Выделенный полинуклеотид (варианты), содержащий его вектор и клетка-хозяин, кодируемый им полипептид рецептора nogo, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов (варианты),выделенное антитело и фармацевтическая композиция на их основе

008480 Область изобретения Изобретение относится к новым человеческим и мышиным генам, которые кодируют белок рецептора Nogo, причем данный рецептор способен регулировать рост аксонов. Данные гены рецептора Nogo избирательно экспрессируются в аксонах и дендритах нейронов в центральной нервной системе во время роста аксонов. Изобретение также относится к композициям, с помощью которых можно осуществлять избирательную блокаду опосредованного рецептором Nogo ингибирования роста аксонов путем блокирования взаимодействия Nogo с рецептором Nogo, вызывая последующее повышение роста аксонов. Предпосылки изобретения Аксоны и дендриты нейронов представляют длинные клеточные отростки нейронов. На дистальном конце растущего аксона или нейрита расположен специализированный регион, известный как конус роста. Конусы роста ответственны за чувствительность к местному окружению и движению в направлении клетки-мишени нейрона. Конусы роста имеют форму руки, с некоторым количеством тонких филоподий,которые по-разному прилипают к поверхностям эмбриона. Конусы роста могут быть чувствительны к некоторым направительным сигналам, например к поверхностной адгезивности, факторам роста, нейротрансмиттерам и электрическим полям. Направление роста конуса зависит от различных классов молекул адгезии, межклеточных сигналов, так же, как от факторов, которые стимулируют и ингибируют конусы роста. Конус роста, находящийся на конце растущего нейрита, продвигается с различными скоростями, но обычно со скоростью 1 или 2 мм в день. Конус состоит из широких и плоских отростков с многочисленными длинными микрошипиками или филоподиями, которые простираются как шипы. Данные филоподии постоянно активны. В то время, как некоторые филоподии возвращаются назад к конусу роста, другие продолжают удлиняться сквозь субстрат. Продолжения между несколькими филоподиями образуют ламеллиподий. Конус роста может обследовать область, которая лежит впереди его и по каждую сторону от его ламеллиподий и филоподий. Когда отросток входит в контакт с поверхностью, которая неблагоприятна,он отклоняется. Когда отросток входит в контакт с благоприятной поверхностью, он продолжает расти и может регулировать движение конуса роста в данном направлении. Следовательно, конус роста может направляться малыми вариациями поверхностных свойств субстратов. Когда конус роста достигает подходящей клетки-мишени, возникает синаптическое соединение. В центральной нервной системе (ЦНС) поврежденные нейроны не регенерируют после повреждения, вызванного травмой или заболеванием. Отсутствие регенерации аксонов после повреждения может объясняться наличием ингибиторов роста аксонов. Данные ингибиторы преимущественно ассоциированы с миелином и представляют важный барьер для регенерации. Ингибиторы роста аксонов присутствуют в миелине, выделенном из ЦНС, и плазматической мембране олигодендроцитов, которые синтезируют миелин в ЦНС (Schwab et al., (1993) Ann. Rev. Neurosci. 16, 565-595). Миелин ЦНС представляет собой сложное продолжение клеточной мембраны олигодендроцитов. Один олигодендроцит миелинизирует целых тридцать аксонных сегментов ЦНС. Отростки мембраны олигодендроцита обвертываются вокруг аксонов концентрическим способом с образованием миелинового слоя. Плотно компактизованный зрелый миелин состоит из параллельных слоев бимолекулярных липидов, чередующихся слоями гидратированного белка. Активный синтез миелина начинается in utero и продолжается в первые 2 года жизни человека. Медленный синтез продолжается в течение детства и подросткового возраста, и кругооборот зрелого миелина продолжается с более низкой скоростью в течение жизни взрослого. Как развивающиеся, так и зрелые формы миелина чувствительны к повреждению вследствие болезни или физической травмы, что приводит к деградации миелина, окружающего аксоны. Оказывается, что миелинассоциированные ингибиторы вносят первичный вклад в невозможность регенерации аксонов ЦНС in vivo после прерывания целостности аксона, в то время, как другие, не ассоциированные с миелином ингибиторы роста аксонов в ЦНС могут играть меньшую роль. Данные ингибиторы блокируют регенерацию аксонов после повреждения нейронов вследствие травмы, инсульта или вирусной инфекции. Было охарактеризовано много происходящих из миелина ингибиторов роста аксонов (см. для обзора David et al., (1999) WO 995394547; Bandman et al., (1999) патент США 5858708; Schwab, (1996)Neurochem. Res. 21,755-761). Также описаны некоторые компоненты белого вещества ЦНС, NI35, NI250(Nogo) и миелинассоциированный гликопротеин (MAG), которые обладают ингибиторной активностью в отношении распространения аксонов (Schwab et al., (1990) WO 9005191; Schwab et al., (1997) патент США 5684133). В частности, Nogo представляет 250 кДа миелинассоциированный ингибитор роста аксонов, который был клонирован и охарактеризован (Nagase et al., (1998) DNA Res. 5, 355-364; Schwab,(1990) Exp. Neurol. 109,2-5). кДНК Nogo вначале идентифицировали путем случайного анализа кДНК головного мозга и не придавали ему предполагаемой функции (Nagase et al., (1998) DNA Res. 5, 355-364). Шваб с коллегами опубликовали последовательность шести пептидов, случайным образом выделенных из продукта протеолитического расщепления предполагаемого бычьего белка NI250 (Nogo)(Spillmann et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 19283-19293). Вероятная полноразмерная последовательность кДНК данного белка в настоящее время хранится в GenBank. Данный клон кДНК человека размером 4,1 тыс. пар оснований, KIAA0886, был получен при попытке Kazusa DNA Research Institute секвенировать выде-1 008480 ленную из головного мозга кДНК большой молекулярной массы (Nagase et al., (1998) DNA Res. 31, 355364). Данный новый клон кДНК кодирует 135 кДа белок, который включает все шесть пептидных последовательностей, происходящих из бычьего Nogo. Последовательность человеческого Nogo-A проявляет высокую степень гомологии по отношению к карбоксиконцевой трети белков семейства ретикулона (Rtn). Rtn1 также был назван нейроэндокринным специфичным белком (NSP), поскольку он экспрессируется исключительно в нейроэндокринных клетках(Van de Velde et al., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Bсe белки Rtn обладают регионом длиной 200 аминокислотных остатков со сходством последовательности с карбоксильным концом данного белка (Van deBiophys. Acta 1450, 68-76). Родственные последовательности были обнаружены в геномах мухи и червя(Moreira et al., (1999) Genomics 58, 73-81). Данный регион обладает приблизительно 70% идентичностью по семейству Rtn. Аминоконцевые регионы не являются родственными один другому и происходят вследствие различных событий альтернативного сплайсинга РНК. В результате анализа последовательностей, хранящихся в GenBank, и по гомологии с опубликованными изоформами Rtn были предсказаны три формы белка Nogo (Nogo-A, Nogo-B, Nogo-C). Nogo-B массой 37 кДа, возможно, может соответствовать NI35, и этим объясняется антигенное сходство ингибиторной активности в отношении разрастания аксонов NI35 и NI250 (Nogo-A). Nogo-B-Myc при SDSPAGE проявляет электрофоретическую подвижность, соответствующую 25 кДа, и был описан ранее какRtn4 или vp2015. Способность белка Nogo-A ингибировать регенерацию аксонов выявлена лишь недавноNature 403, 483-484). Отсутствие в ЦНС повторного роста аксонов через очаг повреждения после травмы считалось причиной стойких неблагоприятных эффектов, ассоциированных с травмой, инсультом и демиелинизирующими нарушениями. Модуляция NI250 описана как средство лечения путем регенерации нейронов, поврежденных травмой, инсультом или дегенеративными нарушениями ЦНС (Schwab et al., (1994) WO 9417831; Tatagiba et al., (1997) Neurosurgery 40, 541-546), так же, как и злокачественными опухолями в ЦНС, такими как глиобластома (Schwab et al., (1993) патент США 5250414; Schwab et al., (2000) патент США 6025333). Имеются сообщения о том, что антитела, которые распознают NI250, могут использоваться для диагностики и лечения повреждения нервов в результате травмы, инфекции и дегенеративных нарушений в ЦНС (SchnellSchwab, (1990) Nature 343, 269-272; Schwab et al., (1997) патент США 5684133). В аксонах, которые становятся миелинизированными, имеет место корреляция между развитием миелина и появлением Nogo. После того, как Nogo блокируется антителами, нейроны снова могут прорастать через очаги разрушения, вызванного повреждением нерва (Varga et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,10959-10963). Механизм действия, посредством которого Nogo ингибирует рост аксонов, еще не выяснен. Идентификация и характеристика данного механизма действия и биохимических путей, ассоциированных с эффектами Nogo, могли бы использоваться для лечения болезненных состояний, ассоциированных с повреждением аксонов и демиелинизацией аксонов. Сущность изобретения Настоящее изобретение основано на открытии белков рецептора Nogo, уменьшающих опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, и относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, которые их кодируют. Так, вариант изобретения относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид рецептора NOGO, по меньшей мере на 80, 90 и 95% идентичный полипептиду, содержащему аминокислоты 1-348 SEQ ID NO: 2 человека или SEQ ID NO: 4 мыши, или кодирующему полипептид, содержащий аминокислоты 1-348 SEQ ID NO: 2 человека или SEQ ID NO: 4 мыши. Вариант изобретения относится также к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует растворимый фрагмент полипептида рецептора Nogo, содержащий по меньшей мере 50, 60 или 70 смежных аминокислот 1-348 из SEQ ID NO: 2 человека или SEQ ID NO: 4 мыши. Вариант изобретения относится также к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида рецептора Nogo (NgR), содержащий область LRRNT NgR, области LRRNgR и область LRRCT NgR в пределах аминокислот 1-309 SEQ ID NO: 2 человека или SEQ ID NO: 4 мыши. Вариант представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид рецептораNOGO, содержащий аминокислоты 1-348 SEQ ID NO: 2 человека или SEQ ID NO: 4 мыши, слитый с гетерологичным полипептидом. Настоящее изобретение далее относится к указанной выше выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид рецептора NOGO, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, функционально связанной с одним или несколькими элементами контроля экспрессии, включая векторы, в состав которых входят изолированные молекулы нуклеиновой кислоты.-2 008480 Изобретение далее относится к клеткам-хозяевам, трансформированным таким образом, что они содержат молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, и получаемым белкам по способам, включающим культивирование клетки-хозяина, трансформированной молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению при условиях, в которых экспрессируется данный белок. Настоящее изобретение включает изолированный полипептид, выбранный из группы, состоящей из изолированного полипептида, включающего фрагмент по меньшей мере из 50, 60 или 70 смежных аминокислот из последовательностей 1-348 SEQ ID NO: 2 человека, SEQ ID NO: 4 мыши; изолированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность 1-348 SEQ ID NO: 2 человека, SEQ IDNO: 4 мыши; включающую по меньшей мере 1, например, 5, 10, 15 или 20 консервативных аминокислотных замен; изолированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность 1-348SEQ ID NO: 2 человека, SEQ ID NO: 4 мыши, включающую по меньшей мере 1, например, 5, 10, 15 или 20 встречающихся в природе аминокислотных замен, то есть изолированного полипептида с идентичностью аминокислотной последовательности, равной по меньшей мере 80, 90 или 95% по отношению к 1348 SEQ ID NO: 2 человека, SEQ ID NO: 4 мыши. Изобретение также относится к выделенному фрагменту полипептида рецептора NOGO (NgR), содержащему область LRRNT NgR, области LRR NgR и область LRRCT NgR в пределах аминокислот 1309 SEQ ID NO: 2 человека или SEQ ID NO: 4 мыши. Изобретение также относится к химерным полипептидам, включающим аминокислотную последовательность 1-348 SEQ ID NO: 2 человека, SEQ ID NO: 4 мыши. Изобретение далее относится к антителам, которые связывают указанные выше белки рецептораNogo. Антитела могут быть моноклональными и поликлональными антителами. В дополнение, антитела могут быть гуманизированными. Изобретение также относится к антителам, которые проявляют антигенсвязывающую активность. Изобретение также относится к способу лечения нарушения центральной нервной системы млекопитающего, включающему стадию введения эффективного количества композиции, содержащей в качестве действующего начала указанный выше выделенный полинуклеотид, или указанную выше клеткухозяина, или указанный выше полипептид, или антитело, которые уменьшают опосредованное рецептором Nogo ингибирование роста аксонов. В некоторых осуществлениях нарушение центральной нервной системы является результатом черепной или церебральной травмы, повреждения спинного мозга, инсульта или демиелинизирующего заболевания. Примерами демиелинизирующих заболеваний являются рассеянный склероз, монофазная демиелинизация, энцефаломиелит, мультифокальная лейкоэнцефалопатия, панэнцефалит, болезнь Маркьяфава-Биньями (Marchiafava-Bignami), миелинолизис моста, адренолейкодистрофия, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (Pelizaeus-Merzbacher), спонгиозная дегенерация, болезнь Александра (Alexander), болезнь Канавана (Canavan), метахроматическая лейкодистрофия и болезнь Краббе (Krabbe). Описание фигур Фиг. 1 - сравнение доменов Nogo.(а) представляет собой схематичную диаграмму, которая суммирует свойства белка Nogo, использованные в данном исследовании. (b) представляет фотографию фибробластов NIH-3T3, культивированных на поверхностях, покрытых Amino-Nogo, GST-Nogo-66 или без белка, и окрашенных с выявлением актина филаментов (масштаб 40 мкм). (с) представляет фотографию куриных ганглиев дорзального корешка Е 12, культивированных на поверхностях, покрытых Amino-Nogo, GST-Nogo-66 или без белка (связанных с субстратом) или в присутствии 100 нМ белка Nogo (растворимого) (масштаб 40 мкм). (d) представляет фотографию геля и иммуноблота, где очищенный белок Amino-Nogo-Myc-His подвергали SDS-PAGE- и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым (СВВ) или выявляли иммуноблоттингом посредством антител против Мус (Мус) (маркеры молекулярной массы 200, 116, 97, 65 и 45 кДа находятся слева). (е) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где измеряли процент фибробластов 3 Т 3 с площадью более 1200 мкм 2 (покрытие) в экспериментах, проведенных по (b) на поверхностях, покрытыхAM+Myc, Amino-Nogo, преинкубированный с антителом против Мус; АМ+Мус+Мо, АМ+Мус, преинкубированные с антителом против мышиных IgG; Мус+Мо, антитело против Мус плюс антитело против мышиных IgG). (f) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где определяли процент покрытия клетками COS-7 после культивирования на поверхностях, покрытых Nogo, или с растворимыми 100 нМ препаратами Nogo. (g) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где эффекты очищенных препаратов GST-Nogo-66 или Amino-Nogo на морфологию конуса роста оценивали на культурах ганглиев дорзального корешка Е 12 в указанных концентрациях через 30 мин. В данном эксперименте было продемонстрировано, что при данном анализе GST-Nogo-66 действует в 2 раза более мощно по амплитуде, чем Amino-Nogo. (h) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где проводили количественную оценку разрастаний нейритов на клетку в культурах ганглиев дорзального корешка Е 13 в экспериментах, проведенных по (с) на поверхностях, покрытыхNogo или с растворимыми 100 нМ препаратами Nogo. (i) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где измеряли эффекты препаратов Nogo на разрастание нейритов в мозжечковых-3 008480 гранулярных нейронах. Фиг. 2 - фрагменты Nogo являются антагонистами действия Nogo и миелина ЦНС.(а) представляет собой фотографию отростков куриного ганглия дорзального корешка Е 12, которые культивировали, после чего оценивали коллапс конуса роста, как описано на фиг. 4. Культуры подвергали действию следующих препаратов в течение 30 мин до фиксации и окрашивания родамин-фаллоидином: только буфер (контроль); 15 нМ GST-Nogo (Nogo); Pep1, Pep2 и Рер 3 (Pep); 15 нМ GST-Nogo плюсPep1, Pep2 и Рер 3 по 1 мкМ каждого (Nogo + Pep). Заметьте, что коллапс конуса роста за счет Nogo блокировался добавлением пептидов. Pep1, остатки 1-25 внеклеточного домена; Рер 2, 11-35; и Рер 3, 21-45.(b) представляет график количественной оценки результатов анализа коллапса конуса роста по (а). Индивидуальные пептиды включали в концентрации 4 мкМ, а смесь пептидов 1-3 содержала по 1 мкМ каждого пептида. Миелин ЦНС получали, как описано, и указанные общие концентрации миелинового белка включали в культуры. Все результаты представляют собой средниестанд.ош.средн. (s.e.m.), рассчитанные на основе 4-7 измерений. Отмечены значения, значимо отличающиеся от соответствующих значений с теми же концентрациями Nogo или миелина, но без пептида (звездочка, р 0,05, двухсторонний t-тест Стьюдента). Фиг. 3 - антагонист Nogo Pep2-41.(а) представляет график, показывающий результаты анализа коллапса конуса роста на куриных ганглиях дорзального корешка Е 12. Данный анализ проводили и подвергали количественной оценке, как в GrandPre et al., (2000) Nature 403,439-444. Анализ проводили без добавления (контроль), с 15 нМ GSTNogo (Nogo) или 15 нМ GST-Nogo плюс 1 мкМ Рер 2-41 (Nogo-Pep). Значения представляют собой средниестанд.ош.средн. (s.e.m.), рассчитанные на основе четырех измерений. (b) представляет график, показывающий результаты по связыванию, где измеряли связывание 10 нМ AP-Nogo с нейронами куриных ганглиев дорзального корешка Е 12, как описано на фиг. 4, с добавлением указанных концентраций Рер 2-41. Фиг. 4 - Nogo Pep2-41 предотвращает ингибирование разрастания нейритов Nogo и миелином ЦНС. Данная фигура представляет собой график, на котором показаны результаты анализа разрастания,где нейроны культивировали в присутствии указанных концентраций Рер 2-41, очищенного белка GSTNogo (GST-Nogo-66) и грубого белка миелина ЦНС. Нейроны куриных ганглиев дорзального корешка Е 12 культивировали в стандартных условиях. Для анализа разрастания нейроны культивировали в присутствии указанных концентраций Рер 2-41, очищенного белка GST-Nogo (GST-Nogo-66) и грубого белка миелина ЦНС. Данный эксперимент продемонстрировал, что Рер 2-41 может обращать ингибирование разрастания нейритов за счет GST-Nogo или общего миелина ЦНС. Фиг. 5 - анализ связывания лиганда аксонными рецепторами Nogo.(а) представляет собой фотографию геля и иммуноблота, где белок His-AP-Nogo (66 аминокислот) экспрессировали в клетках НЕK293 Т и очищали от кондиционной среды на смоле, содержащей никель посредством гистидиновой метки. Очищенный белок подвергали SDS-PAGE и окрашивали общий белок СВВ или проводили иммуноблоттинг с использованием антител против Nogo (анти-Nogo). Слева показаны маркеры молекулярной массы 200, 116, 97, 65 и 45 кДа, а справа находится миграция AP-Nogo. (b) представляет собой фотографию диссоциированных нейронов куриного ганглия дорзального корешка Е 12,которые инкубировали с 10 нМ AP-Nogo или 10 нМ AP-Nogo + 160 нМ GST-Nogo в течение 60 мин при 23 С. Клетки отмывали, фиксировали и инкубировали при 60 С для инактивации эндогенного АР. Связанный Ap-Nogo выявляли путем инкубации с голубым нитротетразолием. Заметьте интенсивное окрашивание нейронов Ap-Nogo, которое отменяется введением немеченого лиганда. (с) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где оценивали эффективность AP-Nogo и GST-Nogo путем анализа коллапса конуса роста на куриных ганглиях дорзального корешка Е 12, как описано в разделе примеров. Определено, что ЕС 50 AP-Nogo составляет 1 нМ или меньше. Показаны средние значениястанд.ош.средн., рассчитанные для 5-8 измерений. (d) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где оценивали связывание AP-Nogo в концентрации 10 нМ с нейронами куриного ганглия дорзального корешка Е 12, или в присутствии 100 нМ GST-Nogo, или в присутствии 4 мкМ Рер 2,которое количественно анализировали по (b), способом, описанным в разделе примеров. Показаны средние значениястанд.ош.средн., рассчитанные для 8 измерений. (е) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где измеряли связывание AP-Nogo с нейронами ганглия дорзального корешка как функцию концентрации AP-Nogo. Приведен один из шести экспериментов со сходными результатами.(f) представляет график, суммирующий данные из (е), преобразованные для анализа Скетчарда. Очевидная Kd связывания Ap-Nogo с нейронами куриного ганглия дорзального корешка Е 12 составляет 3 нМ. Фиг. 6 - связывание Nogo с COS-7, экспрессирующими рецептор Nogo. Данная фигура представляет собой фотографию клеток COS-7, которые трансфицировали экспрессирующим вектором, кодирующим мышиный рецептор Nogo. Через 2 дня после трансфекции оценивали связывание Ap-Nogo или АР, как описано в разделе примеров для нейронов ганглия дорзального корешка. Отметьте избирательное связывание Nogo с клетками, экспрессирующими рецептор Nogo. Связывание сильно уменьшается в присутствии избытка пептида Nogo, не слитого с АР. Фиг. 7 - структура рецептора Nogo. Данная схематичная диаграмма иллюстрирует главные структурные черты рецептора Nogo.-4 008480 Фиг. 8 - распределение мРНК рецептора Nogo. Данная фигура представляет собой фотографию нозерн-блота мРНК рецептора Nogo для образцовpolyA+PHK из указанных тканей мыши слева и для образцов общей РНК из различных регионов головного мозга крысы справа. Слева показана миграция маркеров размера РНК. Фиг. 9 - иммуногистология рецептора Nogo-66.(а) представляет собой фотографию иммуноблота, где анализировали мембранную фракцию (10 мкг белка) из указанных клеток или тканей цыпленка путем иммуноблоттинга против рецептора Nogo-66(маркеры молекулярной массы в кДа находятся справа). (b) представляет собой фотографию клеток COS-7,экспрессирующих Мус-рецептор Nogo-66, или отростков куриного спинного мозга Е 5 (8 дней in vitro),окрашенных антителами против рецептора Nogo-66, против Мус или олигодендроцитспецифическими антителами O4. На нижних трех панелях показана иммуногистохимия той же области (масштаб 40 мкм для трех верхних панелей и 80 мкм для трех нижних панелей). (с) представляет собой фотографию фиксированных параформальдегидом вибратомных секций головного мозга или спинного мозга взрослого,окрашенных препаратом антител против рецептора Nogo-66. Данные результаты демонстрируют окрашивание профилей аксонов (стрелки) как в мосте, так и в спинном мозге. Окрашивание существенно снижается в присутствии 10 мкг/мл антигена-GST-рецептора Nogo-66. Фиг. 10 - рецептор Nogo-66 опосредует коллапс конуса роста, происходящий за счет Nogo-66.(а) представляет собой фотографию куриных отростков DRG Е 12, подвергавшихся действию Nogo-66 после предварительной обработки PI-PLC или буфером. Показано окрашивание F-актина в аксонах (масштаб 40 мкм). (b) представляет график, суммирующий экспериментальные результаты связывания 3 нМ АР или AP-Nogo с диссоциированными нейронами куриного ганглия дорзального корешка Е 12. Там, где это отмечено, культуры предварительно обрабатывали PI-PLC или включали 150 нМ GST-Nogo-66 в инкубационную среду с Ap-Nogo. (с) представляет график, суммирующий измерения коллапса конуса роста из экспериментов по (а). Культуры куриных DRG E12 обрабатывали PI-PLC или не делали этого перед воздействием 30 нМ GST-Nogo-66 или 100 пМ Sema3A. (d) представляет фотографию отростков клеток ганглия сетчатки Е 7, инфицированных контрольным вирусом (HSV-PlexinA1) или HSV-Мус-рецепторомNogo-66 и затем инкубированных с Nogo-66 или без него. Показано окрашивание фаллоидином конусов роста аксонов (масштаб 25 мкм). (е) представляет график с количественной оценкой коллапса конусов роста неинфицированных или инфицированных вирусом нейронов сетчатки Е 17 по (d). Фиг. 11 - структурно-функциональный анализ рецептора Nogo-66.(а) представляет схематичную диаграмму различных мутантов с делецией рецептора Nogo-66. В данных мутантах оценивали уровень экспрессии путем иммуноблоттинга и связывание AP-Nogo. Заметьте,что богатые лейцином повторы и богатый лейциновыми повторами С-конец требуются для связыванияNogo, но оставшаяся часть белка не требуется. Второй белок тестировали после очистки и иммунизации.(b) представляет диаграмму с предсказанной трехмерной структурой первых семи богатых лейцином повторов рецептора Nogo-66. Данный результат выведен при компьютерном моделировании, основанном на предсказанной структуре сходных богатых лейцином повторов рецептора лейтропина (Jiang et al., (1995)Structure 3, 1341-1353). Моделирование проводили посредством Swiss-Model на www.expasy.ch/spdbv. Также отмечены регионы с бета-листовой и альфа-спиральной вторичной структурой. Фиг. 12 - растворимый рецептор Nogo блокирует Nogo-66. Нейроны куриных DRG E13 культивировали в стандартных условиях. При анализе коллапса конуса роста вместе с 100 нМ Nogo-66 добавляли кондиционированную среду от клеток НЕK293 Т, секретирующих фрагмент эктодомена мышиного рецептора Nogo длиной 1-348 аминокислот или контрольную кондиционированную среду. На нижней левой панели данные графика показывают, что индуцируемыйNogo коллапс блокируется растворимым фрагментом рецептора. Для анализа разрастания нейроны культивировали в присутствии контроля или кондиционированной среды с эктодоменом рецептора Nogo вместе с Nogo-66 (50 нМ) или миелином центральной нервной системы (13 мкг общего белка/мл). На четырех верхних панелях показаны фотографии, на которых продемонстрировано, что миелин центральной нервной системы ингибирует разрастание и что данный эффект блокируется присутствием белкаэктодомена рецептора Nogo. На графике на нижней правой панели показана количественная оценка разрастания. Подробное описание изобретенияI. Определения. Кроме определенных по-другому, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, под которыми они обычно понимаются обычным специалистом в области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в осуществлении и тестировании настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, что здесь описаны, описываются предпочтительные способы и материалы. Используемый здесь термин аксон относится к длинному клеточному выпячиванию нейрона, по которому от тела клетки к клеткам-мишеням проводятся эфферентные (исходящие) потенциалы действия. Используемый здесь термин рост аксонов относится к удлинению длинного отростка или аксона,начинающемуся от тела клетки и происходящему за счет конуса роста.-5 008480 Используемый здесь термин нарушение центральной нервной системы относится к любому патологическому состоянию, ассоциированному с ненормальной функцией центральной нервной системы(ЦНС). Термин включает в качестве неограничивающих примеров измененную функцию ЦНС, возникающую в результате физической травмы ткани головного мозга, вирусной инфекции, аутоиммунного механизма, генной мутации и нейродегенеративных заболеваний или нарушений. Используемый здесь термин химерный белок относится к любому полипептиду, который не полностью гомологичен на аминокислотном уровне его последовательности дикого типа или кодируется нуклеиновой кислотой, возникающей из соединения нуклеиновых кислот из двух разных источников. Термин включает в качестве неограничивающих примеров белки слияния и белки, сконструированные таким образом, что они содержат одну или несколько аминокислотных замен, за счет которых их аминокислотная последовательность отличается от последовательностей дикого типа. Используемый здесь термин демиелинизирующее заболевание относится к патологическому нарушению, характеризующемуся деградацией миелиновой оболочки клеточной мембраны олигодендроцитов. Используемый здесь термин конус роста относится к специализированному региону на кончике растущего нейрита, который отвечает за чувствительность к местному окружению и движение аксона по направлению к соответствующей ему синаптической клетке-мишени. Используемый здесь термин движение конуса роста относится к вытяжению или коллапсу конуса роста по направлению к клетке-мишени нейрона. Используемый здесь термин нейрит относится к отростку, растущему от нейрона. Так как в культуре иногда трудно отличить аксон от дендрита, термин нейрит используется для них обоих. Используемый здесь термин олигодендроцит относится к клетке нейроглии ЦНС, функцией которой является миелинизация аксонов ЦНС. Используемый здесь термин полипептид относится к пептиду, который при гидролизе дает более двух аминокислот, называемому трипептидами, тетрапептидами и т.д., согласно числу аминокислот, содержащихся в полипептиде. Термин полипептид используется по ходу спецификации в качестве синонима термину белок или пептид.II. Конкретные осуществления. А. Белок-рецептор Nogo и пептидные средства (агенты) для белка-рецептора Nogo. Настоящее изобретение относится к изолированному белку, аллельным вариантам белка и консервативным аминокислотным заменам в белке. Используемые здесь термины белок или полипептид относятся к белку-рецептору Nogo, который имеет аминокислотную последовательность человека, описанную SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность мыши, описанную SEQ ID NO: 4. Белок или полипептид также относится к пептидам, идентифицированным как пептидные агенты рецептора Nogo, которые имеют аминокислотные последовательности, описанные SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14,16, 18 и 20. Изобретение также включает встречающиеся в природе аллельные варианты и белки, которые имеют аминокислотную последовательность, слегка отличающую от тех, что специфично перечислены выше. Аллельные варианты, хотя обладают аминокислотной последовательностью, слегка отличающейся от тех, что специфично перечислены выше, тем не менее, имеют ту же или сходную биологическую функцию, ассоциированную с белками-рецепторами Nogo человека и мыши и пептидными агентами рецептора Nogo, описанными SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20. Используемый здесь термин семейство белков, родственных белкам-рецепторам Nogo, относится к белкам, которые выделены из организмов в дополнение к людям и мышам. Способы, используемые для идентификации и выделения других членов семейства белков, родственных белкам-рецепторам Nogo,описаны ниже. Белки и пептидные агенты - рецепторы Nogo - по настоящему изобретению находятся предпочтительно в изолированной форме. При использовании здесь белок или лиганд называют изолированным,когда для отделения белка от клеточных составляющих, которые в норме ассоциированы с белком, привлекают физические, механические и химические способы. Специалист в данной области может легко применить стандартные способы очистки для получения изолированного белка или лиганда. Белки по настоящему изобретению далее включают консервативные варианты белков и лигандов,описанных здесь. Используемый здесь термин консервативный вариант относится к изменениям в аминокислотной последовательности, которые не оказывают неблагоприятного влияния на биологические функции белка. Говорят, что замена, вставка или делеция неблагоприятно влияют на белок, когда у измененной последовательности предотвращена или нарушена функция, ассоциированная с белком. Например, общий заряд, структура или гидрофобно-гидрофильные свойства белка могут изменяться без неблагоприятного влияния на биологическую активность. Соответственно, аминокислотная последовательность может быть изменена, например, для приведения пептида в более гидрофобное или гидрофильное состояние, без неблагоприятного влияния на типы биологической активности белка. Обычно аллельные варианты, варианты с консервативными заменами и члены белкового семейства обладают аминокислотной последовательностью, имеющей по крайней мере 75%-ную идентичность последовательности с человеческими и мышиными последовательностями, заданными SEQ ID NO: 2, 4, 8,-6 008480 10, 12, 14, 16, 18 или 20, более предпочтительно по крайней мере 80%-ную, даже более предпочтительно по крайней мере 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность. Идентичность или гомология в отношении таких последовательностей определяется здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными таковым в известных пептидах после выравнивания последовательностей и, если необходимо, введения вставок для достижения максимальной процентной гомологии, и не считая любые консервативные замены частью идентичности последовательности. N-концевые, С-концевые или внутренние расширения, делеции или инсерции в пептидной последовательности считаются не влияющими на гомологию. Таким образом, белки и пептиды по настоящему изобретению включают молекулы, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20, их фрагменты, имеющие последовательность из следующих друг за другом по крайней мере 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более аминокислотных остатков белков и пептидных агентов - рецепторов Nogo; варианты аминокислотной последовательности таких последовательностей, где по крайней мере один аминокислотный остаток вставлен с N- или С-конца, или внутри описанных последовательностей: варианты аминокислотной последовательности таких последовательностей или их фрагменты, как определено выше, которые замещены другим остатком. Рассмотренные варианты далее включают те, что содержат предварительно определенные мутации, полученные, например, путем гомологичной рекомбинации, сайт-специфического или ПЦР-мутагенеза, и соответствующие белки других видов животных, включая в качестве неограничивающих примеров кроличьи, крысиные, свиные, бычьи, овечьи, лошадиные белки и белки видов приматов, кроме человека, аллели или другие встречающиеся в природе варианты семейства белков; и производные, где белок был ковалентно модифицирован путем замещения химическими, ферментными или другими подходящими средствами группой, отличной от встречающихся в природе аминокислот (например, детектируемой группой, такой как фермент или радиоизотоп). Как описано ниже, члены семейства белков могут использоваться: (1) для идентификации средств,которые модулируют по крайней мере один тип активности белков; (2) для способов идентификации связывающих партнеров белка; (3) в качестве антигена для получения поликлональных и моноклональных антител и (4) в качестве терапевтического средства. В. Молекулы нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение далее относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки и пептиды, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20, и описанные здесь родственные белки, предпочтительно в изолированной форме. Используемый здесь термин нуклеиновая кислота включает геномную ДНК, кДНК, мРНК и антисмысловые молекулы, так же, как нуклеиновые кислоты, основанные на альтернативных скелетах или включающие альтернативные основания, выделенные из природных источников или синтезированные. Гомологию или идентичность определяли посредством анализа BLAST (Basic Local Alignmenttblastx (Karlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268 and Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36,290-300, полностью включено в качестве ссылок), которые предназначены для поиска сходства последовательностей. Подход, использованный программой BLAST, представляет собой, во-первых, распознавание сходных сегментов между запрашиваемой последовательностью и последовательностью из базы данных, затем оценку статистической значимости всех совпадающих пар, которые были идентифицированы, и, наконец, суммирование только тех совпадающих пар, которые удовлетворяют предварительно выбранному уровню значимости. Для обсуждения основных вопросов поиска сходства в базах данных последовательностей см. Altschul et al., (1994) Nature Genetics 6, 119-129, которое полностью включено в качестве ссылки. Параметры поиска histogram, descriptions, alignments, expect (т.е. уровень статистической значимости для сообщаемых совпадений по отношению к последовательностям базы данных), cutoff, matrix и filter совпадали с таковыми по умолчанию. Использованная по умолчанию матрица счета, использованная blastp, blastx, tblastn, и tblastx, представляла собой матрицу BLOSUM62(winkth) по запросу); и gapw=16 (устанавливает ширину окна, внутри которого генерируются выравнивания со вставками). Эквивалентные установки параметров Blastp составляли Q=9; R=2; wink=1; иgapw=32. Сравнение последовательностей посредством Bestfit, доступной в пакете GCG, версия 10.0,использует параметры для ДНК, составляющие GAP=50 (штраф за создание вставки) и LEN=3 (штраф за продолжение вставки), и эквивалентные параметры для сравнения белков равны GAP=8 и LEN=2. Используемый здесь термин условия высокой жесткости означает гибридизацию при 42 С в присутствии 50% формамида, с последующей первой отмывкой при 65 С 2xSSC, содержащим 1% SDS, с последующей второй промывкой при 65 С 0,1xSSC. При использовании здесь говорят, что молекула нуклеиновой кислоты является изолированной,когда молекула нуклеиновой кислоты, по существу, отделена от контаминантной нуклеиновой кислоты,кодирующей другие полипептиды из источника нуклеиновой кислоты.-7 008480 Настоящее изобретение далее относится к фрагментам кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин фрагмент кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты относится к части целой последовательности, кодирующей белок. Размер фрагмента определяется предназначенным способом применения. Например, если фрагмент выбран таким образом, что он должен кодировать активную часть белка, необходимо, чтобы фрагмент был достаточно большим для кодирования функционального региона(-ов) белка. Если фрагмент подлежит использованию в качестве зонда нуклеиновой кислоты или праймера для ПЦР, тогда выбирают длину фрагмента так, чтобы получить относительно малое количество ложноположительных результатов во время зондирования/использования праймера. Фрагменты кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (т.е. синтетические олигонуклеотиды), которые используются в качестве зондов или специфических праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для синтеза генных последовательностей, кодирующих белки по изобретению, могут быть легко синтезированы посредством химических технологий, например фосфотриэфирным способом по Matteucci et al., (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191, или с использованием способов автоматического синтеза. Кроме того, большие сегменты ДНК могут быть легко получены хорошо известными способами, такими как синтез группы олигонуклеотидов, которые определяют различные модульные сегменты гена, с последующим лигированием олигонуклеотидов для построения полного модифицированного гена. Кодирующие молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут далее быть модифицированы так, что они будут содержать детектируемую метку для целей диагностики и зондирования. Такие разнообразные метки известны в данной области и могут легко задействоваться с описанными здесь кодирующими молекулами. Подходящие метки включают в качестве неограничивающих примеров биотин, радиоактивно меченные нуклеотиды и т.п. Специалист в данной области может применить любую из известных в данной области меток для получения меченой кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Модификации самой первичной структуры путем делеции, дополнения или изменения аминокислот, входящих в состав белковой последовательности во время трансляции, могут проводиться без нарушения активности белка. Такие замены или другие изменения приводят к появлению белков, обладающих аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеиновой кислотой, попадающих в предполагаемые рамки настоящего изобретения. С. Выделение других родственных молекул нуклеиновой кислоты. Как описано выше, идентификация молекулы нуклеиновой кислоты человека, обладающей SEQ IDNO: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19, позволяет специалисту в данной области выделять молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют другие члены семейства белков-рецепторов Nogo в дополнение к описанным здесь последовательностям. Далее, описанные в настоящее время молекулы нуклеиновой кислоты позволяют специалисту в данной области выделять молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют другие члены семейства белков-рецепторов Nogo и пептидные агенты. По существу, специалист в данной области может легко использовать аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 или их содержащие эпитопы фрагменты для получения зондов-антител для скрининга экспрессионных библиотек, полученных из подходящих клеток. Поликлональные антитела из таких млекопитающих, как кролики, иммунизированные очищенным белком(как описано ниже), или моноклональные антитела обычно могут применяться для зондирования кДНК млекопитающих или геномных экспрессионных библиотек, таких как библиотека лямбда gt.ll, для получения подходящей кодирующей последовательности других членов семейства белков. Клонированная последовательность кДНК может экспрессироваться в качестве белка слияния, экспрессироваться непосредственно с использованием его собственных последовательностей контроля или экспрессироваться посредством конструкций, использующих последовательности контроля конкретного хозяина, использованного для экспрессии фермента. Альтернативно, часть описанной здесь кодирующей последовательности может синтезироваться и применяться в качестве зонда для обнаружения ДНК, кодирующей член белкового семейства, в любом организме млекопитающего. Олигомеры, содержащие, например, примерно 18-20 нуклеотидов (кодирующие отрезок примерно в 6-7 аминокислот), могут быть получены и использованы для скрининга геномной ДНК или библиотек кДНК с получением гибридизации в жестких условиях или условиях с жесткостью, достаточной для элиминации недолжного уровня ложноположительных результатов. Кроме того, могут быть получены пары олигонуклеотидных праймеров для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью селективного клонирования кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Цикл ПЦР денатурация/отжиг/удлинение для применения таких праймеров ПЦР хорошо известен в данной области и может быть легко адаптирован для применения с целью выделения других кодирующих молекул нуклеиновой кислоты.D. Молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение далее относится к молекулам рекомбинантной ДНК (рДНК), которые содержат кодирующую последовательность. Используемый здесь термин рДНК представляет молекулу ДНК, которая подвергалась молекулярным манипуляциям. Способы получения молекул рДНК хорошо-8 008480 известны в данной области, например см. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press. В предпочтительных молекулах рДНК кодирующая последовательность ДНК функционально связана с последовательностями контроля экспрессии и векторными последовательностями. Выбор векторных последовательностей и последовательностей контроля экспрессии, с которыми функционально связывается одна из последовательностей, кодирующих белок белкового семейства по настоящему изобретению, зависит, как хорошо известно в данной области, непосредственно от требуемых функциональных свойств (например, экспрессии белка и клетки-хозяина, подлежащей трансформации). Вектор по настоящему изобретению может быть, по крайней мере, способным направлять репликацию или вставку в хромосому хозяина структурного гена, входящего в состав молекулы рДНК, и предпочтительно также его экспрессию. Элементы контроля экспрессии, которые используются для регуляции экспрессии функционально связанной последовательности, кодирующей белок, известны в данной области и включают в качестве неограничивающих примеров индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, секреторные сигналы и другие регуляторные элементы. Предпочтительно индуцируемый промотор легко контролируется, как отвечающий на наличие питательного вещества в среде для клетки-хозяина. В одном из осуществлений вектор, содержащий кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты,включает прокариотический репликон, т.е. последовательность ДНК, обладающую способностью к направлению автономной репликации и поддержанию молекулы рекомбинантной ДНК внехромосомно в прокариотической клетке-хозяине, такой как прокариотическая клетка-хозяин, транформированной ею. Такие репликоны хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, которые включают прокариотический репликон, могут также включать ген, экспрессия которого предоставляет детектируемый маркер, такой как лекарственная устойчивость. Обычными генами бактериальной лекарственной устойчивости являются те, что предоставляют устойчивость к ампициллину или тетрациклину. Векторы, которые включают прокариотический репликон, могут далее включать прокариотический промотор или промотор бактериофага, способный направлять экспрессию (транскрипцию и трансляцию) кодирующих генных последовательностей в бактериальной клетке-хозяине, такой как Е. coli. Промотор представляет собой элемент контроля экспрессии, образованный последовательностью ДНК, которая обеспечивает связывание РНК-полимеразы и то, что транскрипция происходит. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно обеспечиваются в плазмидных векторах,содержащих удобные сайты рестрикции для вставки сегмента ДНК по настоящему изобретению. Примерами таких векторных плазмид являются pUC8, pUC9, pBR322 и pBR329 (Biorad Laboratories), pPL и рKK223 (Pharmacia). Любой подходящий прокариотический хозяин может использоваться для экспрессии молекулы рекомбинантной ДНК, кодирующей белок по изобретению. Экспрессирующие векторы, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно те, что совместимы с клетками позвоночных, также могут использоваться для получения молекул рДНК, которые содержат кодирующие последовательности. Экпрессирующие векторы эукариотических клеток хорошо известны в данной области и доступны из некоторых коммерческих источников. Обычно такие векторы предоставляются с содержанием удобных сайтов рестрикции для вставки требуемого сегмента ДНК. Примерами таких векторов являютсяpSVL и pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDTl (ATCC 31255) и подобные эукариотические экспрессирующие векторы. Экспрессирующие векторы эукариотических клеток, использованные для конструирования молекул рДНК по настоящему изобретению, могут далее включать избирательный маркер, который эффективен в эукариотической клетке, предпочтительно селективный маркер лекарственной устойчивости. Предпочтительный маркер лекарственной устойчивости представляет собой ген, экспрессия которого приводит к устойчивости к неомицину, например ген неомицинфосфотрансферазы (neo) (Southern et al., (1982) J.Mol. Anal. Genet. 1, 327-341). Альтернативно, селективный маркер может присутствовать в отдельной плазмиде, два вектора могут вводиться путем совместной трансфекции в клетку-хозяина, и трансфицированные клетки отбираются путем культивирования с подходящим лекарственным средством в качестве селективного маркера. Е. Клетки-хозяева, содержащие введенную извне кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение далее относится к клеткам-хозяевам, трансформированным молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Эукариотические клетки, которые могут использоваться для экспрессии белка по изобретению, не ограничиваются при условии того, что клеточная линия совместима со способами клеточной культуры и совместима с воспроизведением экспрессирующего вектора и экспрессией генного продукта. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в качестве неограничивающих примеров клетки дрожжей, насекомых и млекопитающих предпочтительно клетки позвоночных, такие как клеточные линии мыши, крысы, обезьяны или человека. Примеры применимых эукариотических клеток-хозяев включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), доступные от АТСС как CCL61, клетки мышиного эм-9 008480 бриона NIH Swiss NIH-3T3, доступные от АТСС как CRL1658, клетки почки новорожденного хомячка(ВНК) и подобные клеточные линии культур эукариотических тканей. Трансформация подходящих клеток-хозяев молекулой рДНК по настоящему изобретению выполняется хорошо известными способами, которые обычно зависят от типа использованного вектора и задействованной системы хозяина. В отношении трансформации прокариотической клетки-хозяина могут применяться способы электропорации и солевой обработки (см., например, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cohen et al., (1972) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 69, 2110-2114). В отношении трансформации клеток позвоночных векторами, содержащими рДНК, могут применяться способы электропорации, обработки катионными липидами и солевой обработки (см., например, Graham et al., (1973) Virology 52, 456-467; Wigler et al., (1979) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 76, 1373-1376). Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат молекулу рДНК по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, включающими отбор при помощи селективного маркера. Например, клетки, полученные в результате введения рДНК по настоящему изобретению, могут быть клонированы с получением единичных колоний. Клетки из данных колоний могут отбираться, лизироваться, и содержание их ДНК может проверяться на предмет наличия рДНК с использованием способа, такого как описанный Southern, (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517, или белки, продуцированные клетками, могут анализироваться иммунологическим способом.F. Продукция рекомбинантных белков с использованием молекулы рДНК. Настоящее изобретение далее относится к способам продукции белка по изобретению с использованием описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты. В общих терминах продукция рекомбинантной формы белка обычно включает следующие стадии. Вначале получают молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок по изобретению, такой как молекула нуклеиновой кислоты, описанная SEQ ID NO: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19 или нуклеотидами 166-1584 SEQ ID NO: 1 и нуклеотидами 178-1596 SEQ ID NO: 3. Если кодированная последовательность не прерывается интронами, то она непосредственно подходит для экспрессии в любом хозяине. Тогда молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно помещается в функциональной связи с подходящими последовательностями контроля, как описано выше, для получения экспрессионной единицы, содержащей открытую рамку считывания белка. Экспрессионную единицу используют для трансформации подходящего хозяина, а трансформированный хозяин культивируют в условиях, обеспечивающих продукцию рекомбинантного белка. Необязательно, рекомбинантный белок выделяют из среды или из клеток; выделение или очистка белка может в некоторых случаях, когда примеси допустимы, не понадобиться. Каждая из указанных выше стадий может быть осуществлена множеством способов. Например, желаемые кодирующие последовательности могут быть получены из фрагментов генома и непосредственно использованы в подходящих хозяевах. Конструирование экспрессирующих векторов, функциональных во множестве хозяев, осуществляют, используя подходящие репликоны и контрольные последовательности, приведенные выше. Контрольные последовательности, экспрессирующие векторы и способы трансформации, зависят от типа клетки-хозяина, применяемой для экспрессии гена, и подробно обсуждались выше. Подходящие сайты рестрикции, если таковые отсутствуют исходно, могут быть добавлены на концы кодирующей последовательности для обеспечения встраивания вырезаемого гена в данные векторы. Квалифицированный специалист может с легкостью приспособить известные в данной области хозяин/экспрессирующую систему для использования с молекулами нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению для продукции рекомбинантного белка.G. Способы идентификации партнеров связывания. Настоящее изобретение относится к способам использования белков по настоящему изобретению для выделения и идентификации партнеров связывания. В некоторых осуществлениях белок по настоящему изобретению смешивают с потенциальным партнером связывания или экстрактом или фракцией клетки в условиях, обеспечивающих связывание потенциальных партнеров связывания с белком по настоящему изобретению. После смешивания пептиды, полипептиды, белки и другие молекулы, связавшиеся с белком по настоящему изобретению, выделяют из смеси. Партнер связывания, связавшийся с белком по настоящему изобретению, может быть затем отделен и подвергнут дополнительному анализу. Для идентификации и выделения партнера связывания может быть применен полноразмерный белок,например полноразмерный белок рецептора Nogo SEQ ID NO: 2 или 4 либо полноразмерный белок NogoSEQ ID NO: 6. Альтернативно, может быть использован фрагмент белка. Примером применимого фрагмента белка рецептора Nogo является растворимый полипептид рецептора Nogo, не содержащий трансмембранного домена (фиг. 7). Используемый здесь термин клеточный экстракт относится к препарату или фракции, которые получены из лизированных или разрушенных клеток. Предпочтительным источником клеточных экстрактов являются клетки, выделенные из ткани человеческого головного или спинного мозга, например ткани головного мозга человека. Альтернативно, клеточные экстракты могут быть получены из любого- 10008480 источника нервной ткани или доступных линий нервных клеток, в частности клеточных линий, происходящих от олигодендроцитов. Для получения экстракта клетки могут использоваться разнообразные способы. Клетки могут быть разрушены с использованием физических или химических способов разрушения. Примеры физических способов разрушения включают в качестве неограниченных примеров обработку ультразвуком и механическим сдвигом. Примеры химических способов лизиса включают в качестве неограниченных примеров лизис детергентами и ферментативный лизис. Специалист в данной области может легко адаптировать способы подготовки клеточных экстрактов для получения экстрактов для применения по настоящим способам. Как только получают экстракт клетки, экстракт смешивают с белком по изобретению при условиях,в которых может происходить ассоциация белка со связывающими партнерами. Могут использоваться разнообразные условия, причем наиболее предпочтительными являются условия, которые приближаются к условиям, обнаруженным в цитоплазме клетки человека. Такие свойства, как осмолярность, рН, температура и концентрация используемого клеточного экстракта, могут варьировать для оптимизации ассоциации белка со связывающим партнером. После смешивания в подходящих условиях связанный комплекс отделяют от смеси. Для разделения смеси могут задействоваться различные способы. Например, для иммунопреципитации комплекса со связывающим партнером могут использоваться антитела, специфичные по отношению к белку по изобретению. Альтернативно, могут применяться стандартные способы химического разделения, такие как хроматография и седиментационное центрифугирование в градиенте плотности. После удаления неассоциированных клеточных составляющих, находящихся в экстракте, связывающий партнер может диссоциироваться из комплекса с использованием общепринятых способов. Например, диссоциацию могут осуществлять путем изменения концентрации соли или рН смеси. Для облегчения разделения ассоциированных пар связывающих партнеров в смешанном экстракте белок по изобретению может иммобилизироваться на твердой основе. Например, белок может привязываться к нитроцеллюлозному матриксу или акриловым гранулам. Идентифицированные связывающие партнеры могут представлять собой как отдельный белок, так и комплекс, состоящий из двух или более белков. Альтернативно, связывающие партнеры могут идентифицироваться с использованием анализа на основе слияния с щелочной фосфатазой согласно процедурам по FlanaganVanderhaeghen, (1998) Annu.Rev. Neurosci. 21, 309-345 или Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69; путем Дальневосточного (FarWestern) анализа согласно процедурам по Takayama et al., (1997) Methods Mol. Biol. 69, 171-184 илиSauder et al., J. Gen. Virol. (1996) 77, 991-996, или идентифицироваться путем применения меченных эпитопом белков или белков слияния с GST. Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут использоваться в дрожжевой двухгибридной системе. Дрожжевая двухгибридная система была использована для идентификации других пар белковых партнеров и может быть легко адаптирована для привлечения описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты (см. двухгибридную систему Stratagene Hybrizap). Н. Способы идентификации средств, модулирующих экспрессию. Настоящее изобретение относится к способам идентификации средств, модулирующих экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-рецептор Nogo. Настоящее изобретение также относится к способам идентификации средств, модулирующих экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белокNogo. Такие способы анализа могут задействовать любые доступные средства мониторинга изменений уровня экспрессии нуклеиновых кислот по изобретению. При использовании здесь о средстве говорят как о модулирующем экспрессию нуклеиновой кислоты по изобретению, например нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6, если он способен регулировать повышение или снижение экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. В одном из форматов анализа могут быть получены клеточные линии, которые содержат слияния с геном-репортером открытой рамки считывания, заданной нуклеотидами 166-1584 из SEQ ID NO: 1, или нуклеотидами 178-1596 из SEQ ID NO: 3, или нуклеотидами 135-3713 из SEQ ID NO: 5, и любой анализируемый партнер для слияния. Многие анализируемые партнеры для слияния известны и легкодоступны, включая ген люциферазы светляка и ген, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу (Alam etal., (1990) Anal. Biochem. 188, 245-254). Клеточные линии, содержащие гены-репортеры, затем подвергаются действию средства, подлежащего тестированию, в подходящих условиях и в течение подходящего времени. Различие в уровне экспрессии гена-репортера между образцами, подвергшимися действию средства, и контрольными образцами приводит к идентификации средства, которое модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6. Дополнительные форматы анализа могут использоваться для мониторинга способности средства модулировать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-рецептор Nogo по изобретению,такой как белок, обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или 4, или белокNogo, обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6. Например, экспрессия мРНК может отслеживаться непосредственно путем гибридизации с нуклеиновой кислотой по изобретению. Клеточные линии подвергают действию средства, подлежащего тестированию, в подходящих условиях и- 11008480 в течение подходящего времени и выделяют общую РНК или мРНК путем стандартных процедур, таких как те, что описаны Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press. Зонды для детекции различий в уровне экспрессии РНК между клетками, подвергшимися действию средства, и контрольными клетками могут быть получены из нуклеиновой кислоты по изобретению. Предпочтительным, но не необходимым, является конструирование зондов, которые гибридизуются только с целевой нуклеиновой кислотой в условиях высокой жесткости. Только высококомплементарные продукты гибридизации нуклеиновых кислот образуются в условиях высокой жесткости. Соответственно, жесткость условий анализа определяет степень комплементарности, которая должна существовать между двумя цепями нуклеиновой кислоты для образования гибридной молекулы. Жесткость должна выбираться так, чтобы максимизировать различие в стабильности продукта гибридизации зонд - мишень и потенциального продукта гибридизации зонд - участок, не являющийся мишенью. Зонды могут конструироваться из нуклеиновых кислот по изобретению способами, известными в данной области. Например, содержание G+C в зонде и длина зонда могут влиять на связывание зонда с его целевой последовательностью. Способы оптимизации специфичности зонда обычно доступны поSambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, или по Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing. Условия гибридизации модифицируют с использованием известных способов, таких как те, что описаны Sambrook et al., (1989) или Ausubel et al., (1995), как это требуется для каждого зонда. Гибридизацию общей клеточной РНК или РНК с обогащенной фракцией polyA-PHК можно осуществлять в любом доступном формате. Например, общую клеточную РНК или РНК с обогащенной фракциейpolyA+PHК можно зафиксировать на твердой основе и подвергать твердую основу воздействию по крайней мере одного зонда, включающего по крайней мере одну или часть одной из последовательностей по изобретению, при условиях, в которых будет происходить специфическая гибридизация зонда. Альтернативно, фрагменты нуклеиновой кислоты, включающие по крайней мере одну или часть одной из последовательностей по изобретению, могут фиксироваться на твердой основе, такой как пластина на основе силикона или пластина пористого стекла. Пластина затем может подвергаться воздействию общей клеточной РНК или РНК с обогащенной фракцией polyA+PHК из образца в условиях, в которых будет происходить специфическая гибридизация зафиксированной последовательности. Такие пластины и способы гибридизации широко доступны, например те, что описаны Beattie, (1995) WO 9511755. Средства, которые регулируют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-рецептор Nogo,обладающий последовательностью SEQ ID NO: 2 или 4, путем повышения или снижения экспрессии,идентифицируют путем оценки способности данного зонда к специфической гибридизации с образцом РНК из необработанной популяции клеток и из популяции клеток, подвергшихся воздействию средства. Гибридизация с целью качественного или количественного анализа мРНК также может проводиться с использованием анализа защиты от РНКаз (т.е. RPA, см. Ma et al., Methods (1996) 10, 273-238). В кратком изложении экспрессионный носитель, содержащий кДНК, кодирующую генный продукт и промотор для фагоспецифической ДНК-зависимой РНК-полимеразы (например, РНК-полимеразы Т 7, Т 3 или SP6), линеаризуют с 3'-конца молекулы кДНК, ниже фагового промотора, где такая линеаризованная молекула впоследствии используется в качестве шаблона для синтеза меченого антисмыслового транскрипта кДНК путем транскрипции in vitro. Меченый транскрипт затем подвергают гибридизации со смесью изолированной РНК (т.е. общей или фракционированной мРНК) путем инкубации при 45 С в течение ночи в буфере, содержащем 80% формамид, 40 мМ Pipes, рН 6,4, 0,4 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Полученные в результате продукты гибридизации затем расщепляли в буфере, содержащем 40 мкг/мл рибонуклеазы А и 2 мкг/мл рибонуклеазы. После дезактивации и экстракции избыточного белка образцы загружали в полиакриламидный гель с мочевиной для анализа. В другом формате анализа средств, которые воздействуют на экспрессию конкретного генного продукта, вначале идентифицируют клетки или клеточные линии, которые экспрессируют указанные генные продукты физиологически. Ожидается, что клетки и клеточные линии, идентифицированные таким образом, должны включать необходимый клеточный аппарат, так что будет достигаться правильная модуляция транскрипционного аппарата при экзогенном контакте средства с подходящими механизмами трансдукции с поверхности и цитозольными каскадами. Далее, такие клетки или клеточные линии должны подвергаться трансдукции или трансфекции экспрессирующей несущей конструкцией (например, плазмидой или вирусным вектором), включающей дееспособный нетранслируемый 5'-промотор, содержащей конец структурного гена, кодирующего конкретный генный продукт, слитый с одним или несколькими антигенными фрагментами, являющимися специфическими для конкретных генных продуктов, где указанные фрагменты находятся под транскрипционным контролем указанного промотора и экспрессируются в качестве полипептидов, молекулярная масса которых может отличаться от встречающихся в природе полипептидов и может, кроме того, включать иммунологически отличную метку. Такой способ хорошо известен в данной области (см. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press). Клетки или клеточные линии, трансдуцированные или трансфицированные, как описано выше, за- 12008480 тем должны контактировать со средствами в подходящих условиях; например, средство включает фармацевтически приемлемый наполнитель и контактирует с клетками в водном физиологическом буфере,таком как фосфатно-солевой буфер (PBS) при физиологическом значении рН, сбалансированный солевой раствор Игла (Eagles; BSS) при физиологическом значении рН, PBS или BSS, включающие сыворотку,или кондиционированные среды, включающие PBS или BSS и сыворотку, с инкубацией при 37 С. Солевые условия могут модулироваться так, как сочтет нужным специалист в данной области. После контакта клеток со средством указанные клетки разрушают и фракционируют полипептиды из продукта разрушения таким образом, что белковую фракцию объединяют и подвергают контакту с антителом, что далее подлежит иммунологическому анализу (например, ELISA, иммунопреципитация или вестерн-блот). Совокупность белков, выделенных из образца, контактировавшего со средством, сравнивают с контрольным образцом, где с клетками контактировал только наполнитель, и повышение или снижение иммунологически генерированного сигнала образца, контактировавшего с средством, по сравнению с контрольным образцом используют для характеристики эффективности средства.I. Способы идентификации средств, которые модулируют активность. Настоящее изобретение относится к способам идентификации средств, которые модулируют по крайней мере один тип активности белка-рецептора Nogo. Изобретение также относится к способам идентификации средств, которые модулируют по крайней мере один тип активности белка Nogo. Такие способы анализа могут задействовать любые средства мониторинга или детекции требуемой активности. В одном из форматов может анализироваться специфическая активность белка-рецептора Nogo или белка Nogo, нормализованная относительно стандартной единицы, в сравнении между клеточной популяцией, подвергшейся воздействию средства, подлежащего тестированию, и не подвергавшейся воздействию контрольной клеточной популяцией. Клеточные линии или популяции подвергаются воздействию средства, подлежащего тестированию, в подходящих условиях и в течение подходящего времени. Из подвергшейся воздействию клеточной линии или популяции и контрольной, не подвергавшейся воздействию клеточной линии или популяции могут быть получены клеточные лизаты. Затем клеточные лизаты анализируют посредством зонда. Зонды на основе антител могут быть получены путем иммунизации подходящих хозяев-млекопитающих при задействовании подходящих протоколов иммунизации, с использованием белка-рецептораNogo, белка Nogo, пептидных агентов рецептора Nogo или антигенсодержащих фрагментов любого из перечисленных. Для усиления иммуногенности данные белки или фрагменты могут конъюгироваться с подходящими носителями. Способы получения иммуногенных конъюгатов с такими носителями, какBSA, KLH, или другими носителями хорошо известны в данной области. В некоторых обстоятельствах может быть эффективным прямое конъюгирование с использованием, например, карбодиимидных реагентов; в других случаях может быть желательным применение связывающих реагентов, таких как поставляемые Pierce Chemical Co., для обеспечения доступности гаптена. Гаптенные пептиды могут быть продолжены с N- или С-конца цистеиновым остатком или иметь в промежутках цистеиновые остатки,например, для облегчения связывания носителя. Введение иммуногенов проводится, главным образом,путем инъекции через подходящий период времени и с использованием подходящих адъювантов, как, в основном, принято в данной области. Во время выполнения регламента иммунизации анализируют титры антител для определения адекватности образования антител. Хотя поликлональные антитела, получаемые таким образом, могут быть удовлетворительными для некоторых применений, для фармацевтических композиций предпочтительным является использование моноклональных препаратов. Линии иммортализованных клеток, которые секретируют требуемые моноклональные антитела, могут быть получены с использованием стандартных способов, см., например,KohlerMilstein, (1992) Biotechnology 24, 524-526, или модификаций, которые действуют за счет иммортализации лимфоцитов или клеток селезенки, как широко известно. Линии иммортализованных клеток, секретирующие требуемые антитела, могут подвергаться скринингу путем иммунологического анализа, в котором антиген представляет собой пептидный гаптен, полипептид или белок. Когда идентифицируют подходящую культуру иммортализованных клеток, секретирующую требуемое антитело, клетки могут культивироваться in vitro или путем продукции асцитной жидкости. Требуемые моноклональные антитела могут извлекаться из культурального супернатанта или из асцитного супернатанта. Интактные антитела против Nogo или рецептора Nogo или их фрагментов, содержащих иммунологически значимую часть, могут применяться, например, в качестве антагонистов связывания Nogo (лиганда) с рецептором Nogo. Применение иммунологически реактивных фрагментов,таких как фрагменты Fab, Fab' из F(ab')2, часто является предпочтительным, особенно в контексте терапии, поскольку данные фрагменты обычно менее иммуногенны, чем целый иммуноглобулин. Антитела или фрагменты могут также продуцироваться с использованием современной технологии рекомбинантными средствами. Регионы антитела, которые специфично связываются с требуемыми регионами белка, могут также продуцироваться в контексте химер с многовидовым происхождением. Регионы антитела, которые специфично связываются с требуемыми регионами белка, могут также продуцироваться в контексте химер с многовидовым происхождением, например гуманизированные антитела. Поэтому антитело может быть гуманизированным антителом или человеческим антителом, как- 13008480 описано в патенте США 5585089 или Riechmann et al., (1988) 332, 323-327. Средства, которые анализируют вышеуказанным способом, могут быть выбраны случайным образом или выбраны или сконструированы рационально. При использовании здесь о средстве говорят как о случайным образом выбранном, когда средство выбирают случайно без рассмотрения специфических последовательностей, вовлеченных в ассоциацию одного белка по изобретению или с ассоциированными с ним субстратами, связывающими партнерами и т.д. Примером случайно выбранных средств является применение химической библиотеки, или пептидной комбинаторной библиотеки, или питательного бульона организма. При использовании здесь о средстве говорят как о выбранном или сконструированном рационально, когда средство выбирают на неслучайной основе, беря в расчет последовательность сайта-мишени или его конформацию в связи с действием средства. Средства могут рационально выбираться или рационально конструироваться путем привлечения белковых последовательностей, которые составляют данные сайты. Например, рационально выбранное пептидное средство может представлять собой пептид,последовательность которого идентична связывающему домену (SEQ ID NO: 20) Nogo, который взаимодействует с рецептором Nogo. Альтернативно, это может быть фрагмент связывающего домена, например SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Средства по настоящему изобретению могут представлять собой, например, пептиды, антитела,фрагменты антител, малые молекулы, производные витаминов, а также углеводы. Пептидные средства по изобретению могут быть получены с использованием стандартных способов твердофазного (или в растворимой фазе) пептидного синтеза, как это известно в данной области. Кроме того, ДНК, кодирующая данные пептиды, может синтезироваться с использованием коммерчески доступного оборудования олигонуклеотидного синтеза и быть получена рекомбинантно с использованием стандартных систем рекомбинантной продукции. Продукция с использованием твердофазного пептидного синтеза является необходимой, если надлежит включить некодируемые генетически аминокислоты. Другим классом средств по настоящему изобретению являются антитела или их фрагменты, которые связываются с белком Nogo или белком-рецептором Nogo. Средства на основе антител могут быть получены путем иммунизации подходящих субъектов-млекопитающих пептидами, содержащими антигенные регионы, причем данные части белка предназначены быть мишенями для антител.J. Высокопроизводительные способы анализа. Мощность высокопроизводительного скрининга используется для поиска новых соединений, которые способны взаимодействовать с белком-рецептором Nogo. Для общей информации по высокопроизводительному скринингу (например, Devlin, (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; патент США 5763263). Высокопроизводительные способы анализа включают один или несколько разных технологий анализа. Иммунодиагностика и иммунологические способы анализа. Иммунодиагностика и иммунологические способы анализа представляют собой группу способов,используемых для измерения специфичных биохимических веществ, обычно в низких концентрациях в сложных смесях, таких как биологические жидкости, которые зависят от специфичности и высокой аффинности, проявляемой подходящим образом полученными и выбранными антителами по отношению к комплементарным им антигенам. Вещество, подлежащее измерению, обязательно должно быть антигенным, или в виде иммуногенной макромолекулы, или гаптенной малой молекулы. К каждому образцу добавляют известное ограниченное количество специфичного антитела, и оценивается связавшаяся с ним доля антигена, часто выражаемая в виде отношения связанный:свободный, с использованием индикатора формы антигена, меченного радиоизотопом (радиоиммунный анализ), флуоресцентной молекулы (иммунофлуоресцентный анализ), стабильного свободного радикала (спиновый иммунологический анализ),фермента (иммуноферментный анализ) или другой легко различимой метки. Антитела могут быть мечены различными способами, включая сорбционный иммуноферментный анализ (ELISA); радиоиммунный анализ (RIA); иммунофлуоресцентный анализ (FIA); иммунохемилюминесцентный анализ (CLIA); и мечение антитела частицами коллоидного золота (immunogold). Обычные форматы анализа включают сэндвич-анализ, конкурентный анализ или анализ конкуренции, анализ агглютинации латекса, гомогенный анализ, формат планшетов для микротирования и анализ,основанный на микрочастицах. Сорбционный иммуноферментный анализ (ELISA).ELISA представляет собой иммунохимический способ, который избегает опасности радиоактивных химикатов и дороговизны флуоресцентных систем детекции. Вместо этого, в анализе используются в качестве индикаторов ферменты. ELISA представляет собой форму количественного иммунологического анализа, основанного на применении антител (или антигенов), связанных с поверхностью нерастворимого носителя, который затем используется для захвата относящегося к делу антигена (или антитела) в растворе тестирования. Затем комплекс антиген-антитело детектируется путем измерения активности соответствующего фермента, который предварительно был ковалентно привязан к антигену (или антителу). Для информации по способам ELISA см., например, Crowther, (1995) ELISA - Theory and PracticeBiochemistry and Molecular Biology) Elsevier. Колориметрические способы анализа ферментов. Колориметрия является тем способом количественного химического анализа, в котором концентрация или количество соединения определяется путем сравнения окраски, продуцируемой реакцией реагента со стандартными и тестируемыми количествами соединения с использованием, например, колориметра или спектрофотометра. Стандартные колориметрические способы анализа бета-галактозидазной ферментной активности хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Norton et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5,281-290). Колориметрический анализ может проводиться на цельноклеточных лизатах с использованием О-нитрофенил-бета-D-галактопиранозида (ONPG, Sigma) в качестве субстрата в стандартном колориметрическом бета-галактозидазном анализе (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press). Также доступны способы автоматического колориметрического анализа для детекции бета-галактозидазной активности (см., например, патент США 5733720). Иммунофлуоресцентные способы анализа. Иммунофлуоресценция или иммунофлуоресцентная микроскопия является способом, в котором антиген или антитело делают флуоресцентным путем конъюгирования с флуоресцентной меткой и затем им позволяют прореагировать с комплементарным антителом или антигеном на срезе или мазке ткани. Локализация антигена или антитела затем может определяться наблюдением флуоресценции путем микроскопии в ультрафиолетовом свете. Для общей информации по иммунофлуоресцентным способам см., например, Knapp et al., (1978)Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press. Для детального объяснения иммунофлуоресцентных способов, которые могут применяться по настоящему изобретению, см. патент США 5912176; патент США 5869264; патент США 5866319; и патент США 5861259.K. Применение средств, модулирующих активность. Как описано в примерах, белки и нуклеиновые кислоты Nogo и рецептора Nogo, такие как белки,обладающие аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6, экспрессируются в миелине,происходящем из аксона и дендритов. Средства, которые модулируют или регулируют повышение или снижение экспрессии Nogo или белка-рецептора Nogo, или средства, такие как агонисты или антагонисты по крайней мере одного типа активности Nogo или белка-рецептора Nogo, могут использоваться для модулирования биологических и патологических процессов, ассоциированных с функцией и активностью белков. Изобретение, в частности, может использоваться для лечения людей. Патологические процессы относятся к биологическим процессам, которые имеют вредоносный эффект. Например, экспрессия белка по изобретению может быть ассоциирована с ингибированием регенерации аксонов после черепной, церебральной или спинальной травмы, инсульта или демиелинизирующего заболевания. Такие демиелинизирующие заболевания включают в качестве неограниченных примеров рассеянный склероз, монофазную демиелинизацию, энцефаломиелит, мультифокальную лейкоэнцефалопатию, панэнцефалит, болезнь Маркьяфава-Биньями (Marchiafava-Bignami), миелинолизис моста,адренолейкодистрофию, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (Pelizaeus-Merzbacher), спонгиозную дегенерацию, болезнь Александра (Alexander), болезнь Канавана (Canavan), метахроматическую лейкодистрофию и болезнь Краббе (Krabbe). При использовании здесь о средстве говорят как о модулирующем патологический процесс, когда средство снижает степень или тяжесть процесса. Например, может предотвращаться демиелинизирующее заболевание или модулироваться прогрессирование заболевания путем введения средств, которые снижают, способствуют или модулируют некоторым образом экспрессию по крайней мере одного типа активности белка по изобретению. В одном из примеров введение пептидных средств (агентов) на основе Nogo, показанных SEQ IDNO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20, может применяться для лечения демиелинизирующего заболевания, ассоциированного с Nogo и белком-рецептором Nogo. В другом примере клетки, которые экспрессируют пептидные средства по изобретению, могут трансплантироваться в место повреждения спинного мозга для облегчения роста аксонов через поврежденный участок. Такие трансплантированные клетки представляют собой средство для восстановления функции спинного мозга после повреждения или травмы. Еще в одном примере введение растворимого белка-рецептора Nogo, который связывается с Nogo,может использоваться для лечения демиелинизирующего заболевания, ассоциированного с Nogo или с белком-рецептором Nogo. Данное средство может использоваться для предотвращения связывания Nogo со связанным с клеткой рецептором Nogo и действует как антагонист Nogo. Растворимые рецепторы использовали для связывания цитокинов и других лигандов для регуляции их функции (Thomson, (1998)Cytokine Handbook, Academic Press). Растворимый рецептор оказывается в растворе или вне мембраны. Растворимые рецепторы могут возникать в результате отсутствия сегмента молекулы, который пронизы- 15008480 вает или ассоциируется с мембраной. Данный сегмент обычно обозначается в данной области как трансмембранный домен гена или мембраносвязывающий сегмент белка. Таким образом, в некоторых осуществлениях изобретения растворимый фрагмент включает фрагмент или аналог мембраносвязанного рецептора. Предпочтительно фрагмент содержит по крайней мере 6, например 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 или 70 аминокислот, что обеспечивает поддержание его требуемой активности. В других осуществлениях изобретения модифицируют структуру сегмента, который ассоциирован с мембраной (например, полиморфизм последовательности ДНК или мутация в гене), таким образом, что рецептор не вставляется в мембрану или рецептор вставляется, но не остается внутри мембраны. Таким образом, растворимый рецептор, по контрасту с соответствующей мембраносвязанной формой, отличается одним или несколькими сегментами гена белка-рецептора, которые важны для ассоциации с мембраной. Средства по настоящему изобретению могут предоставляться по одному, или в комбинации, или в последовательной комбинации с другими средствами, которые модулируют конкретный патологический процесс. Например, средство по настоящему изобретению может вводиться в комбинации с противовоспалительными средствами после инсульта как средство для блокирования дальнейшего повреждения нейронов и ингибирования регенерации аксонов. При использовании здесь говорят, что два средства вводятся в комбинации, когда два средства вводятся одновременно или вводятся независимо таким образом, что средства будут действовать в одно и то же время. Средства по настоящему изобретению могут вводиться парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, чрескожным или буккальным путем. Например, средство может вводиться местно в участок повреждения путем микроинфузии. Обычно участки включают в качестве неограниченных примеров поврежденные области спинного мозга, возникшие в результате травмы, или поврежденные участки в головном мозге, возникшие в результате инсульта. Альтернативно или одновременно, введение может происходить пероральным путем. Вводимая дозировка зависит от возраста, здоровья и массы реципиента, вида одновременного лечения, если таковое проводится, частоты лечения и природы требуемого действия. Настоящее изобретение далее относится к композициям, содержащим одно или несколько средств,которые модулируют экспрессию по крайней мере одного типа активности белка по изобретению. Когда индивидуальные потребности варьируют, определение оптимальных пределов эффективных количеств каждого компонента зависит от специалиста в данной области. Обычные дозировки включают от 1 пг/кг до 100 мг/кг массы тела. Предпочтительные дозировки для системного введения включают от 100 нг/кг до 100 мг/кг массы тела. Предпочтительные дозировки для непосредственного введения в участок путем микроинфузии включают от 1 нг/кг до 1 мкг/кг массы тела. В дополнение к фармакологически активному средству композиции по настоящему изобретению могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые наполнители и добавки, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые могут применяться в фармацевтике для доставки к месту действия. Подходящие препараты для парентерального введения включают водные растворы активного соединения в водорастворимой форме, например в виде водорастворимых солей. Кроме того,могут вводиться суспензии активных соединений в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензий, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и декстран. Суспензии также могут необязательно содержать стабилизаторы. Для инкапсуляции средства при доставке в клетку также могут использоваться липосомы. Фармацевтический препарат для системного введения по изобретению может составляться для внутреннего, парентерального или местного введения. В действительности, все три типа препаратов могут использоваться одновременно для достижения системного введения активного ингредиента. Подходящие препараты для перорального введения включают твердые или мягкие желатиновые капсулы, пилюли, таблетки, включая покрытые таблетки, эликсиры, суспензии, сиропы или жидкости для ингаляции и их формы с контролируемым высвобождением. При осуществлении способов данного изобретения средства по данному изобретению могут использоваться по одному, или в комбинации, или в комбинации с другими терапевтическими или диагностическими средствами. В некоторых предпочтительных осуществлениях соединения по данному изобретению могут вводиться совместно с другими соединениями, обычно предписанными для данных состояний согласно общепринятой медицинской практике, такими как противовоспалительные средства,антикоагулянты, противотромботические средства, включая ингибиторы агрегации тромбоцитов, активаторы тканевого плазминогена, урокиназу, проурокиназу, стрептокиназу, аспирин и гепарин. Соединения по данному изобретению могут применяться in vivo, обычно на млекопитающих, таких как люди, овцы,лошади, крупный рогатый скот, свиньи, собаки, кошки и мыши, или in vitro.L. Пептидные миметики. Данное изобретение также включает пептидные миметики, которые имитируют трехмерную структуру Nogo и блокируют связывание Nogo с рецептором Nogo. Такие пептидные миметики могут обла- 16008480 дать значительными преимуществами над встречающимися в природе пептидами, включая, например,более экономичное получение, большую химическую стабильность, улучшенные фармакологические свойства (период полужизни, всасывание, мощность, действенность и т.д.), измененную специфичность(например, более широкий спектр типов биологической активности), сниженную антигенность и др. В одной из форм миметики представляют собой пептидсодержащие молекулы, которые имитируют элементы вторичной структуры белка (см., например, Johnson et al., (1993) Peptide Turn Mimetics, inBiotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., (editors) Chapman and Hall). Основным логическим обоснованием применению пептидных миметиков является то, что пептидный остов белков, главным образом,существует с ориентацией аминокислотных боковых групп, способствующей молекулярным взаимодействиям, таким как между антителом и антигеном. Ожидается, что пептидный миметик обеспечивает молекулярное взаимодействие, сходное с таковым природной молекулы. В другой форме аналоги пептидов обычно используются в фармацевтической промышленности в виде непептидных лекарственных средств со свойствами, аналогичными таковым для эталонных пептидов. Данные типы непептидных соединений также относятся к пептидным миметикам или пептидомиметикам Fauchere, (1986) Adv. Drug Res. 15, 29-69; VeberFreidinger, (1985) Trends Neurosci. 8,392-396; Evans et al., (1987) J. Med. Chem. 30, 1229-1239, которые включены сюда в качестве ссылки) и обычно разрабатываются с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые являются структурно сходными с пептидами, применяемыми в терапии, могут использоваться для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Как правило, пептидные миметики структурно сходны с эталонным полипептидом (т.е. полипептидом, который обладает биохимическими свойствами или фармакологической активностью), таким как внеклеточный домен Nogo, но имеют одну или несколько пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (цис- и транс-), -СОСН 2-, -СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-, способами, известными в данной области и описанными далее следующими ссылками: Weinstein, (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and(-COCH2-); Holladay et al., (1983) Tetrahedron Lett. 24, 4401-4404 (-C(OH)CH2-); и Hruby, (1982) Life Sci. 31, 189-199 (-CH2S-); каждая из которых включена сюда в качестве ссылки. Мечение пептидных миметиков часто включает ковалентное пришивание одной или нескольких меток, непосредственно или через спейсер (например, амидную группу), к позиции(-ям) пептидного миметика, не мешающей связыванию, которая предсказывается посредством количественных данных по структуре-активности и молекулярного моделирования. Такие позиции на пептидном миметике, не мешающие связыванию, как правило, представляют собой позиции, которые не образуют прямых контактов с макромолекулой(-ами) (например, не являются точками контакта в комплексах Nogo-рецептор Nogo), с которой связывается пептидный миметик для получения терапевтического эффекта. Дериватизация (например, мечение) пептидных миметиков не должна существенно мешать требуемой биологической или фармакологической активности пептидного миметика. Пептидные миметики Nogo могут конструироваться посредством конструирования лекарственных средств, основанного на структуре, путем замен аминокислот органическими группами (см., например,Hughes, (1980) Philos. Trans. R. Soc. Lond. 290, 387-394; Hodgson, (1991) Biotechnol. 9, 19-21; Suckling,(1991) Sci. Prog. 75,323-359). Применение пептидных миметиков может быть улучшено путем использования комбинаторной химии с целью создания библиотек лекарственных средств. В конструировании пептидных миметиков может помочь идентификация аминокислотных мутаций, которые повышают или снижают связываниеNogo с рецептором Nogo. Подходы, которые могут использоваться, включают дрожжевой двухгибридный метод (см. Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582) и применение метода фагового дисплея. Посредством двухгибридного метода выявляют белок-белковые взаимодействия у дрожжей(Fields et al., (1989) Nature 340, 245-246). Посредством метода фагового дисплея выявляют взаимодействия между иммобилизированным белком и белком, который экспрессирован на поверхности фагов, таких как лямбда и М 13 (Amberg et al., (1993) Strategies 6, 2-4; Hogrefe et al., (1993) Gene 128, 119-126). Данные способы позволяют проводить позитивную и негативную селекцию белок-белковых взаимодействий и идентификацию последовательностей, которые определяют данные взаимодействия. Для общей информации по пептидному синтезу и пептидным миметикам см., например, Jones,(1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press; Jung, (1997) Combinatorial Peptide andM. Трансгенные животные. Используемый здесь термин животное включает всех позвоночных животных, кроме человека. Он также включает индивидуальное животное на всех стадиях развития, включая стадии эмбриона и- 17008480 плода. Трансгенное животное представляет собой животное, содержащее одну или несколько клеток,несущих генетическую информацию, полученную, непосредственно или непрямым путем, посредством преднамеренной генетической манипуляции на клеточном уровне, такой как микроинъекция или инфекция рекомбинантным вирусом. Данная введенная молекула ДНК может интегрироваться в хромосому,или она может быть внехромосомно реплицирующейся ДНК. Термин трансгенное по клеткам зародышевой линии животное относится к трансгенному животному, в котором генетическая информация введена в линию зародышевых клеток, таким образом оно приобретает способность передавать информацию потомству. Если такое потомство обладает некоторой частью такой информации, то оно тогда также является трансгенными животными. Трансгенные животные, содержащие мутантные гены, нокаутгены, модифицированные гены или генные конструкции для избыточной экспрессии или экспрессии в зависимости от условий гена, соответствующего последовательностям кДНК SEQ ID NO: 1 или 3 или родственным последовательностям, относятся к настоящему изобретению. Информация может быть чужеродной для вида животного, к которому относится реципиент, чужеродной только для конкретного индивидуального реципиента, или генетическая информация может всегда быть присуща реципиенту. В последнем случае введенный ген может быть по-другому экспрессирован по сравнению с нативным эндогенным геном. Гены могут быть получены путем выделения их из геномных источников, путем получения кДНК из выделенных шаблонных РНК, путем прямого синтеза или путем некоторых комбинаций перечисленного. Для экспрессии ген должен быть функционально связан с регуляторным регионом. Регуляторные регионы, такие как промоторы, могут использоваться для повышения, снижения, регуляции или приурочивания к конкретным тканям или конкретным стадиям развития экспрессии гена. Промотор не обязательно должен быть встречающимся в природе промотором. Трансгенные животные, не являющиеся человеком по изобретению получают путем введения трансгенов в зародышевые клеточные линии животных, не являющихся человеком. Способы, позволяющие введение ДНК в клетки, как правило, доступны и хорошо известны в данной области. Могут использоваться различные способы введения трансгенов. Как правило, зигота является лучшей мишенью для микроинъекции. У мыши мужской пронуклеус достигает размеров приблизительно 20 мкм в диаметре, что позволяет проведение воспроизводимой инъекции 1 или 2 пл раствора ДНК. Применение зигот в качестве мишени для генного переноса имеет большое преимущество. В большинстве случаев инъецированная ДНК включается в ген хозяина до первого дробления (Brinster et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438-4442). Впоследствии примерно все клетки трансгенного животного, не являющегося человеком, будут нести включившийся трансген. Как правило, это также приводит к эффективной передаче трансгена потомству производителя, поскольку 50% зародышевых клеток несут трансген. Микроинъекция зигот является предпочтительным способом введения трансгенов при осуществлении изобретения. Также для введения трансгена в животное, отличное от человека, может использоваться ретровирусная инфекция. Развивающийся нечеловеческий эмбрион можно культивировать in vitro до стадии бластоцисты. В течение этого времени бластомеры могут являться мишенью для ретровирусной инфекции. Эффективное инфицирование бластомеров получают путем ферментной обработки с целью удаления zona pellucida. Система вирусных векторов, используемая для введения трансгена, обычно представляет собой дефектный в плане репликации ретровирус, несущий трансген (Jahner et al., (1985) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82, 6927-6931; Van der Putten et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152). Трансфекцию легко и эффективно осуществляют путем культивирования бластомеров на монослое продуцирующих вирус клеток (Van der Putten et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152; Stewart etal., (1987) EMBO J. 6, 383-388). Альтернативно, инфицирование можно проводить на более поздней стадии. Вирус или продуцирующие вирус клетки можно инъецировать в бластоцеле (Jahner et al., (1982)Nature 298, 623-628). Большинство животных-производителей являются мозаичными в плане наличия трансгена, поскольку включение происходит только в отдельные группы клеток, которые образуют трансгенное животное, отличное от человека. Более того, животное-производитель может содержать ретровирусные вставки трансгена в различных позициях генома; они, как правило, разделяются в потомстве. Кроме того, также возможно введение трансгенов в зародышевую линию, хотя с меньшей эффективностью, путем внутриматочного инфицирования эмбриона в середине гестации (Jahner et al., (1982)Nature 298, 623-628). Третьим типом клетки-мишени для введения трансгена является эмбриональная стволовая клетка(ES). Клетки ES получают из доимплантационных эмбрионов, культивируемых in vitro (Evans et al.,(1981) Nature 292, 154-156; Bradley et al., (1984) Nature 309, 255-256; Gossler et al., (1986) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 83, 9065-9069). Трансгены могут эффективно вводиться в клетки ES путем трансфекции ДНК или путем ретровирусопосредованной трансдукции. Полученные в результате трансформированные клетки ES могут после этого комбинироваться с бластоцистой животного, не являющегося человеком. Клетки ES колонизируют эмбрион и вносят вклад в зародышевую линию полученного химерного животного. Способы оценки присутствия введенной ДНК, а также ее экспрессии легко доступны и хорошо известны в данной области. Такие способы включают в качестве неограниченных примеров (саузерн-)гиб- 18008480 ридизацию ДНК для выявления экзогенной ДНК, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и вестерн-блоттинг для выявления ДНК, РНК и белка. Способы включают иммунологические и гистохимические подходы для выявления экспресии гена рецептора Nogo. Используемый здесь термин трансген представляет собой последовательность ДНК, введенную в зародышевую линию животного, не являющегося человеком, путем человеческого вмешательства, таким путем, как описано ниже в примерах. Последовательность нуклеиновой кислоты трансгена, в данном случае формы SEQ ID NO: 1 или 3, может интегрироваться в локус генома, где данная конкретная последовательность нуклеиновой кислоты не обнаружена в норме, или, наоборот, в нормальный локус для трансгена. Трансген может состоять из последовательностей нуклеиновых кислот, происходящих из генома того же вида или других видов по отношению к виду целевого животного. Например, регенерация аксонов у мыши, лишенной Nogo, может сравниваться с таковой у мыши, лишенной MAG или как MAG,так и Nogo. Для определения того, является ли действие антител против Nogo следствием блокады Nogo,эффекты антител могут исследоваться на животных, лишенных экспрессии Nogo. Как обсуждалось выше, нуклеиновая кислота по изобретению может трансфицировать в клетку-хозяин с использованием вектора. Предпочтительными векторами являются плазмиды и вирусные векторы,такие как ретровирусы. Вирусные векторы могут использоваться для получения трансгенного животного по изобретению. Предпочтительно вирусные векторы являются дефектными в плане репликации, то есть они не могут автономно реплицироваться в клетке-мишени. Как правило, геном вирусных векторов, дефектных в плане репликации, которые используются в рамках настоящего изобретения, не содержит по крайней мере один регион, необходимый для репликации вируса в инфицированной клетке. Данные регионы или могут быть элиминированы (целиком или частично), или сделаны нефункциональными любым способом, известным специалисту в данной области. Данные способы включают полное удаление,замену (другими последовательностями, в частности вставленной нуклеиновой кислотой), частичную делецию или добавление одного или нескольких оснований в существенный (для репликации) регион. Данные способы могут осуществляться in vitro (на выделенной ДНК) или in situ с использованием способов генетической манипуляции или путем обработки мутагенными агентами. Предпочтительно вирус, дефектный в плане репликации, сохраняет последовательности его генома,необходимые для упаковывания в капсид вирусных частиц. Ретровирусы являются интегрирующимися вирусами, которые инфицируют делящиеся клетки. Ретровирусный геном включает два LTR, последовательность включения в капсид и три кодирующих региона (gag, pol и env). Описана конструкция рекомбинантных ретровирусных векторов (см., например, Bernstein et al., (1985) Genet. Eng. 7, 235; McCormick,(1985) Biotechnol. 3, 689-691). В рекомбинантных ретровирусных векторах гены gag, pol и env, как правило, подвергнуты делеции, полностью или частично, и замещены интересующей гетерологической последовательностью нуклеиновой кислоты. Данные векторы могут конструироваться из разных типов ретровирусов, таких как ВИЧ, MoMuLV (вирус мышиного лейкоза Молони (Moloney, MSV (вирус мышиной саркомы Молон), HaSV (вирус саркомы Харви (Harvey; SNV (вирус некроза селезенки); RSV(вирус саркомы Рауша (Rous вирус Френда (Friend). Как правило, для конструирования рекомбинантных ретровирусов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, конструируют плазмиду, которая содержит LTR, последовательность включения в капсид и кодирующую последовательность. Данная конструкция используется для трансфицирования в упаковочную клеточную линию, причем клетки данной линии способны возмещать в транс-положении функции ретровируса, которых не хватает в плазмиде. Как правило, упаковочные клеточные линии способны, таким образом, экспрессировать гены gag, pol и env. Такие упаковочные клеточные линии описаны в предшествующих исследованиях, в частности клеточная линия РА 317 (патент США 4861719); клеточная линия PsiCRIP (WO 9002806) и клеточная линия GP+envAm-12 (WO 8907150). Кроме того,рекомбинантные ретровирусные векторы могут содержать модификации внутри LTR для подавления транскрипционной активности, а также последовательности интенсивного включения в капсид, которые могут включать часть гена gag (Bender et al., (1987) J. Virol. 61, 1639-1646). Рекомбинантные ретровирусные векторы очищают посредством стандартных способов, известных рядовым специалистам в данной области. В одном из аспектов нуклеиновая кислота кодирует антисмысловую молекулу РНК. В данном осуществлении нуклеиновую кислоту функционально связывают с подходящими регуляторными регионами(обсуждаемыми выше), делающими возможной экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, и вводят в клетку, задействуя, предпочтительно, рекомбинантные векторные конструкции, которые будут экспрессировать антисмысловую нуклеиновую кислоту, как только вектор будет введен в клетку. Примеры подходящих векторов включают плазмиды, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (см., например, патент США 4797368, патент США 5139941), ретровирусы (см. выше) и герпесвирусы. Для доставки терапевтического гена вектор предпочтительно является аденоассоциированным вирусом. Аденовирусы представляют собой ДНК-вирусы эукариотов, которые могут модифицироваться для эффективной доставки нуклеиновой кислоты по изобретению в различные клеточные типы. Существуют различные серотипы аденовируса. Из этих серотипов предпочтение в рамках настоящего изобретения отдается применению аденовирусам человека второго типа или пятого типа (Ad 2 или Ad 5) или адено- 19008480 вирусам животного происхождения (см. WO 9426914). Данные аденовирусы животного происхождения,которые могут применяться в рамках настоящего изобретения, включают аденовирусы, происходящие из лошади, быка, мыши, овцы, свиньи и обезьян. Рекомбинантные аденовирусы по изобретению, дефектные в плане репликации, могут быть получены любым способом, известным специалисту в данной области. В частности, они могут быть получены путем гомологичной рекомбинации между аденовирусом и плазмидой, которая, среди прочего, несет интересующую последовательность ДНК. Гомологичная рекомбинация происходит после совместной трансфекции указанными аденовирусом и плазмидой подходящей клеточной линии. Клеточная линия,которая задействуется, должна предпочтительно (i) быть способной к трансформации указанными элементами и (ii) содержать последовательности, способные восполнять часть генома дефектного в плане репликации аденовируса, предпочтительно в интегрированной форме во избежание риска рекомбинации. Рекомбинантные аденовирусы выделяют и очищают с использованием стандартных молекулярно-биологических способов, которые хорошо известны рядовому специалисту в данной области. Было получено некоторое количество рекомбинантных или трансгенных мышей, включая тех, что экспрессировали последовательность активированного онкогена (патент США 4736866); экспрессировали обезьяний Т-антиген SV 40 (патент США 5728915); были лишены экспрессии регуляторного фактора интерферона 1 (IRF-1) (патент США 5731490); проявляли дофаминергическую дисфункцию (патент США 5723719); экспрессировали по крайней мере один ген человека, который участвовал в контроле кровяного давления (патент США 5731489); проявляли большое сходство с состояниями, существующими при встречающейся в природе болезни Альцгеймера (патент США 5720936); обладали сниженной способностью опосредовать клеточную адгезию (патент США 5602307); обладали геном бычьего гормона роста (Clutter et al., (1996) Genetics 143, 1753-1760); или были способны генерировать ответ полностью человеческих антител (Zou et al., (1993) Science 262, 1271-1274). Хотя мыши и крысы остаются животными выбора во многих трансгенных экспериментах, в некоторых случаях предпочтительно или даже необходимо использовать альтернативные виды животных. Трансгенные процедуры успешно применяли на различных немышевидных животных, включая овец,коз, кур, хомяков, кроликов, коров и морских свинок (см. Aigner et al., (1999) Biochem. Biophys. Res.N. Диагностические способы. Одно из средств для диагностики димиелинизирующих заболеваний с использованием молекул нуклеиновой кислоты включает получение образца ткани из живых субъектов. Получение образцов ткани из живых источников является проблематичным для таких тканей, как таковые центральной нервной системы. От пациентов, страдающих демиелинизирующим заболеванием, образцы ткани для диагностических способов могут быть получены путем менее инвазивных процедур. Например, образцы могут быть получены из цельной крови и сыворотки. Применение молекулярно-биологических средств стало рутинным в судебной технологии. Например, для определения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, включающей SEQ ID NO: 1, в судебных патологических образцах могут использоваться зонды на основе нуклеиновой кислоты. Кроме того,способы анализа нуклеиновой кислоты могут осуществляться любыми средствами проведения анализа транскрипционного профиля. В дополнение к анализу нуклеиновой кислоты судебные способы по изобретению могут быть нацелены на белок, кодированный SEQ ID NO: 1, для определения регуляции, повышающей или снижающей экспрессию генов (Shiverick et al., (1975) Biochim. Biophys. Acta 393, 124-133). Способы по изобретению могут включать обработку тканей коллагеназами и другими протеазами для того, чтобы сделать ткань подверженной клеточному лизису (Semenov et al., (1987) Biull. Eksp. Biol.Med. 104, 113-116). Кроме того, возможно получение образцов биопсии из разных регионов головного мозга для анализа. Способы анализа для детекции молекул нуклеиновой кислоты или белка по изобретению могут быть в любом доступном формате. Обычные способы анализа молекул нуклеиновой кислоты включают гибридизацию или форматы, основанные на ПЦР. Обычные способы анализа для детекции белков, полипептидов или пептидов по изобретению включают применение зондов-антител в любом доступном формате, таком как анализ связывания in situ, и т.д. См. HarlowLane, (1988) Antibodies - A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press. В предпочтительных осуществлениях анализы проводятся с соответствующими контролями. Без дальнейшего описания предполагается, что рядовой специалист в данной области может, используя предшествующее описание и последующие иллюстративные примеры, получить и задействовать соединения по настоящему изобретению и осуществить входящие в формулу изобретения способы. Поэтому следующие рабочие примеры специально показывают предпочтительные осуществления настоящего изобретения и не истолковываются как любым образом ограничивающие оставшуюся часть описания.- 20008480 Примеры Пример 1. Идентификация Nogo как члена ретикулонового семейства белков. Регенерация аксонов взрослых млекопитающих, как правило, успешно проходит на периферии, но,к несчастью, слабо выражена в ЦНС. Однако многие классы аксонов ЦНС могут вытягиваться на большие расстояния при трансплантации на нервную периферию (BenfyAguayo (1982) Nature 296, 150152). При сравнении миелина ЦНС и периферической нервной системы (ПНС) выявлено, что белое вещество ЦНС является избирательным ингибитором разрастания аксонов (SchwabThoenen (1985) J.Neurosci. 5, 2415-2423). Описаны некоторые компоненты белого вещества ЦНС, NI135, NI250 (Nogo) иMAG с ингибиторной активностью по отношению к вытягиванию аксонов (Wang et al., (1999) TransductionHumana Press; CaroniSchwab, (1988) J. Cell Biol. 106, 1281-1288; Spillmann et al., (1998) J. Biol. Chem. 73, 19283-19293; McKerracher et al., (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay et al., (1994) Neuron 13,757-767). Антитело IN-1, полученное против NI135 и NI250 (Nogo), приводило, как сообщалось, к умеренной степени регенерации аксонов и восстановления функции после травмы спинного мозга (Bregmanet al., (1995) Nature 378, 498-501; Thallmair et al., (1998) Nature Neurosci. 1, 24-31). По настоящему изобретению Nogo идентифицирован как член белкового семейства ретикулона.Nogo экспрессируется олигодендроцитами, но не Шванновскими клетками, и первоначально ассоциирован с эндоплазматическим ретикулумом. Люменально-внеклеточный домен Nogo, состоящий из 66 аминокислот (SEQ ID NO: 20), ингибирует вытягивание аксонов и выводит из строя конусы роста ганглиев дорзальных корешков. Другие ретикулоновые белки не экспрессируются олигодендроцитами, и люменально-внеклеточный 66-аминокислотный домен других ретикулоновых белков не ингибирует регенерацию аксонов. Эти данные обеспечивают молекулярную основу причастности Nogo к отсутствию регенерации аксонов в ЦНС взрослых. Для экспрессии и белковой очистки рекомбинантного Nogo-A полноразмерная последовательность(KIAA0886) была любезно предоставлена Kazusa DNA Research Institute. Полноразмерную кодирующую последовательность амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигировали в вектор pCDNA3.1-MycHis (Invitrogen) с получением плазмиды, кодирующей Nogo-A, слитый с С-концом эпитопа Мус (Nogo-A-Myc). Альтернативно, кодирующую последовательность амплифицировали с использованием праймеров, которые кодируют в рамке эпитоп Мус сразу с N-конца от первого остатка и стоп-кодон с С-конца (Мус-Nogo-A). Экспрессирующие векторы Nogo-C-MycHis и Rtn1C-MycHis были получены в той же манере, кроме того, что в качестве шаблона для реакции ПЦР использовали библиотеку кДНК головного мозга взрослой крысы, с праймерами, основанными на последовательностях NogoC или Rtn1C (Van de Velde et al., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Данными плазмидами трансфицировали COS-7 или НЕK293 Т посредством Lipofectamine (Gibco-BRL) или по способу FuGENE 6 (BoerhingerMannheim). Часть Nogo-A, кодирующую 66-аминокислотный люменально-внеклеточный фрагмент Nogo-A, амплифицировали посредством ПЦР и лигировали в плазмиду pGEX-2T с получением прокариотического экспрессирующего вектора для белка слияния GST-Nogo. Сходные регионы Rtn1, Rtn2 и Rtn3 амплифицировали путем вложенной ПЦР с использованием в качестве шаблона библиотеки кДНК головного мозга взрослой крысы и лигировали в pGEX-2T. E. coli, трансформированную данными плазмидами, индуцировали IPTG. Растворимые, нативные белки слияния с GST очищали с использованием глутатионовой смолы, и они содержали приблизительно 75% GST и 25% полноразмерных белков GST-Nogo или GSTRtn. Большая часть белка GST-Nogo не подлежала экстракции при неденатурирующих условиях, но экстракт с 8 М мочевиной, диализованный против PBS, содержал свыше 98% чистого GST-Nogo. Иммунореактивность Мус выявляли с продуктом очевидного размера в области 225 кДа в восстановительных условиях (данные не показаны). Таким образом, кДНК направляет экспрессию белка с подходящей электрофоретической подвижностью и аминокислотной последовательностью, относящейся кNogo, который был назван человеческим Nogo-A (hNogo-A). Консервативный С-конец белков семейства Rtn содержал два гидрофобных домена, разделенных гидрофильным сегментом длиной 66 аминокислотных остатков. Ни одна из этих последовательностей не содержит сигнального пептида. Предсказанная для данных белков топология такова, что N- и С-конец должны находиться в цитозоле, а консервативный регион должен быть ассоциирован с липидным бислоем. Для Rtn1A имеется экспериментальное доказательство, демонстрирующее, что полипептид ведет себя как интегральный мембранный белок и что гидрофобные сегменты консервативного домена ответственны за это проявление (Van de Velde et al., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Меченный Мус Nogo также асссоциирован с конкретными фракциями и экстрагируется детергентом, но не посредством высокой ионной силы (данные не показаны). При повышенной экспрессии в клетках почки белок Rtn1 первоначально локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ER) в мелкогранулированном виде, отсюда термин Reticulon (Van de Velde et al.,(1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). На С-конце Nogo и большинства белков Rtn имеется дилизиновый мотив задержки в ER (Van de Velde et al., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416; Jackson et al., (1991) EMBO J. 9, 3153-3162). В нейронах Rtn1 экспрессируется на протяжении отростков и сконцентрирован в конусах- 21008480 роста (Senden et al., (1996) Eur. J. Cell. Biol. 69, 197-213). Исследование его локализации в трансфицированных клетках почки привело к тому предположению, что Rtn1 может регулировать сортировку белков или другие аспекты функции ER (Van de Velde et al., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Формы сплайсинга Nogo А и С характеризуются распределением в ретикулуме при экспрессии в клетках COS-7, сходным с таковым Rtn1C. Пример 2. Поликлональные антитела против Nogo. Предсказанная внутримембранная топология двух гидрофобных доменов Nogo указывает, что 66 аминокислотных остатков между данными сегментами локализованы на люменальной/внеклеточной поверхности мембраны. Для дальнейшего выяснения этого получали антисыворотки, направленные против 66-аминоксилотного домена. Для продукции антител и иммуногистологии получали иммуноблоты и иммуногистологию против Мус с антителом 9 Е 10, как описано Takahashi et al., (1998) Nature Neurosci., 1, 487-493Takahashi et al.,(1999) Cell, 99, 59-69. Белок слияния GST-Nogo использовали в качестве иммуногена для получения кроличьей антисыворотки против Nogo. Антитело аффинно очищали и использовали в концентрации 3 мкг/мл для иммуногистологии и 1 мкг/мл для иммуноблотов. Для оценки специфичности антисыворотки проводили окрашивание в присутствии белка GST-Nogo в концентрации 0,1 мг/мл. Для окрашивания живых клеток клетки инкубировали в разведениях первичного антитела при 4 С в течение 1 ч в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (Hanks) с 0,05% BSA и 20 мМ Na-Hepes (pH 7,3). После фиксации связанное антитело выявляли путем инкубации с флуоресцентно меченными вторичными антителами. Посредством антитела выявлен низкий уровень поверхностной экспрессии данного эпитопа, тогда как эпитоп Мус на С-конце экспрессированного Nogo не выявляли до тех пор, пока клетки не делали проницаемыми. Поверхностное окрашивание указывало на то, что с поверхностью ассоциирована меньшая часть белка Nogo по сравнению с мембраной ER. Эти данные служат подтверждением топографической модели, на которой N- и С-концы белка находятся в цитоплазме и 66 аминокислот белка выступают на люменально-внеклеточную сторону ER или плазматической мембраны. Пример 3. Экспрессия Nogo в центральной нервной системе. Если Nogo вносит основной вклад в ингибиторные характеристики разрастания аксонов (Caroniet al., (1995) Nature 378, 498-501), то Nogo должен экспрессироваться в миелине ЦНС взрослых, но не в миелине ПНС. Анализ экспрессии Nogo посредством нозерн-блота проводили с использованием зондов,происходящих из 5'-концевого Nogo-A/B-специфического региона и из 3'-концевого общего региона кДНК Nogo. Единственная полоса размером около 4,1 тыс. нуклеотидов была выявлена с 5'-концевым зондом в образцах общей РНК зрительного нерва взрослой крысы, но не в образцах из седалищного нерва. Результаты указывают на то, что клон Nogo-A представляет полноразмерную кДНК, и согласуются с ролью Nogo как специфического для миелина ЦНС ингибитора разрастания аксонов. При помощи анализа нозерн-блота с 3'-концевым зондом выявлено, что зрительный нерв экспрессирует большие количества мРНК Nogo-A и значительно меньшие количества Nogo-B и Nogo-C. Целый головной мозг экспрессирует как Nogo-A, так и Nogo-C, но некоторое количество периферических тканей (включая седалищный нерв) экспрессируют малое количество или не экспрессируют Nogo. Продемонстрировано, что экспрессия Nogo-C/Rtn4C происходит в скелетной мышце и адипоцитах, так же, как в головном мозге (Morris etal., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1450, 68-76). Из семейства Rtn в зрительном нерве происходит селективная экспрессия Nogo в отсутствие выявляемой экспресии Rtn1 или Rtn3. Rtn2 не определяли. Посредством гибридизации in situ мРНК Nogo выявлена в клетках с морфологией олигодендроцитов в зрительном нерве и пирамидном пути взрослой крысы. В некоторых популяциях нейронов в головном мозге также выявлена экспрессия Nogo. В отличие от Nogo, Rtn1 или Rtn3 не экспрессируются в зрительном нерве, но мРНК выявляют в некоторых популяциях нейронов. Локализацию белка Nogo анализировали в клеточных культурах спинного мозга, обработанных PDGF и разбавленной сывороткой для индукции дифференцировки олигодендроцитов, с использованием антител против Nogo и специфичных для олигодендроцитов моноклональных антител O4. В живых клетках на поверхности олигодендроцитов были обнаружены как люменально-внеклеточная 66-аминокислотная петля Nogo, так и антиген O4. Приблизительно половина O4-положительных клеток в данных культурах характеризовались поверхностным окрашиванием на Nogo. Пример 4. Опосредованный Nogo коллапс конусов роста. Для всех экспериментов с привлечением клеточных культур использовали следующие способы. Способы с использованием культур выростов и диссоциированных нейронов ганглиев эмбриональных куриных дорзальных корешков Е 10 и Е 12 описаны для культур ганглия дорзального корешка Е 7 (Takahashiet al., (1998) Nature Neurosci. 1, 487-493; Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69; Goshima et al., (1995) Nature 376, 509-514; JinStrittmatter, (1997) J. Neurosci. 7, 6256-6263). NGF-дифференцированные клетки РС 12 культивировали, как описано (Strittmatter et al., (1994) J. Neurosci. 14, 2327-2338). Выросты эмбрионального спинного мозга (Е 10 крысы или Е 5 цыпленка) культивировали в течение 7-14 дней в присутствииPGDF-AA для индукции дифференцировки некоторых клеток в зрелые олигодендроциты (Vartanian et al.,(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 731-735). Процедура анализа коллапса конусов роста идентична тако- 22008480 вой для анализа Sema3 А-индуцированного коллапса конусов роста (Takahashi et al., (1998) Nature Neurosci. 1, 487-493; Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69; Goshima et al., (1995) Nature 376, 509-514; JinStrittmatter,(1997) J. Neurosci. 17, 6256-6263). Способ анализа общего разрастания нейритов также был описан (Goshimaet al., (1995) Nature 376, 509-514; JinStrittmatter, (1997) J. Neurosci. 17, 6256-6263; Strittmatter et al.,(1994) J. Neurosci. 14, 2327-2338). При анализе разрастания белки и пептиды добавляли через 1 ч после помещения на чашки для минимизации любого действия на общее количество прилипающих клеток. Для тестирования действия связанного с субстратом GST или GST-Nogo белковые растворы высушивали на покрытом поли-L-лизином стекле, отмывали и затем покрывали ламинином. Для культур Е 12 идентичность клеток нейронам проверяли путем окрашивания антителами против нейрофиламентов (2 Н 3,Develomental Studies Hybridoma Bank) и следы нейритов отмечали при наблюдении окрашивания родаминфаллоидином F-актина в отростках. Экспрессия рекомбинантного Nogo в клетках НЕK293 Т позволяет проводить точное тестирование того, оказывает ли данный белок ингибирующее действие на разрастание аксонов. Отмытые мембранные фракции из трансфицированных вектором или hNogo-A-Myc клеток НЕK293 Т добавляли к культурам выростов ганглиев куриных дорзальных корешков Е 12. Морфологию конусов роста оценивали после 30 минутной инкубации при 37 С путем фиксации и окрашивания родаминфаллоидином. Контрольные мембраны НЕK не оказывали детектируемого действия на морфологию конусов роста. Мембраны, содержащие Nogo-A, индуцировали коллапс большей части конусов роста ганглия дорзальных корешков. Данный коллапс конусов роста является индикатором ингибирующей активности в отношении разрастания аксонов, и также показано ингибирование Nogo вытягивания аксонов (см. ниже). Форма Nogo-C также проявляет активность в отношении коллапса, и это означает то, что общий С-конец белка, включающий гидрофобные сегменты и 66-аминокислотный люменально-внеклеточный домен,содержит функционально важные остатки. Наличие дополнительной ингибиторной активности N-концевого региона Nogo-A не исключается данными исследованиями. Чувствительность более незрелых культур выростов из куриных эмбрионов Е 10 или из крысиных эмбрионов Е 15 (данные не показаны) является существенно меньшей. Регуляция чувствительности по ходу развития согласуется с экспериментами, в которых используют частично очищенный Nogo (Bandtlow et al., (1997) Eur. J. Neurosci. 9, 2743-2752). В приводящем к коллапсу конуса роста белка Nogo-C гидрофильный 66-аминокислотный люменально-внеклеточный домен кажется более вероятным кандидатом на взаимодействие с поверхностью нейронов ганглиев дорзального корешка, чем погруженные в мембрану гидрофобные домены. Для проверки данной гипотезы 66-аминокислотный регион hNogo экспрессировали в Е. coli и очищали. Большая часть белка слияния GST-Nogo скапливалась в тельцах включения, но может быть выделена путем экстракции мочевиной. Данный ограниченный регион Nogo проявляет сильную (ЕС 50=50 нМ) активность,приводящую к коллапсу конусов роста в нейронах ганглиев дорзального корешка Е 12 (данные не показаны). Препарат экстрагированного мочевиной белка, вероятно, представляет только малую фракцию последовательности Nogo в активной конформации. Поэтому 10% GST-Nogo, который растворим в Е.coli, очищали посредством смолы глутатионсефарозы. Данный препарат является даже более сильным,чем экстрагированный мочевиной белок, фактором коллапса, резко изменяя морфологию конуса роста в таких низких концентрациях, как 1 нМ. Действие в наномолярных концентрациях является стандартом для большинства известных физиологических регуляторов, управляющих аксонами. Разрастание аксонов нейронов ганглиев дорзального корешка и NGF-дифференцированных клеток РС 12 также блокируется данным растворимым белкомGST-Nogo в нМ концентрациях (данные не показаны). Когда GST-Nogo связан с поверхностями субстрата, разрастание аксонов нейронов ганглиев дорзального корешка или клеток РС 12 снижается до недетектируемого уровня. Имеет место селективное действие на разрастание аксонов, но не на выживание клеток, поскольку GST-Nogo не снижает число нейрофиламент-положительных прилипающих клеток (13724% для обработанных GST культур) и не изменяет значимо число апоптотических ядер, идентифицированных путем окрашивания DAPI (4,01,7% в контрольных культурах и 5,21,1% в образцах, обработанных GST-Nogo). Оказывается, что олигодендроциты избирательно экспрессируют Nogo из белков Rtn. Для выяснения избирательности роли Nogo в регенерации аксонов рассматривали активность, ингибирующую разрастание аксонов, других белков Rtn. Предсказанные люменально-внеклеточные 66-аминокислотные фрагменты Rtn1, Rtn2 и Rtn3 экспрессировали в виде белков слияния с GST и очищали в нативной форме. В концентрациях, в которых фрагмент Nogo приводит к коллапсу большей части конусов роста ганглиев дорзальных корешков Е 12, другие белки Rtn не изменяли морфологии конусов роста (данные не показаны). Таким образом, активность, ингибирующая регенерацию аксонов, является в семействе Rtn специфичной для Nogo. Пример 5. Пептидные агенты рецептора Nogo. Для дальнейшего определения активного домена Nogo синтезировали пептиды длиной 25 аминокислотных остатков, соответствующие сегменту 6,6-аминокислотной последовательности. Пептид, соответствующий остаткам 31-55 внеклеточного фрагмента Nogo, вызывает коллапс конусов роста (фиг. 2) и проявляет виды активности, ингибирующие разрастание (данные не показаны), в концентрации, равной 4 мкМ.- 23008480 В то время, как данная последовательность может относиться к центральной части (core) ингибиторного домена, 66-аминокислотный фрагмент явно требуется для полной силы действия. Интересно, что этот регион внутри 66-аминокислотного домена проявляет наименьшее сходство с другими белками Rtn, и это согласуется с тем, что другие члены семейства не активны в качестве ингибиторов регенерации аксонов. Действительно, люменально-внеклеточный пептид из 31-55 аминокислот Rtn1 не проявляет активности, вызывающей коллапс конусов роста (данные не показаны). Вышеуказанные экспериментальные данные определяют Nogo как олигодендроцитспецифический член семейства Rtn и демонстрируют, что дискретный домен Nogo может ингибировать разрастание аксонов. Другие белки Rtn не обладают данной активностью. Поэтому экспрессия Nogo в олигодендроцитах, но не в Шванновских клетках, способствует отсутствию регенерации аксонов в ЦНС взрослых млекопитающих по сравнению с ПНС взрослых. Относительный вклад Nogo по сравнению с другими компонентами в тормозящую природу белого вещества ЦНС может теперь быть охарактеризован на молекулярном уровне. В то время, как настоящие экспериментальные данные согласуются с ролью Nogo в блокировании регенерации аксонов в ЦНС взрослых после патологического повреждения, это также может относиться к физиологической роли Nogo в непатологических состояниях. Основываясь на исследованиях локализации, полагают, что другие белки Rtn играют роль в функционировании ER (Van de Velde et al., (1994) J.Cell. Sci. 107, 2403-2416). Большая часть Nogo распределена в ретикулярной системе в клетках COS-7, и лишь меньшая часть представляется доступной на клеточной поверхности. Пример 6. Ингибирование активности Nogo. Предыдущие примеры показали, что 66-аминокислотный регион вблизи С-конца Nogo ингибирует разрастание аксонов и экспрессируется на клеточной поверхности. Более короткие сегменты данного домена длиной 25 аминокислот или являются инертными в качестве ингибиторов разрастания, или проявляют гораздо меньшую силу действия (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444). Область 31-55 из данного 66-аминокислотного сегмента обладает слабой активностью, вызывающей коллапс конусов роста и ингибирующей разрастание аксонов. Для блокирования действия Nogo in vivo мог бы очень потребоваться конкурентный антагонист Nogo, который связывается с тем же рецептором, но, в свою очередь,не оказывает биологического эффекта. Различные фрагменты 66-аминокислотной область тестировали в качестве блокаторов опосредованного Nogo ингибирования роста аксонов. Для этой цели применяли два способа анализа. Первый представлял собой анализ коллапса конусов роста, а второй представлял анализ связывания. При анализе коллапса конусов роста измеряли реакцию на Nogo в присутствии различных пептидов-потенциальных антагонистов. Три из пептидов длиной 25 аминокислот (1-25, 11-35 и 21-45) из 66 аминокислотного региона обладают блокирующей активностью в мкМ концентрациях (фиг. 2). Комбинация всех трех пептидов не изменяла морфологию конусов роста при базовых условиях, но полностью предотвращала коллапс за счет 15 нМ GST-Nogo. Та же смесь пептидов также была способна блокировать коллапс конусов роста, индуцированный низкой дозой миелина ЦНС. Наличие данной блокады поддерживало гипотезу о том, что Nogo представляет первичный ингибиторный компонент миелина ЦНС. Более того, блокада обладала свойствами, ожидаемыми для конкурентного антагонизма, будучи неэффективной при больших дозах миелина ЦНС. Для разработки антагониста с более высокой специфичностью и силой действия тестировали более длинный фрагмент Nogo. Предпочтительно, чтобы такой пептид сам по себе не обладал ингибирующей разрастание аксонов активностью, при этом конкурентно блокируя действие Nogo. Фрагмент 2-41 Nogo ацетилирован на С-конце, и амидирован на N-конце, и является наиболее мощным блокатором Nogo,определенным к настоящему моменту. Рер 2-41 препятствует GST-Nogo-индуцированному коллапсу конусов роста и обладает при анализе связывания кажущейся Ki, равной 150 нМ (фиг. 3). Фрагмент 2-41 также блокирует способность очищенного белка Nogo-66 и грубого миелина ЦНС ингибировать разрастание нейритов в культивируемых нейронах (фиг. 4). Пример 7. Идентификация рецептора Nogo. Разработан анализ связывания Nogo, который задействует способ, широко используемый для определения функции управления аксонами семафорина и эфрина (FlanaganVanderhaeghen, (1998) Annu.Rev. Neurosci. 21, 309-345; Takahashi et al., (1999) Cell 99, 59-69). Он включает слияние части секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (АР) с лигандом для получения биологически активного средства, связывающего рецептор, который может детектироваться путем исключительно чувствительного колориметрического анализа. В случае Nogo создали экспрессирующий вектор, кодирующий сигнальный пептид, метку His6 для очистки, АР и 66-аминокислотный активный домен Nogo. Белок слияния может очищаться из кондиционированной среды трансфицированных клеток в миллиграммовых количествах (фиг. 5). Данный белок является биологически активным в качестве средства, приводящего к коллапсу конусов роста с ЕС 50, равной 1 нМ. AP-Nogo действует лишь ненамного сильнее, чем GST-Nogo,возможно, из-за того, что данный белок синтезируется в эукариотической, а не прокариотической клетке. Первоначальные исследования выявили на аксонах насыщаемые сайты с высокой аффинностью. Связывание блокируется GST-Nogo и антагонистическими пептидами длиной 25 аминокислот, что соответст- 24008480 вует конкурентному связыванию с рецепторным сайтом нейрона. Поскольку кажущаяся Kd (3 нМ) для данных сайтов близка ЕС 50 AP-Nogo в анализе коллапса, сайты, вероятно, представляют собой необходимые физиологически рецепторы Nogo. Данный анализ задействовали для экспрессионного клонирования рецептора Nogo. Порциями экспрессионной библиотеки кДНК головного мозга взрослой мыши, представляющей собой 250000 независимых клонов, трансфицировали клетки COS-7 ненейронного происхождения. Нетрансфицированные клетки COS-7 не связывали AP-Nogo, но трансфекция двумя порциями из 5000 клонов приводила к появлению небольшого числа клеток с сильным связыванием AP-Nogo. Отдельные клоны кДНК, кодирующие сайт связывания Nogo, выделяли путем sib-селекции из каждой из двух позитивных порций. Два независимо выделенных клона были идентичны один другому, кроме расширения длиной 100 п.осн. 5'концевого нетранслируемого региона в одном из клонов. Трансфекция клеток COS-7 приводила к образованию сайта связывания с аффинностью для AP-Nogo, идентичной таковой, наблюдаемой в нейронах ганглиев спинного корешка Е 13; Kd связывания составляет примерно 3 нМ (фиг. 6). Сама по себе АР не связывается с какой-либо детектируемой аффинностью с данными трансфицируемыми клетками, и это означает, что аффинность является следствием наличия 66 аминокислот, происходящих из Nogo. Более того, GST-Nogo вытесняет AP-Nogo из данных сайтов. Данная кДНК кодирует новый белок длиной 473 аминокислот. О кДНК со значительной гомологией не сообщалось в GenBank. Предсказанный белок содержит сигнальный пептид, за которым следуют восемь регионов богатых лейцином повторов, уникальный домен и предсказанный сайт заякориванияGPI (фиг. 7). Идентифицирован человеческий гомолог мышиной кДНК, характеризующийся 89% аминокислотной идентичностью. Существование данной кДНК предсказано на основе структуры мышиной кДНК и анализа последовательности генома человека, хранящейся в GenBank как часть Human SequencingProject. Экзоны человеческой кДНК распространены на 35 тыс. нуклеотидов, и кДНК ранее не была распознана в геномной последовательности. Структура белка соответствовала белку клеточной поверхности, способной связывать Nogo. По связанной с GPI природе белка предполагается, что может существовать вторая субъединица рецептора, которая пронизывает плазматическую мембрану и опосредует трансдукцию сигнала от Nogo. Пример 8. Распределение рецептора Nogo в тканях. Распределение мРНК для данного рецептора Nogo соответствует роли данного белка в регуляции регенерации и пластичности аксонов в ЦНС взрослых. Путем нозерн-анализа в головном мозге выявлена единственная полоса размером 2,3 тыс. оснований, что указывает на то, что выделенный клон рецептораNogo является полноразмерным (фиг. 8). Малые количества данной мРНК наблюдаются в сердце и почке, но не в других периферийных тканях. В головном мозге экспрессия является широко распространенной, и области, наиболее богатые серым веществом, экспрессируют наибольшие количества мРНК. Пример 9. Биологические эффекты разных доменов Nogo. Способы анализа функции Nogo-A включали коллапс конусов роста, разрастание нейритов и распластывание фибробластов со связанными с субстратом и растворимыми препаратами белка (CaroniNature 403, 434-439; Prinjha et al., (2000) Nature 403, 483-484). При анализе морфологии фибробласт 3 Т 3,связанный с субстратом Nogo-66, не ингибировал распластывание (фиг. 1b, е). Поскольку препаратыNI250 и полноразмерный Nogo-A являются тормозящими факторами в отношении распластывания 3 Т 3,необходимо рассмотреть, могут ли разные домены Nogo способствовать этому при активности in vitro. Для облегчения сравнения различных доменов Nogo-A кислый N-концевой фрагмент длиной 1040 аминокислот (Amino-Nogo) экспрессировали в виде меченного Мус-his белка в клетках НЕK293 Т (фиг. 1d). Белок Nogo присутствует в цитозольных фракциях. Поверхности, покрытые очищенным белком AminoNogo, не поддерживали распластывание фибробласта 3 Т 3 (фиг. 1b, е). Сходные результаты наблюдали на происходящей из почки клеточной линии COS-7 (фиг. 1f). Поэтому оказывается, что N-концевой домен имеет значение для действия полноразмерного Nogo-A на фибробласты. Домен Nogo-66 является специфичным для нейронов; он не влияет на клетки ненейронного происхождения. Культуры ганглиев дорзальных корешков также подвергали воздействию белка Amino-Nogo (фиг. 1c,g-i). Как и 3 Т 3, фибробластоподобные клетки в культурах ганглиев дорзальных корешков не распластываются по данному субстрату. Более того, разрастание аксонов на покрытых Amino-Nogo поверхностях снижается до низкого уровня. Таким образом, в то время, как действие Nogo-66 является специфичным в отношении нейронов, ингибиторное действие домена Amino-Nogo является более генерализованным. При наличии в растворимой форме в концентрации 100 нМ полипептид Nogo-66 приводит к коллапсу конусов роста куриных ганглиев дорзальных корешков Е 12 и почти отменяет вытяжение аксонов, как описано ранее (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444). По заметному контрасту с этим растворимый белок Amino-Nogo оказывается неактивным и значимо не модулирует морфологию конусов роста ганглиев дорзальных корешков, или вытяжение аксонов ганглиев дорзальных корешков, или распластывание ненейронных клеток (фиг. 1c, g-i). В экспериментах Walsh и коллег (Prinjha et al., (2000) Nature 403, 483-484) исследованы гранулярные нейроны мозжечка, и растворимый Amino-Nogo присутствовал в виде белка слияния Fc, возможно, в- 25008480 димерной форме. Поэтому необходимо уяснить, может ли данными различиями объясняться неактивность растворимого Amino-Nogo. Гранулярные нейроны мозжечка мыши Р 4 реагируют на препаратыNogo в манере, неотличимой от реакции нейронов куриных ганглиев дорзальных корешков Е 13 (фиг. 1i).Amino-Nogo, димеризованный с антителом против Мус, ингибирует распластывание 3 Т 3 и COS-7 (фиг. 1e,f) и имеет тенденцию к снижению разрастания аксонов мозжечка (фиг. 1i). При дальнейшей агрегации путем добавления антитела против мышиных IgG Amino-Nogo значимо снижает разрастание аксонов ганглиев дорзальных корешков и мозжечка (фиг. 1h, i). Хотя белок Amino-Nogo является довольно кислым, электростатический заряд сам по себе не имеет значения для его ингибиторного действия, поскольку поли-Asp не изменяет распластывание клеток или разрастание аксонов (фиг. 1e, f, h). Таким образом,домен Nogo-66 является сильным и специфичным для нейронов ингибитором, тогда как внутриклеточный домен Amino-Nogo ингибирует многие клеточные типы и оказывается функциональным только в агрегированном состоянии. Пример 10. Локализация рецептора Nogo. Для дальнейшей характеристики экспрессии белка-рецептора Nogo-66 получали антисыворотку к белку слияния GST-рецептор Nogo. Данной антисывороткой селективно выявляется 85 кДа белок в экспрессирующих рецептор Nogo-66 клетках НЕK293 Т (фиг. 9 а) и специфично окрашиваются клетки COS7, экспрессирующие рецептор Nogo-66 (фиг. 9b). Иммуногистологическое окрашивание культур спинного мозга куриного эмбриона локализует белок в аксонах, что согласуется с опосредованием ингибирования разрастания аксонов, индуцированного Nogo-66. Экспрессия рецептора Nogo-66 не обнаружена в О 4-положительных олигодендроцитах, которые экспрессируют Nogo-66. Иммунореактивный 85 кДа белок экспрессируется в препаратах нейронов из куриных ганглиев дорзальных корешков Е 13, отвечающих на Nogo-66, но в гораздо меньшей степени в слабо отвечающей ткани куриных ганглиев дорзальных корешков Е 7 и куриной сетчатке Е 7 (фиг. 9 а). В общем, характер экспрессии рецептора Nogo-66 соответствует белку, опосредующему ингибирование аксонов за счет Nogo-66. Данное антитело также является эффективным при локализации белка-рецептора Nogo-66 в секциях тканей (фиг. 9 с). В то время, как из гибридизации in situ ясно, что белок экспрессируется во многих классах нейронов, путем иммуногистологии белок выявляется в больших количествах в белом веществе ЦНС, в профилях, соответствующих аксонам. В небольших количествах белок выявляется в телах нейронов и нейропиле. Эти данные предоставляют дальнейшее подтверждение предполагаемого функционирования данного белка при опосредовании взаимодействий с олигодендроцитами. Пример 11. Рецептор Nogo опосредует ответы на Nogo-66. Белок-рецептор Nogo-66 необходим для действия Nogo-66 и не является просто участком связывания с функцией, не относящейся к ингибированию разрастания аксонов. Первым предсказанием этого является то, что обработка фосфоинозитолспецифичной фосфолипазой С (PI-PLC) для удаления с поверхности нейронов, связанных с гликофосфатидилинозитолом (GPI) белков, делает нейроны нечувствительными к Nogo. Данное предсказание остается в силе по отношению к нейронам куриных ганглиев дорзальных корешков Е 13; обработка PI-PLC отменяет как связывание AP-Nogo, так и индуцированныйGST-Nogo-66 коллапс конусов роста (фиг. 10 а-с). В качестве контроля в параллельных культурах обработка PI-PLC не изменяла ответ на Sema3A. Конечно, ожидается, что обработка PI-PLC удаляет некоторое количество белков с поверхности аксонов, так что данный результат оставляет возможность того, что другие связанные с GPI белки опосредуют ответ на Nogo-66 в необработанных культурах. Для демонстрации того, что рецептор Nogo-66 способен опосредовать ингибирование разрастания аксонов за счет Nogo-66, белок экспрессировали в нейронах, лишенных реакции на Nogo-66. Испытывали нейроны ганглиев дорзального корешка и сетчатки из куриных эмбрионов Е 7. Реакции на Nogo в нейронах ганглиев дорзального корешка с данной стадии развития являются слабыми, но в некоторых культурах можно выявить незначительный ответ (данные не показаны). Конусы роста клеток ганглиев сетчатки Е 7 одинаково нечувствительны к индуцированному Nogo-66 коллапсу конусов роста (фиг. 10 е), не связывают AP-Nogo (данные не показаны), и в них не проявляется 85 кДа белок, иммунореактивный с антителами против рецептора Nogo-66 (фиг. 9 а). Экспрессия в данных нейронах NgR путем инфекции рекомбинантными препаратами HSV приводит к появлению у конусов роста клеток ганглиев сетчатки чувствительности к индуцированному Nogo-66 коллапсу. Инфекция контрольным препаратом HSV, экспрессирующим плексин А 1, не изменяет реакции на Nogo. Совместно эти данные означают, что идентифицированный здесь рецептор Nogo участвует в опосредованном Nogo-66 ингибировании реакции аксонов. Пример 12. Структурный анализ рецептора Nogo-66. Структуру рецептора Nogo-66 оценивали путем определения, какой регион опосредует связываниеNogo-66. Данный белок легко разделяется на регион повторов, богатых лейцином, и не содержащий их регион. Анализ делеций ясно показывает, что богатые лейцином повторы требуются для связыванияNogo-66, но оставшаяся часть белка не является необходимой для этого (фиг. 11). В домене богатых лейцином повторов отдельно подвергали делеции два домена. Предсказано, что должна поддерживаться вся структура домена богатых лейцином повторов, и сходный подход применяли для рецептора лейтропина. Очевидно, что связывание Nogo-66 требует наличия всех восьми богатых лейцином повторов, и предпо- 26008480 лагается, что значительный сегмент плоской поверхности формируется линейными бета-листами богатых лейцином повторов. Находящиеся с N- и С-конца от богатых лейцином повторов консервативные богатые цистеином регионы с каждого конца от богатых лейцином повторов также требуются для связывания Nogo-66, по-видимому, они необходимы для формирования подходящей конформации богатого лейцином повтора. Пример 13. Блокада Nogo растворимым белком-эктодоменом рецептора Nogo. Одним из способов блокирования каскада трансдукции сигнала, инициируемого связыванием Nogo66 с рецептором Nogo, является получение избытка растворимого эктодомена рецептора. Секретируемый фрагмент белка-рецептора Nogo продуцировали в клетках НЕK293 Т. кДНК, кодирующую аминокислотные остатки 1-348 мышиного рецептора Nogo, лигировали в эукариотический экспрессионный вектор и данной ДНК трансфицировали клетки НЕK293 Т. Кондиционированная среда от данных клеток содержит высокие концентрации данного фрагмента рецептора Nogo (NgR-экто), что продемонстрировано путем иммуноблотов с антителом против NgR. Кондиционированная среда содержит примерно 1 мг/л белкаNgR-экто. При анализе связывания AP-Nogo добавление кондиционированной среды с NgR-экто к клеткам COS-7, экспрессирующим полноразмерный рецептор Nogo, или к нейронам ганглиев дорзального корешка снижает связывание 0,5 нМ AP-Nogo-66 на 80%. Формирование комплексов между растворимым NgR-экто и Nogo-66 предотвращает связывание с рецепторами клеточной поверхности. В некоторых рецепторных системах такие растворимые комплексы лиганд-рецептор могут блокировать сигнал путем образования неэффективных взаимодействий. Например, растворимый эктодоменTrk служит для блокирования сигнала нейротрофина и широко используется с данной целью (Shelton etal., (1995) J. Neurosci. 15, 477-491). Альтернативно, растворимый комплекс Nogo-66/NgR-экто может связываться и стимулировать предполагаемую вторую трансмембранную субъединицу рецептора Nogo. Имеется предшествующий пример данного типа действия из исследований рецпторов семейства GDNF(Cacalano et al., (1998) Neuron 21, 53-62). Комплекс Nogo-66/NgR-экто не вызывает коллапс конусов роста в тех нейронах (куриные клетки ганглиев сетчастки Е 7), которые не имеют рецептора Nogo-66, но содержат другие компоненты сигнального пути Nogo. Это означает, что NgR-экто функционирует как блокатор сигнала Nogo-66. В прямых тестах белок NgR-экто защищает аксоны от ингибиторных эффектов Nogo-66. NgR-экто предотвращает индуцированный Nogo-66 коллапс конусов роста и блокирует индуцированное Nogo-66 ингибирование разрастания нейритов в куриных нейронах DRG E13 (фиг. 12). Более того, наличие белкаNgR-экто блокирует способность миелина ЦНС ингибировать разрастание аксонов in vitro (фиг. 12). Эти данные демонстрируют, что белок NgR-экто может опосредовать регенерацию аксонов in vivo. Хотя настоящее изобретение описано детально со ссылкой на вышеуказанные примеры, понятно,что могут быть выполнены различные модификации без отклонения от духа изобретения. Соответственно, изобретение ограничено только следующими пунктами. Все цитированные патенты и публикации, на которые ссылается данная заявка, включены сюда в качестве ссылки во всей их целостности. Результаты части описанных здесь экспериментов были опубликованы (GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444) после даты подачи U.S. Provisional Application 60/175707, с которой данная заявка предъявляет право на приоритет, причем данная публикация включена сюда в качестве ссылки во всей целостности.