакцинные композиции с N-AcGM3/VSSP и/или N-GcGM3/VSSP, не содержащие других антигенных компонентов, кроме ганглиозидов или какихлибо других иммунологических адъювантов, и которые вводят подкожно. Подробное описание изобретения Целевые вакцинные композиции согласно изобретению содержат раствор или дисперсию в воде одного или более ганглиозидов и его включение в ОМР N. meningitidis (VSSP), и они способны стимулировать иммунологический ответ при подкожном введении без дополнительного иммунологического адъюванта.VSSP представляют собой высокостабильные ганглиозидные гидрофобные ассоциации с белковым-1 008905 комплексом наружной мембраны Neisseria meningitidis, без необходимости в ковалентных связях. Такие системы белки-ганглиозиды подробно описаны в патентах ЕР-А-661061 и US-A-6149921, а также в других публикациях, например Estvez et al., Vaccine, 1999; Vol. 18(1-2): pp. 190-197. В этих документах также описан способ их получения. Среди ганглиозидов, включенных в VSSP, предпочтение отдается N-AcGM3 и N-GcGM3, где NAcGM3 является особенно предпочтительным. Подробное описание иммуногенности конъюгированных ганглиозидов, а также их применения в качестве противоопухолевых средств и стимуляторов приобретенного иммунитета можно найти в вышеуказанных документах и в обзоре Bitton R. et al., Oncology Reports (2002), Vol. 9, pp. 267-276, и в недавних сообщениях и материалах научных встреч, например 6-ого латиноамериканского конгресса по иммунологии, который проходил в Гаване 9 декабря 2002 года, сообщение Saurez G. et al. "Phase I clinicaltrial of the ganglioside cancer Vaccine N-AcetilGM3/VSSP Montanide ISA 51 in advanced breast cancer patients". Вакцинные композиции, не содержащие других антигенных компонентов, кроме ганглиозидов, являются предпочтительным предметом изобретения, где особенно предпочтительными являются содержащие уникальный иммуногенный компонент N-AcGM3 (N-AcGM3/VSSP) и/или N-GCGM3 (NGcGM3/VSSP), где особенно предпочтительными являются содержащие только N-AcGM3/VSSP. Целевые вакцинные композиции согласно изобретению представляют собой растворы или дисперсии в воде VSSP, которые в некоторых случаях могут содержать нетоксичные, не вызывающие раздражения, совместимые с водой растворители, обычно используемые в фармацевтических препаратах для парентерального введения, например это может быть полиэтиленгликоль. Концентрация конъюгированных гликозидов в растворах и в дисперсиях в воде не является решающей и может находиться в пределах 0,03-3% (мас./об.), предпочтительно от 0,04 до 2,5% (мас./об.). Диапазон доз для п/к введения, используемых для данных вакцин согласно изобретению, составляет в пределах от 50 мкг до 2,4 мг, предпочтительно от 200 мкг до 2 мг. Основное свойство вакцинных композиций, предмета настоящего изобретения, заключается в том,что они предназначены для подкожного введения без какого-либо дополнительного иммунологического адъюванта. Иммунологические адъюванты часто используются в вакцинных композициях. Такие адъюванты способствуют проявлению иммуногенного действия различными путями созданием депо антигена в месте инъекции с освобождением или высвобождением антигена в систему кровообращения; обеспечением того, чтобы антиген достиг селезенки и лимфатических узлов посредством образования масляных микрокапель, легко захватываемых макрофагами; прямым или опосредованным активированием клеток, участвующих в иммунном ответе. Наиболее известными иммунологическими адъювантами являются полный или неполный адъювант Фрейнда, Montanide ISA, адъюванты Ribi, Hunter's TiterMax, соли алюминия, адъювант Gerbu, QS-21 и т.д. Совершенно неожиданно авторы настоящего изобретения установили, что, когда вакцины на основе ганглиозидов/VSSP вводят подкожно, то можно полностью исключить адъюванты. Это дает возможность, в отличие от предшествующего уровня, почти полностью исключить необходимость во внутримышечном введении. Следовательно, настоящее изобретение имеет несомненные преимущества практически во всех случаях, когда это касается проблем с местным воспалением, возникающих в результате применения адъювантов. Этот способ вакцинации с ганглиозидами является простым, эффективным и вызывающим меньшее раздражающее действие у пациентов. В последующих примерах включены сравнительные экспериментальные подробности, позволяющие продемонстрировать иммунологическую эффективность вакцинной композиции, не содержащей иммунологических адъювантов. Пример 1. Используя способ, описанный в примере 3 патента США 6149921, готовили водную вакцинную композицию (Трис-HCl буфер), содержащую 2,4 мг/мл N-AcGM3/VSSP. К аликвоте такой иммуногенной композиции добавляли такой же объем адъюванта Montanide ISA 51 (Seppic Paris, Франция). Одновременно к другой аликвоте добавляли такой же объем Трис-HCl буфера. Получали две вакцинные композиции: А: водный раствор, содержащий 1,2 мг/мл N-AcGM3/VSSP. В: эмульсию вода/масло, содержащую 1,2 мг/мл N-GcGM3/VSSP. Отбирали 50 мышей-самок C57BL/6 с массой тела в пределах 18-20 г, и формировали 5 опытных групп по 10 животных в каждой. Животным группы 1 (контроль) вводили внутримышечно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Животным группы 2 вводили внутримышечно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл вакцинной композиции В(120 мкг N-AcGM3/VSSP). Животным группы 3 (контроль) вводили подкожно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл PBS. Животным группы 4 вводили подкожно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл вакцинной композиции В (120 мкг де N-GcGM3/VSSP). Животным группы 5 вводили подкожно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл вакцинной композиции А (120 мкг де N-AcGM3/VSSP). Мышам всех групп прививали на 63 день 5103 клеток меланомы MB16F10 подкожно (0,2 мл). С 0-го дня за мышами проводили индивидуальное наблюдение и дважды в неделю определяли следующие параметры: объем опухоли, выживаемость и время прогрессирования. Были получены следующие результаты. Объем опухоли На фиг. 1 представлена кинетика роста опухолей у животных каждой опытной группы. Использовали тест Манн-Уитни с U-критерием (двухсторонний) для анализа статистической значимости в парных группах значений объема опухоли у каждого животного на 33 день после прививки опухоли. Данный метод статистической обработки особенно подходит для оценки результатов опытов данного типа, где имеется естественная дисперсия данных, относящихся к биологическому событию. Значение р представляет собой вероятность, связанную с практическим значением, рассчитанным для пробы, и позволяет определить близость значения альфа (достоверность), рассчитанного по графику,и реальных данных, подтверждающих исходную гипотезу (р 0,05). Результаты представлены на фиг. 1 и в табл. 1. Таблица 1 Влияние вакцинации на объем опухолей а - значение р, полученное в результате сравнения данных по группе 2 против данных по группе 1b - значение р, полученное в результате сравнения данных по группе 4 против данных по группе 3 с - значение р, полученное в результате сравнения данных по группе 5 против данных по группе 3 Данные, представленные на фиг. 1 и в табл. 1, свидетельствуют о том, что у мышей, вакцинированных целевой композицией согласно изобретению, имело место достоверное уменьшение объема опухолей по сравнению с животными других опытных и соответствующих контрольных групп. Выживаемость С помощью данного параметра оценивают способность вакцинации увеличивать продолжительность жизни у иммунизированных мышей с летальной опухолью, такой как МВ 16. Данный параметр выражают в сутках по сравнению с выживаемостью необработанных животных. Для определения статистической значимости использовали тест Log-рангов. Полученные данные представлены на фиг. 2 и в табл. 2. В табл. 2 выражение сравниваемая группаX означает группу, которую сравнивают с каждой колонкой. Таблица 2 Статистические данные по выживаемости, полученные с использованием теста Log-рангов-3 008905 Полученные результаты показали, что у мышей, входящих в группу 5, вакцинированных подкожно целевой композицией согласно изобретению, имела место самая высокая выживаемость после прививки опухоли. Время прогрессирования Время прогрессирования представляет параметр, с помощью которого оценивают период, необходимый для определения опухолей у каждого животного отдельно, размеры которых определяли с момента прививки. Данные представлены в табл. 3. Таблица 3 Статистические данные по времени прогрессирования, полученные с использованием теста Log-рангов Для мышей, у которых не развивалась какая-либо опухоль на время окончания опыта, за время прогрессирования принимали 60 суток. Удлинение времени прогрессирования объективно является параметром, очень желаемым для получения достоверных изменений в действии вакцины против опухолей, и согласно результатам, представленным в табл. 3, у животных группы 5, подкожно вакцинированных целевой композицией с VSSP согласно изобретению, были, соответственно, более положительные результаты. Регрессия опухолей В группах 4 и 5, соответствующих подкожной вакцинации с адъювантом и без него, у животных наблюдали регрессию опухолей. У животного в группе 4 опухоль определялась на 19 сутки после прививки, практически не увеличиваясь до 35 суток. При пальпации у мыши в группе 5 наличие опухоли определяли на 26 сутки после прививки, и были получены отрицательные результаты на 29 сутки. Оценка в целом Результаты опытов показывали, что целевая вакцинная композиция согласно изобретению повышала время выживания и время прогрессирования, одновременно достоверно снижая скорость роста опухолей по сравнению с животными контрольной группы, обработанными PBS. С другой стороны, введение вакцинной композиции, содержащей адъювант Montanide ISA 51, оказывало защитное действие только при внутримышечном введении, показывая полное отсутствие эффективности при подкожном введении. В заключении подкожная вакцинация целевыми вакцинными композициями согласно изобретению показывала более высокие результаты по сравнению с результатами, полученными при внутримышечном введении вакцинных композиций, содержащих адъювант типа Montanide. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлено графическое изображение роста объема опухолей у животных 5 групп, подвергшихся обработке различными вакцинами и прививке клеток злокачественных опухолей. На фиг. 2 представлен график, позволяющий оценить параметр выживаемости у опытных животных 5 групп. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вакцинная композиция, содержащая раствор или водную дисперсию одного или более ганглиозидов, заключенных в протеолипосомы очень малого размера (VSSP), отличающаяся тем, что указанные ганглиозиды выбраны из N-AcGM3 и N-GcGM3 и способны стимулировать иммунный ответ при подкожном введении без какого-либо дополнительного иммунологического адъюванта. 2. Вакцинная композиция по п.1, в которой ганглиозид, включенный в VSSP, представляет собой NAcGM3. 3. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве уникальных иммунологических компонентов она содержит N-AcGM3/VSSP и/или N-GcGM3/VSSP. 4. Вакцинная композиция по п.3, которая содержит в качестве уникального иммунологического-4 008905 компонента N-AcGM3/VSSP. 5. Применение вакцинной композиции по пп.1-4 для производства фармацевтической композиции для подкожного введения, используемого для лечения пациентов, нуждающихся в усилении их иммунологического ответа.