Растворимый гликопротеин гиалуронидазы (shasegp), способ его получения, применение и фармацевтическая композиция его содержащая
Номер патента: 9383
Опубликовано: 28.12.2007
Авторы: Фрост Грегори И., Кунду Анирбан, Букбиндер Луис Х.
Формула / Реферат
1. По существу, очищенный гликопротеин, содержащий растворимый гиалуронидазный полипептид РН-20, активный в нейтральных условиях, причем полипептид РН-20 усечён у C-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного GPI (гликозилфосфатидил-инозитола) и содержит по меньшей мере один N-связанный фрагмент молекулы сахара, характеризующийся тем, что N-связанный фрагмент молекулы сахара ковалентно присоединен к остатку аспарагина полипептида.
2. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид выбран из:
a) полипептида, содержащего кодируемую нуклеотидной последовательностью последовательность аминокислот, которая имеет степень идентичности аминокислотной последовательности по меньшей мере приблизительно 74% с последовательностью аминокислот 1-483, приведённой в последовательности SEQ ID NO: 1;
b) полипептида, содержащего последовательность аминокислот, кодируемую последовательностью нуклеотидов 1-1499, представленной в последовательности SEQ ID NO: 6;
c) полипептида, содержащего последовательность аминокислот, кодируемую последовательностью нуклеотидов, по меньшей мере 85% от полной длины которой гибридизируется при условиях высокой степени строгости, с последовательностью нуклеотидов, представленной как последовательность SEQ ID NO: 6, или
d) полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая является полученным при сплайсинге вариантом последовательности нуклеотидов, включающей последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 50.
3. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара ковалентно присоединен к остатку аспарагина, выбранному из аминокислот 82, 166, 235, 254, 368 или 393, указанных в последовательности SEQ ID NO: 1.
4. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара ковалентно присоединен к полипептиду связью, чувствительной к PNGазе.
5. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара относится к типу фрагментов молекулы сахара, содержащих большое количество маннозы.
6. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара относится к типу комплексов.
7. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара относится к типу гибридов.
8. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара дополнительно содержит по меньшей мере один фрагмент молекулы сахара, заканчивающийся сиаловой кислотой.
9. Гликопротеин по п.8, отличающийся тем, что полипептид сверхсиалирован.
10. Гликопротеин по п.9, отличающийся тем, что полипептид содержит последовательность аминокислот, представленную как аминокислоты 1-450 последовательности SEQ ID NO: 3, аминокислоты 1-438 последовательности SEQ ID NO: 3 или аминокислоты 1-459 последовательности SEQ ID NO: 3.
11. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что он имеет степень идентичности последовательности, большую чем приблизительно 80% с полипептидом, содержащим последовательность аминокислот, приведённую в последовательности SEQ ID NO: 3, а также отличающийся тем, что полипептид представляет собой гиалуронидазу.
12. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид кодируется полинуклеотидом, по меньшей мере 70% полной длины которого гибридизируется при условиях высокой степени строгости с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов, которая приведена в последовательности SEQ ID NO: 6, или по меньшей мере с одним её доменом либо с каталитически активной частью домена.
13. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что представляет собой гликопротеин человека.
14. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид представляет собой растворимый полипептид, представленный в последовательности SEQ ID NO: 4.
15. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид не содержит полной последовательности, приведённой в последовательности SEQ ID NO: 1, и включает, по меньшей мере, аминокислоты 1-429 последовательности SEQ ID NO: 4.
16. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что представляет собой мутеин (мутированный белок), причем приблизительно до 50% аминокислот полипептида замещены другими аминокислотами; при этом полученный полипептид (мутеин) имеет каталитическую активность, составляющую по меньшей мере 10% от активности немутированного полипептида.
17. Гликопротеин по п.16, отличающийся тем, что приблизительно до 10% аминокислот полипептида замещены другими аминокислотами.
18. Гликопротеин по п.16, отличающийся тем, что полученный полипептид (мутеин) имеет каталитическую активность, составляющую по меньшей мере 50% активности немутированного полипептида.
19. Гликопротеин по п.16, отличающийся тем, что свободный цистеин в гиалуронидазном домене замещён другой аминокислотой.
20. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что к полипептиду гликопротеина функционально присоединена сигнальная последовательность, способная направить полипептид из клетки наружу.
21. Изолированный растворимый гликопротеин гиалуронидазы РН-20 человека (sHASEGP), причем гликопротеин РН-20 усечён у C-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного GPI, характеризующийся тем, что эффективность sHASEGP превышает 40000 единиц USP (ед.) на 1 мг белка.
22. sHASEGP по п.21, отличающийся тем, что гиалуронидаза сиалирована.
23. sHASEGP по п.21, отличающийся тем, что эффективность превышает приблизительно 45000, 55000, 60000, 80000, 90000, 95000 или 100000 ед./мг.
24. sHASEGP по п.21, отличающийся тем, что эффективность составляет приблизительно от 60000 до 80000 ед./мг.
25. Гликопротеин по п.1 или 21, отличающийся тем, что полипептид модифицирован полимером.
26. Гликопротеин по п.25, отличающийся тем, что полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
27. Композиция, включающая гликопротеин, как он определен в п.21.
28. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид гликопротеина, как он определен в п.1.
29. Изолированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая растворимый гиалуронидазный полипептид РН-20, активный в нейтральных условиях, причем полипептид РН-20 усечён у C-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного GPI, включающая последовательность, выбранную из:
a) полинуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность аминокислот, которая имеет степень идентичности аминокислотной последовательности по меньшей мере приблизительно 74%, с последовательностью аминокислот 1-483, приведённой в последовательности SEQ ID NO: 1;
b) полинуклеотидной последовательности нуклеотидов 1-1499, представленной в последовательности SEQ ID NO: 6;
c) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере 85% от полной длины которой гибридизируется при условиях высокой степени строгости с последовательностью нуклеотидов, приведённой в последовательности SEQ ID NO: 6, или
(d) полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая является полученным при сплайсинге вариантом последовательности нуклеотидов, включающей последовательность, представленную как последовательность SEQ ID NO: 50.
30. Вектор, имеющий последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO: 51.
31. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, как она определена в п.29.
32. Вектор по п.31, отличающийся тем, что представляет собой экспрессирующий вектор.
33. Вектор по п.31, отличающийся тем, что представляет собой вектор эукариот.
34. Вектор по п.31, отличающийся тем, что включает последовательность нуклеотидов, которая направляет секрецию любого полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, функционально к ней присоединённой.
35. Вектор по п.31, отличающийся тем, что это вектор Pichia, вектор Е. coli или вирусный вектор.
36. Изолированная клетка, содержащая вектор, как он определен в п.31.
37. Клетка по п.36, отличающаяся тем, что это прокариотическая или эукариотическая клетка.
38. Клетка по п.36, отличающаяся тем, что выбрана из бактериальной, дрожжевющ, растительной клеток, из клетки насекомого или клетки животного.
39. Клетка по п.36, отличающаяся тем, что является клеткой млекопитающего.
40. Антитело, связывающееся с гликопротеином, как он определен в п.1, характеризующееся тем, что не обладает реактивностью по отношению к бычьей, овечьей или бактериальной гиалуронидазе.
41. Трансгенное животное, не являющееся человеком, отличающееся тем, что эндогенный ген, кодирующий полипептид гликопротеина, как он определен в п.1, был разрушен гомологичной рекомбинацией или мутагенезом по типу вставок у животного или его предка.
42. Способ получения растворимого полипептида, содержащего полипептид sHASEGP, включающий
введение нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид гликопротеина, как он определен в п.1, функционально присоединённой к подходящему промотору, в клетку, которая содержит в sHASEGP N-связанные фрагменты молекулы сахара;
культивирование клетки в условиях, при которых кодируемый полипептид экспрессируется клеткой, и
выделение экспрессированного полипептида.
43. Способ по п.42, отличающийся тем, что клетка представляет собой эукариотическую клетку.
44. Способ по п.43, отличающийся тем, что эукариотическая клетка выбрана из клетки млекопитающего, клетки насекомого, дрожжевой или растительной клеток.
45. Способ по п.44, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку CHO.
46. Способ получения раствоpимого полипептида, содержащего полипептид sHASEGP, включающий
культивирование клетки, как она определена в п.36, в условиях, при которых кодируемый полипептид экспрессируется клеткой, и
выделение экспрессированного полипептида.
47. Применение гликопротеина по п.1 в медицине.
48. Способ генной терапии ex vivo, включающий
введение in vitro нуклеиновой кислоты, кодирующей гликопротеин, как он определен в п.1, и функционально присоединённой к подходящему промотору, в клетку, не являющуюся клеткой человека, которая способна включать в sHASEGP N-связанные фрагменты молекулы сахара;
создание таким путём генетически модифицированной клетки, не являющейся клеткой человека, содержащей нуклеиновую кислоту.
49. Способ получения овоцита млекопитающего, не являющегося человеком, для оплодотворения in vitro, включающий
приведение нечеловеческого овоцита в контакт с гликопротеином, как он определен в п.1, взятым в количестве, эффективном для удаления кумулюсного матрикса.
50. Способ по п.49, отличающийся тем, что кумулюс эффективно удаляют без применения пипетки с узким отверстием для манипулирования с овоцитом.
51. Способ получения гликопротеина, включающий приведение полипептида гликопротеина, как он определен в п.1, в контакт с гликозилтрансферазными ферментами, способными вводить N-связанные фрагменты молекулы сахара в полипептид, создавая таким путём гликопротеин, как он определен в п.1.
52. Способ по п.51, отличающийся тем, что гликозилтрансферазные ферменты получают из микросомных мембран псовых.
53. Композиция, содержащая, по существу, очищенный гликопротеин, как он определен в п.1, и подходящий фармацевтический носитель.
54. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, в лечении избытка субстрата sHASEGP у индивидуума, включающего удаление субстрата sHASEGP.
55. Применение по п.54, отличающееся тем, что избыток субстрата продуцируется тканью рубцов.
56. Применение по п.55, отличающееся тем, что ткань рубцов представляет собой глиальные рубцы, возникшие вследствие повреждения спинного мозга.
57. Применение по п.55, отличающееся тем, что ткань рубцов представляет собой результат хирургической операции.
58. Применение по п.55, отличающееся тем, что ткань рубцов представляет собой келоидные рубцы.
59. Применение по п.58, отличающееся тем, что субстрат связан с образующим грыжу диском.
60. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, для усиления у индивидуума диффузии терапевтического вещества с диаметром, меньшим чем приблизительно 0,5 мкм, включающее открытие или формирование у указанного индивидуума каналов с диаметром менее 0,5 мкм.
61. Применение по п.60, отличающееся тем, что гликопротеин вводят инъекцией в дозе от 0,1 до 1500 ед.
62. Применение по п.60, отличающееся тем, что полипептид гликопротеина смешивают с терапевтическим веществом до инъекции.
63. Комплект, содержащий:
a) гликопротеин по п.1 в дозе от 0,1 до 1500 ед./мл в приемлемом носителе;
b) по меньшей мере одно терапевтическое вещество в приемлемом носителе; и
(c) по усмотрению, инструкции по введению терапевтических веществ.
64. Комплект по п.63, отличающийся тем, что гликопротеин и терапевтическое вещество представляются в виде смеси.
65. Применение по п.47 для лечения сердечно-сосудистого расстройства, включающее удаление избытка гликозаминогликанов.
66. Применение по п.65, отличающееся тем, что сердечно-сосудистое расстройство выбрано из инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности или артериосклероза.
67. Применение по п.47 для лечения опухоли, включающее удаление избытка гликозаминогликанов.
68. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, для доставки молекулы в ткань, содержащую избыточные количества гликозаминогликана, включающее разрушение гликозаминогликанов в степени, достаточной для открытия каналов диаметром менее чем приблизительно 500 нм.
69. Применение по п.68, отличающееся тем, что полипептид модифицирован полимером.
70. Применение по п.69, отличающееся тем, что полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
71. Фармацевтическая композиция, содержащая, по существу, очищенный гликопротеин, как он определен в п.1, и фармацевтический носитель.
72. Фармацевтическая композиция, содержащая, по существу, очищенный гликопротеин, как он определен в п.1.
73. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что полипептид в композиции использован в качестве вещества, распределяющего фармацевтически активное средство.
74. Фармацевтическая композиция по п.73, отличающаяся тем, что фармацевтически активное средство выбрано из группы средств, состоящей из химиотерапевтического, анальгезирующего, противовоспалительного, антимикробного, амёбоцидного, трихомоноцидного, антипаркинсонного, антималярийного, антиконвульсионного, антидепрессивного, противоартритного, противогрибкового, антигипертензивного, жаропонижающего, противопаразитного, антигистаминного, альфа-адренергического агониста, альфа-блокирующего, обезболивающего, бронхолитического, биоцидного, бактерицидного, бактериостатического, бета-адренергоблокирующего, блокирующего кальциевые каналы, сердечно-сосудистого лекарства, противозачаточного, противозастойного, мочегонного, депрессантного, диагностического, электролитического, гипнотического, гормонального, гипергликемического, мышцерасслабляющего, мышцесокращающего, офтальмологического, парасимпатомиметического, тимолептического, седативного, симпатомиметического, транквилизатора, мочевого, вагинального, противовирусного, витаминного, нестероидного противовоспалительного и ингибирующего ангиотензинпреобразующий фермент средств, полипептида, белка, нуклеиновой кислоты, лекарства, органической молекулы или снотворного средства.
75. Фармацевтическая композиция по п.74, отличающаяся тем, что химиотерапевтическим средством является токсин или фактор некроза опухолей.
76. Фармацевтическая композиция по п.74, отличающаяся тем, что анестезирующим средством является лигнокаин или бупивикаин.
77. Фармацевтическая композиция по п.74, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гормональное средство.
78. Фармацевтическая композиция по п.77, отличающаяся тем, что гормональным средством является эпинефрин.
79. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что фармацевтический носитель представляет собой стабилизирующий раствор.
80. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор содержит NaCl и металл, выбранный из CaCl2 и MgCl2.
81. Фармацевтичесъря композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор дополнительно содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).
82. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор дополнительно содержит носитель, выбранный из группы, содержащей альбумин, детергент или поверхностно-активное вещество.
83. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор содержит фенол красный, человеческий сывороточный альбумин, HEPES, NaCl и металл, выбранный из CaCl2 и MgCl2.
84. Фармацевтическая композиция по п.83, отличающаяся тем, что концентрация гликопротеина составляет приблизительно 80 ед./мг.
85. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
86. Фармацевтическая композиция по п.85, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество выбрано из сорбитан-монолаурата; сорбитан-моноолеата; сорбитан-пальмитата; сорбитан-моностеарата; сорбитан-сесквитолата; сорбитан-триолеата; производных эфира полиоксиэтилен-олеиновой кислоты; производных полиоксиэтилен-лауриламина; производных полиоксиэтилен-стеариламина; производных полиоксиэтилен-олеиламина; полиоксиэтиленовых производных касторового масла; полиоксиэтиленовых производных гидрогенизированного касторового масла; полиоксиэтиленовых производных бис-фенольного эфира; полиоксиэтиленгликолей; сорбитановых производных эфиров жирных кислот; полиоксиэтиленовых производных эфиров жирных кислот; производных полиоксиэтилен-полиоксипропилена; полиэтиленгликоль-гексадецилового эфира (Brijв 56); полиэтиленгликоль-октадецилового эфира (Brijв 72); полиоксиэтилен-10 олеилового эфира (Brijв 97); трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (Тритонв Х-100); полиэтиленгликоль-сорбитан-монолаурата (Твинв 20); полиоксиэтилен-сорбитан-монопальмитата (Твинв 40); полиэтиленгликоль-сорбитан-моностеарата (Твинв 60); полиоксиэтилен-сорбитан-тристеарата (Твинв 65); полиэтиленгликоль-сорбитан-моноолеата (Твинв 80); полиоксиэтилен-сорбитан-триолеата (Твинв 85); трис-(оксиметил)аминометан-лаурилсульфата (Тризмав додецилсульфат); блочного сополимера полиэтилен- и полипропиленгликолей (Плюроникв F68) или альбумина.
87. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что концентрация гликопротеина находится в интервале приблизительно 1-5000 ед./мг.
88. Фармацевтическая композиция по п.85, отличающаяся тем, что концентрация гликопротеина находится в интервале приблизительно 1-300 ед./мг.
89. Фармацевтическая композиция по п.85, отличающаяся тем, что концентрация гликопротеина находится в интервале приблизительно 1-150 ед./мг.
90. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ион металла, выбранного из кальция и магния.
91. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что составлена для заданного высвобождения во времени или для высвобождения при контакте с местом введения или тканью-мишенью.
92. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что составлена для местного, локального, брюшного, парентерального, внутрицистного, внутрикожного, внутрь стекловидного тела, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения.
93. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что составлена в виде спрея, пены или аэрозоля, таблетки или капсулы.
94. Фармацевтическая композиция по п.90, отличающаяся тем, что дополнительно содержит растворимое в кишечнике покрытие.
95. Фармацевтическая композиция по п.94, отличающаяся тем, что покрытие выбрано из фталата ацетата целлюлозы, полиэтиленгликоля, полиоксиэтилен-сорбитана, касторового масла, псевдолатекса этилцеллюлозы фенилсалицилата, н-бутилстеарата, стеариновой кислоты и карнаубского воска.
96. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что представляет собой лиофилизированный порошок.
97. Фармацевтическая композиция по п.96, отличающаяся тем, что лиофилизованный порошок получают способом, включающим:
a) перенесение фармацевтической композиции в буферный раствор;
b) стерильное фильтрование полученного раствора;
c) лиофильную сушку фильтрованного раствора при стандартных условиях, чтобы получить стерильный порошок.
98. Фармацевтическая композиция по п.97, отличающаяся тем, что буферный раствор выбран из HEPES, фосфата, цитрата и бикарбоната.
99. Фармацевтическая композиция по п.98, отличающаяся тем, что буферный раствор дополнительно содержит сахар или углевод.
100. Фармацевтическая композиция по п.99, отличающаяся тем, что сахар или углевод представляет собой декстрозу или лактозу.
101. Фармацевтическая композиция по п.100, отличающаяся тем, что лактоза присутствует в концентрации приблизительно 1-15 мг/мл.
102. Фармацевтическая композиция по п.97, отличающаяся тем, что буферный раствор дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
103. Фармацевтическая композиция по п.97, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество выбрано из сорбитан-монолаурата; сорбитан-моноолеата; сорбитан-пальмитата; сорбитан-моностеарата; сорбитан-сесквитолата; сорбитан-триолеата; производных эфира полиоксиэтилен-олеиновой кислоты; производных полиоксиэтилен-лауриламина; производных полиоксиэтилен-стеариламина; производных полиоксиэтилен-олеиламина; полиоксиэтиленовых производных касторового масла; полиоксиэтиленовых производных гидрогенизированного касторового масла; полиоксиэтиленовых производных бис-фенольного эфира; полиоксиэтиленгликолей; сорбитановых производных эфиров жирных кислот; полиоксиэтиленовых производных эфиров жирных кислот; производных полиоксиэтилен-полиоксипропилена; полиэтиленгликоль-гексадецилового эфира (Brijв 56); полиэтиленгликоль-октадецилового эфира (Brijв 72); полиоксиэтилен-10 олеилового эфира (Brijв 97); трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (Тритонв Х-100); полиэтиленгликоль-сорбитан-монолаурата (Твинв 20); полиоксиэтилен-сорбитан-монопальмитата (Твинв 40); полиэтиленгликоль-сорбитан-моностеарата (Твинв 60); полиоксиэтилен-сорбитан-тристеарата (Твинв 65); полиэтиленгликоль-сорбитан-моноолеата (Твинв 80); полиоксиэтилен-сорбитан-триолеата (Твинв 85); трис(оксиметил)аминометан-лаурилсульфата (Тризмав додецилсульфат); блочного сополимера полиэтилен- и полипропиленгликолей (Плюроникв F68) или альбумина.
104. Набор, включающий стерильный флакон и фармацевтическую композицию, как она определена в п.71, характеризующийся тем, что композиция находится во флаконе.
105. Набор по п.104, отличающийся тем, что стерильный флакон содержит количество фармацевтической композиции, предназначенное для введения одной дозы.
106. Набор, включающий стерильный флакон, содержащий фармацевтическую композицию, как она определена в п.92.
107. Набор по п.104, отличающийся тем, что стерильный флакон дополнительно содержит необходимое для инъекции количество стерильной воды, и конечная концентрация гликопротеина составляет приблизительно 1-5000 ед./мл.
108. Набор, включающий стерильный шприц, содержащий фармацевтическую композицию, как она определена в п.71.
109. Набор по п.108, отличающийся тем, что стерильный шприц имеет объём приблизительно 5-50 мкл.
110. Набор по п.108, отличающийся тем, что конечная концентрация гликопротеина находится в интерврых приблизительно 1-5000 ед./мл.
111. Набор, включающий стерильный шприц, содержащий фармацевтическую композицию, как она определена в п.92.
112. Набор по п.111, отличающийся тем, что конечная концентрация гликопротеина находится в интервале приблизительно 1-5000 ед./мл.
113. Набор по п.111, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция растворена в стерильной воде объёмом приблизительно 5-50 мкл.
114. Набор по п.111, отличающийся тем, что он дополнительно содержит второй шприц, содержащий фармацевтически эффективное средство.
115. Набор по п.111, отличающийся тем, что фармацевтически эффективное средство выбрано из группы средств, состоящей из химиотерапевтического, анальгезирующего, противовоспалительного, антимикробного, амёбоцидного, трихомоноцидного, антипаркинсонного, антималярийного, антиконвульсионного, антидепрессивного, противоартритного, противогрибкового, антигипертензивного, жаропонижающего, противопаразитного, антигистаминного, альфа-адренергического агониста, альфа-блокирующего, обезболивающего, бронхолитического, биоцидного, бактерицидного, бактериостатического, бета-адренергоблокирующего, блокирующего кальциевые каналы, сердечно-сосудистого лекарства, противозачаточного, противозастойного, мочегонного, депрессантного, диагностического, электролитического, гипнотического, гормонального, гипергликемического, мышцерасслабляющего, мышцесокращающего, офтальмологического, парасимпатомиметического, тимолептического, седативного, симпатомиметического, транквилизатора, мочевого, вагинального, противовирусного, витаминного, нестероидного противовоспалительного, ингибирующего ангиотензин-преобразующий фермент средств, полипептида, белка, нуклеиновой кислоты, лекарства, органической молекулы или снотворного средства.
116. Набор по п.115, отличающийся тем, что фармацевтически эффективным средством является вязкоупругое вещество.
117. Комплект, содержащий набор, как он определен в п.104 или 111, и одно или более из следующего:
упаковочный материал и
инструкции по пользованию комплектом для применения фармацевтической композиции.
118. Комплект по п.117, отличающийся тем, что упаковочный материал включает лёд, сухой лёд, пенополистирол, пенопласт, пластмассу, целлофан, плотную обёртку, пупырчатую обёртку, бумагу, картон, арахисовый крахмал, скрученные стяжки, металлические скрепки, металлические контейнеры, осушители, стекло и резину.
119. Применение по п.47 для лечения патологического накопления гликозаминогликанов, причём гликопротеин не содержит бычьего, овечьего или бактериального ферментов и исправляет или снижает накопление гликозаминогликанов.
120. Применение по п.119, отличающееся тем, что накопление выбрано из сердечно-сосудистого, церебрального накопления, парафимоза, микседемы, склеромикседемы и лимфедемы.
121. Применение по п.47 для облегчения восстановления сосудов в некротической ткани, включающего введение и индуцирующее прорастание новых кровеносных сосудов в некротическую ткань.
122. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, для удаления гликозаминогликанов из жидкой части стекловидного тела.
123. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что N-связанный гликан имеет степень полимеризации, равную приблизительно 15,6; 13,7; 11,6; 10,0; 8,37; 7,32; 6,1; 5,6; 3,8 или 3,2.
124. Способ получения, по существу, очищенного растворимого гиалуронидазного полипептида РН-20, активного в нейтральных условиях, усечённого у C-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного GPI, состоящий в выращивании клеток яичника китайского хомячка в подходящей ростовой среде и в присутствии 0,1-1 мМ бутирата натрия в условиях, подходящих для продуцирования полипептида.
125. Способ очистки гликопротеина по п.1, включающий
приведение содержащей sHASEGP среды при низкой ионной силе в контакт с анионообменной смолой при нейтральном рН;
элюирование sHASEGP солью с концентрацией приблизительно 400 мМ;
приведение sHASEGP в контакт со смолой для хроматографии с гидрофобным взаимодействием в присутствии приблизительно 0,5 М сульфата аммония;
приведение sHASEGP в сульфате аммония в контакт с фенилборонатной смолой;
элюирование sHASEGP в низкой концентрации соли при нейтральном рН;
приведение sHASEGP в контакт со смолой оксиапатитом;
элюирование sHASEGP фосфатом натрия с концентрацией приблизительно 100 мМ, что приводит в результате к получению sHASEGP, причём sHASEGP является, по существу, очищенным.
126. Применение по п.47 для лечения расстройства глаза млекопитающего посредством индукции разжижения жидкой части стекловидного тела.
127. Применение по п.126, отличающееся тем, что протеин модифицирован полимером.
128. Применение по п.127, отличающееся тем, что полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
129. Применение человеческого sHASEGP для снижения внутриглазного давления в глазу индивидуума, включающее введение его нуждающемуся в этом субъекту, причем указанный человеческий sHASEGP характеризуется тем, что он
представляет собой полипептид РН-20, усечённый у C-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного GPI;
по существу, не содержит бычьего, овечьего или бактериального ферментов;
имеет активность более 40000 единиц USP на 1 мг белка.
130. Применение по п.129, отличающееся тем, что человеческий sHASEGP дополнительно характеризуется тем, что не содержит IgG.
131. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, в производстве медикамента для лечения сердечно-сосудистого расстройства, включающего инфаркт миокарда, застойную сердечную недостаточность и артериосклероз, накопления гликозаминогликанов, кровоизлияния в стекловидное тело, грыжи межпозвоночного диска, рака, внутриглазного давления и микседемы.
Текст
009383 Ссылки на родственные заявки Заявка на данное изобретение относит приоритет под номером 35 USC 119(e) к заявке с регистрационным номером 60/452360, поданной 5 марта 2003 г., которая включена в настоящую работу ссылкой во всей е полноте. Область техники Настоящее изобретение в основном относится к активным в нейтральных условиях растворимым гликопротеинам гиалуронидазы (neutral-active, soluble hyaluronidase glycoproteins, sHASEGP), их частям,в особенности к гиалуронидазным доменам. Более конкретно, изобретение относится к химическим модификациям, фармацевтическим композициям, экспрессирующим плазмидам, способам производства и терапевтическим способам, использующим гиалуронидазные гликопротеины и их домены, и к кодирующим молекулам нуклеиновой кислоты для терапевтической модификации гликозаминогликанов в лечении заболевания и для применения в целях усиления у животного диффузии других введнных инъекцией молекул, имеющих диаметр менее 200 нм. Предшествующий уровень техники Гликозаминогликаны (ГАГ) - это сложные линейные полисахариды внеклеточного матрикса(ВКМ), характеризующиеся повторяющимися дисахаридными структурами, состоящими изN-замещнного гексозамина и уроновой кислоты [гиалуронана (ГУ), хондроитин-сульфата (ХС), хондроитина (X), дерматан-сульфата (ДС), гепаран-сульфата (ГС), гепарина (Г)] или галактозы [кератансульфата (КС)]. За исключением ГУ все оказываются ковалентно связанными с сердцевинными (капсидными) белками. ГАГ со своими сердцевинными белками в соответствии с их структурой относят к протеогликанам (ПГ). Гиалуронан (ГУ) обнаруживается у млекопитающих преимущественно в соединительных тканях,коже, хрящах и синовиальной жидкости. Гиалуронан является также основной составляющей стекловидного тела глаза. В соединительной ткани связанная с гиалуронаном гидратная вода создат просветы между тканями, образуя окружение, способствующее перемещению и пролиферации клеток. Гиалуронан играет ключевую роль в биологических процессах, связанных с подвижностью клеток, включая быстрое развитие, регенерацию, репарацию, эмбриогенез, эмбриологическое развитие, залечивание ран, ангиогенез и онкогенез (развитие опухолей) (Toole //Cell Biol. Extracell. Matrix. Под ред. Hay. Plenum Press,New York, 1991, p. 1384-1386; Bertrand et al. //Int. J. Cancer. 1992, v. 52, p. 1-6; Knudson et al. //FASEB J. 1993, v. 7, p. 1233-1241). Кроме того, уровень гиалуронана коррелирует с агрессивностью раковых опухолей (Ozello et al. //Cancer Res. 1960, v. 20, p. 600-604; Takeuchi et al. //Cancer Res. 1976, v. 36, p. 21332139; Kimata et al. //Cancer Res. 1983, v. 43, p. 1347-1354). ГУ обнаружен во внеклеточном матриксе многих клеток, особенно в мягких соединительных тканях. ГУ выполняет различные физиологические функции, такие, как связанные с гомеостазом воды и белков плазмы (Laurent T.C. et al. //FASEB J. 1992, v. 6, p. 2397-2404). Продукция ГУ повышается в пролиферирующих клетках и может играть роль в митозе. Он участвует также в подвижности клеток и клеточной миграции. По-видимому, ГУ играет важную роль в регуляции, развитии и дифференцировке клеток (Laurent et al., см. выше). ГУ использовался в клинической медицине. Была доказана полезность его тканезащитных и реологических свойств в офтальмологической хирургии для защиты эндотелия роговицы в ходе операций катаракты. Сывороточный ГУ является диагностическим показателем при заболеваниях печени и различных воспалительных болезненных состояниях, таких как ревматоидный артрит. Интерстициальный отк,вызванный накоплением ГУ, может приводить к дисфункции различных органов (Laurent et al., см. выше). Взаимодействия гиалуронана с белком вовлечены также в формирование структуры внеклеточного матрикса или базового вещества (ground substance). Гиалуронидазы представляют собой группу активных в нейтральных или кислотных условиях ферментов, которые обнаруживаются во всем животном царстве. Гиалуронидазы различаются по субстратной специфичности и механизму действия. Существуют три основных класса гиалуронидаз: 1. Гиалуронидазы млекопитающих (КФ 3.2.1.35), которые представляют собой эндо-бета-Nацетилгексозаминидазы с тетрасахаридами и гексасахаридами в качестве конечных продуктов. Они имеют как гидролитическую, так и трансгликозидазную активности и могут расщеплять гиалуронан и хондроитинсульфаты (CS), особенно C4-S и C6-S. 2. Бактериальные гиалуронидазы (КФ 4.2.99.1), которые расщепляют гиалуронан и, до различной степени, CS и дерматан-сульфат (DS). Они представляют собой эндо-бета-N-ацетилгексозаминидазы,которые осуществляют реакцию бета-отщепления, где конечными продуктами являются в основном дисахариды. 3. Гиалуронидазы (КФ 3.2.1.36) из пиявок, других паразитов и ракообразных, которые являются эндо-бета-глюкуронидазами и дают в качестве конечных продуктов тетрасахариды и гексасахариды путм гидролиза бета 1-3 связи. Гиалуронидазы млекопитающих могут быть далее подразделены на две группы: ферменты, активные в нейтральных условиях и активные в кислотных условиях. В геноме человека имеется шесть генов,-1 009383 подобных генам гиалуронидазы: HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 и PH20/SPAM1.HYALP1 - это псевдоген, а у продукта HYAL3 не было обнаружено никакой ферментативной активности в отношении любых известных субстратов. Продукт HYAL4 представляет собой хондроитиназу и не обладает активностью в отношении гиалуронана. Продукт HYAL1 - это прототип фермента, активного в кислотных условиях, а продукт РН 20 прототип фермента, активного в нейтральных условиях. Активные в кислотных условиях гиалуронидазы, такие как HYAL1 и HYAL2, утрачивают каталитическую активность при нейтральном рН. Например, HYAL1 не обладает каталитической активностьюin vitro при рН выше 4,5 (Frost et al. //Anal. Biochemistry. 1997). HYAL2 представляет собой фермент, активный в кислотных условиях, с очень низкой специфической активностью in vitro. Гиалуронидазоподобные ферменты можно также разделить на те, которые закреплены в плазматической мембране с помощью гликозилфосфатидил-инозитольного (GPI) якоря, такие как HYAL2 и РН 20 человека (Danilkovitch-Miagkova et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003, v. 100,8, p. 4580-4585; PhelpsRes. Commun. 1997, v. 236,1, p. 10-15). Однако от вида к виду наблюдаются вариации: например,РН 20 крупного рогатого скота очень слабо прикреплена к плазматической мембране и не зацеплена чувствительным к фосфолипазе якорем (Lalancette et al. //Biol. Reprod. 2001, v. 65,2, p. 628-636). Эта уникальная особенность бычьей гиалуронидазы позволила использовать растворимый фермент гиалуронидазу из бычьих семенников в виде экстракта для клинического применения (Wydase, Hyalase). Другие виды РН 20 являются заякоренными в липиде ферментами, которые не могут быть растворены без применения детергентов или липаз. Например, РН 20 человека заякорен в плазматической мембране черезGPI. Попытки создать конструкции ДНК для РН 20 человека, не внедряющие липидный якорь в полипептид, приводили к получению либо каталитически неактивного, либо нерастворимого фермента (Arminget al. //Eur. J. Biochem. 1997, v. 247,3, p. 810-814). Существующая в природе гиалуронидаза из спермы макак обнаружена и в растворимой, и в связанной с мембраной формах. В то время как связанная с мембраной форма с молекулярной массой 64 кДа обладает ферментативной активностью при рН 7,0, форма 54 кДа активна только при рН 4,0 (Cherr et al. //Dev. Biol. 1996, v. 175,1, p. 142-153). Таким образом,растворимые формы РН 20 часто теряют ферментативную активность при нейтральных условиях. Хондроитиназы - это ферменты, имеющиеся во всм животном мире. Эти ферменты расщепляют гликозаминогликаны по механизму эндогликозидазной реакции. Конкретные примеры известных хондроитиназ включают в себя хондроитиназу ABC (получаемую из Proteus vulgaris: заявка на японский патент, регистрационный номер 6-153947, Yamagata Т., Saito H., Habuchi О., Suzuki S. //J. Biol. Cftem. 1968, v. 243, p. 1523; Suzuki//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974, v. 56, p. 973; Michelacci Y.M. and Dietrich C.P. //Biochem. J. 1975,v. 151, p. 121; Maeyama K., Tawada A., Ueno A., Yoshida K. //Seikagaku. 1985, v. 57, p. 1189); хондроитиназу C (получаемую из Flavobacterium sp. Нр 102: Miyazono H., Kikuchi H., Yoshida K.,Morikawa K., Tokuyasu K. //Seikagaku. 1989, v. 61, p. 1023) и подобные им. Гликопротеины состоят из полипептидной цепи, ковалентно связанной с одним или более углеводными фрагментами. Имеются две обширные категории гликопротеинов, которые содержат углеводы,сшитые с белковой составной частью либо N-гликозидной связью, либо О-гликозидной связью.N- и О-связанные гликаны присоединены к полипептидам через соответственно аспарагин-N-ацетил-Dглюкозамин и серин(треонин)-N-ацетил-D-галактозамин. Комплекс N-связанных олигосахаридов не содержит концевых маннозных остатков. Они содержат только концевые остатки N-ацетилглюкозамина,галактозы и/или сиаловой кислоты. Гибридные олигосахариды содержат концевые маннозные остатки, а также концевые остатки N-ацетилглюкозамина, галактозы и/или сиаловой кислоты. Что касается гликопротеинов с N-связью, олигосахаридный предшественник присоединяется к аминогруппе аспарагина в ходе пептидного синтеза в эндоплазматической сети (эндоплазматическом ретикулуме). Затем олигосахаридный фрагмент последовательно обрабатывается серией специфических ферментов, которые удаляют и добавляют фрагменты молекулы сахара. Процессинг происходит в эндоплазматическом ретикулуме и продолжается при прохождении сквозь цис-, промежуточный и трансаппарат Гольджи.-2 009383 Сущность изобретения В настоящей работе предусматриваются представители семейства растворимых гиалуронидазных гликопротеинов, активных в нейтральных условиях, в частности растворимых гиалуронидазных гликопротеинов РН-20 человека (называемых здесь также sHASEGP). Предусмотренный в настоящей работеsHASEGP является представителем семейства sHASEGP, обозначаемым как sHASEGP. Предусматривается также растворимый гиалуронидазный домен и его применение. Изобретение основывается на открытии того, что высокий уровень продукции активной в нейтральных условиях растворимой гиалуронидазы может быть получен в экспрессирующей системе млекопитающих путм введения нуклеиновых кислот, лишнных узкой области, кодирующей в кДНК РН 20 человека аминокислоты карбоксильного конца. Предусматриваются также дополнительные модификации sHASEGP для повышения секреции с использованием ненативных лидерных пептидов. Далее предусматриваются также способы модификации sHASEGP для продления его времени полужизни путм маскировки белка полиэтиленгликолем и посттрансляционных модификаций в направлении нативного гликозилирования. Ранее производившиеся попытки получить секретируемый активный в нейтральных условиях sHASEGP человека оказались безуспешными. Был сделан вывод, что усечения полипептида человеческого sHASEGP приводят к утрате и ферментативной активности в нейтральных условиях и способности клеток секретировать рекомбинантный белок в экспрессирующих системах млекопитающих(Arming et al. //Eur. J. Biochem. 1997, v. 247,3, p. 810-814). Крайне необходимым является создание активного в нейтральных условиях секретируемого sHASEGP для коммерческого производства и для терапевтического применения в качестве гиалуронидазы. Эти проблемы преодолеваются раскрываемым здесь изобретением. Далее настоящим изобретением предусмотрен каталитически активный гликопротеин sHASEGP человека, причм sHASEGP содержит по меньшей мере один N-связанный сахарный фрагмент. Приведнные в настоящей работе исследования показывают, что для каталитической активности РН 20 человека требуется наличие N-связанных гликанов, тогда как гиалуронидазы крупного рогатого скота и пчелиного яда остаются активными и без таких N-связанных гликанов. Гиалуронидазный домен человека, лишнный N-связанных фрагментов, каталитически неактивен. Поэтому классическая технология рекомбинантной ДНК не позволяет получить продукцию каталитически активного человеческого sHASEGP в отличие от sHASEGP пчелиного яда, который можно продуцировать в Е. coli. Изобретение включает способы и клетки для получения гликопротеинового полипептида sHASEGP с N-связью путм использования клеток, способных вводить указанные N-связанные фрагменты, или путм введения указанных N-связанных фрагментов в полипептид sHASEGP. Далее раскрываются способы идентификации надлежащим образом гликозилированных sHASEGP. Предусматриваются также каталитически активные сверхсиалированные гликопротеины sHASEGP. Сверхсиалированные sHASEGP имеют более длительные времена полужизни в сыворотке в сравнении с природными sHASEGP из семенников быка и барана и поэтому они предпочтительны и для повышения ферментативной стабильности и для применения в качестве внутривенно вводимых лекарств. Изобретение предусматривает способы получения сверхсиалированных sHASEGP, композиции и применение. Предусматриваются также белки, кодируемые полученными сплайсингом вариантами последовательностей для sHASEGP, дефицитными по природному якорю GPI. Далее предусматриваются композиции sHASEGP, содержащие растворимый гликопротеинsHASEGP с ионом металла, причм ион металла представляет собой ион кальция, магния или натрия. Оптимум активности sHASEGP достигается в присутствии указанных металлов. Предусматриваются также композиции, состоящие из sHASEGP в присутствии указанных ионов металлов. Предусматриваются модификации sHASEGP для дополнительного продления полужизни. Предусматриваются химические модификации sHASEGP полимерами, такими как полиэтиленгликоль и декстран. Такие модификации защищают (экранируют) sHASEGP от выведения через циркуляцию в кровотоке и от иммунной системы, а также от чувствительных к гликосиалированию рецепторов для маннозы и асиалогликопротеинов. Далее предусматриваются способы присоединения к специфическим функциональным группам, таким как сайты гликозилирования, положительно заряженные аминогруппы и цистеины. В настоящей работе также предусматриваются способы анализа для идентификации эффекторов,таких как вещества, в том числе малые молекулы, и условий, таких как рН, температура и ионная сила,которые модулируют активацию, экспрессию или активность sHASEGP. В приводимых для примера анализах оценивается влияние испытуемых соединений на способность гиалуронидазного доменаsHASEGP расщеплять известный субстрат, как правило, гликозаминогликан или протеогликан. Агенты,обычно соединения, в особенности малые молекулы, которые модулируют активность гиалуронидазного домена, являются соединениями-кандидатами для модулирования активности sHASEGP. Гиалуронидазные домены могут быть также применены для получения специфичных к гиалуронидазе антител, функция которых заключается в нарушении активности. Предусматриваемые здесь гиалуронидазные домены включают (но не ограничиваются ими) N-концевой гликозилгидролазный домен с усечннымиC-концевыми частями его, проявляющий каталитическую активность in vitro.-3 009383 Предусматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки и гиалуронидазные домены, молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют растворимый гиалуронидазный домен или его каталитически активные части, а также те молекулы, которые кодируют sHASEGP полной длины. Нуклеиновая кислота, кодирующая гиалуронидазный домен, и нуклеотидная кислота противоположного направления представлены далее последовательностью SEQ ID NO: 6; а гиалуронидазный доменsHASEGP представлен далее последовательностью SEQ ID NO: 1 (аминокислоты 35-464). Белковая последовательность аминокислот и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты для sHASEGP полной длины представлены далее как последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 6. Предусматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, которые гибридизируются с такой кодирующей sHASEGP нуклеиновой кислотой по всей их полной длине или вдоль по меньшей мере 70, 80 или 90% от их полной длины, и кодирующие гиалуронидазный домен или его часть. Гибридизация обычно проводится при условиях, по меньшей мере, низкой, как правило, по меньшей мере, умеренной,и часто высокой степени строгости. Изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК, включающий геномную ДНК или кДНК, или представляет собой РНК, или может включать другие компоненты, такие как пептидонуклеиновую кислоту или другие нуклеотидные аналоги. Изолированная нуклеиновая кислота может включать дополнительные компоненты, такие как гетерологичные или нативные промоторы, и иные последовательности, регулирующие транскрипцию или трансляцию. Эти гены могут быть присоединены к другим генам, таким как репортерные гены или другие индикаторные гены или гены, кодирующие индикаторы. Предусматривается также изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность таких молекул, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, кодирующей sHASEGP или его часть. Предусматриваются также фрагменты изолированной молекулы нуклеиновой кислоты или олигонуклеотиды, которые могут быть использованы в качестве зондов или праймеров и которые содержат по меньшей мере примерно 10, 14, 16 нуклеотидов, обычно количество нуклеотидов менее 1000, или же менее 100, или равно 100, эти фрагменты представлены далее последовательностью SEQ ID NO: 6 (или комплементарной ей последовательностью); или эти фрагменты содержат по меньшей мере 30 нуклеотидов (или комплементарную им последовательность), или они содержат олигонуклеотиды, которые гибридизируются по всей своей полной длине (или по меньшей мере на 70, 80 или 90% своей полной длины) с любыми из таких фрагментов или олигонуклеотидов. Длина фрагментов зависит от цели, для которой они используются и/или от сложности представляющего интерес генома. Как правило, зонды и праймеры содержат менее чем примерно 50, 150 или 500 нуклеотидов. Предусматриваются также плазмиды, содержащие любую из указанных молекул нуклеиновой кислоты. Предусматриваются также клетки, содержащие плазмиды. Такие клетки включают (но не ограничиваются ими) бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки грибов, растительные клетки, клетки насекомых и клетки животных. Предусматриваются также системы млекопитающих с усиленной экспрессией, использующие сигнальные лидерные последовательности, способные эффективно секретировать sHASEGP. Пример аминокислотной последовательности такого лидерного пептида с эффективной секрецией и слитого белка сsHASEGP представлен в последовательностях SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 46. Предусматривается также способ продукции sHASEGP путм выращивания описанных выше клеток в условиях, когда sHASEGP экспрессируется клетками, и выделения экспрессированного полипептида или гликопротеина sHASEGP. Предусматриваются также способы выделения нуклеиновой кислоты,кодирующей другие sHASEGP. Предусматриваются также клетки, как правило клетки эукариот, такие, как клетки млекопитающих и дрожжевые клетки, в которых полипептид sHASEGP экспрессируется на поверхности клеток. Такие клетки используют в тестах по скринингу лекарств для идентификации соединений, модулирующих активность полипептида sHASEGP. В этих тестах, в том числе тестах на связывание in vitro и тестах на основе транскрипции, в которых происходит прямое или косвенное влияние на передачу сигнала, как, например, через активацию факторов стимуляции роста, оценивается действие sHASEGP. Предусматриваются также пептиды, кодируемые такими молекулами нуклеиновой кислоты. Среди этих пептидов - гиалуронидазный домен sHASEGP или полипептид с такими аминокислотными заменами, когда специфичность и/или гиалуронидазная активность существенно не изменяются. В частности,предусматривается существенно очищенный гликопротеин sHASEGP млекопитающего, который включает секретируемый гиалуронидазный домен, каталитически активный в нейтральных условиях. Изобретение включает также каталитический гиалуронидазный домен и может дополнительно включать другие домены. sHASEGP может образовывать гомодимеры и может также образовывать гетеродимеры с некоторыми другими белками, такими, как связанные с мембранами белки. Предусматривается также, по существу, очищенный гликопротеин, включающий последовательность аминокислот,имеющую степень идентичности с sHASEGP по меньшей мере 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, где процент идентичности определяется с помощью стандартных-4 009383 алгоритмов и отбрасывания пробелов, максимизирующего процент идентичности. Здесь рассматриваются полученные сплайсингом варианты sHASEGP, в особенности те, которые содержат каталитически активный гиалуронидазный домен. В других формах осуществления настоящего изобретения предусматриваются, по существу,очищенные полипептиды, которые включают гиалуронидазный домен полипептида sHASEGP или его каталитически активную часть, но не включают полную аминокислотную последовательность, представленную далее как последовательность SEQ ID NO: 1. Среди них полипептиды, включающие последовательность аминокислот, имеющие степень идентичности с последовательностями SEQ ID NO: 1 илиSEQ ID NO: 3, по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95 или 100%. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается нуклеиновая кислота, которая кодирует эукариотический гиалуронидазный гликопротеин, обозначенный sHASEGP. В частности, нуклеиновая кислота включает последовательность нуклеотидов, указанную далее в последовательности SEQ ID NO: 6, особенно указанную далее как нуклеотиды 106-1446 последовательностиSEQ ID NO: 6, или же е часть, кодирующую каталитически активный полипептид. Предусматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, которые гибридизируются при условиях, по меньшей мере, низкой степени строгости, обычно при условиях умеренной степени строгости и более типично при условиях высокой степени строгости, с последовательностью SEQ ID NO: 6 или е вырожденными производными. В одном из осуществлений настоящего изобретения изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность,указанную далее в последовательности SEQ ID NO: 6 (или е вырожденные производные) при условиях высокой степени строгости. sHASEGP полной длины указан далее в последовательности SEQ ID NO: 1 и кодируется последовательностью SEQ ID NO: 6 или е вырожденными производными. Предусматриваются также мутеины (мутантные белковые формы) гиалуронидазного доменаsHASEGP, в частности такие мутеины, в которых остаток Cys в гиалуронидазном домене, являющийся свободным (т.е. не образующий дисульфидных связей ни с каким из других остатков Cys в гиалуронидазном домене), замещн другой аминокислотой, как правило (хотя и не обязательно), такая аминокислотная замена является консервативной заменой или такой заменой, которая не нарушает активность, и мутеины, в которых удалн (или удалены) специфический сайт (или сайты) гликозилирования. В настоящей работе предусматриваются полипептиды sHASEGP, в том числе (но не ограничиваясь ими) полученные сплайсингом его варианты, и нуклеиновые кислоты, кодирующие sHASEGP, и их домены, производные и аналоги. Предусматриваются также одноцепочечные секретируемые гиалуронидазные гликопротеины, имеющие N-конец, функционально эквивалентный тем, которые создаются активацией сигнальной пептидазы с образованием sHASEGP. Существуют семь сайтов потенциально возможного N-связанного гликозилирования в положениях N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490sHASEGP, как для примера приведено в последовательности SEQ ID NO: 1. Между цистеиновыми остатками Cys C60-C351 и остатками Cys C224-C238 образуются дисульфидные связи, формируя сердцевину гиалуронидазного домена sHASEGP. Однако для каталитической активности фермента в нейтральных условиях необходимы дополнительные цистеины в карбоксильном конце, так что sHASEGP с аминокислотами от 36 до Cys464 в последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой минимальный активный гиалуронидазный домен sHASEGP человека. Таким образом, сайт N-связанного гликозилированияN490 не нужен для полноценной активности sHASEGP. Гликозилирование sHASEGP с N-связью играет решающую роль для их каталитической активности и стабильности. В то время как изменение типа гликана, модифицирующего гликопротеин, может очень сильно влиять на антигенность, структурное сворачивание, растворимость и стабильность белка, существует мнение, что для оптимальной ферментативной активности большинства ферментов гликозилирование не требуется. Таким образом, sHASEGP являются в этом смысле уникальными, так как удалениеN-связанного гликозилирования может приводить к почти полной инактивации гиалуронидазной активности. Присутствие N-связанных гликанов является решающим для создания активного sHASEGP. Сюда включены системы экспрессии белка, пригодные для введения в sHASEGP важных N-связанных гликозилирующих остатков. Дополнительно включено введение дегликозилированного полипептидаsHASEGP в присутствии экстрактов, способных присоединять N-связанные гликаны. В одном из аспектов изобретения описывается также комплексное гликозилирование, завершающееся сиалированием, но рассматриваются и другие случаи, когда гликозилирование завершается свободными остатками маннозы. Предпочтительно в концевых остатках N-связанного гликозилирования на sHASEGP находятся остатки сиаловой кислоты.N-связанные олигосахариды распадаются на несколько главных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфированные), которые все имеют сердцевины (Man)3-GlcNAc-GLcNAc-, присоединнные через атом амидного азота в остатках Asn, находящихся в пределах последовательностей-Asn-Xaa-Thr/Ser-(где Хаа - это не Pro). Гликозилирование в сайте -Asn-Xaa-Cys- было описано для коагуляционного белка C. Часто сайты с N-связью косвенно различимы по появлению пустого цикла при секвенировании. Позитивная идентификация может быть осуществлена после высвобождения олигоса-5 009383 харида ферментом PNGазой (пептид-N-гликозидазой) F, которая превращает гликозилированный Asn вAsp. После удаления PGNазы F N-связанные олигосахариды могут быть очищены с помощью хроматографии на биогеле Р-6, а олигосахаридный пул подвергается препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (high pH anion exchange chromatography, HPAEC) (Townsend et al. //Anal. Biochem. 1989, v. 182, p. 1-8). С помощью HPAEC можно разделить некоторые изомеры олигосахаридов. На хроматограммах HPAEC остатки фукозы смещаются к более раннему элюированию, тогда как остатки дополнительной сиаловой кислоты выходят при большем времени элюирования. Путм сопутствующей обработки гликопротеинов с известной олигосахаридной структурой (например, фетуин крупного рогатого скота, кислый гликопротеин -1, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) можно улучшить идентификацию олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды можно охарактеризовать, сочетая анализы состава и метилирующих связей (Waeghe et al. //Carbohydr. Res. 1983, v. 123, p.281-304), различая аномерные конфигурации с помощью спектроскопии ЯМР (Van Halbeek //Methods Enzymol. 1993, v. 230). Предусматриваются также композиции, содержащие sHASEGP. Композиции, содержащие sHASEGP могут быть составлены в лиофилизованной форме или как стабилизированные растворы. Для оптимальной активности при нейтральных рН полезны композиции, содержащие ионы специфических металлов, таких как кальций, магний или натрий. Кроме композиций в виде стабилизированных растворов,в настоящей работе рассматриваются также композиции с медленным высвобождением, пригодные для пролонгированного выделения гликозаминогликанов. В настоящей работе предусматриваются также наборы для введения малых объмов sHASEGP при процедурах внутриглазной хирургии и других процедур с введением малых объмов. Наборы представляют собой предварительно наполненные шприцы сsHASEGP. Предусматриваются также композиции со сбалансированным солевым составом для применения ex vivo в процедурах технологии искусственного оплодотворения. Предусматриваются также способы применения sHASEGP для удаления гликозаминогликанов.sHASEGP открывает каналы в интерстициальном пространстве путм разрушения гликозаминогликанов,что дат возможность диффундировать молекулам, имеющим размер менее 500 нм. Эти каналы продолжают существовать в течение 24-48 ч, в зависимости от дозы и типа композиции. Такие каналы могут быть использованы для усиления диффузии добавленных извне молекул, таких как жидкости, небольшие молекулы, белки, нуклеиновые кислоты, векторы для генотерапии и другие молекулы размером менее 500 нм.sHASEGP может быть также применн для удаления избытка гликозаминогликанов, таких как возникающие после повторной ишемической перфузии, воспаления, артериосклероза, водянки, рака, травмы спинного мозга и других форм рубцевания. В некоторых случаях sHASEGP может вводиться системно путм внутривенного вливания. Это может быть полезно тогда, когда местное введение невозможно как в случае сердца или мозга, или в случае рассеянной неоплазии, когда заболевание охватывает вс тело. Сверхсиалированные sHASEGP предпочтительны для увеличения времени полужизни в сыворотке и улучшения распространения в организме по сравнению с природными гиалуронидазными ферментами,лишнными концевых сиаловых кислот. В некоторых случаях, таких как повреждение спинного мозга, глаукома и косметические процедуры, предпочтительно длительное введение. При других симптомах предпочтительна однократная доза с кратким действием. Кратковременное удаление гликозаминогликанов можно применять для усиления доставки растворов и лекарств в интерстицальные промежутки. Это может быть полезно для диффузии анестетиков и для введения терапевтических жидкостей, молекул и белков. Подкожное и внутримышечное введение молекул в присутствииsHASEGP также быстрее способствует их системному распределению. Такие способы чрезвычайно полезны, когда внутривенное введение невозможно или когда необходима более быстрая системная доставка молекул. Для доставки других больших молекул, таких как фактор VIII, которые при подкожном введении имеют низкую биологическую доступность, можно осуществлять инъекцию вместе сsHASEGP, чтобы повысить их доступность. Предусматриваются также способы применения sHASEGP для ферментативного удаления скопившегося матрикса (кумулюс матрикс), окружившего овоциты. Удаление скопившегося матрикса с помощью очищенного sHASEGP, не содержащего токсических примесей, характерных для полученных из экстрактов гиалуронидаз, обеспечивает более мягкую процедуру получения овоцитов с повышенной выживаемостью. Кроме того, производство sHASEGP может осуществляться без использования экстрактов из организма крупного рогатого скота или других организмов, которые содержат вирусы и другие патогены, такие как агенты передаваемых губкообразных энцефалопатии. Для малых пространств также могут быть применены инъекции малых объмов sHASEGP, предназначенные для внутриглазного применения. sHASEGP могут быть инъецированы в переднюю камеру глаза для удаления избытка вязкоупругих субстратов, вводимых в ходе хирургических операций. Внутриглазные инъекции sHASEGP можно также применять для снижения внутриглазного давления при глаукоме, для растворения в стекловидном теле агрегатов (или скитальцев, floaters), для очистки стекловидного тела от кровоподтков, для лечения (рассасывания) пятен на роговице, для помощи при отслойке сетчатки в случаях диабетической ретинопатии и для смешивания с другими ферментами с це-6 009383 лью корректировки формы роговицы для улучшения е облегания корректирующими линзами. Следует учитывать, что в некоторых случаях может быть желательно применение sHASEGP длительного действия, такого как модифицированного полиэтиленгликолем (ПЭГ), ПЭГилированного sHASEGP. Можно предвидеть также совместные композиции sHASEGP с другими веществами для пригодных к инъекции доз, предназначенных для введения малого объма или для быстрого подкожного введения. Для примера в композиции Epipen могут быть объединены инсулин и другие жидкости. Способы данного изобретения включают введение полипептида sHASEGP или фармацевтических композиций, содержащих sHASEGP, до, одновременно или после введения других терапевтических молекул. Можно ввести sHASEGP в месте, отличном от места введения терапевтической молекулы, или же sHASEGP может быть введн в том же самом месте, что и терапевтическая молекула. Итак, в настоящей работе предусматривается семейство секретируемых эукариотами активных в нейтральных условиях гиалуронидазных гликопротеинов, обозначенных sHASEGP, и их функциональных доменов, особенно их гиалуронидазных (или каталитических) доменов, мутеинов и других их производных и аналогов. Предусматриваются здесь также нуклеиновые кислоты, кодирующие sHASEGP. Дополнительно предусматриваются композиции и способы терапевтического применения указанныхsHASEGP для лечения заболеваний и для использования в качестве ферментов, модифицирующих ткани. Краткое описание графических материалов На чертеже фигуры представлена карта вектора HZ24 для sHASEGP. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения А. Определения Если не определено иное, все использованные здесь технические и научные термины имеют такое же значение, как обычно понимается специалистами в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и печатные публикации, последовательности банка данных Genbank, вебсайты и другие опубликованные материалы, на которые производятся ссылки на протяжении всего этого описания, если это не определено иным образом, включены в настоящую работу ссылкой во всей их полноте. В том случае, когда для используемых здесь терминов существует несколько определений, предпочтение отдатся определениям, приводимым в этом разделе. Если сделана ссылка на URL или иной подобный идентификатор или адрес, понятно, что такие идентификаторы могут меняться и что конкретная информация в Интернете может появляться и исчезать, однако поиском в Интернете может быть найдена эквивалентная информация. Ссылка на это свидетельствует о доступности и открытом распространении такой информации. Сокращения для любых защитных групп, аминокислот и других соединений, как они использованы в настоящей работе, находятся, если не указано иное, в согласии с их общепринятым использованием,легко поддающимися расшифровке сокращениями или рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (см. Biochem. 1972, v. 11, p. 942-944). Термин гиалуронидаза эукариот, как он использован в настоящей работе, относится к семейству разнообразных гликозаминогликан-эндоглюкозаминидаз, причм остаток глутамата в гиалуронидазе гидролизует бета-1,4 связи в гиалуронане и хондроитин-сульфатах по кислотно-щелочному механизму катализа. Особый интерес представляют sHASEGP, происходящие из млекопитающих, включая человека. Специалистам в данной области понятно, что, как правило, одиночные аминокислотные замены в существенно неважных частях полипептида не влияют заметным образом на биологическую активность (см.,например, Watson et al. //Molecular Biology of the Gene. 4-е изд. The Benjamin/Cummings Pub. Co. 1987,p. 224). Термин заякоренный в мембране HASEGP, как он использован в настоящей работе, относится к семейству заякоренных в мембране гиалуронидаз, имеющих общие структурные особенности, как описано в настоящей работе. Термин растворимая гиалуронидаза, как он использован в настоящей работе, относится к полипептиду, для которого характерна растворимость при физиологических условиях. Растворимый HASEGP можно отличить, например, по его переходу в водную фазу раствора тритона Х-114, нагретого до 37CHASEGP будет переходить в богатую детергентом фазу, но будет переходить в обедннную детергентом или водную фазу после обработки фосфолипазой C. Таким образом, ссылка, например, на sHASEGP охватывает все гликопротеины, кодируемые семейством генов sHASEGP, включая (но не ограничиваясь ими) sHASEGP человека, sHASEGP мыши, или эквивалентную молекулу, полученную из любого другого источника, или молекулу, приготовленную синтетически, или молекулу, обладающую такой же активностью. Последовательности кодирующих молекул нуклеиновой кислоты и кодируемые аминокислотные последовательности приводимых для примера sHASEGP и/или их доменов, приведены далее, например, в последовательности SEQ ID NO: 4. Этот термин охватывает также sHASEGP с аминокислотными заменами, которые не меняют существенно активность каждого представителя, и охватывают также их варианты, полученные сплайсингом. Подходя-7 009383 щие замещения, включающие, но не обязательно, консервативные замещения аминокислот, известны специалистам в данной области и могут быть сделаны без утраты биологической активности, такой как каталитическая активность, получаемой молекулы. Термин sHASEGP, как он использован в настоящей работе, при всякой ссылке на него, включает по меньшей мере один или все, или любую комбинацию из следующих: полипептид, кодируемый последовательностью нуклеотидов, приведнную далее как последовательность SEQ ID NO: 6, или последовательностью нуклеотидов, включающей нуклеотиды, которые кодируют аминокислоты 1-509 в последовательности SEQ ID NO: 1; полипептид, кодируемый последовательностью нуклеотидов, которая гибридизируется при условиях низкой, умеренной или высокой степени строгости с последовательностью нуклеотидов, приведнной далее как последовательность SEQ ID NO: 6; полипептид, который включает последовательность аминокислот, приведнную далее как аминокислоты 1-509 в последовательности SEQ ID NO: 1; полипептид, который включает последовательность аминокислот, имеющую степень идентичности по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% с последовательностью аминокислот, приведнной далее как последовательность SEQ ID NO: 1 или как аминокислоты 1-448 в последовательности SEQ ID NO: 4. В частности, предусматривается полипептид sHASEGP с гиалуронидазными доменами, как указано в последовательности SEQ ID NO: 4. Полипептид представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный полипептид. Предусматриваются также его меньшие части, которые сохраняют гиалуронидазную активность. Гиалуронидазные домены из sHASEGP различаются по размеру и составу, в том числе имеют вставки и делеции в поверхностных петлях. Таким образом, для указанных здесь целей каталитический домен представляет собой часть sHASEGP, как определено в настоящей работе, и гомологичен домену других гиалуронидазоподобных последовательностей, таких как HYAL1, HYAL2, HYAL3, которые были идентифицированы ранее. Ранее, однако, не было отмечено, что изолированная одноцепочечная форма гиалуронидазного домена человека может функционировать в испытаниях in vitro. В консервативных лейтмотивах присутствуют остатки аспартата и глутамата, необходимые для активности. Термин нейтральный гиалуронидазный домен растворимого sHASEGP относится к бета-1,4-эндоглюкозаминидазному домену sHASEGP, который проявляет гиалуронидазную активность при нейтральном рН, растворим при описанных условиях и имеет одинаковые гомологию и структурные особенности с доменами гиалуронидазного семейства гликозил-гидролаз, но содержит дополнительные последовательности в карбоксильном конце, необходимые для активности в нейтральных условиях. Следовательно, он представляет собой по меньшей мере минимальную часть домена, которая проявляет гиалуронидазную активность при испытаниях стандартными методами анализа in vitro, и остатся растворимым. В настоящей работе рассматриваются такие гиалуронидазные домены и их каталитически активные части. Предусматриваются также усечнные формы гиалуронидазного домена, включающие его наименьший фрагмент, действующий каталитически в виде одноцепочечной формы. Гиалуронидазный домен sHASEGP во всех случаях, когда на него сделана ссылка, включает по меньшей мере один, или все, или любую комбинацию, или каталитически активную часть из следующего: гликопротеиновый полипептид с N-связью, который включает последовательность аминокислот,приведнную далее как последовательность SEQ ID NO: 1; полипептид, кодируемый последовательностью нуклеотидов, которая гибридизируется при условиях низкой, умеренной или высокой степени строгости с последовательностью нуклеотидов, приведнной далее как последовательность SEQ ID NO: 6; полипептид, который включает последовательность аминокислот, приведнную далее как последовательность SEQ ID NO: 1; полипептид, который включает последовательность аминокислот, имеющую степень идентичности по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% с последовательностью аминокислот, приведнной далее как последовательность SEQ ID NO: 1; и/или гиалуронидазный домен полипептида, кодируемого полученным сплайсингом вариантомsHASEGP. Таким образом, для указанных в настоящей работе задач гиалуронидазный домен представляет собой часть sHASEGP, как он определн в настоящей работе, и гомологичен домену других sHASEGP. Так же, как и для более обширного класса ферментов гиалуронидазного семейства, каталитические доменыsHASEGP имеют высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей. В консервативных лейтмотивах присутствуют остатки Asp и Glu, необходимые для активности. Под активной формой подразумевается форма, активная in vivo и/или in vitro. Как описано в настоящей работе, гиалуронидазный домен может также существовать как растворимый секретируемый гликопротеин. В настоящей работе показано, что, по меньшей мере, in vitro одноцепочечные формыsHASEGP и его каталитические домены или ферментативно активные части (как правило, C-концевые усечения) обладают гиалуронидазной активностью. Поэтому в настоящей работе предлагаются изолированные формы гиалуронидазных доменов sHASEGP и способы их применения в анализах на скрининг-8 009383 лекарств in vitro для идентификации агентов, модулирующих их активность. Термин каталитически активный домен sHASEGP, как он использован в настоящей работе, относится к активному в нейтральных условиях эндоглюкозаминидазному домену, как это определено по активности in vitro no отношению к гликозаминогликановому субстрату. Представляющие интерес sHASEGP включают такие sHASEGP, которые активны по отношению к хондроитин-сульфатам и хондроитин-сульфат-протеогликанам (CSPGs) in vivo и in vitro; и такие, которые активны по отношению к гиалуронану. Термин sHASEGP человека представляет собой sHASEGP,кодируемый нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, присутствующей в геноме человека, включая все аллельные варианты и консервативные вариации, если только они не являются вариантами, обнаруживаемыми у других млекопитающих. Термин нуклеиновая кислота, кодирующая гиалуронидазный домен или каталитически активную часть sHASEGP, как он использован в настоящей работе, следует понимать как относящийся к нуклеиновой кислоте, кодирующей лишь перечисленные одноцепочечный гиалуронидазный домен или его активную часть, но не другие смежные части sHASEGP как непрерывную последовательность. Термины заболевание или расстройство, как они использованы в настоящей работе, относятся к патологическому состоянию организма, являющемуся результатом, например, инфекции или генетического дефекта, и характеризуемому годными для идентификации симптомами. Термин сплайсинговый вариант или полученный сплайсингом вариант, как он использован в настоящей работе, относится к варианту, полученному характерной обработкой (процессингом) исходного транскрипта геномной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, приводящей к получению более чем одного типа мРНК. В настоящей работе предусматриваются сплайсинговые варианты sHASEGP. Термин гиалуронидазный домен белка sHASEGP, как он использован в настоящей работе, относится к гиалуронидазному домену sHASEGP, обладающему эндоглюкозаминидазной активностью в нейтральных условиях. Следовательно, он представляет собой, по меньшей мере, минимальную часть белка,которая проявляет эндоглюкозаминидазную активность при испытаниях стандартными способами анализа in vitro. Приводимые для примера гиалуронидазные домены человека включают для проявления эндоглюкозпаминидазной активности, по меньшей мере, достаточную часть последовательностей аминокислот, приведнных далее как последовательность SEQ ID NO: 4. Рассматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, имеющийт эндоглюкозаминидазную активность при анализе активности гиалуронидазы in vitro и степень идентичности последовательности по меньшей мере 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98 или 99% с гиалуронидазным доменом полной длины полипептида sHASEGP, или которые гибридизируются по всей своей длине или по меньшей мере 70, 80 или 90% от полной длины с нуклеиновыми кислотами, кодирующими гиалуронидазный домен, в особенности при условиях умеренной, обычно высокой, степени строгости. Для гиалуронидазных доменов остатки в N-концевой части могут быть крайне важными, но недостаточными для активности. В настоящей работе показано, что гиалуронидазный домен sHASEGP каталитически активен. Следовательно, для активности гиалуронидазного домена нужны, как правило, его Nконцевые аминокислоты; C-концевая часть может быть усечена вплоть до последнего остатка цистеина,но домену для оптимальной активности нужны дополнительные аминокислоты. Количество аминокислот, которые могут быть удалены, можно определить эмпирически тестированием гиалуронидазной активности полипептида анализом in vitro, который определяет степень каталитического расщепления. Поэтому рассматриваются меньшие части гиалуронидазных доменов, в частности их одноцепочечные домены, сохраняющие гиалуронидазную активность. Такие уменьшенные версии представляют собой, как правило, усечнные на C-конце версии гиалуронидазных доменов. Гиалуронидазные домены различаются по размеру и составу, в том числе имеют вставки и делеции в поверхностных петлях. Такие домены проявляют консервативные особенности структуры, включая по меньшей мере одну структурную особенность, такую как донор протона, и/или другие особенности гиалуронидазных доменов эндоглюкозаминидаз. Так, для обозначенных в настоящей работе задач гиалуронидазный домен представляет собой одноцепочечную часть sHASEGP, как он определн в настоящей работе, но он гомологичен по своим структурным особенностям и по сохраняющимся последовательностям, определяющим подобие или гомологию гиалуронидазного домена, другим гиалуронидазо-подобным последовательностям. Гликопротеин проявляет гиалуронидазную активность как одиночная цепь. Под гомологией, как этот термин используется в настоящей работе, подразумевается степень идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты большая, чем 25%, такая как 25, 40, 60, 70, 80, 90,или 95%. При необходимости процент гомологии может быть точно установлен. Термины гомология и идентичность часто используются как взаимозаменяемые. Как правило, последовательности выравнивают таким образом, что получается перекрывание наибольшего порядка (см., например: "ComputationalMath. 1988, v. 48, p. 1073). При установлении идентичности последовательностей определяют число сохраняющихся (консервативных) аминокислот с помощью стандартных программ с алгоритмами выравнивания, которые используются с устанавливаемыми каждым поставщиком программ вычетами несовпадающих пробелов. Существенно гомологичные молекулы нуклеиновых кислот гибридизируются, как правило, при условиях умеренной или высокой степени строгости по всей длине нуклеиновой кислоты или по длине, составляющей по меньшей мере примерно 70, 80 или 90% от полной длины представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Рассматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизирующейся молекуле нуклеиновой кислоты. Можно определить, имеют ли две молекулы нуклеиновой кислоты нуклеотидные последовательности, которые идентичны по меньшей мере, например, на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, или 99% с помощью известных компьютерных алгоритмов, таких как программа "FASTA", использующая, например, параметры вычетов, как предложено Pearson et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988, v. 85, p. 2444. Другие программы включают пакет программ GCG (Devereux J. et al. //Nucleic Acids Research. 1984, v. 12,p. 387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul S.F. //J. Molec. Biol. 1990, v. 215, p. 403; "Guide to Huge Computers". Под ред. Martin J. Bishop. Academic Press, San Diego, 1994; и Carillo et al. //Siam J. Applied Math. 1988, v. 48, p. 1073). Например, для определения идентичности можно использовать функцию BLAST банка данных от National Center for Biotechnology Information. Другие коммерчески поставляемые или открытые программы включают программу DNASTAR "MEGALIGN" PROGRAM (Madison, WI) и программу "Gap" группы University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWD) (Madison, WI). Процент гомологии или идентичности белков и/или молекул нуклеиновой кислоты можно определить, например,с помощью компьютерной программы GAP (см., например, Needleman et al. //J. Mol. Biol. 1970, v. 48,p. 443; ссылка в обзоре Smith and Waterman //Adv. Appl. Math. 1981, v. 2, p. 482). Вкратце, программаGAP определяет степень подобия как число расположенных последовательно символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), являющихся одинаковыми, делнное на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры вычета для программы GAP могут включать: 1) однокомпонентную (одномерную) матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичностей и 0 для неидентичностей) и нормированную матрицу сравнения по Gribskov et al. //Nucl. Acids. Res. 1986, v. 14, p. 6745, описанную в "Atlas of Protein Sequence and Structure". Под ред. Schwartz and Dayhoff.National Biomedical Research Foundation, 1979, p. 353-358; 2) вычет 3,0 для каждого пробела и дополнительный вычет 0,10 для каждого символа в каждом пробеле; 3) отсутствие вычетов для концевых пробелов. Следовательно, термин идентичность, как он использован в настоящей работе, представляет сравнение между испытуемым и референсным полипептидами или полинуклеотидами. Термин не менее чем на 90% идентичен с, как он использован в настоящей работе, относится к проценту идентичности от 90 до 99,99% по отношению к референсным полипептидам. Идентичность на уровне 90% или более указывает на тот факт, предполагая для примера, что сравниваются испытуемый и референсный полипептиды длиной 100 аминокислот; при этом не более 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в испытуемом полипептиде отличаются от аминокислот в референсном полипептиде. Подобные же сравнения могут быть произведены между испытуемым и референсным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены точечными мутациями, случайным образом распределнными по всей длине аминокислотной последовательности, или же они могут быть расположены блоками различной длины в одной или нескольких позициях, составляя максимально допустимую разницу в аминокислотах 10/100(идентичность приблизительно 90%). Различия определены как замещения или делеции в последовательности нуклеиновой кислоты или в последовательности аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше, чем приблизительно 85-90% результат не должен зависеть от программы и установки параметров пробелов; такие высокие уровни идентичности могут быть легко обнаружены, часто без обращения к компьютерным программам. Термин праймер, как он использован в настоящей работе, относится к олигонуклеотиду, содержащему два или более дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида, обычно более трх, которые могут инициировать синтез продукта удлинения праймера. Экспериментальные условия, благоприятные для синтеза, включают наличие нуклеозид-трифосфатов и агента для полимеризации и удлинения, такого как ДНК-полимераза, а также подходящие буфер, температуру и рН. Упоминаемые в настоящей работе животные включают любых животных, таких как (но не ограничиваясь ими) козы, коровы, олени, овцы, грызуны, свиньи и люди. Животные, не являющиеся людьми(non-human animals) не включают человека как рассматриваемое животное. Предусматриваемые в настоящей работе sHASEGP происходят из любого источника: животного, растительного, прокариотического и грибкового. Большинство sHASEGP происходят из животных, включая млекопитающих.- 10009383 Термин генетическая терапия (генная терапия), как он использован в настоящей работе, включает перенос гетерологичной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, в определнные клетки, клетки-мишени из млекопитающего, особенно человека, имеющего расстройство или болезненное состояние, для которого подбирается такая терапия. Нуклеиновую кислоту, такую как ДНК, вводят в выбранные клеткимишени таким способом, что гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, экспрессируется и в результате этого продуцируется кодируемый ею терапевтический продукт. В качестве альтернативы гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, может некоторым способом опосредовать экспрессию ДНК, кодирующей терапевтический продукт, или она может кодировать продукт, такой как пептид или РНК, который некоторым способом опосредует, прямо или косвенно,экспрессию терапевтического продукта. Генетическая терапия может быть также использована для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт гена, которая заменяет дефектный ген или дополняет продукт гена, продуцируемый животным или клеткой, в который она вводится. Вводимая нуклеиновая кислота может кодировать терапевтический продукт, такой как фактор роста или его ингибитор либо фактор некроза опухолей или его ингибитор, такой как его рецептор, который в норме не продуцируется в животном-хозяине или который не продуцируется в терапевтически эффективных количествах или в терапевтически необходимое время. Гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, кодирующая терапевтический продукт, может быть модифицирована перед введением в клетки поражнного хозяина,чтобы усилить или иным образом изменить продукт или его экспрессию. Генетическая терапия может также включать доставку ингибитора или репрессора или иного модулятора экспрессии гена. Термин гетерологичная нуклеиновая кислота, как он использован в настоящей работе, обозначает нуклеиновую кислоту, которая кодирует РНК и белки, которые не продуцируются в нормальных условиях in vivo клеткой, или которая опосредует или кодирует медиаторы, изменяющие экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, путм воздействия на транскрипцию, трансляцию или другие подвергающиеся регуляции биохимические процессы. Гетерологичной нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, может считаться также чужеродная нуклеиновая кислота, такая как ДНК. Любая нуклеиновая кислота, такая как ДНК, которую специалист в данной области может признавать или рассматривать как гетерологичную или чужеродную для клетки, в которой осуществляется экспрессия, входит здесь в понятие гетерологичная нуклеиновая кислота; гетерологичная нуклеиновая кислота включает добавляемую извне нуклеиновую кислоту, которая экспрессируется также и эндогенно. Примеры гетерологичной нуклеиновой кислоты включают (но не ограничиваются ими) нуклеиновую кислоту, которая кодирует прослеживаемые маркерные белки, такие как белок, привносящий лекарственную устойчивость, нуклеиновую кислоту, которая кодирует терапевтически эффективные вещества, такие как противораковые агенты, ферменты и гормоны, и нуклеиновую кислоту, такую как ДНК, которая кодирует другие типы белков, такие как антитела. Антитела, кодируемые гетерологичной нуклеиновой кислотой, могут секретироваться или экспрессироваться на поверхности клетки, в которую была введена гетерологичная нуклеиновая кислота. Гетерологичная нуклеиновая кислота, как правило, не является эндогенной для клетки, в которую она вводится, но получена из другой клетки или приготовлена синтетически. Как правило, хотя и не обязательно, такая нуклеиновая кислота кодирует РНК и белки, которые в нормальных условиях не продуцируются клеткой, в которой она экспрессируется. Термин терапевтически эффективный продукт, как он использован в настоящей работе, обозначает продукт, кодируемый гетерологичной нуклеиновой кислотой, как правило, ДНК, которая, будучи введена в хозяина, экспрессирует продукт, ослабляющий или сводящий на нет симптомы, проявления наследственного или приобретнного заболевания или излечивающий заболевание. Используемое в настоящей работе утверждение, что гликопротеин состоит, по существу, из гиалуронидазного домена, означает, что единственная часть sHASEGP полипептида представляет собой гиалуронидазный домен или его каталитически активную часть. Полипептид может по желанию включать,и, как правило, включает дополнительные, не входящие в sHASEGP, последовательности аминокислот. Термин домен, как он использован в настоящей работе, относится к части молекулы, например,гликопротеина или кодирующей нуклеиновой кислоты, которая структурно и/или функционально отличается от других частей молекулы. Термин гиалуронидаза, как он использован в настоящей работе, относится к ферменту, катализирующему гидролиз гликозаминогликанов. Для ясности ссылка на гиалуронидазу относится ко всем формам и конкретные формы будут специально обозначаться. Для изложенных в настоящей работе задач гиалуронидазный домен включает связанные с мембраной и растворимые формы белка sHASEGP. Упоминаемые в настоящей работе нуклеиновые кислоты включают ДНК, РНК и их аналоги, включая пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) и их смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть однонитевыми или двунитевыми. Когда упоминаются зонды или праймеры, по усмотрению несущие распознаваемую метку, такую как флуоресцентная или радиоактивная метка, рассматриваются однонитевые молекулы. Такие молекулы обычно имеют такую длину, что их мишень статистически уникальна или существует в малом числе копий (обычно менее 5, как правило, менее 3) для зондирования или амплификации опреде- 11009383 лнных последовательностей в библиотеке генов. Как правило, зонд или праймер содержат по меньшей мере 14, 16 или 30 смежных элементов последовательности, комплементарной или идентичной последовательности в рассматриваемом гене. Зонды и праймеры могут быть длиной 10, 20, 30, 50, 100 или более нуклеотидов. Термин нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент или часть sHASEGP, как он использован в настоящей работе, относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей только упоминаемый фрагмент или упоминаемую часть sHASEGP, но не другие части sHASEGP. Термин функциональное (operative) присоединение гетерологичной нуклеиновой кислоты к регуляторным и эффекторным нуклеотидным последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, сайты остановки транскрипции и трансляции и другие сигнальные последовательности, относится к взаимоотношениям между такой нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, и такими последовательностями нуклеотидов. Например, функциональное присоединение гетерологичной ДНК к промотору относится к физической взаимосвязи между ДНК и промотором, в результате чего с промотора инициируется транскрипция такой ДНК РНК-полимеразой, которая специфически распознат, связывается и транскрибирует ДНК в рамке считывания. Поэтому выражения функционально присоединнная или функционально ассоциированная относится к функциональным взаимоотношениям нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, с регуляторными и эффекторными последовательностями нуклеотидов, такими как промоторы,энхансеры, сайты остановки транскрипции и трансляции и другие сигнальные последовательности. Например, функциональное присоединение ДНК к промотору относится к физической и функциональной взаимосвязи между ДНК и промотором, в результате чего транскрипция такой ДНК инициируется с промотора РНК-полимеразой, которая специфически распознат, связывается и транскрибирует ДНК. Для того чтобы оптимизировать экспрессию и/или транскрипцию in vitro, может оказаться необходимым удалить, добавить или изменить 5'-нетранслируемые области (5' UTR) в клонах, чтобы удалить избыточные, потенциально неподходящие альтернативные кодоны инициации трансляции (т.е. стартовые кодоны) или иные последовательности, которые могут мешать экспрессии или снижать е на уровне либо транскрипции, либо трансляции. В качестве альтернативы непосредственно в 5'-положении относительно стартового кодона можно ввести консенсусные сайты связывания с рибосомой (см., например, Kozak //J.Biol. Chem. 1991, v. 266, p. 19867-19870), которые могут усилить экспрессию. Желательность (или необходимость) такой модификации может быть установлена опытным путм. Упоминаемая в настоящей работе последовательность, комплементарная по меньшей мере части РНК, с упоминанием антисмысловых олигонуклеотидов, означает последовательность, чья комплементарность достаточна, чтобы быть способной гибридизироваться с РНК, в основном при условиях умеренной или высокой степени строгости, образуя стабильный дуплекс; в случае двунитевых антисмысловых нуклеиновых кислот sHASEGP можно поэтому тестировать одну нить дуплекса РНК (или двунитевой РНК, dsRNA), или же можно анализировать образование триплекса. Способность гибридизироваться зависит от степени комплементарности и длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Как правило, чем длиннее гибридизирующаяся нуклеиновая кислота, тем больше она может содержать нарушений комплементарного спаривания оснований (base mismatches) с кодируемой РНК sHASEGP, но вс ещ может образовывать стабильный дуплекс (или, как в ряде случаев, триплекс). Специалист в данной области может установить допустимую степень неспаренности оснований с помощью стандартных процедур определения точки плавления гибридного комплекса. Для обозначенных в настоящей работе задач в любом из sHASEGP и их гиалуронидазных доменов могут быть сделаны аминокислотные замены, при условии, что получаемый в итоге белок проявляет гиалуронидазную активность. Рассматриваемые аминокислотные замещения включают консервативные замещения, такие как представленные далее в табл. 1, которые не нарушают протеолитическую активность. Как описывается в настоящей работе, рассматриваются также замещения, которые изменяют свойства белков, такие как удаление сайтов расщепления и других подобных сайтов. Такие замещения,как правило, не являются консервативными, но они могут быть легко произведены специалистами в данной области. Специалистам в данной области подходящие консервативные замещения аминокислот хорошо известны и могут быть произведены, как правило, без изменения у получаемой молекулы биологической активности, например ферментативной активности. Специалистам в данной области понятно, что, как правило, одиночные аминокислотные замещения в несущественных участках полипептида, по существу,не меняют биологическую активность (см., например: Watson et al. "Molecular Biology of the Gene", 4-е изд. The Benjamin/Cummings Pub. Co., 1987, p. 224). В пределы этого определения включн также каталитически активный фрагмент sHASEGP, в особенности одноцепочечная гиалуронидазная часть. Консервативные аминокислотные замещения выполнены, например, в соответствии с замещениями, представленными далее в табл. 1.- 12009383 Таблица 1 Исходный аминокислотный остаток - консервативное замещение Допустимы также другие замещения, которые могут быть определены эмпирически или установлены по соответствию с известными консервативными замещениями. Использованная в настоящей работе аббревиатура Abu обозначает 2-аминомасляную кислоту(2-aminobutyric acid); Orn - это орнитин. Указанные в настоящей работе аминокислоты, которые появляются в различных приводимых аминокислотных последовательностях, идентифицированы в соответствии с их хорошо известными трхбуквенными или однобуквенными аббревиатурами. Нуклеотиды, появляющиеся в различных фрагментах ДНК, даны в стандартных однобуквенных обозначениях, постоянно используемых в данной области. Приводимые в настоящей работе зонды или праймеры, основанные на раскрываемых в настоящей работе нуклеотидных последовательностях, содержат последовательности по меньшей мере из 10, 14,обычно по меньшей мере из 16 соприкасающихся нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 6,а зонды - по меньшей мере из 30, 50 или 100 соприкасающихся нуклеотидов последовательностиSEQ ID NO: 6. Длина зонда или праймера, обеспечивающая уникальную гибридизацию, является функцией сложности представляющего интерес генома. Упоминаемое в настоящей работе ослабление симптомов конкретного расстройства введением конкретной фармацевтической композиции относится к любому уменьшению: постоянному или временному, длящемуся или преходящему, которое может быть приписано введению или связано с введением композиции. Термин антисмысловые полинуклеотиды, как он использован в настоящей работе, относится к синтетическим последовательностям нуклеотидных гетероциклических оснований, комплементарным мРНК или смысловой нити двунитевой ДНК. Смесь смысловых и антисмысловых полинуклеотидов при подходящих условиях приводит к связыванию двух молекул, или гибридизации. Если эти полинуклеотиды связываются (гибридизируются) с мРНК, происходит ингибирование синтеза белка (трансляции). Если эти полинуклеотиды связываются с двунитевой ДНК, происходит ингибирование синтеза РНК(транскрипции). Получаемое в результате ингибирование трансляции и/или транскрипции ведт к ингибированию синтеза белка, кодируемого смысловой нитью. Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты обычно содержит достаточное число нуклеотидов, чтобы специфически связаться с целевой нуклеиновой кислотой; обычно это по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов, часто по меньшей мере 14 или 16, или 30 смежных нуклеотидов или модифицированных нуклеотидов, комплементарных кодирующей части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует целевой ген, например нуклеиновой кислоты, которая кодирует одноцепочечный гиалуронидазный домен sHASEGP. Термин сетка, матрица (array), как он использован в настоящей работе, относится к набору элементов, таких как антитела, содержащему три или более элемента. Матица с адресованием - это такая матрица, в которой элементы могут быть идентифицированы, обычно по положению на твердофазной подложке. Поэтому элементы матрицы, как правило, иммобилизованы на дискретных доступных для идентификации участках на поверхности тврдой фазы. Термин антитело, как он использован в настоящей работе, относится к иммуноглобулину, либо природному, либо полученному частично или полностью синтетическим путм, включая любое его производное, которое сохраняет специфическую способность антитела к связыванию. Поэтому антитело включает любой белок, имеющий домен связывания, гомологичный или существенно гомологичный домену связывания иммуноглобулина. Антитела включают представителей любых иммуноглобулиновых семейств, в том числе IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин фрагмент антитела, как он использован в настоящей работе, относится к любому производному антитела, которое меньше его полной длины, сохраняющему по меньшей мере часть специфической способности к связыванию антитела полной длины. Примеры фрагментов антитела включают (но не ограничиваются ими) фрагменты Fab, Fab', F(ab)2, одноцепочечный Fvs (scFV), Fv, двойное антитело(diabody) dsFv и фрагменты Fd. Фрагмент может включать несколько цепей, соединнных вместе, например, дисульфидными мостиками. Фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере около 50 аминокислот и обычно по меньшей мере 200 аминокислот. Упоминаемый в настоящей работе фрагмент антитела Fv состоит из одного варьируемого тяжлого домена (VH) и одного варьируемого лгкого домена, соединнных нековалентными взаимодействиями. Упоминаемый в настоящей работе dsFv относится к Fv со сконструированной межмолекулярной дисульфидной связью.- 13009383 Упоминаемый в настоящей работе фрагмент F(ab)2 - это фрагмент антитела, полученный в результате расщепления иммуноглобулина пепсином при рН 4,0-4,5; он может быть экспрессирован с помощью генно-инженерных способов, чтобы получить эквивалентный фрагмент. Упоминаемые в настоящей работе фрагменты Fab - это фрагменты антитела, получаемые путм расщепления иммуноглобулина папаином; они могут быть экспрессированы с помощью генноинженерных способов, чтобы получить эквивалентный фрагмент. Используемое в настоящей работе обозначение scFv относится к фрагментам антитела, содержащим варьируемую лгкую цепь V и варьируемую тяжлую цепь (VH), ковалентно соединнные полипептидным мостиком в любой последовательности. Мостик имеет такую длину, чтобы два варьируемых домена были соединены, не мешая друг другу. Мостики включают последовательности n остатков (Gly-Ser) с некоторым количеством распределнных среди них остатков Glu или Lys для повышения растворимости. Термин очеловеченные антитела (humanized antibodies), как он использован в настоящей работе, относится к антителам, которые модифицированы включением свойственных человеку последовательностей аминокислот, так что их введение человеку не провоцирует иммунного ответа. Способы приготовления таких антител известны. Например, чтобы получить такие антитела, гибридому или другую прокариотическую или эукариотическую клетку, такую как клетку Е. coli или CHO, которая экспрессирует моноклональные антитела, изменяют с помощью техники рекомбинантной ДНК таким образом,чтобы она экспрессировала антитела, в которых аминокислотный состав неварьируемой части основан на составе антител человека. Для идентификации таких участков были разработаны компьютерные программы. Упоминаемые в настоящей работе двойные антитела (diabodies) - это димерные scFv; двойные антитела обычно имеют более короткие пептидные мостики, чем scFv, и они, как правило, димеризуются. Термин продукция рекомбинантным способом, как он использован в настоящей работе, значит с помощью методов рекомбинантной ДНК, что означает применение хорошо известных методов молекулярной биологии для экспрессирования белков, кодируемых клонированной ДНК. Подразумевается, что термин определение (assessing) включает качественное и количественное определение в смысле получения абсолютной величины для активности sHASEGP или его домена, присутствующего в образце, а также получения показателя, соотношения, процентной доли, визуальной или другой величины, указывающей на уровень активности. Определение может быть прямым или косвенным, и реально обнаруживаемое химическое вещество, конечно, не должно быть обязательно самим продуктом протеолиза, но может быть, например, его производным или некоторым дальнейшим веществом. Термин биологическая активность как он использован в настоящей работе, относится к активностям соединения in vivo или к физиологическим проявлениям, являющимся следствием введения in vivo соединения, композиции или иной смеси. Таким образом, биологическая активность касается терапевтических воздействий и фармацевтической активности таких соединений, композиций и смесей. Виды биологической активности могут быть наблюдаемы в системах in vitro, разработанных для тестирования или использования таких видов активности. Так, для очерченных в настоящей работе задач биологической активностью люциферазы является е оксигеназная активность, вследствие которой при окислении субстрата испускается свет. Термин функциональная активность, как он используется в настоящей работе, относится к полипептиду или его части, которые проявляют одну или более активностей, присущих белку полной длины. Типы функциональной активности включают (но не ограничиваются ими) биологическую активность, каталитическую или ферментативную активность, антигенность (способность связываться с антиполипептидным антителом или конкурировать с полипептидом за связывание с антиполипептидным антителом), иммуногенность, способность образовывать мультимеры, способность специфически связываться с рецептором или лигандом для полипептида. Термин конъюгат, как он использован в настоящей работе, относится к предусматриваемым в настоящей работе соединениям, которые включают один или более из sHASEGP, включая sHASEGP, в частности и его одноцепочечные гиалуронидазные домены, и один или более из нацеливающих агентов. Эти конъюгаты включают конъюгаты, продуцируемые рекомбинантными способами в виде слитых белков, получаемые химическими способами, такими как химическое сшивание путм, например, сшивания с сульфгидрильными группами, и получаемые любым другим способом, причм по меньшей мере одинsHASEGP или его домен соединн, непосредственно или через мостик(и), с нацеливающим агентом. Термин нацеливающий агент (targeting agent), как он использован в настоящей работе, представляет собой любой фрагмент, такой как белок или его эффективная часть, который обеспечивает специфическое связывание конъюгата с рецептором клеточной поверхности, который может интернализовать(переносить в клетку) конъюгат или его sHASEGP-часть. Нацеливающий агент может быть также таким агентом, который содействует или усиливает, например, аффинное выделение или очистку конъюгата,прикрепление конъюгата к поверхности или обнаружение конъюгата или комплексов, содержащих конъюгат.- 14009383 Упоминаемый в настоящей работе термин конъюгат с антителом относится к конъюгату, в котором нацеливающим агентом является антитело. Термины производное или аналог молекулы, как они используются в настоящей работе, относятся к полученной из молекулы е части или к модифицированной версии молекулы. Термин эффективное количество соединения для лечения конкретного заболевания, как он использован в настоящей работе, - это количество, достаточное, чтобы ослабить или некоторым образом уменьшить симптомы, связанные с заболеванием. Такое количество может быть введено в виде разовой дозы или может вводиться курсом, в зависимости от того, в каком случае оно эффективно. Это количество может излечивать заболевание, но обычно оно вводится, чтобы ослабить симптомы заболевания. Для достижения необходимой степени ослабления симптомов может потребоваться повторное введение. Термин эквивалентный, как он использован в настоящей работе, если он относится к двум последовательностям нуклеиновых кислот, означает, что рассматриваемые последовательности кодируют одну и ту же последовательность аминокислот или эквивалентные белки. Если понятие эквивалентный используется в отношении двух белков или пептидов, это означает, что два белка или пептида имеют, по существу, одну и ту же аминокислотную последовательность только с такими аминокислотными замещениями (такими, но не ограничиваясь ими, как консервативные замещения, такие как приведнные выше в табл. 1), которые не меняют существенно активность или функцию белка или пептида. Если эквивалентный относится к свойству, это свойство не обязательно должно присутствовать в той же самой степени (например, два пептида могут проявлять разные скорости в одном и том же типе ферментативной активности), но активности обычно, по существу, одни и те же. Комплементарный, если это относится к двум нуклеотидным последовательностям, означает, что две последовательности нуклеотидов способны гибридизироваться, обычно с содержанием нарушений спаривания между противолежащими нуклеотидами менее 25, 15, 5 или 0%. При необходимости процент комплементарности может быть точно определн. Обычно две молекулы выбирают таким образом, что они будут гибридизироваться в условиях высокой степени строгости. Упоминаемый в настоящей работе агент, модулирующий активность белка или экспрессию гена или нуклеиновой кислоты, либо снижает, либо повышает, либо иным образом изменяет активность белка или же некоторым образом регулирует е с повышением или с понижением, или иным образом изменяет экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Термин ингибитор активности sHASEGP, как он использован в настоящей работе, охватывает любое вещество, которое прекращает или снижает продукцию, посттрансляционную модификацию (модификации), созревание или мембранную локализацию sHASEGP, или любое вещество, мешающее его протеолитической эффективности или снижающее его протеолитическую эффективность, в частности,его одноцепочечной формы в анализах на скрининг in vitro. Термин способ лечения или предотвращения опухолевого заболевания, как он использован в настоящей работе, означает, что любой из симптомов, таких как опухоль, е метастазы, васкуляризация опухолей или другие параметры, которыми характеризуется заболевание, уменьшаются, снижаются,предотвращаются, переводятся в состояние ремиссии или поддерживаются в состоянии ремиссии. Он также означает, что признаки опухолевого заболевания и метастазирования могут быть удалены, уменьшены или предотвращены лечением. Неограничивающие примеры признаков включают неконтролируемое разрушение базальной мембраны и проксимального внеклеточного матрикса, миграцию, деление и организацию клеток эндотелия в новые функционирующие капилляры и устойчивость таких функционирующих капилляров. Термин фармацевтически приемлемые соли, эфиры или иные производные конъюгатов, как он использован в настоящей работе, включает любые соли, эфиры или производные, которые могут быть легко приготовлены специалистами в данной области с использованием известных способов для такой обработки и получением в итоге соединений, которые могут быть введены животным или людям без существенных токсических воздействий и которые являются фармацевтически активными или представляют собой предшественники лекарств. Термин пролекарство (предшественник лекарства, prodrug), как он использован в настоящей работе, - это соединение, которое при введении in vivo подвергается метаболизму или иным образом превращаетсяв биологически, фармацевтически или терапевтически активную форму соединения. Для того чтобы получить пролекарство, фармацевтически активное соединение модифицируют таким образом, что активный компонент регенерируется в ходе метаболических процессов. Пролекарство может быть предназначено для изменения метаболической стабильности или транспортных характеристик лекарства, чтобы препятствовать побочным эффектам или токсичности, чтобы улучшить вкус лекарства или изменить другие характеристики или свойства лекарства. На основании знания фармакодинамических процессов и метаболизма лекарства in vivo, специалисты в данной области могут (если известно фармацевтически активное соединение) сконструировать предшественники этого соединения (см., например: Nogrady //"Medicinal Chemistry. A Biochemical Approach". Oxford University Press, New York,1985, p. 388-392).- 15009383 Термин лекарство, идентифицированное предусматриваемыми в настоящей работе способами скрининга, как он использован в настоящей работе, относится к любому соединению, которое является кандидатом для применения в качестве терапевтического или преимущественного соединения (lead compound) для создания терапевтического соединения. Такими веществами могут быть небольшие молекулы, в том числе небольшие органические молекулы, пептиды, пептидоимитаторы, антисмысловые молекулы или двунитевые РНК (dsRNA), такие как RNAi, антитела, фрагменты антител, рекомбинантные антитела и другие соединения, которые могут быть кандидатами в лекарства или преимущественными соединениями. Термин пептидоимитатор, как он использован в настоящей работе, обозначает соединение, которое имитирует конформацию и определнные стереохимические особенности биологически активной формы конкретного пептида. Как правило, пептидоимитаторы конструируют, чтобы имитировать определнные желательные свойства соединения, но не повторять нежелательные свойства, такие как гибкость, которая приводит к утрате биологически активной конформации и разрыву связей. Пептидоимитаторы могут быть приготовлены из биологически активных соединений путм замещения биоизостерами определнных групп или связей, которые дают вклад в нежелательные свойства. Биоизостеры (т.е. вещества, имеющие подобную пространственную, стерическую конфигурацию) известны специалистам в данной области. Например, метиленовый биоизостер CH2S был использован как амидный заместитель в аналогах энкефалина (см., например, Spatola //"Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, andProteins". Под ред. Weistein, v. 7. Marcel Dekker, New York, 1983). Морфин, который можно вводить перорально, является пептидоимитатором пептида эндорфина. Для определнных в настоящей работе задач среди пептидоимитаторов включены циклические пептиды. Термины промоторная область или промоторный элемент, как они использованы в настоящей работе, относятся к сегменту ДНК или РНК, контролирующему транскрипцию ДНК или РНК, к которым он функционально присоединн. Промоторная область включает специфические последовательности,достаточные для распознавания РНК-полимеразой, е связывания и инициации транскрипции. Эта часть промоторной области называется промотором. Кроме того, промоторная область включает последовательности, модулирующие эту активность РНК-полимеразы в распознавании, связывании и инициации транскрипции. Эти последовательности могут быть действующими в цис-положении или могут участвовать в действии трансфункционирующих факторов. Промоторы, в зависимости от природы регуляции, могут быть конститутивными или регулируемыми. Рассматриваемые для примера промоторы для использования в прокариотах включают промоторы бактериофагов Т 7 и Т 3. Термин рецептор, как он использован в настоящей работе, относится к молекуле, которая имеет сродство (аффинность) к данному лиганду. Рецепторы могут быть существующими в природе или синтетическими молекулами. В данной области рецепторы могут быть также названы антилигандами. Термины рецептор и антилиганд, как они использованы в настоящей работе, являются взаимозаменяемыми. Рецепторы могут использоваться в их неизменнном состоянии или как агрегаты с другими видами. Рецепторы могут быть прикреплены, ковалентно или нековалентно, к связывающему участнику или могут находиться с ним в физическом контакте; это может осуществляться прямо или косвенно - через посредство специфического связывающего вещества или мостика (линкера). Примеры рецепторов включают (но не ограничиваются ими): антитела, рецепторы клеточной мембраны (рецепторы поверхности и интернализующие рецепторы), моноклональные антитела и антисыворотки, реагирующие со специфическими антигенными детерминантами, такими как находящиеся на вирусах, клетках или других материалах), лекарства, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, пептиды, факторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны и органеллы. Примеры рецепторов и применений с использованием таких рецепторов включают (но не ограничиваются ими: а) ферменты: специфические транспортные белки или ферменты, необходимые для выживания микроорганизмов, которые могут служить мишенями для отбора антибиотиков (лигандов);b) антитела: может быть исследована идентификация лиганд-связывающего сайта на молекуле антитела, которая соединяется с эпитопом представляющего интерес антигена; определение последовательности, имитирующей антигенный эпитоп может привести к разработке вакцин, иммуноген которой основывается на одной или более из таких последовательностей; или привести к разработке связанных с этим диагностических агентов или соединений, полезных в терапевтическом воздействии на такие заболевания, как аутоиммунные заболевания;c) нуклеиновые кислоты: идентификация сайтов связывания лиганда, такого как белок или РНК;d) каталитические полипептиды: полимеры, в том числе полипептиды, которые способны запускать химическую реакцию, включая конверсию одного или более реагентов в один или более продуктов; такие полипептиды, как правило, включают сайт связывания, специфичный для по меньшей мере одного реагента или промежуточного соединения в реакции, и функционально активный участок, следующий непосредственно за сайтом связывания, в которых функционально активный участок способен химически модифицировать связанный реагент (см., например, патент США 5215899);e) рецепторы гормонов: определение лигандов, связывающихся с высокой степенью сродства с рецептором полезно для разработки терапии с замещением гормонов; например, идентификация лигандов,связывающихся с такими рецепторами, может приводить к разработке лекарств для контроля кровяного давления;f) рецепторы наркотиков (опиатные рецепторы): установление лигандов, связывающихся с рецепторами наркотиков в мозгу, полезно для разработки заместителей морфина и других родственных лекарств, дающих меньшее привыкание. Термин образец, как он использован в настоящей работе, относится ко всему, что содержит подлежащий анализу объект, для которого необходим анализ. Образцом может быть биологический образец,такой как биологическая жидкость или биологическая ткань. Примеры биологических жидкостей включают мочу, кровь, плазму, сыворотку, слюну, семенную жидкость, испражнения, мокроту, спинномозговую жидкость, слзы, слизь, сперму, околоплодные воды или подобные им. Биологическими тканями являются агрегаты клеток, обычно определнного типа, вместе с их внеклеточным веществом, которые формируют один из структурных материалов структуры человека, животного, растения, бактерии,грибка или вируса, включая соединительные, эпителиальные, мышечные и нервные ткани. Примеры биологических тканей включают также органы, опухоли, лимфатические узлы, артерии и индивидуальные клетки. Термин строгость условий гибридизации при определении процентного содержания неспаренностей оснований, как он использован в настоящей работе, состоит в следующем: 1) Высокая степень строгости: 0,1SSPE (SSPE - 0,18 М NaCl в фосфатном буфере, рН 7,4),0,1% SDS (додецилсульфат натрия), 65C. 2) Средняя степень строгости: 0,2SSPE, 0,1% SDS, 50C. 3) Низкая степень строгости: 1,0SSPE, 0,1% SDS, 50C. Специалистам в данной области известно, что этап промывки отбирает стабильные гибриды, и известны также ингредиенты SSPE (см., например, Sambrook, Fritsch E.F., Maniatis Т.В. Molecular Cloning,A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, v. 3, p. В.13; см. также многочисленные каталоги, описывающие обычно используемые лабораторные растворы). Далее, специалистам в данной области понятно, что стабильность гибридов определяется температурой плавления (Tm), которая является функцией концентрации ионов натрия и температуры(Tm=81,5C-16,6+0,41(% G+C)-600/L), так что единственными параметрами в условиях промывки, важными для стабильности гибридов, являются концентрация ионов натрия в SSPE (или SSC) и температура.SSC - standard saline-citrate solution: 0,15 М NaCl+0,015 М Na-цитрат, рН 7. Понятно, что эквивалентные степени строгости могут быть получены при использовании альтернативных буферов, солей и температуры. Только с целью примера, но не ограничения, могут быть приведены следующие процедуры, использующие условия низкой степени строгости (см. также Shilo andWeinberg //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981, v. 78, p. 6789-6792): содержащие ДНК фильтры предварительно обрабатывают в течение 6 ч при 40C раствором, содержащим 35% формамид, 5SSC, 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА (этилендиамин-тетраацетат), 0,1% ПВП (поливинилпирролидон), 0,1% фиколл, 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) и 500 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося. 10SSC представляет собой раствор 1,5 М хлорида натрия и 0,15 М цитрата натрия, рН которого доведн до 7. Гибридизацию проводят в таком же растворе со следующей модификацией: 0,02% ПВП,0,02% фиколл, 0,2% БСА, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 10% (масса к объму) декстран-сульфат и(5-20)106 имп./мин меченого 32 Р-зонда. Фильтры инкубируют в гибридизационной смеси в течение 18-20 ч при 40C и затем промывают в течение 1,5 ч при 55C раствором, содержащим 2SSC, 25 мМ трис-HCl (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА и 0,1% SDS. Промывной раствор заменяют свежим раствором и инкубируют в течение ещ 1,5 ч при 60C. Фильтры просушивают фильтровальной бумагой и экспонируют с плнкой для авторадиографии. При необходимости фильтры промывают третий раз при 65-68C и повторно экспонируют с плнкой. Другие условия для низкой степени строгости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области (например, это условия, которые используют при межвидовой гибридизации ДНК). С целью примера, но не ограничения, могут быть приведены следующие процедуры, использующие условия умеренной (средней) степени строгости. Содержащие ДНК фильтры предварительно выдерживают в течение 6 ч при 55C в растворе, содержащем 6SSC, 5 раствор Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизацию проводят в том же растворе, добавляя(5-20)106 имп./мин меченого 32 Р-зонда. Фильтры инкубируют в гибридизационной смеси в течение 18-20 ч при 55C и затем промывают дважды в течение 30 мин при 60C в растворе, содержащем 1SSC и 0,1% SDS. Фильтры просушивают фильтровальной бумагой и экспонируют с плнкой для авторадиографии. Другие условия умеренной степени строгости, которые можно использовать, хорошо известны в данной области. Промывание фильтров может производиться при 37C в течение 1 ч в растворе, содержащем 2SSC и 0,1% SDS.- 17009383 С целью примера, но не ограничения, могут быть приведены следующие процедуры, использующие условия высокой степени строгости. Предгибридизацию содержащих ДНК фильтров проводят в течение 8 ч в течение ночи (до следующего дня) при 65C в буфере, состоящем из 6SSC, 50 мМ трис-HCl(рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% ПВП, 0,02% фиколла, 0,02% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося. Фильтры подвергают гибридизации в течение 48 ч при 65C в предгибридизационной смеси, содержащей 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося и (5-20)106 имп./мин меченого 32 Р-зонда. Промывку фильтров проводят при 37C в течение 1 ч в растворе, содержащем 2SSC, 0,01% ПВП, 0,01% фиколл и 0,01% БСА. После этого проводится промывка в 0,1SSC при 50C в течение 45 мин с последующей авторадиографией. Другие условия высокой степени строгости, которые можно использовать, хорошо известны в данной области. Термины по существу, идентичный или по существу, гомологичный или подобные им, как понятно специалистам в данной области, варьируют в зависимости от контекста и обозначают, как правило,по меньшей мере 60 или 70%, предпочтительно по меньшей мере 80 или 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность. Термин по существу, идентичный продукту означает по существу, подобный в том смысле, что представляющее интерес свойство в основном не изменено, вследствие чего, по существу, идентичный продукт может быть использован вместо основного продукта. Термин по существу, чистый, как он использован в настоящей работе, означает - настолько гомогенный, чтобы быть свободным от легко обнаруживаемых примесей, определяемых стандартными способами анализа, такими как тонкослойная хроматография (ТСХ), электрофорез в геле и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которые применяются специалистами в данной области для оценки такой чистоты, или настолько существенно чистый, что дальнейшая очистка не меняет заметным образом физических и химических свойств вещества, таких как ферментативная и биологическая активности. Методы очистки соединений с целью получения, по существу, химически чистых соединений известны специалистам в данной области. По существу, химически чистое соединение может быть, однако,смесью стереоизомеров или изомеров. В таких случаях дополнительная очистка может повысить специфическую активность соединения. Термин клетка-мишень, как он использован в настоящей работе, относится к клетке, которая экспрессирует sHASEGP in vivo. Термин испытуемое вещество (или испытуемое соединение), как он использован в настоящей работе, относится к химически определнному соединению (например, к органическим молекулам, неорганическим молекулам, органическим/неорганическим молекулам, белкам, пептидам, нуклеиновым кислотам, олигонуклеотидам, липидам, полисахаридам, сахаридам или гибридам этих молекул, таким как гликопротеины и т.д.) или к смесям соединений (к примеру, библиотекам испытуемых соединений, природным экстрактам или культуральным жидкостям и т.д.), чь действие на sHASEGP, в частности на одноцепочечную форму, содержащую гиалуронидазный домен или достаточную для активности его часть,определяют in vitro таким способом, как предлагаемые в настоящей работе способы анализа. Такие термины, как терапевтический агент, лечебная схема, радиопротектор или хемотерапевтическое средство, как они использованы в настоящей работе, означают традиционные лекарства и способы лекарственного лечения, в том числе вакцины, которые известны специалистам в данной области. Радиотерапевтические агенты хорошо известны в данной области. Термин лечение, как он использован в настоящей работе, означает любой образ действий, при котором симптомы болезненного состояния, расстройства или заболевания ослабляются или иным образом благоприятно изменяются. Лечение также охватывает любое фармацевтическое применение предлагаемых в настоящей работе композиций. Термин вектор (или плазмида), как он использован в настоящей работе, относится к дискретным элементам, которые используются для введения в клетки гетерологичной нуклеиновой кислоты для не экспрессии или репликации. Векторы, как правило, остаются эписомными, но они могут быть сконструированы так, чтобы достигалась интеграция гена или его части в хромосому генома. Рассматриваются также векторы, являющиеся искусственными хромосомами, такими, как дрожжевые искусственные хромосомы (YAC) и искусственные хромосомы млекопитающих (MAC). Селекция и использование таких переносчиков хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессирующий вектор включает векторы, способные экспрессировать ДНК, которая функционально соединена с регуляторными последовательностями, такими, как промоторные области, которые способны осуществлять экспрессию таких фрагментов ДНК. Таким образом, экспрессирующий вектор относится к конструкции с рекомбинантной ДНК или РНК, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или иной вектор, который при введении в подходящую клетку-хозяина приводит к экспрессии клонированной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают такие векторы, которые способны реплицироваться в эукариотических клетках и/или в прокариотических клетках, и такие, которые остаются эписомными, или такие, которые интегрируются в геном клетки-хозяина.- 18009383 Термин белковая последовательность связывания, как он использован в настоящей работе, относится к последовательности белка или пептида, которая способна специфически связываться с последовательностью другого белка или пептида вообще, с набором последовательностей белков или пептидов или же с конкретной последовательностью белка или пептида. Термин эпитопная метка (epitope tag), как он использован в настоящей работе, относится к короткой протяжнности аминокислотных остатков, соответствующих эпитопу, предназначенных для облегчения последующего биохимического и иммунологического анализа помеченного в эпитопе белка или пептида. Введение метки в эпитоп достигается путм вставки последовательности для эпитопной метки в кодирующую белок последовательность в соответствующем экспрессирующем векторе. Белки с метками в эпитопе можно подвергнуть аффинной очистке, используя высоко специфичные антитела,нацеленные на метки. Термин последовательность связывания с металлом, как он использован в настоящей работе, относится к последовательности белка или пептида, способной специфически связываться вообще с ионами металлов, с набором ионов металлов или с конкретным ионом металла. Термин комбинация, как он использован в настоящей работе, относится к любой ассоциации между двумя или более партнрами. Термин композиция, как он использован в настоящей работе, относится к любой смеси. Это может быть раствор, суспензия, жидкость, порошок, паста - водная или неводная или их любая комбинация. Термин жидкость, как он использован в настоящей работе, относится к любой композиции, которая способна течь. Поэтому жидкости охватывают такие композиции, которые находятся в форме полутврдых веществ, паст, растворов, водных смесей, гелей, лосьонов, кремов и других подобных композиций. Термин клеточный экстракт, как он использован в настоящей работе, относится к препарату или фракции, которые получены из лизированных или разрушенных клеток. Если говорится, что средство (или агент), как этот термин используется в настоящей работе,выбрано случайным образом, это означает, что средство выбрано случайным образом без учета специфических последовательностей, участвующих в ассоциации белка самого по себе или с ассоциированными с ним субстратами, связывающимися партнрами, и т.д. Примером случайным образом выбранных средств является использование химической библиотеки или пептидной комбинаторной библиотеки, или ростовой среды организма, или среды, отвечающей внешним условиям. Если говорится, что средство выбрано или сконструировано рационально, это означает, что средство выбрано на неслучайной основе, которая принимает во внимание связь между последовательностью адресующего сайта и/или его конформацией и действием средства. Как описано в примерах, существуют предполагаемые сайты связывания для гиалуронидазного и (каталитического) сайтов в гликопротеине,имеющем последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность SEQ ID NO: 4. Средства могут быть рационально выбраны или рационально сконструированы путм использования пептидных последовательностей, которые образуют эти сайты. Например, рационально выбранным пептидным средством может быть пептид, чья аминокислотная последовательность идентична сайтам или доменам связывания АТР или кальмодулина. Считается, что олигосахариды имеют редуцирующий конец и нередуцирующий конец, вне зависимости от того, является ли сахарид на редуцирующем конце действительно редуцирующим сахаром. В соответствии с принятой номенклатурой, олигосахариды изображены в настоящей работе с нередуцирующим концом слева и редуцирующим концом справа. Все описанные в настоящей работе олигосахариды описаны с названием или аббревиатурой для нередуцирующего сахарида (например, Gal), за которым следует конфигурация гликозидной связи (альфа или бета), связь в кольце, положение в кольце редуцирующего сахарида, участвующего в связи, и затем название или аббревиатура редуцирующего сахарида (например, GlcNAc). Связь между двумя сахарами может быть обозначена, например, как 2, 3, 2.3 или (2, 3). Каждый сахарид является пиранозой. Термин N-связанный сахарный фрагмент, как он использован в настоящей работе, относится к олигосахариду, присоединнному к sHASEGP посредством амидного азота в остатках Asn.N-связанные олигосахариды подразделяются на несколько главных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфированные), все они имеют сердцевины (Man)3-GlcNAc-GLcNAc-, присоединнные через атом амидного азота в остатках Asn, находящихся в пределах последовательностей-Asn-Xaa-Thr/Ser- (где Хаа - это не Pro). Часто сайты с N-связью косвенно различимы по появлению пустого цикла при секвенировании. Позитивная идентификация может быть осуществлена после высвобождения олигосахарида ферментом PNGазой F, которая превращает гликозилированный Asn в Asp. После удаления PGNазы F N-связанные олигосахариды могут быть очищены с помощью хроматографии на биогеле Р-6, а олигосахаридный пул подвергается препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (high pH anion exchange chromatography, HPAEC) (Townsend et al. //Anal. Biochem. 1989,v. 182, p. 1-8). С помощью HPAEC можно разделить некоторые изомеры олигосахаридов. На хроматограммах HPAEC остатки фукозы смещаются к более раннему элюированию, тогда как остатки дополнительной сиаловой кислоты выходят при большем времени элюирования. Путм сопутствующей обработки гликопротеинов с известной олигосахаридной структурой (например, фетуин крупного рогатого ско- 19009383 та, кислый гликопротеин -1, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) можно улучшить идентификацию олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды можно охарактеризовать сочетанием анализов состава и метилирующих связей (Waeghe et al. //Carbohydr. Res. 1983, v. 123, p.281-304), различая аномерные конфигурации с помощью спектроскопии ЯМР (Van Halbeek //Methods Enzymol. 1993, v. 230). В качестве альтернативы можно идентифицировать олигосахариды с помощью соединнного с флуоресценцией электрофореза углеводов (fluorescence assisted carbohydrate electrophoresis, FACE) (см.Callewaert et al. //Glycobiology. 2001, v. 11, p. 275-281). Термин сиаловая кислота, как он использован в настоящей работе, относится к любому представителю семейства 9-углеродных карбоксилированных сахаров. Наиболее часто встречающимся представителем семейства сиаловых кислот является N-ацетилнейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5 дидезокси-D-глицеро-D-галактононулопираноз-1-ная кислота (обозначение часто сокращается какNeu5Ac, NeuAc или NANA). Вторым представителем семейства является N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc или NeuGc), в которой N-ацетильная группа в NeuAc гидроксилирована. Третьим представителем семейства сиаловых кислот является 2-кето-3-дезоксинонулосоновая кислота (KDN) (Nadanoet al. //J. Biol. Chem. 1986, v. 261, p. 11550-11557; Kanamori et al. //J. Biol. Chem. 1990, v. 265, p. 2181121819). Сюда входят также 9-замещнные сиаловые кислоты, такие как подобные соединению 9-O-C.sub.1-C.sub.6 acyl-Neu5Ac-9-O-лактил-Neu5 Ас или 9-О-ацетил-Neu5 Ас, 9-дезокси-9-фтор-Neu5 Ас и 9-азидо-9-дезокси-Neu5 Ас. Для обзора семейства сиаловых кислот см., например, Varki //Glycobiology. 1992, v. 2, p. 25-40; "Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function". Под ред. R. Schauer. SpringerVerlag, N. Y., 1992. Синтез и применение соединений с сиаловыми кислотами в процедуре сиалирования раскрыты в международной публикации WO 92/16640, опубликованной 1 октября 1992 г. Использованное в настоящей работе обозначение PNGаза (PNGase) относится к специфичной к аспарагиновому пептиду N-гликозидазе F, такой как пептид-N-гликозидаза F из Flavobacterium maningoseptum. Для ферментов PNGaз характерна специфичность к N-связанным, но не к О-связанным олигосахаридам. Охарактеризовать эффективность PNGазы можно с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS или с помощью электрофореза углеводов в соединении с флуоресценцией. Упоминаемое в настоящей работе в основном оконечное сиалирование относится к N-связанным олигосахаридам, оканчивающимся остатком сиаловой кислоты в качестве оконечного сахара. Оконечные сиаловые кислоты могут быть идентифицированы с помощью анализа методом FACE углеводов, высвобождаемых после обработки нейраминидазой. Время жизни гликопротеинов при циркуляции в крови в высокой степени зависит от состава и структуры присоединнных N-связью углеводных групп. Этот факт имеет непосредственное значение для терапевтических гликопротеинов, предназначенных для парентерального введения. Как правило, для максимального времени полужизни в циркуляции гликопротеина необходимо, чтобы его N-связанные углеводные группы оканчивались последовательностью NeuAc-Gal-GlcNAc. Без оконечной сиаловой кислоты (NeuAc) гликопротеин быстро выводится из кровотока с помощью механизма, включающего распознавание прилегающих остатков N-ацетилгалактозамина (GalNAc) или галактозы (Gal) (Goochee etal. //Biol/Technology. 1991, v. 9, p. 1347-1355). По этой причине для коммерческого производства терапевтических гликопротеинов важным обстоятельством является наличие в их N-связанных углеводных группах оконечной сиаловой кислоты. Циркулирующие гликопротеины подвергаются действию сиалидазы (сиалидаз) (или нейраминидазы), которые могут отщеплять концевые остатки сиаловой кислоты. Как правило, удаление сиаловой кислоты открывает галактозные остатки, которые распознаются и связываются галактозоспецифичными рецепторами гепатоцитов (обзор см. в Ashwell and Harford //Ann. Rev. Biochem. 1982, v. 51, p. 531). Печень содержит также другие сахароспецифичные рецепторы, которые являются посредниками в выведении гликопротеинов из циркуляции. Эти рецепторы специфичны также к N-ацетилглюкозамину, маннозе, фукозе и фосфоманнозе. Удаляемые с помощью галактозных рецепторов гликопротеины претерпевают существенное расщепление и затем поступают в жлчь; выводимые с помощью маннозных рецепторов клеток Купфера гликопротеины поступают в ретикулоэндотелиальную систему (обзор см. в Ashwelland Harford //Ann. Rev. Biochem. 1982, v. 51, p. 531). Термин активный в нейтральных условиях (или нейтрально активный), как он использован в настоящей работе, относится к гликопротеину sHASEGP с каталитической активностью по отношению к гликозаминогликановому субстрату in vitro при рН в интервале от 5 до 8 при концентрации соли менее чем 150 мМ и буферной силе менее чем 50 мМ. Термин стабилизированный раствор, как он использован в настоящей работе, относится кsHASEGP, который сохраняет более 60% своей исходной активности после хранения при комнатной температуре в течение 30 дней. Термин единица, как он использован в настоящей работе, если не определн иначе, представляет собой единицу снижения мутности (turbidity reducing unit, TRU). Одна TRU определяется как такая величина гиалуронидазной активности, которая необходима для снижения мутности подкисленного раствора гиалуроновой кислоты и эквивалентна единице NFU Фармакологического справочника фармакопеи США (USP/National Formulary (NF XIII. Приведенный в настоящей работе иммуноферментный анализ- 20009383 типа твердофазного иммуноферментного анализа ELISA может быть соотнесн с единицами TRU, NFU или единицей Национальной фармакопеи США (USP) с помощью стандартной кривой для образца гиалуронидазы (например, стандарт Фармакопеи США или Всемирной организации здравоохранения, ВОЗ),стандартизованного по правилам Фармакопеи США. Следовательно, ферментативные активности, определнные иммуноферментным анализом типа ELISA, выражаются на самом деле в относительных единицах TRU, поскольку в турбидиметрическом анализе ферментативная активность в действительности не измеряется (Dorfman et al. //J. Biol. Chem. 1948, v. 172, p. 367). Эффективность (potency), как она указывается в настоящей работе, определяется количеством белка sHASEGP, необходимого для расщепления субстрата in vitro с использованием единицы снижения мутности или относительной единицы снижения мутности. Термин удельная активность (specific activity), как он использован в настоящей работе, относится к единицам активности на 1 мг белка. Количество белка sHASEGP определяют по поглощению раствораsHASEGP при 280 нм, принимая коэффициент молярной экстинкции равным приблизительно 1,7 М-1 см-1. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) и ранее широко использовался в биоматериалах, биотехнологии и медицине, прежде всего, потому что это - биологически совместимый, нетоксичный, неиммуногенный и водорастворимый полимер (Zhao and Harris //ACS Symposium Series. 1997, v. 680, p. 458-472). В области доставки лекарств производные ПЭГ широко используются в ковалентном присоединении к белкам (например, ПЭГилирование) для снижения их иммуногенности, протеолиза и выведения через почки и для повышения растворимости (Zalipsky //Adv. Drug. Del. Rev. 1995, v. 16, p. 157-182). Подобным же образом присоединяли ПЭГ к низкомолекулярным, относительно гидрофобным лекарствам для повышения их растворимости, снижения токсичности и изменения биологического распределения. Как правило,ПЭГилированные лекарства вводят инъекцией в виде растворов. Тесно связанным применением является синтез сшитых разлагаемых сеток или композиций с ПЭГ для применения в доставке лекарств, поскольку многое из таких же химических подходов, применнных в конструировании разлагаемых, растворимых носителей лекарств, может быть использовано в создании разлагаемых гелей (Sawhney et al. //Macromolecules. 1993, v. 26, p. 581-587). Известно также, что межмолекулярные комплексы можно получать смешиванием растворов двух комплементарных полимеров. Такие комплексы обычно стабилизированы электростатическими взаимодействиями (полианионполикатион), и/или образованием водородных связей (поликислота-полиоснование) между участвующими полимерами, и/или гидрофобными взаимодействиями между полимерами в водном окружении (Krupers et al. //Eur. Polym. J. 1996, v. 32, p. 785-790). Например, смешивание растворов полиакриловой кислоты (ПАК) и полиэтиленоксида (ПЭО) при подходящих условиях приводит к образованию комплексов, в основном путм формирования водородных связей. Диссоциацию этих комплексов при физиологических условиях использовали для доставки свободных лекарств (например, не ПЭГилированных). Кроме того,комплексы комплементарных полимеров получали из гомополимеров и сополимеров. В одном из аспектов полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 3 до приблизительно 50 кДа, предпочтительно приблизительно от 5 до приблизительно 30 кДа. Ковалентное связывание ПЭГ с лекарством (известное как ПЭГилирование) может быть достигнуто с помощью известных методов химического синтеза. Например, в одном из аспектов настоящего изобретения ПЭГилирование белка может быть произведено путм реакции ПЭГ, активированного NHS, с белком при подходящих условиях реакции. Хотя для ПЭГилирования было описано много реакций, наиболее широко применимые из них являются прямыми, используют мягкие реакционные условия, и не требуют экстенсивной последующей обработки для удаления токсичных катализаторов или побочных продуктов. Например, монометоксиПЭГ (мПЭГ) имеет только один реакционно-способный концевой гидроксил, и поэтому его применение частично ограничивает гетерогенность получаемых в смеси продуктов ПЭГ-белок. Обычно для достижения эффективного ПЭГилирования белка необходима активация гидроксильной группы на конце полимера, противоположном концевой метоксигруппе. Это требуется для того, чтобы сделать модифицированный ПЭГ более восприимчивым для нуклеофильной атаки. Атакующим нуклеофилом обычно является эпсилон-аминогруппа лизильного остатка, но при благоприятных локальных условиях и другие амины(например, N-концевой альфа-амин или амины в кольце гистидина) могут давать реакцию. В белках, содержащих одиночный лизин или цистеин, возможно более направленное прикрепление. На остаток цистеина может быть нацелен ПЭГ-малеимид для тиол-специфичной модификации. В качестве альтернативы ПЭГ-гидразид может реагировать с окисленным периодатом sHASEGP и затем быть восстановленным в присутствии NaCNBH3. Более специфично, ПЭГилированные сахара CMP (цитидинмонофосфата,cytidine monophosphate) могут реагировать с sHASEGP в присутствии соответствующих гликозилтрансфераз. Одной из техник является техника ПЭГилирования, в которой к целевому полипептиду присоединено несколько полимерных молекул. При использовании такой техники у иммунной системы возникают трудности в распознавании ответственных за образование антител эпитопов на поверхности полипептида, что ослабляет иммунную реакцию. Для полипептидов, вводимых непосредственно в циркуляторную систему тела человека с целью получения конкретного физиологического эффекта (т.е. для- 21009383 фармацевтических препаратов), типичным потенциальным иммунным ответом является появление IgG и/или IgM, тогда как при ингаляции полипептидов в дыхательную систему (например, полипептиды в промышленных загрязнениях) потенциальным ответом может быть появление IgE (т.е. аллергическая реакция). Одна из теорий, объясняющих сниженный иммунный ответ, состоит в том, что полимерная молекула (полимерные молекулы) экранирует (экранируют) эпитоп(ы) на поверхности полипептида, ответственные за иммунную реакцию, приводящую к образованию антител. Другая теория (или по меньшей мере один из факторов) состоит в том, что чем больше конъюгат, тем большее снижение иммунного ответа получается в итоге. Полимерными молекулами, присоединнными к полипептиду, могут быть любые пригодные полимерные молекулы с молекулярной массой, определнной в соответствии с настоящим изобретением, в том числе природные и синтетические гомополимеры, такие как полиолы (например, поли-ОН), полиамины (например, поли-NH2) и поликарбоновые кислоты (например, поли-COOH), а также гетерополимеры, т.е. полимеры, содержащие одну или более из других связывающихся групп (например, гидроксильную группу и аминогруппы). Примеры подходящих полимерных молекул включают полимерные молекулы, выбранные из группы, содержащей полиалкиленоксиды (ПАО), такие как полиалкиленгликоли (ПАГ), в том числе полиэтиленгликоли (ПЭГ), метоксиполиэтиленгликоли (мПЭГ) и полипропиленгликоли, ПЭГ-глицидиловые эфиры (Ерох-ПЭГ), ПЭГ-оксикарбонилимидазол (CDI-ПЭГ), разветвлнные полиэтиленгликоли (ПЭГs),поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилаты, поливинилпирролидон, поли-D,L-аминокислоты, сополимер полиэтилена с ангидридом малеиновой кислоты, сополимер полистирола с ангидридом малеиновой кислоты, декстраны, в том числе карбоксиметилдекстраны, гепарин, гомологичный альбумин, целлюлозы, в том числе метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиэтилцеллюлозу и гидроксипропилцеллюлозу, гидролизаты хитозана, крахмалы, такие как гидроксиэтилкрахмалы и гидроксипропилкрахмалы, гликоген, агарозы и их производные, камедь гуара,пуллулан, инулин, ксантановую камедь, каррагинан, пектин, гидролизаты альгиновой кислоты и биополимеры. Предпочтительными полимерными молекулами являются нетоксичные полимерные молекулы, такие как метоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), для которого, кроме того, нужны относительно простые химические подходы, чтобы осуществить его ковалентное связывание с реакционными группами на поверхности фермента. Предпочтительными полимерными молекулами являются обычно рассматриваемые полиалкиленоксиды (ПАО), такие как полиэтиленоксиды (такие как ПЭГ и, в особенности, мПЭГ), поскольку эти полимерные молекулы, в сравнении с полисахаридами, такими как декстран, пулуллан и подобные им,имеют небольшое количество реакционноспособных групп, способных обеспечить сшивание. В. Профили экспрессии sHASEGP в тканях Хотя первоначально полагали, что sHASEGP человека специфически находится в яичках, применение более чувствительного анализа методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) позволило установить, что он экспрессируется во многих тканях человека. Транскрипция sHASEGP обнаружена в продолговатом мозгу (головной мозг), эндотелии микрокапилляров, простате, молочной железе, сетчатке глаза, скоплениях меланоцитов человека, сердце плода и беременной матке. sHASEGP экспрессируется также в опухолях половых клеток. Для определения уровней транскрипции sHASEGP в других, кроме яичек, тканях обычно требуется применение ОТ-ПЦР.C. Анализ ферментативной активности sHASEGP Определение гиалуронидазной активности на основе турбидиметрического микротитрования. Гиалуронидазную активность можно обнаружить в подкисленном растворе сыворотки с помощью модифицированного турбидиметрического метода анализа. Для этого необходимы следующие реагенты Готовят следующие реагенты. Раствор ацетатного буфера: 14,0 г ацетата калия, 25,0 мл ледяной уксусной кислоты, вода до 1000 мл. Раствор фосфатного буфера: 2,5 г фосфата натрия двузамещнного (одноосновного), 1,0 г безводного фосфата натрия однозамещнного (двухосновного), 8,2 г хлорида натрия, вода до 1000 мл. Базовый раствор для разбавления фермента: 500 мл раствора фосфатного буфера и 500 мл воды. Рабочий раствор для разбавления фермента: 33 мг гидролизованного желатина растворяют в 50 мл базового раствора для разбавления фермента - готовят не более чем за 2 ч до использования. Буферный раствор для стабилизации образцов (раствор SSB): 125 мкл 20% раствора человеческого сывороточного альбумина и 50 мкл 1 М раствора хлорида кальция в 50 мл рабочего раствора для разбавления фермента, тщательно перемешать. Базовый раствор сыворотки: разбавить 1 объм лошадиной сыворотки 9 объмами раствора ацетатного буфера. Довести рН до 3,1 добавлением 4 Н соляной кислоты и оставить раствор стоять при комнатной температуре в течение 18-24 ч. Хранить раствор при 4C, использовать в течение 30 дней. Рабочий раствор сыворотки: 10 мл базового раствора сыворотки в 30 мл раствора ацетатного буфера, довести температуру до комнатной. Базовый раствор гиалуроновой кислоты: растворить натриевую соль гиалуроновой кислоты в воде до концентрации 5,0 мг/мл. Рабочий раствор гиалуроновой кислоты: 0,75 мл базового раствора гиалуроновой кислоты в 4,25 мл раствора фосфатного буфера. Стандартный базовый раствор: одну упаковку референсного стандартного препарата гиалуронидазы USP растворить в воде до концентрации 1000 ед./мл, разделить на аликвоты по 50 мкл, хранить при 20C. Стандартный рабочий раствор: 40 мкл стандартного базового раствора в 960 мкл холодного рабочего раствора для разбавления фермента, чтобы получить раствор с известной концентрацией 40 ед./мл,готовить непосредственно перед использованием в анализе. Все образцы фермента разбавляют в планшетах на 96 ячеек для низкого связывания белка (Lowa) Область максимальной чувствительности данного анализа располагается между 10 и 30 ед./мл. Для того чтобы минимизировать число определений, следует повторить анализ, чтобы получить результаты, попадающие в этот интервал. Для этого в образце определяют приблизительное полное число ед./мл, а затем выбирают разбавление (полное число разведений), так что конечная концентрация составит около 20 ед./мл.b) Минимальные объмы проб, необходимые для проведения анализа, следующие: фракции FPLC - 50 мкл,надосадочные жидкости из культур ткани - 1 мл,очищенный/концентрированный конечный материал - 10 мкл.c) Для проб с последовательными разведениями делают разведения 1:10 с 3-кратным повтором в планшетах на 96 ячеек для низкого связывания белка, внося пипеткой в каждую ячейку 360 мкл раствора SSB и 40 мкл пробы.- 23009383 Для приготовления стандарта USP получают стандартную кривую USP в планшетах на 96 ячеек для низкого связывания белка, как указано ниже (табл. 3). Таблица 3 Для получения контроля гиалуроновой кислоты в колонках 1-3 готовят его в планшетах на 96 ячеек с плоским дном следующим образом (табл. 4). Таблица 4 Реакционный планшет: Рабочий раствор гиалуроновой кислоты (30 мкл на ячейку) пипетируют в микротитровальный планшет на 96 ячеек с плоским дном, используя 8-канальный дозатор на 50 мкл. Ячейки Н 1-Н 3 оставляют пустыми. В эти ячейки Н 1-Н 3 того же планшета пипетируют рабочий раствор для разбавления фермента (60 мкл на ячейку) (контроль гиалуроновой кислоты). Рабочий раствор сыворотки: 40 мкл рабочего раствора сыворотки помещают в ячейку для переноса и затем переносят в нагревательный блок. Стадия предварительного прогрева: Как только приготовлены оба планшета - планшет на 96 ячеек для низкого связывания белка, содержащий разбавленные пробы, стандарты и контроли, и планшет на 96 ячеек с плоским дном, содержащий рабочий раствор гиалуроновой кислоты, их помещают в нагревательный блок и прогревают в течение 5 мин при 37C. Реакцию инициируют добавлением фермента к субстрату: добавляют по 30 мкл из ферментного планшета во все ячейки в колонке 1 в планшете на 96 ячеек с плоским дном (содержащем субстрат) с помощью 8-канальной пипетки на 5-50 мкл. Фермент-субстратную реакционную смесь всасывают пипеткой 5 раз (прогоняя раствор пипеткой вверх и вниз в течение первых 15 с для обеспечения полного перемешивания проб. После перемешивания фермента и субстрата наконечники пипетки выбрасывают и на дозатор для переноса помещают новый набор наконечников для следующей колонки. Отсчт времени включают заново и в момент времени t=30 с этот процесс повторяют для колонки 2. После следующего 30-секундного интервала, t=1 мин, этот процесс повторяют для колонки 3. Процесс повторяют каждые 30 с, перемещаясь по планшету слева направо, пока все ячейки не будут содержать и фермент, и субстрат. Остановка реакции: Когда отсчт времени достигает t=6 мин, в каждую ячейку пипетируют 240 мкл рабочего раствора сыворотки с помощью 8-канальной пипетки для переноса на 50-300 мкл. Раствор вносят из резервуара для реагентов объмом 50 мл в ячейки колонки 1-го планшета на 96 ячеек с плоским дном. Смесь отсасывают 3 раза (прогоняя раствор пипеткой для переноса вверх и вниз) в течение первых 10 с для обеспечения полного перемешивания. Этот процесс повторяют каждые 30 с, перемещаясь от колонки 1 до колонки 12. После завершения процедуры для последней колонки (колонка 12) реакционный планшет удаляют из нагревательного блока и помещают планшет на регистрационный столик в аппарат для автоматического просмотра планшетов при 640 нм. По ячейкам для стандартной кривой получается линейная калибровка, которая позволяет экстраполировать испытуемые пробы. Альтернативные методы анализа для гиапуронидазы. Микротитровальный анализ биотинилированного гиалуронана. Свободные карбоксильные группы на остатках глюкуроновой кислоты гиалуронана биотинилируют в одностадийной реакции, используя биотин-гидразид (Pierce), сульфо-NHS (Pierce) и 1-этилдиметиламинопропилкарбодиимид (Sigma). Этот субстрат - биотинилированный гиалуронан (ГУ) ковалентно связывают во второй реакции в ячейках микротитровального планшета на 96 ячеек. После завершения ферментативной реакции остаточный субстрат определяют с помощью авидинпероксидазной реакции, которую можно регистрировать в стандартном устройстве для считывания планшетов ELISA. Поскольку субстрат ковалентно связан с микротитровальным планшетом, отсутству- 24009383 ют такие артефакты, как рН-зависимое замещение биотинилированного субстрата. Чувствительность реакции позволяет быстро измерять гиалуронидазную активность в пробах из культивируемых клеток и биологических образцов с разбросом между параллельными анализами менее 10%. Удельную активность гиалуронидазы выражают в единицах снижения мутности (TRU). Одна единица TRU определяется как такая величина гиалуронидазной активности, которая необходима для снижения мутности подкисленного раствора гиалуроновой кислоты и эквивалентна единице NFU Фармакологического справочника фармакопеи США (USP/National Formulary (NF XIII. Проведенный в настоящей работе иммуноферментный анализ типа твердофазного иммуноферментного анализа ELISA может быть соотнесн с единицами TRU, NFU или единицей Национальной фармакопеи США с помощью стандартной кривой для образца гиалуронидазы (например, стандарт Фармакопеи США или Всемирной организации здравоохранения), стандартизованного по правилам Фармакопеи США. Следовательно,ферментативные активности, определнные иммуноферментным анализом типа ELISA, выражаются на самом деле в относительных TRU, поскольку в турбидиметрическом анализе ферментативная активность в действительности не измеряется (Dorfman et al. //J. Biol. Chem. 1948, v. 172, p. 367). Многие методы анализа гиалуронидазы были основаны на измерении появления новых редуцирующих N-ацетиламиногрупп (Bonner and Cantey //Clin. Chim. Acta. 1966, v. 13, p. 746-752) либо утраты вязкости (De Salegui et al. //Arch. Biochem. Biophys. 1967, v. 121, p. 548-554) или мутности (Dorfman andOtt //J. Biol. Chem. 1948, v. 172, p. 367). С очищенными субстратами все эти методы пригодны для определений в присутствии или в отсутствие эндоглюкозамидазной активности. По существу, очищенные субстраты гликозаминогликана могут быть также использованы в анализе по сдвигу подвижности в геле. Гликозаминогликаны смешивают с рекомбинантным sHASEGP для определения эндоглюкозидазной активности, которая приводит к сдвигу подвижности субстрата в геле. Хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, гепаран-сульфат можно получить от фирмы Sigma Chemical. Гиалуронан пупочного жгутика человека можно получить от ICN. Каждый тестовый субстрат разбавляют до концентрации 0,1 мг/мл в буфере с рН в интервале 3,5-7,5. Пробы объмом 10 мкл очищенного sHASEGP или культуральной среды от продуцирующих sHASEGP клеток смешивают с 90 мкл тестового субстрата в необходимом буфере и инкубируют в течение 3 ч при 37C. После инкубации пробы нейтрализуют буфером для образцов (трис-ЭДТА, рН 8,0, содержащий бромфенол синий и глицерин), после чего проводят электрофорез. Гликозаминогликаны детектируют, окрашивая гели в точение ночи 0,5% альцианом голубым в 3% уксусной кислоте с последующей отмывкой краски 7% уксусной кислотой. Расщепление определяют путм сравнения подвижности субстрата в присутствии и в отсутствие фермента. Гиалуронидазную активность можно также определять зимографией гелей с субстратом (Guentenhoner et al. //Matrix. 1992, p.388-396). В этом методе анализа образец наносят на полиакриламидный гель с SDS, содержащий гиалуроновую кислоту, и белки в образце разделяют электрофорезом. Затем гель инкубируют в буфере для анализа фермента и после этого окрашивают для определения распределения гиалуроновой кислоты в геле. Гиалуронидазная активность визуализируется как неокрашенная зона в геле с субстратом.D. Идентификация и выделение генов для полипептида sHASEGP Ген полипептида sHASEGP и/или его доменов может быть получен методами, хорошо известными в области выделения ДНК. Может быть применн любой метод, известный специалистам в области идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих требуемые гены. Для получения клона комплементарной ДНК (кДНК) или геномной ДНК полной длины, кодирующей полипептид sHASEGP, можно использовать любой метод, существующий в данной области. Например, можно использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для размножения (амплификации) последовательности, которая может быть экспрессирована в нормальных тканях (например, нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид sHASEGP (последовательности 1 и 2) из библиотеки геномной ДНК или кДНК). Олигонуклеотидные праймеры, гибридизирующиеся с последовательностями на 3'-и 5'-концах идентифицированных последовательностей, могут быть использованы в качестве праймеров для амплификации с помощью ПЦР последовательностей из образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК, обычно библиотеки кДНК) из соответствующего источника (например, яичек, простаты, молочной железы). ПЦР можно проводить, например, с использованием термоциклера Cetus фирмы Perkin-Elmer и полимеразы Taq (Gene Amp). Подлежащая амплификации ДНК может включать мРНК, или кДНК, или геномную ДНК из любого вида эукариот. Для использования в реакциях ПЦР можно выбрать для синтеза несколько различных вырожденных праймеров. Возможно также варьирование степени строгости условий для гибридизации, используемых при затравке (прайминге) реакций ПЦР с целью амплифицировать гомологи нуклеиновой кислоты (например,чтобы получить последовательности для полипептидов sHASEGP из видов, отличающихся от человека,или чтобы получить последовательности человека с гомологией по отношению к последовательностям для полипептида sHASEGP), обеспечивая большую или меньшую степень подобия последовательностей нуклеиновой кислоты между известной нуклеотидной последовательностью и подлежащим выделению гомологом нуклеиновой кислоты. Для межвидовой гибридизации используют для смягчения степени стро- 25009383 гости низкую степень строгости. Для гибридизации в пределах одного вида используют условия умеренной степени строгости или высокой степени строгости. Условия могут быть определены опытным путм. После успешной амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей кодирующую последовательность для всего идентифицированного полипептида sHASEGP или его части, или же нуклеиновой кислоты, кодирующей весь полипептидный гомолог sHASEGP или его часть, этот сегмент нуклеиновой кислоты может быть подвергнут молекулярному клонированию, секвенирован и использован в качестве зонда для выделения полной кДНК или полного геномного клона. Это, в свою очередь, позволяет определить полную нуклеотидную последовательность гена, провести анализ его экспрессии и получить его белковый продукт для функционального анализа. Когда нуклеотидная последовательность определена, открытая рамка считывания, кодирующая белковый продукт гена полипептида sHASEGP, может быть определена любым методом, хорошо известным в данной области для определения открытых рамок считывания, например с помощью общедоступных компьютерных программ анализа нуклеотидных последовательностей. Как только открытая рамка считывания установлена, нетрудно определить аминокислотную последовательность белка, кодируемого открытой рамкой считывания. Таким путм можно идентифицировать нуклеотидную последовательность полных генов полипептида sHASEGP, так же как и аминокислотную последовательность белков полипептида sHASEGP и его аналогов. Любая эукариотическая клетка в принципе может служить источником нуклеиновой кислоты для молекулярного клонирования гена полипептида sHASEGP. Нуклеиновые кислоты можно выделить из клеток позвоночных, млекопитающих, людей, свиней, кошачьих, птиц, лошадей, собак, а также из других видов приматов, насекомых, растений и иных организмов. ДНК может быть получена стандартными методами, известными в данной области, из клонированной ДНК (например из ДНК-библиотеки), химическим синтезом, клонированием кДНК или клонированием геномной ДНК или е фрагментов, полученных и очищенных из требуемых клеток (см., например, Sambrook et al. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2-е изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; "DNACloning: A Practical Approach". Под ред. Glover D.M. MRL Press, Ltd. Oxford, UK, 1985, v. 1, p. 11). Полученные из геномной ДНК клоны могут содержать, кроме кодирующих участков, регуляторные и интронные участки ДНК, полученные из кДНК клоны будут содержать только экзонные последовательности. При любом источнике, ген клонируют в подходящий вектор для его воспроизводства. При молекулярном клонировании гена из геномной ДНК получаются фрагменты ДНК, некоторые из которых кодируют требуемый ген. ДНК может быть расщеплена в специфических местах с помощью различных ферментов рестрикции. В качестве альтернативы для фрагментирования ДНК можно использовать ДНКазу в присутствии ионов марганца или же ДНК можно фрагментировать механически, например, с помощью ультразвука. Затем линейные фрагменты ДНК можно разделить по размерам с помощью стандартных методов, включающих (но не ограниченных ими) электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле и колоночную хроматографию. Когда фрагменты ДНК получены, можно осуществить различными способами идентификацию фрагмента, содержащего требуемый ген. Например, часть гена полипептида sHASEGP (любого вида), например, полученная как продукт амплификации в ПЦР в соответствии с описанным выше, или олигонуклеотид, имеющий известную нуклеотидную последовательность или е часть, или его специфическая РНК, или е фрагмент могут быть очищены и помечены, и созданные фрагменты ДНК могут быть подвергнуты скринингу путм гибридизации нуклеиновой кислоты с меченым зондом (Benton and Davis //Science. 1977, v. 196, p. 180; Grunsteinand Hogness. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, v. 72, p. 3961). Фрагменты ДНК, имеющие существенную гомологию с зондом, будут с ним гибридизироваться. Можно также идентифицировать подходящий фрагмент с помощью расщепления ферментом (ферментами) рестрикции и сопоставления размеров полученных фрагментов с размерами, ожидаемыми на основании известной карты рестрикции (если она имеется), или с помощью анализа последовательности ДНК и е сопоставления с известной нуклеотидной последовательностью для полипептида sHASEGP. Дальнейшую селекцию можно осуществить на основании свойств гена. В качестве альтернативы наличие гена может быть установлено анализом физических, химических или иммунологических свойств его экспрессированного продукта. Например, могут быть отобраны клоны кДНК или клоны ДНК, селективно гибридизирующиеся с подходящей мРНК, которые продуцируют белок, имеющий, например, похожие или идентичные электрофоретическую подвижность, поведение при изоэлектрическом фокусировании, карты протеолитического расщепления,антигенные свойства, гиалуронидазную активность. Если имеются антитела к полипептиду sHASEGP,белок можно идентифицировать по связыванию меченых антител с клонами, предположительно синтезирующими полипептид sHASEGP, с помощью метода типа твердофазного иммуноферментного анализаELISA (enzyme-linked immunosorbent, assay). Альтернативные подходы в выделении геномной ДНК для полипептида sHASEGP включают (но не ограничиваются ими) химический синтез последовательности гена по известной последовательности или получение по мРНК кодирующей полипептид sHASEGP кДНК.- 26009383 Например, РНК для клонирования кДНК гена полипептида sHASEGP можно выделить из клеток,экспрессирующих белок. Затем идентифицированные и выделенные нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в подходящий клонирующий вектор. Можно использовать большое число систем векторхозяин, известных в данной области. Возможные векторы включают (но не ограничиваются ими) плазмиды или модифицированные вирусы, однако векторная система должна быть совместима с использованной клеткой-хозяином. Такие векторы включают (но не ограничиваются ими) бактериофаги, такие как производные бактериофага X, или плазмиды, такие как плазмидные производные pBR322 или pUC вектора Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Вставка в клонирующий вектор может быть, например, осуществлена вшиванием (лигированием) фрагмента ДНК в клонирующий вектор, имеющий комплементарные липкие концы. Если комплементарные сайты рестрикции, необходимые для вставки фрагмента ДНК, отсутствуют в клонирующем векторе, концы молекул ДНК можно ферментативно модифицировать. В качестве альтернативы любой необходимый сайт можно создать пришивкой нуклеотидных последовательностей(линкеров, мостиков) на концы ДНК; эти пришитые линкеры могут включать специфические синтезированные химически олигонуклеотиды, кодирующие узнаваемые последовательности для рестрикционных эндонуклеаз. В альтернативном способе расщеплнный вектор и ген полипептида sHASEGP можно модифицировать пришивкой гомополимеров на их концах. Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клетки-хозяева путм трансформации, трансфекции, инфекции, электропорации, осаждения кальцием или иными способами, так что создатся большое число копий последовательности гена. В специфических вариантах осуществления настоящего изобретения трансформация клеток-хозяев рекомбинантными молекулами ДНК, включающими изолированный ген полипептида sHASEGP, кДНК или синтезированную последовательность ДНК, обеспечивает создание многих копий гена. Таким образом, ген может быть получен в больших количествах путм выращивания трансформантов, выделения из трансформантов рекомбинантных молекул ДНК и, при необходимости, возвращения вставленного гена из изолированной рекомбинантной ДНК. Е. Векторы, плазмиды и клетки, содержащие нуклеиновые кислоты,кодирующие полипептид sHASEGP или его гиалуронидазный домен,и экспрессирующие полипептиды sHASEGP векторы и клетки Для рекомбинантной экспрессии одного или более полипептидов sHASEGP нуклеиновая кислота,содержащая всю или часть нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид sHASEGP, может быть вставлена в подходящий экспрессирующий вектор, т.е. в вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной последовательности, кодирующей белок. Необходимые транскрипционный и трансляционный сигналы могут быть также предоставлены нативным промотором для генов sHASEGP и/или их фланкирующими участками. Предусматриваются также векторы, содержащие кодирующую sHASEGP нуклеиновую кислоту,которая может быть введена в экспрессирующую систему, способную продуцировать растворимый sHASEGP, активный в нейтральных условиях. Предусматриваются также клетки, содержащие векторы. Клетки включают эукариотические и прокариотческие клетки, а векторы включают такие векторы, которые пригодны для использования в них. Предусматриваются эукариотические клетки, в том числе дефицитные по дигидрофолат-редуктазе клетки яичников китайского хомячка (DG44), содержащие векторы. Подходящие клетки включают клетки дрожжей, клетки грибков, клетки растений, клетки насекомых и клетки животных. Клетки используются для продукции полипептида sHASEGP или его гиалуронидазного домена путм (а) выращивания описанных выше клеток в условиях, при которых клетка экспрессирует кодируемый полипептид sHASEGP или гиалуронидазный домен полипептида sHASEGP, и затем (b) выделения экспрессированного белка гиалуронидазного домена. В приводимых для примера вариантах осуществления настоящего изобретения гиалуронидазный домен секретируются в культуральную среду. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматриваются векторы, которые включают последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, который имеет гиалуронидазную активность и содержит весь белок sHASEGP или часть только гиалуронидазного домена, или множество его копий. Предусматриваются также векторы, содержащие последовательность нуклеотидов,которая кодирует гиалуронидазный домен и дополнительные части белка sHASEGP, вплоть до белкаsHASEGP полной длины и включая его, а также его множественные копии. Векторы могут быть выбраны для экспрессии белка sHASEGP или его гиалуронидазного домена в клетке или такой экспрессии, что белок sHASEGP экспрессируется как секретируемый белок. В качестве альтернативы векторы могут включать сигналы, необходимые для секреции кодируемых белков. Когда экспрессируется гиалуронидазный домен, нуклеиновая кислота присоединена к нуклеиновой кислоте, кодирующей сигнал секреции, такой как кодирующая сигнальный фактор спаривания у Saccharomyces cerevisiae или е части, или нативную сигнальную последовательность.- 27009383 Для того чтобы произвести растворимый sHASEGP, активный в нейтральных условиях, необходимы клетки, способные осуществлять гликозилирование с N-связью. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки яичников млекопитающего - китайского хомячка, дефицитные по дигидрофолат-редуктазе (такие, как клетки DG44), подвергают электропорации с плазмидой, содержащей сильный промотор млекопитающих (такой как промотор цитомегаловируса, CMV), кодирующую sHASEGP нуклеиновую кислоту, за которой следуют внутренний сайт входа в рибосому, ген дигидрофолат-редуктазы мыши и последовательность полиаденилирования SV40, как показано в последовательности SEQ ID NO: 51. Затем эти клетки культивируют в химически точно охарактеризованной среде в отсутствие гипоксантина и тимидина с повышающимися концентрациями метотрексата, после чего проводят амплификацию гена. Для экспрессии кодирующей белок последовательности могут быть использованы различные системы хозяин-вектор. Эти системы включают (но не ограничиваются ими) клеточные системы млекопитающих, заражнные вирусом (например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом и т.д.); клеточные системы насекомых, заражнные вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмы, такие, как дрожжи,содержащие дрожжевые векторы; или бактерии, трансформированные бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК Необходимые для экспрессии элементы векторов варьируют по их силе и специфичности. В зависимости от использованной системы хозяин-вектор может быть использован любой из большого числа подходящих элементов транскрипции и трансляции. Следует отметить, что бактериальная экспрессия ДНК sHASEGP сама по себе не приводит к получению каталитически активного sHASEGP, для этого необходимо соединение с подходящей системой гликозилирования, тогда sHASEGP может быть гликозилирован искусственно. Для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих химерный ген, в который входят подходящие сигналы контроля транскрипции/трансляции и кодирующие белок последовательности, могут быть использованы любые известные специалистам в данной области методы вставления фрагментов ДНК в вектор. Эти методы могут включать технику получения рекомбинантной ДНК и синтеза in vitro и получения рекомбинантов in vivo (генетическая рекомбинация). Экспрессию последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид sHASEGP или его домены, производные, фрагменты или гомологи, можно регулировать второй последовательностью нуклеиновой кислоты, так что е гены или их фрагменты экспрессируются в хозяине, трансформированном рекомбинантной молекулой (молекулами) ДНК. Например, экспрессию белков можно контролировать любым известным в данной области промотором/энхансером. В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения промотор не является нативным по отношению к генам для полипептида sHASEGP. Промоторы, которые могут быть использованы, включают (но не ограничиваются ими) ранний промотор CV40 (Benoist and Chambon //Nature. 1981, v. 290, p. 304-310), содержащийся в 3'концевом длинном повторе вируса саркомы Роуза (Yamamoto et al. //Cell. 1980, v. 22, p. 787-797), промотор тимидин-киназы вируса герпеса (Wagner et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981, v. 78, p. 1441-1445),регуляторные последовательности гена металлотионеина (Brinster et al. //Nature. 1982, v. 296, p. 39-42); промоторы прокариотических экспрессирующих векторов, такие как промотор гена -лактамазыet al. //Nature. 1984, v. 303, p. 209-213) или промотор 35S РНК вируса цветной капусты (Garder et al.//Nucleic Acids Res. 1981, v. 9, p. 2871), и промотор фотосинтетического фермента рибулозобифосфаткарбоксилазы (Herrera-Estrella et al. //Nature. 1984, v. 310, p. 115-120); промоторные элементы из дрожжей и других грибов, такие как промотор Gal4, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицерин-киназы, промотор щелочной фосфатазы, и следующие области контроля транскрипции животных, которые проявляют тканевую специфичность и были использованы в трансгенных животных: контрольную область гена эластазы I, активную в гроздевидных клетках поджелудочной железы(Swift et al. //Cell. 1984, v. 38, p. 639-646; Omitz et al. //Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986, v. 50, p. 399- 409; MacDonald //Hepatology. 1987, v. 7, p. 425-515); контрольную область гена инсулина, активную в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan etal. //Nature. 1985, v. 315, p. 115-122), контрольную область гена иммуноглобулина, активную в лимфоидных клетках Grosschedl et al. //Cell. 1984, v. 38, p. 647-658; Adams et al. //Nature. 1985, v. 318, p. 533-538;Alexander et al. //Mol. Cell Biol. 1987, v. 7, p. 1436-1444), контрольную область вируса опухоли молочной железы мыши, активную в клетках яичников, молочной железы, лимфоида и сосков (Leder et al. //Cell. 1986, v. 45, p. 485-495), контрольную область гена альбумина, активную в печени (Pinckert et al. //Genesand Devel. 1987, v. 1, p. 268-276), контрольную область гена альфа-фетопротеина, активную в печени(Krumlauf et al. //Mol. Cell. Biol. 1985, v. 5, p. 1639-1648; Hammer et al. //Science. 1987, v. 235, p. 53-58),контрольную область гена альфа-1 антитрипсина, активную в печени (Kelsey et al. //Genes and Devel. 1987, v. 1, p. 161-171), контрольную область гена бета-глобина, активную в миелоидных клетках(Mogram et al. //Nature. 1985, v. 315, p. 338-340; Kollias et al. //Cell. 1986, v. 46, p. 89-94), контрольную область гена основного белка миелина, активную в олигодендроцитных клетках мозга (Readhead et al.//Cell. 1987, v. 48, p. 703-712), контрольную область гена лгкой цепи 2 миозина, активную в скелетных мышцах (Sani //Nature. 1985, v. 314, p. 283-286), и контрольную область гена высвобождающего гонадотропин гормона, активного в дельта-клетках гипоталамуса (Mason et al. //Science. 1986, v. 234, p. 13721378). В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения использован вектор, который содержит промотор, функционально присоединнный к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептид sHASEGP или его домен, фрагмент, производное или гомолог, одно или более мест начала репликации и, по усмотрению, один или более из селектирующих маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику). Для эффективной трансляции последовательности sHASEGP также могут быть нужны специфические сигналы инициации. Эти сигналы включают инициирующий кодон ATG и прилегающие к нему последовательности. В тех случаях, когда в подходящий экспрессирующий вектор вставлены последовательность sHASEGP, е инициирующий кодон и восходящие последовательности, может не быть необходимости в дополнительных сигналах контроля трансляции. Однако в тех случаях, когда вставлена только кодирующая последовательность или е часть, должны быть добавлены экзогенные (внешние) сигналы контроля транскрипции, в том числе инициирующий кодон ATG. Кроме того, инициирующий кодон должен быть в правильной рамке считывания, чтобы обеспечить транскрипцию всей вставки. Экзогенные элементы регуляции транскрипции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение - они могут быть и природными, и синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить введением энхансеров, подходящих для используемой клеточной системы (Scharf D. et al. //Results Probl.Cell Differ. 1994, v. 20, p. 125-162; Bittner et al. //Methods in Enzymol. 1987, v. 153, p. 516-544). Кроме того, в выборе штамма клеток-хозяев могут учитываться его способность модулировать экспрессию вставленных последовательностей или осуществлять процессинг (модификацию) экспрессированного белка нужным образом. Такие модификации полипептида включают (но не ограничиваются ими) ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. Посттрансляционная модификация, в которой преобразуется предварительная форма белка, может также быть важна для правильной вставки, сворачивания и/или функционирования. Различные линии клеток-хозяев, такие как CHO (DG44, DXB11, CHO-K1), HeLa, MDCK, 293, WI38 и др., имеют специфические клеточные структуры и характерные для них механизмы для таких посттрансляционных процессов и могут выбираться таким образом, чтобы обеспечить правильные модификацию и процессинг внедрнных чужеродных белков. Для длительной продукции с высоким выходом рекомбинантных белков предпочтительна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют sHASEGP, можно трансформировать экспрессирующими векторами, содержащими вирусные области начала репликации или экзогенные элементы регуляции экспрессии и пригодный для селекции маркерный ген. После введения вектора клеткам можно дать расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед переносом их в селективные среды. Задача пригодного к селекции маркера состоит в том, чтобы придать клеткам устойчивость в селектирующих условиях, и его присутствие позволяет вырастить и отобрать клетки, которые успешно экспрессируют внедрнные последовательности. Пролиферацию устойчивых агрегатов стабильно трансформированных клеток можно получить с помощью техники культур ткани, подходящей для данного типа клеток. Для выделения линий трансформированных клеток пригодно любое число систем селекции. Они включают (но не ограничиваются ими) гены тимидин-киназы вируса простого герпеса (Wigler М. et al.//Cell. 1977, v. 11, p. 223-232) и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowy I. et al. //Cell. 1980, v. 22, p. 817823), которые могут быть использованы соответственно в клетках TK или APRT. Как основу для селекции можно также использовать устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам. Например, DHFR привносит устойчивость к метотрексату (Wigler М. et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980,v. 77, p. 3567-3570); npt придат устойчивость к аминогиликозидам неомицину и G-418 (Colbere-GarapinF. et al. //J. Mol. Biol. 1981, v. 150, p. 1-14), a als или pat обеспечивают устойчивость соответственно к хлорсульфурону и фосфинотрицин-ацетилтрансферазе (Murry, см. выше). Были описаны и другие пригодные для селекции гены, например trpB, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или hisD, который дат возможность клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина(Hartman S. And Mulligan R.C. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988, v. 85, p. 8047-8051). В последнее время,благодаря использованию видимых маркеров, приобрели популярность такие маркерные системы, как антоцианины, бета-глюкуронидаза и е субстрат GUS и люцифераза и е субстрат люциферин, которые широко используются не только для идентификации трансформантов, но также и для количественной оценки уровня преходящей или стабильной экспрессии белка, присущей конкретной векторной системе- 29009383 Идентификация трансформантов, содержащих полинуклеотидную последовательность. Хотя присутствие/отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что представляющий интерес ген также присутствует, наличие и экспрессию активного гена sHASEGP необходимо подтверждать. Например, если последовательность sHASEGP вставлена внутри последовательности маркерного гена, содержащие последовательность sHASEGP рекомбинантные клетки могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. В качестве альтернативы маркерный ген может быть помещн в стыке с последовательностью sHASEGP под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно указывает на полноценную экспрессию тандема с последовательностью sHASEGP. Свидетельство о наличии должным образом гликозилированного активного в нейтральных условиях sHASEGP может быть получено на основании измерений ферментативной активности sHASEGP в культуральной среде при подходящих условиях. Очистка sHASEGP. Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью для sHASEGP, можно культивировать в условиях, необходимых для экспрессии и выделения кодированного белка из клеточной культуры. Продуцируемый рекомбинантной клеткой белок предпочтительно секретируется, но он может и оставаться внутри клеток, в зависимости от нуклеотидной последовательности и/или использованного вектора. Специалистам в данной области понятно, что содержащие последовательность дляsHASEGP экспрессирующие векторы могут быть сконструированы с сигнальными последовательностями, которые способствуют прямой секреции sHASEGP через мембрану прокариотических или эукариотических клеток. В других рекомбинантных конструкциях последовательность для sHASEGP может быть присоединена к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчит очистку растворимых белков (Kroll D.J. et al. //DNA Cell Biol. 1993, v. 12, p. 441-453; см. дискуссию по векторам infra, содержащим последовательности для слитых белков).sHASEGP может быть также экспрессирован как рекомбинантный белок с одним или более добавочными полипептидными доменами, добавленными для облегчения очистки белка. Такие облегчающие очистку домены включают (но не ограничиваются ими) хелатирующие металл пептиды, такие как модули гистидин-триптофан, которые позволяют вести очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые позволяют вести очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе FLAGS с удлинением и аффинной очисткой (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Вставка последовательностей для расщепляемого линкера, такого, как фактор ХА или энтерокиназа (Invitrogen, SanDiego, Calif.) между последовательностями для обеспечивающего очистку домена и sHASEGP, полезна для облегчения очистки. Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию содержащего sHASEGP слитого белка и содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 остатков гистидина, за которыми следуют последовательности для тиоредоксинового и энтерокиназного сайтов расщепления. Остатки гистидина обеспечивают очистку на IMIAC (immobilized metal ion affinity chromatography, аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металла, описанная Porath et al. //Protein Expressionand Purification. 1992, v. 3, p. 263-281), тогда как энтерокиназный сайт расщепления представляет способ очистки хемокина из слитого белка. Кроме продукции на основе рекомбинантной техники, фрагменты sHASEGP можно получать прямым пептидным синтезом с помощью твердофазного метода (см. Stewart et al. //"Solid-Phase Peptide Synthesis". W.H. Freeman Co. San Francisco, 1969; Merrifield J. //J. Am. Chem. Soc. 1963, v. 85. p. 2149-2154). Синтез белка in vitro может быть осуществлн как вручную, так и в автоматическом режиме. Автоматизированный синтез может быть осуществлн, например, в пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) в соответствии с инструкциями производителя. Различные фрагменты sHASEGP можно синтезировать химически по отдельности и затем объединить с помощью химических методов, получая молекулу полной длины. Экспрессирующие векторы, содержащие кодирующие последовательности или их части для полипептида sHASEGP, получают, например, субклонированием кодирующих частей в сайт расщепления рестриктазой EcoRI каждого из трх векторов PGEX (экспрессирующие векторы для глутатионS-трансферазы (Smith and Johnson //Gene. 1988, v. 7, p. 31-40. Это позволяет экспрессировать продукты в правильной рамке считывания. Приводимые для примера векторы и системы для экспрессии гиалуронидазных доменов полипептидов sHASEGP включают хорошо известные векторы Pichia (их можно приобрести, например, в Invitrogen, San Diego, CA), в особенности те, которые сконструированы для секреции кодируемых белков. Белок может быть также экспрессирован в цитоплазме, например в тельцах включения. Один приводимый для примера вектор описан в примерах. Плазмиды для трансформации клеток Е. coli включают, например, экспрессирующие векторы рЕТ(см. патент США 4952496), поставляемые фирмой Novagen, Madison, WI (см. также описание этой системы в литературе, опубликованной Novagen). Такие плазмиды включают рЕТ 11 а, содержащую промотор T7-lac, терминатор Т 7, индуцибельный оператор lac E. coli и ген lac-penpeccopa; рЕТ 12 А-C, содержащую промотор Т 7, терминатор Т 7 и сигнал секреции OMRT E. coli; и рЕТ 15 В и рЕТ 19 В (Novagen, Madison, WI), содержащие лидерную последовательность His-Tag для использования при очистке на колонке His и тромбиновый сайт расщепления, ко- 30
МПК / Метки
МПК: C12N 1/20, C12N 9/24, C12N 9/00, C12N 15/00, C12P 21/06, C07H 21/04
Метки: shasegp, растворимый, фармацевтическая, композиция, гиалуронидазы, получения, гликопротеин, содержащая, способ, применение
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-9383-rastvorimyjj-glikoprotein-gialuronidazy-shasegp-sposob-ego-polucheniya-primenenie-i-farmacevticheskaya-kompoziciya-ego-soderzhashhaya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Растворимый гликопротеин гиалуронидазы (shasegp), способ его получения, применение и фармацевтическая композиция его содержащая</a>
Пирролидинил-, пиперидинил- или гомопиперидинилзамещенные производные, способ их получения, их применение в медицине, содержащая их фармацевтическая композиция и способ ее получения
Номер патента: 4648
Опубликовано: 24.06.2004
Авторы: Ван Эмелен Кристоф, Вирсхюэрен Вим Гастон, Вигеринк Пит Том Берт Поль, Де Брюин Марсель Франс Леопольд
МПК: A61P 9/00, A61K 31/505, C07D 405/14...
Метки: медицине, содержащая, способ, пирролидинил, производные, гомопиперидинилзамещенные, фармацевтическая, применение, композиция, пиперидинил, получения
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы (I) его стереохимически изомерная форма или его фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль, в которых R1, R2 и R3 каждый представляет водород; -Z1-Z2- представляет двухвалентный радикал формулы -O-CH(R4)-CR2-CH2- (a-4), R4 представляет водород; Alk представляет C1-6алкандиил, необязательно замещенный гидроксигруппой; представляет двухвалентный радикал формулы в которой m равно 0 или 1; R6...
Фармацевтическая композиция, содержащая фенофибрат, и способ ее получения
Номер патента: 4294
Опубликовано: 26.02.2004
Авторы: Сюпли Паскаль, Шеневьер Филипп, Криер Брюно
МПК: A61K 31/216
Метки: способ, получения, композиция, содержащая, фенофибрат, фармацевтическая
Формула / Реферат:
1. Фармацевтическая композиция, содержащая микронизированный фенофибрат, поверхностно-активное вещество и связующее производное целлюлозы в качестве адъюванта солюбилизации, отличающаяся тем, что она содержит количество фенофибрата выше или равное 60 мас.%. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что связующим производным целлюлозы, являющимся адъювантом солюбилизации, является гидроксипропилметилцеллюлоза. 3. Композиция по п.2, отличающаяся...
Азотсодержащие гетероциклические производные, содержащая их фармацевтическая композиция, их применение и способ лечения
Номер патента: 7537
Опубликовано: 27.10.2006
Авторы: Андерсен Ким, Банг-Андерсен Бенни, Смит Гаррик Пол, Пюшль Аск, Мольтсен Айнер Кнуд, Руланд Томас
МПК: A61K 31/4965, A61P 25/00, A61K 31/44...
Метки: применение, фармацевтическая, композиция, способ, производные, содержащая, азотсодержащие, лечения, гетероциклические
Формула / Реферат:
1. Соединение, представленное общей формулой I где Y означает N, С или СН; X означает S; m означает 1 или 2; р означает 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; q означает 0, 1, 2, 3 или 4; s означает 1 или 2; пунктирная линия означает возможную связь; каждый R1 независимо выбран из группы, представленной C1-6-алкилом, или два R1, присоединенные к одному и тому же атому углерода, могут образовывать 3-6-членный спироприсоединенный циклоалкил; каждый R2...
Спироимидазолиновые соединения, способ их получения и фармацевтическая композиция, содержащая их
Номер патента: 2979
Опубликовано: 26.12.2002
Авторы: Брокко Морисетт, Миллан Марк, Корди Алекс, Ньюмен-Танкреди Адриан
МПК: A61P 25/24, C07D 235/02, A61K 31/4184...
Метки: фармацевтическая, спироимидазолиновые, соединения, получения, композиция, содержащая, способ
Формула / Реферат:
1. Спироимидазолиновые соединения формулы (I) в которой А представляет бензольное кольцо, незамещенное или замещенное 1-4 одинаковыми или различными группами, выбранными из линейного или разветвленного (С1-С6)алкила, линейного или разветвленного (С1-С6)алкокси, гидрокси, полигалоген-(С1-С6)алкила, в котором алкильный фрагмент является линейным или разветвленным, и галогена, В представляет имидазолиновое кольцо, как представлено в формулах (Iа)...
Бета- карболиновые соединения, способ их получения и фармацевтическая композиция, их содержащая
Номер патента: 4140
Опубликовано: 26.02.2004
Авторы: Миллан Марк, Парментье Жан-Жилль, Гольдстейн Соло, Пуассонне Гийом, Бутэн Жан, Декейн Анн, Брион Жан-Даниель
МПК: A61P 25/00, C07D 471/04, A61K 31/437...
Метки: beta, карболиновые, содержащая, получения, способ, соединения, фармацевтическая, композиция
Формула / Реферат:
1. Соединения формулы (I) в которой --- представляет простую или двойную связь, способную необязательно сообщать ароматический характер кольцу, несущему ее, R1 представляет группу, выбранную из водорода, прямого или разветвленного (C1-C6)алкила, -R6-арила, -R6-циклоалкила, -R6-гетероцикла, где группы R6 представляют прямую или разветвленную (C1-C6)алкиленовую группу, -CO2R7, где R7 представляет прямую или разветвленную (C1-C6)алкильную группу,...
Предыдущий патент: Автоматизированные способы и системы для обнаружения и анализа сосудистых бляшек
Следующий патент: Композиции простагландина и способы лечения мужской эректильной дисфункции
Случайный патент: Способ обработки липкого хлопкового волокна