Аналог фрагмента эпидермального фактора роста, его конъюгат с доксорубицином и фармацевтическая композиция на основе конъюгата

005865 Область техники Изобретение относится к области химии природных соединений, фармакологии и медицине и может быть использовано в медицине для лечения онкологических больных. Предшествующий уровень техники Среди главных причин, существенно ограничивающих эффективность противоопухолевой химиотерапии, можно выделить первичную и приобретенную резистентность опухолевых клеток к лекарственным препаратам, а также низкую избирательность их действия. Повышение селективности химиопрепаратов может быть достигнуто посредством их направленного транспорта к клеткам-мишеням с помощью различных белковых векторов. При этом химиопрепараты попадают внутрь клетки в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза конъюгата, представляющего собой ковалентно связанные векторный белок и химиопрепарат. Избирательность действия конъюгатов достигается либо за счет наличия на поверхности опухолевых клеток специфических рецепторов, узнаваемых векторным белком или антителом, либо за счет значительно более высокого уровня рецепторов векторного белка на поверхности опухолевых клеток по сравнению с нормальными. Возможность эффективного использования эпидермального фактора роста (ЭФР) в качестве векторной молекулы обусловлена его высокой стабильностью, доступностью в виде рекомбинантного белка, а также значительно более высоким содержанием ЭФРрецепторов на поверхности опухолевых клеток по сравнению с нормальными. Известно большое число работ и патентов, посвященных различным конъюгатам на основе ЭФР с доксорубицином (ДР) и другими противоопухолевыми препаратами, способам их получения, фармацевтических композиций на их основе [пат. США 5824805, 5349066, 5087616, 5393737, 5505931, 5622929, 5122368, 5776458 и др.]. Доксорубицин (ДР) - известный противоопухолевый антибиотик - несмотря на широкое клиническое применение, имеет ряд существенных недостатков, к числу которых относятся высокая кардиотоксичность и быстро развивающаяся резистентность опухолевых клеток при повторных внутривенных инъекциях антибиотика. Применение ДР в составе конъюгата могло бы значительно улучшить его терапевтические свойства. Особый интерес представляет использование коротких пептидных фрагментов ЭФР в качестве векторных молекул для доставки ДР и других противоопухолевых лекарств в опухолевые клетки-мишени. Поскольку технология их получения относительно проста, экономична и не предполагает использования биологического сырья для их производства, конъюгаты, созданные на их основе, легче поддаются стандартизации. Известно использование для химиотерапии рака смесей (фармацевтических композиций) ДР (и других противоопухолевых средств) и различных пептидных фрагментов ЭФР [пат. США 4863902]. Усиление противоопухолевого действия патентуемых препаратов авторы объясняют более высокой чувствительностью опухолевых клеток к действию ДР на фоне стимуляции клеточной пролиферации, опосредованной ЭФР и его активными фрагментами. Однако нековалентная иммобилизация ДР с пептидными фрагментами ЭФР и ЭФР не гарантирует его целенаправленную доставку к опухолевым клеткаммишеням и повышает тем самым неспецифическую токсичность препарата. Известно также использование в терапии рака биологически активного циклического полипептида,имеющего аминокислотную последовательность, аналогичную последовательности с 32 по 48 аминокислоту ЭФР [пат. США 5183805]. В патенте указано, что пептид может быть химически конъюгирован с химиотерапевтическими агентами, такими как ДР, однако, конъюгаты в формуле изобретения не заявлены, нет описания их получения, не указаны их биологические свойства. Известен также полипептид - фрагмент эпидермального фактора роста с 21 по 31 аминокислоту формулы(I) способный эффективно связываться с рецептором ЭФР и вызывать пролиферацию клеток; его конъюгат с ДР в соотношении 1:1, в котором конъюгированные части соединены азометиновой кислотолабильной связью с помощью глутарового альдегида, в качестве сшивающего агента [Российский онкологический журнал,3, 2001 г., стр. 33-37, Увеличение цитотоксической активности доксорубицина при его транспорте в опухолевые клетки с помощью белковых векторов]. В качестве фармацевтических композиций могут быть указаны любые композиции, описанные в пат. США 5349066, 5087616,5122368, содержащие конъюгаты ДР с ЭФР в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель. Раскрытие изобретения Изобретательской задачей является расширение арсенала средств данного назначения, а также увеличение эффективности их действия. Задача решается тем, что предлагается биологически активный полипептид, представляющий собой аналог фрагмента эпидермального фактора роста с 21 по 31 аминокислоту, способный связываться с рецептором эпидермального фактора роста, вызывать пролиферацию клеток и выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. Биологически активный полипептид (далее полипептид) имеет структуру(II) В отличие от полипептида-прототипа, в патентуемом полипептиде аминокислота Lys, находящаяся в активном центре рецепторсвязывающего фрагмента человеческого ЭФР, заменена на Ser, одну из ами-1 005865 нокислот, формирующих центр связывания в мышином ЭФР. Неожиданным образом было установлено,что замена Lys на Ser позволяет избежать нежелательного конъюгирования по -аминогруппам лизина в активном центре рецепторсвязывающего фрагмента, что, в свою очередь, позволяет избежать ингибирования связывания полипептида с рецептором ЭФР. Эффективность нового полипептида показана на основе известного антибиотика доксорубицина,однако, могут быть использованы также другие противопухолевые антибиотики, такие как винкристин,цисплатин, дауномицин, метотрексат, а также другие известные противоопухолевые средства: токсины,такие как дифтерийный или рицин, циклофосфамид и др. Другим объектом изобретения является также конъюгат полипептида с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к полипептиду через кислотолабильную азометиновую связь, а в качестве полипептида он содержит полипептид формулы MYIEALDSYAC. Предложенный конъюгат обладает избирательным действием в отношении раковых опухолей и способен значительно снижать резистентность опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. В качестве сшивающего агента по аминогруппам полипептида и доксорубицина может быть использован глутаровый альдегид, а также другие известные бифункциональные агенты. В результате, получают конъюгат с кислотолабильной химической связью. Предметом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием и содержащая конъюгат предлагаемого полдипептида с доксорубицином в эффективном количестве (0,05-0,1%) и фармацевтические носители, приемлемые для внутривенного введения. При этом носителем может быть физиологический раствор, фосфатно-солевой раствор, обезболивающие препараты. Композиция также может содержать дополнительно противомикробные, противовирусные и противопаразитарные средства, а также другие препараты, применяемые для лечения онкологических больных, в количестве не более 50 вес.% от общего веса композиции. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлены сравнительные данные о влиянии предлагаемого и известного полипептида формулы (I) на пролифирацию клеток фибропластов мыши линии NIH 3 Т 3. На фиг. 2 представлены данные о замедлении времени появления опухолей и скорости их роста под воздействием композиций, содержащих ДР, на модели перевиваемых опухолей мышей. Подробное описание изобретения Ниже приведены примеры, иллюстрирующие предлагаемое изобретение и доказывающие возможность использования рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста, предлагаемого конъюгата и композиции на его основе по указанному назначению. Пример 1. Получение полипептида. Полипептид был получен методом твердофазной пептидной химии с использованием Fmoc стратегии синтеза. В качестве полимерного носителя была выбрана смола Wang-resin. На каждом шаге пептидной конденсации карбоксильную группу Fmoc-аминокислот активировали превращением в гидроксибензотриазоловый эфир с помощью HOBt и N,N-диизопропилкарбодиимида, Fmoc-аминокислоты, HoBt иN,N-диизопропилкарбодиимид вводили в реакцию в 10-кратных молярных избытках по отношению к аминогруппам полимера. За ходом реакции следили по изменению окраски бромфенолового синего, который добавляли в реактор в виде раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1/1000 (мол.) к количеству аминогрупп. Реакция длилась 1,5-2 ч. После завершения конденсации смолу промывали 4 раза диметилформамидом (ДМФ) и обрабатывали 50% раствором пиперидина в ДМФ. Отщепление полипептида от полимерного носителя проводили смесью трифторуксусной кислоты - 95%; воды - 2,5%; 1,2-этандитиола - 2,5%. После того как смола была отфильтрована, пептид высаживали из раствора диэтиловым эфиром. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали в вакууме и анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФВЭЖХ) на колонке Phenomenex Luna C18 2503. Градиентное элюирование полипептида с колонки проводили в системе растворителей ацетонитрил-0,1% трифторуксусная кислота/вода. Полупрепаративная ОФ ВЭЖХ проводилась в тех же условиях на колонке Nucleosil С 18 2508. Чистота полипептида после хроматографического разделения составила 96%. Полипептид был охарактеризован методом масс-спектрометрии (молекулярный ион - 1265). Структура полипептида приведена в табл. 1. Таблица 1 Структура известного и предлагаемого полипептида-2 005865 Пример 2. Получение конъюгата полипептида с ДР. Полипептид растворяли в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7) ( концентрация 1 мг/мл) и добавляли доксорубицин, предварительно растворенный в 5 мл дистиллированной воды (рН=5,5) (концентрация 1,2 мг/мл). Синтез конъюгата осуществляли по схеме 1. Схема 1 К реакционной смеси при перемешивании добавляли по каплям глутаровый альдегид (ГА) в 0,05 М фосфатном буфере(рН=7,2) (концентрация ГА 0,5 мг/мл). Объем добавленного раствора ГА составил 3 мл. После добавления ГА смесь инкубировали в течение 1 ч при 50 С. Синтезированный конъюгат отделяли от исходных веществ на колонке PD-10 Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden). Конъюгат анализировали методом ОФ ВЭЖХ на колонке Nucleosil С 18 2504.6. Градиентное элюирование конъюгата с колонки проводили в системе растворителей ацетонитрил-0,1% трифторуксусная кислота/вода. Концентрацию полипептида в конъюгате определяли спектрофотометрически (длина волны =280 нм). Содержание ДР в конъюгате определяли спектрофотометрически при длине волны =495 нм. Молярное соотношение полипептид:ДР в конъюгате составляет 1:1. Таким образом, разработана методика химического конъюгирования предлагаемого полипептида и доксорубицина с помощью глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. Получен и охарактеризован конъюгат полипептид-ДР, в котором соотношение конъюгированных частей составляет 1:1. Пример 3. Биологическая активность полипептида. Определение пролиферативной активности полипептида проводили на клетках фибробластов мыши линии NIH 3 Т 3. Интенсивность биосинтеза ДНК определяли по включению 3 Н-тимидина в кислоторастворимую фракцию клеток. Клетки линии фибробластов мыши линии NIH 3 Т 3 культивировали в пластиковых флаконах(Costar) в среде RPMI (Sigma), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% СO2 при 37 С. Пролиферацию синхронизированных фибробластов линии NIH 3 Т 3 индуцировали, добавляя к суспензии клеток полипептид в различных концентрациях (0,1-1000 нг/мл). Фибробласты культивировали в 96-луночных планшетах в 200 мкл среды по 200-800 тысяч/лунку в полной среде. 3H-тимидин (1 мкКи/лунку, 40 мКи/моль) вносили за 2 ч до окончания инкубации. Радиоактивность клеток измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике (Rackbeta, LKB) с использованием сцинтилляционной жидкости ЖС-8 на основе толуола. Интенсивность биосинтеза ДНК выражали в виде индекса стимуляции (отношение стимулированных клеток к контрольным) по формуле I=N/Nox100%, где I - индекс стимуляции, N - число стимулированных ЭФР клеток, No - число контрольных клеток. На фиг. 1 представлены сравнительные данные о влиянии предлагаемого полипептида и известного полипептида формулы I (ЭФРфр) на пролиферацию клеток фибробластов мыши линии NIH 3 Т 3. Эти данные демонстрируют более выраженный дозозависимый пролиферативный эффект полипептида в отношении данной линии клеток, чем у известного полипептида, что может свидетельствовать о более высокой эффективности взаимодействия полипептида с рецептором. Поскольку экспрессия рецепторов к ЭФР на несколько порядков превышает таковую на нормальных клетках организма, данный факт подтверждает возможность использования предлагаемого полипептида в качестве более эффективной векторной молекулы для доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. Пример 4. Эффективность конъюгата полипептида с доксорубицином в отношении опухолевых клеток различных линий, оцениваемая по выживаемости. Действие конъюгата было исследовано на следующих линиях клеток: карцинома молочной железы человека линии MCF-7Wt и резистентная линия карциномы молочной железы человека МСF-7AdrR; карцинома яичника человека линии SKOV3 и резистентная линия карциномы яичника человека SKVLB; мышиная меланома линии В 16. Протокол испытаний был общим для всех проведенных испытаний и состоял в следующем: клетки культивировали в пластиковых флаконах ("Costar") в среде RPMI ("Sigma"), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки ("Sigma"), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% СО 2 при 37 С. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (Costar) по 10 тысяч клеток/лунку, добавляя исследуемые препараты в различных концентрациях, и инкубировали 72 ч. За 2-4 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора (1 мг/мл) МТТ (3-[4,5 диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, Sigma) в среде для культивирования клеток. После развития окраски среду удаляли, растворяли кристаллы формазана в 150 мкл диметилсульфоксида и спектрофотометрически измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм. Выживаемость-3 005865 клеток, подвергшихся воздействию ДР и конъюгата, оценивали в процентах, принимая за 100% выживаемость контрольной культуры. Данные о выживаемости клеток после их инкубации с конъюгатом полипептид-ДР, свободным доксорубицином, а также конъюгатом ЭФРфр-ДР приведены в табл. 2. Таблица 2 Выживаемость опухолевых клеток после их инкубации со свободным или с конъюгированным доксорубицином Цитотоксичность (IС 50) Линия клеток ДР Конъюгат ЭФРфр-ДР Конъюгат полипептид-ДРB16 35 нМ 1,5 нМ 1,1 нМ Из представленных данных следует, что предлагаемый конъюгат полипептида с доксорубицином оказывает значительно более высокое токсическое действие в отношении опухолевых клеток человека линий MCF-7Wt и SKOV3, чувствительных к доксорубицину, а также в отношении клеток мышиной меланомы B16, чем свободный ДР и его конъюгат с ЭФРфр (прототип). Конъюгат полипептид-ДР также проявлял высокую цитотоксическую активность в отношении клеток линий MCF-7AdrR и SKVLB, обладающих резистентностью к антрациклиновым антибиотикам. Таким образом, показано, что противоопухолевый препарат (доксорубицин) в составе конъюгата с предлагаемым полипептидом проявляет значительное цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, как чувствительных, так и резистентных в отношении доксорубицина, что доказывает эффективность предлагаемого полипептида в качестве векторной молекулы для доставки противоопухолевых средств в условия in vitro. Пример 5. Фармацевтические композиции для инъекций получают растворением конъюгата в физиологическом растворе или фосфатно-солевом растворе, рН растворов около 7,4. Концентрация конъюгата в растворе составляет 0,05-0,1%. Пример 6. Противоопухолевая активность композиции конъюгата полипептид-ДР с физиологическим раствором (по примеру 5) на модели перевиваемых опухолей мышей. Для сравнительной оценки терапевтической активности конъюгата полипептид-ДР в отношении солидных опухолей, полученных подкожным введением мышам опухолевых клеток линии B16, использовали внутривенный способ введения композиций, описанных в примере 5. Полученные результаты представлены на фиг. 2 и в табл. 3. Препараты вводили в дозах 0,2 мг/кг по ДР по схеме 1 раз в 4 дня,всего 3 инъекции, начиная с 3-го дня после прививки опухоли. Из фиг. 2 следует, что конъюгат, в отличие от свободного ДР, значительно замедлял время появления опухолей и скорость их роста. Торможение роста опухолей составило 58%. Из табл. 3 следует, что заявляемый конъюгат позволяет получить терапевтический эффект при внутривенном способе введения препарата, который оценивался по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) животных. Применение конъюгата приводило к 46%-ному УПЖ, чего не наблюдалось в случае свободного ДР. Таблица 3 Увеличение продолжительности жизни животных при внутривенном введении композиций, содержащих ДР Группа животных СПЖ, дни УСПЖ, % Контроль 31,44,8 ДР 23,64,0-24,8 Конъюгат 46,65,7 48,5 Увеличение средней продолжительности жизни животных, а также более высокие показатели ингибирования роста опухоли подтверждают терапевтическую эффективность направленной доставки противопухолевого агента в составе предлагаемой композиции в условиях in vivo. Показано (примеры 4, 6), что конъюгат предлагаемого полипептида с антибиотиком антрациклинового ряда доксорубицином (полипептид-ДР) обладает терапевтической эффективностью в отношении солидных опухолей при внутривенном способе введения. Перечень аминокислотной последовательности заявляемого полипептида-4 005865 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биологически активный полипептид формулы MYIEALDSYAC, представляющий собой аналог фрагмента эпидермального фактора роста с 21 по 31 аминокислоту, способный связываться с рецептором эпидермального фактора роста, вызывать пролиферацию клеток и выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. 2. Конъюгат полипептида по п.1 с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к полипептиду через кислотолабильную азометиновую связь. 3. Конъюгат полипептида с доксорубицином по п.2, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к полипептиду с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. 4. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, содержащая конъюгат по любому из пп.2, 3 в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель.