Плазмида, кодирующая фактор роста фибробластов, для лечения ангиогенных дефектов, ассоциированных с гиперхолестеинемией или диабетом

009390 Область изобретения и введение Настоящее изобретение относится к применению плазмиды, кодирующей фактор роста фибробластов, в качестве терапевтического агента для профилактики и лечения миокардиальных или скелетных ангиогенных дефектов, ассоциированных с гиперхолестеринемией или диабетом. Настоящее изобретение также относится к способу усиления образования как коллатеральных кровеносных сосудов, так и артериол в миокардиальных или скелетных ишемизированных тканях млекопитающего, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом. Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции роста коллатеральных кровеносных сосудов в ишемизированных миокардиальных или скелетных тканях без индукции экспрессии VEGF-A (фактора роста сосудистого эндотелия-А) и образования отека в мышцах, которые лечат. Предпосылки изобретения Кровеносные сосуды образуют замкнутую систему доставки крови, которая начинается и заканчивается в сердце и включает три основных типа кровеносных сосудов, а именно артерии, капилляры и вены. При сокращении сердца кровь из желудочков нагнетается в крупные артерии. Крупные артерии разветвляются на артерии среднего размера, которые разветвляются на более мелкие артерии, доставляющие кровь в различные участки организма. Артерии разветвляются вновь и вновь до тех пор, пока они не достигнут своих наименьших разветвлений, называемых артериолами. Как только артериолы проникают в ткань, они разветвляются на микроскопические сосуды, называемые капиллярами, которые располагаются вплотную к клеткам ткани. Капилляры обладают очень тонкими стенками. Кислород и питательные вещества покидают кровь в капиллярах и переходят в клетки ткани, а двуокись углерода и другие продукты жизнедеятельности покидают клетки и переходят в кровь в капиллярах. Перед тем как капилляры покинут ткань, они сливаются с образованием небольших вен, называемых венулами. Венулы сливаются с образованием больших вен, которые в конечном итоге впадают в крупные вены, которые возвращают кровь в сердце. Стенки всех кровеносных сосудов, за исключением капилляров, состоят из 3 отдельных слоев, окружающих просвет. Наиболее глубокий слой, который выстилает просвет сосудов, называют внутренней оболочкой, и он состоит в основном из эндотелиальных клеток. Средний слой, средняя оболочка, состоит в основном из циркулярно расположенных гладкомышечных клеток. Наиболее удаленный слой стенки кровеносного сосуда, наружная оболочка, состоит в основном из эластических и коллагеновых волокон,которые защищают кровеносный сосуд и прикрепляют его к окружающим структурам. Внешнюю оболочку пронизывают нервные волокна, а в более крупных артериях и венах - система крошечных кровеносных сосудов. Артериолы представляют собой мельчайшие артерии и имеют диаметр просвета менее 50 мкм. Стенка артериол состоит из внутренней оболочки, окруженной редко расположенными гладкомышечными волокнами в средней оболочке. Артериолы регулируют кровоток из артерий в капилляры. Во время сужения стенок артериол кровоток в капилляры ограничивается, и ткань, снабжаемая артериолой,может мгновенно остаться без снабжения. Во время расширения стенок артериол кровоток в капилляры значительно усиливается. В отличие от артериол капилляры обладают чрезвычайно тонкими стенками, которые состоят только из одного слоя эндотелиальных клеток, а именно внутренней оболочки. Они образуют обширную сеть, которая пронизывает почти все ткани организма и подходит едва ли не к каждой клетке организма. Средний диаметр просвета капилляра составляет 0,01 мм (10 мкм), достаточно большой для того, чтобы эритроциты легко передвигались через него в один ряд. Чрезвычайно тонкие стенки делают капилляры идеально подходящими для их назначения, которое заключается в обмене питательными веществами,кислородом и продуктами жизнедеятельности с клетками организма. Коллатеральные кровеносные сосуды играют значительную роль в снабжении органа кислородом в особенности, когда доставка кислорода ограничивается заболеванием в нормальной сосудистой сети. Коллатеральные сосуды могут представлять собой уже существующие сосуды, которые в норме имеют небольшой кровоток или вообще лишены его. Острая закупорка (окклюзия) нормальных сосудов (например, тромбоз крупной артерии) может вызвать перераспределение давления в сосудистом русле и привести, таким образом, к появлению кровотока в коллатеральных сосудах. Коллатеральные кровеносные сосуды особенно важны в коронарном и скелетно-мышечном (например, нога человека) кровообращении. В сердце коллатеральные сосуды могут обеспечивать снабжение кровью ишемизированных областей, возникших в результате стеноза или закупорки эпикардиальных артерий. Коллатеральный кровоток может представлять собой важный механизм ограничения размера инфаркта. Образование коллатеральных кровеносных сосудов инициируется в терапевтическом ангиогенезе. Ангиогенез представляет собой сложный процесс, который включает в себя пролиферацию эндотелиальных клеток, деградацию базальной мембраны, миграцию через окружающий матрикс, а также выстраивание и дифференцировку в трубкообразные структуры с образованием стенок кровеносных сосудов, что приводит, таким образом, к вновь сформированной капиллярной сети. Также полагают, что артериогенез, который относится к развитию коллатеральных артериол, представляет собой наиболее эффективный процесс восстановления кровоснабжения вследствие высокой-1 009390 емкости этих сосудов по сравнению с капиллярной сетью (Carmeliet et al., Nat. Med., 2000; 6: 389-395;Van Royen et al., Cardiovasc. Res., 2001; 49: 543-553). Фактически артериолы рассматривают в качестве зрелых крепких и функциональных сосудов благодаря наличию в них и внутренней, и средней оболочек,т.е. слоя эндотелиальных клеток, поддерживаемых слоем гладкомышечных клеток. Образование артериол является предпочтительным типом для длительной и эффективной нейроваскуляризации. Среди патологических состояний, ассоциированных с дисфункцией сосудистого эндотелия, известна гиперхолестеринемия - заболевание, характеризующееся аномальным образованием сосудов, нарушенной регуляцией тканевого кровоснабжения, аномальным пространственным распределением кровотока, а также аномальной функцией микрососудов. Кроме того, кинетика роста сосудов, а также природа полученных в результате сосудов отличаются от здоровых тканей. Эти изменения могут представлять собой результат повреждения сосудистого эндотелия, демонстрирующего сниженную трансдукцию сигнала, уменьшенную доступность L-аргинина, пониженную экспрессию eNOS (синтетазы оксида азота),инактивацию NO, увеличенную супероксид-анионом, продуцируемым макрофагами, другими воспалительными клетками, высвобождение некоторых сосудосуживающих факторов, таких как эндотелин, и реакцию гладких мышц сосудов. У субъектов, страдающих гиперхолестеринемией, плотность капилляров и их распределение в артериальной стенке значительно меняется. В конечном итоге они демонстрируют плотные сплетения адвентициальных микрососудов с заметной дезориентацией. Полагают, что это может являться результатом различных стимулов, которые могут вызвать более сильный или более слабый ангиогенный ответ. Гиперхолестеринемия у людей вызывает дисфункцию сосудистого эндотелия и в конечном итоге прогрессирующее сужение основных артерий. Дисбаланс коронарного кровотока в состоянии покоя и во время стресса приводит к скрытому нарушению функции мышцы, что вызывает боль и пониженную сократимость. Как правило, снабжение является достаточным в состоянии покоя, но при возникновении стресса эти потребности увеличиваются, тогда как снабжение не может быть увеличено вследствие артериальных обструктивных поражений. Это является причиной того, почему задача имитации этой человеческой патологии приводит к развитию стеноза, например, в основной коронарной артерии и применению стресс-теста для выявления дисбаланса, вызванного этим стенозом при стрессе. Также известно, что сосудистая функция у пациентов, страдающих сахарным диабетом I и II типов, характеризуется нарушением расслабления, зависящего от эндотелия. Сахарный диабет характеризуется преждевременным развитием микрососудистого и макрососудистого заболевания (Kannel et al., Diabetes Care,1979, 241: 2035-2038). Таким образом, возникает вопрос, можно ли такие тяжелые поражения и аномалии эндотелия, возникающие вследствие гиперхолестеринемии, диабета, гипертензии и гиперлипидемии, у пациентов, страдающих заболеванием периферических артерий (ЗПА), окклюзионным заболеванием периферических артерий (ОЗПА) или заболеванием сердечных артерий (ЗСА), устранить путем использования терапевтического ангиогенеза. Введение нескольких ангиогенных факторов, таких как, например фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), кислый фактор роста фибробластов (aFGF) и щелочной фактор роста фибробластов(bFGF), HIF-1/VP16 (фактор 1, индуцируемый при гипоксии/этопозид) и трансформирующий фактор роста(TGF-), для стимуляции роста коллатеральных кровеносных сосудов, также известное как терапевтический ангиогенез, было предложено для лечения сердечно-сосудистой и периферической ишемии. Однако сильные плейотропные эффекты на различные типы клеток могут ограничивать терапевтическую применимость некоторых из этих соединений. Например, VEGF-A был одним из наиболее эффективных ангиогенных факторов. Однако было показано, что VEGF-A приводит к образованию отека, а также дезорганизованных извилистых и неплотных сосудов, напоминающих сосуды, обнаруженные в опухолях(Lee et al., Circulation 2000, 102: 898-901; Springer et al., Mol Cell, 1998, 2: 549-559). Существуют две разные стратегии терапевтического ангиогенеза. Белковая терапия, которая включает доставку фактора роста непосредственно в ишемизированную ткань, представляет собой одну возможность. Ангиогенная генная терапия представляет собой альтернативную возможность, которая служит для улучшения развития коллатеральных сосудов и преодоления дефектов кровоснабжения и связанной с ними ишемии посредством доставки нуклеиновых кислот в соматические клетки (8-10). Исследования, проведенные на животных, продемонстрировали локальный ангиогенный потенциал многих факторов роста, включая, например, рекомбинантный VEGF человека, рекомбинантный PDGF(тромбоцитарный фактор роста) или рекомбинантный bFGF. Однако было показано, что доставка рекомбинантных белков и системное введение высоких доз рекомбинантных белков приводят к большому количеству других негативных побочных эффектов. Кроме того, важным является количество необходимого рекомбинантного белка. Если доставляется слишком мало белка, то ангиогенез не происходит. Если доставляется слишком много белка, то это может привести к образованию дезорганизованных сосудистых слоев и случайному ангиогенезу. Терапевтический ангиогенез исследовали путем введения нуклеиновых кислот, способных экспрессировать ангиогенный белок либо в "голом" виде, либо посредством липосом или вирусных векторов. Доставка ангиогенной кодирующей последовательности посредством вирусного вектора обеспечивает высокую эффективность доставки, но страдает от множества недостатков, связанных с использованием-2 009390 вирусных векторов, таких как возникновение иммунной реакции, а также возможность интеграции и распространения. Например, методы аденовирусной генной терапии были поставлены под сомнение после смерти Jesse Gelsinger в сентябре 1999 г. в Университете Пенсильвании после введения в печеночную артерию путем инфузии Е 1- и Е 4-делетированного рекомбинантного аденовируса, который экспрессировал правильную форму орнитин-транскарбамилазы человека. Патологические анализы показали, что официальная причина смерти состояла в полиорганной недостаточности, которая была вторична относительно респираторного дистресс-синдрома взрослого, индуцированного системным воспалительным ответом на систематически вводимый рекомбинантный аденовирус. Недавно сообщили о двух случаях лейкемии в исследовании, предназначенном для лечения детей, страдающих тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), которые объяснили использованием в качестве вектора ретровируса. И липосомы, и "голая" ДНК, включающая ДНК, кодирующую ангиогенный пептид, также страдают от главного недостатка, состоящего в меньшей эффективности доставки по сравнению с вирусом, и возможны трудности в получении такого уровня белка, который необходим для достижения терапевтического эффекта. Относительно стратегии использования "голой" ДНК неожиданно было продемонстрировано, что внутримышечная инъекция NV1FGF - плазмиды, кодирующей кислый фактор роста фибробластов или фактор роста фибробластов 1 типа (FGF-1), пациентам, страдающим конечной стадией окклюзионного заболевания периферических артерий (ОЗПА) или заболеванием периферических артерий (ЗПА), удовлетворяет требованиям безопасности. Camerota с соавт. (J. Vasc. Surg., 2002, 35, 5: 930-936) описывает,что 51 пациент, страдающий конечной стадией невосстанавливаемого ЗПА, с болью в состоянии покоя или некрозом тканей, были инъецированы внутримышечно возрастающими разовыми или повторными дозами NV1FGF в ишемизированное бедро и заднюю часть голени. Затем оценивали различные параметры, такие как чрескожное давление кислорода, лодыжечно- и пальцево-брахиальные индексы, оценка боли и заживление язвы. Наблюдали значительное увеличение брахиальных индексов, уменьшение боли,уменьшение области язвы и улучшенное кровоснабжение после введения NV1FGF. Также была продемонстрирована индукция ангиогенеза посредством переноса гена VEGF пациентам, страдающим ишемией нижних конечностей. "Голую" плазмидную ДНК, кодирующую изоформуVEGF-165, вводили в ишемизированные мышцы пациентов в состоянии покоя с незаживающими ишемическими язвами и/или болью вследствие заболевания периферических артерий. Вновь образованные коллатеральные кровеносные сосуды и улучшенное кровоснабжение, а также капилляры могут быть обнаружены ангиографически через 8 недель после лечения. Однако также наблюдали значительное увеличение концентрации VEGF в сыворотке крови через 5-6 недель после лечения (Isner et al., Lancet, 1996; 348: 370-4). Такое увеличение концентрации VEGF в сыворотке крови может вызвать беспорядочный нежелательный ангиогенез и серьезные негативные побочные эффекты, такие как отек (26).Vincent с соавт. (Circulation, 2000; 102 (18): 2225-61) сообщает о том, что введение "голой" плазмидной ДНК, кодирующей фактор транскрипции 1, индуцируемый гипоксией (HIF-1), было связано со значительными улучшениями коэффициента кровяного давления в задней части голени, ангиогенного показателя, местного кровотока и плотности капилляров. Однако также сообщают, что HIF-1 активирует экспрессию эндогенного гена VEFG, что свидетельствует об усилении VEGF-опосредованного ангиогенеза, а также некоторые мишени in vivo. Кроме того, Taniyama с соавт. (Gene Therapy, 2001, 8: 181-189) сообщил о терапевтическом ангиогенезе с использованием внутримышечной инъекции "голой" плазмидной ДНК, кодирующей фактор роста гепатоцитов человека (HGF), в моделях ишемизированных задних конечностей у крыс и кроликов. Рост коллатеральных кровеносных сосудов был идентифицирован путем ангиографии и плотности капилляров, что было продемонстрировано с помощью щелочной фосфатазы, используемой в качестве маркера эндотелиальных клеток. Также было показано, что HGF, который сначала был идентифицирован в качестве митогена для гепатоцитов, также является митогеном для некоторых типов клеток, включая меланоциты, клетки почечных канальцев, кератиноциты и некоторые эндотелиальные клетки, а также клетки эпителиального происхождения (Matsumoto et al., BBRC, 1991, 176: 5-51). Также было показано,что HGF стимулирует рост эндотелиальных клеток без репликации гладкомышечных клеток сосудов(Nakamura et al., Hypertension, 1996; 28: 409-413; Hayashi et al., BBRC, 1996; 220: 539-545). Наконец, было показано, что HGF может действовать также в качестве "фактора рассеяния" (scatter factor), активности,которая способствует диссоциации эпителиальных и эндотелиальных клеток сосудов (Giordano et al.,PNAS, 1993, 90: 649-653). Таким образом, было постулировано, что HGF вовлечен в образование опухолей. В противоположность этому доказано, что введение плазмиды, кодирующей кислый фактор роста фибробластов (aFGF или FGF-1), не увеличивает концентрацию FGF-1 в сыворотке крови, таким образом, демонстрируя, что применение такой плазмиды, экспрессирующей FGF-1 человека, особенно благоприятно с точки зрения безопасности, поскольку отсутствуют беспорядочный ангиогенез или негативные побочные эффекты. Отсутствие циркулирующего FGF-1 дает значительное преимущество с точки зрения безопасности по сравнению с другими ангиогенными факторами, такими как, например VEGF или FGF-3 009390 2, которые, как было описано, проникают в систему кровообращения и приводят к дистантному отеку(Baumgartner et al., Circulation, 1998, 97: 1114-23). Семейство факторов роста фибробластов (FGF) состоит по меньшей мере из 23 структурно родственных белков (FGF 1-23), из которых наиболее известны FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-9. Члены этого семейства стимулируют поздний митогенез в большинстве клеток, происходящих из мезодермы и нейроэктодермы, и оказывают влияние на другие биологические процессы, включая ангиогенез, удлинение нейритов, рост остеобластов, выживание нейронов и дифференцировку миобластов. Как правило,FGF обладают высоким сродством к гепарину. До анализа их номенклатуры некоторые FGF были известны как гепаринсвязывающие факторы роста-1, -2 и т.д., а многие, но не все, являются митогенами для фибробластов. Члены семейства FGF демонстрируют приблизительно 25-55% идентичности аминокислотной последовательности с коровой последовательностью, а некоторые FGF демонстрируют значительные удлинения либо на С-конце, N-конце, либо на обоих концах за пределами этой коровой последовательности. Эта структурная гомология свидетельствует о том, что различные гены, кодирующие известные FGF, могут происходить из общего гена-предшественника. В дополнение к 23 известным членам семейства FGF, дополнительная сложность является результатом образования нескольких молекулярных форм FGF из одного гена. Например, первичный продукт трансляции FGF (FGF-1) состоит из 155 остатков. Однако самая длинная форма FGF-1, обнаруженная в природном источнике (например, головном мозге быков), состоит из 154 остатков. Эта форма FGF-1,состоящая из 154 остатков, не имеет NH2-концевого метионина из формы, включающей 155 остатков, и имеет ацетилированный аминоконец. Протеолитический процессинг in vivo или во время очистки приводит к образованию активных форм FGF-1 меньшего размера, в которых имеется делеция 15 (des 1-15) или 21 (des 1-21) аминоконцевых аминокислот. Как определено в данном описании, FGF-1 относится к форме, состоящей из 154 остатков, и ее более коротким биологически активным формам, таким как вышеописанные формы с делецией 15 (des 1-15) или 21 (des 1-21) аминоконцевых аминокислот. Исторически форма FGF-1, состоящая из 154 остатков, была названа фактором роста -эндотелиальных клеток (ECGF), форма des 1-15 была названа aFGF или FGF-1, а форма des 1-21 была названа -ECGF. Перед стандартизацией терминологии для этой группы факторов роста, для одного и того же белка применяли несколько дополнительных терминов, включая фактор роста, происходящий из глаза, и гепаринсвязывающий фактор роста 1. Также были описаны аналогичные формы bFGF (FGF-2). Кроме расщепленных форм были описаны также удлиненные формы bFGF, являющиеся результатом инициации трансляции в нескольких различных GTG кодонах, располагающихся выше относительно кодона инициации трансляции ATG, который приводит к образованию формы bFGF, состоящей из 155 остатков. Все эти альтернативные формы FGF содержат кодовую область, обладающую структурной гомологией, которая определяет семейство FGF. Многие из этих различных молекул FGF были выделены и вводились в различные животные модели ишемии миокарда с отличающимися и часто противоположными результатами. Было выдвинуто предположение, что ангиогенная роль FGF-1 основана на исследованиях, проведенных in vivo (Comerota et ai., J. Vasc. Surg., 2002, 35, 5: 930-936). Внутримышечные инъекции экспрессирующей FGF-1 плазмиды продемонстрировали улучшенное кровоснабжение, основываясь на увеличенном лодыжечно-брахиальном индексе, уменьшении боли и увеличении чрескожного кислорода. Заявитель неожиданно обнаружил, что внутримышечная инъекция плазмиды, экспрессирующейFGF-1, не вызывает индукции VEGF в эндотелиальных клетках сосудов и, таким образом, представляет весьма безопасную ангиогенную терапию в противоположность другим ангиогенным факторам, включающим другие факторы FGF, VEGF, HIF-1/VP16 и HGF. Большая часть исследований терапевтического ангиогенеза была подтверждена на животных моделях ишемии конечностей и была осуществлена на нормальных здоровых животных, но лишь немногие из них были протестированы в отношении способности реверсировать дефекты ангиогенеза при гиперхолестеринемии или диабете, при которых функция эндотелия значительно нарушена. В этой связи не было доказано, что известный терапевтический ангиогенез является убедительным при тестировании на моделях кроликов с гиперхолестеринемией, подвергнутых иссечению бедренной артерии, поскольку наблюдали нарушение образования коллатеральных кровеносных сосудов и плотности капилляров, которое могло быть лишь частично реверсировано путем введения VEGF (26). Кроме того, не было доказано, что терапевтический ангиогенез является убедительным при тестировании на моделях диабета, так как Roguin А. с соавт. (Cardiovascular Diabetology 2003, 2:18) продемонстрировал,что применение плазмиды, экпрессирующей VEGF, не улучшило кровоток и не способствовало коллатерализации у мышей, страдающих диабетической ишемией,В противоположность этому заявитель неожиданно обнаружил, что плазмида, экспрессирующаяFGF-1 человека, при внутримышечном введении в ишемизированные миокардиальные или скелетные мышцы обладала способностью эффективно реверсировать дефекты коллатеральных сосудов, ассоциированные с гиперхолестеринемией или диабетом, и способствовала образованию зрелых сосудов, таких как артериолы, у млекопитающего, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом. Кроме того, заявитель обнаружил, что в противоположность похожим ангиогенным факторам внут-4 009390 римышечная инъекция плазмиды, экспрессирующей FGF-1, не вызывала отека скелетной или сердечной мышцы, в которую осуществляли введение, и поэтому может быть использована в количестве, достаточном для избавления от дефектов ангиогенеза в ишемизированных мышцах при отягощенных состояниях,таких как гиперхолестеринемия или диабет. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к способу лечения миокардиальных или скелетных ангиогенных дефектов, ассоциированных с гиперхолестеринемией или диабетом, включающему введение субъекту фармацевтических композиций, содержащих плазмиду, несущую ген, кодирующий некоторые факторы роста фибробластов, в количестве, которое стимулирует реверсировение дисфункции эндотелия и ангиогенных дефектов. Настоящее изобретение также относится к способу лечения миокардиальных или скелетных ангиогенных расстройств или дефектов, ассоциированных с гиперхолестеринемией или диабетом, включающему введение эффективного количества плазмиды, кодирующей фактор роста фибробластов, где экспрессия фактора VEGF-A в миокардиальной или скелетной мышце не индуцирована. Настоящее изобретение также относится к способу лечения дисфункции сосудистого эндотелия, ассоциированной с гиперхолестеринемией или диабетом, у пациента путем введения в скелетные или миокардиальные мышцы плазмиды, кодирующей фактор роста фибробластов, в количестве, достаточном для реверсирования миокардиальных или скелетных ангиогенных дефектов, где экспрессия фактора VEGF-A не индуцирована и отек не образуется. Цель настоящего изобретения заключается также в том, чтобы предложить способ стимуляции и/или активации образования зрелых коллатеральных сосудов в ишемизированных сердечных или скелетных мышечных тканях при регуляции гиперхолестеринемии или диабета, включающий введение путем инъекции в указанные ткани указанного субъекта эффективного количества плазмиды, кодирующей фактор роста фибробластов, где экспрессия фактора VEGF-A не индуцирована и/или отек не образуется. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ лечения ишемических состояний, таких как ЗПА, ОЗПА или ЗКА, у млекопитающего, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом, без индукции экспрессии фактора VEGF и без индукции образования отека. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ стимуляции как коллатеральных кровеносных сосудов, так и артериол в ишемизированных тканях, в которых нарушена эндотелиальная функция. Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой способ реверсирования дефектов ангиогенеза, вызванных гиперхолестеринемией или диабетом, без индукции экспрессии фактора VEGF у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ стимуляции ангиогенеза, независимого от VEGF. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ стимуляции ангиогенеза, при условии, что в обработанных клетках не активируется VEGF. Внутримиокардиальная или внутримышечная инъекция плазмиды, экспрессирующей FGF, предпочтительна для реверсирования миокардиальных или скелетных дефектов ангиогенеза, ассоциированных с гиперхолестеринемией или диабетом. Факторы роста фибробластов, предпочтительные при применении настоящего изобретения, представляют собой FGF-1 и наиболее предпочтительно полноразмерный FGF-1 человека. Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества будут понятны из нижеследующего описания и предпочтительных воплощений изобретения, приведенных с целью раскрытия, в сочетании со следующими графическими материалами. Краткое описание графических материалов Фиг. 1: представляет схематическое изображение плана экспериментов. Фиг. 2 А-В: демонстрируют поперечные срезы (увеличение Х 100) мышц хомячка (Gracillis и Adductores) после окрашивания HES (гематоксилин-эозин-шафран); фиг. 2A представляет поперечный срез неишемизированных (контралатеральных) мышц; фиг. 2 Б и В представляют поперечные срезы ишемизированных мышц; пунктирные линии на фиг. 2 Б иллюстрируют наличие умеренного некроза; стрелка на фиг. 2B указывает на центронуклеацию. Фиг. 3 А-В: представляют типичные ангиограммы, зарегистрированные на неишемизированной (левой) и ишемизированной (правой) задних конечностях хомячков из групп с НХ (низким уровнем холестерина) (А); ВХ/21 (высоким уровнем холестерина в течение 21 суток) (Б) и ВХ/28 (В). Фиг. 3 Г: иллюстрирует соответствующую ангиографическую оценку, полученную путем количественного анализа образования коллатеральных сосудов после ишемии задней конечности. Фиг. 4 А-Г: демонстрируют типичные поперечные срезы (увеличение Х 100) зрелых сосудов, меченных иммуногистохимически гладкомышечным -актином (SMA), неишемизированных (А и В) и ишемизированных (Б и Г) мышц (Adductores и Gracilis), приготовленные на 21 (А и Б) или 28 (В и Г) сутки после индукции ишемии. Фиг. 4 Д и Е: демонстрируют график, иллюстрирующий количественную оценку площади мышц иSMA-положительных артериол диаметром менее 50 мкм. Пустые столбцы: неишемизированная задняя конечность; заштрихованные столбцы: ишемизированная задняя конечность; НЗ: не значимо; : р 0,01 против любой группы. Фиг. 5 А и Б: представляют типичные ангиограммы как неишемизированной, так и ишемизированной задних конечностей хомячков, обработанных физиологическим раствором (А) или NV1FGF (Б). Фиг. 5B: иллюстрирует количественную оценку образования коллатеральных кровеносных сосудов посредством ангиографической оценки после ишемии задней конечности. Фиг. 6 А и Б: демонстрируют типичные поперечные срезы (увеличение Х 100), изображающие зрелые сосуды, меченные иммунохимически гладкомышечным -актином (SMA), из ишемизированных мышц (Adductores и Gracilis) хомячков, обработанных физиологическим раствором (А) или NV1FGF (Б). Фиг. 6 В и Г: представляют графики, демонстрирующие количественную оценку площади мышц иSMA-положительных артериол диаметром менее 50 мкм. Пустые столбцы: неишемизированная задняя конечность; заштрихованные столбцы: ишемическая задняя конечность; НЗ: Не значимо; : р 0,01;р 0,01 (физиологический раствор против NV1FGF). Фиг. 7: представляет типичные картины (увеличение Х 100) иммунохимического окрашивания поликлональным антителом против FGF-1 в мышцах задней части бедра (Gracilis и Adductores) из неишемизированных (контралатеральных) задних конечностей, которые не были инъецированы (А), и ишемизированных задних конечностей, инъецированных физиологическим раствором (Б) или NV1FGF (В). Стрелки показывают иммунореактивные волокна, идентифицированные по коричневому окрашиванию иммунных комплексов. Фиг. 8 А-В: представляют гистологические срезы мышц Tibialis Cranialis, окрашенных антителом к мышиному VEGF. (А): срез мышцы, инъецированной NaCl, с мозаичной картиной положительного окрашивания миофибрилл; (Б): срез мышцы, инъецированной pCOR-CMV-empty, с похожей картиной окрашивания; (В): срез мышцы, инъецированной NaCl, после адсорбции антитела к mVEGF-A с пептидомmVEGF-A. Фиг. 8 Г и Д: представляют последовательные гистологические срезы мышцы Tibialis Cranialis, инъецированной pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1, окрашенной антителом против mVEGF-A (Г) или FGF-1 (Д). Фиг. 9 А: демонстрирует образец, представляющий расположение 13 инъекций в сердце кролика,страдающего от гиперхолестеринемии. Фиг. 9 Б: представляет микрофотографию HES-окрашенных срезов левой огибающей коронарной артерии кролика Watanabe, страдающего гиперхолестеринемией, при 100-кратном увеличении. А соответствует наружной оболочке (адвентиции); М соответствует средней оболочке; головки стрелок соответствуют внутренней оболочке (интиме); стрелка соответствует атеросклеротической бляшке. Фиг. 10: демонстрирует ЭКГ в состоянии покоя у людей в соответствии с номенклатурой модификаций сегмента ST во время стресс-теста у людей (из Braunwald et al. Heart Disease, 5th ed., p. 159). Слева фиг. 10 представлена ЭКГ людей в состоянии покоя, а справа, сверху вниз, постепенно более серьезные модификации сегмента ST, в зависимости от наклона этого сегмента: подъем, горизонтальный и наклон вниз. Подъем, представленный в нижней части, является наиболее серьезным. Фиг. 11 А: демонстрирует ЭКГ, полученную на кроликах в течение добутаминового стресс-теста. Фиг. 11 Б: демонстрирует увеличение отведения I. Снижение ST, горизонтальное ясно видно сразу после комплекса QRS большим вертикальным пиком. Фиг. 12: демонстрирует оценку ЭКГ при самой высокой дозе добутамина. Фиг. 13 А: демонстрирует типичную ЭКГ с 12 отведениями у кролика в состоянии покоя. Фиг. 13 Б: демонстрирует сильную ишемию при максимальном стрессе у того же самого кролика. Фиг. 14: представляет схематичную номенклатуру двумерной эхокардиографии. Фиг. 15: демонстрирует микроскопические повреждения миокарда и ассоциированную с ними экспрессию FGF-1 в сердце здоровых кроликов через 3 суток после инъекции NV1FGF. HES-окрашивание демонстрирует дегенерацию и некроз миокарда с активным хроническим воспалительным ответом (А) и ассоциированной экспрессией FGF-1 (головки стрелок, Б). Фонотносится к конъюгации вторичного антитела (против кролика) с эндогенным IgG. Увеличение: 100. Фиг. 16: демонстрирует развитие максимальной балльной оценки ЭКГ во время стресс-теста на кроликах, которым вводили пустую плазмиду (серая колонка) или плазмиду NV1-FGF (заштрихованная колонка). Фиг. 17: демонстрирует количественную оценку 16 нормальных сегментов (серый цвет) и 14 аномальных сегментов (черный цвет). Качественная оценка нормальный/аномальный представляла собой визуальную оценку. Фиг. 18: демонстрирует график максимальной оценки ЭКГ в зависимости от максимальной балльной оценки эхо. Кривая регрессии представлена черным цветом. Две основные зоны (аномальная ЭКГ и аномальная эхо, нормальная ЭКГ и нормальная эхо) затенены серым цветом. Фиг. 19: демонстрирует развитие эхокардиографической оценки в зависимости от времени после обработки. Животные, обработанные NV1-FGF, представлены штриховкой. Животные, обработанные-6 009390 пустой плазмидой, представлены серым цветом.указывает на значимое различие (р 0,05) между группами. Фиг. 20: представляет стандартизированную методику, используемую для приготовления образцов срезов сердца для гистологического анализа различных секторов сердца в соответствии с 3 срезами вдоль короткой оси, например, апикального, среднего и базального сегментов. Фиг. 21: демонстрирует количественный анализ плотности сосудов в рубце в жизнеспособном миокарде, удаленном от рубца. Подробное описание изобретения В настоящем изобретении предложен способ лечения или восстановления миокардиальных или скелетных ангиогенных дефектов, ассоциированных с регуляцией гиперхолестеринемии или диабета, при которых эндотелиальные функции эндотелия нарушены или недостаточны. Способ и композиция по настоящему изобретению особенно полезны в реверсировании эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с гиперхолестеринемией или диабетом, после прямого внутримышечного введения для стимуляции общего усиления образования кровеносных сосудов в миокардиальной или скелетной мышце. Изобретение охватывает применение плазмиды, кодирующей биологически активный фактор роста фибробластов, и его фармацевтически приемлемые соли и производные. В настоящем изобретении также предложен способ стимуляции образования зрелых коллатеральных сосудов в ишемизированных сердечных или скелетных мышечных тканях у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение путем инъекции в указанные ткани указанного субъекта эффективного количества плазмиды, кодирующей фактор роста фибробластов, где экспрессия фактора VEGF-A у указанного субъекта не индуцирована. В частности, введение плазмиды, экспрессирующей FGF, индуцирует образование как коллатеральных кровеносных сосудов, так и артериол в ишемизированных миокардиальных и скелетных мышечных тканях без индукции экспрессии фактора VEGF-A. Плазмида, экспрессирующая FGF, по настоящему изобретению может не вызвать побочные эффекты,такие как отек. В настоящем изобретении также предложен способ реверсирования дефектов ангиогенеза, вызванных гиперхолестеринемией или диабетом, без индукции экспрессии фактора VEGF-A и/или индукции образования отека, включающий введение путем инъекции в миокардиальные или скелетные ткани указанного пациента эффективного количества плазмиды, экспрессирующей фактор роста фибробластов,для стимуляции образования как коллатеральных кровеносных сосудов, так и артериол. В настоящем изобретении также предложен способ усиления реваскуляризации путем стимуляции как коллатеральных кровеносных сосудов, так и артериол в ишемизированных тканях млекопитающего,страдающего гиперхолестеринемией или диабетом, включающий введение путем инъекции в указанные ткани указанного субъекта эффективного количества плазмиды, экспрессирующей FGF, для реверсирования дефектов ангиогенеза. Доставка и экспрессия указанной плазмиды неожиданно привела к значительному улучшению кровоснабжения через ишемизированные мышцы. Термин "субъект" включает, но не ограничивается ими, млекопитающих, таких как собаки, кошки,лошади, коровы, свиньи, крысы, мыши, обезьяны и люди. Термин "биологически активная последовательность" обозначает нуклеотидную последовательность, кодирующую природный пептид или любые его биологически активные аналоги или фрагменты. В природе существуют различные формы, обладающие вариациями последовательности структурного гена, кодирующего пептиды, обладающие идентичной биологической функцией. Эти биологически активные аналоги последовательности включают природные и неприродные аналоги, имеющие единичные или множественные аминокислотные замены, делеции, вставки или замены. Все такие аллельные модификации и аналоги, дающие в результате производные, которые сохраняют одно или более нативных биологически активных свойств, включены в объем этого изобретения. Таким образом, плазмида, кодирующая FGF, включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует желаемый белок FGF. Эти молекулы могут представлять собой кДНК, геномную ДНК, синтезированную ДНК или их гибрид, или молекулу РНК, такую как мРНК. Предпочтительно, плазмида включает нуклеотидную последовательность, кодирующую FGF-1, и, таким образом, охватывает нуклеотидную последовательность, кодирующую форму кислого фактора роста FGF-1, состоящую из 154 остатков, как описано в патенте США 4686113. Регуляторные элементы, необходимые для генной экспрессии молекулы ДНК, могут включать промотор, инициирующий кодон, стоп-кодон и сигнал полиаденилирования. Кроме того, для генной экспрессии часто требуются энхансеры. Необходимо, чтобы эти элементы были функционально связаны с последовательностью, которая кодирует желаемые белки, и чтобы регуляторные элементы функционировали в миокарде субъекта, которому их вводят. Инициирующий кодон и стоп-кодон обычно рассматривают как часть нуклеотидной последовательности, которая кодирует желаемый белок. Однако необходимо, чтобы эти элементы были функциональными в субъекте, которому вводят генетическую конструкцию. Инициирующий и терминирующий кодоны должны находиться в рамке с кодирующей последовательностью. Используемые промоторы и сигналы полиаденилирования должны быть функциональными в мио-7 009390 кардиальных клетках субъекта. Примеры промоторов, пригодных для осуществления настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, промоторы обезьяньего вакуолизирующего вируса 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (HIV), такой как промотор длинного концевого повтора (LTR) HIV, вируса Молони, ALV (вируса птичьего лейкоза), цитомегаловируса (CMV), такой как ранний промотор CMV, промотор вируса Эпштейна-Барра (EBV), вируса саркомы Рауса (RSV), а также промоторы генов человека, таких как гены альфа-актина человека,миозина человека, гемоглобина человека, мышечного креатина человека и металлотионеина человека. В другом предпочтительном воплощении экспрессия генов FGF запускается промотором, специфическим для мышц, таким как вышерасположенная последовательность гена CARP мыши или человека,которая описана в публикации США 2003/0039984, промоторная последовательность сердечного альфаактина, описанная в международной публикации WO 01/11064. Примеры сигналов полиаденилирования, пригодных для осуществления настоящего изобретения, в особенности для производства генетической вакцины для людей, включают, но не ограничиваются ими,сигналы полиаденилирования SV40, сигналы полиаденилирования гормона роста быка или человека и сигналы полиаденилирования LTR. В частности, используют сигнал полиаденилирования SV40, находящийся в плазмиде pCEP4 (Invitrogen, San Diego Calif.), известный как сигнал полиаденилирования SV40. Кроме регуляторных элементов, необходимых для экспрессии ДНК, в молекулу ДНК могут быть также включены другие элементы. Такие дополнительные элементы включают энхансеры. Энхансер может быть выбран из группы, включающей энхансеры актина человека, миозина человека, гемоглобина человека, мышечного креатина человека и вирусные энхансеры, такие как энхансеры CMV, RSV и EBV. Могут быть предложены генетические конструкции, имеющие точку инициации репликации, происходящую из млекопитающих, для внехромосомного поддержания конструкции и продуцирования многочисленных копий этой конструкции в клетке. Плазмиды pCEP4 и pREP4 от Invitrogen (San-Diego,Calif.) содержат точку инициации репликации из вируса Эпштейна-Барра и участок, кодирующий ядерный антиген EBNA-1, который обеспечивает высококопийную эписомальную репликацию без интеграции. Другие подходящие плазмиды хорошо известны специалистам в данной области, например плазмида pBR322 с репликатором pMB1 или плазмида pMK16 с репликатором ColE1 (Ausubel, Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1988),II:1.5.2). В предпочтительном воплощении плазмида, кодирующая FGF, представляет обусловленную точку инициации репликации pCOR, как описано в международной заявке на патент WO 97/10343 и Soubrier с соавт. (Gene Ther. 1999; 6:1482-1488). Плазмида pCOR несет оптимизированную экспрессионную кассету, кодирующую секретируемую форму FGF-1 человека (sphFGF-1), встроенную в исходную цепь. Полученная плазмида преимущественно имеет небольшой размер 2,4 т.п.н. Последовательность, кодирующая sphFGF-1, представляет собой слияние между последовательностями, кодирующими пептидный сигнал секреции (sp) фибробластного интерферона человека, и природной укороченной формой FGF-1 человека, включающей аминокислоты от 21 до 154 (US 4686113; US 5849538). Экспрессия sphFGF-1 запускается непосредственным/ранним энхансером/промотором цитомегаловируса человека (CMV) (от нуклеотида -522 до +72). Поздний сигнал полиаденилирования обезьяньего вакуолизирующего вируса 40(нуклеотиды 2538-2759 из генома SV40, GenBank локус SV4CG; US 5168062) был встроен ниже относительно слияния sphFGF-1 для обеспечения правильной и эффективной терминации транскрипции и последующего полиаденилирования транскрипта sphFGF-1. Эта предпочтительная плазмида обозначена как NV1FGF и не имеет гена устойчивости к антибиотику. Селекция плазмиды основана на гене супрессора транспортной РНК в аутотрофном штамме-реципиенте. Поддержание высокой копийности и строго ограниченного диапазона плазмид в организме хозяина достигали с использованием точки инициации репликации R6K. Последовательность, кодирующую этот белок, обычно не обнаруживают в бактериях,а искусственно встраивают в геном выбранного штамма-хозяина. Таким образом, существенно ограничивают возможное распространение плазмиды. Плазмиды по настоящему изобретению могут быть введены позвоночному любым способом, который доставляет инъецируемый материал в клетки миокарда. Предпочтительно, плазмиду вводят в виде"голой" ДНК плазмиды в том смысле, что она не содержит какого-либо носителя для доставки, который мог бы облегчать проникновение в клетку, например данные полинуклеотидные последовательности не содержат вирусных последовательностей, в частности, каких-либо вирусных частиц, которые могут нести генетическую информацию. Аналогично, они не содержат или оголены в отношении какого-либо материала, который стимулирует трансфекцию, такого как липосомальные препараты, заряженные липиды, такие как Lipofectin, или осаждающие агенты, такие как CaPO4. С другой стороны, плазмида может быть доставлена животному с помощью фармацевтически приемлемого жидкого носителя. В предпочтительных воплощениях жидкий носитель представляет собой водный или частично водный носитель, содержащий стерильную апирогенную воду. pH данного препарата соответствующим образом регулируют и забуферивают. Альтернативно, плазмиду можно инъецировать с применения липосом, таких как катионные или положительно заряженные липосомы.-8 009390 Нижеследующие примеры ясно демонстрируют, что плазмида NV1FGF обеспечивает медленное высвобождение кодируемого белка FGF-1 в концентрации, достаточной для стимуляции длительного ангиогенного ответа через образование капиллярных сосудов, а также зрелых сосудов, таких как артериолы. Кроме того, было показано, что NV1FGF является особенно эффективной, так как было продемонстрировано, что она эффективно стимулирует ангиогенез в обработанных мышцах в недетектируемой концентрации. Таким образом, NV1FGF может быть использована в концентрациях, которые находятся в пределах терапевтического окна, предотвращая тем самым негативные побочные эффекты вследствие распространения в окружающие ткани или органы, или беспорядочного ангиогенеза. Кроме того, было показано, что благодаря таким превосходным характеристикам с точки зрения безопасности и эффективности, NV1FGF особенно полезна для терапевтического ангиогенеза в отягощенных состояниях, вызванных гиперхолестеринемией или диабетом. Таким образом, настоящим изобретением охвачено реверсирование дефектов ангиогенеза, вызванных ослабленным кровоснабжением, независимо от их происхождения, которые усугубляются при таких состояниях, как гиперхолестеринемия или диабет. Таким образом, в контексте настоящего изобретения ткань-мишень включает мышечные ткани,страдающие от ишемического поражения или имеющие риск пострадать от ишемического поражения,являющегося результатом того, что ткань лишена достаточного поступления кислородосодержащей крови, дополнительно отягощенного комплексом гиперхолестеринемии или диабета. Как продемонстрировано в примерах, внутримышечная инъекция плазмиды NV1FGF может быть эффективно использована в терапевтическом окне, которое совместимо с требуемым стандартом безопасности в генной терапии и способно индуцировать ангиогенез в ишемизированной ткани, дополнительно демонстрирующей поражение эндотелиальной функции. Согласно первому воплощению настоящего изобретения плазмиду NV1FGF вводят локально в мышечную ткань-мишень. Хотя в контексте настоящего изобретения могут быть использованы любые подходящие средства введения плазмиды NV1FGF в ткань-мишень, предпочтительно, чтобы такая локальная инъекция в мышечную ткань-мишень была осуществлена путем непосредственной инъекцииNV1FGF в мышцу с использованием иглы. Под термином "инъекция" подразумевают, что NV1FGF вводят в ткань-мишень принудительно. Согласно настоящему изобретению может быть использовано любое подходящее устройство для инъекции. Хотя введение дозы плазмиды NV1FGF может быть осуществлено путем однократной инъекции в ткань-мишень, предпочтительно введение дозы путем многократных инъекций NV1FGF. Многократные инъекции могут представлять собой 2, 3, 4, 5 или более повторных инъекций и предпочтительно 5 или более инъекций в ишемизированную мышцу млекопитающего, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом. Многократные инъекции демонстрируют преимущество по сравнению с однократными инъекциями, заключающееся в том, что ими можно манипулировать с помощью таких параметров, как специфическая геометрия, определяемая местоположением ткани-мишени, в которую осуществляют каждую инъекцию. Инъекция разовой дозы NV1FGF путем множества инъекций может лучше контролироваться и эффективность для любой заданной вводимой дозы может быть максимизирована. Специфическая геометрия многократных инъекций может быть определена в двухмерном пространстве, в котором осуществляют каждое введение NV1FGF. Многократные инъекции могут быть осуществлены в ишемизированную ткань или вокруг нее, предпочтительно они расположены пространственно таким образом, что точки инъекции разделены 2 или 3 см. Согласно другому воплощению настоящего изобретения каждую из множества инъекций осуществляют приблизительно через 5-10 мин друг от друга. При введении NV1FGF в ткань-мишень, которая поражена дефектами ангиогенеза и в которой функция эндотелия значительно нарушена, желательно, чтобы введение было таким, чтобы NV1FGF могла контактировать с участком, достаточно близким к началу и концу формирования коллатерального кровеносного сосуда, а также областью между ними. Введение композиции по настоящему изобретению для осуществления терапевтических задач может быть осуществлено путем локального, внутримышечного, парентерального, внутривенного, внутримиокардиального, перикардиального, эпикардиального или внутрикоронарного введения в целевую ткань сердечной мышцы. Предпочтительно, внутримиокардиальное, эпикардиальное, перикардиальное или внутрикоронарное введение осуществляют с использованием иглы или катетера. Предпочтительно, внутримышечная инъекция NV1FGF может быть осуществлена в дистальную бедренную мышцу и дистальную мышцу голени и в область, близкую и окружающую место ишемии. Кроме того, когда введение осуществляют путем прямой внутримиокардиальной инъекции, оно может быть осуществлено во время операции со вскрытием грудной клетки или с помощью катетера. Катетеры для доставки в сердце хорошо известны в данной области и включают, например, игольчатый катетер, как описано в патентах США 5045565 или 4661133, с расположением системы датчиков, как описано в патентах США 6254573 и 6309370. Альтернативные катетеры, имеющие спиральную иглу,описаны в патентах США 6346099 и 6358247. В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения вводят терапевтически эффективную-9 009390 дозу NV1FGF для реверсирования дефектов ангиогенеза в состоянии гиперхолестеринемии или диабета. Хотя эффективная доза будет варьировать в зависимости от массы и состояния конкретного субъекта,страдающего от дефектов ангиогенеза, в дополнение к гиперхолестеринемии или диабету в данной области предполагают определять подходящую дозу для конкретного субъекта и состояний. В соответствии с предпочтительным воплощением этого аспекта осуществляют лечение с использованием дозы плазмиды, составляющей приблизительно от 8000 до приблизительно 16000 мг, которую вводят путем множества инъекций, предпочтительно, 2-4 повторяющихся внутримышечных инъекцийNV1FGF с интервалом времени приблизительно 1-2 недели или более, при тяжелых состояниях дефектов ангиогенеза для стимуляции длительного образования коллатеральных сосудов и артериол, обеспечивая при этом возможность для реверсирования дефектов ангиогенеза, возникающих вследствие ишемии у млекопитающего, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом. Желательно вводить NV1FGF в ишемизированную ткань-мишень в составе фармацевтической композиции, которая включает фармацевтически приемлемый носитель и плазмиду NV1FGF. В контексте настоящего изобретения может быть использован любой подходящий фармацевтически приемлемый носитель, и такие носители хорошо известны в данной области. Выбор носителя будет определяться отчасти конкретным местом, в которое должна вводиться композиция, и конкретным способом, используемым для введения композиции. Препараты, подходящие для инъекции, включают водные и неводные растворы, изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворители, которые делают препарат изотоническим крови предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Препараты могут быть представлены в однодозовых или многодозовых запаянных контейнерах, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в замороженном-высушенном (лиофилизированном) состоянии, для которого требуется только добавление стерильного жидкого носителя, например воды, непосредственно перед применением. Растворы и суспензии для немедленной инъекции могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа. Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой забуференный физиологический раствор. Наиболее предпочтительно, фармацевтическая композиция включает раствор хлорида натрия (0,9%). В предпочтительном воплощении композицию по настоящему изобретению вводят совместно с низкомолекулярным гепарином (НМГ). Молекулы НМГ и способ приготовления хорошо известны в данной области и описаны, кроме того, в патентах США 5389618, 4692435 и 4303651, заявке на европейский патент ЕР 0040144 и Nenci GG (Vasc. Med, 2000; 5: 251-258), которые включены здесь путем ссылки. Во втором воплощении плазмиду, экспрессирующую FGF, инъецируют в скелетную мышцу пациента, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом, до или после применения электрической стимуляции к обработанной скелетной мышце. Электрическая стимуляция, используемая согласно этому воплощению, является такой, как описано в патенте США 2002/0031827, и применяется при напряжении и частоте, которые не вызывают сокращения скелетной мышцы, а также не причиняет боль пациенту,поскольку находятся ниже порога мышечного сокращения. Например, применяемая частота составляет приблизительно 50 Гц, а напряжение составляет приблизительно 0,1 В. Когда электрическую стимуляцию используют в комбинации с плазмидой, экспрессирующей FGF, она приводит в результате к синергическому превосходному эффекту в отношении увеличения кровотока. В третьем воплощении плазмиду, экспрессирующую FGF-1, которая представляет собой ВВ, доставляют в комбинации с одним или более чем одним фактором, стимулирующим ангиогенез. Без какоголибо ограничения ангиогенный фактор может включать PDGF-AA, M-CSF, GMCSF, VEGF-A, VEGF-B,VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, нейрофилин, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, ангиопоэтин 1,ангиопоэтин 2, 1 5 эритропоэтин, ВМР-2, ВМР-4, ВМР-7, TGF-бета, IGF-I, остеопонтин, плейотропин,активин, эндотелин-1 и их комбинации. Предпочтительно, NV1FGF инъецируют в скелетную или сердечную мышцу вместе с PDGFBB экспрессирующей плазмидой, и это приводит в результате к превосходному образованию коллатеральных кровеносных сосудов и артериол в состоянии гиперхолестеринемии или диабета. Таким образом, это воплощение относится к способу стимуляции коллатеральных кровеносных сосудов и артериол, включающему доставку NV1FGF и плазмиды, экспрессирующей PDGF-BB, в локальную область ткани в количестве, эффективном для индукции ангиогенеза в этой области ткани. Фактор(ы), стимулирующий(е) ангиогенез, доставляют путем экспрессии выделенной ДНК, кодирующей фактор, после доставки ДНК в локальную область ткани. Настоящее изобретение также относится к способу лечения патологий ЗПА и ОЗПА, ЗКА или ХСН(хронической сердечной недостаточности) у пациентов, дополнительно страдающих гиперхолестеринемией и диабетом. Нарушение кровоснабжения задних конечностей вследствие единичных или множественных окклюзий крупных кровеносных сосудов представляет собой причину ЗПА. На ранней стадии это приводит к дискомфорту в мышцах ноги при передвижении, приводящему на более поздних стадиях к изъязвле- 10009390 нию и гангрене (1). Хронические сердечно-сосудистые расстройства представляют собой отягощающие факторы для пациентов, уже страдающих ишемическими состояниями, такими как ЗПА, через механизмы, вовлекающие дисфункцию эндотелия (2, 3). Патологии, такие как гиперхолестеринемия, гипертензия и диабет, были исследованы в качестве возможных мишеней для разработки экспериментальных моделей ЗПА (4-7). Однако в таких моделях ишемии задней конечности критический момент заключается в том, чтобы избежать спонтанного ангиогенного ответа для того, чтобы обеспечить эффективность любого реваскуляризирующего лечения в попытке имитировать клиническое состояние ишемии задней конечности. Генетические модели гиперхолестеринемии также были использованы для оценки ангиогенных свойств в состояниях гиперхолестеринемии или диабета, однако в таких генетических моделях получают единичное изменение единичного рецептора (дефицит рецептора LDL (липопротеинов низкой плотности) у кроликов Watanabe, страдающих наследственной гиперлипидемией), или белка (дефицит гликопротеина АроЕ, приводящий в результате к увеличению уровней VLDL (липопротеинов очень низкой плотности) и LDL у мышей АроЕ-/-) и, по существу, не воспроизводят состояния патологии. В отличие от этого было продемонстрировано, что плазмида NV1FGF является особенно эффективной в реверсировании дефекта, вызванного гиперхолестеринемией, в животных моделях, которые хорошо сравнимы с патологическими состояниями, обнаруженными у пациентов. Действительно, причиной патологии является всеобщая липидная перегрузка в результате богатой холестерином диеты, имитирующей ситуацию, встречающуюся у пациентов с ЗПА, страдающих гиперхолестеринемией. Согласно настоящему изобретению было продемонстрировано, что NV1FGF является особенно эффективной для избавления от холестерининдуцированного нарушения ангиогенеза у пациентов, страдающих ЗПА, путем стимуляции роста как коллатеральных сосудов, так и артериол. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ стимуляции роста как коллатеральных кровеносных сосудов, так и артериол в ишемизированных тканях, в которых нарушена эндотелиальная функция. Как показано в нижеследующих примерах, NV1FGF способна эффективно индуцировать образование зрелых сосудов с высокой степенью проводимости (коллатеральных сосудов диаметром более 150 мкм) и артерий с малым сопротивлением (артериол диаметром менее 50 мкм) в пораженных ишемией мышцах задней части бедра, которые необходимы для транспорта и доставки крови к тканям. Индукция таких зрелых сосудов представляет собой особенно эффективное лечение в наиболее тяжелых случаях, когда негативные дефекты ангиогенеза вызваны гиперхолестеринемией или диабетом. Рост как коллатералей, так и артериол представляет особый интерес в терапевтическом ангиогенезе. Действительно, коллатерали представляют собой сосуды, образующие мостики между артериальными сетями, тогда как артериолы представляют собой зрелые сосуды, образованные из слоя эндотелиальных клеток, стабилизированных клетками стенки (перициты или гладкомышечные клетки), обеспечивающие основной поток к ткани. Таким образом, капиллярные сети зависят от их присутствия для обеспечения распределения потока (Carmeliet et al., Nat. Med., 2000; 6: 389-395; Van Royen et al., Cardiovasc. Res.,2001; 49: 543-553). Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ стимуляции ангиогенеза при условии, что VEGF не активируется в обработанных клетках. В следующих примерах продемонстрировано, что внутримышечное введение NV1FGF путем инъекции не приводит к локальной индукции мышиного VEGF-A в инъецированных мышцах, а также не приводит к секреции мышиного VEGF-A в циркулирующую кровь инъецированной мыши. Это является важным аспектом настоящего изобретения, который связан с новым способом стимуляции роста коллатеральных кровеносных сосудов и артериол без индукции фактора в VEGF-A-независимом пути. В действительности хорошо известно, что VEGF-A вызывает серьезные негативные побочные эффекты, такие как беспорядочный нежелательный ангиогенез, отек и вероятность образования опухоли. В данном изобретении сделаны ссылки на различные публикации, патенты и заявки на патенты. Сущность и описание этих публикаций, патентов и заявок на патенты во всей их полноте включены в данное изобретение путем ссылки, чтобы более полно описать состояние уровня техники, к которому относится настоящее изобретение. Также понятно и ожидается, что принципы изобретения, раскрытые в данном описании в примерном воплощении, могут быть изменены специалистом в данной области, и подразумевается, что такие модификации, изменения и замены должны быть включены в объем настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Животные и диета. В экспериментах использовали сирийских золотистых хомячков (n=50) в возрасте 11-12 недель(CERJ, Le Genest St Isle, France). Животным давали возможность акклиматизироваться в стандартных условиях по меньшей мере за 7 суток до начала протокола исследования. Все животные имели свободный доступ к воде в течение всех экспериментов. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом Aventis Pharma по использованию животных (Animal Use Committee of Aventis Pharma) и проводились в соответствии с указаниями, опубликованными Национальным институтом здоровья (National Insti- 11009390tute of Health) (публикация NIH85-23, переработана в 1985 г.). В эксперименте 1 хомячков (n=37) случайным образом распределяли на три группы (фиг. 1). Хомячков в группе с низким уровнем холестерина (НХ) (n=13) кормили ad libitum стандартным кормом(ссылка А 04-С, UAR, Epinay-sur-Orge, France). Хомячкам в обеих группах с высоким содержанием холестерина (ВХ) в течение 21 суток (ВХ/21) и 28 суток (ВХ/28) после обработки (ВХ/21: n=12; ВХ/28: n=12) ежесуточно давали обогащенную холестерином диету в количестве 20 г на животное, приготовленную из стандартного корма, дополненного 3% холестерина и 15% масла какао (ссылка 1414 С, UAR, Epinay-surOrge, France). В эксперименте 2 хомячков (n=13) случайным образом распределяли на две группы (фиг. 1). Хомячков в группе с физиологическим раствором (n=5) и в группе с NV1FGF (n=8) кормили обогащенной холестерином диетой, как описано в эксперименте 1. Пример 2. Индукция ишемии задней конечности. Через 35 суток НХ- или ВХ-диеты животных подвергали ишемии задней конечности согласно следующей хирургической процедуре. Ишемию задней конечности индуцировали под анестезией газом N2O(0,8 л/мин), О 2 (0,4 л/мин) и изофлуораном (2%) согласно процедуре, описанной для других видов животных (19, 20). В стерильных хирургических условиях осуществляли продольный разрез по средней линии бедра правой задней конечности от паховой связки до точки, находящейся проксимально относительно коленной чашечки. Через этот разрез, используя хирургические петли, иссекали бедренную артерию и ее основные ветви коагулировали. Бедренную артерию полностью иссекали, начиная от ее проксимальной точки, в виде ветви внешней подвздошной артерии до точки, располагающейся дистально,где она разветвляется на подкожную и подколенную ветви (20). Разрез закрывали в один слой с помощью шелковой проволоки 4,0. Пример 3. Генный перенос в скелетные мышцы задней конечности. В эксперименте 2 случайным образом вводили физиологический раствор (n=5) или плазмиду, кодирующую NV1FGF (180 мкг ДНК, n=8), через 14 суток после индукции ишемии с помощью трех инъекций по 50 мкл каждая в мышцы Tibialis cranialis, Adductores и Quadriceps ишемизированной конечности. Пример 4. Измерения уровней общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови. На -35, -7 и +21 или +28 сутки от дня проведения хирургической операции получали кровь от хомячков из групп ВХ/21, ВХ/28, из группы, которой вводили физиологический раствор, и из группы, которой вводили NV1FGF, посредством ретроорбитальной пункции под анестезией газом N2O (0,8 л/мин),O2 (0,4 л/мин) и изофлуораном (2%). Уровни общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови определяли ферментативно с использованием имеющихся в продаже наборов (Olympus DiagnosticaGmbH, Hamburg, Germany). Пример 5. Количественный анализ образования коллатеральных сосудов посредством ангиографии. На 21 (группа ВХ/21) или 28 сутки (группы НХ, ВХ/28, группа, которой вводили физиологический раствор, и группа, которой вводили NV1FGF) после индукции ишемии проводили ангиографическую процедуру в соответствии со следующим. Непосредственно после инъекции приблизительно 300 мкл контрастной среды (0,5 г/мл раствора сульфата бария в воде) через катетер, вставленный в брюшную аорту, хомячков умерщвляли избыточной дозой фенобарбитала натрия. Хомячков помещали в положение лежа на спине в аппарат для радиографии (модель МХ-20, Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL, USA) и получали и оцифровывали посмертные картины сосудистой системы обеих конечностей (программное обеспечение Specimen, DALSA MedOptics, Tucson, AZ, USA). Эта радиографическая система позволяет визуализировать сосуды диаметром более 150 мкм. Картины были проанализированы в автономном режиме исследователем, который не располагал информацией об обработке, с помощью предназначенного для этого программного обеспечения,как описано ранее (22). Кратко и для ишемизированных, и для неишемизированных конечностей определяли протяженность коллатеральных сосудов с задней стороны бедра в виде процентного отношения от проанализированной площади. Ангиографическую оценку рассчитывали как процентное соотношение ишемизированной ткани к неишемизированной. Для проверки пригодности этого способа ангиографическую оценку проводили для шести отдельных, сопоставимых по возрасту, хомячков, не подвергнутых ишемии задней конечности. Как ожидали, ангиографическая оценка, рассчитанная как соотношение процентных величин для правой конечности/левой конечности, составляла 1,040,18, что отражало сходную васкуляризацию в обеих конечностях. Пример 6. Количественный анализ образования артериол посредством иммуногистохимии и типичные мышечные поражения, индуцированные ишемией задней конечности после иссечения бедренной артерии у хомячков, страдающих гиперхолестеринемией. На 21 (группа ВХ/21) или 28 (группы НХ, ВХ/28, группа, которой вводили физиологическим раствором, и группа, которой вводили NV1FGF) сутки после индукции ишемии скелетные мышцы извлекали из ишемизированной задней конечности и фиксировали в растворе 3,7% формалина в PBS. Образцы мышц из неишемизированных конечностей получали аналогичным образом и использовали в качестве контрольных мышц. Два поперечных среза, состоящих из различных мышц (Gracilis, Semimembranosus,- 12009390Adductores, Semitendinosus, Biceps femoris), готовили из задней части каждого бедра. Срезы обезвоживали, заливали парафином и готовили срезы толщиной 5 мкм для иммуногистохимии. Мышиное моноклональное антитело против гладкомышечного -актина (SMA; клон 1 А 4, разведение 1:200, Dako, Carpinteria, CA, USA) использовали в качестве маркера гладкомышечных клеток сосудов (ГМКС), поскольку он конститутивно экспрессируется в зрелых сосудах. Антитело к SMA обнаруживали с помощью имеющегося в продаже набора (Envision+System/Horse Radish Peroxidase, Dako, Carpinteria, CA, USA) посредством авидин-биотин-пероксидазного способа. SMA-положительные (SMA+) сосуды ранжировали по размеру (внешний диаметр) и артериолы диаметром менее 50 мкм подсчитывали в мышцах Adductors иGracilis. Эти мышцы были выбраны по их чувствительности к гистопатологическим поражениям в используемой авторами модели ишемии задней конечности у хомячков, в противоположность другим мышцам,расположенным в задней части бедра (Semitendinosus, Semimembranosus и Biceps femoris). Типичные поражения, индуцированные иссечением бедренной артерии, представлены на фиг. 2. Мышцы задней части бедра, т.е. Gracilis и Adductors, извлекали на 28 сутки после индукции ишемии и исследовали срезы мышц толщиной 5 мкм после HES-окрашивания. На фиг. 2 Б и 2 В показано соответственно наличие умеренного некроза (пунктирная линия) и центронуклеации (стрелки) в ишемизированных мышцах. На фиг. 2 А показан поперечный срез неишемизированных контралатеральных мышц, не имеющих поражений, в качестве контроля при увеличении Х 100. Общую площадь мышц Adductores иGracilis определяли для исследования влияния ишемии на объем мышцы. Количество SMA+ артериол определяли для общей площади мышцы. Для обоих параметров затем рассчитывали соотношение величин для ишемизированных/неишемизированных тканей. Все процедуры осуществлялись исследователем,который не располагал информацией об обработке. Пример 7. Экспрессия FGF-1 после генного переноса NV1FGF в ишемизированные мышцы. В эксперименте 2 через 14 суток после инъекции физиологического раствора или генного переносаNV1FGF (т.е. через 28 суток после индукции ишемии) мышцы задней части бедра (Gracilis и Adductores) неишемизированных и ишемизированных конечностей обрабатывали в соответствии со следующим. Иммуногистохимию в отношении FGF-1 осуществляли с использованием классического стрептавидинбиотинового анализа, используемого для обнаружения экспрессии FGF1. После инкубации с первичным поликлональным кроличьим антителом против FGF-1 (ссылка АВ-32-NA, разведение 1:30, RD Systems,Abingdon, UK) следовала инкубация с биотинилированным ослиным иммуноглобулином против кроличьих антител (разведение 1:200, Amersham, Buckinghamshire, UK). Иммунные комплексы локализовали с использованием хромогенного диаминобензидинового субстрата после добавления пероксидазы, связанной со стрептавидином. Срезы толщиной 5 мкм подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином, обезвоживали и заключали в постоянную среду для заливки. Иммунореактивные волокна идентифицировали (коричневое окрашивание) под микроскопом (Axioplan 2, Zeiss, Hallbergmoos, Germany). Статистический анализ. Результаты выражали как среднее значениестандартное отклонение (СО). Статистическую значимость принимали при p0,05. В эксперименте 1 уровни липидов в сыворотке крови в группах ВХ/21 и ВХ/28 сравнивали в различные моменты времени с помощью ANOVA с повторной проверкой согласно Таки-Крамеру (TukeyKramer) для сравнения любых 2 значений. Ангиографические оценки, рассчитанные в группах НХ,ВХ/21 и ВХ/28, сравнивали с помощью ANOVA с повторной проверкой согласно Таки-Крамеру. Величины площади мышцы и количество SMA-положительных артериол для неишемизированных и ишемизированных тканей, а также соответствующие отношения сравнивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента в группах ВХ/21 и ВХ/28. В эксперименте 2 уровни липидов в сыворотке крови в группах, которым вводили физиологический раствор и NV1FGF, сравнивали в различные моменты времени с помощью ANOVA с повторной проверкой согласно Таки-Крамеру для сравнения любых 2 значений. Ангиографические оценки, величины площади мышцы и количество SMA-положительных артериол для неишемизированных и ишемизированных тканей, а также соответствующие отношения сравнивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента в группах, которым вводили физиологический раствор и NV1FGF. Пример 8. Измерение уровней липидов в сыворотке крови для диеты с низким уровнем холестерина и диеты, обогащенной холестерином. В табл. 1 и 2 обобщены уровни липидов в сыворотке крови соответственно в эксперименте 1 и эксперименте 2 перед тем, как начинали давать диету, обогащенную холестерином (сутки -35), и в различные моменты времени после модификации диеты (сутки -7 и +21 или +28). Диета, обогащенная холестерином, приводила со временем к увеличению уровней общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови. Н.П.: не применимо.p0,001 относительно величины перед диетой. Н.П.: не применимо.p0,01 относительно величины перед диетой.p0,001 относительно величины перед диетой. Пример 9. Влияние обогащенной холестерином диеты на развитие коллатеральных кровеносных сосудов и плотность артериол после ишемии задней конечности (эксперимент 1). Как показано на фиг. 3, образование коллатеральных кровеносных сосудов на 28 сутки после ишемии задней конечности было высоким в группе НХ (фиг. 3 А), что приводило к ангиографической оценке 0,930,45 (фиг. 3 Г). Наоборот, в обеих группах ВХ образование коллатеральных кровеносных сосудов было резко нарушено на 21 или 28 сутки после ишемии задней конечности, при этом ангиографические оценки уменьшались соответственно до 0,350,38 и 0,370,21 (см. фиг. 3 Б и 3 В). Уменьшение ангиографической оценки было значимым в обеих группах ВХ по сравнению с группой НХ (p0,01). Однако ангиографические оценки не различались между группами ВХ/21 и ВХ/28 (p0,05), как показано на фиг. 3 Г. На фиг. 4 А-Г представлены типичный поперечный срез при увеличении Х 100, изображающий зрелые сосуды, меченные иммуногистохимически против гладкомышечного -актина (SMA), из неишемизированных и ишемизированных мышц (Adductores и Gracilis), извлеченных на 21 или 28 сутки после индукции ишемии, и количественный анализ площади мышц и SMA-положительных артериол диаметром менее 50 мкм. Как показано на фиг. 4 Д, Е, площадь мышц Adductores и Gracilis уменьшалась в ишемизированной конечности по сравнению с неишемизированной конечностью на 21 сутки после ишемии (p0,01). Хотя не удалось достичь статистической значимости (p=0,0538), такая же тенденция наблюдалась на 28 сутки после ишемии задней конечности. Кроме того, количество артериол диаметром менее 50 мкм значительно уменьшалось в ишемизированной конечности по сравнению с неишемизированной конечностью(p0,01) и на 21, и на 28 сутки после ишемии. Несмотря на эти статистические уровни значимости, на промежуточных стадиях расчета плотности артериол сама плотность не отличалась на 21 и 28 сутки после начала модификации диеты. Площадь мышц, SMA+ артериолы и плотность артериол, выраженные- 14009390 как соотношения для ишемизированной/ неишемизированной конечности, не различались на 21 и 28 сутки. Эти результаты ясно демонстрируют, что гиперхолестеринемия индуцирует ингибирование развития коллатеральных кровеносных сосудов и хроническое ангиогенное расстройство на макро- и микрососудистом уровнях, что было количественно определено с помощью ангиографии, и артериол диаметром менее 50 мкм, что было количественно определено гистологическими способами в течение того же периода, а именно на 21 и 28 сутки после ишемии задней конечности (фиг. 2 Б и 2 В). Кроме того, хомячки, страдающие от гиперхолестеринемии, используемые в этом исследовании,представляли собой особенно строгую модель, поскольку липидная перегрузка, применяемая в описанной авторами модели, была увеличена и очевидно приводила в результате к эндотелиальной дисфункции и дефектам ангиогенного ответа после ишемии задней конечности. Кроме того, гистопатологический анализ артерий, извлеченных из хомячков через 4 недели после начала приема обогащенной холестерином диеты, выявил наличие пенистых клеток. Кроме того, происходило постоянное увеличение уровней общего холестерина и триглицеридов, которое продолжалось в течение периода восстановления после ишемии задней конечности, что приводило, таким образом, к тому, что модель представляет собой самый худший сценарий с точки зрения тяжести нарушения эндотелия и дефектов ангиогенеза. Пример 10. Влияние генного переноса NV1FGF на развитие коллатеральных кровеносных сосудов и плотность артериол через 14 суток после внутримышечного введения (т.е. на 28 сутки после ишемии задней конечности) у хомячков, страдающих гиперхолестеринемией (эксперимент 2). Как показано на фиг. 5 Б, внутримышечный генный перенос NV1FGF на 14 сутки после индукции ишемии задней конечности значительно улучшал образование коллатеральных кровеносных сосудов в ишемизированной конечности по сравнению с хомячками, которым вводили физиологический раствор(фиг. 5 А). Кроме того, ангиографическая оценка после генного переноса NV1FGF (0,750,47) действительно была значительно выше (p0,01), чем ангиографическая оценка хомячков, которым вводили физиологический раствор (0,220,05). На фиг. 6 А и 6 Б представлены типичные поперечные срезы (увеличение Х 100), изображающие зрелые сосуды, меченные иммуногистохимически гладкомышечным -актином (SMA), из ишемизированных мышц хомячков, которым вводили физиологический раствор и NV1FGF, и количественный анализ площади мышц и SMA-положительных артериол диаметром менее 50 мкм. Наблюдали уменьшение площади мышц Adductores и Gracilis в ишемизированной задней конечности в группах, которым вводили как физиологический раствор, так и NV1FGF (p=0,2404 и p=0,0846 соответственно). Как показано на фиг. 6 В и 6 Г, площадь мышцы, выраженная как соотношение для ишемизированной/неишемизированной конечности, была сходна в группах, которым вводили физиологический раствор и NV1FGF (p=0,4584). Количество артериол диаметром менее 50 мкм значительно уменьшалось в ишемизированной конечности по сравнению с неишемизированной конечностью (p=0,0333) у животных, которым вводили физиологический раствор, тогда как это различие было незначительным в группе,которой вводили NV1FGF (p=0,1347). Расчет соотношения для ишемизированной/неишемизированной конечности выявил статистически более высокое значение в NVIFGF-обработанных мышцах по сравнению с мышцами, обработанными физиологическим раствором (p=0,0187). Однако плотность артериол не отличалась в мышцах неишемизированной и ишемизированной конечностей для обеих групп (p=0,9320 иp=0,1586 для групп, которым вводили соответственно физиологический раствор и NV1FGF). Плотность артериол, выраженная как соотношение для ишемизированной/неишемизированной конечности, не отличалась в группах, которым вводили физиологический раствор и NV1FGF (p=0,2724). Пример 11. Экспрессия FGF-1 в ишемизированных мышцах после генного переноса NV1FGF. В противоположность генной терапии, вовлекающей другие ангиогенные факторы, такие как VEGF или FGF-2, авторы изобретения показали, что экспрессия FGF-1 была преимущественно ограничена ишемизированными мышцами животных, которым вводили NV1FGF. Кроме того, как показано типичными картинами (увеличение Х 100) иммуногистохимического окрашивания с использованием поликлонального антитела против FGF-1 в мышцах задней части бедра(Gracilis и Adductores) неишемизированных (контралатеральных) неинъецированных конечностей (фиг. 7 А) и ишемизированных конечностей, в которые вводили физиологический раствор (фиг. 7 Б) илиNV1FGF (на фиг. 7 В), экспрессия FGF-1 не могла быть неожиданно обнаружена ни в ишемизированных мышцах животных, которым вводили физиологический раствор, ни в неишемизированных (контралатеральных) мышцах животных, которым вводили физиологический раствор и NV1FGF. Это ясно демонстрирует превосходные свойства плазмиды NV1FGF, которая делает возможным медленное высвобождение кодируемого белка FGF-1 в терапевтическом окне, достаточном для того, чтобы вызвать длительный ангиогенный ответ через образование зрелых кровеносных сосудов, но в концентрации, которая не приводит к распространению и беспорядочному ангиогенезу или негативным побочным эффектам. Таким образом, было доказано, что NV1FGF является особенно эффективной, поскольку обладает способностью эффективно стимулировать ангиогенез при недетектируемой концентрации в обработанных мышцах, делая возможным, таким образом, применение концентраций NV1FGF, находящихся в пределах- 15009390 терапевтического окна, и в состояниях, характеризующихся отягощенными эндотелиальными дисфункциями. Благодаря таким превосходным характеристикам с точки зрения безопасности и эффективности,NV1FGF может быть преимущественно использована в ангиогенной терапии при отягощенных состояниях, вызванных гиперхолестеринемией или диабетом. Эти результаты ясно демонстрируют, что генная терапия с использованием NV1FGF способна избавлять от нарушения путем увеличения роста коллатеральных кровеносных сосудов и артериол. Действительно, рост коллатеральных сосудов диаметром более 150 мкм был доказан ангиографически, а рост артериол диаметром менее 50 мкм был доказан посредством иммуногистохимии в задней части бедра,включающей мышцы Biceps femoris, Adductores, Gracilis, Semimembranosus и Semitendinosus. Неожиданно, заявитель продемонстрировал, что образование коллатеральных сосудов значительно стимулировалось в этом участке через 14 суток после генного переноса NV1FGF, что подчеркивается ангиографической оценкой (фиг. 5 В). Хотя никаких измерений in situ насыщения ткани кислородом не было проведено для того, чтобы доказать, что в этом участке наблюдалась ишемия после иссечения бедренной артерии, было обнаружено наличие гистологических повреждений, таких как центронуклеация, дистрофия, некроз и воспаление(фиг. 2). Более конкретно, эти повреждения были ограничены мышцами Adductors и Gracilis, тогда как мышцы Biceps femoris, Semimembranosus и Semitendinosus не были подвержены повреждениям. Таким образом, количественный анализ артериол диаметром менее 50 мкм осуществляли исключительно в мышцах Adductors и Gracilis, непосредственно над каналом приводящей мышцы. Как показано на фиг. 6 Г, генный перенос NV1FGF приводил к увеличению абсолютного количества артериол в этих мышцах ишемизированной конечности. Таким образом, эти данные однозначно демонстрируют способность NV1FGF индуцировать образование зрелых сосудов с высокой проводимостью (коллатеральных сосудов диаметром более 150 мкм) и артерий с небольшим сопротивлением (артериолы диаметром менее 50 мкм) в пораженных ишемией мышцах задней части бедра, которые необходимы для транспорта и доставки крови к тканям. Пример 12. Отсутствие индукции VEGF-A в NV1FGF-обработанных мышцах. Цель этого эксперимента заключалась в определении in vivo индукции VEGF-A после внутримышечного (в/м) введения мышам "голой" ДНК, кодирующей FGF-1 крысы. Исследовали как уровни циркулирующего мышиного VEGF-A (mVEGF-A), так и локальную экспрессию генов. Циркулирующие уровни измеряли с помощью ELISA (иммуноферментного анализа) на 3 и 7 сутки после в/м введения дозы, а локальную генную экспрессию mVEGF-A исследовали на 7 сутки, используя два анализа: иммуногистохимию (ИГХ) против белка и обнаружение мРНК с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в режиме реального времени (ОТ-ПЦР). В этом исследовании использовали 40 самок мышей. Группы с 1 по 3 (n=8 в группе) получали в/м введения соответственно pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1, pCOR-CMV.Empty (без гена FGF-1) или 0,9% NaCl в правую и левую мышцы Tibialis Cranialis. pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1 соответствует плазмиде NV1FGF, в которой FGF-1 человека был замещен на соответствующую кодирующую последовательность из крысы. Инъецированные мышцы извлекали на 7 сутки после введения дозы и подвергали иммуногистохимии в отношении VEGF-A и FGF-1 (правые мышцы) или ОТ-ПЦР в отношении mVEGF-A (левые мышцы). В группах 1-3 кровь отбирали на 3 (сутки-3) и 7 (сутки-7) сутки после введения дозы для обнаруженияmVEGF-A с помощью ELISA в свежеприготовленных образцах сыворотки крови. Как показано на фиг. 8, никаких FGF-1 положительных миофибрилл не было обнаружено ни в мышцах, в которые инъецировали pCOR-CMV.Empty I (фиг. 8 Б), ни в мышцах, в которые инъецировалиNaCl (фиг. 8 В). В среднем 25 миофибрилл, экспрессирующих FGF-1/срез определяли в мышцах, инъецированных pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1 (фиг. 8 Д). С использованием иммуногистохимии похожее и слабое мечение mvVEGF-A было обнаружено в обеих группах контрольных мышц (NaCl и pCOR-CMV.Empty), что указывало на эндогенную экспрессию mVEGF-A. Иммуноокрашивание, локализованное в миофибриллах, продемонстрировало мозаичную картину, поскольку некоторые волокна были более интенсивно мечены по сравнению с другими. В мышцах, инъецированных pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1, не наблюдали никакого увеличения иммунного мечения в отношении mVEGF-A на 7 сутки после введения дозы (фиг. 8 Г) по сравнению с мышцами, инъецироваными pCOR-CMV.Empty или NaCl. Наблюдали такую же мозаичную картину иммунного окрашивания. Используя технологию ОТ-ПЦР в реальном времени в мышцах, в которые вводили pCORCMV.Empty и NaCl, были показаны сходные уровни экспрессии мРНК mVEGF-A (6,84103 и 4,31103 копий кДНК на 2 нг общей РНК), что свидетельствовало об эндогенной экспрессии mVEGF-A. В мышцах, в которые инъецировали pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1, не наблюдали никакого увеличения уровня мРНКmVEGF-A (6,51103 копий кДНК на 2 нг общей РНК) на 7 сутки после введения дозы по сравнению с мышцами, инъецированными pCOR-CMV.Empty или NaCl. Эти результаты ясно показывают, что внутримышечное введение pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1 не привело к локальной индукции mVEGF-A в инъецированных мышцах и не привело к секреции mVEGF-A в- 16009390 циркулирующую кровь инъецированных мышей. Пример 13. Животная модель заболевания коронарной артерии на кроликах Watanabe. Проверка продукта генной терапии в качестве возможного средства лечения частично основана на его биологической активности. Для того чтобы оценить это, выбранная животная модель должна быть похожа, насколько это возможно, на заболевание человека, которое она имитирует, поскольку это касается анатомии и функции. Анатомическая релевантность основана на используемых видах, которые должны иметь сердце, по возможности сходное с человеческим, поскольку это касается коронарной сети. Кроме того, чем больше виды, тем лучше, поскольку это облегчает различные технические стадии. С другой стороны, рассматривают такие факторы, как стоимость, легкость в обращении, непредвиденное состояние животного и его податливость. Наилучший компромисс, найденный в настоящем исследовании, представляет собой кролик, который достаточно мал для того, чтобы быть легким в обращении, и которому легко делать уколы,но достаточно большой для того, чтобы обеспечить хорошее распознавание конкретной артерии, точную коронарографию и сравнимые с человеком различные анатомические и функциональные аспекты. Действительно, функциональная релевантность основана на способности животного развивать патологию, максимально напоминающую патологию у человека, т.е. ангиогенные дефекты, ассоциированные с гиперхолестеринемией. Гиперхолестеринемия у людей вызывает дисфункцию эндотелия сосудов и в конечном итоге прогрессирующее сужение основных коронарных артерий. Дисбаланс коронарного кровотока в состоянии покоя и во время стресса вызывает скрытое нарушение функции миокарда, которое приводит к боли и уменьшенной сократимости. Как правило, снабжение в состоянии покоя достаточно, но, когда возникает стресс, потребность возрастает, тогда как снабжение не может увеличиться вследствие обструктивных коронарных поражений. Это является причиной того, почему цель имитации этой человеческой патологии приводит к началу стеноза основной коронарной артерии и применению стресс-теста для выявления дисбаланса, вызванного этим стенозом при стрессе. Поэтому кроликов Watanabe с врожденной гиперлипидемией (WHHR), у которых отсутствует рецептор LDL, развивающих спонтанный атеросклероз, приводящий к образованию коронарной атеромы,использовали для оценки ишемии и эффекта на их ишемический статус внутримиокардиальных инъекций NV1FGF во время операции со вскрытием грудной клетки. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по содержанию и использованию животных (Animal Care and Use Committee), и следовали указаниям NIH по использованию и содержанию лабораторных животных. Кроликов WHH в возрасте одного года и с массой от 3000 до 3500 г получали из Covance (PO Box 7200, Denver, PA, 17517, USA). Всех животных содержали в помещениях для животных в соответствии с хорошей практикой содержания животных в течение по меньшей мере восьми суток перед их использованием. В течение этого периода их содержали по одному животному в клетке, они имели свободный доступ к корму (тип 112 С из UAR) и соответствующим образом отфильтрованной питьевой воде. В помещении для животных поддерживали 12-ч цикл свет/темнота (свет с 6 ч утра) при температуре окружающей среды 20-24 С и влажности 35-75%. Кролики Watanabe имели уровни холестерина в 7-10 раз выше, чем кролики дикого типа, тогда как их уровни триглицеридов были в 4-5 раз выше по сравнению с нормальными кроликами. После умерщвления четырех из них подвергали окрашиванию масляным красным, которое свидетельствует о наличии липидных бляшек в аорте, коронарных отверстиях и митральных клапанах. Кроме того, одного из кроликов подвергали гистологическому анализу. Микроскопическое исследование окрашенных HES срезов огибающей коронарной артерии идентифицировало атеросклеротические бляшки, покрывающие приблизительно 15% просвета у одного из двух исследованных кроликов(кроликCAD98R2, см. фиг. 9 Б). Кролик Watanabe с врожденной гиперлипидемией обладает двумя интересными особенностями: размер его сердца хорошо подходит для многократных внутримиокардиальных инъекций, и его коронарная сеть усеяна атеросклеротическими бляшками. Последнее обстоятельство объясняет, почему коронарный кровоток является нормальным в состоянии покоя (как определено с помощью нормальной ЭКГ и нормальной сократимости), тогда как стресс-тест с использованием добутамина под анестезией приводит к отчетливой картине ишемии. Фактически оба анализа, например электрокардиография и эхокардиография, указывают на признаки стресса, которые могут сравниваться с аналогичными симптомами у людей, например снижение сегмента ST или гипокинез. Пример 14. Операция. Операцию использовали для доставки продукта генной терапии в миокард путем прямой инъекции. Хирургическую процедуру осуществляли в стерильных условиях. Животных анестезировали внутримышечной инъекцией (1 мл/кг) смеси кетамина (70 мг/кг) + ксилазина (7 мг/кг). После того как животные были побриты, их обрабатывали 5% аэрозолем лидокаина в гортань, чтобы облегчить эндотрахеальную(Siemens, Servo Ventilator 900D) со следующими параметрами: Вдуваемый объем 1,4 л/мин Частота дыхания 40/мин Галотан 0,4-0,6% Кислород 30-35% Катетеризацию краевой ушной вены осуществляли таким образом, что животному постоянно вливали 5% глюкозы. Мониторинг посредством ЭКГ использовали для обеспечения стабильного ритма в процессе хирургической процедуры. Осуществляли левую торакотомию в четвертом межреберном пространстве. После вскрытия перикарда осуществляли инъекцию плазмиды в сердце. Инъекции осуществляли в 13 различных участках свободной стенки левого желудочка с помощью самодельной иглы: шприца Hamilton объемом 250 мкл, соединенного с катетером Steriflex G19 (ссылка 167.10), зафиксированным с помощью короткой конической иглы BD(26G3/8). Авторы изобретения инъецировали по 25 мкл 1 мг/мл раствора плазмиды в каждый участок. На фиг. 1 А показано положение каждого участка инъекции. После инъекций в грудную полость помещали дренажную трубку и ребра располагали рядом с помощью двух нитей Mersurtures (1,0). Подачу галотана прекращали, а кислород поддерживали до тех пор, пока животное не проснется. Дренаж устанавливали примерно 200-400 мбар (20-40 МПа) в процессе закрывания грудной клетки. Два слоя мышц закрывали с помощью нити Vicryl (4,0). Затем сшивали кожу с помощью нити Suturamide (2,0). После того как был сделан последний шов, но до удаления дренажной трубки, положительное концевое давление выдоха (PEEP) увеличивали в легких с помощью механического вентилятора для того, чтобы легкие хорошо продувались в грудной клетке непосредственно перед извлечением дренажной трубки. Наносили бетадиновый гель и на рану надевали повязку. После пробуждения животного механический вентилятор останавливали. Пример 15. Послеоперационная обработка. Как только животные просыпались, им инъецировали следующие соединения: агент против агрегации и антикоагулянт для того, чтобы избежать возможного тромбоза коронарной артерии во время и после хирургической операции: 0,375 мл веталгина (за сутки до операции и затем в течение 5 суток): внутримышечно,0,1 мл гепарина (в течение 4 суток начиная со следующего дня после операции): подкожно; антибиотик широкого спектра действия для предупреждения каких-либо инфекций: 0,2 мл байтрила (Baytryl) 2% (в течение 5 суток): подкожно; сильный анальгетик для того, чтобы животное перенесло тяжелую хирургическую процедуру: 0,5 мл морфина (в течение 2 суток): подкожно. Пример 16. Электрокардиография. Электрокардиографию проводили максимально приближенно к ее эквиваленту у людей. Четыре электрода размещали на четырех конечностях и шесть электродов (V1-V6) размещали на прекордии. Классическую ЭКГ с 12 отведениями регистрировали на HP Pagewriter II 4565 А. Применение ЭКГ позволяло контролировать (1) сердечный ритм во время операции, (2) сердечный ритм во время стресстеста с использованием добутамина, (3) обнаружение инфаркта миокарда и (4) обнаружение признаков ишемии. 16.1. Контроль сердечного ритма во время хирургической операции. Операция со вскрытием грудной клетки с общей анестезией потенциально может приводить к различным проблемам в процессе ее выполнения, которые могут быть обнаружены с помощью ЭКГ мониторинга. Брадикардию лечили инъекцией атропина, аритмию - инъекцией 0,5% лидокаина (от 0,5 до 1 мл) и остановку сердца - энергичной сердечно-легочной реанимацией, включающей изопреналин. 16.2. Контроль сердечного ритма во время стресс-теста с использованием добутамина. Даже если основное фармакологическое действие добутамина состоит в его влиянии на инотропию,этот продукт также, по-видимому, является хронотропным, и, таким образом, увеличение сердечного ритма, по-видимому, представляет собой самый легкий путь контроля за стресс-тестом. 16.3. Обнаружение инфаркта миокарда. Электрическую активность сердца регистрировали в виде последовательности сокращений, каждое из которых представляет собой последовательность зубцов: р, q, r, s и t для наиболее важной части. Зубец р использовали в качестве показателя атриальной активности, комплекс qrs - в качестве показателя вентрикулярной активности и зубец t - качестве маркера реполяризации. Наиболее классическим ЭКГ признаком инфаркта миокарда у людей является глубокий и крупный зубец q. Можно провести параллель с кроликами, поскольку анализ пробных групп кроликов продемонстрировал наличие такого зубца q у большинства из них, когда они претерпевали механическое закрытие коронарной артерии.- 18009390 16.4. Обнаружение признаков ишемии. Это скрытое явление обычно не обнаруживают в состоянии покоя. Во время стресс-теста были описаны различные модификации. Авторы выдвинули предположение, что сердце кролика демонстрирует такую же электрическую картину, когда оно претерпевает такой же механический/химический стресс. Фактически реальная ишемия у людей приводит к подъему или снижению сегмента ST или/и инверсии зубца Т (фиг. 10). Два основных признака представляют собой снижение сегмента ST и глубина отрицательного зубца Т, как показано на фиг. 10 во время стресс-теста у людей. Пример аналогичного показателя у кроликов представлен на фиг. 11. Способ оценки признаков ишемии представлен на фиг. 12. На фиг. 12 приведена и зарегистрирована шкала от 0 (нормальная ЭКГ) до 3 (значительная ишемия) для каждого отведения. Наличие значительного отклонения в каком-либо отведении так же важно, как и количество отведений, в которых было обнаружено отклонение. Таким образом, сначала регистрировали сумму всех баллов, затем только наибольший балл, обнаруженный на конкретной ЭКГ, сохраняли и использовали для включения ишемизированных животных. Единственными исключающими критериями было наличие зубца q (более чем 1 квадрат и глубже 3 квадратов), указывающего на трансмуральный некроз. Типичная нормальная ЭКГ с 12 отведениями в состоянии покоя представлена на фиг. 13 А, тогда как то же самое животное в состоянии максимального стресса (см. фиг. 13 Б) демонстрировало значительное нисходящее снижение в отведении I, II, aVF, V1, V2, V3, V4 и незначительное снижение в отведении III,V5 и V6. Эта конкретная ЭКГ показала очень сильную ишемию. В заключение, ЭКГ представляла собой самый лучший первичный способ обнаружения как исключающих критериев (т.е. некроза), так и включающих критериев (ишемический ответ на добутамин). Примеры 17. Эхокардиография.Acuson Sequoia 256 и линейный зонд 8L5 8 МГц использовали для оценки сократимости миокарда,поскольку небольшой размер грудной области кролика позволял использовать этот поверхностный зонд в этом конкретном анализе. Для каждого животного один раз перед хирургической операцией, а затем каждую неделю перед и во время стресс-теста проводили эхокардиографию. В каждом случае исследовали общее кинетическое поведение сердца, столько сегментов, сколько возможно, друг за другом вдоль длинной оси и короткой оси. Затем вдоль длинной оси определяли наибольший диаметр и аппарат включали в режиме М для обеспечения нормального поведения левого желудочка. На каждой стадии стресс-теста осуществляли похожий двухмерный анализ. Любую обнаруженную аномалию регистрировали и затем отмечали локализацию, используя представленную ниже номенклатуру (фиг. 14), а также оценивали тип дефекта: 1 - для нормы, 2 - для гипокинезии, 3 - для акинезии, 4 - для дискинезии. Когда возникали сомнения относительно наличия дефекта, утолщенный фрагмент оценивали, используя режим М. После этого последовательность оценивали как: 1 - если все сегменты имели нормальный утолщенный фрагмент (свыше 30%), 2 - если гипокинетический (один или более сегмент ниже 30%), 3 - если акинетический (по меньшей мере один сегмент не имел утолщения) или 4 - если дискинетический (один сегмент с отрицательно утолщенным фрагментом, т.е. миокард тратится во время систолы). Для окончательного анализа оставляли наибольшие оценки дефекта. Пример 18. Добутаминовый стресс-тест. В этом тесте использовали добутамин из-за его инотропных и хронотропных свойств, для того чтобы имитировать сердечный ответ на стрессовые условия. Поскольку ишемия представляет собой скрытое явление, которое обычно возникает во время стресса, ее обнаруживают по электрической сигнатуре на ЭКГ и по ее последствиям на сократимость миокарда, о чем свидетельствует электрокардиография. Технические стадии теста были следующими. Анестезия: От изофурана отказались, поскольку он приводит к высокому сердечному ритму в состоянии покоя. От галотана отказались, поскольку добавление атропина приводило к появлению эктопии желудочка. Таким образом, выбрали ксилазин-кетамин, поскольку кинетика увеличения сердечного ритма была хорошей. Атропин: 0,5 мг/кг метилнитрата атропина инъецировали в ушной катетер в качестве предварительной стадии. От сульфата атропина отказались, поскольку он приводит к некоторому увеличению сердечного ритма. Постепенное увеличение доз: Первая доза составляла 2 мкг/кг/мин. Каждые 3 мин дозу увеличивали до 5, 10, 20, 30 и 40 мкг/кг/мин. Если не достигали максимальной частоты сокращения сердца, то использовали конечную дозу 80 мкг/кг/мин. На каждой стадии регистрировали ЭКГ и эхокардиографию. Сердечный ритм анестезированного кролика в состоянии покоя составлял 20322 (n=61 тестов), 28031 (n=59) при 40 мкг/кг/мин и 29919(n=29) при 80 мкг/кг/мин. Решение перейти от 40 к 80 мкг/кг/мин принимали только в том случае, если сердечный ритм был ниже 300 ударов в минуту при 40 мкг/кг/мин. В заключение, этот тест использовали для выяснения поведения миокарда во время химического стресса, таким образом обнаруживая ишемизированный участок сердца.- 19009390 Пример 19. Гистологический анализ - обнаружение атеросклеротических бляшек, толерантность и экспрессия FGF-1. Огибающую коронарную артерию двух кроликов исследовали на наличие атеросклеротических бляшек в конце эксперимента. Сердца извлекали и образец из левого желудочка, содержащий верхнюю часть огибающей коронарной артерии иссекали и погружали в PBS, забуференный 3,7% формалина, для дальнейшего анализа. Каждый образец погружали в парафин. Готовили срезы толщиной 5 мкм каждый и окрашивали гематоксилин-эозин-шафраном (HES) для микроскопического исследования. Двух других кроликов использовали для оценки эффективности и безопасности инъекции плазмиды, кодирующей FGF-1, в стенку левого желудочка. На 3 сутки кроликов умерщвляли, сердце извлекали и промывали и переднюю стенку исследовали и выдерживали в формалине в течение 1 ч. Затем ее делили на пять образцов, каждый из них фиксировали в течение ночи в PBS, забуференном 3,7% формалина,перед заливкой в парафин. Для каждого сердца получали по 5 образцов, представляющих макроскопические повреждения, или которые, как полагали, содержали участки инъекций, и их фиксировали в течение ночи в PBS, забуференном 3,7% формалина, перед заливкой в парафин. Для приготовления микроскопического препарата использовали стандартный способ. Из каждого блока готовили два последовательных среза толщиной 5 мкм. Один срез окрашивали HES для гистопатологической исследования; другой срез обрабатывали для иммуногистохимии (ИГХ) в отношении FGF-1. Участки инъекций идентифицировали на срезах, окрашенных HES, по наличию гистологических изменений, связанных с иглой и инъекцией вектора. Процедуру ИГХ осуществляли с использованием классического стрептавидин-биотинового анализа. После инкубации с первичным поликлональным кроличьим антителом против FGF-1 (RD Systems; AB-32-NA, разведение 1:30) следовала инкубация с биотинилированным ослиным иммуноглобулином против кроличьих антител (Amersham, разведение 1:200). Иммунные комплексы определяли, используя хромогенный диаминобензидиновый субстрат после добавления пероксидазы, связанной со стрептавидином. Срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином, обезвоживали и заключали в постоянную среду для заливки. При использовании этого способа иммунореактивные волокна выглядели коричневыми, а ядра голубыми. Предварительная проверка ИГХанализа FGF-1 в мышце кролика продемонстрировала способность обнаруживать трансген FGF-1 в миофибриллах, даже при использовании вторичных антител против антител кролика на образцах кроличьей ткани. Отрицательный контроль (пропуск первичного антитела, но использование вторичного антитела) использовали для того, чтобы различать неспецифическое окрашивание (в основном внеклеточное) от специфической иммунореактивности. Кроме того, эффективность ИГХ FGF-1 контролировали в течение всего анализа, используя положительный срез мышцы кролика, имеющей, как было показано ранее, высокий уровень экспрессии FGF-1 (срез P1056GNR2, исследование PAD31.2001). Иммунореактивные волокна идентифицировали и подсчитывали под микроскопом (Zeiss, Axioplan 2). Заданное количество иммунореактивных клеток представляло собой количество иммунореактивных сердечных миофибрилл,наблюдаемых вокруг каждого участка инъекции. Пример 20. Демонстрация терапевтического ангиогенеза в гиперхолестеринемических состояниях. В общей сложности 16 самцов кроликов Watanabe в возрасте одного года использовали для оценки эффективности NV1FGF на реверсирование ишемии миокарда, ассоциированной с гиперхолестеринемией. Кроме того, два новозеландских кролика были подвергнуты такой же хирургической процедуре и были умерщвлены на 3 сутки для анализа экспрессии. 20.1. Определение экспрессии FGF-1 и гистопатологическая картина. Двух здоровых новозеландских кроликов умерщвляли через трое суток после хирургической процедуры и инъекции NV1FGF. Успешно осуществляли оценку гистопатологических изменений в связи с инъекцией вектора, поскольку 5 и 7 участков инъекций были локализованы в 5 образцах, анализируемых из каждого сердца. В некоторых образцах были представлены до 3 различных участков инъекций, разделенных 6-10 мм, что соответствует расстоянию между 2 инъекциями. Повреждения миокарда были более или менее линейными и состояли в дегенерации и некрозе с активным хроническим воспалительным ответом (см. фиг. 15 А). Некоторые образцы демонстрировали диффузную инфильтрацию лимфоцитов ниже перикарда, что свидетельствовало об ограниченном перикардите. Индивидуальные результаты представлены в табл. 3. Через трое суток после внутримиокардиальной инъекции NV1FGF во всех образцах, имеющих участки инъекций, были обнаружены миофибриллы, иммунореактивные в отношении FGF-1. Экспрессия,ограниченная периферией гистологических повреждений, варьировала от 3 до 36 положительных сердечных миофибрилл на один участок инъекции (см. фиг. 15 Б). Индивидуальные результаты представлены в табл. 3.- 20009390 Таблица 3 Гистологические наблюдения и экспрессия FGF-1 в миокарде здорового кролика через 3 суток после внутримиокардиальных инъекций NV1FGF В заключение, через 3 суток после прямых инъекций NV1FGF в миокард здорового кролика, наблюдались дегенерация миофибрилл и последующая реакция воспаления. В такие ранние моменты времени гистологические повреждения рассматривают как неспецифичные для NV1FGF, поскольку тяжесть и тип повреждений были похожи на аналогичные повреждения, наблюдаемые в миокарде свиней после инъекции "голой" ДНК плазмиды, не кодирующей какой-либо трансген. Эффективность экспрессии трансгена в сердце кролика определяли для внутримиокардиальных инъекций NV1FGF, поскольку экспрессия FGF-1 была обнаружена во всех образцах, имеющих участок инъекции. Принимая во внимание количество иммунореактивных миофибрилл на один участок инъекции, уровень экспрессии был похож на уровень экспрессии, наблюдаемый после внутримиокардиальной инъекции такого же количества NV1FGF в сердце крысы, при условии, что один участок инъекции у кролика эквивалентен одной инъекции в сердце крысы.- 21009390 20.2. Электрокардиографическая картина для инъецированных кроликов Watanabe. В это исследование были включены 16 кроликов. Каждое животное подвергали стресс-тесту до хирургической операции и затем каждую неделю в течение четырех недель. Наибольший обнаруженный балл наносили на график для обеих групп (голубой цвет для животных, инъецированных пустой плазмидой, розовый цвет для животных, инъецированных NV1FGF). На седьмые сутки большинство животных из группы NV1FGF имело более низкий балл, что указывало на то, что ишемия, по-видимому, исчезала при лечении. С другой стороны, большинство животных из группы, которым вводили пустую плазмиду,сохраняли глубокую ишемию (максимальный ишемический балл 3). Результаты, представленные на фиг. 16, демонстрируют развитие максимального ЭКГ балла во время стресс-теста на кроликах, которым вводили пустую плазмиду (голубые точки для индивидуумов,голубая колонка для среднего) или плазмиду NV1FGF (красные точки для индивидуумов, розовая колонка для среднего). Введение плазмиды NV1FGF ясно показало значительное эффективное уменьшение размера ишемии. Начиная с 7 суток, статистический анализ (непартный t-критерий) показал значительное различие между обеими группами (р 0,05 для , р 0,01 для ), что указывает на эффект присутствия FGF-1 в уменьшении ишемической электрокардиографической картины при стрессе. 20.3. Эхокардиографическая картина для инъецированных кроликов Watanabe. Первая стадия заключалась в подтверждении точности соответствия между качественной оценкой(классификация нормальный, гипокинез, акинез) и количественным анализом (доля утолщения стенки). Были проанализированы 30 сегментов: 16 в качестве нормальных и 14 в качестве аномальных. Затем рассчитывали для них доли утолщения стенки, это соответствие представлено на фиг. 17. Как можно видеть, перекрывание между двумя сериями минимальное, что указывает на то, что визуальная оценка была достаточно адекватной. Аномальные сегменты включали один дискинетический сегмент (хороший утолщенный фрагмент,но аномальная подвижность) и три акинетических сегмента, из которых один становился даже тоньше во время систолы. Впоследствии используемая авторами изобретения качественная оценка (нормальный и гипокинетический/акинетический) была признана подходящей, что обеспечивало, таким образом, вторую и более широкую оценку кинетики миокарда. Вторая стадия заключалась в корреляции ЭКГ результата с эхокардиографической оценкой в каждом стресс-тесте. Результат наносили на график на фиг. 18. Кривая регрессии представлена красным цветом, указывая на то, что аномальная ЭКГ приблизительно коррелировала с аномальной эхо. Две затененные области представляют собой две основные группы данных: первая представляет собой нормокинетическое эхо и нормальную/слегка ишемическую ЭКГ, а вторая представляет собой аномальное эхо (гипокинез и акинез) и очень ишемическую ЭКГ (балл 3). Шесть точек, где ишемическая ЭКГ соответствовала нормальному эхо, были получены вследствие технической трудности получения хорошего зажима для каждого теста, что указывало, возможно, на то,что дефекты на эхо были пропущены. С другой стороны, только три теста показали слегка ишемическую ЭКГ с эхо-дефектом. Ни одна нормальная ЭКГ не коррелировала с аномальной эхо, что указывает на хорошую чувствительность ЭКГ. На третьей стадии развитие эхокардиографии в двух группах из четырех обработанных животных было следующим. Балл определял как 1 (нормальный), 2 (гипокинетический) или 3 (акинетический). Для этой группы животных не наблюдали дискинетического сегмента. Исходные данные представлены в табл. 4. Как можно видеть в этом приложении, базовые значения отличались (среднее 2,25 против 1,5). Таким образом, всю группу нормировали, принимая каждое базовое значение за 100%. Затем следующие точки для каждого животного выражали как процентную долю от этого базового значения. Окончательная картина представлена на фиг. 19.- 22009390 Таблица 4 Исходные данные эхокардиографических оценок Балльная оценка для животных, которым вводили NV1FGF, была значительно ниже, чем балльная оценка для животных, которым вводили пустую (empty) плазмиду (анализ осуществляли с помощью непарного t-критерия Стьюдента), что указывало на влияние присутствия FGF-1 на сократимость миокарда,тогда как у животных, которым вводили пустую плазмиду, балльная оценка увеличивалась. Следует отметить, что, поскольку конечная стадия умерщвления, включающая другой технический анализ, не приведена в данном описании подробно, для этих животных на 28 сутки не приведена запись эхо. Результаты, представленные на фиг. 19, ясно показали, что многократные инъекции NV1FGF в миокард животных приводили к регрессии ишемической картины при стрессе как в ЭКГ, так и в эхокардиографии, тогда как инъекция пустой плазмиды не уменьшала ишемической картины. Эти результаты также ясно показали, что влияние NV1FGF помогало сердцу адаптироваться к стрессовым условиям в гиперхолестеринемических состояниях. Пример 21. Демонстрация индукции артериол в сердечной мышце, обработанной NV1FGF. 21.1. Животные. Для этого исследования использовали взрослых самцов мини-свиней (30 кг). Всего использовали 34 животных (n=8 окончательно ожидали в каждой обработанной и контрольной группе, всего 4 группы). Животных содержали в стандартных условиях и давали регулярную диету. Комитет по содержанию и использованию животных Университета Дьюки одобрил все процедуры и протоколы. Животные получали гуманный уход в соответствии с "Принципами содержания лабораторных животных" ("Principles ofLaboratory Animal Care"), сформулированными Национальным обществом медицинских исследований иLaboratory Animals"), подготовленным Институтом ресурсов лабораторных животных и опубликованным Национальным институтом здоровья (NIH) (публикация NIH 85-23, переработана в 1985 г.). Животных подвергали анестезии и рототрахеальной интубации. Во время этой процедуры осуществляли постоянный электрокардиографический и импульсно-оксиметрический контроль для обеспечения стабильного сердечного ритма и оксигенации. В стерильных условиях осуществляли антеролатеральную торакотомию через четвертое межреберное пространство. Перикард изолировали в продольном направлении и ушко левого предсердия отводили для того, чтобы обеспечить доступ к левой огибающей артерии (LCx). Проксимальную часть LCx иссекали для обеспечения возможности размещения вокруг сосуда гидравлического окклюдатора и 2 мм ультразвукового датчика кровотока (Transonic Systems, Inc., Ithaca,NY). Датчик кровотока размещали дистально относительно окклюдатора для того, чтобы регистрировать нисходящий кровоток через LCx. Затем окклюдатор и датчик кровотока выводили наружу через отдель- 23009390 ный колотый надрез. Помещали плевральную дренажную трубку 20 French и рану закрывали послойно. Дренажную трубку удаляли после завершения процедуры. Через трое суток после операции окклюдатор надували для уменьшения кровотока в состоянии покоя в LCx приблизительно до 10% от базового, как определяли с помощью имплантированного датчика кровотока. Животных выдерживали в этом состоянии с низким кровотоком в течение двух недель, причем регистрацию кровотока осуществляли трижды в неделю для обеспечения одинаковой степени закупорки сосуда перед физиологической оценкой. 21.2. Позитронная эмиссионная томография, эхокардиография при добутаминовом стрессе и окрашенные микросферы. Через 3211 суток в состоянии с низким кровотоком животных подвергали позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) и эхокардиографии при добутаминовом стрессе (ЭДС) для того, чтобы охарактеризовать кровоток, метаболический и функциональный статус сердца и документально подтвердить наличие ишемизированного жизнеспособного миокарда в распределении LCx. ПЭТ сканограммы интерпретировали как демонстрирующие "спящий" миокард, если дефицит кровотока отмечен в латеральной и заднее-нижней стенках левого желудочка, снабжаемого LCx, сопровождаемой нормальным или увеличенным потреблением глюкозы в тех же самых областях (обе сравнивали с неишемизированной перегородкой). С использованием ЭДС жизнеспособность в латеральной и задне-нижней стенках левого желудочка определяли как улучшение систолического утолщения стенки при небольшой дозе добутамина в областях миокарда, страдающих тяжелой гипосократимостью в состоянии покоя. Жизнеспособные сегменты рассматривали как ишемизированные, если систолическое движение стенки ухудшалось при стрессе (двухфазный ответ). Введение доз осуществляли после того, как с помощью ПЭТ и ЭДС было подтверждено наличие ишемизированного миокарда, путем прямой внутримиокардиальной инъекции плазмиды, экспрессирующей FGF, такой как NV1FGF, с доступом через вскрытие грудной клетки (5216 суток после закупорки LCx). Векторы вводили в 10 участков (100 мкг/100 мкл/участок инъекции для плазмидных векторов), распределенных в свободной стенке левого желудочка. В контрольной группе осуществляли 10 инъекций по 100 мкл физиологического раствора. Введение осуществляли исполнители и исследователи,у которых отсутствовала информация относительно того, что они вводят. Все параметры эффективности обозначали вслепую и код открывали в конце исследования. 21.3. План эксперимента. Через 10913 суток после обработки сердца извлекали для гистологического анализа и анализа кровоснабжения. Использовали стандартизированную процедуру для приготовления образцов, как показано на фиг. 20. Более конкретно, сердца разрезали вдоль короткой оси на 3 среза (апикальный, средний и базальный сегменты). Каждый из этих сегментов разделяли на 6 (средний и базальный сегменты) или 4 ориентированных сектора (апикальный сегмент), что приводило к получению в общей сложности 16 секторов на сердце. Каждый сектор затем разделяли на 3 трансмуральных образца; один образец хранили для анализа путем перфузии микросферами, другой сразу замораживали в охлажденном в жидком азоте изопентане, тогда как последний образец фиксировали в 3,7% формалине. Образец, полученный из правого желудочка, отбирали в качестве контроля. 21.4. Гистологический анализ. Для приготовления срезов использовали стандартизированную процедуру. Каждый образец, фиксированный в формалине, заливали в парафиновую смолу и из каждого блока приготавливали три серийных среза толщиной 5 мкм. Один срез окрашивали гематоксилин-эозин-шафраном (HES) для оценки постнекротического фиброза путем гистопатологического исследования; серийный срез окрашивали антителами против -гладкомышечного актина (SMA) для идентификации артерий и артериол. -SMA действительно экспрессируется и в перицитах, и в гладкомышечных клетках, ассоциированных с эндотелиальными клетками в зрелых кровеносных сосудах (Benjamin et al., Development, 125, 1591-1598. 1998). Следует отметить, что некоторые крупные вены могут окрашиваться этим антителом, но их легко идентифицировать на основе морфологических критериев. 21.4.1. Окрашивание против -SMA. Все секторы, полученные от всех свиней, подвергали иммуногистохимии против -SMA. Процедуру осуществляли, используя систему детекции Dako EnVision+/HRP (пероксидаза хрена) (Dako, Sabattini et al., J. Clin Pathol, 51: 506-511, 1998). Срезы инкубировали с моноклональным антителом против - 24009390SMA (Dako, клон 1 А 4, разбавление 1:100). Вторая стадия заключалась в инкубации с козьим антителом против кроличьих антител, конъюгированным с ПХ-меченным полимером. Иммунные комплексы локализовали с использованием хромогенного диаминобензидинового субстрата. Срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином, обезвоживали и заключали в постоянную среду для заливки. При использовании этого способа иммунореактивные клетки выглядели коричневыми, а ядра голубыми. 21.4.2. Морфометрический анализ. Измерения проводились одним исследователем, у которого отсутствовала информация относительно схемы введения. Для каждого сектора HES-окрашенный срез сначала анализировали, для того чтобы определить площадь рубца (постнекротический фиброз). Величину фиброза в образце определяли при малом увеличении (25) с использованием следующей шкалы:+: минимальный (менее 5% поверхности образца поражено фиброзом),: умеренный (приблизительно 5-15% поверхности образца),: заметный (приблизительно 15-25% поверхности образца),: тяжелый (более 25% образца). Оценку плотности сосудов проводили на серийном срезе, окрашенном против -SMA. Количество-SMA-окрашенных сосудов подсчитывали в 9 микроскопических полях при большом увеличении (каждое 0,37 мм 2), расположенных в 1) центре рубца (3 поля), 2) границе рубца (3 поля) и 3) на расстоянии от рубца, т.е. в жизнеспособном миокарде (3 поля). Для каждого поля регистрировали 3 категории сосудов: небольшие однослойные сосуды, многослойные сосуды диаметром менее 100 мкм, артериолы и артерии диаметром более 100 мкм (см. фиг. 2). Крупные вены с -SMA-окрашиванием исключали из анализа на основе их морфологических особенностей. Следует отметить, что многочисленные миофибробласты,содержащие -SMA филаменты, были исключены из морфометрического анализа. Затем для каждой зоны (рубец, пограничная зона, жизнеспособный миокард) рассчитывали плотность сосудов (т.е. количество сосудов каждой категории на 1 мм 2) путем объединения данных, полученных из 5 секторов, которые, как предполагалось, были подвергнуты инъекции (секторы ВА, BAL, MA,MAL и АА). В качестве дополнительного контроля также рассчитывали плотность сосудов в неинъецированной зоне (секторы BIL, BI, BIS, BAS, MIL, MI, MIS, MAS, AL, AI, AS). 21.4.3. Экспрессия трансгена. Секторы ВА, BAL, MA, MAL и АА, извлеченные из свиней, которым вводили NV1FGF, подвергали иммуногистохимии в отношении FGF-1. Экспрессию FGF-1 определяли с использованием классического стрептавидин-биотинового анализа. После инкубации с первичным поликлональным кроличьим антителом против FGF-1 (RD Systems;AB-32-NA, разведение 1:30) следовала инкубация с биотинилированным ослиным иммуноглобулином против кроличьих антител (Amersham, разведение 1:200). Иммунные комплексы локализовали с использованием хромогенного диаминобензидинового субстрата после добавления пероксидазы, связанной со стрептавидином. Срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином, обезвоживали и заключали в постоянную среду для заливки. С помощью этого способа иммунореактивные волокна выглядели коричневыми, а ядра голубыми. Эффективность ИГХ в отношении FGF-1 контролировали во время анализа путем использования положительного среза мышцы крысы,демонстрирующего высокий уровень генного переноса плазмиды pCOR-CMV.rat-sp-FGF-1. 21.4.4. Статистический анализ. Количественные вариации сосудистой сети были обнаружены в различных зонах (рубец, краевая область, жизнеспособный миокард) между группами, которым вводили физиологический раствор и плазмиду. Для каждой категории сосудов были рассчитаны среднее арифметическое и стандартное отклонение (СО). Межгрупповые данные сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA, SigmaStat, Jandel Scientific). При обнаружении значительного различия осуществляли множественные сравнения с контрольной группой, используя способ Дуннетта (Dunnett). Все различия считали значимыми на уровне р 0,05. 21.5. Оценка плотности сосудов. Были проведены сравнения средних значений между зоной инъекции у животных, которым вводили NV1FGF, и зоной инъекции NaCl у животных, использованных в качестве контроля (фиг. 21). Анализ проводили отдельно для каждого класса сосудов (небольшие, средние, крупные) в жизнеспособном миокарде. Независимо от группы обработки в фиброзном рубце были обнаружены многочисленные артериальные структуры, имеющие диаметр менее 100 мкм. Основываясь только на морфологических критериях, эти сосуды не отличались от нативных сосудов миокарда. Большинство этих сосудов были небольшими, демонстрирующими один слой гладкомышечных клеток. При сравнении с областями, в которые вводили физиологический раствор, введение NV1FGF в сердце индуцировало в жизнеспособной части миокарда, располагающейся в зоне инъекции, увеличение на 22 и 20% плотности небольших однослойных сосудов (р=0,017). Этот эффект не был продемонстрирован для более крупных сосудов. Эти результаты ясно показали, что прямая внутримиокардиальная инъекция плазмиды pCOR, кодирующей любой трансген spFGF-1, индуцировала в ишемизированных сердцах свиней значительное уве- 25009390 личение плотности однослойных артерий, т.е. артериол с одним слоем гладкомышечных клеток. Кроме того, эти результаты продемонстрировали долговременную экспрессию FGF-1 после прямой внутримиокардиальной инъекции NV1FGF. Действительно, в некоторых сердечных миофибриллах, всегда располагающихся вокруг участка инъекции, через 104-132 суток после введения дозы экспрессировалось детектируемое количество FGF-1. Эта долговременная экспрессия, вероятно, способствует вовлечению и делению клеток-предшественников, необходимых для артериогенеза и для поддержания индуцированных новых сосудов. Полагают, что в момент извлечения эти сосуды находились на ранней стадии артериогенеза. Ссылки 1. Ouriel K. Peripheral arterial disease. Lancet. 2001; 358: 1257-1264. 2. Dormandy J.A., Rutherford R.B. Trans Atlantic inter-consensus (TASC): management of peripheral arterial disease (PAD). J. Vasc. Surg. 2000; 31 (suppl. 1, pt. 2): S. 1-278. 3. Yu H.I., Sheu H.H., Lai С.J., Lee W.J., Chen Y.T. Endothelial dysfunction in type 2 diabetes mellituspattern of collateral vessels in patients with superficial femoral artery occlusion. Invest. Radiol. 2001; 36: 422429. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения миокардиальных или скелетно-мышечных ангиогенных расстройств или дефектов, ассоциированных с гиперхолестеринемией или диабетом, у пациента, страдающего ими, включающий введение указанному пациенту эффективного количества плазмиды, кодирующей фактор роста фибробластов, достаточного для стимуляции образования зрелых коллатеральных сосудов и артериол в миокардиальной или скелетной мышцах указанного пациента, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом, где экспрессия фактора VEGF-A (фактора роста сосудистого эндотелия-А) не индуцирована. 2. Способ лечения дисфункции сосудистого эндотелия, ассоциированной с гиперхолестеринемией или диабетом, у пациента, страдающего ими, включающий введение в скелетные или миокардиальные мышцы указанного пациента плазмиды, кодирующей фактор роста фибробластов, в количестве, достаточном для стимуляции образования зрелых коллатеральных сосудов и артериол в миокардиальной или скелетной мышцах указанного пациента, страдающего гиперхолестеринемией или диабетом, и реверсирования миокардиальных или скелетных ангиогенных дефектов, где экспрессия фактора VEGF-A не индуцирована. 3. Способ стимуляции образования зрелых коллатеральных сосудов и артериол в ишемизированной сердечной или скелетной мышечных тканях млекопитающего, страдающего гиперхолестеринемией и диабетом, включающий введение путем инъекции в указанные ткани указанного субъекта плазмиды,кодирующей фактор роста фибробластов, в количестве, достаточном для реверсирования ишемических и ангиогенных дефектов в ишемизированной сердечной или скелетной мышечных тканях указанного субъекта, где экспрессия VEGF-A не индуцирована у указанного субъекта. 4. Способ реверсирования дефектов ангиогенеза, вызванных гиперхолестеринемией или диабетом,у пациента, страдающего ими, без индукции экспрессии фактора VEGF-A, включающий введение путем инъекции в миокардиальные или скелетные мышечные ткани указанного пациента плазмиды, экспрессирующей фактор роста фибробластов, для стимуляции образования как коллатеральных кровеносных сосудов, так и артериол в сердечной и скелетной мышечных тканях указанного пациента. 5. Способ стимуляции образования зрелых сосудов с высокой проводимостью (коллатеральных сосудов диаметром более 150 мкм) и артерий с небольшим сопротивлением (артериол диаметром менее 50 мкм) в миокардиальных или скелетных мышцах пациентов, страдающих гиперхолестеринемией или диа- 27009390 бетом, включающий введение путем инъекции в указанные мышцы эффективного количества плазмиды,экспрессирующей фактор роста фибробластов, где экспрессия фактора VEGF-A не индуцирована. 6. Способ по любому из пп.1-5, где инъекцию плазмиды осуществляют повторно в скелетные мышцы, расположенные в задней и/или передней частях бедра и задней части голени. 7. Способ по п.6, где плазмиду вводят путем множества инъекций вокруг ишемизированного участка указанной мышцы. 8. Способ по любому из пп.1-7, где плазмиду вводят в миокард указанного пациента путем внутрикоронарных, внутримиокардиальных, трансторакальных, перикардиальных или эпикардиальных инъекций, путем многократных инъекций вокруг ишемизированного участка указанной сердечной мышцы или путем однократной инъекции. 9. Способ по любому из пп.1-8, где фактор роста фибробластов представляет собой FGF-1 или кислый фактор роста фибробластов. 10. Способ по любому из пп.1-9, где плазмида дополнительно содержит регуляторную последовательность, последовательность, кодирующую сигнальный пептид выше гена FGF-1, сигнал терминации транскрипции и сигнал полиаденилирования ниже гена FGF-1. 11. Способ по любому из пп.1-10, где регуляторная последовательность представляет собой промотор цитомегаловируса (CMV), сигнальная пептидная последовательность происходит из пептидной последовательности интерферона, сигнал полиаденилирования происходит из сигнала полиаденилированияSV40 (обезьяньего вакуолизирующего вируса 40) и плазмида, кодирующая FGF-1, обозначена NV1FGF. 12. Способ по любому из пп.1-11, где плазмиду вводят в комбинации с низкомолекулярным гепарином.