Новые липазы и их применение

008007 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к недавно идентифицированной полинуклеотидной последовательности,содержащей ген, кодирующий новый липолитический фермент из Aspergillus niger. Признаками настоящего изобретения являются нуклеотидная последовательность нового гена полной длины, кДНК последовательность, содержащая полную длину последовательности, кодирующей новый липолитический фермент, а также аминокислотная последовательность липолитического фермента полной длины и его функциональные эквиваленты. Настоящее изобретение также относится к способам использования этих ферментов в промышленных процессах и способах диагностики грибковых инфекций. В настоящее изобретение также включены клетки, трансформированные полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, и клетки, в которых липолитический фермент согласно настоящему изобретению является генетически модифицированным для усиления активности и/или уровня экспрессии. Сущность изобретения Печеные изделия, такие как хлеб, готовят из теста, которое обычно изготавливают из основных ингредиентов (пшеничной) муки, воды и необязательно соли. В зависимости от печеных изделий другими добавленными ингредиентами могут быть сахар и прочие вкусовые добавки. Для продуктов с применением разрыхлителей, в основном используют хлебопекарные дрожжи наряду с химическими разрыхляющими системами, такими как комбинация кислот (генерирующее соединение) и бикарбонатов. Для улучшения свойств разделки теста и/или конечных свойств печеных изделий осуществляют непрерывные попытки развития вспомогательных веществ обработки с улучшенными свойствами. Вспомогательные вещества обработки в настоящем описании определены как соединения, которые улучшают свойства разделки теста и/или конечные свойства печеных изделий. Свойства теста, которые могут быть улучшены, включают способность механической обработки, способность аккумулировать газ, уменьшенную липкость, эластичность, растяжимость, пластичность и т.д. Свойства печеных изделий, которые могут быть улучшены, включают объем батона, жесткость корочки, текстуру и мягкость хлебного мякиша, привкус, связанный с несвежестью и сроком хранения. Такие вспомогательные вещества, улучшающие обработку теста и/или печеных изделий, можно подразделить на две группы: химические добавки и ферменты (также упоминаемые как хлебопекарные ферменты). Дрожжи, ферменты и химические добавки обычно добавляют в тесто отдельно. Дрожжи могут быть добавлены в виде жидкой суспензии, в прессованном виде или в виде сухих активных (ADY) или сухих неактивных дрожжей (IDY). Различием между такими составами дрожжей является содержание воды и сухого вещества дрожжей. Жидкие дрожжи имеют содержание сухого вещества дрожжей менее чем 25%(веса к объему). Дрожжи в виде пасты имеют содержание сухого вещества дрожжей от 17 до 23% (веса к объему). Прессованные дрожжи имеют содержание сухого вещества дрожжей между 25-35% (веса к объему), в то время как составы сухих дрожжей имеют содержание сухого вещества дрожжей между 92-98%(веса к объему). Ферменты могут быть добавлены в сухом, например гранулированном, виде или в жидком виде. Химические добавки в большинстве случаев добавляют в виде порошка. Также композиции вспомогательных веществ, которые разработаны для специфических применений выпечки, могут быть составлены из специально предназначенных смесей химических добавок и ферментов. Приготовление теста из ингредиентов и вспомогательных веществ, описанных выше, хорошо известно специалистам в данной области техники и содержит смешивание упомянутых ингредиентов и вспомогательных веществ и один или несколько этапов формования и ферментации. Приготовление печеных изделий из такого теста также хорошо известно специалистам в данной области техники и может содержать формование и придание формы и дополнительное брожение теста, с последующей выпечкой при необходимых температурах и времени выпечки. Химические добавки с улучшенными свойствами содержат окисляющие агенты, такие как аскорбиновую кислоту, броматы и азодикарбонаты, восстанавливающие агенты, такие как L-цистеин и глутатион, эмульгаторы, действующие как улучшители свойств теста, такие как эфиры моно- и диглицеридов диацетилвинной кислоты (DATEM), стеароиллактилат натрия (SSL) или стеароиллактилат калия (CSL),или действующие как размягчители хлебного мякиша, такие как моностеарат глицерина (GMS) и т.д.,жирные вещества, такие как триглицериды (жир) или лецитин и др. В результате из-за диктуемой потребителем необходимости замещения химических добавок более натуральными продуктами, разработаны некоторые хлебопекарные ферменты со свойствами, улучшающими тесто и/или печеные изделия, и, которые могут быть использованы во всевозможных комбинациях,в зависимости от специфических условий применения выпечки. Подходящие ферменты включают ферменты, разрушающие крахмал, ферменты, разрушающие арабиноксилан и другую гемицеллюлозу, ферменты, разрушающие целлюлозу, ферменты окисления, ферменты, расщепляющие жирные вещества,ферменты, разрушающие, модифицирующие или сшивающие белки. Ферментами, разрушающими крахмал, являются, например, ферменты, действующие внутри, такие как альфа-амилаза, мальтогенная амилаза, пуллуланаза, или другие ферменты расщепления разветвленной структуры, и ферменты, действующие снаружи, которые расщепляют до глюкозы (амилоглюкозидаза), мальтозы (бета-амилаза), мальтотриозы, мальтотетрозы и более высокие олигосахариды.-1 008007 Ферментами, разрушающими арабиноксилан- и другую гемицеллюлозу, являются, например, ксиланазы, пентозаназы, гемицеллюлаза, арабинофуранозидаза, глюконаза и др. Ферментами, разрушающими целлюлозу, являются, например, целлюлаза, целлобиогидролаза и бета-глюкозидаза. Ферментами окисления являются, например, глюкозооксидаза, гексозооксидаза, пиранозоксидаза,сульфгидрил-оксидаза, липоксигеназа, лакказа, полифенолоксидаза и др. Ферментами, расщепляющими жирные вещества, являются, например, липолитические ферменты,такие как триацилглицероллипазы, фосфолипазы (такие как A1, А 2, В, С и D) и галактолипазы. Ферментами, разрушающими, модифицирующими или сшивающими белки, являются, например,эндопротеазы (серинпротеазы, металлопротеазы, аспартилпротеазы, тиолпротеазы), экзопептидазы, которые расщепляют до одной аминокислоты или дипептида, трипептида и т.д. с N-терминального (аминопептидазы) или С-терминального (карбоксипептидазы) концов полипептидной цепи, ферменты, разрушающие глутамин или аспарагины, такие как деамидаза и пептидоглутаминаза, или сшивающие ферменты, такие как трансглютаминаза. Хлебопекарные ферменты как правило могут производиться микроорганизмами. Микробные хлебопекарные ферменты являются доступными из различных источников; Bacillus spec. являются обычным источником ферментов бактерий, несмотря на то, что ферменты грибов обычно производят Aspergillusspec. Хлебопекарные ферменты могут быть использованы в многообразии хлебопекарных изделий. Термин "хлебопекарные изделия" в настоящем описании определен как содержащий хлебные изделия, такие как хлеб, батоны хлеба, французский батон, а также булочки, пирожные, пирожки, горячая сдоба, пончики из дрожжевого и недрожжевого теста и т.п. В процессах, упомянутых выше, существует преимущество использования хлебопекарных ферментов, которые получены при помощи ДНК-рекомбинантных технологий. Такие рекомбинантные ферменты имеют некоторые преимущества перед традиционно очищенными аналогами. Рекомбинантные ферменты могут быть созданы по низкой себестоимости, с высоким выходом, свободными от загрязняющих агентов, подобных бактериям или вирусам, а также свободными от бактериальных токсинов или других загрязняющих ферментативных активностей. Задача изобретения Задачей настоящего изобретения является предоставление новых полинуклеотидов, кодирующих новые липолитические ферменты с улучшенными свойствами. Дополнительной задачей является предоставление липолитических ферментов, продуцируемых естественным путем и рекомбинантным способом, а также рекомбинантных штаммов, их продуцирующих. Также частью настоящего изобретения являются слитые полипептиды, а также способы создания и использования полинуклеотидов и полипептидов согласно настоящему изобретению. Задачей настоящего изобретения также является предоставление новых липолитических ферментов,которые решают по меньшей мере одну из вышеупомянутых проблем или предоставляют новые липолитические ферменты, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств при использовании в тесте и/или печеных изделиях, выбранных из группы увеличенной прочности теста, увеличенной эластичности теста, увеличенной стабильности теста, уменьшенной черствости теста, улучшенной растяжимости теста,улучшенной способности теста к механической обработке, увеличенного объема печеного изделия,улучшенной структуры хлебного мякиша печеного изделия, улучшенной мягкости печеного изделия,улучшенного вкуса печеного изделия, улучшенной устойчивости к черствлению печеного изделия,улучшенного цвета печеного изделия, улучшенной корки печеного изделия или которые имеют особенность хлебного субстрата. Сущность изобретения Настоящее изобретение предоставляет новые полинуклеотиды, кодирующие новые липолитические ферменты. Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет полинуклеотиды, имеющие нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется предпочтительно при условиях высокой жесткости с последовательностью, выбранной из группы, состоящую из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14,16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38. Следовательно, изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, которые являются более чем на 40%, такие как примерно 60%, предпочтительно 65%,более предпочтительно 70%, даже более предпочтительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичными последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: l, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13,14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38. В более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет такие выделенные полинуклеотиды, получаемые из мицельных грибов, в частности Aspergillus niger является предпочтительным. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24,27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов.-2 008007 В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет ген липолитического фермента, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31,34 и 37. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, предпочтительно кДНК,кодирующую липолитический фермент Aspergillus niger, чью аминокислотную последовательность выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или варианты или фрагменты такого полипептида. В предпочтительном варианте осуществления кДНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 и 38 или их функциональных эквивалентов. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, содержащий кодирующую последовательность полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, причем предпочтительной является полинуклеотидная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 и 38. Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим полинуклеотидную последовательность согласно настоящему изобретению, и праймерам, зондам и фрагментам, которые могут быть использованы для амплификации или обнаружения ДНК согласно настоящему изобретению. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления предоставляют вектор, в котором полинуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению является функционально связанной с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии кодируемой аминокислотной последовательности в подходящей клетке хозяина, такой как Aspergillus niger или Aspergillusoryzae. Настоящее изобретение также предоставляет способы приготовления полинуклеотидов и векторов согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантно продуцируемым клеткам хозяина, которые содержат гетерологичные или гомологичные полинуклеотиды согласно настоящему изобретению. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет рекомбинантные клетки хозяина, в которых экспрессия липолитического фермента согласно настоящему изобретению существенно увеличена или в которых увеличена активность липолитического фермента. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет клетку хозяина продуцируемую рекомбинантным способом, которая содержит гетерологичный или гомологичный полинуклеотид согласно настоящему изобретению и, где клетка способна продуцировать функциональный липолитический фермент согласно настоящему изобретению, предпочтительно клетка способна к чрезмерной экспрессии липолитического фермента согласно настоящему изобретению, например штамм Aspergillus,содержащий увеличенное количество копий гена или кДНК в настоящем изобретении. В еще одном аспекте настоящего изобретения предоставлен очищенный полипептид. Полипептиды согласно настоящему изобретению включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительным является полипептид, выбранный из группы,состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов. Следовательно, в одном из аспектов настоящее изобретение предоставляет композицию липолитического фермента, содержащую в качестве активного ингредиента фермент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения печеных изделий, в котором в тесто включены используемые для изготовления печеных изделий один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов. Слитые белки, содержащие полипепти, согласно настоящему изобретению также находятся в объеме настоящего изобретения. Настоящее изобретение также предоставляет способы получения полипептидов согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к использованию липолитического фермента согласно настоящему изобретению в любом промышленном процессе как изложено в настоящем описании. Осуществление изобретения Липолитический фермент определен в настоящем описании как фермент, проявляющий себя, по меньшей мере, как один, а предпочтительно два, или три, или четыре, или более из следующих липолитических активностей: триацилглицерол липазы, фосфолипазы A1, фосфолипазы A2, фосфолипазы В,фосфолипазы С, фосфолипазы D, лизофосфолипазы и галактолипазы. Полинуклеотиды Настоящее изобретение представляет нуклеотиды, кодирующие липолитические ферменты, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12,-3 008007 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов. Последовательности семи генов,кодирующих липолитические ферменты NBE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034,NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 и NBE042 соответственно были определены путем секвенирования геномных клонов, полученных из Aspergillus niger. Настоящее изобретение представляет полинуклеотидные последовательности, содержащие гены, кодирующие липолитические ферментыNBE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043,NBE045 и NBE042, а также их полные последовательности кДНК и их кодирующие последовательности(табл. 1). Следовательно, настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, содержащим нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8,10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 или их функциональных эквивалентов. Таблица 1 Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, гибридизуемому в жестких условиях, предпочтительно в условиях высокой жесткости, в полинуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29,31, 32, 34, 35, 37 и 38. Преимущественно, такие полинуклеотиды могут быть получены из мицельных грибов, в частности из Aspergillus niger. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38. Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полинуклеотида, имеющего аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов. Как используется в настоящем описании, термины "ген" и "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которая включает открытую рамку считывания, кодирующую белок, например, липолитический фермент Aspergillus niger. Ген может включать в себя кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Более того, ген относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании. Молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, такая как молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2,4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 или их функциональных эквивалентов, может быть выделена с использованием стандартных техник молекулярной биологии и информации последовательностей, предоставленной настоящим описанием. Например, используя всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1,2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 в качестве гибридизационного зонда, молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут быть выделены-4 008007 с использованием стандартных техник гибридизации и клонирования (например, как описано уLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Более того, молекула нуклеиновой кислоты, охватывающая всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23,25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38, может быть выделена полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, разработанных на основании информации о последовательности, содержащейся в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы,состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35,37 и 38. Нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК, мРНК или, в качестве альтернативы, геномной ДНК, в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров согласно стандартным техникам ПЦР амплификации. Нуклеиновая кислота,амплифицированная таким образом, может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована при помощи анализа последовательности ДНК. Более того, олигонуклеотиды, соответствующие или гибридизуемые с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему изобретению, могут быть приготовлены при помощи стандартных техник синтеза, например, используя автоматизированный ДНК синтезатор. В одном из предпочтительных вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:2. Последовательность SEQ ID NO:2 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, представленного в SEQ ID NO:1. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE028Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:3. Во втором предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:5. Последовательность SEQ ID NO:5 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:4. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE029Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:6. В третьем предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:8. Последовательность SEQ ID NO:8 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:7. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE030Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:9. В четвертом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ IDNO:11. Последовательность SEQ ID NO:11 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger,предоставленного в SEQ ID NO:10. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептидNBE031 Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:12. В пятом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:14. Последовательность SEQ ID NO:14 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:13. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE032Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:15. В шестом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:17. Последовательность SEQ ID NO:17 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:16. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE033,Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:18. В седьмом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:20. Последовательность SEQ ID NO:20 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:19. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE034Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:21. В восьмом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:23. Последовательность SEQ ID NO:23 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:22. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE034Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:24. В девятом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:265. Последовательность SEQ ID NO:26 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:25. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE034Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:27. В десятом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:29. Последовательность SEQ ID NO:29 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger, предоставленного в SEQ ID NO:28. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NBE034Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:30. В одиннадцатом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ IDNO:32. Последовательность SEQ ID NO:32 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger,предоставленного в SEQ ID NO:31. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептидNBE034 Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:33. В двенадцатом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ IDNO:35. Последовательность SEQ ID NO:35 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger,предоставленного в SEQ ID NO:34. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептидNBE034 Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:36. В тринадцатом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ IDNO:38. Последовательность SEQ ID NO:38 соответствует области кодирования гена Aspergillus niger,предоставленного в SEQ ID NO:37. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептидNBE034 Aspergillus niger, как показано в SEQ ID NO:39. В другом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14,16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 или функциональных эквивалентов таких нуклеотидных последовательностей. Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна другой нуклеотидной последовательности, является молекулой, которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности так, что она может гибридизоваться с другой нуклеотидной последовательностью, таким образом, образуя стабильный дуплекс. Один из аспектов настоящего изобретения имеет отношение к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид настоящего изобретения или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также к молекулам нуклеиновых кислот,достаточным для использования в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид настоящего изобретения, и к фрагментам таких молекул нуклеиновых кислот, подходящих для использования в качестве праймеров ПЦР для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот. "Выделенный полинуклеотид" или "выделенная нуклеиновая кислота" представляет собой ДНК или РНК, которая не является непосредственно граничащей с обеими кодирующими последовательностями, с которыми она непосредственно граничит (одна на 5' и одна на 3' концах) в природном геноме организма, из которого получена. Таким образом, в одном из вариантов осуществления выделенная нуклеиновая кислота включает в себя несколько или все 5' некодирующие (например, промотор) последовательности, которые непосредственно примыкают к кодирующей последовательности. Следовательно, термин включает в себя, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует как отдельная молекула (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученной при помощи ПЦР или обработкой рестрикционными эндонуклеазами) независимо от других последовательностей. Она также включает в себя рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, который является по существу свободным от клеточного вещества, вирусного вещества или культуральной среды (при продуцировании ДНК при помощи ДНК-рекомбинантных техник), или химических предшественников, или других химических веществ (при химическом синтезе). Более того, "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" является фрагментом нуклеиновой кислоты, который не является природным, как фрагмент, и не может быть найден в природном состоянии. Как используются в настоящем описании, термины "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" включают в себя молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, созданные с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно, является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов олигонуклеотидов или производных (например, нуклеотидов инозина или фосфоротиоата). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для приготовления нуклеиновых кислот, которые имеют измененные способности спаривания оснований, или увеличенную устойчивость к нуклеазам. Другой вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой к молекуле нуклеиновой кислоты согласно настоя-6 008007 щему изобретению. Также включенными в объем настоящего изобретения являются комплементарные нити молекул нуклеиновых кислот, изложенные в настоящем описании. Ошибки секвенирования Информацию о последовательности, представленную в настоящем описании, не следует толковать настолько узко, чтобы не требовать включения ошибочно идентифицированных оснований. Определенные последовательности, раскрытые в настоящем описании, могут быть легко использованы для выделения полного гена из мицельных грибов, в частности Aspergillus niger, который, в свою очередь, может быть легко подвергнут дополнительному анализу последовательности, таким образом, идентифицируя ошибки секвенирования. Если не оговорено иное, все нуклеотидные последовательности, определенные путем секвенирования молекулы ДНК, в настоящем описании определены с использованием автоматизированного ДНК секвенатора, и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодированные молекулами ДНК,определенными в настоящем описании, были предсказаны при помощи трансляции последовательности ДНК, определенной как упомянуто выше. Следовательно, как известно в данной области техники, для любой последовательности ДНК, определенной при помощи такого автоматизированного способа, любая нуклеотидная последовательность, определенная в настоящем описании, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные при помощи автоматов, обычно являются по меньшей мере на примерно 90% идентичными, более обычно по меньшей мере от примерно 95% до по меньшей мере примерно 99,9% идентичными реальной нуклеотидной последовательности молекулы секвенированной ДНК. Реальная последовательность может быть более точно определена при помощи других способов, включающих в себя способы секвенирования ДНК вручную, хорошо известные в данной области техники. Как известно в данной области техники, единичная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности по сравнению с реальной последовательностью может вызвать сдвиг рамки при трансляции нуклеотидной последовательности таким образом, что предсказанная аминокислотная последовательность, кодированная определенной нуклеотидной последовательностью,может полностью отличаться от аминокислотной последовательности, действительно кодируемой молекулой секвенированной ДНК, начиная с точки такой вставки или делеции. Специалист в данной области техники способен идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как откорректировать такие ошибки. Фрагменты нуклеиновых кислот, зонды и праймеры Молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ IDNO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38, например фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий часть белка, согласно настоящему изобретению. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена липолитического фермента и кДНК, позволяет создавать зонды и праймеры, разработанные для использования при идентификации и/или клонировании других членов семейства липолитических ферментов, а также гомологов липолитического фермента из других видов. Зонд/праймер обычно содержит по существу очищенный олигонуклеотид, который обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется предпочтительно в условиях высокой жесткости до, по меньшей мере, примерно 12 или 15, предпочтительно примерно 18 или 20, предпочтительно примерно 22 или 25, более предпочтительно примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75, или более следующих друг за другом нуклеотидов нуклеиновой последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ IDNO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 или их функциональных эквивалентов. Зонды, основанные на нуклеотидных последовательностях, предоставленных в настоящем описании, могут быть использованы для обнаружения транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих одни и те же или гомологичные белки, например, в других организмах. В предпочтительных вариантах осуществления зонд дополнительно содержит группу-метку, прикрепленную к нему, например, группа-метка может быть радиоизотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Такие зонды также могут быть использованы в качестве части набора диагностического теста для идентификации клеток, которые экспрессируют липолитический ферментативный белок. Идентичность и гомология Термины "гомология" или "процент идентичности" в настоящем описании используются взаимозаменяемо. Для цели настоящего изобретения в настоящем описании определено, что для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности совмещают с целью оптимального сравнения (например, могут быть введены пробелы в последовательность первой аминокислоты или последовательность нуклеиновой кислоты для оптимального совмещения со второй последовательностью амино- или нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают остатки аминокислоты или нуклеотиды в соответствующих позициях аминокислоты или позициях нуклеотидов. Если позиция в первой последовательности занята таким же остатком аминокислоты или нуклеотида, как соответствующая позиция второй последовательности, то мо-7 008007 лекулы являются идентичными в этой позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных позиций, присутствующих в двух последовательностях(т.е. % идентичности=количество идентичных позиций/общее количество позиций (т.е. перекрывающихся позиций) х 100). Предпочтительно, две последовательности имеют одинаковую длину. Специалисту в данной области техники известен факт, что некоторые различные компьютерные программы являются пригодными для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может сопровождаться использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют, используя алгоритм Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970, который встроен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного на http://www/gcg.com),используя либо матрикс Blossom 62, либо матрикс РАМ 250, и вес пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту в данной области техники очевидно, что все указанные различные параметры могут приводить к незначительно различающимся результатам, но что общий процент идентичности двух последовательностей значимо не изменяется при использовании разных алгоритмов. В другом варианте осуществления процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием GAP программы в пакете программного обеспечения GCG(доступного на http://www/gcg.com) , используя матрикс NWSgapdna.CMP и вес пробела 40, 50, 60, 70 или 80 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеотидов определяют с использованием алгоритма Е. Meyers and W.Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989, который встроен в ALIGN программу(версия 2,0) (доступный на: http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi), используя таблицу весов остатков РАМ 120, штраф длины пробела 12 и штраф пробела 4. Последовательности нуклеиновых кислот и белков настоящего изобретения дополнительно могут быть использованы в качестве "последовательности-запроса" для выполнения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие типы поиска могут быть выполнены с использованием программ BLASTN и BLASTX(версия 2,0) Altschul и др. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. BLAST поиски нуклеотидов могут быть выполнены программой BLASTN, объем=100, длина слова=12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам PLP03 нуклеиновых кислот настоящего изобретения. BLAST поиски белков могут быть выполнены BLASTX программой, объем=50, длина слова=3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам PLP03 настоящего изобретения. Для получения совмещений, содержащих пробелы, с целью сравнения, может быть использована GappedBLAST, описанная Altschul и др. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут быть применены параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTN и BLASTX). См. http://www.ncbi.nim.nih.gov. Гибридизация Как используется в настоящем описании, термин "гибридизация" предназначен для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно от 85 до 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичные друг другу обычно остаются гибридизованными друг с другом. Предпочтительным, не ограничивающим примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6 х растворе хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) при примерно 45 С, с последующей одной или двумя промывками в 1-кратном SSC, 0,1% SDS при 50 С, предпочтительно при 55 С, предпочтительно при 60 С, даже более предпочтительно при 65 С. Условия высокой жесткости включают в себя, например, гибридизацию при 68 С в 5-кратномSSC/5-кратном растворе Денхарда/1,0% SDS и промывкой в 0,2-кратном SSC/0,1% SDS при комнатной температуре. В качестве альтернативы промывка может быть выполнена при 42 С. Специалисту в данной области техники известно, какие условия применяются в жестких и условиях высокой жесткости гибридизации. Дополнительным руководством относительно таких условий является легко доступное в данной области техники, например, в Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; и Ausubel и др. (eds.), 1995, Current Protocols in MolecularBiology, (John WileySons, N.Y.). Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли(А) последовательностью (такой как 3' терминальный поли(А) участок мРНК), или с комплементарным фрагментом Т (U) остатков, не может быть включен в полинуклеотид настоящего изобретения, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, поскольку такой нуклеотид будет гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей фрагмент поли(А) или комплементарный ему (например, практически любой клон двухцепочечной ДНК).-8 008007 Получение ДНК полной длины из других организмов В обычном подходе кДНК библиотеки конструируют из других организмов, например, мицельных грибов, в частности может быть проведен скрининг из видов Aspergillus. Например, штаммы Aspergillus могут быть скринированы для гомологичных полинуклеотидов Нозерн-блот анализом. При обнаружении транскриптов, гомологичных полинуклеотидам согласно настоящему изобретению, кДНК библиотеки могут быть сконструированы из РНК, выделенной из подходящего штамма с использованием стандартных техник, хорошо известных специалистам в данной области техники. В качестве альтернативы может быть скринирована полная библиотека геномной ДНК с использованием зонда, гибридизуемого с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению. Гомологичные последовательности генов могут быть выделены, например, путем выполнения ПЦР с использованием двух пулов праймеров вырожденных олигонуклеотидов, разработанных на основе нуклеотидных последовательностей в качестве примера настоящего описания. Матрицей для реакции может быть кДНК, полученная при помощи обратной транскрипции мРНК,приготовленной из штаммов известных или предполагаемых как экспрессирующие полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для гарантии, что амплифицированные последовательности представляют собой последовательности новой PLP03 последовательности нуклеиновой кислоты или ее функциональный эквивалент. Затем может быть использован ПЦР фрагмент для выделения кДНК клона полной длины при помощи множества известных способов. Например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга бактериофага или космидной кДНК библиотеки. В качестве альтернативы,может быть использован меченый фрагмент для скрининга геномной библиотеки. Технология ПЦР может быть использована для выделения последовательностей кДНК полной длины из других организмов. Например, РНК может быть выделена следующими ниже стандартными процедурами из подходящего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть выполнена на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного для наибольшего 5' конца амплифицированного фрагмента для праймирования первого стандартного синтеза. Полученный в результате гибрид РНК/ДНК затем может быть "терминирован" (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции терминальной трансферазы, гибрид может быть расщеплен РНКазой Н, и затем может быть праймирован вторым стандартным синтезом (например, поли-С праймером). Таким образом, последовательности кДНК выше амплифицированного фрагмента могут быть легко выделены. Для обзора пригодных стратегий клонирования см., например, Sambrook и др., указаного выше; и Ausubel и др., указанного выше. Векторы Другой аспект настоящего изобретения имеет отношение к векторам, предпочтительно векторам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок согласно настоящему изобретению или его функциональный эквивалент. Как используется в настоящем описании, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединена. Один тип вектора является "плазмидой", которая относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть вшиты дополнительные ДНК сегменты. Другой тип вектора является вирусным вектором, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть вшиты в вирусный геном. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный источник репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируют в геном клетки хозяина при введении в клетку хозяина, и таким образом, реплицируют в направлении генома хозяина. Более того, некоторые векторы способны к направленной экспрессии генов, к которым они оперативно присоединены. Такие векторы относятся в настоящем описании к "векторам экспрессии". В общем случае, векторы экспрессии, полезные в рекомбинантных техниках ДНК, часто находятся в виде плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем описании, поскольку плазмида является наиболее обычно используемой формой вектора. Однако настоящее изобретение включает в себя другие формы векторов экспрессии,такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с поврежденной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые служат эквивалентным функциям. Рекомбинантные векторы экспрессии настоящего изобретения содержат нуклеиновую кислоту настоящего изобретения в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке хозяина, что означает, что рекомбинантный вектор экспрессии включает в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных из оснований клеток хозяина, предназначенных для экспрессии, которые оперативно связываются с нуклеиновой последовательностью, предназначенной для экспрессии. В пределах рекомбинантного вектора экспрессии "эффективно связанный" предназначен для обозначения,что интересующая нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(последовательностями) способом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в in vitro системе транскрипции/трансляции или в клетке хозяина, если вектор введен в клетку хозяина). Термин "регуляторная последовательность" включает в себя промоторы, энхансеры и-9 008007 другие элементы управления экспрессией (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают в себя такие,которые управляют конститутивной или индуцируемой экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток хозяина, и такими, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в некоторых клетках хозяина (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам в данной области техники будет очевидно, что разработка вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, предназначенной для трансформации, уровня экспрессии желаемого белка и т.п. Векторы экспрессии настоящего изобретения могут быть введены в клетку хозяина, таким образом, для продуцирования белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, как изложено в настоящем описании (например, липолитических ферментов, мутированных липолитических ферментов, их фрагментов, вариантов или их функциональных эквивалентов, слитых белков и т.п.). Рекомбинантные векторы экспрессии настоящего изобретения могут быть разработаны для экспрессии липолитических ферментов в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белок согласно настоящему изобретению может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как Е.coli и Bacillus species, клетках насекомых (с использованием векторов экспрессии бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Соответствующие клетки хозяина дополнительно обсуждены в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990). В качестве альтернативы рекомбинантный вектор экспрессии может быть транскрибирован и транслирован in vitro, например, с использованием Т 7 регуляторных последовательностей промотора и Т 7 полимеразы. Векторы экспрессии, пригодные в настоящем изобретении, включают хромосомные, эписомные и вирусные векторы, например, векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофага, эписомы дрожжей, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы,полученные из их комбинаций, таких как полученные из плазмиды и генетических элементов бактериофага, таких как космиды и фагемиды. Вставка ДНК должна быть оперативно связана с подходящим промотором, таким как PL промотор лямбда фага, lac E.coli, промоторы trp и tac, SV40 ранний и поздний промоторы и промоторы LTR ретровируса, что приведено в качестве некоторых примеров. Специалисту в данной области техники хорошо известны другие подходящие промоторы. В определенном варианте осуществления промоторы предпочтительно являются такими, которые способны управлять высоким уровнем экспрессии липолитических ферментов в мицельных грибах. Такие промоторы известны в данной области техники. Конструкции экспрессии могут содержать сайты инициации транскрипции, терминации, а в транскрибируемых областях - сайт связывания с рибосомой для трансляции. Часть кодирования зрелых транскриптов, экспрессируемых при помощи конструкции, включает в себя AUG, инициирующий трансляцию, в начале и кодон терминации, расположенный соответственно в конце полипептида, предназначенного для трансляции. Вектор ДНК может быть введен в прокариотические или эукариотические клетки посредством обычных техник трансформации или трансфекции. Как использовано в настоящем описании, термины"трансформация" и "трансфекция" предназначены для обозначения различных техник, известных в данной области техники, для введения чужой нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку хозяина,включающую в себя преципитацию фосфатом кальция или хлоридом кальция, DEAE-декстранопосредованную трансфекцию, трансдукцию, инфекцию, липофекцию, трансфекцию с катионными липидами, или электропорацию. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток хозяина могут быть найдены в Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold SpringMethods in Molecular Biology (1986) и в других лабораторных руководствах. Для стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от используемых вектора экспрессии и техники трансфекции, только небольшая фракция клеток может интегрировать чужую ДНК в свой геном. Для идентификации и отбора таких интегрантов, обычно в клетки хозяина вместе с интересующим геном вводят ген, кодирующий селектируемый маркер (например, устойчивый к антибиотикам). Предпочтительные селектируемые маркеры включают такие, которые предоставляют устойчивость к лекарственным веществам, таким как G418, гигромицин и метатриксат. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, предпочтительно вводят в клетку хозяина на тот же самый вектор, который кодирует белок согласно настоящему изобретению или могут ввести на отдельный вектор. Клетки, стабильно трансфецируемые введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы при помощи отбора лекарственным препаратом (например, клетки, которые имеют встроенный ген селектируемого маркера, будут выживать, в то время как другие клетки вымрут). Экспрессию белков в прокариотах часто осуществляют в векторах Е. coli, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, управляющие экспрессией либо слитых, либо неслитых белков.- 10008007 Слитые векторы добавляют некоторое количество аминокислот в белок, кодируемый ими, например, к амино концу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы обычно служат для трех целей: 1) для увеличения экспрессии рекомбинантного белка; 2) для увеличения растворимости рекомбинантного белка; и 3) с целью очистки рекомбинантного белка путем воздействия в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто, в слитых векторах экспрессии сайт протеолитического расщепления вводят в место соединения слитой группы и рекомбинантного белка для возможного отделения рекомбинантного белка от слитой группы после очистки слитого белка. Такие ферменты, и их родственные узнаваемые последовательности, включают в себя фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Как указано, векторы экспрессии предпочтительно могут содержать селектируемые маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолат редуктазу или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток и устойчивость к тетрацилину или ампициллину для культивирования в Е. coli и других бактериях. Представленные примеры подходящих хозяев включают в себя бактериальные клетки, такие как Е. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки насекомых, таких как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как СНО, COS и меланомы Bowes; и клетки растений. Подходящие культуральные среды и условия для выше описанных клеток хозяина известны специалистам в данной области техники. Среди векторов предпочтительными для использования в бактериях являются pQE70, pQE60 иPQE-9, доступные от Qiagen; pBS векторы, Phagescript векторы, Bluescript векторы, pNH8A, pNH16A,pNH18A, pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia. Среди предпочтительных эукариотических векторов - PWLNEO pSV2CAT pOG44 pZTl иpSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Другие подходящие векторы могут быть легко очевидными для специалистов в данной области техники. Известные бактериальные промоторы для использования в настоящем изобретения включают в себя lacI и lacZ промоторы Е.coli, T3 и Т 7 промоторы, gpt промотор, лямбда PR, PL промоторы и tpr промотор, промотор тимидин киназы HSV, SV40 ранние и поздние промоторы, LTR промоторы ретровируса,такого как вируса саркомы Рауса ("RSV"), промоторы металлотионина, такие как промотор металлотионина-I мыши. Вставка энхансерной последовательности в вектор может увеличить транскрипцию ДНК, кодирующую полипептиды настоящего изобретения у высших эукариот. Энхансеры являются цисдействующими элементами ДНК, обычно примерно от 10 до 300 п.н., которые действуют для увеличения транскрипционной активности промотора в данном типе клетки хозяина. Примеры энхансеров включаютSV40 энхансер, который расположен на дальней по отношению к началу репликации стороне на от п.н. 100 до 270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на дальней по отношению к началу репликации стороне и энхансеры аденовирусов. Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в пространство периплазмы или в окружающую среду вне клетки, в эспрессируемый полипептид может быть вставлен подходящий сигнал секреции. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут быть гетерологичными сигналами. Полипептид может быть экспрессирован в модифицированном виде, таком как слитый белок, и может включать в себя не только сигналы секреции, а также дополнительные гетерологичные функциональные области. Таким образом, например, область дополнительных аминокислот, частично измененных аминокислот, может быть добавлена к N-концу полипептида для улучшения стабильности и персистенции в клетке хозяина, во время очистки или во время последующей обработки и хранения. Также для облегчения очистки к полипептиду могут быть добавлены пептидные группы. Полипептиды согласно настоящему изобретению Настоящее изобретение представляет выделенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, аминокислотную последовательность, получаемую путем экспрессии полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 34,35, 37 и 38 в подходящем хозяине. Также пептид или полипептид, содержащий функциональный эквивалент выше указанных полипептидо, включен в настоящее изобретение. Выше указанные полипептиды совместно включены в термин "полипептиды согласно настоящему изобретению". Термины "пептид" и "олигопептид" считаются синонимами (что является общепризнанным) и каждый термин может быть использован взаимозаменяемо, как требуется по контексту, для указания цепи,по меньшей мере, из двух аминокислот, связанных пептидными связями. Слово "полипептид" используется в настоящем описании для цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и пептидов в настоящем описании написаны слева направо и в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Однобуквенный код аминокислот, используемый в настоящем описании, обычно известен специалистам в данной области техники и может быть найден вSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Под "выделенным" полипептидом или белком подразумевается полипептид или белок, удаленный- 11008007 из его естественного окружения. Например, рекомбинантно продуцируемые полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках хозяина, считаются выделенными для цели настоящего изобретения, поскольку являются природными или рекомбинантными полипептидами, которые были по существу очищены любым подходящим способом, таким как, например, способ одноэтапной очистки, описанный в Smith иJohnson, Gene 67:31-40 (1988) . Липолитический фермент согласно настоящему изобретению может быть восстановлен и очищен из рекомбинантных клеточных культур при помощи хорошо известных способов, включающих в себя преципитацию сульфатом аммония или спиртом, экстракцию кислотой, анион- или катион-обменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий,афинную хроматографию, хроматографию с гидроксиапатитом и хроматографию на лектине. Наиболее предпочтительно для очистки используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии(ВЭЖХ). Полипептиды настоящего изобретения включают очищенные естественным путем продукты, продукты способов химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными техниками от прокариотического или эукариотического хозяина, включающего, например, бактериальные дрожжевые клетки, клетки высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от используемого хозяина в способе получения рекомбинанта полипептиды настоящего изобретения могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Дополнительно, полипептиды настоящего изобретения могут также включать исходно модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях, как результат процессов опосредованных хозяином. Липолитический фермент согласно настоящему изобретению может быть преимущественно использован в хлебопекарных процессах. Количество фермента, которое должно быть добавлено в тесто,определяют эмпирически. Это может зависеть от качества используемой муки, степени улучшения, которая требуется, вида хлеба или печеных изделий, способа приготовления теста, пропорции других ингредиентов и т.д. Фрагменты белков Отличительными особенностями настоящего изобретения являются биологически активные фрагменты полипептидов согласно настоящему изобретению. Биологически активные фрагменты полипептида согласно настоящему изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, в достаточной степени идентичные или полученные из аминокислотной последовательности липолитического фермента (например, аминокислотная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27,30, 33, 36 и 39), которая включает в себя меньше аминокислот, чем белок полной длины, и проявляет по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего белка полной длины. Обычно биологически активные фрагменты содержат домен или основу по меньшей мере одной с активностью соответствующего белка полной длины. Биологически активный фрагмент белка согласно настоящему изобретению может быть полипептидом, который, например, представляет собой в длину 10, 25, 50, 100 или более аминокислот. Более того, другие биологически активные части, в которых удалены другие области белка, могут быть приготовлены при помощи рекомбинантных техник и оценены для одной или более биологических активностей природной формы полипептида настоящего изобретения. Отличительными особенностями настоящего изобретения также являются фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют выше описанные биологически активные фрагменты липолетического ферментативного белка. Слитые белки Белки настоящего изобретения или их функциональные эквиваленты, например, их биологически активные части, могут быть эффективно присоединены к нелиполитическому ферментативному полипептиду (например, гетерологичные аминокислотные последовательности) для образования слитых белков. Как используется в настоящем описании, "химерный белок" или "слитый белок" липолитического фермента содержит липолитический ферментативный белок, оперативно связанный с нелиполитическим ферментативным белком. "Липолитический ферментативный полипептид" относится к полипептиду,имеющему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6,9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, тогда как "нелиполитический ферментативный полипептид" относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является по существу гомологичным липолитическому ферменту, например, белку, который отличается от липолитического фермента и который получен из того же самого или другого организма. В липолитическом ферментативном слитом белке липолитический ферментативный полипептид может соответствовать всему или части липолитического ферментативного белка. В предпочтительном варианте осуществления липолитический ферментативный слитый белок содержит по меньшей мере один биологически активный фрагмент липолитического ферментативного белка. В другом предпочтительном варианте осуществления липолитический ферментативный слитый белок содержит по меньшей мере две биологически активные части липолитического ферментативного белка. В слитом белке термин "эффек- 12008007 тивно связанный" предназначен для обозначения того, что липолитический ферментативный полипептид и нелиполитический ферментативный полипептид соединены друг с другом с сохранением рамки считывания. Нелиполитический ферментативный полипептид может быть присоединен к N-концу или С-концу липолитического ферментативного полипептида. Например, в одном из вариантов осуществления слитый белок является GST липолитическим ферментативным слитым белком, в котором липолитическая ферментативная последовательность присоединена к С-концу GST последовательности. Такие слитые белки могут облегчить очистку рекомбинантного липолитического фермента(ферментов). В другом варианте осуществления слитый белок является липолитическим ферментативным белком, содержащим гетерологичную сигнальную последовательность наN-конце. В некоторых клетках хозяина (например, клетках хозяина млекопитающих и дрожжей) экспрессия и/или секреция липолитического фермента может быть увеличена путем использования гетерологичной сигнальной последовательности. В другом примере gp67 секреторная последовательность белка оболочки бакуловируса может быть использована в качестве гетерологичной сигнальной последовательности (Current Protocols in MolecularBiology, Ausubel и др., John WileySons, 1992). Другие примеры гетерологичной сигнальной последовательности эукариот включают в себя секреторные последовательности мелиттина и плацентарной алкалин фосфатазы человека (Stratagene; La Jolla, Калифорния). В еще одном примере пригодные гетерологичные сигнальные последовательности прокариот включают в себя phoA секреторный сигнал (Sambrook и др., указанный выше) и секреторный сигнал протеина A (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey). Сигнальная последовательность может быть использована для облегчения секреции и выделения белка или полипептида настоящего изобретения. Сигнальная последовательность обычно характеризуется кором гидрофобных аминокислот, которые обычно отрезаются от белка во время секреции за одно или несколько отрезаний. Такие сигнальные пептиды содержат сайты процессинга, которые позволяют отрезать сигнальную последовательность от созревших белков, пока они проходят путь секреции. Сигнальная последовательность управляет секрецией белка, такого как из эукариотической клетки хозяина, в которую трансформируют вектор экспрессии, и сигнальная последовательность последовательно или одновременно отрезается. Затем белок может быть быстро очищен от внеклеточной среды при помощи известных в данной области техники способов. В качестве альтернативы, сигнальная последовательность может быть присоединена к интересующему белку с использованием последовательности, которая легко очищается, к такой как с GST доменом. Таким образом, например, последовательность, кодирующая полипептид, может быть слита с последовательностью маркера, такой как последовательность, кодирующая пептид, который облегчает очистку слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления такого аспекта настоящего изобретения последовательность маркера является пептидом гексагистидина,таким как tag, предоставляемый в pQE векторе (Qiagen, Inc), который является одним из многих, которые коммерчески доступны. Как описано в Gentz и др., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:821-824 (1989), например,гексагистидин предоставлен для обычной очистки слитого белка. Например, НА метка является другим пептидом, пригодным для очистки, который соответствует эпитопу полученного белка гриппа гемаглютинина, который описан Wilson и др., Cell 37:767 (1984). Предпочтительно химерный или слитый белок настоящего изобретения получают при помощи стандартных ДНК-рекомбинантных техник. Например, ДНК фрагменты, кодирующие различные полипептидные последовательности, соединены вместе с сохранением рамки считывания согласно обычным техникам, например, путем использования тупых или выступающих концов для сшивки, расщепления рестриктазами для обеспечения подходящих концов, соответственно заполнения липких концов, обработки алкалин фосфатазой для исключения нежелательных соединений и ферментативной сшивки. В другом варианте осуществления слитый белок может быть синтезирован обычными способами, включающими в себя автоматизированные ДНК синтезаторы. В качестве альтернативы, ПЦР амплификация генных фрагментов может быть осуществлена с использованием праймеров якорей, которые повышают комплементарность выступов между двумя последовательными генными фрагментами, которые затем могут быть гибридизованы и снова амплифицированы для создания химерной генной последовательности (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel и др. John WileySons: 1992). Более того, многие векторы экспрессии являются коммерчески доступными, которые уже кодируют слитые компоненты (например, GST полипептид). Липолитические нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент, могут быть клонированы в такие векторы экспрессии из условия, чтобы слитый компонент являлся связанным с сохранением рамки считывания с липолитическим ферментативным белком. Функциональные эквиваленты Термины "функциональные эквиваленты" и "функциональные варианты" используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК, кодирующей липолитический фермент, являются выделенными фрагментами ДНК, которые кодируют полипептид, проявляющий конкретную функцию липолитического фермента Aspergillus niger, как изложено в настоящем описании. Функциональный эквивалент липолитического ферментативного полипептида согласно настоящему изобретению является полипептидом, который проявляет по меньшей мере одну функцию липолитического фермента Aspergillus niger, как изложено в настоящем описании. Следовательно, функциональные экви- 13008007 валенты также охватывают активные фрагменты. Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или замен, вставок или делеций несущественных аминокислот. Следовательно, несущественная аминокислота является остатком, который может быть замещен в аминокислотных последовательностях, выбранных из группы, состоящей изSEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 без существенных изменений биологической функции. Например, считается, что аминокислотные остатки, которые сохранены среди липолитических ферментативных белков настоящего изобретения, являются особенно устойчивыми к изменениям. Помимо этого, аминокислоты, сохраненные среди липолитических ферментативных белков согласно настоящему изобретению и других липолитических ферментов, не являются легко подверженными изменению. Термин "защитная замена" предназначен для обозначения такой замены, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим такую же боковую цепь. Такие семейства известны в данной области техники и включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями(например, лизин, аргинин и гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспартановая кислота,глутаминовая кислота), боковыми цепями с неизмененной полярностью (например, глицин, аспарагины,глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин,лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-ответвленными боковыми цепями(например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Функциональные эквиваленты нуклеиновых кислот обычно могут содержать молчащие мутации или мутации, которые не изменяют биологическую функцию кодируемого полипептида. Следовательно,настоящее изобретение предоставляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие липолитические ферментативные белки, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые не являются существенными для конкретной биологической активности. Такие липолитические ферментативные белки различаются в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 все еще сохраняя по меньшей мере одну биологическую активность. В одном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем белок содержит по существу гомологичную аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39. Например, руководство, относительно того, как создавать фенотипически молчащие аминокислотные замены, предоставлено в Bowie, J.U. и др., Science 247:1306-1310 (1990), в котором авторы указывают, что существует два основных подхода для изучения толерантности аминокислотной последовательности к изменению. Первый способ относится к процессу эволюции, в котором мутации являются либо допускаемыми, либо отбракованными естественным отбором. Второй подход использует генетическую инженерию для введения аминокислотных изменений в определенных позициях клонированного гена и отбирает или проводит скрининг для идентификации последовательностей, которые поддерживают функциональность. Как утверждают авторы, такие исследования установили, что белки являются удивительно толерантными аминокислотными веществами. Дополнительно авторы указали, какие изменения являются возможными, чтобы быть разрешенными в некоторых позициях белка. Например, для большинства внутренних аминокислотных остатков требуются неполярные боковые цепи, тогда как некоторые признаки поверхностных боковых цепей, как правило, сохраняются. Другие такие фенотипически молчащие замены описаны в Bowie и др., указанный выше, и ссылках упомянутых в настоящем описании. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, гомологичный белку, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 может быть создана путем введения одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности (табл. 1) таким образом, что одну или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок вводят в кодируемый белок. Такие мутации могут быть введены стандартными техниками, такими как сайт-направленный мутагенез и мутагенез при помощи ПЦР. Термин "функциональные эквиваленты" также охватывает ортологи липолитических ферментовAspergillus niger, предоставленных в настоящем описании. Ортологи липолитических ферментов Aspergillus niger являются белками, которые могут быть выделены из других штаммов или видов и обладают похожей или идентичной биологической активностью. Такие ортологи могут быть легко идентифицированы, как содержащие аминокислотную последовательность, которая по существу гомологична аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24, 27, 30, 33, 36 и 39. Как определено в настоящем описании, термин "по существу гомологичный" относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минималь- 14008007 ное количество идентичных или эквивалентных (например, с такой же боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности таким образом, что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, имеющий примерно 60%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70, даже более предпочтительно 75, 80, 85, 90, 95,96, 97, 98 или 99% идентичность или более, определены в настоящем описании как достаточно идентичные. Также, нуклеиновые кислоты, кодирующие другие члены семейства липолитических ферментов,которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17,19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 находятся в объеме настоящего изобретения. Более того, нуклеиновые кислоты, кодирующие липолитические ферментативные белки из других видов, которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17,19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 находятся в объеме настоящего изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие вариантам (например, природные аллельные варианты), и гомология полинуклеотидов настоящего изобретения могут быть выделены, основываясь на их гомологии с нуклеиновыми кислотами, раскрытыми в настоящем описании, с использованием кДНК,раскрытой в настоящем описании, или ее подходящего фрагмента, в качестве гибридизационного зонда согласно стандартным гибридизационным техникам предпочтительно в условиях высокой жесткости гибридизации. Дополнительно к природным аллельным вариантам последовательностей Aspergillus niger, предоставленным в настоящем описании, специалистам в данной области техники будет очевидно, что изменения могут быть введены при помощи мутации в нуклеотидных последовательностях, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32,34, 35, 37 и 38, таким образом, приводя к изменениям в аминокислотной последовательности липолитического ферментативного белка без существенных изменений функции этого белка. В другом аспекте настоящего изобретения представляют улучшенные липолитические ферменты. Улучшенные липолитичекие ферменты являются белками, в которых по меньшей мере одна биологическая активность является улучшенной. Такие белки могут быть получены путем случайного введения мутаций во всей или части последовательности, кодирующей липолитический фермент, таким как мутагенез, и полученные в результате мутации могут быть рекомбинантно экспрессированы, и скринированы для биологической активности. Например, в существующем уровне техники имеются способы стандартного анализа для измерения ферментативной активности биологических ферментов и, таким образом, с легкостью могут быть выбраны улучшенные белки. В предпочтительном варианте осуществления липолитический фермент имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33,36 и 39. В другом варианте осуществления липолитический фермент является по существу гомологичным аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12,15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, еще отличается аминокислотной последовательностью вследствие естественного изменения или мутагенеза,как описано выше. В дополнительном варианте осуществления липолитический фермент имеет аминокислотную последовательность, кодируемую при помощи выделенного фрагмента нуклеиновой кислоты, способного к гибридизации с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8,10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 предпочтительно при условиях высокой жесткости гибридизации. Следовательно, липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3,6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39. Более конкретно, липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 75, 80, 85,90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQID NO: 9, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 18, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 21, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98,99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 24, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 27, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 33, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQID NO: 36, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 39. Функциональные эквиваленты белка согласно настоящему изобретению также могут быть идентифицированы, например, при помощи комбинаторных библиотек скрининга мутантов, например мутантов процессинга, белка настоящего изобретения для активности липолитического фермента. В одном из вариантов настоящего изобретения создают смешанную библиотеку вариантов путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот. Смешанная библиотека вариантов может быть получена, например, ферментативной сшивкой смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательностях генов таким образом, что вырожденный набор потенциальных белковых последовательностей экспрессируют как отдельные полипептиды, или в качестве альтернативы, как набор больших слитых белков (например,для обнаружения фага). Существуют различные способы, которые могут быть использованы для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов настоящего изобретения из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны специалистам в данной области техники (см., например, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura и др. (1984) Ann.Rev. Biochera. 53:323; Itakura и др. (1984) Science 198:1056; Ike и др. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Дополнительно, библиотеки фрагментов кодирующих последовательностей полипептидов настоящего изобретения могут быть использованы для создания смешанной популяции полипептидов для скрининга последовательностей вариантов. Например, библиотека фрагментов кодирующих последовательностей может быть создана путем обработки двухнитевого ПЦР фрагмента интересующей кодирующей последовательности нуклеазой в условиях, при которых происходит однонитевой разрыв только примерно один раз на молекулу, денатурируя двухнитевую ДНК, ренатурируя ДНК для образования двунитевой ДНК, которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из различных продуктов с однонитевым разрывом, удаляя однонитевые части из снова образованных дуплексов путем обработки S1 нуклеазой, и сшивая полученную в результате библиотеку фрагментов в вектор экспрессии. При помощи такого способа может быть получена библиотека экспрессии, которая кодирует N-концевые и внутренние фрагменты разных размеров белка настоящего изобретения. В данной области техники известны некоторые способы для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, созданных при помощи точечных мутаций процессинга, и для скрининга кДНК библиотек для генных продуктов, имеющих выбранное свойство. Наиболее широко используемые способы,которые обеспечивают высокую производительность анализа, для скрининга больших генных библиотек обычно включают в себя клонирование генной библиотеки в реплицируемые векторы экспрессии,трансформацию подходящих клеток полученной в результате библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых обнаружение желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был обнаружен. Мутагенез рекурентного множества (REM),техника, которая усиливает частоту функциональных мутаций в библиотеках, может быть использован в сочетании с анализом скрининга для идентификации разновидностей белка настоящего изобретения(Arkin и Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave и др. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331). Специалистам в данной области техники очевидно, что полиморфизм последовательности ДНК, который может приводить к изменениям в аминокислотной последовательности липолитического фермента, может существовать внутри данной популяции. Такой генетический полиморфизм может существовать в клетках из разных популяций или внутри популяции вследствие природного аллельного варианта. Аллельные варианты также могут включать функциональные эквиваленты. Фрагменты полинуклеотидов согласно настоящему изобретению также могут содержать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут работать как зонды или праймеры для ПЦР реакции. Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению безотносительно, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применение молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения, которые не кодируют полипептиды, имеющие липолитическую ферментативную активность, включают, между прочим, (1) выделение гена, кодирующего липолитический ферментативный белок, или его аллельные варианты из библиотеки кДНК, например, из других организмов, а не из Aspergillus niger; (2) гибридизацию in situ (например, FISH) для митофазных хромосомных препаратов для обеспечения точного хромосомного положения гена липолитического фермента,как описано в Verma и др., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Нью Йорк(1988); (3) Нозерн-блот анализ для обнаружения экспрессии мРНК липолитического фермента в определенных тканях и/или клетках и (4) зонды или праймеры, которые могут быть использованы в качестве диагностического инструмента для анализа наличия нуклеиновой последовательности, гибридизуемой с зондом липолитического фермента в данном биологическом (например, ткани) образце. Также охваченным настоящим изобретением является способ получения функционального эквивалента гена или кДНК, кодирующих липолитический фермент. Такой способ определяет порядок получения меченного зонда, который включает в себя выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю или часть последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24,27, 30, 33, 36 и 39, или их варианты; проведение скрининга библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты меченным зондом в условиях, которые позволяют гибридизацию настоящего зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты в библиотеке, таким образом образуя дуплексы нуклеиновых кислот, и приготовление последовательности гена полной длины из фрагментов нуклеиновой кислоты в любом меченном дуплексе для получения гена, имеющего отношение к липолитическому ферменту. В одном из вариантов настоящего изобретения нуклеиновая кислота настоящего изобретения является, по меньшей мере, на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2,4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38, или их дополнения. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения полипептид настоящего изобретения является по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичным аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9,12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39. Клетки хозяина Отличительной особенностью в другом варианте настоящего изобретения являются клетки, например, трансформированные клетки хозяина или рекомбинантные клетки хозяина, которые содержат нуклеиновые кислоты, охваченные настоящим изобретением. "Трансформированная клетка" или "рекомбинантная клетка" является клеткой, в которую (или в предшественника которой) введена, при помощи ДНК-рекомбинантных техник, нуклеиновая кислота настоящего изобретения. Включены как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактериальные, грибные, дрожжевые и т.п., особенно предпочтительными являются клетки из мицельных грибов, более конкретно Aspergillus niger. Клетка хозяина может быть выбрана таким образом, чтобы модулировать экспрессию интересующих последовательностей, или модификации и процессы генного продукта в определенной, желаемой форме. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, разрезание) белковых продуктов можно облегчить оптимальным функционированием белка. Различные клетки хозяина имеют характерные и определенные механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы хозяина, хорошо знакомые специалистам в данной области молекулярной биологиии/или микробиологии, могут быть выбраны с гарантией желательной и правильной модификации и процессинга экспрессии чужеродного белка. С этой целью могут быть использованы эукариотические клетки хозяина, которые обладают клеточным механизмом подходящего процессинга первичной транскрипции, гликолизирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки хозяина хорошо известны в данной области техники. Клетки хозяина также включают, но не ограничивают, линии клеток млекопитающих, такие как СНО, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3 Т 3, WI38 и линии клеток хориоидного сплетения.- 17008007 При желании полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть продуцированы при помощи стабильно трансфецируемой клеточной линии. Некоторые векторы, подходящие для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, являются доступными, способы для конструирования клеточных линий также являются хорошо известными, например в Ausubel и др. (указанный выше). Антитела Дополнительной особенностью настоящего изобретения являются антитела, такие как моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связывают липолитические ферментативные белки согласно настоящему изобретению. Как используется в настоящем описании, термин "антитело" (Аb) или "моноклональное антитело"(Mab) включает в себя интактные молекулы, а также фрагменты антител (таких как, например, фрагменты Fab и F(ab')2), которые способны специфически связываться с липолитическим ферментативным белком. Фрагменты Fab и F(ab')2 не имеют Fc фрагмента интактного антитела, более быстро выводятся из кровообращения и могут иметь меньшее неспецифично-тканевое связывание интактного антитела (Wahl и др., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983. Таким образом, такие фрагменты являются предпочтительными. Антитела настоящего изобретения могут быть приготовлены любым из множества способов. Например, клетки, экспрессирующие липолитический ферментативный белок или его антигенный фрагмент, могут быть введены в животное, чтобы вызвать продуцирование сыворотки, содержащей поликлональные антитела. В предпочтительном способе препарат липолитического ферментативного белка готовят и очищают, чтобы предоставить его по существу свободным от природных загрязнений. Такой препарат затем вводят в животное для продуцирования поликлональных антисывороток более высокой специфичной активности. В наиболее предпочтительном способе антитела настоящего изобретения являются моноклональными антителами настоящего изобретения (или их фрагментами, связывающимися с липолитическим ферментативным белком). Такие моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием технологии гибридомы (Kohler и др., Nature 256:495 (1975); Kohler и др., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976);Hammerling и др., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsiever,N.Y., стр. 563-681 (1981. В общем случае, такие процедуры включают в себя иммунизацию животного (предпочтительно мышь) антигеном липолитического ферментативного белка или клеткой, экспрессирующей липолитический ферментативный белок. Спленоциты таких мышей экстрагируют и сливают с подходящей клеточной линией миеломы. Может быть использована любая подходящая линия клеток миеломы согласно настоящему изобретению; однако предпочтительна для использования родительская линия клеток миеломы(SP2O), доступная из американской коллекции типов культур, Rockville, Мэрилэнд. После слияния полученные в результате клетки гибридомы избирательно поддерживают в среде HAT и затем клонируют путем предельного разбавления, как описано Wands и др. (Gastro-enterology 80: 225-232 (1981. Клетки гибридомы, полученные путем такого отбора, затем анализируют для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные к связыванию антигена липолитического ферментативного белка. В общем случае, полипептиды могут быть соединены с белком носителем, таким как KLH, как описано вAusubel и др., указанный выше, смешены с адъювантом и инъецированы в млекопитающее хозяина. Более конкретно, различные животные хозяева могут быть иммунизированы путем инъекции интересующего полипептида. Примеры подходящих животных хозяев включают кроликов, мышей, морских свинок и крыс. Могут быть использованы различные адьюванты для увеличения иммунологического ответа, в зависимости от вида хозяина включающие в себя, без ограничений, адъювант Фрейнда (полный и неполный), адьювантные минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, поверхностно-активные полиолы, полианионы, пептиды, масляные имульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол, BCG (бацилла Калметта-Герена) и Corynebacteriumparvum. Поликлональные антитела являются гетерогенными популяциями молекул антител, полученных из сывороток иммунизированных животных. Такие антитела могут быть любым классом иммуноглобулина, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любым его подклассом. Гибридомы, продуцирующие mAbs настоящего изобретения, могут быть культивированы in vitro или in vivo. После продуцирования поликлональные или моноклональные антитела тестируют для специфического определения белка согласно настоящему изобретению или его функционального эквивалента иммуноанализом, таким как Вестерн-блот или анализ иммунопреципитации с использованием стандартных техник, например, как описано в Ausubel и др., указанный выше. Антитела, которые специфически связываются с белком согласно настоящему изобретению или его функциональным эквивалентом, являются пригодными в настоящем изобретении. Например, такие антитела могут быть использованы в иммуноанализе для обнаружения белка согласно настоящему изобретению в патогенных или непатогенных штаммах Aspergillus (например, в Aspergillus extracts). Предпочтительно, антитела настоящего изобретения продуцируют, используя фрагменты белка согласно настоящему изобретению, который проявляет себя как антигенный, при помощи критерия, такого как высокая частота измененных остатков. Например, такие фрагменты могут быть созданы при помощи- 18008007 стандартных техник ПЦР и затем клонированы в pGEX вектор экспрессии (Ausubel и др., указанный выше). Затем слитые белки могут быть экспрессированы в Е. coli и очищены с использованием матрикса сродства с глутатион агарозой, как описано в Ausubel и др., указанный выше. При желании некоторые(например, два или три) слияния могут быть созданы для каждого белка, и каждое слияние может быть инъецировано по меньшей мере в двух крыс. Антисыворотка может быть увеличена путем серий инъекций, обычно включающих в себя по меньшей мере три бустер-инъекции. Обычно антисыворотки исследуют на их способность к иммунопреципитации белка согласно настоящему изобретению или его функциональных эквивалентов, тогда как неродственные белки могут быть полезными в качестве контроля на специфичность иммунной реакции. В качестве альтернативы, техники, описанные для продуцирования одноцепочечных антител (патенты США 4946778 и 4704692), могут быть адаптированы для продуцирования одноцепочечных антител к белку согласно настоящему изобретению или его функциональных эквивалентов. Наборы для создания и скрининга библиотек обнаружения фага являются коммерчески доступными, например, от Pharmacia. Дополнительно, примеры способов и реагентов, особенно пригодных для использования при создании и скрининге библиотеки обнаружения антител, могут быть найдены, например, в патенте США 5223409; заявке РСТ WO92/18619; заявке РСТ WO91/17271, заявке РСТ WO20791; заявке РСТHum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse и др. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffits и др. (1993) EMBO J. 12: 725-734. Поликлональные и моноклональные антитела, которые специфично связываются с белком настоящего изобретения или его функциональными эквивалентами, например, могут быть использованы для обнаружения экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению или его функциональные эквиваленты, например, в другом штамме Aspergillus. Например, белок согласно настоящему изобретению может быть быстро обнаружен при обычном иммуноанализе клеток Aspergillus или экстрактах. Примеры подходящего анализа включают в себя, без ограничений, Вестерн-блоттинг, ELISA,радиоиммунный анализ и т.п. Под "специфически связывает" имеется в виду, что антитело узнает и связывает конкретный антиген, например, белок согласно настоящему изобретению, но не предназначен по существу для узнавания и связывания других неродственных молекул в образце. Антитела могут быть очищены, например, при помощи способов аффинной хроматографии, в которых антиген полипептида иммобилизуют на смоле. Антитело, направленное против полипептида настоящего изобретения (например, моноклональное антитело), может быть использовано для выделения полипептида стандартными техниками, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Помимо этого, такое антитело может быть использовано для обнаружения белка (например, в клеточном лизате или супернатанте клеток) для оценки большого количества и образца экспрессии полипептида. Антитела также могут быть использованы диагностически для контролирования уровней белка в клетках или ткани в качестве части процедуры клинического тестирования, например, для, к примеру, определения эффективности данного режима обработки или при диагностике Aspergillosis. Обнаружение может быть облегчено путем присоединения антитела к обнаружимому веществу. Примеры обнаружимых веществ включают в себя различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают в себя пероксидазу хрена, алкалин фосфатазу, галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают в себя умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоционат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, хлорид дансила или фикоэритрин; пример подходящего люминесцентного вещества включает в себя люминол; примеры подходящих биолюминесцентных веществ включают в себя луциферазу, луциферин и акворин, примеры подходящих радиоактивных веществ включают в себя 125I, 131I, 35S или 3 Н. Предпочтительные эпитопы, охваченные антигенными пептидами, являются областями, которые размещены на поверхности белка, например, гидрофильные области. Точки гидрофобности белка настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации гидрофильных областей. Антигенный пептид белка настоящего изобретения содержит 7 (предпочтительно 10, 15, 20 или 30) следующих друг за другом аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, и охватывает эпитоп белка таким образом, что антитело против белка образовывало специфический иммунный комплекс с белком. Предпочтительные эпитопы, охваченные антигенным белком, являются областями белка настоящего изобретения, которые расположены на поверхности белка, например, гидрофильные области, гидрофобные области, альфа области, бета области, кольцевые области, измененные области и гибкие области.- 19008007 Иммуноанализ Качественное или количественное определение полипептида согласно настоящему изобретению в биологическом образце можно проводить с использованием любого хорошо известного в данной области техники способа. Техники, основанные на антителах, обеспечивают ряд преимуществ для анализа уровней определенного полипептида в биологическом образце. В связи с этим, специфическое узнавание обеспечивают при помощи первичного антитела (поликлонального или моноклонального), но система вторичного обнаружения может использовать флуоресцентные, ферментативные или другие связанные вторичные антитела. В результате получают иммунокомплекс. Следовательно, изобретение представляет способ для диагностирования, инфицирован ли определенный организм Aspergillus, содержащий этапы, на которых выделяют биологический образец из упомянутого организма, подозреваемого в том, что он инфецирован Aspergillus; проводят реакцию упомянутого образца с антителом согласно настоящему изобретению; определяют, образовался ли иммунокомплекс. Ткани также могут быть экстрагированы, например мочевиной и нейтральным детергентом, для выделения белка для Вестерн-блоттинга или дот/слот блотов. Такая техника также может быть применима для жидкостей тела. Другие способы, основанные на антителах, пригодные для определения белка согласно настоящему изобретению, включают в себя иммуноанализ, такой как связанный с ферментом иммуносорбент(ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). Например, моноклональные антитела к белку согласно настоящему изобретению могут быть использованы как в качестве иммуносорбента, так и в качестве зонда, меченного ферментом, для обнаружения и качественного определения белка согласно настоящему изобретению. Количество белка, присутствующего в образце, может быть вычислено по количеству, присутствующему в стандартном препарате, используя компьютерный алгоритм линейной регрессии. В другом анализеELISA могут быть использованы два вида разных специфических моноклональных антител для обнаружения в биологической жидкости белка согласно настоящему изобретению. В таком анализе одно из антител используют в качестве иммуно-абсорбента, а другое в качестве зонда, меченого ферментом. Выше описанные техники могут быть проведены как "одноэтапное" или "двухэтапное" исследование. "Одноэтапное" исследование включает контактирование белка согласно настоящему изобретению с иммобилизованным антителом и, без промывки, контактирование смеси с меченым антителом. "Двухэтапное" исследование включает промывку перед контактированием смеси с меченым антителом. Другие обычные способы могут быть использованы, соответственно. Обычно желательно иммобилизовать один компонент системы анализа на подложке, таким образом, позволяя другим компонентам системы войти в контакт с компонентом и быть легко извлеченными из образца. Подходящие ферментативные метки включают, например, метки из группы оксидаз, которые катализируют продуцирование перекиси водорода путем реакции с субстратом. Активность оксидазной метки может быть проанализирована путем измерения концентрации перекиси водорода, образованного реакцией антитело, меченное ферментом/субстрат. По сравнению с ферментами, другие подходящие метки включают в себя радиоизотопы, такие как йод (126I, 125I), углерод (14 С), серу (35S), тритий (3 Н), индий (112In) и технеций (99mТс) и флуоресцентные метки, такие как флуоресцин, родамин и биотин. Специфическое связывание вещества теста с белком согласно настоящему изобретению может быть обнаружено, например, in vitro путем обратимой и необратимой иммобилизации белка согласно настоящему изобретению на субстрате, например, поверхности лунки 96-луночного микротитровального планшета из полистирола. Способы иммобилизации полипептидов и других небольших молекул хорошо известны в данной области техники. Например, микротитровальные планшеты могут быть покрыты белком согласно настоящему изобретению путем добавления белка в раствор (обычно, концентрацией от 0,05 до 1 мг/мл в объеме 1-100 мкл) в каждую лунку, и инкубирования планшетов при комнатной температуре до 37 С в течение от 0,1 до 36 ч. Белки, которые не связались с планшетом при комнатной температуре, могут быть удалены путем встряхивания избытка раствора из планшета, и затем промывкой планшета (один раз или неоднократно) водой или буфером. Обычно белок содержат в воде или буфере. Затем планшет промывают буфером, который не имеет связанного белка. Для блокирования на планшете свободных участков, связывающих белок, планшеты блокируют белком, который не является родственным связанному белку. Например, являются подходящими 300 мкл альбумина бычьей сыворотки (BSA) при концентрации 2 мг/мл в Трис-HCl. Подходящие субстраты включают такие субстраты, которые содержат определенные химические соединения с поперечными сшивками (например, пластиковые субстраты, такие как полистироловые, стироловые или полипропиленовые субстраты из Corning Costar Corp.(Cambridge, MA), например). При желании в качестве субстрата могут быть использованы частицы в виде шариков, например шарообразная агароза или шарообразная сефароза. Связывание вещества теста с полипептидами согласно настоящему изобретению может быть обнаружено любым из множества способов, известных в данной области техники. Например, в иммуноанали- 20008007 зе может быть использовано специфическое антитело. При желании, антитело может быть меченым (например, флуоресцентно или радиоизотопом) и сразу обнаружено (см., например, West и McMahon, J. CellBiol. 74:264, 1977). В качестве альтернативы, для обнаружения может быть использовано второе антитело (например, меченое антитело, которое связывает Fc часть анти-АN97 антитела). При альтернативном способе обнаружения метят белок согласно настоящему изобретению, и обнаруживают метку (например,при помощи мечения белка согласно настоящему изобретению радиоизотопом, флуорофором, хромофором или т.п.). В еще одном способе белок согласно настоящему изобретению продуцируют как слитый белок с белком, который может быть визуально обнаружен, например, зеленым флуоресцентным белком(который может быть обнаружен под УФ светом). В альтернативном способе белок согласно настоящему изобретению может быть ковалентно связан с ферментом, имеющим обнаружимую ферментативную активность, или слит с ним, таким как пероксидаза хрена, алкалин фосфатаза, альфа-галактозидаза или глюкозооксидаза. Гены, кодирующие все эти ферменты, клонированы и легко доступны для использования специалистами в данной области техники. При желании, слитый белок может включать в себя антиген, и такой антиген может быть обнаружен и измерен поликлональным или моноклональным антителом, используя обычные способы. Подходящие антигены включают в себя ферменты (например, пероксидазу хрена, алкалин фосфатазу и альфа-галактозидазу) и неферментативные полипептиды (например,белки сыворотки, такие как BSA и глобины, и молочные белки, такие как казеины). Эпитопы, антигены и иммуногены В другом аспекте настоящее изобретение представляет пептид или полипептид, содержащий часть,несущую эпитоп, полипептида настоящего изобретения. Эпитоп такой части полипептида является иммуногенным или антигенным эпитопом полипептида настоящего изобретения. "Иммуногенный эпитоп" определен как часть белка, которая вызывает ответ антитела, если весь белок является иммуногеном. Предполагается, что такие иммуногенные эпитопы должны быть ограничены некоторыми локусами на молекуле. С другой стороны, область белковой молекулы, к которой может присоединиться антитело,определен как "антигенный эпитоп". Количество иммуногенных эпитопов белка обычно меньше, чем количество антигенных эпитопов. См., например, Geysen, H.M. и др. Proc. Natl. Acad. Sci. США 81:39984002 (1984). В отношении выбора пептидов или полипептидов, несущих антигенный эпитоп (т.е. такое содержание области молекулы белка, с которой может связаться антитело), специалистам в данной области техники хорошо известно, что относительно короткие синтетические пептиды, которые имитируют часть последовательности белка, способны обычным способом активировать антисыворотку, которая реагирует с частично имитированным белком. См., например, Sutcliffe, J.G. и др. Science 219:660-666 (1984). Пептиды, способные активировать сыворотки, реагирующие с белком, зачастую представлены в первичной последовательности белка, могут быть охарактеризованы при помощи набора правил химических образцов, и не ограничены ни иммунодоминантными областями интактных белков (т.е. иммуногенными эпитопами), ни аминными или карбоксильными концами. Пептиды, которые являются чрезвычайно гидрофобными, и пептиды шести или менее остатков обычно являются неэффективными при индуцировании антител, которые связываются с имитированным белком; более длинные растворимые пептиды, особенно такие, которые содержат остатки пролина, обычно являются эффективными. Sutcliffe и др., указанный выше, на 661. Например, 18 из 20 пептидов, разработанных согласно таким рекомендациям, содержащие 8-39 остатков, покрывающих 75% цепи полипептида гемагглютинина HAI вируса гриппа,стимулировали антитела, которые прореагировали с НА 1 белком или интактным вирусом; и 12/12 пептидов из MuLV полимеразы и 18/18 из гликопротеина вируса бешенства стимулировали антитела, которые преципитировали соответствующие белки. Следовательно, пептиды и полипептиды, несущие антигенный эпитоп, настоящего изобретения пригодны для индуцирования антител, включающих в себя моноклональные антитела, которые связываются специфически с полипептидом настоящего изобретения. Таким образом, высокое соотношение гибридов, полученных слиянием клеток селезенки от донора, иммунизированного пептидом, несущим эпитоп антигена, как правило, секретируют антитело, реагирующее с природным белком. Sutcliffe и др.,указанный выше, на 663. Антитела, индуцированные пептидами, несущими антигенный эпитоп, или полипептиды являются пригодными для обнаружения имитированного белка, а антитела к различным пептидам могут быть использованы для отслеживания судьбы различных областей предшественника белка,который подвергнут процессингу после трансляции. Пептиды и антитела к пептидам могут быть использованы во множестве количественных или качественных исследований имитированного белка, например,в сравнительном анализе, так как показано, что даже короткие пептиды (например, около 9 аминокислот) могут связываться и замещать большие пептиды в анализе иммунопреципитации. См., например, Wilson,I.A. и др. Cell 37:767-778 на 777 (1984). Антитела к пептидам настоящего изобретения также являются пригодными для очистки имитированного белка, например, путем адсорбционной хроматографии, используя способы, хорошо известные в данной области техники. Пептиды и полипептиды, несущие антигенный эпитоп, настоящего изобретения, разработанные согласно выше описанным рекомендациям, предпочтительно содержат последовательность по меньшей мере семь, более предпочтительно по меньшей мере девять и наиболее предпочтительно по меньшей- 21008007 мере от примерно 15 до примерно 30 аминокислот, находящихся внутри аминокислотной последовательности полипептида настоящего изобретения. Однако пептиды или полипептиды, содержащие большую часть аминокислотной последовательности полипептида настоящего изобретения, содержащие от примерно 30 до примерно 50 аминокислот, или любую длину до, включая всю аминокислотную последовательность полипептида настоящего изобретения, также считаются пептидами или полипептидами настоящего изобретения, несущими эпитоп, и также являются пригодными для стимулирования антител,которые реагируют с имитированным белком. Предпочтительно аминокислотную последовательность пептида, несущего эпитоп, выбирают для обеспечения существенной растворимости в водных растворителях (т.е. последовательность включает в себя относительно гидрофильные остатки, а высоко гидрофобные последовательности предпочтительно устраняют); и последовательности, содержащие остатки пролина, являются особенно предпочтительными. Пептиды и полипептиды настоящего изобретения, несущие эпитоп, могут быть продуцированы при помощи любого обычного способа создания пептидов или полипептидов, включая рекомбинантные способы, использующие молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Например, короткая аминокислотная последовательность, несущая эпитоп, может быть слита с более большим полипептидом,который действует в качестве носителя во время продуцирования и очистки рекомбинанта, а также во время иммунизации для продуцирования антител к пептиду. Пептиды, несущие эпитоп, также могут быть синтезированы с использованием известных способов химического синтеза. Например, Houghten описал простой способ синтеза большого количества пептидов, таких как 10-20 мг 248 различных пептидов из 13 остатков, представляющих собой единичные варианты аминокислот сегмента НАI полипептида, который приготовили и охарактеризовали (при помощи исследований, связывающих ELISA тип) менее чем за четыре недели. Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad.Sci. США 82:5131-5135 (1985). Такой процесс "одновременного синтеза множества пептидов (SMPS)" дополнительно описан в патенте США 4631211 Houghten и др. (1986). В этой процедуре отдельные смолы для синтеза в твердой фазе различных пептидов содержат в отдельных пакетах, проницаемых для растворителя, способствующих оптимальному использованию многих идентичных повторяющихся этапов,включенных в твердофазные способы. Полностью ручная процедура позволяет проводить одновременно 500-1000 или более синтезов.Houghten и др., указанный выше, на 5134. Пептиды и полипептиды настоящего изобретения, несущие эпитоп, используют для индуцирования антител согласно способам, хорошо известным в данной области техники. См., например, Sutcliffe и др.,указанный выше; Wilson и др., указанный выше; Chow, М. и др., Proc. Natl. Acad. США 82:910-914; иBittle, F.J. и др. J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985). Обычно животные могут быть иммунизированы свободными пептидами; однако может быть усилен титр антител к белку путем присоединения пептида к носителю-макромолекуле, такому как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или столбнячный анатоксин. Например, пептиды, содержащие цистеин,могут быть соединены с носителем с использованием линкера, такого как малеимидобензоил-Nгидроксисукцинимидовый эфир (MBS), в то время как другие пептиды могут быть соединены с носителем с использованием более обычного связывающего агента, такого как глутаральдегид. Животных, таких как кролики, крысы и мыши, иммунизируют либо свободными, либо связанными с носителем пептидами, например при помощи интраперитонеального и/или интрадермального введения инъекции эмульсии, содержащей примерно 100 мкг пептида или белка-носителя и адъюванта Фрейнда. Для некоторых инъекций может потребоваться повторная иммунизация, например, с интервалом в две недели, для обеспечения пригодного титра антитела к белку, который может быть обнаружен, например,при помощи ELISA анализа с использованием свободного белка, адсорбированного на твердой поверхности. Титр антител к белку в сыворотке из иммунизированного животного может быть увеличен путем отбора антител к пептиду, например, путем адсорбции пептида на твердой подложке и элюции отобранных антител согласно способам, хорошо известным в данной области техники. Иммуногенные пептиды настоящего изобретения, несущие эпитоп, т.е. такие части белка, которые вызывают ответ антитела, когда весь белок является иммуногеном, идентифицируют согласно способам,хорошо известным в данной области техники. Например, у Geysen и др., 1984, указанный выше, раскрыта процедура быстрого конкурентного синтеза на твердых подложках сотен пептидов достаточной очистки для реакции в исследовании иммуносорбента, подобного ферменту. Взаимодействие синтезированных пептидов с антителами затем легко обнаруживают без удаления их с подложки. В таком способе пептиды, несущие иммуногенный эпитоп желаемого белка, могут быть просто идентифицированы специалистом в данной области техники. Например, иммунологически важный эпитоп в белке оболочки вируса ящура был локализован Geysen и др. анализом нескольких аминокислот при помощи синтеза покрывающего набора всех 208 возможных гексапептидов, покрывающих полностью 213 аминокислотную последовательность белка. Затем был синтезирован полный набор замещений пептидов, в котором все 20 аминокислот были заменены, в свою очередь, в каждой позиции эпитопа и были определены конкретные аминокислоты, представляющие специфичность для реакции с антителом. Таким образом, пептиды, аналоги пептидов, несущих эпитоп, настоящего изобретения могут быть без затруднения созданы таким- 22008007 способом. Патент США 4708781 Geysen (1987) дополнительно раскрывает способ идентификации пептида, несущего иммунологический эпитоп желаемого белка. Более того, патент США 5194392 Geysen (1990) раскрыл обычный способ обнаружения или определения последовательности мономеров (аминокислот или других соединений), которая является топологическим эквивалентом пептида (т.е. "имитирующим эпитопом"), который комплементарен конкретному паратопу (сайту, связывающему антиген) интересующего антитела. В более общих выражениях, патент США 4433092 Geysen (1989) раскрыл способ обнаружения или определения последовательности мономеров, которая является топографическим эквивалентом лиганда, который является комплементарным лиганду, связывающему сайт конкретного интересующего рецептора. Подобным способом, патент США 5480971 Houghten и др. (1996) на смесях пералкилированных аминопептидов раскрыл линию С 1-С 7 алкил пералкилированных олигопептидов и наборы, и библиотеки таких пептидов, а также способы для использования таких наборов и библиотек пептидов для определения последовательности пералкилированного олигопептида, который предпочтительно связывается с интересующей молекулой акцептора. Таким образом, непептиды, аналоги пептидов, несущих эпитоп, настоящего изобретения также могут быть без затруднения изготовлены такими способами. Использование липолитических ферментов в промышленных процессах Настоящее изобретение также относится к использованию липолитического фермента согласно настоящему изобретению в определенных промышленных процессах. Несмотря на длительный опыт, приобретенный в таких процессах, липолитический фермент согласно настоящему изобретению имеет несколько отличительных существенных преимуществ по сравнению с ныне используемыми ферментами. В зависимости от конкретного применения такие преимущества могут включать в себя аспекты, подобно более низкой цене производства, более высокой специфичности в отношении субстрата, меньшей аллергенности, меньшего количества нежелательных побочных активностей, более высокое получение при продуцировании в подходящем микроорганизме, более подходящий рН и температурные режимы, улучшенный вкус и конечное изделие, а также аспекты качества пищи и чистоты продукта. Настоящее изобретение также относится к способам приготовления теста или печеного изделия, содержащего включенное в тесто эффективное количество липолитического фермента настоящего изобретения, которое улучшает одно или несколько свойств теста или печеного изделия, полученного из этого теста относительно теста или печеного изделия, в которые не включен полипептид. Фраза "включен в тесто" определена в настоящем описании как добавка липолитического фермента согласно настоящему изобретению в тесто, любой ингредиент, из которого может быть сделано тесто,и/или любую смесь ингредиентов теста, из которых может быть сделано тесто. Другими словами, липолитический фермент согласно настоящему изобретению может быть добавлен на любом этапе приготовления теста и может быть добавлен в один, два или несколько этапов. Липолитический фермент согласно настоящему изобретению добавляют в ингредиенты теста, которые замешивают и пекут для изготовления печеного изделия с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. См.,например, патент США 4567046, ЕР-А-426,211, JP-A-60-78529, JP-A-62-111629 и JP-A-63-258528. Термин "эффективное количество" определен в настоящем описании как количество липолитического фермента согласно настоящему изобретению, которое достаточно для обеспечения измеряемого эффекта, по меньшей мере, интересующего свойства теста и/или печеного изделия. Термин "улучшенное свойство" определен в настоящем описании как любое свойство теста и/или изделия, полученного из теста, особенно печеного изделия, которое улучшено действием липолитического фермента согласно настоящему изобретению относительно теста или продукта, в которые не включен липолитический фермент согласно настоящему изобретению. Улучшенное свойство может включать, без ограничений, увеличенную прочность теста, увеличенную эластичность теста, увеличенную стабильность теста, уменьшенную липкость теста, улучшенную растяжимость теста, улучшенный вкус печеного изделия, улучшенное античерствление печеного изделия. Улучшенное свойство может быть определено путем сравнения теста и/или печеного изделия, приготовленного с добавлением полипептида настоящего изобретения согласно способам настоящего изобретения, описанным ниже в примерах, или без добавления. Органолептические качества могут быть оценены с использованием процедур, хорошо отработанных в хлебопекарной промышленности, и могут включать, например, использование группы квалифицированных экспертов-дегустаторов. Термин "увеличенная прочность теста" определен в настоящем описании как свойство теста, которое обычно имеет эластичные свойства и/или требует большего вклада работы в формование и придание формы. Термин "увеличенная эластичность теста" определен в настоящем описании как свойство теста, которое обычно имеет большую тенденцию к восстановлению своей первоначальной формы после того,как оно было подвергнуто некоторому физическому растяжению. Термин "увеличенная стабильность теста" определен в настоящем описании как свойство теста, которое менее восприимчиво к механическим воздействиям, таким образом, лучше поддерживающее свою форму и объем. Термин "уменьшенная липкость теста" определен в настоящем описании как свойство теста, кото- 23008007 рое имеет уменьшенную тенденцию прилипания к поверхности, например, при механическом производстве теста, и является легко оцениваемым эмпирически пекарем-лаборантом или измеряемым с использованием анализатора текстуры (например, ТАХТ 2), известными в данной области техники. Термин "улучшенная растяжимость теста" определен в настоящем описании как свойство теста, которое может быть подвергнуто увеличенному натяжению или растяжению без разрыва. Термин "улучшенная способность теста к механической обработке" определен в настоящем описании как свойство теста, которое является обычно менее тягучим, и/или более плотным, и/или более эластичным. Термин "увеличенный объем печеного изделия" измеряется как определенный объем данного батона хлеба (объем/вес), обычно определяемый традиционным способом определения с использованием рапсового семени. Термин "улучшенная структура хлебного мякиша печеного изделия" определен в настоящем описании как свойство печеного изделия с более удлиненными и/или тонкими стенками ячеек в хлебном мякише и/или более однородным и/или гомогенным распределением ячеек в хлебном мякише и обычно оценивается эмпирически пекарем-лаборантом. Термин "улучшенная мягкость печеного изделия" противопоставлен "твердости" и определен в настоящем описании как свойство печеного изделия, которое является более легко сжимаемым и легко оценивается эмпирически пекарем-лаборантом или измеряется с использованием анализатора (например,ТАХТ 2), известным в данной области техники. Термин "улучшенный вкус печеного изделия" оценивают при помощи группы квалифицированных дегустаторов. Термин "улучшенное античерствление печеного изделия" определен в настоящем описании как свойства печеного изделия, которые имеют уменьшенную скорость ухудшения параметров качества, например, мягкости и/или эластичности, во время хранения. Термин "тесто" определен в настоящем описании как смесь муки и других ингредиентов, достаточно плотных для замешивания или раскатывания. Тесто может быть свежим, замороженным, предварительно раскатанным или подвергнутым предварительной термообработке. Приготовление замороженного теста описано Kulp и Lorenz в Frozen and Refrigerated Dough and Batters. Термин "печеное изделие" определен в настоящем описании как любой продукт, приготовленный из теста, либо мягкого, либо хрустящего типа. Примеры печеных изделий, любых белого, серого или черного типа, которые могут быть преимущественно изготовлены при помощи настоящего изобретения,являются хлебом (более конкретно белым хлебом, хлебом из ржаной муки или ржаного шрота) обычно в виде батонов или бубликов, длинного французского хлеба, макаронных изделий, лаваша, тортильи, тако,тортов, блинов, бисквитов, булочек, хлебной крошки, парового хлеба и хрустящего хлеба или т.п. Липолитический фермент настоящего изобретения и/или дополнительные ферменты, предназначенные для использования в способах настоящего изобретения, могут быть в любом виде, подходящем для рассматриваемого использования, например, в виде сухого порошка, быстрорастворимого порошка,или гранулята, более конкретно, непорошкообразного гранулята, жидкости, более конкретно, стабилизированной жидкости или защищенного фермента, такого как описано в WO01/11974 и WO02/26044. Гранулы и быстрорастворимые порошки могут быть приготовлены обычными способами, например путем распыления липолитического фермента согласно настоящему изобретению на носитель в гранулятор с псевдоожиженным слоем. Носитель может состоять из отдельных ядер, имеющих подходящие размеры частиц. Носитель может быть растворимым и нерастворимым, например солью (такой как NaCl или сульфат натрия), сахаром (таким как сахароза или лактоза), сахарным спиртом (таким как сорбитол),крахмалом, рисом, измельченным зерном или соей. Липолитический фермент согласно настоящему изобретению и/или дополнительные ферменты могут содержаться в препаратах замедленного освобождения. Способы приготовления препаратов замедленного освобождения хорошо известны в данной области техники. Добавление пригодных для пищи стабилизаторов, таких как сахар, сахарный спирт или других полиолей и/или молочной кислоты или другой органической кислоты согласно установленным способам могут, например, стабилизировать жидкие ферментативные препараты. Липолитический фермент согласно настоящему изобретению также может быть включен в дрожжи,содержащие композиции, такие как раскрытые в ЕР-А-0619947, ЕР-А-0659344 и WO02/49441. Преимуществом является то, что для добавления в заранее приготовленные смеси муки полипептиды согласно настоящему изобретению находятся в виде сухого продукта, например непорошкообразно гранулированного, в то время как для добавления вместе с жидкостью он находится преимущественно в жидком виде. Один или несколько дополнительных ферментов также могут быть добавлены в тесто. Дополнительный фермент может быть любого происхождения, включая животное или растительное, и предпочтительно микробное (бактериальное, дрожжевое или грибковое) происхождение и может быть получен при помощи техник, обычно используемых в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления дополнительный фермент может быть амилазой, такой как альфа-амилаза (пригодная для обеспечения сахара, способного к брожению при помощи дрож- 24008007 жей и замедляющая черствление) или бета-амилаза, циклодекстрин глюканотрансфераза, пептидаза, более конкретно, экзопептидаза (пригодная для усиления вкуса), трансглутаминаза, липаза (пригодная для модификации липидов, присутствующих в тесте или компонентах теста для размягчения теста), фосфолипаза, целлюлаза, гемицеллюлаза, более конкретно, пентозаназа, такая как ксиланаза (пригодная для частичного гидролиза пентозанов, которые увеличивают растяжимость теста), протеаза (пригодная для ослабления клейковины, более конкретно, при использовании муки из твердой пшеницы), изомераза дисульфидных белков, например, изомераза дисульфидных белков, как раскрыто в WO95/00636, гликозилтрансфераза, пероксидаза (пригодная для улучшения консистенции теста), лакказа или оксидаза, например глюкозооксидаза, гексозооксидаза, альдозооксидаза, пиранозооксидаза, липоксигеназа или оксидазаL-аминокислот (пригодная для улучшения консистенции теста). Если одна или несколько активностей дополнительных ферментов добавлены по способам настоящего изобретения, такие активности могут быть добавлены отдельно или вместе с полипептидом согласно настоящему изобретению, необязательно в качестве компонента(компонентов) композиции, улучшающей хлеб и/или улучшающей муку. Другие ферментативные активности могут быть любыми ферментами, описанными выше и могут быть дозированы согласно установленной практике хлебопечения. Настоящее изобретение также относится к способам приготовления печеных изделий, включающих выпекание теста, полученного способом настоящего изобретения для производства печеного изделия. Выпекание теста для производства печеного изделия может быть выполнено с использованием способов,хорошо известных в данной области техники. Настоящее изобретение также относится к тесту и печеным изделиям, соответственно, произведенным способами настоящего изобретения. Настоящее изобретение дополнительно относится к предварительной смеси, например, в виде композиции муки, для теста и/или печеных изделий, приготовленных из теста, причем предварительная смесь содержит полипептид настоящего изобретения. Термин "предварительная смесь" определен в настоящем описании для понимания ее в обычном значении, т.е. как смесь агентов печения, обычно включающих в себя муку, которая может быть использована не только в установках/оборудовании промышленного хлебопечения, но также в пекарнях розничной продажи. Предварительная смесь может быть приготовлена путем смешивания полипептида или композиции, улучшающей хлеб и/или улучшающей тесто настоящего изобретения, содержащей полипептид, с подходящим носителем, таким как мука,крахмал, сахар или соль. Предварительная смесь может содержать другие добавки, улучшающие тесто и/или улучшающие хлеб, например, любые добавки, включающие ферменты, упомянутые выше. Настоящее изобретение дополнительно относится к хлебопекарным добавкам в виде гранулированного или быстрорастворимого порошка, который содержит полипептид настоящего изобретения. Дополнительная хлебопекарная добавка предпочтительно имеет узкое распределение размера частиц с более чем 95% (по весу) частиц в области от 25 до 500 мкм. Для теста и хлеба производство настоящего изобретения может быть использовано в комбинации со вспомогательными веществами обработки, определенными ранее в настоящем описании, такими как вспомогательные вещества химической обработки, таким как оксиданты (например аскорбиновая кислота), восстанавливающие агенты (например L-цистеин), оксидоредуктазы (например, глюкозооксидаза) и/или другие ферменты, такие как ферменты, модифицирующие полисахариды (например, -амилаза,гемицеллюлаза, ферменты для печения и т.д.), и/или ферменты, модифицирующие белки (эндопротеаза,экзопротеаза, ферменты для печения и т.д.). Пример 1. Ферментация Aspergillus niger Липолитические ферменты, кодируемые нуклеотидной последовательностью, как предусмотрено в настоящем описании, получили путем конструирования плазмид экспрессии, содержащих последовательности ДНК, трансформации штамма A. niger такой плазмидой и культивирования штаммов A. niger следующим ниже способом. Свежие споры (106-107) штаммов A. niger инокулировали в 20 мл CSL среды (100 мл флакон, перегородка) и культивировали в течение 20-24 ч при 34 С и 170 об./мин. После инокуляции 5-10 мл CSL перед культивированием в 100 мл CSM среде (500 мл флакон, перегородка) штаммы ферментировали при 34 С и 170 об./мин в течение 3-5 дней. Бесклеточные супернатанты получили центрифугированием в 50 мл флаконах Greiner (30 мин, 5000 об./мин). Супернатанты предварительно отфильтровали микроволокнистым фильтром GF/A WhatmanGlass (150 мм Е) для удаления более больших частиц, до рН 5 доводили 4 н КОН (по необходимости) и стерильно отфильтровали 0,2 мкм (с бутылочным верхом) фильтром со всасыванием для удаления грибкового материала. Супернатанты хранили при 4 С (или -20 С). Среда CSL состояла из (в количестве на 1 л): 100 г Com Steep Solids (Roquette), 1 г NaH2PO4H2O, 0,5 г MgSO47H2O, 10 г глюкозаН 2O и 0,25 г Basildon (пеногаситель). Ингредиенты растворили в половине объема воды и рН довели до рН 5,8 при помощи NaOH или H2SO4; 100 мл флакон с перегородкой и шариком для вспенивания заполнили 20 мл бульона ферментации и стерилизовали в течение 20 мин при 120 С, после чего 200 мкл раствора, содержащего 5000 IU/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина,добавили в каждый флакон после охлаждения до комнатной температуры.CSM среда состояла из (в количестве на литр): 150 г мальтозаН 2O, 60 г Soytone (пептон), 1 гNaH2PO4H2O, 15 г MgSO47H2O, 0,08 Твин 80, 0,02 г Basildon (пеногаситель), 20 г MES, 1 г L-аргинина. Ингредиенты растворили в половине объема воды и рН довели до рН 6,2 при помощи NaOH или H2SO4; 100 мл флакон с перегородкой и шариком для вспенивания заполнили 100 мл бульона ферментации и стерилизовали в течение 120 мин при 120 С, после чего 1 мл раствора, содержащего 5000 IU/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина, добавили в каждый флакон после охлаждения до комнатной температуры. Пример 2. Очистка липолитических ферментов настоящего изобретения Этап 1 - Приготовление ультрафильтратов Выполнили ультрафильтрацию супернатантов культур, которые получены в примере 1, для удаления низкомолекулярных загрязнений, которые могут мешать при определении ферментативной активности и тестах при выпечке. Ультрафильтрацию 30 мл супернатанта проводили системой Millipore LabscaleTFF, оборудованной фильтром с 10 kDa границей пропускания. В зависимости от цвета образцы промывали 3-5 раз 40 мл объемами 100 мМ холодного фосфатного буфера рН 6,0, включающего в себя 0,5 мМ СаСl2. Конечный объем раствора фермента составил 30 мл и далее он упоминается как "ультрафильтрат". Этап 2 - Определение концентрации липолитических ферментов при помощи А 280 и HPSEC. Концентрацию липолитических ферментов в ультрафильтрате вычислили из экстинкции при 280 нм(А 280), свойственной липолитическим ферментам, и вычислили коэффициент молекулярной экстинкции липолитических ферментов. Измерение А 280 выполнили спектрометром Uvikon XL Secomam (Beun deRonde, Abcoude, Нидерланды). Коэффициент молекулярной экстинкции фермента может быть вычислен из количества остатков тирозина, триптофана и цистеина на молекулу (S.C. Gill P.H. von Hippel, Anal.Biochem. 182, 319-326(1989. Коэффициент молекулярной экстинкции этих аминокислот составляет 1280, 5690 и 120 М-1 см-1,соответственно. Количество остатков тирозина, триптофана и цистеина в липолитических ферментах настоящего изобретения может быть выведено из последовательностей SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24, 27, 30, 33, 36 и 39. Вычисленные коэффициенты ослабления липолитических ферментов настоящего изобретения суммированы в табл. 2. Таблица 2 Экстинкция ультрафильтрата при 280 нм (А 280), которая является свойством липолитических ферментов, зависит от чистоты образца фермента. Чистота, определенная с использованием HPSEC (высокоразрешающей хроматографией по размеру молекул) с TSK SW-XL колонкой (3007,8 мм; область MW 10-300 kDa). Буфер для элюции состоял из 25 мМ натрий фосфатного буфера рН 6,0 и был использован поток 1 мл/мин. Инъецировали 5-100 мкл образцы. Измерили поглощение при 280 нм. А 280 в ультрафильтратах, свойственное липолитическому ферменту настоящего изобретения, получили из отношения поверхности пика к пику соответствующего липолитического фермента в хроматограмме и общей поверхности пиков поглощения при 280 нм. Затем для каждого липолитического фермента вычислили концентрацию липолитического фермента в ультрафильтрате путем умножения А 280 ультрафильтрата на отношение, описанное выше, и разделили на вычисленный коэффициент экстинкции(1 мг/мл раствора - табл. 2 - самая большая правая колонка). Пример 3. Измерения активностей Бесклеточные супернатанты, полученные в примере 1, исследовали при помощи липазы, фосфолипазы и галактолипазы, что показано в табл. 3. Таблица 3. Активности липолитических ферментов в бесклеточных супернатантах, как приготовлено в примере 1 0 = нет отличия от контроля;+// =выше, чем контроль. Активность липазы определили спектрофотометрически с использованием 2,3-меркапто-1 пропанолтрибутирата (TBDMP) в качестве субстрата. Липаза гидролизует сульфидные связи TBDMP,таким образом, освобождая тиобутановую кислоту, которая в последующей реакции с 4,4 дитиодипиридином (DTDP) образует 4-тиопиридон. Последний находится в таутомерном равновесии с 4-меркаптопиридином, который поглощается при 334 нм. Реакция протекает в 0,1 М ацетатном буфере рН 5,0, содержащем 0,2% Тритон Х-100, 0,65 мМ TBDMP и 0,2 мМ DTDP, при 37 С. Одна единица липазы определена, как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль 4 тиобутановой кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции. Фосфолипазу А определили спектрофотометрически с использованием 1,2-дитиодиоктаноилфосфатдихолина в качестве субстрата. Фосфолипаза А гидролизует сульфидную связь в 1 положении(PLA1) или 2 положении (PLA2), таким образом освобождая 4 тиооктановую кислоту, которая в последующей реакции реагирует с 4,4' -дитиопиридином для образования 4-тиопиридона. Последний находится в таутомерном равновесии с 4-меркаптопиридином, который поглощается при 334 нм. Реакция протекает в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,0, содержащем 0,2% Тритон Х-100, 0,65 мМ субстрата и 0,2 мМDTDP, при 37 С. Одна единица фосфолипазы A (PLA) определена как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль 4 тиооктановой кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции. Активность лизофосфолипазы определили 31 Р-ЯМР спектроскопией с использованием лизофосфатидилхолина в качестве субстрата. Лизофосфолипаза гидролизует эфирную связь, таким образом освобождая жирную кислоту из группы глицерина. Образованный таким образом глицеринфосфохолин количественно определили, используя ЯМР. Реакция протекала в 50 мМ ацетатном буфере рН 4,5, дополнительно содержащем 1 мг/мл лизофосфатидилхолин и 5 мМ СаСl2, в течение 30 мин при 55 С. Одна единица лизофосфолипазы (LPC) определена как количество фермента, которое образует 1 мкмоль 4 глицеринфосфохолина кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции. Активность галактолипазы определили ЯМР спектроскопией с использованием дигалактозилдиглицерида в качестве субстрата согласно способу, описанному Hirayama и Matsuda (1972) Agric. Biol.Chem. 36, 1831. Галактолипаза гидролизует эфирную связь между жирными кислотами и глицериновой основой, таким образом, освобождая одну или две жирные кислоты. Реакция протекает в 50 мМ ацетатном буфере рН 4,5, дополнительно содержащем 5 мМ СаСl2, 0,2% Тритон Х-100 и 1 мг/мл дигалактозилдиглицерида (липидные продукты), в течение 30 мин при 30 С. Одна единица галактолипазы определена как количество фермента, которое образует 1 мкмоль жирной кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции. Ультрафильтраты, полученные в примере 2, подвергли FAU измерению активности фермента. Активность грибковой альфа-амилазы измерили с использованием тестовых таблеток Phadebas Amylase(Pharmacia). Таблетки Phadebas содержат субстрат водонерастворимого крахмала и голубой краситель,связанный поперечными связями с субстратом. Субстрат гидролизовали грибковой амилазой, освобождая окрашенные растворимые мальтодекстрины, которые перешли в раствор. Кривую калибровки приго- 27008007 товили при помощи раствора, содержащего упомянутую активность грибковой альфа-амилазы. Из стандарта и неизвестных образцов в 50 мМ буфере малеиновой кислоты рН 5,5 приготовили соответствующие разбавления. Образцы по 5 мл инкубировали при 30 С в течение 5 мин, добавили Phadebas таблетку и после 15 мин реакцию остановили путем добавления 1,0 мл 0,5 н гидроксида натрия. Смеси оставили остывать до комнатной температуры в течение 5 мин, после чего добавили 4,0 мл воды, после встряхивания руками в течение 15 мин образцы центрифугировали при 4700 об./мин в течение 10 мин. Экстинкцию верхних слоев измерили при 620 нм. OD 620 нм является единицей измерения для активности грибковой альфа-амилазы. Одна единица грибковой альфа-амилазы (FAU) определена в настоящем описании как количество фермента, которое превращает 1 г крахмала (100% сухого вещества) за 1 ч в продукт,обладающий прозрачностью при 620 нм после реакции с йодным раствором известной концентрации в установившихся условиях реакции. Таблица 4. AU и белок в ультрафильтратах, приготовленных в примере 2 Дополнительно к активностям, приведенным в табл. 4, также присутствуют незначительные активности глюкоамилазы, однако в таких низких количествах, что эти ферменты не мешают в экспериментах хлебопечения, описанных в примере 4. Пример 4. Эксперименты 1 хлебопечения - батоны хлеба Батоны хлеба выпекли из 150-граммовых кусков теста, полученного путем смешивания 200 г муки(Kolibri/Ibis в соотношении 80/20), 1,4 г сухих хлебопекарных дрожжей (Fermipan), 4 г соли, 3 г сахара, 10 мг аскорбиновой кислоты, 116 г воды и 2 г жира. После перемешивания в течение 6 мин и 15 с в стержневом миксере, тесто разделили на куски по 150 г и поставили для брожения в течение 45 мин при 30 С, обмяли и поставили для брожения в течение еще 25 мин, отформовали и приготовили. Брожение проводили при относительной влажности 90-100%. После финального брожения в течение 70 мин при 30 С тесто пекли в течение 20 мин при 225 С. Различное воздействие (табл. 5 и 6) липолитических ферментов в экспериментах хлебопечения сравнили с контролем, содержащим такое же количество грибковой амилазы, которую добавили иным способом при помощи дозировки ультрафильтрата (для активности грибковой амилазы в ультрафильтратах см. табл. 4). Это было необходимо, так как количество грибковой амилазы, добавленной с липолитическими ферментами, особенно повлияло на объем хлеба, а не на другие параметры. Объем батонов хлеба с добавленным контрольным количеством грибковой амилазы приняли за 100%. Объем батона определили при помощи измерителя объема хлеба BVM-3 (RI Cards Instruments AB,Viken, Sweden). Принцип такого измерения основан на отражении ультразвука, измеренного при помощи датчика вокруг вращающегося хлеба. Время измерения составляло 45 с. Липкость теста и растяжимость оценили при помощи квалифицированного пекаря, используя шкалу, изображенную в табл. 5. Измеряли среднее значение 2 батонов на один объект. После таких тестов куски теста округлили и первое брожение проводили в течение 45 мин при 30 С и после этого тесто обмяли, отформовали, приготовили и поставили для брожения в течение 75 мин при 30 С. Относительная влажность во время брожения составляла 85%. Затем оценили стабильность теста после брожения при помощи наличия пузырьков, корочки с оборванными краями и нерегулярных кривых поверхностей корочки. Куски теста выпекали в течение 20 мин при 225 С. Объемы батонов определили способом BVM-3: в таблице представлены средние значения 2 хлебов, которые выпекали как один объект. Структуру хлебного мякиша оценили при помощи профессионального пекаря, используя шкалу,изображенную в табл. 5. После хранения батонов в течение 3 дней в полиэтиленовых сумках при комнатной температуре измерили твердость хлебного мякиша, используя Stevens анализатор текстуры. Два ломтика толщиной 2 см из центра каждого батона проанализировали анализатором текстуры, используя пробу диаметром 1,5 дюйма, глубиной давления 5 мм (25%) и скоростью давления 0,5 мм/с. В таблице показано среднее значение двух измерений. Цвет корочки оценивали при помощи профессионального пекаря согласно шкале, изображенной в табл. 5. В качестве контроля использовали стандартный рецепт хлеба с датской формой для выпечки. Цвет хлебного мякиша оценивали при помощи профессионального пекаря согласно оценке, изображенной в табл. 5. Цвет хлебного мякиша контрольного хлеба оценили как норму (3). В качестве положительного контроля батоны 2 объектов использовали с одной и той же композицией как контроль плюс 0,5% соевая мука. Процедуры брожения и выпечки такие же как и для контроля без соевой муки. Последний оценили как "отличный". Нависающую верхушку хлеба оценивали путем нависания верхушки относительно формы для выпечки, более нижние кромки верхушки - более низкая оценка. Меньше нависания, более лучшая оценка. Черствление хлеба оценили путем ощущения твердости хлебного мякиша ломтиков хлеба. Перед нарезкой ломтиков хлеб хранили в пластиковой сумке при комнатной температуре в течение 4 дней. Более мягкий хлебный мякиш ломтиков имеет более лучшую оценку. Пример 5. Эксперименты 2 хлебопечения - батард Хлебопекарные качества липолитических ферментов согласно настоящему изобретению протестировали с французским типом хлеба, называемым "батард". Приготовление батардов в стандартном процессе хлебопечения было осуществлено путем смешивания 3000 г белой муки при примерно 20C. 70 г прессованных дрожжей, 60 г соли, 68 ч./млн аскорбиновой кислоты, 30 ч./млн Bakezyme HS2000 (грибковая гемицеллюлоза), 7 ч./млн Bakezyme P500 (грибковая -амилаза) и 1680 мл воды (8-10 С) в спиральном миксере (Diosna:2 мин со скоростью 1; 100 Вт-ч подавали при скорости 2). Температура теста составляла 27 С. Механически обработанное тесто проанализировали вручную при помощи профессионального пекаря. Тесто подвергли 15-минутной проверке на увеличение объема в герметичном шкафу при 32 С и 90% влажности. Позже тесто разделили на 6 кусков по 350 г, раскатали и поставили для брожения в течение 15 мин при 32 С и 90% влажности. В конце этого периодакуски теста отформовали,придали форму и последний раз поставили тесто для брожения на 90 мин при 32 С и 90% влажности. Полностью подошедшее тесто разрезали по длине кусков теста и выпекали в печи при 240 С в течение 30 мин в присутствии пара. После остывания до комнатной температуры объемы батонов определилиBVM способом (см. пример 4). Разламывание, разрезание и форму батонов проанализировали сразу после остывания до комнатной температуры при помощи профессионального пекаря, используя оценку в табл. 7. После 16 ч (всю ночь) хранения в закрытом ящике при комнатной температуре проанализировали качество хлебного мякиша при помощи профессионального пекаря. Оценку батонов (табл. 8) получали от 1 объекта.