Полимерные конъюгаты мутантного неубластина

008743 Перекрестная ссылка на родственные заявки По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет согласно международной заявкеPCT/US02/02319, поданной 25 января 2002 г., по которой испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США с регистрационным номером 60/266071, поданной 1 февраля 2001 г. (аннулирована). Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к химии белков, молекулярной биологии, нейробиологии, неврологии и лечению боли. Уровень техники Нейротрофические факторы представляют собой встречающиеся в природе белки, которые регулируют выживаемость нейронов в ходе развития и регулируют пластичность и структурную целостность нервной системы у взрослых. Нейротрофические факторы можно выделить из нервной ткани и ткани, из отличной от нервной. За последние 20 лет обнаружено много нейротрофических факторов, которые можно разделить на надсемейства, семейства, подсемейства и индивидуальные разновидности, основанные на их структуре и функции. Надсемейства нейротрофических факторов включают в себя надсемейство фактора роста фибробластов (FGF), надсемейство нейротрофина и надсемейство трансформирующего фактора роста(TGF-). Лиганды, родственные нейротрофическому фактору, выделенному из глиальной клеточной линии (GDNF), являются семейством белков внутри надсемейства TGF-. Лиганды, родственные GDNF,включают в себя GDNF, персефин (PSP), неуртурин (NTN) и неубластин (NBN), известный как артемин или эновин. Членов семейства лигандов, родственных GDNF, отличают помимо других признаков по их семи консервативным остаткам цистеина. Эти остатки формируют внутримолекулярные и межмолекулярные дисульфидные мостики и являются основой третичной и четвертичной структуры димеризованного полипептидного лиганда. Члены семейства также разделяют способность вызывать передачу сигналов через многокомпонентный рецепторный комплекс, состоящий из корецептора из семейства GFR,закрепленного за счет гликозилфосфатидилинозитола (GPI), члена подсемейства лигандов, родственныхGDNF, и RET тирозинкиназного рецептора. Активированный RET инициирует каскад передачи сигнала, который является ответственным, по меньшей мере, частично за дальнейшие эффекты лигандов, родственных GDNF. Соответственно, активация RET может представить один желательный аспект лечения, которое действует посредством GFR рецептора, чтобы влиять на дальнейшие клеточные процессы. Неубластин отнесен к семейству GDNF, потому что он имеет гомологичные области с другимиGDNF лигандами, включая фрагмент из семи остатков цистеина (например, как описано в ЕР 02/02691,РСТUS02/02319 и US02/06388), а также из-за его способности связываться с RET рецептором и активировать его как часть комплекса GFR. В частности, неубластин высокоселективен для связывания сGFR3-RET рецепторным комплексом. В этом отношении неубластин содержит уникальные подобласти в своей аминокислотной последовательности по сравнению с другими членами семейства лигандов, родственных GDNF. Современные данные свидетельствуют, что неубластин может играть защитную и регенеративную роль в периферической и центральной нервной системе и в результате может быть пригоден как лечебное средство при нейродегенеративных заболеваниях. Например, данные свидетельствуют о том, что неубластин может способствовать выживанию культивируемых сенсорных нейронов из спинномозговых ганглиев и ганглиев тройничного нерва и культивируемых дофаминергических нейронов черной субстанции (Baloh et al., Neuron, 1998, 21:1291-1302). Поэтому представляется, что неубластин может способствовать выживанию популяций нейронов, включая сенсорные и дофаминергические нейроны. Это важно, потому что дегенерация и дисфункция нейронов связаны с болезненными состояниями. Например, патология сенсорных и дофаминергических нейронов лежит в основе периферической нейропатии и болезни Паркинсона соответственно. В связи с этим введение неубластина может быть полезным, например, при лечении болезней, связанных с дегенерацией и дисфункцией нейронов. Однако неубластин быстро выводится из организма,что может повлиять на парадигму дозирования неубластина, требующуюся для лечебного применения. Таким образом, существует потребность в измененных полипептидах неубластина с увеличенной биодоступностью. Соответственно объектом настоящего изобретения стала именно идентификация измененных форм неубластина, которые проявляют повышенную биодоступность. Сущность изобретения Изобретение относится к полимерконъюгированным димерам мутантного неубластина. Каждый димер включает в себя первый полипептид, содержащий первую N-концевую аминокислоту, и второй полипептид, содержащий вторую N-концевую аминокислоту. Каждый полипептид по отдельности содержит:(а) аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70, 80, 90 или 95% идентичностью с последовательностью 8-113 аминокислот из SEQ ID NO:1;(b) остаток цистеина в каждом из положений 16, 43, 47, 80, 81, 109 и 111 (нумерация согласно(d) повтор LGLG, мотив FRFC, мотив QPCCRP и мотив SATACGC. Димер включает в себя по меньшей мере одну аминокислотную замену (относительно SEQ ID NO:1), которая представляет внутренний участок для конъюгации с полимером, к которому конъюгирован полимер. Изобретение также относится к полимерконъюгированному димеру мутантного неубластина, содержащему первый полипептид и второй полипептид, где каждый полипептид содержит 90-140, например, 95-120 или 100-110 аминокислот SEQ ID NO:6, с 1-6 аминокислотными заменами, каждая замена предоставляет участок для конъюгации с полимером, к которому конъюгирован полимер. Конкретные примеры полипептидов по изобретению включают в себя NBN113 (SEQ ID NO:2),NBN140 (SEQ ID NO:6), NBN116 (SEQ ID NO:7), NBN112 (SEQ ID NO:8), NBN111 (SEQ ID NO:9),NBN110 (SEQ ID NO:10), NBN109 (SEQ ID NO:11), NBN108 (SEQ ID NO:12), NBN107 (SEQ ID NO:13),NBN106 (SEQ ID NO:14), NBN105 (SEQ ID NO:15), NBN104 (SEQ ID NO:16), NBN103 (SEQ ID NO:17),NBN102 (SEQ ID NO:18), NBN101 (SEQ ID NO:19), NBN100 (SEQ ID NO:20) и NBN99 (SEQ ID NO:21). Предпочтительно по меньшей мере одна из двух N-концевых аминокислот в димере конъюгирована с полимером. Предпочтительные аминокислотные замены включают замену остатка аргинина на остаток лизина (RaaK; где аа представляет номер аминокислоты, основанный на SEQ ID NO:1) и замену остатка аспарагина на остаток лизина (NaaK) или остаток аспартата (NaaD). Конкретными примерами такой замены являются R14K, R39K, R68K, N95D и N95K (нумерация основана на SEQ ID NO:1). Особенно предпочтительна замена N95K. Предпочтительно общая объединенная молекулярная масса полимеров на димере составляет 20000-40000 Да. Предпочтительно средняя молекулярная масса каждого полимера составляет 2000-100000 Да, более предпочтительно 5000-50000 Да и наиболее предпочтительно приблизительно 10000-20000 Да. Полимер может быть линейным или разветвленным. Предпочтительно полимер является остатком полиалкиленгликоля, например остатком полиэтиленгликоля (ПЭГ). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептид гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимерконъюгированный димер содержит первый полипептид и второй полипептид, где:(а) каждый полипептид по отдельности содержит 100-110 аминокислот из SEQ ID NO:1;(b) каждый полипептид содержит замену аспарагина на лизин в положении 95 в SEQ ID NO:1;(с) димер содержит 3 или 4 остатка ПЭГ, где молекулярная масса каждого остатка ПЭГ составляет примерно 10000 Да и каждый остаток ПЭГ конъюгирован с N-концом или с лизином в положении 95. Предпочтительным вариантом осуществления является гомодимер, содержащий пару мономеров, обозначенный 3 (4)10 кДа ПЭГ NBN106-N95K. Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей димер согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит два или несколько различных димеров согласно изобретению. Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, например экспрессирующему ДНК-вектору, который кодирует полипептид для объединения в димер по изобретению. Изобретение также относится к клетке хозяина, трансформированной нуклеиновой кислотой. Изобретение относится к способу лечения нейропатической боли у млекопитающего. Способ предусматривает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества димера по изобретению. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество составляет от 0,1 до 1000, от 1 до 100 или от 1 до 30 мкг/кг. Введение димера может производиться различными путями, например внутримышечным, подкожным или внутривенным. В некоторых способах согласно изобретению димер вводится 3 раза в неделю. Изобретение также относится к способу активации рецептораRET у млекопитающего. Способ предусматривает введение млекопитающему эффективного количества димера. Другие особенности и преимущества изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания и пунктов формулы изобретения. Подробное описание изобретения Если не указано иначе, любая ссылка на номер положения аминокислоты неубластина будет относиться к нумерации, иллюстрированной в SEQ ID NO:1. Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, которое обычно понимается специалистом с обычными навыками в той области техники,к которой данное изобретение принадлежит. Хотя методы и материалы, подобные или эквивалентные-2 008743 рассмотренным в данном патенте, могут использоваться в осуществлении на практике или при испытании изобретения, описание подходящих методов и материалов будет приведено ниже. Все публикации,заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в описание во всей их полноте посредством ссылки. В случае конфликта решающим будет настоящее описание, включая данные в нем определения. Кроме того, материалы, методы и примеры исключительно иллюстративны и не предназначены для ограничения. Как используется здесь, полипептид неубластина дикого типа означает встречающуюся в природе последовательность полипептида неубластина. Полипептид неубластина дикого типа может быть далее определен по источнику неубластина, например человеческий, мышиный или крысиный неубластин(см., например, SEQ ID NO:2, 3 или 4). Консенсусная последовательность полипептида неубластина соответствует SEQ ID NO:1. Как используется здесь, мутантный полипептид неубластина обозначает полипептид, который содержит, по меньшей мере, указанный минимальный уровень идентичности последовательности относительно полипептида неубластина дикого типа, по меньшей мере одну аминокислотную замену, вставку или слияние относительно полипептида неубластина дикого типа и проявляет активность неубластина(например, как описано в международной заявкеPCT/US02/02319 (WO 02/060929. Как используется здесь, внутренний участок для конъюгации с полимером означает неконцевой остаток аминокислоты в мутантном полипептиде неубластина, остаток обеспечивает боковую цепь, пригодную для конъюгации с полимером. Как используется здесь, модифицированный полипептид неубластина означает полипептид, который содержит по меньшей мере один прикрепленный полимер. Как используется здесь, слияние означает коллинеарную ковалентную связь двух или нескольких полипептидов через их соответствующие пептидные каркасы посредством генной экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки, в той же самой рамке считывания. Как используется здесь, идентичность относится к подобию последовательности между двумя полипептидами, молекулами или между двумя нуклеиновыми кислотами. Когда положение в обеих из двух сравненных последовательностей занято тем же самым основанием или субъединицей аминокислотного мономера (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), то соответствующие молекулы гомологичны по этому положению. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа соответствующих положений, разделяемых двумя последовательностями, поделенного на число сравненных положений, 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях соответствуют, то эти две последовательности имеют 60% идентичность. В качестве примера последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT разделяют 50% гомологию (соответствуют 3 из всех 6 положений). Как правило, сравнение производится, когда две последовательности выравнены, чтобы дать максимальное соответствие. Такое выравнивание может быть обеспечено с использованием, например, способаNeedleman et al., J. Mol. Biol., 1970, 48:443-453, что удобно обеспечить компьютерными программами,такими как программа Align (DNAstar, Inc.). Схожие последовательности представляют собой те, которые, будучи выравненными, разделяют идентичные и подобные аминокислотные остатки, где подобные остатки представляют собой консервативные замены или дозволенные точечные мутации соответствующих аминокислотных остатков в выравненной эталонной последовательности. В этом отношении консервативная замена остатка в эталонной последовательности представляет собой замену остатком,который физически или функционально подобен соответствующему эталонному остатку, например, имеет схожий размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность формировать ковалентные или водородные связи, или т.п. Таким образом, мутантная консервативная замена последовательности является такой, которая отличается от эталонной последовательности или последовательности дикого типа тем, что в ней присутствует одна или несколько консервативных замен или дозволенных точечных мутаций. Процентное содержание положительных между двумя последовательностями представляет собой функцию числа положений, которые содержат соответствующие остатки или консервативные замены, разделяемые двумя последовательностями, разделенного на число сравненных положений, 100. Например, если в двух последовательностях соответствуют 6 из 10 положений и 2 из 10 положений содержат консервативные замены, то эти две последовательности имеют 80% положительную гомологию. Мутантные полипептиды неубластина Мутантные полипептиды неубластина по изобретению сохраняют нейротрофическую активность и имеют повышенную биодоступность по сравнению с полипептидом неубластина дикого типа. Например,мутантные неубластины по данному изобретению активируют продукт гена RET в испытаниях, в которых неубластин дикого типа активирует RET. В целом мутантный полипептид неубластина сохранит по меньшей мере одну из следующих особенностей, но будет дополнительно включать по меньшей мере одну модификацию, такую как созданный внутренний участок для конъюгации с полимером:(i) семь консервативных остатков цистеина в положениях 16, 43, 47, 80, 81, 109 и 111, если они про-3 008743 нумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1-4;(ii) аминокислотные остатки следующим образом: С в положении 16, L в положении 18, V в положении 25, L в положении 28, G в положении 29,L в положении 30, G в положении 31, Е в положении 36, F в положении 40, R в положении 41,F в положении 42, С в положении 43, G в положении 45, С в положении 47, С в положении 80,С в положении 81, R в положении 82, Р в положении 83, F в положении 91, D в положении 93,S в положении 105, А в положении 106, С в положении 109 и С в положении 111, каждое перечисляется в соответствии с SEQ ID NO:1-4;(iii) повторы LGLG, мотив FRFC, мотив QPCCRP и мотив SATACGC. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к усеченному мутантному полипептиду неубластина, в котором N-конец усеченного полипептида неубластина не имеет одной или нескольких N-концевых аминокислот зрелого полипептида неубластина, но мутирован, чтобы обладать внутренним прикреплением для полимера. Предпочтительно усеченный мутантный полипептид неубластина,когда димеризован, активирует полипептид RET. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид неубластина индуцирует димеризацию полипептида RET. Такая индукция может требовать дополнительных полипептидов или кофакторов, как было бы ясно специалисту в данной области техники. Аминокислотные последовательности человеческого и мышиного полипептидов неубластина раскрыты в РСТ публикации WO 00/01815. Примеры полипептидов неубластина дикого типа согласно изобретению представлены в табл. 1 А. Консенсусная последовательность неубластина (консенсус относительно человека, мыши и крысы) изложена в табл. 1 В. Таблица 1 А Зрелые полипептиды неубластина дикого типа NBN113 В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из остатков аргинина (Arg или R) или аспарагина (Asn или N), показанные полужирным шрифтом в табл. 1 А, заменены отличающимся аминокислотным остатком. В предпочтительном варианте осуществления мутантный полипептид неубластина имеет лизиновый (Lys или K) остаток, заместивший аспарагин в положении 95, обозначенном звездочкой в табл. 1 А, и упоминается как NBN-N95K. В целом замена N95K приводит к улучшенной растворимости. Это облегчает приготовление композиций с высокими концентрациями. Изобретение относится к полимерконъюгированному мутантному полипептиду неубластина, содержащему аминокислотную последовательность, которая, например, по меньшей мере на 70% идентична аминокислотам 8-113 из SEQ ID NO:1 (см. табл. 1). В одном варианте осуществления один или несколько аргининов в положении 14, положении 39, положении 68 или аспарагин в положении 95 заменен(ы) другой аминокислотой, отличающейся от аргинина или аспарагина. В одном варианте осуществления аминокислота дикого типа заменена лизином или цистеином. Замененные остатки в мутантном полипептиде неубластина могут быть выбраны, чтобы облегчить связывание полимера, например полиалкиленгликолевого полимера, с замененной аминокислотой. Благоприятными участками модификации являются участки в областях, доступных для растворителя в полипептиде неубластина. Такие участки могут быть выбраны, основываясь на осмотре кристаллической структуры родственного нейротрофического фактора, такого как GDNF, кристаллическая структура которого описана Eigenbrot et al., Nat. Struct. Biol. 1997, 4:435-38. Участки также могут быть выбраны, основываясь на кристаллической структуре неубластина, кристаллизация и определение структуры которого описаны ниже. К тому же участки могут быть выбраны, основываясь на структурно-функциональной информации, предоставленной для химерных белков персефина/неубластина. Эти химеры описаны вBaloh et al., J. Biol. Chem. 2000, 275:3412-20. Иллюстративный перечень доступных для растворителей или выставленных на поверхность аминокислот неубластина, выявленных с помощью этой методики,изложен в табл. 2. Табл. 2 содержит список и количество остатков в человеческом неубластине, которые, как ожидается, будут выставлены на поверхность. Первая колонка относится к выставленным на поверхность остаткам, определенным путем исследования структуры крысиного димера GDNF, образованного цепями А и В (PDB код 1AGQ), и определения, находился ли остаток на поверхности структуры. Эта структура была затем сравнена с выравниванием последовательности GDNF и неубластина в Baloh et al., Neuron 21:12911302, 1998, чтобы определить подходящие остатки в неубластине. Вторая и третья колонки, соответственно, относятся к находящимся на поверхности остаткам, определенным путем исследования структуры димера человеческого неубластина, сформированного цепями А и В. Схема нумерации в табл. 2 та же,что и в табл. 1.n указывает на то, что остатки не присутствуют в структурах GDNF или неубластина. Это происходит либо из-за строения конструкта, гибких областей, либо из-за вставок в неубластине относительно GDNF (остатки 68-71);- указывает на то, что остатки погружены, а не находятся на поверхности или являются остатками цистеина, вовлеченными в дисульфидные связи. Поскольку этот белок является цистеиновым клубком, подавляющее большинство остатков находится на поверхности;+ указывает на то, что этот остаток находится в неприкрытом виде на поверхности в структуреGDNF или в структуре неубластина, хотя петля, содержащая остатки 66-75, видна только в структуре мономеров GDNF (предположительно гибкой). Эта петля также содержит 4 остатка, вставленных в неубластин относительно GDNF. В некоторых вариантах осуществления полипептид неубластина сохраняет семь консервативных остатков Cys, которые характерны для подсемейства GDNF и для TGF- надсемейства. Последовательность полной длины человеческого препрополипептида NBN (SEQ ID NO:5) показана в табл. 3. Три зрелые формы полипептидов неубластина были идентифицированы. Эти формы включают:(i) 140 АА полипептид, обозначенный здесь как NBN140, который содержит аминокислотную последовательность, обозначенную как SEQ ID NO:6;(ii) 116 АА полипептид, обозначенный здесь как NBN116, который содержит аминокислотную последовательность, обозначенную как SEQ ID NO:7;(iii) 113 АА полипептид, обозначенный здесь как NBN113, который содержит аминокислотную последовательность, обозначенную как SEQ ID NO:2. Табл. 3 иллюстрирует отношения между раскрытыми последовательностями полипептида препронеубластина по изобретению. Линия 1 предусматривает полипептид SEQ ID NO:5, линия 2 предусматривает полипептид SEQ ID NO:6, линия 3 предусматривает полипептид SEQ ID NO:7 и линия 4 предусматривает полипептид SEQ ID NO:2. Семь консервативных остатков цистеина обозначаются символами(, , "+" и ), чтобы показать внутримолекулярные (с, с и +с+) и межмолекулярные дисульфидные мостики, сформированные в зрелом димеризованном лиганде неубластина. Знак вставкиуказывает на остаток аспарагина в аминокислотном положении 95, который заменен лизином в В альтернативных вариантах осуществления последовательности определенных выше полипептидов неубластина были усечены в их N-концевой аминокислотной последовательности. Их примеры включают:(iv) 112AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN112, которая содержит 112 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 29-140 из SEQ ID NO:6(v) 111AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN111, которая содержит 111 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 30-140 из SEQ ID NO:6(vi) 110AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN110, которая содержит 110 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 31-140 из SEQ ID NO:6(vii) 109AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN109, которая содержит 109 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 32-140 из SEQ ID NO:6(viii) 108AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN108, которая содержит 108 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 33-140 из SEQ ID(ix) 107AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN107, которая содержит 107 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 34-140 из SEQ ID NO:6(х) 106 АА полипептидная последовательность, обозначенная здесь альтернативно как NBN106 или(xi) 105AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN105, которая содержит 105 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 36-140 из SEQ ID NO:6(xii) 104AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь альтернативно как NBN104 или N-9, которая содержит 104 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 37-140 из SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:16) или аминокислоты 10-113 из SEQ ID NO:1, 3 или 4;(xiii) 103AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN103, которая содержит 103 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 38-140 из(xiv) 102AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN102, которая содержит 102 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 39-140 из(xv) 101AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN101, которая содержит 101 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 40-140 из(xvi) 100AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь как NBN100, которая содержит 100 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 41-140 из(xvii) 99AA полипептидная последовательность, обозначенная здесь альтернативно как NBN99 илиN-14, которая содержит 99 С-концевых аминокислот полипептида неубластина, например аминокислоты 42-140 из SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:21) или аминокислоты 15-113 из SEQ ID NO:1, 3 или 4. Полипептидные последовательности этих усеченных полипептидов неубластина с NBN113 поNBN99 показаны в табл. 4. Формирование дисульфидных мостиков, как описано в табл. 3. Таблица 4 Выравнивание усеченных полипептидов неубластина-8 008743 Мутантный полипептид неубластина согласно изобретению может быть, например, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичен аминокислотам 8-113 из SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность мутантного полипептида неубластина включает аминокислотную последовательность встречающегося в природе крысиного, человеческого или мышиного полипептида неубластина в аминокислотах 1-94 и 96-113 мутантного полипептида неубластина,например, полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 3 или 4 в этих положениях. Мутантный полипептид неубластина, отличающийся последовательностью от раскрытых вSEQ ID NO:1-4, может включать одну или несколько замен консервативных аминокислот. Альтернативно или в дополнение мутантный полипептид неубластина может отличаться одной или несколькими заменами неконсервативных аминокислот или делециями, или вставками. Предпочтительно замены, вставки или делеции не ликвидируют биологическую активность выделенного белка. Консервативная замена представляет собой замену одной аминокислоты другой с подобными характеристиками. Консервативные замены включают замены в пределах следующих групп: валин, аланин и глицин; лейцин, валин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин, цистеин и треонин; лизин и аргинин; фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Любую замену одного члена вышеупомянутых полярных, основных или кислых групп другим членом той же самой группы можно считать консервативной заменой. Другие замены могут быть легко выявлены обычным специалистом в данной области. Например,для аминокислоты аланина замену можно взять любую из D-аланина, глицина, бета-аланина, цистеина иD-цистеина. Для лизина заменой может быть любая из D-лизина, аргинина, D-аргинина, гомоаргинина,метионина, D-метионина, орнитина или D-орнитина. Как правило, заменами в функционально важных областях, от которых следует ожидать изменений в свойствах выделенных полипептидов, являются те, в которых:(i) полярный остаток, например серин или треонин, заменяет гидрофобный остаток (и наоборот),например лейцин, изолейцин, фенилаланин или аланин;(ii) остаток цистеина заменяет любой другой остаток или заменяется любым другим остатком;(iii) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например лизин, аргинин или гистидин замещает остаток, имеющий электроотрицательную боковую цепь (и наоборот), например глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту; или(iv) остаток, имеющий крупную боковую цепь, например фенилаланин, замещает остаток, не имеющий такой боковой цепи (и наоборот), например глицин. Вероятность того, что одна из предшествующих неконсервативных замен может изменить функциональные свойства белка, также коррелирует с положением замены относительно функционально важных областей белка. Несколько неконсервативных замен могут соответственно слабо повлиять или никак не повлиять на биологические свойства. Во многих случаях полимерконъюгированный мутантный полипептид неубластина имеет более длительное время полужизни в сыворотке по сравнению со временем полужизни полипептида дикого типа или мутантного полипептида в отсутствие полимера. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный мутантный полипептид неубластина значительно увеличивал силу действия invivo по сравнению с силой действия полипептида или гликозилированного полипептида в отсутствие полимера. Полимерконъюгированный полипептид неубластина может быть предусмотрен как димер, который включает по меньшей мере один полимерконъюгированный полипептид неубластина. В некоторых вариантах осуществления димер является гомодимером полимерконъюгированных мутантных полипептидов неубластина. В других вариантах осуществления димер является гомодимером полимерконъюгированных мутантных усеченных полипептидов неубластина. В других вариантах осуществления димер является гетеродимером, который включает один полимерконъюгированный мутантный полипептид неубластина и один полипептид неубластина дикого типа. В других вариантах осуществления димер является гетеродимером, который включает один полимерконъюгированный мутантный полипептид неубластина и один полимерконъюгированный полипептид неубластина дикого типа, где конъюгация полимера про-9 008743 исходит в N-конце и где полипептиды могут быть или не быть усеченными. Другие димеры включают гетеродимеры или гомодимеры форм полимерконъюгированного мутантного полипептида неубластина,которые могут быть или не быть усеченными. В изобретение включены зрелые и усеченные мутантные полипептидные последовательности, содержащие ближайшие к С-концу аминокислотные остатки препро-NBN полипептида, такие как включенные в SEQ ID NO:5, и которые обозначаются здесь как NBN, гдепредставляет число С-концевых остатков, остающихся в упомянутом полипептиде неубластина. Полимерконъюгированные полипептиды неубластина, присутствующие в биологически активных димерах неубластина, могут быть продуктами реакции расщепления протеазами или химической реакции расщепления, или могут быть экспрессированы с рекомбинантного ДНК-конструкта, или могут быть синтезированы. Примеры полипептидов неубластина включают, например, NBN140, NBN116 и NBN113. Дополнительные полипептиды неубластина по изобретению включают NBN112, NBN111, NBN110, NBN109, NBN108, NBN107, NBN106, NBN105,NBN104, NBN103, NBN102, NBN101, NBN100 и NBN99 (SEQ ID NO:8-21). Предпочтительным полимерконъюгированным полипептидом неубластина является гомодимерNBN106-N95K, конъюгированный либо с тремя 10 кДа остатками ПЭГ ("310 кДа ПЭГ NBN106-N95K"),либо с четырьмя 10 кДа остатками ПЭГ ("410 кДа ПЭГ NBN106-N95K"). Также предпочтительна смешанная популяция NBN106-N95K гомодимеров, конъюгированных либо с тремя 10 кДа остатками ПЭГ,либо с четырьмя 10 кДа остатками ПЭГ, упоминающаяся здесь как "3 (4)10 кДа ПЭГ NBN106-N95K". Также предпочтительным является 3 (4)10 кДа ПЭГ NBN106-N95K гомодимер, в котором две Nконцевые аминокислоты ковалентно связаны с остатками ПЭГ, и третий и/или четвертый остаток ПЭГ ковалентно связаны с одним или обоими замещенными N95K остатками. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина основан на консенсусной последовательности SEQ ID NO:1. В определенных вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина включает в себя аминокислоты 1-7 из SEQ ID NO:1 в дополнение к аминокислотам 8-113. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина, когда димеризован, связывает GFR3. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина, когда димеризован, стимулирует фосфорилирование тирозина полипептида RET или самостоятельно, или когда связан с GFR3. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина, когда димеризован, увеличивает выживаемость нейрона, например увеличивает выживаемость сенсорного нейрона. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина, когда димеризован, уменьшает или обращает патологические изменения нейрона, такого как сенсорный нейрон. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина, когда димеризован, увеличивает выживаемость нейрона, например вегетативного нейрона или дофаминергического нейрона. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина включает в себя одну, две, три, четыре или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из аминокислоты, отличающейся от аргинина в положении 14 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, аминокислоты, отличающейся от аргинина в положении 39 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, аминокислоты, отличающейся от аргинина в положении 68 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, и аминокислоты, отличающейся от аспарагина в положении 95 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в одной или нескольких аминокислотах в положениях 14, 39, 68 и 95 представляет собой лизин. Предпочтительно аминокислоты 8-94 и 96-113 полимерконъюгированного полипептида неубластина по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотам 894 и 96-113 из SEQ ID NO:1. Более предпочтительно аминокислотные последовательности по меньшей мере на 95% идентичны тем же. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность полимерконъюгированного полипептида неубластина включает аминокислотную последовательность встречающегося в природе человеческого, мышиного или крысиного полипептида неубластина в аминокислотах 8-94 и 96-113 полимерконъюгированного полипептида неубластина. Например, аминокислоты 8-94 и 96-113 полимерконъюгированного полипептида неубластина могут включать аминокислотную последовательность аминокислот 8-94 и 96-113 из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. В вышеупомянутых вариантах осуществления предпочтительный остаток в положении аминокислоты 95 представляет собой лизин или цистеин. Изобретение относится к конструкту, который является гетеродимером или гомодимером, содержащим полимерконъюгированные слитые белки неубластина, например неубластин, снабженный полигистидиновым (His) тэгом, предусмотренный в SEQ ID NO:36, или слитый белок неубластина, где участ- 10008743 вующий в слиянии остаток представляет собой полипептид иммуноглобулина (Ig), полипептид сывороточного альбумина или полипептидпроизводное репликазы. Слитые белки неубластина могут иметь улучшенные фармакокинетические свойства и биодоступность in vivo. Изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей зрелый или усеченный полипептид неубластина с мутантной полипептидной последовательностью. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая данный полипептид неубластина, предпочтительно включена в вектор, например экспрессирующий вектор. Мутантная молекула нуклеиновой кислоты неубластина или вектор, содержащий ее, могут быть включены в клетку.Клетка может быть, например, клеткой млекопитающего, клеткой гриба, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или бактериальной клеткой. Предпочтительной клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка ("СНО клетка"). Кроме того, изобретение относится к способу получения полимерконъюгированного полипептида неубластина путем выращивания клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид неубластина при условиях, позволяющих происходить экспрессии полипептида неубластина. В некоторых вариантах осуществления неубластин конъюгируется с остатком, встречающимся в природе. В конкретных вариантах осуществления остаток, встречающийся в природе, представляет собой гликозильный остаток. В некоторых вариантах осуществления экспрессируется гликозилированный неубластин, например в СНО клетке. Изобретение далее относится к полипептиду неубластина, экспрессированному в клетке. Подобные нуклеиновые кислоты, векторы, клетки хозяина и способы производства полипептида раскрыты здесь для слитых белков (таких как слитые белки неубластина - сывороточного альбумина) по данному изобретению. В некоторых вариантах осуществления полипептид неубластина, который экспрессирован в клетке,собирается и конъюгируется с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой остаток полиалкиленгликоля. В частных вариантах осуществления полимер представляет собой остаток ПЭГ. Конкретно предусмотрена изобретением композиция, которая содержит мутантный полипептид неубластина, связанный с полимером, не встречающимся в природе. Мутантный полипептид неубластина в композиции предпочтительно включает в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную аминокислотам 8-113 из SEQ ID NO:1, предусматривая, что полимерконъюгированный полипептид неубластина включает в себя одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из аминокислоты, отличающейся от аргинина в положении 14 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, аминокислоты, отличающейся от аргинина в положении 39 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, аминокислоты, отличающейся от аргинина в положении 68 полимерконъюгированного полипептида, и аминокислоты, отличающейся от аспарагина в положении 95 полимерконъюгированного полипептида, где положения аминокислот пронумерованы в соответствии с последовательностью полипептида из SEQ IDNO:1. Изобретение относится к устойчивому, растворимому в воде конъюгированному полипептиду неубластина или мутантному полипептидному комплексу неубластина, включающему полипептид неубластина или мутантный полипептид неубластина, связанный с остатком ПЭГ, где полипептид неубластина или мутантный полипептид неубластина связан с остатком ПЭГ лабильной связью. В некоторых вариантах осуществления лабильная связь является расщепляемой биохимическим гидролизом, протеолизом или сульфгидрильным расщеплением. В некоторых вариантах осуществления лабильная связь является расщепляемой в условиях in vivo. Кроме того, изобретение относится к способу получения модифицированного полипептида неубластина, который имеет увеличенное время полужизни в сыворотке по сравнению с неубластином дикого типа. Способ предусматривает заготовку полипептида неубластина или мутантного полипептида неубластина и связывание полипептида или мутантного полипептида неубластина с остатком полимера, не встречающегося в природе, таким образом формируя связанную композицию полимера и полипептида неубластина. Полимерконъюгированные мутантные полипептиды неубластина по данному изобретению включают в себя замену одной или нескольких аминокислот, например аминокислоты, кроме аргинина в положении 14 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, аминокислоты, кроме аргинина в положении 39 в аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, аминокислоты, кроме аргинина в положении 68 аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, или аминокислоты, кроме аспарагина в положении 95 аминокислотной последовательности полимерконъюгированного полипептида, когда положения аминокислот нумеруются в соответствии с последовательностью полипептида из SEQ ID NO:1. Синтез и выделение полипептидов неубластина дикого типа и мутантных Полипептиды неубластина могут быть выделены с использованием способов, известных в технике. Встречающиеся в природе полипептиды неубластина могут быть выделены из клеток или тканевых источников посредством соответствующей схемы очистки с использованием стандартных способов очистки белка. Альтернативно мутантные полипептиды неубластина могут быть синтезированы химически с- 11008743 использованием стандартных способов синтеза пептидов. Синтез коротких аминокислотных последовательностей хорошо известен в технике пептидов. См., например, Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed., 1984). В некоторых вариантах осуществления мутантные полипептиды неубластина производятся методами рекомбинантной ДНК. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный полипептид неубластина, может быть помещена в вектор, например в экспрессирующий вектор, и нуклеиновая кислота может быть введена в клетку. Подходящие клетки включают, например, клетки млекопитающих (такие как человеческие клетки или СНО клетки), клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки насекомых и бактериальные клетки. Когда экспрессия осуществляется в рекомбинантной клетке, клетка предпочтительно культивируется при условиях, позволяющих осуществить экспрессию мутантного полипептида неубластина. Мутантный полипептид неубластина может быть выделен из клеточной суспензии, если желательно. Как используется здесь, выделенный означает, что мутантный полипептид извлечен из тех компонентов клетки или культуральной среды, в которых он присутствует до процесса выделения. Процесс выделения может включать в себя одну или несколько стадий рефолдинга или очистки. Мутантные полипептиды неубластина могут быть сконструированы с использованием любого из нескольких способов, известных в технике. Одним из таких способов является сайт-направленный мутагенез, при котором специфический нуклеотид (или, если желательно, небольшое количество специфических нуклеотидов) изменяется, чтобы изменить одну аминокислоту (или, если желательно, небольшое количество заранее обозначенных аминокислотных остатков) в кодируемом полипептиде неубластина. Специалисты в данной области техники сознают, что сайт-направленный мутагенез является типовым и широко используемым способом. Фактически многие комплекты для сайт-направленного мутагенеза коммерчески доступны. Один такой комплект - "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" - продаетсяClontech Laboratories (Palo Alto, Калифорния). При осуществлении на практике настоящего изобретения будут использоваться, если не обозначено иначе, обычные способы клеточной биологии, культуры клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белка и иммунологии, которые находятся в пределах технических навыков. Такие способы описаны в литературе. См., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndManipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1986. Конъюгация полипептидов неубластина с полимером Химически модифицированные полипептиды неубластина могут быть получены специалистом, основываясь на настоящем раскрытии. Химические остатки, предпочтительные для конъюгации с полипептидом неубластина, представляют собой водорастворимые полимеры. Водорастворимый полимер выгоден, потому что белок, к которому он прикрепляется, не выпадает в осадок в водной окружающей среде, такой как физиологическая окружающая среда. Предпочтительно полимер является фармацевтически приемлемым для приготовления лечебного продукта или композиции. Если желательно, единичная молекула полимера может использоваться для конъюгации с полипептидом неубластина, хотя более чем одна молекула полимера тоже может быть присоединена. Композиции конъюгированного неубластина по изобретению могут оказаться полезными для применения как invivo, так и не in vivo. Кроме того, установлено, что конъюгируемый полимер может использовать любые другие группы, остатки или другие конъюгированные разновидности, которые подходят для конечного использования приложения. Например, в некоторых применениях может быть полезно ковалентно связать с полимером функциональный остаток, придающий полимеру устойчивость к деградации под действием ультрафиолета или антиоксидантные свойства, или другие свойства или характеристики. В качестве дальнейшего примера в некоторых применениях может быть выгодно внести в полимер функциональную группу, чтобы придать ему реакционноспособность или способность к поперечным сшивкам по характеру, усилить различные свойства или характеристики всего конъюгированного материала. Соответственно полимер может содержать любые функциональные группы, повторяющиеся группы, связи или другие структурные составляющие, которые не препятствуют эффективности конъюгированной композиции неубластина для его предполагаемого назначения. Специалист в данной области техники будет способен выбрать желаемый полимер, основываясь на таких соображениях как, будет ли конъюгат полимера/белка использоваться терапевтически и если так,он способен также выбрать желаемую дозу, время циркуляции, устойчивость к протеолизу и др. Эффективность дериватизации может быть установлена путем введения производного в желаемой форме (на- 12008743 пример, осмотическим насосом или, более предпочтительно, путем инъекции или инфузии, или далее приготовленным в виде композиции для орального, пульмонального или других путей введения) и определения его эффективности. Подходящие водорастворимые полимеры включают, но не ограничиваются ими, ПЭГ, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этиленового/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (или гомополимеры, или случайные сополимеры) и декстран или поли(нвинилпирролидон)ПЭГ, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные многоатомные спирты (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полимер может иметь любую подходящую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Для ПЭГ подходящая средняя молекулярная масса находится между приблизительно 2 и приблизительно 100 кДа. Это обеспечивает удобство в обращении и производстве. Специалисты в данной области техники оценят, что в препаратах ПЭГ некоторые молекулы будут иметь большую массу, некоторые меньшую, чем заявленная молекулярная масса. Таким образом, молекулярная масса обычно обозначается как средняя молекулярная масса. Другие молекулярные массы (размеры) могут использоваться в зависимости от желаемого терапевтического профиля (например, желаемой продолжительности непрерывного выделения; влияний, если таковые вообще имеются, на биологическую активность; легкости в обращении; степени антигенности или ее отсутствия и других известных влияний ПЭГ на лечебный белок). В различных вариантах осуществления молекулярная масса составляет приблизительно 2 кДа, приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 15 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 25 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 40 кДа или приблизительно 100 кДа. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления средняя молекулярная масса каждой цепи ПЭГ составляет приблизительно 20 кДа, в некоторых предпочтительных вариантах приблизительно 10 кДа. Число молекул полимера, присоединенных таким образом, может меняться, и специалист в данной области техники будет способен установить влияние на функцию. Возможны монодериватизация или проведение ди-, три-, тетра- или некоторой комбинации дериватизации с теми же самыми или различными химическими остатками (например, полимерами, такими как ПЭГ различной массы). Соотношение между молекулами полимера и молекулами белка (или полипептида) будет меняться по мере того, как будут меняться их концентрации в реакционной смеси. В общем оптимальное соотношение (с точки зрения эффективности реакции, в которой нет избытка непрореагировавшего белка или полимера) будет определяться факторами, такими как желаемая степень дериватизации (например, моно, ди-, три- и т.д.),молекулярная масса выбранного полимера, является полимер разветвленным или нет, а также условиями реакции. Молекулы ПЭГ (или других химических остатков) должны присоединяться к белку с учетом влияния на функциональные или антигенные области белка. Существует множество способов присоединения,доступных специалистам в данной области техники. См., например, ЕР 0401384 (связывание ПЭГ с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF; Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035,1992(отчет о конъюгации с ПЭГ GM-CSF с использованием трезилхлорида). Например, ПЭГ может быть ковалентно связан с аминокислотными остатками посредством реакционноспособной группы, такой как свободная аминогруппа или карбоксильная группа. Аминокислотные остатки, имеющие свободную аминогруппу, включают в себя остатки лизина и остаток N-концевой аминокислоты. Те остатки, которые имеют свободную карбоксильную группу, включают в себя остатки аспарагиновой кислоты, остатки глутаминовой кислоты и остаток С-концевой аминокислоты. Сульфгидрильные группы тоже могут использоваться в качестве реакционноспособной группы для прикрепления молекул(ы) ПЭГ. Для терапевтических целей прикрепление может осуществляться к аминогруппе, например к N-концу или группе лизина. Особенно желательным может оказаться белок, химически модифицированный в N-конце. Используя ПЭГ как иллюстрацию настоящих композиций, можно выбирать из разнообразия молекул ПЭГ (по молекулярной массе, ветвлению и т.д.) соотношения молекул ПЭГ и молекул белка (или пептида) в реакционной смеси, типа выполняемой реакции конъюгации с ПЭГ и способа получения выбранного конъюгированного с ПЭГ в N-концевой области белка. Способом получения препарата, конъюгированного с ПЭГ в N-концевой области (т.е. отделения этого остатка от других моноконъюгированных с ПЭГ остатков, если необходимо), может быть очистка конъюгированного с ПЭГ в N-концевой области материала от популяции конъюгированных с ПЭГ молекул белка. Селективная химическая модификацияN-конца может быть выполнена путем восстановительного алкилирования, которое использует дифференциальную реакционную способность различных типов первичных аминогрупп (лизина противN-концевой), доступных для дериватизации в отдельном белке. При соответствующих условиях реакции достигают в основном селективной дериватизации N-конца белка полимером, содержащим карбонильную группу. Например, можно селективно связать с ПЭГ концевую аминокислоту белка, проводя реакцию при рН, который позволит использовать преимущества различий между pKa эпсилон-аминогруппы остатков лизина и альфа -аминогруппы N-концевого остатка белка. Путем такой селективной дериватизации контролируется прикрепление водорастворимого полимера к белку: конъюгация с полимером имеет место преимущественно в N-конце белка, и никакой существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина, не происходит. При использовании восстановительного алкилирования водорастворимый полимер может иметь тип, описанный выше, и должен иметь единственный реакционноспособный альдегид для прикрепления к белку. Может использоваться пропионовый альдегид ПЭГ, содержащий единственный реакционноспособный альдегид. Настоящее изобретение относится к мутантным полипептидам неубластина, которые экспрессируются в прокариотах или эукариотах или созданы искусственно. В некоторых вариантах осуществления неубластин гликозилирован. В некоторых специфических вариантах осуществления димер неубластина конъюгирован с полимером у каждого N-конца и гликозилирован по каждому внутреннему остаткуAsn95. В других вариантах осуществления мутантный димер неубластина конъюгирован с полимером у каждого N-конца и конъюгирован с полимером у одного или обоих внутренних остатков Lys95. Конъюгация с ПЭГ может быть выполнена посредством любой подходящей реакции конъюгации с ПЭГ. Различные химизмы конъюгации с ПЭГ известны в технике. См., например, Focus on Growth Factors, 1992, 3 (2):4-10; ЕР 0154316; ЕР 0401384 и другие процитированные здесь публикации, которые касаются конъюгации с ПЭГ. Конъюгация с ПЭГ может быть выполнена через реакцию ацилирования или реакцию алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Конъюгация с ПЭГ посредством ацилирования обычно предполагает реагирование активного сложноэфирного производного ПЭГ. Любая известная или впоследствии обнаруженная реакционноспособная молекула ПЭГ может использоваться, чтобы выполнить конъюгацию с ПЭГ. Предпочтительным активированным сложным эфиром ПЭГ является ПЭГ, этерифицированный N-гидроксилсукцинимидом(NHS). Как используется здесь, ацилирование включает в себя без ограничения следующие типы связей между лечебным белком и водорастворимым полимером, таким как ПЭГ: амидную, карбаматную,уретановую и т.п. См. Bioconjugate Chem. 1994, 5:133-140. Реакционные условия могут быть выбраны из любых, известных в технике конъюгации с ПЭГ, или разработанных впоследствии, но следует избегать условий, таких как температура, растворитель и рН, которые могли бы инактивировать модифицируемый белок или полипептид неубластина. Конъюгация с ПЭГ посредством ацилирования, как правило, будет приводить к продукту белка неубластина, связанному с несколькими молекулами ПЭГ. Предпочтительно соединяющие связи являются амидными. Также предпочтительно получающийся продукт является в основном только (например,95%) моно-, ди- или триконъюгированным с ПЭГ. Тем не менее, некоторые разновидности с более высокими степенями конъюгации с ПЭГ могут быть сформированы в количествах, зависящих от конкретных используемых условий реакции. Если желательно, более очищенные конъюгированные с ПЭГ разновидности могут быть выделены из смеси, в особенности непрореагировавшие разновидности, стандартными способами очистки, включающими, среди прочих, диализ, высаливание, ультрафильтрацию,ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию и электрофорез. Конъюгация с ПЭГ посредством алкилирования, как правило, предполагает реакцию концевого альдегидного производного ПЭГ с неубластином в присутствии восстанавливающего агента. Конъюгация с ПЭГ посредством алкилирования также может привести к поликонъюгированным с ПЭГ белковым продуктам неубластина. Кроме того, можно управлять условиями реакции, чтобы существенно содействовать связыванию с ПЭГ только с -аминогруппой N-конца неубластина (т.е. моноконъюгированному с ПЭГ белку). Как в случае моноконъюгации с ПЭГ, так и в случае поликонъюгации с ПЭГ, ПЭГ-группы предпочтительно прикрепляются к белку через группу -СН 2-NH-. Особенно в отношении группы -СН 2 этот тип связи упоминается здесь как алкильная связь. Дериватизация через восстановительное алкилирование с получением моноконъюгированного с ПЭГ продукта использует дифференциальную реакционную способность различных типов первичных аминогрупп (лизина против N-концевой), доступных для дериватизации. Реакцию проводят при рН, который позволяет использовать преимущества различий между pKa -аминогрупп остатков лизина и-аминогруппы N-концевого остатка белка. Посредством такой селективной дериватизации регулируется прикрепление к белку водорастворимого полимера, который содержит реакционноспособную группу,такую как альдегид: конъюгация с полимером имеет место преимущественно в N-конце белка, и никакой существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина, не происходит. Молекулы полимера, используемые в подходе ацилирования и в подходе алкилирования, могут быть выбраны из числа водорастворимых полимеров, как описано выше. Выбранный полимер должен быть модифицирован, чтобы иметь единственную реакционноспособную группу, такую как активную эфирную для ацилирования или альдегидную для алкилирования, предпочтительно так, чтобы степень полимеризации можно было регулировать, как предусмотрено в настоящих способах. Примером реакци- 14008743 онноспособного альдегида ПЭГ является пропионовый альдегид ПЭГ, который устойчив в воде, или моно С 1-С 10 алкокси или арилокси его производные (см. патент США 5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Для реакций ацилирования выбранный(е) полимер(ы) должен(ны) иметь единственную реакционноспособную эфирную группу. Для данного восстановительного алкилирования выбранный(е) полимер(ы) должен(ны) иметь единственную реакционноспособную альдегидную группу. Как правило, водорастворимый полимер не будет выбран из встречающихся в природе гликозильных остатков, так как их обычно более удобно производить с помощью рекомбинантных экспрессионных систем млекопитающих. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Примером водорастворимого полимера для использования здесь является ПЭГ. Как используется здесь, полиэтиленгликоль заключает в себе любую из форм ПЭГ, которые использовались для дериватизации других белков, включая, но не ограничиваясь ими, например, моно(С 1-С 10)алкокси- или арилоксиПЭГ. Как правило, химическая дериватизация может быть выполнена при любом подходящем условии,использующемся для реагирования биологически активного вещества с активированной молекулой полимера. Способы получения конъюгированного с ПЭГ неубластина обычно будут включать следующие стадии:(а) реагирование белка или полипептида неубластина с ПЭГ (таким как реакционноспособное сложноэфирное или альдегидное производное ПЭГ) при условиях, в соответствии с которыми молекула становится прикрепленной к одной или более группам ПЭГ;(b) получение продукта(ов) реакции. Как правило, оптимальные реакционные условия для реакций ацилирования будут выбраны в каждом отдельном случае, основываясь на известных параметрах и желаемом результате. Например, чем больше отношение ПЭГ:белок, тем выше процентное содержание поликонъюгированного с ПЭГ продукта. Восстановительное алкилирование с получением в основном гомогенной популяции монополимера/неубластина будет, как правило, включать в себя следующие стадии:(а) реагирование белка или полипептида неубластина с реакционноспособной молекулой ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования при рН, подходящем для осуществления pen-nit селективной модификации -аминогруппы в N-конце неубластина;(b) получение продукта(ов) реакции. В основном для гомогенной популяции монополимера/неубластина реакционными условиями восстановительного алкилирования являются те, которые позволяют селективное прикрепление водорастворимого полимерного остатка к N-концу неубластина. Такие реакционные условия обычно обеспечивают различия pKa между аминогруппами лизина и -аминогруппой на N-конце (pKa представляет собой рН,при котором 50% аминогрупп присоединили протон и 50% - нет). рН также влияет на используемое отношение полимера к белку. В целом, чем рН ниже, тем больший избыток полимера к белку будет желателен (т.е. чем менее реакционноспособна N-концевая -аминогруппа, тем больше полимера требуется,чтобы достигнуть оптимальных условий). Если рН выше, отношение полимер:белок не должно быть большим (т.е. реакционноспособных групп доступно больше, так что молекул полимера необходимо меньше). Для целей настоящего изобретения рН будет, главным образом, относиться к диапазону 3-9,предпочтительно 3-6. Другим важным соображением является молекулярная масса полимера. Как правило, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше молекул полимера может быть присоединено к белку. Подобным образом ветвление полимера должно приниматься во внимание при оптимизации этих параметров. Как правило, чем выше молекулярная масса (или чем больше ветвей), тем выше отношение полимер:белок. В целом, для реакций конъюгации с ПЭГ, включенных здесь, предпочтительная средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 2 до приблизительно 100 кДа. Предпочтительная средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 5 до приблизительно 50 кДа, особенно предпочтительно приблизительно от 10 кДа до приблизительно 20 кДа. Предпочтительная полная молекулярная масса составляет приблизительно от 10 до приблизительно 40 кДа. В некоторых вариантах осуществления полипептид неубластина связан с полимером через концевую реакционноспособную группу на полипептиде. Альтернативно или в дополнение полипептид неубластина может быть связан через аминогруппу боковой цепи внутреннего остатка лизина, например остатка лизина, введенного в аминокислотную последовательность встречающегося в природе полипептида неубластина. Таким образом, конъюгации могут также ответвляться от неконцевых реакционноспособных групп. Полимер с реакционноспособной(ыми) группой(ами) обозначается здесь как активированный полимер. Реакционноспособная группа выборочно реагирует с реакционноспособными группами на белке, например свободными аминогруппами.- 15008743 Прикрепление может произойти в активированном полимере к любой доступной аминогруппе неубластина, такой как альфа аминогруппы или эпсилон аминогруппы остатка или остатков лизина, введенных в аминокислотную последовательность полипептида неубластина. Свободные карбоксильные группы, надлежащим образом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, имидазол,остатки окисленных углеводов и меркаптогруппы неубластина (если имеются) также могут использоваться как участки прикрепления. Главным образом, используется приблизительно от 1,0 до приблизительно 10 моль активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество является балансом между максимизацией степени реакции при минимизации неспецифических модификаций продукта и в то же самое время определением химизмов, которые поддерживают оптимальную активность в то же самое время оптимизации, если возможно, времени полужизни белка. Предпочтительно сохраняется по меньшей мере приблизительно 50% биологической активности белка и наиболее предпочтительно около 100%. Полимер может быть связан с полипептидом неубластина с использованием методов, известных в технике. Например, в одном варианте осуществления полиалкиленгликолевый остаток связывается с группой лизина мутантного полипептида неубластина. Связывание с группой лизина может быть выполнено с N-гидроксилсукцинимидным (NHS) активным сложным эфиром, таким как сукцинимидилсукцинат-ПЭГ (SS-PEG) и сукцинимидилпропионат (SPA-PEG). Подходящие полиалкиленгликолевые остатки включают в себя, например, карбоксиметил-NHS, норлейцин-NHS, SC-PEG, трезилат, альдегид, эпоксид,карбонилимидазол и карбонат PNP. Дополнительные реагирующие с амином линкеры ПЭГ могут замещать сукцинимидильный остаток. Они включают, например, изотиоцианаты, нитрофенилкарбонаты, эпоксиды и бензотриазолкарбонаты. Условия предпочтительно выбираются, чтобы максимизировать селективность и степень реакции. Если желательно, полимерконъюгированные полипептиды неубластина могут содержать тэг, например тэг, который впоследствии может быть высвобожден протеолизом. Таким образом, остаток лизина может быть модифицирован селективно: сначала модифицированный His-тэг будет реагировать с низкомолекулярным линкером, таким как реактив Traut (Pierce), который будет реагировать как с лизином,так и N-концом, а затем His-тэг будет отщеплен. Полипептид будет тогда содержать свободную группуSH, которая может быть селективно модифицирована ПЭГ, содержащим головную группу, реагирующую с тиолами, такую как малеимидная группа, винилсульфоновая группа, галогенацетатная группа или свободная или защищенная SH. Реактив Traut может быть заменен любым линкером, который введет специфический участок для прикрепления ПЭГ. Например, реактив Traut мог быть заменен SPDP, SMPT, SATA или SATP (все доступны от Pierce). Подобным образом можно вызвать реакцию белка с реагирующим с амином линкером,который вставляет малеимидную (например SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS или GMBS), галогенацетатную группу (SBAP, SIA, SIAB) или винилсульфоновую группу, и вызвать реакцию полученного в результате продукта с ПЭГ, который содержит свободный SH. Единственным ограничением размера линкера, который используется, является то, что он не может блокировать последующее удаление N-концевого тэга. Таким образом, в других вариантах осуществления полиалкиленгликолевый остаток присоединяется к группе цистеина мутантного полипептида неубластина. Связывание может быть осуществлено с использованием, например, малеимидной, винилсульфоновой, галогенацетатной и тиольной групп. В предпочтительных вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина в композиции имеет более длительное время полужизни в сыворотке относительно времени полужизни полипептида неубластина в отсутствие полимера. Альтернативно или в дополнение полимерконъюгированный димер полипептида неубластина в композиции связывает GFR, активирует RET, нормализует патологические изменения нейрона, увеличивает выживаемость нейрона или ослабляет нейропатическую боль или выполняет комбинацию этих физиологических функций. Испытания для определения того,увеличивает ли полипептид выживаемость нейрона или нормализует патологические изменения нейрона,описаны, например, в WO 00/01815. Предпочтительно нейрон является сенсорным, вегетативным или дофаминергическим. В предпочтительных вариантах осуществления композиция предусмотрена как устойчивый водорастворимый полипептидный комплекс конъюгированного неубластина, включающий полипептид неубластина или мутантный полипептид неубластина, связанный с остатком ПЭГ. Если желательно, полипептид неубластина или мутантный полипептид неубластина может быть связан с остатком ПЭГ посредством лабильной связи. Лабильная связь может быть расщеплена, например, при биохимическом гидролизе, протеолизе или сульфгидрильном расщеплении. Например, связь может быть расщеплена в условиях in vivo (физиологических). Другие параметры реакции, такие как растворитель, время реакции, температура и т.д., и средства очистки продуктов могут быть определены в каждом отдельном случае, основываясь на опубликованной информации, касающейся дериватизации белков с водорастворимыми полимерами.- 16008743 Если желательно, может быть использована одна молекула полимера для конъюгации на полипептиды неубластина. Альтернативно может быть прикреплена более чем одна молекула полимера. Композиции конъюгированного неубластина по изобретению могут применяться как in vivo, так и не in vivo. Кроме того, считается, что для конъюгации с полимером могут быть использованы любые другие группы, остатки или другие конъюгированные разновидности, которые соответствуют конечному использованию приложения. Например, может быть полезно в некоторых применениях ковалентно связать полимер с функциональным остатком, придающим полимеру устойчивость к деградации под действием ультрафиолета либо антиоксидантные или другие свойства или характеристики. В качестве дальнейшего примера может быть выгодно в некоторых применениях выполнить полимер функциональным, чтобы сделать его по характеру реакционноспособным или способным к образованию поперечных связей, чтобы усилить различные свойства или характеристики всего конъюгированного материала. Соответственно полимер может содержать любые функциональные группы, повторяющиеся группы, связи или другие составные структуры, которые не препятствуют эффективности композиции конъюгированного мутеина неубластина для ее предполагаемой цели. Иллюстративные полимеры, которые могут быть успешно использоваться для достижения этих желаемых характеристик, рассмотрены ниже в показательных реакционных схемах. В применениях ковалентно связанных пептидов полимеру может быть придана функциональность, и затем он связывается со свободной(ыми) аминокислотой(ами) пептида(ов) с образованием лабильной связи. Реакции могут иметь место посредством любого подходящего способа, используемого для взаимодействия биологически активных материалов с инертными полимерами, предпочтительно при рН приблизительно 5-8, например рН 5, 6, 7 или 8, если реакционноспособные группы находятся на-аминогруппе в N-конце. В целом процесс включает в себя подготовку активированного полимера и после этого реагирование белка с активированным полимером с получением растворимого белка, подходящего для лекарственной композиции. Вышеупомянутая реакция модификации может быть выполнена несколькими способами, которые могут включать в себя одну или несколько стадий. Могут использоваться линейные и разветвленные формы ПЭГ, так же как другие алкилированные формы. Длина ПЭГ может быть различной. Самые распространенные формы отличаются по размеру от 2-100 кДа. В то время как представленные примеры свидетельствуют о том, что намеченная конъюгация с ПЭГ N-конца не влияет на фармакокинетические свойства, факт, что материал сохранил физиологическую функцию, указывает на то, что модификация на участке или участках, раскрытых здесь, не является вредной. Следовательно, в производстве мутантных форм неубластина, которые могли бы обеспечить дополнительные участки прикрепления путем вставки остатков лизина, вероятный результат того, что эти формы будут конъюгированы с ПЭГ как по лизину, так и по N-концу, включен в изобретение. Один или несколько участков на полипептиде неубластина могут быть связаны с полимером. Например, один, два, три, четыре или пять остатков ПЭГ могут быть связаны с полипептидом. В некоторых вариантах осуществления остаток ПЭГ связан с N-концом и/или аминокислотами 14, 39, 68 и 95 полипептида неубластина, пронумерованных, как показано в табл. 1 и SEQ ID NO:1. В выгодных вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина в композиции имеет более длительное время полужизни в сыворотке относительно полужизни неубластина дикого типа или мутантного полипептида в отсутствие полимера. Альтернативно или в дополнение, полимерконъюгированный полипептид неубластина в композиции связывает GFR3, активирует RET,нормализует патологические изменения нейрона, увеличивает выживаемость нейрона или ослабляет нейропатическую боль, или выполняет комбинацию этих физиологических функций. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид неубластина или полимер, конъюгированный в комплексе, имеет физиологическую активность, выбранную из группы, состоящей из связывания GFR3, активации RET, нормализации патологических изменений нейрона, увеличения выживаемости нейрона или ослабления нейропатической боли. Изобретением также предусмотрены мультимерные полипептиды, которые включают в себя полимерконъюгированный полипептид неубластина. Мультимерные полипептиды предпочтительно предусматриваются как очищенные мультимерные полипептиды. Примеры мультимерных комплексов включают в себя, например, димерные комплексы. Мультимерный комплекс может быть предусмотрен как гетеромерный или гомомерный комплекс. Таким образом, мультимерный комплекс может быть гетеродимерным полимерконъюгированным полипептидным комплексом, включающим в себя один мутантный полипептид неубластина и один немутантный неубластин, или гетеродимерным полимерконъюгированным полипептидным комплексом, включающим в себя два или несколько мутантных полипептидов неубластина. В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный полипептид неубластина связывает GFR3. Предпочтительно связывание полимерконъюгированного полипептида неубластина стимулирует фосфорилирование полипептида RET. Для того чтобы определить, связывает ли полипептидGFR3, испытания могут быть выполнены, как описано в WO 00/01815. Например, присутствие неубластина в надосадочной жидкости среды клеток линии СНО может быть описано с использованием моди- 17008743 фицированной формы тройного комплексного испытания, проведенного Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1997, 94:6238). В этом испытании способность GDNF-подобных молекул может быть оценена по их способности опосредовать связь между внеклеточным доменом RET и различными корецепторами,GFR1, GFR2 и GFR3. Растворимые формы RET и корецепторов производятся как слитые белки. Слитый белок между внеклеточным доменом крысиного RET и плацентарной щелочной фосфатазой(RET-AP) и слитый белок между внеклеточным доменом крысиного GFR1 (раскрытого в опубликованной заявке WO 9744356; 27 ноября 1997 г.) и Fc-областью человеческого IgG1 (rG;FR(1-Ig) были описаны Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94:6238). Полимер по изобретению предпочтительно является полиалкиленгликолевым остатком и более предпочтительно остатком ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления остаток полимера имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 100 до приблизительно 25000 Да, приблизительно от 1000 до приблизительно 20000 Да или приблизительно от 5000 до приблизительно 20000 Да. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полимерный остаток имеет среднюю молекулярную массу приблизительно 5000 Да, среднюю молекулярную массу приблизительно 10000 Да или среднюю молекулярную массу приблизительно 20000 Да. Функциональная группа на полиалкиленгликолевом остатке может быть, например, карбоксиметилNHS, норлейцин-NHS, SC-PEG, трезилатом, альдегидом, эпоксидом, карбонилимидазолом или PNP карбонатом. Прикрепление может произойти через посредство активного сложного эфира Nгидроксилсукцинимида (NHS). Активный сложный эфир может быть, например, сукцинимидилсукцинатом-ПЭГ (SS-PEG), сукцинимидилбутиратом (SPB-PEG) или сукцинимидилпропионатом (SPA-PEG). В некоторых вариантах осуществления остаток полиалкиленгликоля связан с группой цистеина полипептида неубластина или мутантного полипептида неубластина. Например, прикрепление может произойти посредством малеимидной, винилсульфоновой, галогенацетатной и тиольной групп. В различных вариантах осуществления полипептид неубластина или мутантный полипептид неубластина включает в себя один, два, три или четыре остатка ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления полимер связан с полипептидом на участке неубластина, который представляет собой N-конец. В некоторых вариантах осуществления полимер связан с полипептидом на участке в неконцевой аминокислоте полипептида неубластина или мутантного полипептида неубластина. В некоторых вариантах осуществления полимер связан с открытой для растворителя аминокислотой полипептида неубластина или мутантного полипептида неубластина. В некоторых вариантах осуществления полимер связан с полипептидом неубластина или мутантным полипептидом неубластина у остатка, выбранного из группы, включающей в себя аминокислоту N-конца полимерконъюгированного полипептида,положение 14 в аминокислотной последовательности полипептида неубластина или мутантного полипептида неубластина,положение 39 в аминокислотной последовательности полипептида неубластина или мутантного полипептида неубластина,положение 68 в аминокислотной последовательности полипептида неубластина или мутантного полипептида неубластина,положение 95 в аминокислотной последовательности полипептида неубластина или мутантного полипептида. Полимерконъюгированные слитые белки неубластина Если желательно, полимерконъюгированный полипептид неубластина может быть представлен как слитый белок. Слитые полипептидные производные белков по изобретению также включают различные структурные формы первичного белка, которые сохраняют биологическую активность. Полимерконъюгированные слияния неубластина - сывороточного альбумина могут быть получены с использованием способов, известных в технике. Любой из ряда кросслинкеров, которые содержат соответствующую группу, реагирующую с аминами, и группу, реагирующую с тиолами, может использоваться, чтобы связать неубластин с сывороточным альбумином. Примеры подходящих линкеров включают реагирующие с аминами кросслинкеры, которые вставляют реагирующий с тиолами малеимид. Они включают в себя, например, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS или GMBS. Другие подходящие линкеры вставляют реагирующую с тиолами галогенацетатную группу. Они включают, например, SBAP, SIA, SIAB и тех, которые предоставляют защищенный или незащищенный тиол для реакции с сульфгидрильными группами, чтобы создать восстановимую связь - SPDP, SMPT, SATA или SATP - все из которых коммерчески доступны (например, Pierce Chemicals). Специалист в данной области техники может подобным образом представить себе альтернативные подходы, которые свяжутN-конец неубластина с сывороточным альбумином. Также считается, что специалист в данной области техники может произвести конъюгаты с сывороточным альбумином, которые не нацелены на N-конец неубластина или на тиольные остатки на сывороточном альбумине. Если желательно, слияния неубластина - сывороточного альбумина могут быть проведены с использованием методов генной инженерии, в которых неубластин сливается с геном сыворо- 18008743 точного альбумина в его С-конце, N-конце или в обоих концах. Любой конъюгат неубластина, который приводит к продукту с увеличенным временем полужизни,например in vivo или конкретно у животных (включая людей), может быть произведен с использованием подобной стратегии. Другим примером конъюгата неубластина, который приводит к продукту с увеличенным временем полужизни in vivo, является слитый белок неубластина, где партнером слияния является Ig. Другие производные полимерконъюгированных неубластинов включают в себя ковалентные или агрегатные конъюгаты мутантного неубластина или его фрагментов с другими белками или полипептидами, такие как полученные синтезом в рекомбинантной культуре в качестве дополнительных N- или Сконцов. Например, конъюгированный пептид может быть сигнальной (или лидерной) полипептидной последовательностью в N-концевой области белка, которая одновременно с трансляцией или после нее направляет перемещение белка от участка его синтеза к участку его функции внутри или снаружи клеточной мембраны или стенки (например, лидер альфа-фактора дрожжей). Белки неубластинового рецептора могут включать в себя пептиды, добавленные для облегчения очистки или идентификации неубластина (например, слияние гистидина/неубластина). Аминокислотная последовательность неубластина также может быть связана с пептидом Asp-TyrLys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), SEQ ID NO:22 (Норр et al., Biotechnology, 1988, 6:1204). Последняя последовательность очень антигенна и обеспечивает антигенную детерминанту, обратимо связывающуюся со специфическим моноклональным антителом, что позволяет быстро производить анализ и облегчает очистку экспрессируемого рекомбинантного белка. Эта последовательность также специфически расщепляется энтерокиназой бычьей слизистой оболочки по остатку, непосредственно следующему за парой Asp-Lys. Биологически активные полипептиды Полипептиды по изобретению могут быть представлены в любой биологически активной форме,включая форму пре-пробелков, пробелков, зрелых белков, гликозилированных белков, негликозилированных белков, фосфорилированных белков, нефосфорилированных белков, усеченных форм или любого другого белка, подвергшегося посттрансляционной модификации. Биологически активный полипептид неубластина включает в себя полипептид, который, например,когда димеризован, один или в присутствии кофактора, такого как GFR3 или RET, связывается с RET,индуцирует димеризацию RET и аутофосфорилирование RET. Полипептиды по изобретению могут, в частности, быть N-гликозилированным полипептидом, который предпочтительно гликозилирован в области N-остатков, обозначенных в списках последовательностей. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:6, удерживая гликозилированный остаток аспарагина в положении 122, или аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:14, удерживая гликозилированный остаток аспарагина в положении 95, или в аналогичном положении в любом мутантном полипептиде неубластина, если он выравнен с помощью, например, программного обеспеченияClustalW. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:23, упоминается здесь как NBN113-N95K, содержит остаток лизина, который заместил остаток аспарагина в положении 95 из SEQ ID NO:2,; или аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:24, упоминается здесь как NBN106-N95K, или аналогичное положение в любом мутантном полипептиде неубластина, если он выравнен с помощью,например, программного обеспечения ClustalW. Настоящее изобретение также относится к слитым белкам мутантного неубластина, таким как Igслияния, как описано, например, в патенте США 5434131, или слияния сывороточного альбумина. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID NO:1, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:2.- 19008743 В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:7. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:8-21, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как любая из SEQ ID NO:8-21. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с последовательностью,представленной как SEQ ID NO:36. В дальнейших вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:1-21 и 36, за исключением одной замены, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85%,предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с любой из последовательностей,представленных как SEQ ID NO:1-21 и 36. В других вариантах осуществления мутантный полипептид по изобретению содержит отпечаток пальца подсемейства GDNF, т.е. консервативные аминокислотные остатки цистеина, обозначенные в табл. 3 и 4. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мутантному полипептиду, кодируемому полинуклеотидной последовательностью, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид SEQ ID NO:1, ее комплемен- 20008743 тарной цепью или ее субпоследовательностью. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид по изобретению кодируется полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 70% идентичность с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к ранее не существовавшим полипептидам, кодируемым полинуклеотидной последовательностью, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид SEQ ID NO:2,ее комплементарной цепью или ее субпоследовательностью. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид по изобретению кодируется полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 70% идентичность с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидSEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мутантным полипептидам, кодируемым полинуклеотидной последовательностью, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид любой из SEQ ID NO:8-21, ее комплементарной цепью или ее субпоследовательностью. В других вариантах осуществления мутантный полипептид по изобретению кодируется полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 70% идентичность с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид любой изSEQ ID NO:8-21. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к ранее не существовавшим полипептидам, кодируемым полинуклеотидной последовательностью, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид SEQ ID NO:36,ее комплементарной цепью или ее субпоследовательностью. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид по изобретению кодируется полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 70% идентичность с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидSEQ ID NO:36. Биологическое происхождение Неконъюгированный димер полипептида неубластина может быть выделен и затем конъюгирован с одним или несколькими полимерами с получением полимерконъюгированного димера полипептида неубластина по изобретению. Димер полипептида неубластина может быть выделен из клетки млекопитающего, предпочтительно из человеческой клетки или из клетки мышиного происхождения, или из клетки, происходящей из яичника китайского хомячка. Нейротрофическая активность Модифицированные полипептиды неубластина, включая усеченные полипептиды неубластина по изобретению, пригодны для ослабления метаболизма, роста, дифференцировки или выживания нерва или клетки нейрона. В частности, модифицированные полипептиды неубластина используются, чтобы вылечить или облегчить расстройство или болезнь животного, например человека, которые отвечают на активность нейротрофического средства. Такое лечение и способы описаны более подробно ниже. Фармацевтические композиции, включающие неубластинполимерные конъюгаты Кроме того, предусмотрена фармацевтическая композиция, включающая в себя димер модифицированного полипептида неубластина по настоящему изобретению. Полимернеубластиновые конъюгаты по изобретению могут быть введены в чистом виде, а также в форме фармацевтически приемлемых сложных эфиров, солей и других их физиологически функциональных производных. В таких фармацевтических и медикаментозных композициях полимерконъюгированный конъюгат неубластина предпочтительно использовать вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемым(и) носителем(ями) и, по выбору, с любыми другими лечебными ингредиентами. Носитель(и) должен(ны) быть фармацевтически приемлем(ыми) в смысле совместимости с другими компонентами лекарственной композиции и не быть чрезмерно вредным(и) для реципиента. Полимерконъюгированный неубластин предусмотрен в эффективном количестве для достижения желаемого фармакологического воздействия или выгодного медицинского воздействия, как описано здесь, и в соответствующем количестве для достижения желаемой биодоступной in vivo дозы или концентрации. Композиции содержат препараты, подходящие для парентерального, а также для не парентерального введения и специфических способов введения, включая оральное, ректальное, буккальное, местное,назальное, глазное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, чрескожное, интратекальное, внутрисуставное, внутриартериальное, субарахноидальное, бронхиальное, лимфатическое, влагалищное и внутриматочное введение. Предпочтительны лекарственные препараты, подходящие для аэрозольного и парентерального введения как местного, так и системного. Когда полимерконъюгированный неубластин используется в композиции, содержащей жидкий раствор, препарат может быть выгодно введен орально, через бронхи или парентерально. Когда полимерконъюгированный неубластин используется в форме жидкой суспензии или в виде порошка в биологически совместимом носителе, лекарственный препарат может быть выгодно введен орально, ректально или через бронхи. Альтернативно он может быть введен через нос или бронхи путем распыления порошка в газе-носителе для образования газообразного рассеивания порошка, который вдыхается пациентом из дыхательного контура, включающего подходящее распылительное устройство.- 21008743 Лекарственные композиции, включающие белки по настоящему изобретению, могут быть удобно представлены в стандартных дозированных формах и могут быть приготовлены любым из способов, известных в фармации. Такие способы обычно включают стадию введения активных ингредиентов в связь с носителем, который составляет один или несколько дополнительных компонентов. В типичном случае композиции готовятся путем единообразного и тесного приведения активного(ых) компонента(ов) в связь с жидким и тонкоизмельченным твердым носителем или обоими, а затем,если необходимо, формирования продукта в дозированных формах желаемого препарата. Композиции по настоящему изобретению, пригодные для орального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, таблетки или лепешки, каждая из которых включает в себя заранее определенное количество активного компонента в виде порошка или гранул; или суспензии в водной либо неводной жидкости, такой как сироп, эликсир, эмульсия или доза жидкого лекарства. Композиции, пригодные для парентерального введения, удобно включают в себя стерильный жидкий препарат активного конъюгата, который предпочтительно изотоничен с кровью реципиента (например, физиологический солевой раствор). Такие композиции могут включать суспендирующие вещества и загустители или другие системы микрочастиц, которые предназначены для нацеливания соединения на компоненты крови или один или несколько органов. Композиции могут быть представлены в форме с разовой дозой или многоразовыми дозами. Композиции в виде назальных спреев включают в себя очищенные водные растворы активного конъюгата с консервирующими и изотоническими веществами. Такие композиции предпочтительно приводить к рН и изотоническому состоянию, совместимому со слизистыми оболочками носа. Композиции для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящим носителем, таким как масло какао, гидрогенизированные жиры или гидрогенизированная жирная карбоновая кислота. Глазные лекарственные формы, такие как глазные капли, готовятся по схожей методике с назальными спреями, за исключением того, что рН и изотонические факторы предпочтительно приспосабливаются, чтобы соответствовать таковым глаза. Композиции для местного применения содержат конъюгат по изобретению, растворенный или суспендированный в одной или нескольких средах, таких как минеральное масло, вазелин, многоатомные спирты или другие основания, используемые в фармацевтических композициях для местного применения. В дополнение к вышеупомянутым ингредиентам композиции по данному изобретению могут дополнительно включать один или несколько дополнительных ингредиентов, выбранных из растворителей,буферов, ароматизаторов, вызывающих дезинтеграцию средств, поверхностно-активных веществ, загустителей, смазок, консервантов (включая антиоксиданты) и т.п. Предшествующие соображения применяются также к слитым белкам неубластина по изобретению (например, слитым белкам неубластина - сывороточного альбумина). Соответственно настоящее изобретение относится к обеспечению подходящими слитыми белками для стабилизации in vitro конъюгата полимерконъюгированного неубластина в растворе в качестве предпочтительного иллюстративного применения изобретения. Слитые белки могут использоваться, например, для увеличения устойчивости к ферментативной деградации полимерконъюгированного полипептида неубластина, и представляют средство улучшения срока годности, стабильности при комнатной температуре и т.п. Понятно, что предшествующие соображения применяются также к слитым белкам неубластина - сывороточного альбумина (включая слитые белки человеческого неубластина - человеческого сывороточного альбумина) по изобретению. Способы лечения Композиции по изобретению могут использоваться для лечения или облегчения расстройства или болезни у млекопитающего, например примата, включая человека, если расстройство или болезнь реагирует на действие нейротрофических средств. Композиции по изобретению могут использоваться непосредственно, например, через инъецированные, имплантированные или принятые внутрь фармацевтические композиции, чтобы лечить патологический процесс, реагирующий на полипептиды неубластина. Композиции могут использоваться для облегчения расстройства или болезни живого организма животного, включая человека, если расстройство или болезнь реагируют на действие нейротрофических средств. Расстройство или болезнь могут, в частности, быть повреждением нервной системы, вызванным травмой, операцией, ишемией, инфекцией,нарушениями обмена веществ, недостатком питания, злокачественной опухолью или токсичными веществами и наследственными или идиопатическими процессами. Повреждение может, в частности, происходить в сенсорных нейронах или ганглиозных клетках сетчатки, включая нейроны в ганглиях задних корешков или в любой из следующих тканей: коленчатом,каменистом и узловатом ганглиях; вестибулярно-слуховом комплексе восьмого черепного нерва; вентролатеральном полюсе верхненижнечелюстной доли ганглия тройничного нерва; и среднемозговом ядре тройничного нерва.- 22008743 В некоторых вариантах осуществления способа по изобретению болезнь или расстройство являются нейродегенеративной болезнью, вовлекающей пораженные и травмированные нейроны, такой как травматические повреждения периферических нервов, мозга и/или спинного мозга, церебральное ишемическое повреждение нейронов, нейропатия и особенно периферическая нейропатия, травма или повреждение периферического нерва, ишемический инсульт, острое повреждение мозга, острое повреждение спинного мозга, опухоли нервной системы, множественный склероз, воздействие нейротоксинов, нарушения обмена веществ, такие как диабет или нарушения функции почек, и повреждения, вызванные возбудителями инфекций, нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона, болезнь Паркинсона, паркинсонизм - плюс синдромы, прогрессирующий надъядерный паралич (синдром Стила-Ричардсона-Ольшевского), оливопонтоцеребеллярную атрофию (ОРСА), синдром Шая-Дрейджера (атрофию множества систем), гуамский комплекс паркинсонизма-деменции, боковой амиотрофический склероз или любое другое врожденное или нейродегенеративное заболевание и ухудшение памяти, связанное с деменцией. В некоторых вариантах осуществления можно лечить сенсорные нейроны и/или нейроны вегетативной системы, в частности, можно лечить ноцицептивные и механорецептивные нейроны, более конкретно нейроны волокна А-дельта, С-волокна и А-бета волокна. Кроме того, можно лечить симпатические и парасимпатические нейроны вегетативной системы. В некоторых вариантах осуществления можно лечить болезни моторного нейрона, такие как боковой амиотрофический склероз (БАС) и спинальная мышечная атрофия. В других вариантах осуществления молекулы неубластина по данному изобретению могут использоваться для улучшения восстановления нерва после травматического повреждения. Альтернативно или в дополнение, канал направления нерва с матриксом, содержащим полимерконъюгированные полипептиды неубластина или слияние, или конъюгаты мутантных полипептидов неубластина, может использоваться в способах, описанных здесь. Такие каналы направления нерва раскрыты, например, в патенте США 5834029. В некоторых вариантах осуществления композиции, раскрытые здесь (и фармацевтические композиции, включающие то же самое), используются при лечении периферических нейропатий. Среди периферических нейропатий, включенных для лечения молекулами по данному изобретению, находятся вызванные травмой нейропатии, например вызванные физическим повреждением или болезненным состоянием, физическим повреждением головного мозга, физическим повреждением спинного мозга, инсультом, связанным с повреждением мозга, и неврологическими расстройствами, связанными с нейродегенерацией. Также включены сюда нейропатии, вторичные по отношению к инфекции, воздействию токсина и воздействию лекарственного средства. Дополнительно сюда включены нейропатии, вторичные по отношению к системному заболеванию или нарушению обмена веществ. Например, раскрытые здесь композиции также могут использоваться для лечения нейропатий, вызванных химиотерапией (таких как вызванные введением химиотерапевтических средств, например таксола или цисплатина); токсических нейропатий, лекарственных нейропатий, нейропатий, вызванных витаминной недостаточностью; идиопатических нейропатий; диабетических нейропатий; и постгерпетической невралгии. См., например, патенты США 5496804 и 5916555. Дополнительными состояниями, которые можно лечить согласно изобретению, являются мононейропатии, множественные мононейропатии и полинейропатии, включая аксональные и демиелинизирующие нейропатии. В некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению (и фармацевтические композиции, включающие то же самое) используются при лечении различных заболеваний глаз, включая потерю фоторецепторов сетчатки у больных, пораженных дегенерацией желтого пятна, пигментным ретинитом,глаукомой и сходными заболеваниями. Способы и фармацевтические композиции Настоящее изобретение относится к способам лечения нейропатической боли, лечения тактильной аллодинии и уменьшения потери болевой чувствительности, связанной с нейропатией. Настоящие способы используют димеры полимерконъюгированного полипептида неубластина, включая димеры, содержащие биоактивные полипептиды неубластина полной длины или биоактивные усеченные полипептиды неубластина. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим димер полимерконъюгированного полипептида неубластина, суспендированный, растворенный или диспергированный в фармацевтически приемлемом носителе. 1. Лечение нейропатической боли. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения нейропатической боли у субъекта, предусматривающему введение субъекту эффективного количества полимерконъюгированного димера полипептида неубластина. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения нейропатической боли у субъекта, предусматривающему введение субъекту фармацевтически эффективного количества либо только полимерконъюгированного димера полипептида неубластина, включающего, например, полипептиды неубластина дикого типа, усеченные или мутантные, в том числе, например,любой из SEQ ID NO:1, 2, 6-21 и 36 или его мутантную форму, либо введение субъекту также эффективного количества индуцирующего анальгезию соединения, выбранного из группы, состоящей из опиоидов, проти- 23008743 воаритмических средств, местнодействующих анальгетиков, местных анестетиков, противосудорожных средств, антидепрессантов, кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств (НПВС). В предпочтительном варианте осуществления индуцирующее анальгезию соединение является противосудорожным средством. В другом предпочтительном варианте осуществления индуцирующее анальгезию соединение является габапентином 1-аминометил)циклогексануксусной кислотой) или прегабалином (S-(+)-4 амино-3-(2-метилпропил)бутановой кислотой). Полипептиды неубластина и нуклеиновые кислоты по данному изобретению (и фармацевтические композиции, содержащие полимерконъюгированные димеры полипептида неубластина, описанные здесь) используются при лечении боли, связанной с периферическими нейропатиями. Среди периферических нейропатий, которые можно лечить согласно данному изобретению, находятся вызванные травмой нейропатии, например вызванные физическим повреждением или болезненным состоянием, физическим повреждением головного мозга, физическим повреждением спинного мозга, инсультом, связанным с повреждением мозга, и неврологическими расстройствами, связанными с нейродегенерацией. Изобретение также предусматривает лечение нейропатий, вызванных химиотерапией (таких как вызванных введением химиотерапевтических средств, например таксола или цисплатина); токсических нейропатий, лекарственных нейропатий, нейропатий, вызванных патогенами (например, вызванных вирусом), нейропатий, вызванных витаминной недостаточностью; идиопатических нейропатий и диабетических нейропатий. См., например, патенты США 5496804 и 5916555, каждый включен сюда путем ссылки. Более того, изобретение может использоваться для лечения мононейропатий, множественных мононейропатий и полинейропатий, включая аксональные и демиелинизирующие нейропатии, с использованием нуклеотидов и полипептидов неубластина по данному изобретению. Нейропатическая боль может быть связана со множеством периферических нейропатий, включая:(с) токсические нейропатий (включая, но не ограничиваясь ими, нейропатии, вызванные алкоголизмом, интоксикацией витамином В 6, гексакарбоновой интоксикацией, амиодароном, хлорамфениколом,дисульфирамом, изониазидом, золотом, литием, метронидазолом, мизонидазолом, нитрофурантоином);(d) вызванные лекарственным средством нейропатий, включая вызванную лекарственным препаратом нейропатическую боль (такую как вызванная противоопухолевыми средствами, особенно противоопухолевыми средствами, выбранными из группы, состоящей из таксола, таксотера, цисплатина, нокодазола, винкристина, виндезина и винбластина, и такую как вызванная противовирусными средствами, особенно противовирусными средствами, выбранными из группы, состоящей из ddl, DDC, d4T, фоскарнета,дапсона, метронидазола и изониазида);(е) нейропатии, вызванные витаминной недостаточностью (включая, но не ограничиваясь ими, недостаточность витамина В 12, недостаточность витамина В 6 и недостаточность витамина Е);(k) наследственную нейропатию (включая, но не ограничиваясь ими, атаксию Фридрейха, семейную амилоидную нейропатию, танджирскую болезнь, болезнь Фабри);(l) метаболические расстройства (включая, но не ограничиваясь ими, почечную недостаточность и гипотиреоз);(m) инфекционные и вирусные нейропатии (включая, но не ограничиваясь ими, нейропатическую боль, связанную с проказой, лаймскую болезнь, нейропатическую боль, связанную с инфекцией, вызванной вирусом, особенно вирусом, выбранным из группы, состоящей из вируса герпеса (например, опоясывающий герпес, который может вести к постгерпетической невралгии), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вируса папилломы);(n) аутоиммунные нейропатии (включая, но не ограничиваясь ими, синдром Гийена-Барре, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, моноклональную гаммапатию неясного значения и полинейропатию);(о) невралгию тройничного нерва и туннельные синдромы (включая, но не ограничиваясь им, запястный канал);(р) другие синдромы нейропатической боли, включая посттравматическую невралгию, фантомную боль в конечности, боль при множественном склерозе, сложные региональные болевые синдромы (включая, но не ограничиваясь ими, симпатическую рефлекторную дистрофию, каузальгию), боль, связанную с опухолью, васкулитную/ангиопатическую нейропатию и ишиалгию. Нейропатическая боль может проявляться как аллодиния, гиперальгезия, спонтанная боль или фантомная боль.- 24008743 2. Лечение тактильной аллодинии. Термин тактильная аллодиния обычно относится к состоянию субъекта, у которого боль вызвана стимулированием кожи (например, прикосновением), в норме безвредным. Настоящее изобретение относится к способу лечения тактильной аллодинии у субъекта. В некоторых вариантах осуществления тактильная аллодиния лечится введением субъекту фармацевтически эффективного количества только полимерконъюгированного димера мутантного полипептида неубластина. В связанном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения тактильной аллодинии у субъекта либо посредством введения субъекту эффективного количества только полимерконъюгированного димера полипептида неубластина, содержащего усеченные полипептиды дикого типа или мутантные полипептиды неубластина, включая, например, по меньшей мере один из SEQ ID NO:1, 2, 6-21 и 36 или его мутантную форму; либо посредством введения субъекту эффективного количества полипептида неубластина с эффективным количеством индуцирующего анальгезию соединения, выбранного из группы, состоящей из опиоидов, противоаритмических средств, местнодействующих анальгетиков, местных анестетиков, противосудорожных средств,антидепрессантов, кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств (НПВС). В предпочтительном варианте осуществления индуцирующее анальгезию соединение является противосудорожным средством. В другом предпочтительном варианте осуществления индуцирующее анальгезию соединение является габапентином 1-аминометил)циклогексануксусной кислотой) или прегабалином(S-(+)-4-амино-3-(2-метилпропил)бутановой кислотой). В некоторых вариантах осуществления полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина вводится в сочетании с лечебным средством, включая, но не ограничиваясь ими, противоопухолевое средство или противовирусное средство. Противоопухолевые средства включают, но не ограничиваются ими, таксол, таксотер, цисплатин, нокодазол, винкристин, виндезин и винбластин. Противовирусные средства включают, но не ограничиваются ими, ddl, DDC, d4T, фоскарнет, дапсон, метронидазол и изониазид. 3. Лечение для уменьшения потери болевой чувствительности. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу уменьшения потери болевой чувствительности у субъекта, пораженного нейропатией. В предпочтительном варианте осуществления нейропатия является диабетической. В предпочтительном варианте осуществления потеря болевой чувствительности является потерей тепловой болевой чувствительности. Настоящее изобретение рассматривает как профилактическое, так и терапевтическое лечение. При профилактическом лечении полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина вводится субъекту с повышенным риском развития потери болевой чувствительности; следовало бы ожидать, что такие субъекты будут субъектами с ранней стадией нейропатии. Лечение неубластином в таких обстоятельствах служило бы для превентивного лечения пациентов с повышенным риском. При терапевтическом лечении полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина вводится субъекту, который испытал потерю болевой чувствительности в результате поражения нейропатией; следовало бы ожидать, что такие субъекты будут субъектами с поздней стадией нейропатии. Лечение полимерконъюгированным димером мутантного полипептида неубластина в таких обстоятельствах служило бы для того, чтобы спасти соответствующую болевую чувствительность у субъекта. 4. Лечение вирусных инфекций и вирусных нейропатий. Рассмотрено профилактическое лечение инфекционных и вирусных нейропатий. Профилактическое лечение показано после определения вирусной инфекции и перед появлением нейропатической боли. Во время лечения полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина вводится, чтобы предотвратить появление нейропатической боли, включая, но не ограничиваясь ими, нейропатическую боль, связанную с проказой, лаймскую болезнь, нейропатическую боль, связанную с инфекцией, вызванной вирусом, особенно вирусом, выбранным из группы, состоящей из вируса герпеса (более конкретно,опоясывающего герпеса, который может вести к постгерпетической невралгии), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вируса папилломы). В альтернативном варианте осуществления полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина вводится, чтобы уменьшить тяжесть нейропатической боли, если бы она появилась. Симптомы острой вирусной инфекции часто включают появление сыпи. Другие симптомы включают, например, развитие постоянной боли в пораженной области тела, которая является обычным осложнением инфекции опоясывающего герпеса (опоясывающего лишая). Постгерпетическая невралгия может длиться в течение месяца или больше и может появиться спустя несколько месяцев после того,как любые подобные сыпи симптомы исчезли. 5. Лечение болезненной диабетической нейропатии. Рассмотрено профилактическое лечение болезненной диабетической нейропатии. Профилактическое лечение диабетических нейропатий следовало бы начинать после определения начального диагноза диабета или связанных с диабетом симптомов и перед началом нейропатической боли. Профилактическое лечение болезненной диабетической нейропатии может также начаться после определения того, что- 25008743 у субъекта повышен риск развития диабета или связанных с диабетом симптомов. В течение лечения полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина вводится, чтобы предотвратить появление нейропатической боли. В альтернативном варианте осуществления полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина вводится, чтобы уменьшить тяжесть нейропатической боли,которая уже появилась. 6. Заболевания нервной системы. В дальнейшем аспекте изобретение относится к способу лечения или предотвращения заболевания нервной системы у субъекта (такого как человек) путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полимерконъюгированного полипептида неубластина, композиции, содержащей полипептид неубластина или мутантный полипептид неубластина, связанный с полимером, или комплекс, который включает в себя стабильный водорастворимый конъюгированный полипептид неубластина, или комплекс мутантного полипептида неубластина, включающий полипептид неубластина или мутантный полипептид неубластина, связанный с полиалкиленовым остатком, таким как,например, ПЭГ. Заболевание нервной системы может быть заболеванием периферической нервной системы, такой как периферическая нейропатия или синдром нейропатической боли. Люди являются предпочтительными субъектами лечения. Полимерконъюгированный димер полипептида неубластина по изобретению пригоден для лечения дефекта нейрона, включая без ограничения пораженные и травмированные нейроны. Периферические нервы, которые испытали травму, включают, но не ограничиваются ими, нервы мозга или спинного мозга. Изобретательские полимерконъюгированные димеры полипептида неубластина пригодны для лечения нейродегенеративного заболевания, например, церебрального ишемического повреждения нейронов; нейропатии, например, периферической нейропатии, болезни Альцгеймера, болезни Гентингтона, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза (БАС). Такие димеры полипептида неубластина могут использоваться при лечении ухудшения памяти, связанного с деменцией. Дополнительные примеры состояний или заболеваний включают в себя заболевания периферической нервной системы, мозга или спинного мозга, так же как травматические нейропатии, вызванные химиотерапией нейропатии, токсические нейропатии, лекарственные нейропатии, вызванные витаминной недостаточностью нейропатии; идиопатические нейропатии; диабетические нейропатии, нейропатическую боль, связанную с токсическим повреждением нерва, повреждением нерва, вызванным патогеном, повреждением нерва, вызванным воспалением или нейродегенерацией. Изобретательский димер полипептида неубластина дополнительно пригоден для лечения нейропатической боли, для лечения тактильной аллодинии и для уменьшения потери болевой чувствительности,связанной с нейропатией. 7. Дозировка. Вышеупомянутые способы рассматривают введение субъекту, предпочтительно системное, композиции, содержащей димер полимерконъюгированного мутантного полипептида неубластина, который может быть или не быть усеченным, в дозировке от 0,01 до 1000 мкг/кг массы тела субъекта на дозу,предпочтительно от 1 до 100 мкг/кг массы тела субъекта на дозу, более предпочтительно от 1 до 30 мкг/кг массы тела субъекта на дозу, например от 3 до 10 мкг/кг массы тела субъекта на дозу. Терапевтически эффективные количества композиции по изобретению могут вводиться субъекту, нуждающемуся в этом, в режиме дозирования, который может быть уточнен специалистом в соответствующей области без неуместного экспериментирования. 8. Введение. Полипептидный димер, используемый в вышеупомянутых способах, может вводиться посредством любой пригодной системы введения и предпочтительно из группы, состоящей из внутривенного, внутримышечного, внутрилегочного, подкожного и внутрибрюшинного введения, наиболее предпочтительно внутримышечное, внутривенное или подкожное введение. Полипептид неубластина, используемый в вышеупомянутых способах, может также вводиться интратекально. Введение полимерконъюгированного димера полипептида неубластина может быть, например, системным или местным. Композиции включают в себя подходящие для парентерального, так же как для непарентерального введения, а конкретные способы введения включают оральное, ректальное, буккальное, местное, назальное, глазное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, трансдермальное, интратекальное, внутрисуставное, внутриартериальное, субарахноидальное, бронхиальное, лимфатическое,влагалищное и внутриматочное введение. Включены композиции, подходящие для аэрозольного и парентерального введения как местного, так и системного. Предпочтительными композициями являются подходящие для подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. 9. Режимы. В некоторых вариантах осуществления частота дозирования полипептидного димера по изобретению обеспечивает введение субъекту композиции три раза в неделю в течение двух недель. Для того чтобы оптимизировать терапевтическую эффективность, полимерконъюгированный димер мутантного полипептида неубластина сначала вводится в различных режимах дозирования. Разовая доза и режим- 26008743 зависят от факторов, которые включают в себя, например, вид иммунизированного млекопитающего, его иммунный статус, массу тела млекопитающего. Как правило, содержание белка в ткани контролируется с использованием соответствующих скрининговых проб как часть процедуры клинического испытания,например, чтобы определить эффективность данного режима лечения. Частота дозирования для полимерконъюгированного димера мутантного полипептида неубластина по данному изобретению находится в рамках опыта и клинического суждения врачей. Как правило, режим введения устанавливается клиническими испытаниями, которые могут установить оптимальные параметры введения. Однако практикующий врач может менять такие режимы введения в соответствии с возрастом, здоровьем, весом, полом и медицинским статусом субъекта. Частота дозирования также может разниться при остром и хроническом лечении нейропатии. Кроме того, частота дозирования может различаться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Изобретение далее иллюстрируется следующими неограничивающими примерами. Примеры Пример 1. Биодоступность неубластина с конъюгированным с ПЭГ N-концом. Было отмечено, что полученные из клеток СНО и Е. coli рекомбинантные неубластины быстро удаляются из кровотока, если их вводят внутривенно крысам. Белки были ниже порога обнаружения в сыворотке после подкожного введения. Для увеличения биодоступности неубластина были созданы конъюгированные с ПЭГ формы мутантного неубластина. Поскольку в последовательности неубластина отсутствует лизин, химизмы специфической конъюгации с ПЭГ аминов приведут к конъюгации с ПЭГ полипептида неубластина дикого типа в области Nконца. Таким образом, к каждому димеру неубластина должны прикрепиться два остатка ПЭГ. Соответственно формы ПЭГ были сначала непосредственно направлены на N-конец с использованием специфичных для аминов реакций. Удивительно, что конъюгация с ПЭГ экспрессируемого Е. coli неубластина дикого типа даже с прикреплением двух 20 кДа остатков ПЭГ незначительно улучшила время полужизни, указывая на то, что механизм, основанный на пути выведения, преодолел увеличение времени полужизни, которое, как ожидалось, будет достигнуто конъюгацией с ПЭГ. Пример 2. Создание конъюгированного с ПЭГ мутантного неубластина (N95K). Следующей исследовали биодоступность форм мутантного неубластина, конъюгированных с ПЭГ в области внутренних аминокислотных остатков. Ряд из четырех мутантов с заменами встречающихся в природе остатков в положениях 14, 39, 68 и 95, если их пронумеровать, как показано в SEQ ID NO:1, был разработан, чтобы вставить лизины в выбранные участки последовательности. Эти лизины создали бы альтернативные участки для прикрепления ПЭГ. Эти участки были выбраны с использованием кристаллической структуры GDNF (Nat. Struct. Biol. 1997, 4:435-8,) как основы, чтобы выявить поверхностные остатки. Исследование мутагенеза химеры персефин/неубластин (J. Biol. Chem. 2000, 275:3412-20,) было использовано, чтобы выявить функционально важные области структуры, которых нужно избегать. Для того чтобы экспрессировать ген неубластина дикого типа в Е. coli, были созданы сингены с более низким содержанием GC и предпочтительными Е. coli кодонами. Синген был клонирован в двух векторах, рЕТ 19b и pMJB164, производных от рЕТ 19b. В рЕТ 19b последовательность, кодирующая зрелую область неубластина (NBN113), связана непосредственно с инициирующим метионином. В pMJB164 зрелая область неубластина связана с гистидиновым тэгом (например, 10 гистидинов) и отделена от гистидинового свободного конца участком, расщепляемым энтерокиназой (SEQ ID NO:35 и 36). Инициирующий метионин предшествует гистидиновому тэгу.- 27008743 Таблица 5 Нуклеотид неубластина дикого типа и полипептидная последовательность, снабженные His-тэгом Две из мутаций (R39 и R68) служили целями в области, которая согласно распределению положительных зарядов на поверхности, может представлять собой участок связывания гепарина. Этот участок,вероятно, должен отвечать за быстрое выведение белка. Третий участок служил целью в N95 и являлся природным участком гликозилирования в неубластине дикого типа. В естественных условиях этот участок модифицируется сложной углеводной структурой, поэтому ожидалось, что модификация посредством ПЭГ на этом участке не будет воздействовать на функцию. Четвертый участок (R14) был выбран в области, которая не затрагивалась ни одной из модификаций. Мутант, в котором остаток аспарагина в положении 95 был заменен лизином (N95K мутант), был выбран для исследований, раскрытых здесь. Были получены четыре различных мутантных крысиных неубластина, включающих одно или большее количество изменений в последовательности полипептида крысиного неубластина дикого типа. Данные мутантные неубластины содержали замены единственной аминокислоты: R14K; R68K; R39K или N95K. В табл. 1 А эти иллюстративные точечные мутации выделены полужирным шрифтом. В"X1N1X2" номенклатуре X1 относится к аминокислоте полипептида неубластина дикого типа, N1 относится к числовому положению аминокислоты X1 в последовательности, пронумерованной согласноSEQ ID NO:1, и Х 2 относится к аминокислоте, замещающей аминокислоту дикого типа в указанном числовом положении N1. Для создания мутации крысиного N95K неубластина был выполнен сайт-направленный мутагенез на рСМВ 020, плазмиде, кодирующей крысиный неубластин дикого типа. Последовательность нуклеотидов крысиного неубластина дикого типа и аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого таким образом, представлены ниже. Мутагенез рСМ 020 с использованием олигонуклеотидов KD3-210 и KD3-211 привел к формированию плазмиды рСМВ 027: В рСМВ 027 кодон, кодирующий аспарагин в положении 95, был замещен кодоном, кодирующим лизин. Мутантный неубластин R14K был сформирован путем замены кодона, кодирующего аргинин в положении 14, на кодон, кодирующий лизин в кодирующей неубластин последовательности рСМВ 020. Сайт-направленный мутагенез был выполнен на рСМВ 020 с использованием олигонуклеотидов KD3-254 и KD3-255: Результирующий конструкт получил название рСМВ 029. Мутантный неубластин R68K был сформирован путем замены кодона, кодирующего аргинин в положении 68, на кодон, кодирующий лизин в кодирующей неубластин последовательности рСМВ 020. Сайт-направленный мутагенез был выполнен на рСМВ 020 с использованием олигонуклеотидов KD3-258 и KD3-259: Результирующий конструкт получил название рСМВ 030. Мутантный неубластин R39K был сформирован путем замены аргинина в положении 39 на лизин в кодирующей неубластин последовательности рСМВ 020. Сайт-направленный мутагенез был выполнен на рСМВ 020 с использованием олигонуклеотидов KD3-256 и KD3-257: Экспрессия и определение параметров мутантного неубластина в Е. coli Для экспрессии и очистки плазмида кодирующая полипептид крысиного неубластина N95K была экспрессирована в Е. coli в виде слитого белка, снабженного His-тэгом, с участком, расщепляемым энтерокиназой, вплотную прилегающим к началу последовательности зрелого неубластина из 113 аминокислот. Е. coli выращивали в 500-литровом ферменторе и готовили замороженную клеточную пасту. Клетки Е. coli лизировали в APV Gaulin Press и крысиный неубластин N95K выделяли из нерастворимой отмытой шаровой фракции. Мутантный неубластин N95K извлекали из шара гидрохлоридом гуанидина, подвергали рефолдингу и His-тэг удаляли энтерокиназой (см. пример 5). Продукт затем подвергали хроматографии наNi-NTA агарозе (Qiagen) и на катионообменной смоле Bakerbond WP СВХ.- 29008743 Обработка энтерокиназой продукта, содержащего His-тэг, привела к аберрантному расщеплению белка по аргинину 7 в зрелой последовательности. Результирующий дез 1-7 продукт неубластина(NBN106-N95K) был полностью активным в KIRA ELISA и структурно не отличим от зрелой формы по своей восприимчивости к индуцированной гуанидином денатурации и поэтому использовался для последующей работы. Крысиный мутантный неубластин NBN106-N95K конъюгировали с ПЭГ в среднем остатками 3,3 ПЭГ на молекулу неубластина с использованием в качестве реагента метоксилполи(этиленгликоль)сукцинимидилпропионата (SPA-PEG) с молекулярной массой 10000 Да. Полученный в результате конъюгированный с ПЭГ продукт подвергали обширному определению параметров, включая анализ посредством SDS-PAGE, эксклюзионную хроматографию с исключением по размеру молекулы (SEC), ВЭЖХ с обращенной фазой, матриксную масс-спектрометрию с лазерной десорбцией и ионизацией пробы(MALD/IMS), картирование пептида, оценку активности в KIRA ELISA и определение содержания эндотоксина. Чистота продукта неубластина N95K до конъюгации с ПЭГ, измеренная путем SDS-PAGE иSEC, была больше 95%. Продукт неубластина N95K мигрировал при невосстанавливающих условиях как димер, что согласовалось с его предсказанной структурой. После конъюгации с ПЭГ конечный продукт состоял из ряда модифицированных продуктов присоединения, включая 2 ПЭГ на молекулу, который составлял 5% продукта, 3 ПЭГ на молекулу, который составлял 60% продукта, 4 ПЭГ на молекулу, который составлял 30% продукта, и нескольких неосновных форм с более высокой массой. В конъюгированной с ПЭГ пробе не было никаких признаков агрегатов. Остаточные уровни немодифицированного неубластина в продукте были ниже пределов количественного анализа. Содержание эндотоксина в материале обычно было менее чем 1 EU/мг. Специфическая активность конъюгированного с ПЭГ неубластина вKIRA ELISA составляла 10 нМ. Из конъюгированного с ПЭГ продукта был приготовлен препарат на PBS рН 6,5 с концентрацией 1,1 мг/мл. Материал, схожий по активности с неубластином дикого типа(NBN113), может поставляться в виде замороженной жидкости, которая хранится при -70 С. Мутантные полипептиды неубластина R14K, R39K и R68K были экспрессированы в Е. coli и могут быть подвергнуты тем же методам очистки, конъюгации с ПЭГ и оценки функции, которые описаны выше для неубластина NBN106-N95K. Получение мутантного конъюгированного с ПЭГ неубластина NBN106-N95K 230 мл подвергнутого рефолдингу крысиного мутантного неубластина N95K (2,6 мг/мл), который был продуцирован Е. coli и хранился при 4 С в 5 мМ фосфате натрия с рН 6,5, 100 мМ NaCl, растворяли в 77 мл воды, 14,4 мл 1 М HEPES с рН 7,5 и 2,8 г ПЭГ SPA с 10000 Да (конечная 10 мг/мл) (ShearwaterPolymers, Inc). Пробу инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч в темноте, затем обрабатывали 5 мМ имидазолом (конечная), фильтровали и хранили в течение ночи при 4 С. Было произведено две партии продукта, одна содержала 130 мл объема N95K, вторая - 100 мл объема. Конъюгированный с ПЭГ неубластин очищали от реакционной смеси на Fractogel EMD SO3- (М) (ЕМ Industries). Колонку запускали при комнатной температуре. Все буферы готовили без пирогенов. Хлорид натрия добавляли к реакционной смеси до конечной концентрации 87 мМ и пробу загружали в 45-миллилитровую колонку(внутренний диаметр 5 см) с Fractogel. Колонку промывали одним объемом колонки 5 мМ фосфатом натрия с рН 6,5, 80 мМ NaCl, затем трехкратными одному объему колонки аликвотами 5 мМ фосфата натрия, содержащими 50 мМ NaCl. Смолу переносили в колонку диаметром 2,5 см и конъюгированный с ПЭГ неубластин элюировали из колонки за шесть 10-миллилитровых стадий, содержащих 5 мМ фосфат натрия с рН 6,5, 400 мМ NaCl,три стадии, содержащие 500 мМ NaCl, и шесть стадий, содержащих 600 мМ NaCl. Фракции элюирования анализировали на содержание белка по спектральной поглощательной способности при 280 нм и затем по степени модификации с помощью SDS-PAGE. Выбранные фракции объединяли, фильтровали через 0,2 мкм фильтр и разбавляли водой до 1,1 мг конъюгированного с ПЭГ крысиного неубластина на 1 мл. После оценки уровней эндотоксина в отдельных партиях их объединяли и повторно фильтровали через 0,2 мкм мембрану. Из конечного материала отбирали аликвотные пробы, которые хранили при -70 С. УФ-спектр очищенного мутантного конъюгированного с ПЭГ неубластина NBN106-N95K УФ-спектр (240-340 нм) конъюгированного с ПЭГ NBN106-N95K получали на чистой пробе. Пробу анализировали трижды. Конъюгированная с ПЭГ проба показала максимум спектральной поглощательной способности при 275-277 нм и минимум спектральной поглощательной способности при 247-249 нм. Этот результат согласовался с тем, что наблюдалось в основной части промежуточного соединения. Концентрацию белка конъюгированного с ПЭГ продукта оценивали по спектру с использованием коэффициента экстинкции 2800,1%=0,50. Концентрация белка в основной части конъюгированного с ПЭГ неубластина составляла 1,1 мг/мл. Мутность пробы отсутствовала, что явствует из отсутствия поглощения при 320 нм. Определение параметров мутантного конъюгированного с ПЭГ неубластина NBN106-N95K с помощью SDS-PAGE Аликвоты конъюгированного с ПЭГ неубластина, содержащие 3; 1,5; 0,75 и 0,3 мкг продукта, подвергали SDS-PAGE на 4-20% градиентном геле (Owl). Гель был окрашен Кумасси бриллиантовым синимR-250. Параллельно были запущены маркеры молекулярной массы (GIBGO-BRL).