Применение cd2-связывающего агента для избирательного снижения числа cd45ro-позитивных эффекторных т-лимфоцитов памяти в организме пациента

005948 Это изобретение относится к способам применения ингибиторов взаимодействия CD2/LFA-3 при лечении болезней, обусловленных наличием активированных Т-клеток у млекопитающих, включая человека. Такими болезнями являются воспалительные заболевания кишечника, псориатический артрит, ревматоидный артрит и рассеянный склероз. Антигенпредставляющие клетки (АРС) экспрессируют на своей поверхности антиген главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II с высокой степенью плотности. Молекулы МНС классаII связывают пептиды, полученные из подвергаемого эндоцитозу антигена, и распознаются главным образом Т-лимфоцитами-хелперами. Рецептор Т-клетки, расположенный на ее поверхности, распознает антиген в виде пептидного фрагмента, связанного с молекулами на поверхности клетки, кодированными МНС (Springer, "Adhesion Receptors of the Immune System", Nature, 346, pp. 425-27 (1990. Помимо взаимодействия рецептора Т-клеток и МНС, происходят многочисленные взаимодействия между молекулами, экспрессированными на поверхности таких АРС, и поверхностью Т-клеток. Эти поверхностные молекулы, часто именуемые адгезивными молекулами, участвуют в выполнении ряда функций, включающих в себя межклеточную адгезию, распознавание антигена, костимулирующую передачу сигнала при активации Т-клеток и стимуляцию эффекторов Т-клеточной цитотоксичности ("Adhesion Molecules in Diagnosis and Treatment of Inflammatory Diseases". The Lancet, 336, pp. 1351-52 (1990. Такая межклеточная адгезия, по-видимому, активирует пролиферацию Т-клеток в процессе иммунного ответа (Hughes et al., "The Endothelial Cell as a Regulator of T-cell Function", Immunol. Rev., 117, pp. 85-102(1990. Одним способом активации Т-клеток является связывание рецепторов антигенспецифических Тклеток с комплексами пептид -МНС на поверхности антигенпредставляющих клеток, таких как макрофаги. Активация Т-клеток стимулирует пролиферацию и дифференцировку функциональных Т-клеток двух типов: клеток-хелперов, которые стимулируют пролиферацию и созревание антителопродуцирующих Влимфоцитов, и клеток-киллеров, которые лизируют клетки-мишени (Bierer et al., "A Monoclonal Antibody(1990. Существует много заболеваний, вызываемых нарушением иммунных ответов, и многие из этих заболеваний обусловлены, в частности, повышенной активацией Т-клеток. Т-клетки играют важную роль в иммунном ответе в результате взаимодействия с клетками-мишенями и антигенпредставляющими клетками. Например, уничтожение клеток-мишений, опосредованное Т-клетками, представляет собой многостадийный процесс, включающий первоначальную адгезию цитолитических Т-клеток (эффекторных клеток) с клетками-мишенями. Кроме того, Т-клетки-хелперы инициируют иммунный ответ в результате адгезии с антигенпредставляющими клетками. Такие взаимодействия Т-клеток с клетками-мишенями и антигенпредставляющими клетками являются в высшей степени специфическими и зависят от распознавания антигена на поверхности клеткимишени или АРС одним из многочисленных рецепторов специфического антигена на поверхности Тклеток. Взаимодействие между рецептором и антигеном Т-клеток и других клеток облегчается наличием разных белков на поверхности Т-клеток, например, антигенрецепторного комплекса CD3, и дополнительных адгезивных молекул, таких как CD4, LFA-1, CD8 и CD2. Это взаимодействие облегчается также такими дополнительными адгезивными молекулами, как LFA-3, ICAM-I и МНС, которые экспрессированы на поверхности клеток-мишеней и антигенпредставляющих клеток. Например, LFA-1 и его противорецептор ICAM-1 или ICAM-2, а также CD2 и его противорецептор LFA-3 участвуют в межклеточной адгезии и активации Т-клеток. Известно, что взаимодействия LFA-1/ICAM и CD2/LFA-3 не зависят друг от друга. Целый ряд других молекул, представленных на покоящихся Т-клетках, также участвуют в адгезии Т-клеток, включая Е 2 (MIC2), VLA-4 (CD49d), CD44 (Hermes, Pgp-2, ECMRIII) и H19(N4) (см., Makgoba et al., "The CD2-LFA-3 and LFA-1-ICAM Pathways: Relevance to T-cell Recognition", Immunol. Today,10, pp. 417-22 (1989. Взаимодействие между CD2 и LFA-3 плохо изучено с точки зрения повышения активности Тклеток. Недавние исследования позволяют предположить, что между CD2 (адгезивная молекула Тклетки) и LFA-3 (адгезивная молекула клетки-мишени и АРС) происходит специфическое взаимодействие, которым опосредована адгезия Т-клеток с клетками-мишенями и антигенпредставляющими клетками. Эта межклеточная адгезия инициирует функциональные реакции Т-клеток (Dustin et al., "PurifiedLFA-3, обнаруженный на поверхности целого ряда клеток, включая эритроциты человека, стал предметом многочисленных исследований, целью которых является дальнейшее изучение его роли в разных взаимодействиях Т-клеток (см., например, Krensky et al., "The Functional Significance, Distribution,and Structure of LFA-1, LFA-2, and LFA-3: Cell Surface Antigen Associated with CTL-Target Interactions". J.man Cytotoxic T-cell Clones", Nature, 323, pp. 262-64 (1986. Идентифицированы две природные формы LFA-3. Одна форма LFA-3 ("трансмембранный LFA-3") связана в клеточной мембране трансмембранным гидрофобным доменом. кДНК, кодирующая эту формуFunction-Associated Antigen-3 (LFA-3)", J. Exp. Med., 166, pp. 923-32 (1987. Другая форма LFA-3 связана в клеточной мембране ковалентной связью с фосфатидилинозитол ("PI")-содержащим гликолипидом. Эта последняя форма получила название "РI-связанный LFA-3", и кДНК, кодирующая эту форму LFA-3,также клонирована и секвенирована (Wallner et al., публикация заявки РСТ WO 90/02181). Молекула CD2 человека является поверхностным гликопротеином в длиной 50 кДа, экспрессированным на 95% тимоцитах и фактически на всех Т-лимфоцитах периферической крови. Биохимические анализы, выполняемые с использованием специфических моноклональных антител, позволяют предположить, что CD2 специфичен для линии Т-клеток и присутствует на поверхности клетки в нескольких по-разному гликозилированных формах (Howard et al., "A Human T Lymphocyte Differentiation MarkerBrown et al., in Leukocyte Typing III, ed. McMichael, Oxford University Press, pp. 110-12 (1987); Sayre et al.,"Molecular Cloning and Expression of T11 cDNAs Reveals a Receptor-Like Structure on Human T Lymphocytes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 2941-45 (1987. Описана последовательность гена CD2 человека (Seed and Aruffo, "Molecular Cloning of the CD2Structure on Human T Lymphocytes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 2941-45 (1987. Клоны кДНК CD2 позволяют предположить наличие расщепленного сигнального пептида, состоящего из 24 аминокислотных остатков, внеклеточного сегмента, состоящего из 185 остатков, трансмембранного домена, состоящего из 25 остатков, и цитоплазматической области, состоящей из 117 остатков (Sayre et al., см. вышеAcad. Sci. USA, 83, pp. 8718-22 (1986); Seed and Aruffo, см. выше (1987); Clayton et al., Eur. J. Immun., 17,pp. 1367-70 (1987. Описаны растворимые полипептиды CD2, имеющие домен связывания LFA-3 (заявка РСТ WO 90/08187). Кроме того, описаны моноклональные антитела к CD2, например, TS2/18, T111, T112,Т 113, и к LFA-3, например, TS2/9 (см., например, Hughes et al., "The Endothelial Cell as a Regulator of TCell Function", Immunol. Reviews, 117, pp. 85-102 (1990); Meuer, "An Alternative Pathway of T-Cell Activation: A Functional Role for the 50 kD T11 Sheep Erythrocyte Receptor Protein", Cell, 36, pp.897-906 (1984. Связывание рецепторов антигенспецифических Т-клеток с комплексами пептид - МНС на поверхности антигенпредставляющих клеток вызывает образование так называемых клеток "памяти", которые обычно образуются во время адаптивного иммунного ответа, требующего контактирования с антигеном и увеличения количества антигенспецифических клеток памяти. Память Т-клеток, вероятно, зависит от повторяющейся стимуляции антигеном. Т-клетки памяти усиливают авидность связывания с антигенпред-ставляющими клетками благодаря повторяющейся экспрессии CD2, LFA-3 и других дополнительных адгезивных молекул. Действительно, важное фенотипическое изменение изоформы лейкоцитарного антигена CD45R позволяет отличить "необученные" Т-клетки, экспрессирующие CD45R, от Т-клеток памяти, взаимодействующих с низкомолекулярной формой CD45RO. Понимание того, что большинство, если не все, клеток памяти подвергается повторяющейся бомбардировке антигеном, позволяет предположить, что большая часть особенностей, характерных для субпопуляции CD45RO, фактически является проявлением эффекторных Т-клеток. В научной литературе все чаще появляются сведения о том, что эффекторные Т-клетки памяти CD45RO имеют непосредственное отношение к разным воспалительных заболеваниям, таким как воспалительные заболевания кишечника, включая болезнь Крона и неспецифический язвенный колит (Horiuchi et al., J. Japan. Soc. Colo.(1993). В связи с возможным участием этих эффекторных Т-лимфоцитов памяти в патогенезе существует необходимость создания усовершенствованных способов модуляции этих клеток у субъектов, страдающих такими заболеваниями. Настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения заболеваний, обусловленных инфильтрацией эффекторных Т-лимфоцитов памяти в какой-либо орган млекопитающего. При осуществлении этих способов нуждающемуся субъекту вводят CD2-связывающий агент, способный модулировать количество и/или распределение зффекторных Т-лимфоцитов памяти. Способы согласно изобретению превосходят ранее известные методы лечения этих заболеваний по многим причинам, в частности, потому, что эти способы являются более избирательными, и следовательно, менее иммуносупрессивными по сравнению с существующими методами лечения и характеризуются меньшей общей токсич-2 005948 ностью. В соответствии со способом согласно настоящему изобретению можно использовать любую молекулу, которая является CD2-связывающим агентом. К таким агентам относятся молекулы или другие химические частицы, которые модулируют взаимодействие CD2/LFA-3. Указанный агент предпочтительно выбирают из группы, включающей в себя гомологи антител против LFA-3, гомологи антител против CD2, растворимые полипептиды LFA-3, растворимые полипептиды CD2, агенты, имитирующие CD2 или LFA-3 (в частности, мелкие органические молекулы), и их производные. Одним объектом данного изобретения является способ избирательной модуляции эффекторных Тлимфоцитов памяти у субъекта, нуждающегося в этом, который включает в себя введение указанному субъекту эффективного количества СD2-связывающего агента. Т-лимфоциты памяти могут проникать в орган-мишень этого субъекта. Эффекторные Т-лимфоциты памяти предпочтительно являются Тлимфоцитами CD45RO. CD2-связывающий агент выбирают из группы, включающей в себя гомологи антител против LFA-3, гомологи антител против CD2, растворимые полипептиды LFA-3, растворимые полипептиды CD2, агенты, имитирующие CD2, и агенты, имитирующие LFA-3. Другой способ согласно изобретению относится к лечению заболевания, обусловленного эффекторными Т-лимфоцитами памяти,участвующими в патогенезе, который включает в себя введение нуждающемуся субъекту эффективного количества СD2-связывающего агента. Указанное заболевание относится к группе, включающей в себя псориатический артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, атопический дерматит, увеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и Т-клеточную лимфому кожи. Другим способом согласно изобретению является способ модуляции эффекторных Т-лимфоцитов памяти у млекопитающего, применяемый в том случае, когда в каком-либо органе млекопитающего находятся инфильтрирующие эффекторные Т-лимфоциты памяти. Этот способ включает в себя введение млекопитающему СD2-связывающего агента в количестве, достаточном для избирательной модуляции эффекторных Т-лимфоцитов памяти в указанном органе. При этом млекопитающее страдает заболеванием, выбираемым из группы, включающей в себя псориатический артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, атопический дерматит, увеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и Т-клеточную лимфому кожи. Композиции согласно изобретению содержат популяцию эффекторных Т-лимфоцитов памяти, полученных у млекопитающего, страдающего заболеванием, обусловленным присутствием инфильтрирующих зффекторных Т-лимфоцитов памяти в каком-либо органе данного млекопитающего, в сочетании с СD2-связывающим агентом. На фиг. 1 изображен график, на котором показано избирательное сокращение количества эффекторных Т-клеток памяти по сравнению с "необученными" Т-клетками у пациентов, страдающих псориазом, при лечении СD2-связывающим агентом, LFA3-TIP. Горизонтальным прямоугольником, расположенным над осью X, обозначена продолжительность лечения, которое было прекращено примерно через 80 дней. Кривые соответствуют среднему подсчету лимфоцитов у 57 пациентов в каждой лечебной группе. На этом графике показаны статистически значимые лечебные и временные результаты воздействия на Т-клетки памяти (CD45 RO+), а не на "необученные" Т-клетки (CD45 RA+). Подсчеты Т-клеток при лечении разными CD2-связывающими агентами свидетельствуют о сокращении их количества, приближающегося к некоторой относительно постоянной величине в течение 80-дневного периода введения. После окончания лечения количество эффекторных Т-клеток памяти начинает увеличиваться. Определения. В используемом здесь значении термины "эффекторный Т-лимфоцит", "эффекторные Т-клетки","эффекторный Т-лимфоцит/клетка памяти" или подобные термины имеют взаимозаменяемое значение и относятся к Т-лимфоцитам, подвергнутым воздействию антигена (т.е. это клетки, которые не являются"необученными"). В частности, эти термины означают Т-лимфоциты CD45RO в отличие от "необученных" Т-лимфоцитов CD45RA. В используемом здесь значении термин "CD2" означает полипептид CD2, связывающийся с природным полипептидом LFA-3 и кодируемый (а) природной последовательностью ДНК CD2 млекопитающего (например, SEQ ID5); (b) последовательностью ДНК, вырожденной относительно природной последовательности ДНК CD2; или (с) последовательностью ДНК, гибридизирующейся с одной из вышеуказанных последовательностей ДНК при температуре около 20-27 С ниже температуры плавления и в присутствии 1 М раствора хлорида натрия. В используемом здесь значении термин "LFA-3" означает полипептид LFA-3, связывающийся с природным полипептидом CD2 и кодируемый (а) природной последовательностью ДНК LFA-3 млекопитающего (например, SEQ ID1 или SEQ ID3); (b) последовательностью ДНК, вырожденной относительно природной последовательности ДНК LFA-3; или (с) последовательностью ДНК, гибридизирующейся с одной из вышеуказанных последовательностей ДНК в стандартных условиях гибридизации, описанных ниже. В используемом здесь значении термин "CD2-связывающий агент" означает молекулу, соединение или другую химическую частицу, которая модулирует взаимодействие CD2/LFA3 и/или передачу сигна-3 005948 ла CD2. Этот термин относится к гомологам антител против LFA-3, гомологам антител против CD2, растворимым полипептидам LFA-3, растворимым полипептидам CD2, агентам, имитирующим CD2 илиLFA-3, и их производным. Термин "модулирует" означает, что СD2-связывающий агент изменяет (предпочтительно уменьшает) интенсивность передачи сигнала CD2 и/или изменяет способность CD2 связываться с LFA3, хотя увеличение указанной интенсивности и/или способности связываться также входит в определение этого термина. CD2-связывающие агенты "модулируют" также эффекторные Т-лимфоциты памяти (то есть CD45RO), и в этом смысле термин "модулировать" означает, что связывающие агенты изменяют количество и/или распределение эффекторных Т-лимфоцитов памяти у субъекта, принимающего СD2-связывающие агенты. В соответствии с предпочтительными способами связывающие агенты"избирательно" модулируют такие эффекторные Т-лимфоциты памяти, и это означает, что эффекторные Т-лимфоциты памяти модулированы по сравнению с "необученными" Т-лимфоцитами (например, Тлимфоцитами CD45RA). В используемом здесь значении термин "растворимый полипептид LFA-3" или "растворимый полипептид CD2" означает полипептид LFA-3 или CD2, не способный связываться с мембраной. Такими растворимыми полипептидами являются, например, полипептиды CD2 и LFA-3, у которых отсутствует значительная часть мембранного домена, предназначенного для связывания полипептида,или которые модифицированы так, что мембранный домен является нефункциональным. В используемом здесь значении растворимые полипептиды LFA-3 включают в себя непроцессированный или процессированный (например, с внутренними делециями) РI-связанный LFA-3. В используемом здесь значении "гомолог антитела" означает белок, содержащий один или несколько полипептидов, выбираемых из легких цепей иммуноглобулина, тяжелых цепей иммуноглобулина и их антигенсвязывающих фрагментов, способных связываться с одним или несколькими антигенами. Составляющие полипептиды гомолога антитела, состоящего более чем из одного полипептида, могут быть необязательно связаны дисульфидной связью или какой-либо другой ковалентной поперечной связью. Гомологи антител включают в себя интактные иммуноглобулины типов IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (а также их подтипы), в которых легкие цепи иммуноглобулина могут относиться к типам каппа или лямбда. Гомологи антител включают в себя также части интактных иммуноглобулинов, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность, например, Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, F(v)фрагменты, мономеры или димеры с тяжелыми цепями, мономеры или димеры с легкими цепями, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и тому подобные. В используемом здесь значении термин "гомолог очеловеченного рекомбинантного антитела" означает гомолог антитела, полученный методом рекомбинантных ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не нужны для связывания антигена, заменены соответствующими аминокислотами из легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина млекопитающего, не являющегося человеком. В используемом здесь значении термин "гомолог химерного рекомбинантного антитела" означает гомолог антитела, полученный методом рекомбинантных ДНК, в котором все или часть шарнирных и константных областей легкой цепи, тяжелой цепи или обеих цепей иммуноглобулина заменены соответствующими областями из другой легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина. Способы согласно изобретению можно использовать для лечения любого млекопитающего, предпочтительно человека. Термин "аминокислота" означает мономерное звено пептида, полипептида или белка. В природных пептидах, полипептидах и белках обнаружено двадцать аминокислот, все из которых являются Lизомерами. Этот термин относится также к аналогам аминокислот и D-изомерам белковых аминокислот и их аналогам. Термин "белок" означает любой полимер, состоящий в основном из любых 20 аминокислот. Хотя термин "полипептид" часто используется для обозначения относительно длинных полипептидов и термин "пептид" часто используется для обозначения коротких полипептидов, значения этих терминов иногда перекрываются один другим. Термин "белок" в используемом здесь значении означает пептиды, белки и полипептиды за исключением особо оговоренных случаев. Термин "слияние" означает колинейную связь двух или более белков или их фрагментов, образуемую остовами отдельных пептидов благодаря генетической экспрессии полинуклеотидной молекулы,кодирующей эти белки, или при помощи методов синтеза белков. Желательно, чтобы белки или их фрагменты были получены из разных источников. Так, предпочтительные слитые белки включают в себяCD2-связывающий агент, представляющий собой белок или фрагмент, ковалентно связанный со второй частью, которая является другим CD2-связывающим агентом или вообще не является CD2-связывающим агентом. В частности, термин "слияние белка СD2-связывающего агента/Ig" означает получение белка,содержащего CD2-связывающий агент согласно изобретению или его фрагмент, связанный с N-концом цепи иммуноглобулина, в котором часть N-конца иммуноглобулина заменена CD2-связывающим агентом. Термин "мутант" означает любое изменение в генетическом материале организма, в частности, любое изменение (т.е. делецию, замену, присоединение или изменение) в полинуклеотидной последова-4 005948 тельности дикого типа или любое изменение в белке дикого типа. Термин "стандартные условия гибридизации" означает, что используемая соль и температурные условия эквивалентны использованию 0,5-5-кратного объема раствора хлорида и цитрата натрия (SSC) и температуры, равной 65 С, для гибридизации и промывки. Таким образом, термин "стандартные условия гибридизации" в используемом здесь значении является рабочим определением и включает в себя целый ряд условий гибридизации. Более строгие условия могут, например, включать в себя гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек (0,2% поливинил-пирролидона, 0,2% Ficoll 400; 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 50 мМ трис-HCl (рН 7,5); 1 М NaCl; 0,1% пирофосфата натрия; 1%SDS); 10% сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, при 65 С в течение 12-20 ч и промывку 75 мМ NaCl/7,5 мМ цитрата натрия (0,5SSC)/1%SDS при 65 С. Менее строгие условия могут, например, включать в себя гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек, 10% сульфата декстрана и 110 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, при 55 С в течение 12-20 ч и промывку 300 мМ NaCl/30 мМ цитрата натрия (2,0SSC)/1% SDS при 55 С. См. также Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, Inc., New York, Sections 6.3.1-6.3.6 (1989). Термин "контролирующая экспрессию последовательность" означает последовательность полинуклеотидов, которая контролирует и регулирует экспрессию генов, будучи функционально связанной с этими генами. Термин "функционально связанная" означает, что полинуклеотидная последовательность (ДНК,РНК) функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью, когда контролирующая экспрессию последовательность контролирует или регулирует транскрипцию и трансляцию указанной полинуклеотидной последовательности. Термин "функционально связанная" включает в себя наличие соответствующего инициирующего сигнала (например, ATG) перед экспрессируемой полинуклеотидной последовательностью и сохранение правильной рамки считывания, обеспечивающей экспрессию полинуклеотидной последовательности под контролем контролирующей экспрессию последовательности и продуцирование требуемого полипептида, кодируемого указанной полинуклеотидной последовательностью. Термин "экспрессирующий вектор" означает полинуклеотид, такой как ДНК-содержащая плазмида или фаг (наряду с другими типичными примерами), который обеспечивает экспрессию по крайней мере одного гена при введении экспрессирующего вектора в клетку-хозяина. Этот вектор может реплицироваться или не реплицироваться в клетке. Термин "выделенный" (используемый взаимозаменяемо с термином "по существу чистый") применительно к нуклеиновой кислоте, то есть полинуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды, означает полинуклеотид РНК или ДНК, часть геномного полинуклеотида, кДНК или синтетический полинуклеотид, который благодаря своему происхождению или соответствующей обработке (i) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, с которым он ассоциирован в природе (например, присутствует в клетке-хозяине в виде экспрессирующего вектора или его части); (ii) связан с нуклеиновой кислотой или другой химической частицей, отличающейся от той, с которой он связан в природе; или (iii) не встречается в природе. Термин "выделенный" далее означает полинуклеотидную последовательность,которая: (i) амплифицирована in vitro, например, при помощи полимеразной цепной реакции (PCR); (ii) химически синтезирована; (iii) получена методом рекомбинантных ДНК путем клонирования; или (iv) очищена расщеплением и разделением в геле. Термин "по существу чистая нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, которая не является смежной с одной или обеими кодирующими последовательностями, с которыми она обычно соседствует в природном геноме организма, из которого выделена эта нуклеиновая кислота. Термин "выделенный" (используемый взаимозаменяемо с термином '"по существу чистый") применительно к полипептидам означает полипептид или его часть, который благодаря своему происхождению или соответствующей обработке (i) присутствует в клетке-хозяине в виде продукта экспрессии части экспрессирующего вектора; (ii) связан с белком или другой химической частицей, отличающейся от той, с которой он связан в природе; или (iii) не встречается в природе. Термин "выделенный" далее означает белок, который (i) химически синтезирован; (ii) экспрессирован в клетке-хозяине и очищен от ассоциированных белков. Этот термин обычно означает полипептид, отделенный от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он существует в природе. Этот полипептид предпочтительно отделен также от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки. Термин "гетерологичный промотор" в используемом здесь значении означает промотор, который в природе не ассоциирован с геном или очищенной нуклеиновой кислотой. Термин "гомологичный" в используемом здесь значении является синонимом термина "идентичный" и означает сходство последовательностей у двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда в одинаковых положениях обеих сравниваемых последовательностей находятся одинаковые основания или мономерные субъединицы аминокислоты (например, когда в одинаковых положениях-5 005948 обеих молекул ДНК находится аденин или в одинаковых положениях обоих полипептидов находится лизин), тогда эти молекулы являются гомологичными в данном положении. Процентное значение гомологии между двумя последовательностями определяется количеством согласующихся или гомологичных положений, имеющихся в обеих последовательностях, деленным на число сравниваемых положений и умноженным на 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются согласованными или гомологичными, то эти две последовательности гомологичны на 60%. В качестве примера можно отметить, что последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT характеризуются 50% гомологией(согласуются 3 из 6 имеющихся в них положений) . Как правило, сравнение производят после упорядочения двух последовательностей для достижения максимальной гомологии. Такое упорядочение можно произвести, например, методом Нидлмана и др. (Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970) с использованием компьютерных программ, таких как программа Align (DNAstar, Inc.). Гомологичные последовательности имеют идентичные или подобные аминокислотные остатки, где подобные остатки являются консервативными заменами или "допустимыми точковыми мутациями" соответствующих аминокислотных остатков в упорядоченной эталонной последовательности. В связи с этим термин "консервативная замена" остатка в эталонной последовательности означает такую замену, которая физически или функционально подобна соответствующим эталонным остаткам, например, имеющим одинаковый размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, и тому подобные. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются замены, удовлетворяющие критерию, установленному для "приемлемой точковой мутации" Дейхоффом и др. (Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat.Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978). Термины "гомология" и "идентичность" означают сходство между двумя полипептидыми последовательностями, выявляемое в результате более строгого сравнения. Гомологию и идентичность можно установить, сравнивая положения в обеих последовательностях, которые могут быть упорядочены в целях сравнения. Когда в одинаковых положениях сравниваемых последовательностей находятся одинаковые аминокислотные остатки, тогда эти полипептиды можно считать идентичными в этом положении; когда эквивалентные сайты занимают одинаковые аминокислоты (например, идентичные) или подобные аминокислоты (например, подобные в пространственном и/или электронном отношении), тогда эти молекулы можно считать гомологичными в этом положении. Процентное значение гомологии или идентичности между последовательностями определяется количеством согласующихся или гомологичных положений, имеющихся в этих последовательностях. "Неродственная" или "негомологичная" последовательность характеризуется менее чем 40% идентичностью, предпочтительно менее чем 25% идентичностью, с последовательностью аминокислотных остатков согласно изобретению. Можно использовать разные алгоритмы и/или программы упорядочения, включая FASTA, BLAST или ENTREZ. FASTA и BLAST являются частью пакета программ для анализа последовательности GCG(Висконсинский Университет, Мадисон, шт. Висконсин) и могут использоваться с установками по умолчанию. ENTREZ можно приобрести в Национальном центре биотехнологической информации, Национальной медицинской библиотеке, Национальном институте здравоохранения, Бетеста, шт. Мэрилэнд. В одном варианте осуществления изобретения процентное значение идентичности двух последовательностей можно определить при помощи программы GCG с массой разрыва, равной 1, для чего каждый разрыв аминокислоты взвешивают, как если бы он был единственным несоответствием аминокислоты или нуклеотида в двух последовательностях. Термины "пептид (пептиды)", "белок (белки)" и "полипептид (полипептиды)" использованы в данном описании во взаимозаменяемом значении. Термины "полинуклеотидная последовательность" и"нуклеотидная последовательность" использованы здесь также во взаимозаменяемом значении. Молекулу согласно изобретению используют в "эффективном количестве", то есть в количестве,которое обеспечивает достижение положительного результата или ослабление симптомов подлежащего лечению заболевания. Термин "полимер" означает более крупную молекулу, состоящую из нескольких более мелких структурных единиц, именуемых "мономерами", которые связаны друг с другом любыми возможными способами. Когда для создания более крупной молекулы используется только один вид мономера, полученный продукт именуется "гомополимером", и этот термин имеет взаимозаменяемое значение с термином "полимер". Если цепи полимера состоят из нескольких разных мономеров, полученное вещество имеет общее название "гетерополимер". Полимерная часть, к которой присоединяют CD2-связывающий агент, фрагмент или вариант, предпочтительно является полиалкиленгликолем, но для этой цели можно использовать остов любого полимера, наиболее предпочтительно водорастворимые, нетоксичные и неиммуногенные полимеры. За исключением особо оговоренных случаев, при осуществлении настоящего изобретения используют обычные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК, химии белков и иммунологии, которые хорошо известны в этой области. Такие методы описаны в научной литературе. См., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning,-6 005948He желая связывать себя какой-либо теорией, авторы данного изобретения считают, что СD2 связывающие агенты, используемые в соответствии со способами согласно изобретению, оказывают профилактическое и терапевтическое действие при лечении вышеуказанных заболеваний благодаря тому, что они модулируют взаимодействие LFA3/CD2 и/или передачу сигнала CD2, вследствие чего наряду с прочим подавляется пролиферация и активация Т-клеток и, в частности, изменяется число и/или распределение эффекторных Т-лимфоцитов памяти. Авторы данного изобретения считают, что заболевания вышеописанного типа возникают вследствие такой пролиферации и активации Т-клеток. Авторы данного изобретения полагают, что способы согласно изобретению превосходят ранее известные методы лечения этих заболеваний по ряду причин, в том числе благодаря подавлению антигенспецифических взаимодействий всех имеющихся антигенов,подавлению активации Т-клеток, отсутствию общей иммуносупрессии и, возможно, индукции толерантности. В частности, авторы данного изобретения считают, что применение способов согласно изобретению позволит более целенаправленно воздействовать на Т-клетки на начальной стадии поражения, не влияя на эффекторные механизмы, опосредованные полиморфноядерными лейкоцитами или макрофагами. Поэтому пациент будет менее восприимчив к инфекциям, чем при использовании стероидов или других иммуносупрессивных средств широкого спектра действия. Таким образом, рассматриваемые способы подавления активации Т-клеток оказывают профилактическое и лечебное действие на указанные кожные заболевания. СD2-связывающие агентыCD2-связывающие агенты, используемые при осуществлении способов согласно изобретению, обладают только им присущими свойствами, а именно способностью модулировать передачу сигнала CD2,изменять и предпочтительно подавлять взаимодействие CD2/LFA-3. Данный СD2-связывающий агент способен выполнять обе эти функции. Такие агенты включают в себя гомологи антител против LFA-3,гомологи антител против CD2, растворимые полипептиды LFA-3, растворимые полипептиды CD2, агенты, имитирующие LFA-3 и CD2, и их производные. Предпочтительными CD2-связывающими агентами являются растворимые полипептиды CD2 и LFA-3, гомологи антител против CD2 и агенты, имитирующие LFA-3 и CD2. Возможность применения при осуществлении способов согласно изобретению конкретных растворимых полипептидов CD2, растворимых полипептидов LFA-3, гомологов антител против LFA-3, гомологов антител против CD2 или агентов, имитирующих CD2 и LFA-3, можно определить, анализируя их способность модулировать взаимодействие LFA-3/CD2. Эту способность можно определить при помощи простого анализа связывания клеток, который позволяет производить визуальную (под микроскопом) оценку способности предполагаемого СD2-связывающего агента подавлять взаимодействие между LFA3 и CD2 на клетках, имеющих эти молекулы. Клетки Jurkat предпочтительны в качестве субстрата дляCD2+ и эритроциты овцы или клетки JY человека предпочтительны в качестве субстрата для LFA-3+. Характеристики связывания растворимых полипептидов, гомологов антител и миметических агентов,пригодных для данного изобретения, можно исследовать несколькими известными методами, такими как мечение радиоактивными изотопами гомолога антитела, полипептида или агента (например, 35S или 125I) и последующее контактирование меченого полипептида, миметического агента или гомолога антитела с клетками CD2+ или LFA-3+. Характеристики связывания можно также исследовать, используя соответствующее вторичное антитело, меченное ферментом. Можно также использовать методы конкурентного розеткообразования, описанные Сидом и др. (Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 336569 (1987). А. Гомологи антител против LFA-3 и СD2. При осуществлении способов согласно изобретению можно использовать многие типы гомологов антител против LFA-3 или CD2. К ним относятся моноклональные антитела, рекомбинантные антитела,химерные рекомбинантные антитела, очеловеченные рекомбинантные антитела, а также антигенсвязывающие части вышеуказанных антител. Среди гомологов антител против LFA-3 предпочтительными являются моноклональные антитела против LFA-3. Более предпочтительным является моноклональное антитело против LFA-3, продуцируемое гибридомой, выбираемой из группы гибридом сдоступа АТСС НВ 10693 (1 Е 6), АТСС НВ 10694 (НС-1 В 11), АТСС НВ 10695 (7 А 6) и АТСС НВ 10696 (8 В 8), или моноклональное антитело, известное как TS2/9 (Sanchez-Madrid et al., "Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte-7 005948Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 and LFA-3", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, pp. 7489-93 (1982. Моноклональное антитело против LFA-3 наиболее предпочтительно продуцируют гибридомой, выбираемой из группы гибридом сдоступа АТСС НВ 10695 (7 А 6) и АТСС НВ 10693 (IE6). Среди гомологов антител против CD2 предпочтительными являются моноклональные антитела против CD2, такие как моноклональные антитела против CD2, известные как антидетерминантные антитела Т 11, включая TS2/18 (Sanchez-Madrid et al., "Three Distinct Antigens Associated with Human TLymphocyte-Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 and LFA-3", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, pp. 7489-93(1982. Технология продуцирования моноклональных антител хорошо известна. Ее можно коротко охарактеризовать следующим образом: иммортализованную линию клеток (обычно миеломных клеток) подвергают слиянию с лимфоцитами (обычно спленоцитами), полученными у млекопитающего, иммунизированного препаратом, содержащим данный антитен, и из культуральных супернатантов полученных клеток гибридомы выделяют антитела против данного антигена. См. Kohler et al., Nature, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", 256, pp. 495-97 (1975). Полезными иммуногенами в соответствии с целями данного изобретения являются CD2- или LFA-3-содержащие клетки, а также бесклеточные препараты, содержащие LFA-3, CD2 или их фрагменты, связывающиеся с противорецепторами (например, фрагменты CD2, которые связываются с LFA-3, или фрагменты LFA-3, которые связываются с CD2). Иммунизацию можно производить стандартными методами. Beличина однократной дозы и схема иммунизации зависят от вида иммунизируемого млекопитающего, его иммунного статуса, массы тела и т.д. У иммунизированных млекопитающих обычно берут кровь, и в каждой пробе крови исследуют сыворотку на наличие определенных антител при помощи приемлемых методов анализа. Например, полезные антитела против LFA-3 или CD2 можно идентифицировать, исследуя способность иммунной сыворотки блокировать перестройку клеток Jurkat под действием эритроцитов овцы благодаря наличию LFA3 и CD2 соответственно на поверхностях этих клеток. Лимфоциты, используемые для продуцирования клеток гибридомы, обычно выделяют из иммунизированных млекопитающих, сыворотка которых дала положительный результат на наличие требуемых антител при выполнении таких методов анализа. Иммортализованную линию клеток (например, линию миеломных клеток) обычно выделяют у того же вида млекопитающих, что и лимфоциты. Предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются линии миеломных клеток мыши, которые чувствительны к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("среда HAT"). НАТ-чувствительные миеломные клетки мыши обычно подвергают слиянию со спленоцитами мыши, используя полиэтиленгликоль ("PEG") 3350. Клетки гибридомы, полученные в результате слияния, отбирают, используя среду HAT, которая уничтожает неслитые и непродуктивно слитые миеломные клетки (неслитые спленоциты погибают через несколько дней, поскольку они не трансформированы). Гибридомы, продуцирующие требуемое антитело, обнаруживают, исследуя супернатанты культуры гибридомы, например, в отношении способности связываться с соответствующими противорецептором или способности блокировать адгезию клеток Jurkat с эритроцитами овцы. Для обеспечения моноклональности субкультуры гибридом обычно субклонируют с ограниченным разведением. Чтобы получить моноклональные антитела против LFA-3 или CD2, клетки гибридомы, давшие положительный результат при выполнении таких анализов, культивируют в питательной среде в условиях и в течение времени, необходимых для секреции клетками гибридомы моноклональных антител в культуральную среду. Методы получения культуры ткани и культуральных сред, приемлемых для клеток гибридомы, хорошо известны. Супернатант кондиционированной культуры гибридомы собирают и требуемые антитела далее необязательно очищают хорошо известными методами. Альтернативно требуемое антитело можно получить, инъецируя клетки гибридомы в брюшную полость мыши, примированной пристаном. Клетки гибридомы пролиферируют в брюшной полости, секретируя антитело, которое накапливается в виде асцитной жидкости. Антитело собирают, удаляя асцитную жидкость из брюшной полости шприцем. Гомологи антител против CD2 и LFA-3, пригодные для настоящего изобретения, могут быть также рекомбинантными антителами, продуцируемыми клетками-хозяевами, трансформированными ДНК, кодирующей легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина требуемого антитела. Рекомбинантные антитела можно получить известными методами рекомбинантных ДНК. См., например, патент США 4816397,который включен в это описание изобретения в качестве ссылки. Например, рекомбинантные антитела можно получить, клонируя кДНК или геномную ДНК, кодирующую легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина требуемого антитела из клетки гибридомы, которая продуцирует гомолог антитела, пригодный для данного изобретения. кДНК или геномную ДНК, кодирующую эти полипептиды, затем вводят в экспрессирующие векторы так, чтобы оба гена были функционально связаны с их собственными транскрипционными и трансляционными контролирующими экспрессию последовательностями. Экспрессирующий вектор и контролирующие экспрессию последовательности выбирают с учетом их совместимости с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Оба гена обычно вводят в один и тот же экспрессирующий вектор. Можно использовать прокариотические или эукариотические клетки-хозяева.-8 005948 Эукариотические клетки используют для экспрессии потому, что такие клетки гораздо лучше, чем прокариотические клетки, поддаются сборке и секретируют иммунологически активное антитело с правильно уложенной цепью. Однако любое продуцируемое антитело, которое является инертным вследствие неправильной укладки цепи, можно ренатурировать хорошо известными методами (Kim and Baldwin,"Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding". Ann.Rev. Biochem., 51, pp. 459-89 (1982. Клетки-хозяева могут продуцировать части интактных антител,такие как димеры с легкой или тяжелой цепью, которые также являются гомологами антител согласно изобретению. Следует отметить, что при осуществлении настоящего изобретения можно использовать варианты вышеуказанного метода. Например, можно трансформировать клетку-хозяина при помощи ДНК, кодирующей легкую или тяжелую цепь (но не обе цепи) гомолога антитела. Можно также использовать метод рекомбинантных ДНК для удаления части или всей ДНК, кодирующей одну или обе легкие и тяжелые цепи, которая является необязательной для связывания CD2 или LFA-3 с противорецептором. При осуществлении способов согласно изобретению можно использовать молекулы, экспрессированные из молекул процессированной ДНК. Кроме того, могут быть получены бифункциональные антитела, в которых одни тяжелые и легкие цепи являются гомологами антител против CD2 или LFA-3 и другие тяжелые и легкие цепи специфичны для антигена, не являющегося CD2 или LFA-3 либо другим эпитопом CD2 или LFA-3. Гомологи химерных рекомбинантных антител против LFA-3 или CD2 можно получить, трансформируя клетку-хозяина приемлемым экспрессирующим вектором, содержащим ДНК, кодирующую требуемые легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина, в которых вся или часть ДНК, кодирующей шарнирные и константные области тяжелой и/или легкой цепи, заменена ДНК из соответствующей области легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина других видов. Когда исходное рекомбинантное антитело не принадлежит человеку и СD2-связывающий агент предполагается вводить человеку, желательно произвести замену соответствующими последовательностями человека. Типичное химерное рекомбинантное антитело имеет вариабельные области [иммуноглобулина] мыши и шарнирные и константные областиAcad. Sci. USA, 81, pp. 6851-55 (1984). Очеловеченные рекомбинантные антитела против LFA-3 или CD2 можно получить, трансформируя клетку-хозяина приемлемым экспрессирующим вектором, содержащим ДНК, кодирующую требуемые легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, в которых вся или часть ДНК, кодирующей аминокислоты, не участвующие в связывании антигена, заменены ДНК из соответствующей области требуемой легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека. См., например, Jones et al., "Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody withThose from a Mouse". Nature, 321, pp. 522-25 (1986). Гомологи антител против CD2 и LFA-3, которые не являются интактными антителами, также могут быть использованы в данном изобретении. Такие гомологи можно получить из любых вышеописанных гомологов антител. Например, для использования в настоящем изобретении пригодны антигенсвязывающие фрагменты, а также непроцессированные мономерные, димерные или тримерные полипептиды,выделенные из вышеописанных антител. Приемлемыми гомологами антител этого типа являются Fabфрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, F(v)-фрагменты, мономеры или димеры с тяжелыми цепями, мономеры или димеры с легкими цепями, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и тому подобное. Тяжелые цепи против LFA-3 являются предпочтительными фрагментами антитела против LFA-3. Фрагменты антител можно также получить химическими методами, например, расщепляя интактное антитело протеазой, такой как пепсин или папаин, и производя необязательную обработку расщепленного продукта восстановителем. Альтернативно требуемые фрагменты можно получить, используя клетки-хозяева, трансформированные процессированными генами тяжелой и/или легкой цепи. Мономеры с тяжелыми и легкими цепями можно получить, обрабатывая интактное антитело восстановителем,таким как дитиотреитол, с последующей очисткой для разделения цепей. Мономеры с тяжелой и легкой цепью можно также получить, используя клетки-хозяева, трансформированные ДНК, кодирующей требуемую тяжелую цепь или легкую цепь, но не обе цепи. См., например, Ward et al., "Binding Activities ofNatl. Acad. Sci. USA, 86, pp. 572832 (1989). В. Растворимые полипептиды СD2 и LFA-3. При осуществлении способов согласно изобретению можно использовать растворимые полипептиды LFA-3 или CD2, которые модулируют взаимодействие LFA-3 и CD2. Растворимые полипептиды LFA3 являются предпочтительными. Растворимые полипептиды LFA-3 можно получить из трансмембранной формы LFA-3, в частности,из внеклеточного домена (например, АА 1-АА 187 SEQ ID2). Такие полипептиды описаны в патентах-9 005948 США 4956281 и 5547853 (которые имеют общего правопреемника с настоящей заявкой на патент),которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Предпочтительными растворимыми полипептидами LFA-3 являются полипептиды, содержащие АА 1-АА 92 SEQ ID2, АА 1-АА 80 SEQID2, АА 50-АА 65 SEQ ID2 и АА 20-АА 80 SEQ ID2. Вектор, содержащий последовательность ДНК (SEQ ID1), которая кодирует аминокислоты SEQ ID2, включен в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд, поддоступа 75107. Наиболее предпочтительными белками этого типа являются слитые белки, содержащие 92 аминоконцевые аминокислоты зрелого LFA-3, 10 С-концевых аминокислот шарнирной области IgG1 человека,имеющей два остатка цистеина, которые, по-видимому, участвуют в образовании дисульфидной связи между цепями, и области СН 2 и СН 3 константной области тяжелой цепи IgG1 человека (например, SEQID8). Этот слитый белок определяется здесь как "LFA3TIP". Плазмида pSAB152, кодирующая типичный белок LFA3TIP, включена в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд,поддоступа АТСС 68720. Последовательность ДНК вставки pSAB152 является последовательностьюSEQ ID7. Этот рекомбинантный белок предназначен для модуляции иммунных ответов в результате взаимодействия с рецептором CD2. Часть LFA-3 этого слитого белка связывается с рецептором CD2 на Т-лимфоцитах. Часть IgG1 связывается с рецепторами FcgammaRI (макрофаг) и FcgammaRIII (клетки NK и нейтрофилы). Известно, что взаимодействие LFA3TIP с CD2 подавляет in vitro реакции Т-лимфоцита. См, патенты США 5728677 и 5547853. Один способ получения LFA3TIP, предназначенного для использования при осуществлении способов согласно изобретению, описан в патенте США 5547853. Кондиционированную культуральную среду клеток COS7 или СНО, трансфицированных pSAB 152,концентрируют при помощи системы со спиральной кассетой AMICON SI Y3 0 (AMICON, Danvers, Massachusetts) и хроматографируют на белке A-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, Missouri). Связанные белки элюируют и подвергают гель-фильтрации на Superose-12 (Pharmacia/LKB, Pis-cataway, New Jersey). Фракции Superose-12, содержащие LFA3TIP с наименьшим количеством загрязняющих белков, которые определяют при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDSPAGE) и вестерн-блоттинга (см., например, Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp. 4350-54(1979); Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 474-510 (Cold Spring Harbor Laboratory (1988), собирают и концентрируют в устройстве Centricon YM30 (AMICON). LFA3TIP детектируют в вестерн-блотах, используя поликлональную антисыворотку против LFA-3 и затем меченый IgG козы против кролика. Очищенный LFA3TIP клеток COS7 или СНО является димером двух мономерных слитых белков LFA-3-Ig,связанных дисульфидными связями. Другой предпочтительный слитый белок содержит первый и второй внеклеточные домены LFA-3,слитые с шарнирными областями СН 2 и СН 3 IgG1 человека, и определяется здесь как LLFA3-Ig. Растворимые полипептиды LFA-3 можно также получить из PI-связанной формы LFA-3, как это описано в заявке на патент РСТWO 90/02181. Вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую PI-связанный LFA-3 (то есть SEQ ID3), включен в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд, поддоступа 68788. Следует отметить, что PI-связанная форма LFA-3 и трансмембранная форма LFA-3 имеют идентичные аминокислотные последовательности во всем внеклеточном домене. Аналогичным образом предпочтительные PI-связанные полипептиды LFA-3 соответствуют трансмембранной форме LFA-3. Растворимые полипептиды CD2 можно получить из непроцессированногоCD2, в частности, из внеклеточного домена (например, АА 1-АА 185 SEQ ID6). Такие полипептиды могут содержать весь или часть внеклеточного домена CD2. Типичные растворимые полипептиды CD2 описаны в заявке на патент РСТ WO 90/08187, которая включена в это описание изобретения в виде ссылки. Растворимые полипептиды, пригодные для использования в данном изобретении, можно получить разными методами, известными в этой области. Например, эти полипептиды можно выделить из молекул интактного транс-мембранного LFA-3 или CD2 или из молекулы интактного PI-связанного LFA-3 протеолизом, используя специфические эндопептидазы в сочетании с экзопептидазами, расщеплением по Эдману или обоими этими методами. Молекулу интактного LFA-3 или CD2 можно очистить от ее природного источника известными методами. Альтернативно интактный LFA-3 или CD2 можно получить известными методами рекомбинантных ДНК, используя кДНК (см., например, патент США 4956281,выданный Wallner et al.; Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, pp. 2941-45 (1987); Sayre et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, pp. 2941-45 (1987. Растворимые полипептиды, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно получают прямым методом, благодаря чему не нужно использовать в качестве исходного материала всю молекулуLFA-3 или CD2. Для этого используют обычные методы химического синтеза или хорошо известные методы рекомбинантных ДНК, в соответствии с которыми в трансформированных клетках-хозяевах экспрессируют только те последовательности ДНК, которые кодируют требуемые пептиды. Например, ген,кодирующий требуемый растворимый полипептид LFA-3 или CD2, можно синтезировать химическими средствами в синтезаторе олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды конструируют на основе аминокислотной последовательности требуемого растворимого полипептида LFA-3 или CD2. Специфические- 10005948 последовательности ДНК, кодирующие требуемый пептид, можно также получить из непроцессированной последовательности ДНК путем выделения специфических фрагментов эндонуклеазы рестрикции или синтеза указанной области при помощи PCR. Стандартными методами можно синтезировать ген, кодирующий растворимый полипептид LFA-3 или CD2, пригодный для данного изобретения. Например, для конструирования транслированного в обратном направлении гена можно использовать полную аминокислотную последовательность. Олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую растворимый полипептид LFA-3 или CD2, пригодный для данного изобретения, можно синтезировать одностадийным методом. Альтернативно можно синтезировать и затем лигировать несколько олигонуклеотидов меньшей длины, кодирующих части требуемого полипептида. Растворимый полипептид LFA-3 или CD2, используемый в данном изобретении, предпочтительно синтезируют в виде нескольких отдельных олигонуклеотидов, которые затем связывают между собой. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или 3'-концевые избыточные для комплементарной сборки последовательности на одной цепи ДНК. Предпочтительные гены в собранном виде имеют последовательности, которые распознаются эндонуклеазами рестрикции(включая уникальные сайты рестрикции для прямой сборки в клонирующем или экспрессирующем векторе), предпочтительные кодоны, учитывающие экспрессирующую систему хозяина, и последовательность, которая в транскрибированном виде позволяет получить стабильную, эффективно транслированную мРНК. Правильность сборки можно подтвердить секвенированием нуклеиновой кислоты, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в приемлемом хозяине. Специалистам в этой области должно быть понятно, что вследствие вырожденности генетического кода молекулы ДНК, содержащие многие другие нуклеотидные последовательности, также способны кодировать растворимые полипептиды LFA-3 и CD2, кодированные вышеописанными специфическими последовательностями ДНК. Эти вырожденные последовательности также кодируют полипептиды, используемые в данном изобретении. Последовательности ДНК могут быть экспрессированы в одноклеточных хозяевах. Как хорошо известно в этой области, чтобы получить высокие уровни экспрессии трансфицированного гена в хозяине,этот ген должен быть функционально связан с транскрипционными и трансляционными контролирующими экспрессию последовательностями, которые являются функциональными в выбранном хозяине экспрессии. Контролирующие экспрессию последовательности и представляющий интерес ген предпочтительно находятся в экспрессирующем векторе, который далее содержит бактериальный селектируемый маркер и ориджин репликации. Если хозяин экспрессии является эукариотической клеткой, экспрессирующий вектор должен далее содержать дополнительный маркер экспрессии, предназначенный для данного хозяина экспрессии. Последовательности ДНК, кодирующие требуемые растворимые полипептиды,могут кодировать или не кодировать сигнальную последовательность . Если хозяин экспрессии является прокариотической клеткой, желательно, чтобы эта последовательность ДНК не кодировала сигнальную последовательность. Если хозяин экспрессии является эукариотической клеткой, желательно, чтобы сигнальная последовательность была кодирована. Аминоконцевой метионин может присутствовать или отсутствовать в экспрессированном продукте. Если концевой метионин не расщеплен хозяином экспрессии, при желании его можно удалить стандартными химическими методами. Можно использовать разные комбинации хозяина/вектора экспрессии. Полезными экспрессирующими векторами для эукариотических клеток-хозяев являются, например, векторы, содержащие контролирующие экспрессию последовательности из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Полезными экспрессирующими векторами для бактериальных хозяев являются известные бактериальные плазмиды, в частности, плазмиды из Е. coli, включая col El, PCRI,pBR322, pMB9 и их производые, плазмиды с более широким спектром хозяев, такие как RP4, ДНКсодержащие фаги, например, многочисленные производные лямбда-фага, например, NM989, и другие ДНК-содержащие фаги, такие как М 13 и нитчатые фаги, содержащие одноцепочечную ДНК. Полезными экспрессирующими векторами для дрожжевых клеток являются 2 мкм плазмида и ее производные. Полезным вектором для клеток насекомых является pVL 941. Кроме того, в этих векторах можно использовать любые контролирующие экспрессию последовательности. Такими полезными контролирующими экспрессию последовательностями являются контролирующие экспрессию последовательности, ассоциированные со структурными генами вышеуказанных экспрессирующих векторов. Примерами полезных контролирующих экспрессию последовательностей являются, например, ранние и поздние промоторы SV40 или аденовирус, lac-система, trp-система, ТАС или TRC система, основные операторные и промоторные области лямбда-фага, регулирующие области fd-белка оболочки, промотор 3 фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, Pho5, промоторы дрожжевой системы а-спаривания и другие последовательности, которые, как известно, регулируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и разные комбинации указанных последовательностей. Можно использовать разных одноклеточных хозяев. Этими хозяевами являются хорошо известные эукариотические и прокариотические хозяева, такие как штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибы, дрожжи, клетки насекомых, такие как Spodoptera frugiperda (SF9), животные клетки, такие- 11005948 как клетки яичника китайского хомячка и клетки мыши, клетки африканской зеленой мартышки, такие как COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 и ВМТ 10, и клетки человека, а также растительные клетки в культуре ткани. Для экспрессии в животной клетке предпочтительно используют клетки С 140 и COS 7. Следует отметить, что, конечно, не все векторы и контролирующие экспрессию последовательности одинаково хорошо экспрессируют описанные здесь последовательности ДНК. И не все хозяева дают одинаково хорошие результаты при использовании одной и той же экспрессирующей системы. Однако специалист в этой области может выбирать среди этих векторов, контролирующих экспрессию последовательностей и хозяев, не прибегая к ненужному экспериментированию. Например, выбирая вектор, необходимо принять во внимание характеристики хозяина, так как вектор должен реплицироваться в нем. Необходимо также учесть число копий вектора, способность контролировать это число копий и вероятность экспрессии любых других белков, кодируемых этим вектором, таких как антибиотические маркеры. Выбирая контролирующую экспрессию последовательность, нужно также принять во внимание целый ряд факторов. Этими факторами являются, например, относительная прочность последовательности,ее управляемость и совместимость с рассматриваемыми здесь последовательностями ДНК, особенно с потенциальными вторичными структурами. При выборе одноклеточных хозяев необходимо учитывать их совместимость с выбранным вектором, токсичность продукта, кодированного последовательностями ДНК, характеристики секреции, их способность производить правильную укладку цепи растворимых полипептидов, требования, предъявляемые ими к ферментации или культуре, и простоту очистки продуктов, кодированных этими последовательностями ДНК. С учетом этих параметров специалист в данной области может выбрать разные комбинации вектора/контролирующей экспрессию последовательности/хозяина, которые экспрессируют требуемые последовательности ДНК в процессе ферментации или в крупномасштабной культуре животных клеток, содержащей, например, клетки СНО или COS 7. Растворимые полипептиды LFA-3 и CD2 можно выделить из сбраживаемой среды или культуры клеток и очистить при помощи разных известных методов. Специалист в этой области может выбрать наиболее приемлемые методы выделения и очистки. Методы рекомбинантных ДНК предпочтительно используют для получения приемлемых растворимых полипептидов CD2 или LFA-3, имеющих последовательность, состоящую более чем из 20 аминокислот, и при помощи обычных методов химического синтеза предпочтительно получают более короткие полипептиды CD2 или LFA-3, имеющие менее 20 аминокислот. Полипептиды, пригодные для данного изобретения, можно получить синтетическим путем с очень большими выходами и легко очистить. Такие растворимые полипептиды CD2 или LFA-3 предпочтительно синтезируют методом синтеза полипептидов в жидкой или твердой фазе и необязательно гидрируют карбоксипептидазой (чтобы удалить Сконцевые аминокислоты) или расщепляют по Эдману (чтобы удалить N-концевые аминокислоты). Правильную укладку цепи полипептидов производят в окислительных условиях, которые способствуют образованию дисульфидного мостика, как это описано Кентом (Kent, "Chemical Synthesis of Polypeptidesand Proteins", Ann. Rev. Biochem., 57, pp. 95789 (1988. Полипептиды, полученные таким образом, можно очистить методами разделения, хорошо известными в этой области, предпочтительно при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой. При осуществлении синтеза в жидкой фазе можно производить прямое введение конкретных производных аминокислот, таких как О-сульфатный сложный эфир тирозина, для роста полипептидной цепи. Таким образом можно избежать следующей стадии получения производного для модификации какого-либо остатка полипептидов, пригодных для данного изобретения. С. Агенты, имитирующие LFA-3 и CD2. При осуществлении способов согласно изобретению можно также использовать агенты, имитирующие LFA-3 и CD2. Эти агенты, которые могут быть пептидами, полупептидными соединениями или непептидными соединениями, являются СD2-связывающими агентами, модулирующими передачу сигнала CD2 и/или взаимодействие CD2/LFA-3. Наиболее предпочтительные агенты, имитирующие CD2 иLFA-3, подавляют взаимодействие CD2/LFA-3 практически так же, как моноклональное антитело противLFA-3 7A6 или моноклональное антитело против CD2 TS2/18 (описанное выше). Такие миметические агенты можно получить, синтезируя несколько пептидов (например, длиной 520 аминокислот), полупептидных соединений или непептидных органических соединений и исследуя эти соединения в отношении их способности подавлять взаимодействие CD2/LFA-3. См. патент США 4833092, Scott and Smith,"Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, pp. 386-90 (1990), and Devlin et al.,"Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, pp. 40407 (1990),которые включены в это описание изобретения в виде ссылки.D. Производные СD2-связывающие агенты. При осуществлении способов согласно изобретению можно также использовать производные СD2 связывающие агенты, такие как модуляторы взаимодействия CD2/LFA-3, в которых любые гомологи антител, растворимые полипептиды CD2 и LFA-3 или агенты, имитирующие CD2 и LFA-3, функционально связаны (при помощи химической связи, генетического слияния или тому подобного) с одним или несколькими членами, независимо выбираемыми из группы, включающей в себя гомологи антител против LFA-3 или CD2, растворимые полипептиды LFA-3 и CD2, агенты, имитирующие CD2 и LFA-3,цитотоксические и фармацевтические средства. Один тип производного СD2-связывающего агента полу- 12005948 чают, сшивая два или более СD2-связывающих агентов (одного или разных типов). Приемлемыми сшивающими агентами являются гетеробифункциональные вещества, имеющие две реакционноспособные группы, отделенные друг от друга соответствующим спейсером (например, сложный эфир ммалеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида) или гомобифункциональные вещества (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры можно приобрести в компании Pierce Chemical Company, Рокфорд,шт. Иллинойс. В соответствии с другим способом сшивания используют сигнальную последовательностьPI-связи в PI-связанном LFA-3 или ее фрагменты. В частности ДНК, кодирующую сигнальную последовательность PI-связи (например, АА 162-АА 212 SEQ ID4) лигируют в прямом направлении [от 5' к 3'] ДНК, кодирующей требуемый полипептид, предпочтительно растворимый полипептид LFA-3. Если эту конструкцию экспрессировать в соответствующей эукариотической клетке, эта клетка распознает сигнальную последовательность PI-связи и ковалентно свяжет PI с этим полипептидом. Гидрофобное свойство PI затем можно использовать для получения мицеллярных агрегатов полипептидов. Кроме того, можно использовать СD2-связывающие агенты, связанные с одним или несколькими цитотоксическими или фармацевтическими средствами. Полезными фармацевтическими средствами являются биологически активные пептиды, полипептиды и белки, в частности, гомологи антител, специфичные к полипептиду человека, не являющемуся CD2 или LFA-3, или их части. Полезные фармацевтические и цитотоксические средства включают в себя также циклоспорин А, преднизон, FK506, метотрексат, стероиды, ретиноиды, интерферон и азотистое соединение горчицы. Предпочтительными CD2-связывающими агентами, полученными с использованием фармацевтического средства, являются полипептиды, созданные методами рекомбинантных ДНК, в которых растворимый полипептид LFA-3, растворимый полипептид CD2 или агент, имитирующий пептидил-СD2 или пептидил-LFА-3, слит со всей или частью шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина и со всей или частью константной области тяжелой цепи. Предпочтительными полипептидами для получения таких слитых белков являются растворимые полипептиды LFA-3. Особенно предпочтительны слитые белки, содержащие АА 1-АА 92 из LFA-3 (например, SEQ ID2), слитые с частью шарнирной областиIgG1 человека (включая десять С-концевых аминокислот шарнирной области, содержащей два остатка цистеина, которые, по-видимому, участвуют в образовании дисульфидной связи между цепями) и с областями СН 2 и СН 3 константной области тяжелой цепи IgG1. Предполагается, что такие слитые белки обладают длительным временем полужизни в кровяном русле и обеспечивают димеризацию СD2 связывающего агента. Другими производными СD2-связывающими агентами, которые, по-видимому, также характеризуются длительным временем полужизни в кровяном русле, являются CD2-связывающие агенты, наиболее предпочтительно связанные с одним или несколькими полимерами, такими как полиалкиленгликоль. Считается, что этот полимер избирательно взаимодействует со свободной аминогруппой или другими реакционноспособными группами в СD2-связывающем агенте, причем теоретически присоединение этих полимеров происходит у любых имеющихся аминогрупп, таких как -аминогруппы или -аминогруппы лизина, или группы -SH цистеинов. Свободные карбоксильные группы, должным образом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, окисленные углеводородные части и меркаптогруппы СD2-связывающего агента (если они имеются) можно также использовать в качестве сайтов присоединения. В частности, если CD2-связывающий агент является белком, химическую модификацию любого цистеина (например, внутреннего или N-концевого цистеина) для защиты тиола с сопутствующей конъюгацией с полиалкиленгликольной частью (то есть полиэтиленгликолем или PEG) можно выполнить разными способами. См. патент США 4179337. Сульфгидрильная часть с ионом тиолата в качестве активного компонента является наиболее реакционноспособной функциональной группой в белке. Существует много реагентов, которые быстрее взаимодействуют с тиолом, чем с любыми другими группами. См. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (S.S. Wong, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991). В качестве других примеров связывания полиалкиленгликоля с цистеином можно привести реакции с использованием других -галогенацетильных соединений, ртутьорганических соединений, дисульфидных реагентов и других N-замещенных имидов малеиновой кислоты. Многие производные этих активных компонентов можно приобрести коммерческим путем (например, этилиодацетат (Aldrich,Milwaukee, WI), фенилдисульфид (Aldrich) и N-пиренмалеимид (Molecular Probes, Eugene OR) ) или легко синтезировать (например, N-алкилиодацетамиды, N-алкилмалеимиды и ртутьорганические соединения). Поскольку не существует простого химического метода целенаправленного связывания полиалкиленгликоля, такого как PEG, с СD2-связывающим агентом, необходимо генетическим путем создать сайт, который можно использовать для целенаправленного связывания полимерной части, например, при помощи сайт-направленного мутагенеза. Например, введение Cys в сайт, расположенный у С-конца белкового CD2-связывающего агента, обеспечивает специфическую модификацию с использованием полиалкиленгликоля (например, PEG), активированного имидом малеиновой кислоты, винилсульфоном или галогенацетатом. Эти реакции можно выполнить любым приемлемым методом, используемым для осуществления взаимодействия биологически активных веществ с инертными полимерами.- 13005948 Этот способ обычно включает в себя получение активированного полимера (который может иметь по меньшей мере одну концевую гидроксильную группу) и последующее взаимодействие белка с активированным полимером, что дает растворимый белок, пригодный для изготовления композиции. Вышеуказанную модификацию можно произвести разными способами, состоящими из одной или нескольких стадий. В соответствии с настоящим изобретением полиалкиленгликольные остатки С 1-С 4 алкилполиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (PEG), или поли(окси)алкиленгликольные остатки таких гликолей вводят в представляющие интерес полимерные системы. Таким образом, полимер, к которому присоединен белок, может быть гомополимером полиэтиленгликоля (PEG) или полиоксиэтилированным полиолом, при условии, что полимер растворяется в воде при комнатной температуре. Неограничивающими примерами таких полимеров являются гомополимеры полиалкиленоксида, такие какPEG или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные гликоли, их сополимеры и блок-сополимеры,при условии, что блок-сополимер остается водорастворимым. Примерами полиоксиэтилированных полиолов являются полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированная глюкоза и тому подобные. Глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина аналогичен природному остову, имеющемуся, например, в моно-,ди- и триглицеридах животных и человека. Поэтому такое ветвление необязательно следует рассматривать как чужеродный агент в организме. В качестве альтернативы полиалкиленоксидам можно использовать декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводородов и тому подобное. Кроме того, можно использовать гетерополимеры (т.е. полимеры, состоящие из мономеров нескольких видов, такие как сополимеры), описанные в патенте США 5359030 (например, белки, конъюгированные с полимерами, содержащими полиалкиленгликольную часть и одну или несколько жирных кислот). Специалистам в этой области должно быть понятно, что приведенный выше список носит иллюстративный характер, и в объем данного изобретения входят все полимерные материалы, обладающие описанными здесь свойствами. Кроме того, в соответствии с другим объектом изобретения можно использовать производный СD2 связывающий агент, ковалентно связанный с полимерным компонентом, в котором характер конъюгации предполагает наличие расщепляемых ковалентных химических связей. Это позволяет контролировать период времени, в течение которого полимер может быть отщеплен от СD2-связывающего агента. Эта ковалентная связь может быть расщеплена химической или ферментативной реакцией. Продукт, состоящий из полимера и CD2-связывающего агента, сохраняет приемлемую степень активности. Вместе с этим в конъюгируемом полимере присутствуют части полиэтиленгликоля, которые сообщают конъюгату полимера и CD2-связывающего агента высокую растворимость в воде и способность длительное время циркулировать в кровотоке. Благодаря этим улучшенным характеристикам настоящее изобретение делает возможным парентеральное, аэрозольное и пероральное введение конъюгата активного полимера и CD2-связывающего агента, и вслед за гидролитическим расщеплением обеспечивает биологическую доступность самого CD2 связывающего агента при применении in vivo. Фармацевтические композиции и способы согласно изобретению Это изобретение относится к предпочтительному способу профилактики или лечения заболевания у млекопитающего, обусловленного инфильтрацией в один или несколько органов млекопитающего эффекторных Т-лимфоцитов памяти и/или опосредованного такими Т-лимфоцитами. Этот способ включает в себя введение млекопитающему одного или нескольких СD2-связывающих агентов, таких как ингибиторы взаимодействия CD2/LFA-3, или их производных форм, способных избирательно модулировать эффекторные Т-лимфоциты памяти, не воздействуя на "необученные" Т-лимфоциты. Нуждающемуся в этом субъекту вводят эффективное количество CD2-связывающего агента или его производной формы."Эффективное количество" означает количество, позволяющее замедлить распространение или сделать менее тяжелыми описываемые здесь заболевания. Специалисту в этой области должно быть понятно, что эффективное количество CD2 связывающего агента зависит, среди прочего, от схемы введения, величины однократной дозы, использования СD2-связывающего агента в сочетании с другими лекарственными средствами, иммунного статуса и состояния здоровья пациента, терапевтической активности конкретного СD2-связывающего агента и времени полужизни в кровяном русле. СD2-связывающий агент или фармацевтическую композицию можно использовать в разных формах. Такими формами являются, например, твердые, полутвердые и жидкие лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы, дисперсии или суспензии, липосомы, суппозитории,инъекционные и инфузионные растворы и препараты для местного применения. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического назначения. Предпочтительными формами являются инъекционные или инфузионные растворы. СD2-связывающий агент или фармацевтическую композицию можно использовать для внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрисуставного, подоболочечного, периостального, внутриопухолевого вливания, введения в очаг поражения и рядом с очагом поражения, а также перорального и местного применения или ингаляции. Подкожное,- 14005948 внутримышечное или внутривенное введение является предпочтительным. Подкожное введение является наиболее предпочтительным. СD2-связывающие агенты можно вводить в виде перорального, трансбуккального, парентерального, ректального и вагинального препарата, путем аэрозольного впрыскивания в нос, внутрилегочной ингаляции или другими способами. В частности, лекарственные средства согласно изобретению могут быть получены в виде аэрозоля для ингаляции с использованием распыляемого раствора или порошка, инъекционного раствора (например, для подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного или внутриполостного введения), инфузионного раствора или препарата для перорального введения и могут представлять собой однократные лекарственные формы в ампулах или таблетках или многократные лекарственные формы в пробирках или других упаковках с добавлением консерванта. Эти композиции могут быть получены в виде суспензий, растворов, эмульсий или гелей в масляных или водных носителях и могут содержать вспомогательные средства, в частности суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно активный ингредиент может быть получен в виде порошка и/или в лиофилизованной форме для непосредственного применения или для смешивания перед использованием с приемлемым носителем (таким как стерильная, апирогенная вода, нормальный физиологический раствор или 5% декстроза). Унифицированную дозу предпочтительно вводят один-три раза в неделю или один-три раза в день. Более предпочтительно ее вводят один-три раза в день в течение примерно 3-7 дней или один-три раза в день в течение примерно 3-7 дней ежемесячно. Однако следует отметить, что можно использовать более низкие или более высокие дозы и другие схемы введения. СD2-связывающий агент предпочтительно вводят в дозе примерно от 0,001 до 50 мг СD2-связывающего агента на кг массы тела, более предпочтительно, примерно от 0,01 до 10 мг СD2-связывающего агента на кг массы тела, наиболее предпочтительно, примерно от 0,1 до 4 мг СD2-связывающего агента на кг массы тела. Например, CD2-связывающий агент согласно изобретению (растворимый полипептид LFA-3LFA3TIP) предпочтительно хранят в виде замороженного раствора в пробирках, содержащих 10 мг/мл рекомбинантного слитого белка LFA-3/IgG1 и наполнители (хлорид натрия, одноосновный фосфат калия и двухосновный фосфат натрия) . Содержимое пробирок оттаивают в холодильнике или при комнатной температуре, разводят 0,9% хлоридом натрия до конечного объема 5 мл и используют для внутривенной инъекции ударной дозы вещества. LFA3TIP получают в соответствии с описанием, приведенным в статьеMiller et al. (1993) J. Exp. Med. 1 78:211, которая включена в это описание изобретения в виде ссылки, и очищают от культуральной среды, содержащей линии трансфицированных клеток СНО (яичника китайского хомячка), производя абсорбцию на белке-А Sepharose 4B (Pharmacia) и элюирование 50 мМ глицина, 250 мМ NaCl (pH 3,0). Фракции, содержащие белок, собирают и подвергают гель-фильтрации на Superose-6 (Pharmacia) в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS). Максимальные фракции собирают и анализируют на чистоту при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 12% додецилсульфата натрия в восстановительных и невосстановительных условиях. В соответствии с типичной схемой лечения пациенту делают одну внутривенную инъекцию ударной дозы вещества в количестве, которое предпочтительно превышает 0,025 мг/кг и может составлять примерно 0,075-0,150 мг/кг. Дозу этого СD2-связывающего агента определяют с учетом массы тела нуждающегося в этом субъекта. Другая схема лечения может включать в себя одну внутримышечную инъекцию в дозе не менее 0,005 мг/кг, причем предпочтительная доза составляет до 0,025 мг/кг, и наиболее предпочтительные дозы выбирают из 0,05, 0,075, 0,1125 и 0,165 мг/кг. Унифицированные дозы необходимо вводить до достижения положительного результата. Эффективность лечения можно измерить разными методами. В случае рассеянного склероза (MS) лечебное действие можно измерить стандартными методами магнитного резонанса. В случае воспалительного заболевания кишечника (IBD) оценивают степень болей в брюшной полости, заживление свищей, частоту стула и другие показатели, в случае псориатического артрита определяют изменения в припухлости суставов и объем движений. Специалисты в области медицины могут легко определить клинический эффект по любому из описанных здесь симптомов, прибегнув к хорошо известным медицинским методам. СD2-связывающие агенты или их производные формы предпочтительно вводят в составе композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель, который не вызывает аллергической реакции или другого вредного действия у пациентов, которым его вводят. Приемлемыми фармацевтически приемлемыми носителями являются,например, вода, физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, декстроза,глицерин, этанол и тому подобные, а также их сочетания. Фармацевтически приемлемые носители могут далее содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективности СD2-связывающего агента. Фармацевтическую композицию или CD2-связывающий агент можно вводить вместе с другими лечебными или профилактическими средствами. Такими средствами являются, например, циклоспорин А,стероиды, ретиноиды, азотистое соединение горчицы, интерферон, метотрексат, антибиотики и антигистаминные средства. Эти средства можно вводить в виде однократной лекарственной формы вместе с СD2-связывающим агентом (т.е. в составе одной фармацевтической композиции), многократной лекар- 15005948 ственной формы отдельно от СD2-связывающего агента, но одновременно с ним, или многократной лекарственной формы, в которой два компонента вводят отдельно и последовательно. Альтернативно СD2 связывающий агент и другой активный агент можно получить в виде одной конъюгированной молекулы. Конъюгацию двух компонентов производят стандартными методами сшивания, хорошо известными в этой области. Одна молекула может также представлять собой рекомбинантный слитый белок. Кроме того, СD2-связывающие агенты или фармацевтические композиции, пригодные для настоящего изобретения, можно использовать в сочетании с другими терапевтическими методами, такими как химиотерапия. Применяя такие комбинированные терапевтические методы, можно успешно использовать более низкие дозы лекарственных средств. Генная терапия Это изобретение далее относится к генной терапии, используемой для доставки СD2-связывающих агентов в виде продуктов экспрессии последовательности нуклеиновых кислот в организм млекопитающего. Предпочтительная системная доставка ex vivo генных продуктов предполагает использование рекомбинантного вирусного или невирусного вектора, трансфекцию in vitro специфических популяций клеток млекопитающего, выделение и очистку трансфицированных клеток и введение их пациенту. Генная терапия in vivo предполагает аналогичное использование вектора и трансфекцию без удаления клеток или ткани у пациента. Специфические популяции клеток, используемые в качестве мишеней для трансфекции рекомбинантным вектором, содержащим представляющую интерес последовательность нуклеиновых кислот, включают в себя, не ограничиваясь ими, (1) популяции клеток костного мозга, содержащие кроветворные клетки-предшественники; (2) популяции лейкоцитов периферической крови,предпочтительно популяции лейкоцитов крови CD34+, которые обогащены кроветворными клетками и могут быть использованы для возврата трансфицированных кроветворных клеток в организм пациента без иссечения ткани;(3) популяции лимфоцитов периферической крови; (4) миобласты, которые можно снова трансплантировать хозяину после трансфекции in vitro представляющей интерес последовательности нуклеиновых кислот; (5) после чего рекомбинантный вирусный или невирусный вектор, содержащий представляющую интерес последовательность нуклеиновых кислот, или саму последовательность нуклеиновых кислот вводят пациенту при помощи внутримышечной инъекции. Специалистам в данной области должен быть известен метод использования ex vivo костного мозга с кроветворными клетками-предшественниками, содержащими вектор, способный кодировать в результате экспрессии CD2-связывающий агент. Этот метод можно коротко описать следующим образом: клетки костного мозга удаляют, инфицируют рекомбинантным вирусом и вновь вводят млекопитающему-хозяину. Таким образом ген или фрагмент гена системно распределяется в организме млекопитающего-хозяина, при этом происходит экспрессия этой последовательности ДНК, ведущая к системной доставке генного продукта в организм млекопитающего-хозяина. Периферическая кровь является источником клеток млекопитающего, используемых для инфицирования вирусными векторами. В частности, лейкоциты крови, особенно популяция CD34+, которые содержат циркулирующие кроветворные стволовые клетки, можно использовать в качестве клетокмишеней для заражения вирусом, которые затем возвращают в костный мозг млекопитающего-хозяина без иссечения ткани (Karlsson, et al., 1993, Bone Marrow Transplant. 11 (supp. 1): 124-127). Кроме того,лимфоциты можно также использовать в качестве клеток-мишеней для стимуляции системной доставки представляющей интерес последовательности нуклеиновых кислот. Лимфоциты удаляют из периферической крови хозяина, культивируют известными методами и используют в качестве популяции клетокмишеней для инфицирования вирусными векторами, содержащими представляющую интерес последовательность нуклеиновых кислот. Инфицированные лимфоциты затем инъецируют млекопитающемухозяину (см., например, Anderson, et al., 1990, Human Gene Therapy, 1: 331-361). Дополнительную популяцию клеток-мишеней составляют миобласты. Кровоток, поступающий в относительно большую массу скелетных мышц, делает эту ткань локализованным депо для представляющей интерес последовательности нуклеиновых кислот. Поэтому инфицирование in vitro и повторное введение миобластов млекопитающему-хозяину создает в хозяине локальную мишень, которая обеспечивает системную доставку продукта CD2. Для культивирования, инфицирования и повторного введения миобластов хозяину используют известные методы (см., например, Dai, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895). В этой связи следует отметить, что прямая инъекция in vivo в клетки или ткань является еще одним дополнительным методом локальной доставки молекулы вектора, кодирующей CD2-связывающий агент. Прямая инъекция после экспрессии генного продукта обеспечивает системную доставку лекарственного продукта в организм млекопитающего-хозяина (Wolff, et al., 1990, Science 247: 1465-1468; Raz, et al.,1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4523-4527). В этом режиме локализованной доставки используют прямую инъекцию депротеинизированной ДНК, предпочтительного невирусного вектора, такого как плазмидная ДНК. Для конструирования плазмидного вектора можно использовать любую эукариотическую промоторную и/или энхансерную последовательность, имеющуюся в распоряжении специалиста в этой области, которая, как известно, может регулировать экспрессию представляющей интерес нуклеиновой кисло- 16005948 ты, включая, но не ограничиваясь ими, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор вируса лейкемии мышей (MLV), промотор -актина, а также любую специфичную к клеткам эукариотическую промоторную последовательность, которая должна быть активной в клетке, предназначенной для трансдукции. Кроме того, можно использовать любые методы, используемые в данной области, для введения полинуклеотидных последовательностей в вектор. См., например,Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. WileySons, NY (1992). Обычные векторы содержат приемлемые транскрипционные/трансляционные контролирующие сигнальные последовательности, функционально связанные с полинуклеотидной последовательностью для конкретного интерферона. Промоторы/энхансеры можно также использовать для регулирования экспрессии интерферонов (см. раздел III). Экспрессирующие векторы, совместимые с клетками-хозяевами млекопитающего, предназначенными для использования в генной терапии клеток, включают в себя, например, плазмиды; векторы на основе ретровирусов птиц, мышей и человека; векторы на основе аденовирусов; векторы на основе вируса герпеса; парвовирусы и нереплицирующиеся поксвирусы. В частности, рекомбинантные вирусы с дефектом репликации можно генерировать в линиях упаковочных клеток, которые продуцируют только вирусы с дефектом репликации. См. Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.14 (Ausubel etal., eds.) , Greene Publishing Associates, 1989. В настоящее время созданы специфические вирусные векторы, предназначенные для использования в системах переноса генов. См., например, Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-36 (1992) (паповавирус(1992) (вирус простого герпеса (HSV) и вирус Эпштейна-Барра (HBV; Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24 (1992) (ретровиpyc); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754 (1984) (ретровирус); Miller et al., Nature, 357: 455-450 (1992) (ретровирус); Anderson, Science, 256: 808-813 (1992) (ретровирус). Предпочтительными векторами являются ДНК-содержащие вирусы, к которым относятся аденовирусы (предпочтительно векторы на основе Ad-2 или Ad-5), вирусы герпеса (предпочтительно векторы на основе вируса простого герпеса) и парвовирусы (предпочтительно векторы на основе "дефектного" или неавтономного парвовируса, более предпочтительно векторы на основе аденоассоциированного вируса,наиболее предпочтительно векторы на основе AAV-2). См., например, Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384,1994; патенты США 4797368 и 5399346 и приведенное ниже описание. Аденовирусные векторы обеспечивают чрезвычайно высокие уровни доставки трансгена фактически ко всем типам клеток независимо от митотического состояния. Высокие титры (1011 бляшкообразующих единиц/мл) рекомбинантного вируса можно легко генерировать в клетках 293 (трансформированная аденовирусом линия комплементарных эмбриональных клеток почки человека; АТСС CRL1573) и хранить в криостате в течение длительного времени без значительных потерь. Эффективность этой системы доставки лечебного трансгена in vivo, восстанавливающего генетический дисбаланс, продемонстрирована на моделях животных,страдающих разными заболеваниями. См. Y. Watanabe, Atherosclerosis. 36: 261-268 (1968); K. Tanzawa etIshibashi et al., J. Clin. Invest., 92:883-893 (1993); and S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 93: 1889-1893 (1994). Рекомбинантный аденовирус с дефектом репликации, кодирующий кДНК для трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR), признан пригодным для применения в генной терапии в результате выполнения нескольких клинических исследований муковисцидоза. См., например, J. Wilson, Nature, 365: 691692 (Oct., 21, 1993). Дальнейшим подтверждением безопасности рекомбинантных аденовирусов для генной терапии является широкое применение живых аденовирусных вакцин для вакцинации людей. Аденоассоциированные вирусы (AAV) находят применение в качестве векторов для соматической генной терапии. AAV представляет собой вирус, содержащий короткую одноцепочечную ДНК, с простой геномной организацией (4,7 т.п.н.), что делает его идеальным субстратом для генетической инженерии. Две открытые рамки считывания кодируют ряд rep- и сар-полипептидов. Rep-полипептиды (rер 78,rер 68, rер 62 и rер 40) участвуют в репликации, спасении и интеграции генома AAV. Кэппирующие белки(VP1, VP2 и VP3) образуют капсид вириона. Открытые рамки считывания rep- и сар-полипептидов у 5'- и 3'-концов фланкируют инвертированные концевые повторы длиной 145 п.н. (ITR), у которых первые 125 п.н. способны образовывать Y- или Т-образные дуплексные структуры. Важное значение для получения векторов на основе AAV имеет то, что rер- и cap-домены могут быть полностью вырезаны и заменены лечебным или репортерным трансгеном. См. B.J. Carter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRCPress, pp. 155-168 (1990). Установлено, что инвертированные концевые повторы (ITR) представляют собой минимальную последовательность, необходимую для репликации, спасения, упаковки и интеграции генома AAV. Известно, что высокая степень экспрессии гена из AAV у мышей сохраняется в течение по меньшей мере 1,5 лет. См. Xiao, Li and Samulski (1996) Journal of Virology 70, 8089-8108. Поскольку нет данных, свидетельствующих о вирусной токсичности или иммунном ответе клетки-хозяина, можно счи- 17005948 тать, что преодолены эти ограничения, присущие вирусной генной терапии. Фишер и др. (Fisher et al.,Nature Medicine (1997) 3, 306-312) сообщили об устойчивой экспрессии гена у мышей после внутримышечной инъекции AAV. Снова было подтверждено, что этот вирус является безопасным. Не было обнаружено клеточной или гуморальной иммунной реакции на введение вируса или чужеродного генного продукта. Животные модели. СD2-связывающие агенты и описанные способы можно испытать, используя приемлемые модели животных, страдающих разными заболеваниями (такие как хорошо известная модель ЕАЕ для рассеянного склероза). В нижеследующих примерах описано несколько моделей животных. Культуры, включенные в коллекции Клетки гибридомы мышей и антитела против LFA-3 согласно изобретению проиллюстрированы культурами, включенными в Американскую коллекцию типовых культур, Роквиль, шт. Мэрилэнд, США,5 марта 1991 г. в соответствии с Будапештским договором, и идентифицированы следующим образом: Обозначение Номер доступа АТСС 1 Е 6 НВ 10693 НС-1 В 11 НВ 10694 7 А 6 НВ 10695 8 В 8 НВ 10696 Бактериофаг, несущий плазмиду, кодирующую трансмембранный LFA-3, зарегистрирован компанией In Vitro International, Inc., Linthicum, Maryland, США, 28 мая 1987 г. поддоступа IVI-10133 в соответствии с Будапештским договором. Эта культура перенесена в Американскую коллекцию типовых культур (10801 University Blvd, Manassas, Virginia 20110-2209, United States) 20 июня 1991 г. и идентифицирована следующим образом: Обозначение Номер доступа АТСС 75107HT16[gt10/LFA-3] Культура Е. coli, трансформированная плазмидой, кодирующей PI-связанный LFA-3, зарегистрирована компанией In Vitro International, Inc., 22 июля 1988 г. поддоступа IVI-10180 в соответствии с Будапештским договором. Эта культура перенесена в Американскую коллекцию типовых культур (настоящий адрес: 10801 University Blvd, Manassas, Virginia, USA) 20 июня 1991 г. и идентифицирована следующим образом: Обозначение Номер доступа АТСС р 24 68788 Последовательности Далее приведен краткий перечень последовательностей, указанных в списке последовательностей:SEQ ID1: последовательность ДНК трансмембранного LFA-3SEQ ID2: аминокислотная последовательность трансмембранного LFA-3SEQ ID8: аминокислотная последовательность LFA3TIP Для лучшего понимания изобретение далее проиллюстрировано примерами. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения. Пример 1. Модуляция эффекторных Т-лимфоцитов памяти. Этот пример показывает, что конкретный СD2-связывающий агент, LFA3 TIP (SEQ ID8), избирательно модулирует эффекторные Т-лимфоциты памяти у млекопитающих, страдающих псориазом. Вещества и способы Авторы данного изобретения исследовали LFA3TIP рандомизированным, двойным слепым методом в фазе II с параллельным построением опыта в четырех сериях с контролем при помощи плацебо, в котором участвовали пациенты, страдающие хроническим бляшкообразным псориазом. Главной целью исследования было определение клинической реакции на дозы от 0,025 до 0,15 мг/кг массы тела. В 22 пунктах на территории Соединенных Штатов было зарегистрировано 229 субъектов в возрасте от 18 до 70 лет. Критерием для участия в этом исследовании было наличие бляшкообразного псориаза на протяжении по меньшей мере одного года с поражением более 10% площади поверхности и не поддающегося лечению местными средствами. Средняя продолжительность заболевания составила 16 лет (от 1 года до 62 лет). Фототерапия и системное лечение были прекращены за один месяц до начала исследования.LFA3TIP хранили в виде замороженного раствора в пробирках, содержащих по 10 мг/мл слитого белка и наполнители (хлорид натрия, одноосновный фосфат калия и двухосновный фосфат натрия). Пробирки хранили при -70 С (-94F), оттаивали в холодильнике или при комнатной температуре, разводили 0,9% хлоридом натрия до конечного объема, равного 5 мл, и использовали для внутривенной инъекции удар- 18005948 ной дозы вещества.CD2-связывающий агент вводили один раз в неделю в виде внутривенной инъекции ударной дозы вещества в течение 12 недель; за субъектами продолжали вести наблюдение в течение 12 недель после введения последней дозы. Тяжесть заболевания определяли на основании глобальной врачебной оценки и индекса активности и тяжести псориаза (PASI), причем конечные результаты первичной эффективности определяли через 2 недели после введения последней дозы исследуемого лекарственного средства. У пациентов брали пробу периферической крови и отделяли лимфоциты при помощи центрифугирования в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3105) анализировали при помощи проточной цитометрии (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA). Было зарегистрировано десять тысяч показателей. Результаты Авторы данного изобретения обнаружили статистически значимую разницу между LFA3TIP и плацебо в целом ряде конечных результатов, включая уменьшение оценки PASI в случае введения двух более высоких доз LFA3TIP. Клинические реакции на лекарственное средство становятся более выраженными при увеличении концентрации LFA3TIP (данные не представлены). Кроме того, лечение этим CD2 связывающим агентом вызывает уменьшение Т-лимфоцитов периферической крови CD4+ и CD8+ и природных клеток-киллеров. Наблюдается избирательное уменьшение эффекторных Т-клеток памяти CD4 5RO+ по сравнению с "необученными" клетками CD4+ и CD8+, именуемыми CD45RA+. При помощи проточной цитометрии выявлено более значительное уменьшение Т-клеток высокой плотности с фенотипами клеток памяти/эффекторов (CD4-CD45RO и CD8-CD45RO) по сравнению с Т-клетками CD2 низкой плотности с фенотипами "необученных" клеток (CD4-CD45RA и CD8-CD45RA). На фиг. 1 изображен график, показывающий избирательное уменьшение эффекторных Т-клеток памяти по сравнению с"необученными" Т-клетками у пациентов, страдающих псориазом, которым вводили LFA3TIP. Горизонтальным прямоугольником, расположенным над осью X, обозначена продолжительность лечения, которое было прекращено примерно через 80 дней. Кривые соответствуют среднему подсчету абсолютной субпопуляции лимфоцитов у 57 пациентов в каждой лечебной группе. Уменьшение эффекторных Тклеток памяти (CD45 RO+) является статистически значимым в зависимости от дозы. Не наблюдалось каких-либо изменений количества "необученных" Т-клеток периферической крови (CD45 RA+) независимо от схемы лечения. Подсчеты Т-клеток в разных схемах лечения СD2-связывающим агентом свидетельствуют о сокращении их количества, приближающегося к некоторой относительно постоянной величине в течение 80-дневного периода введения. После окончания лечения количество эффекторных Тклеток памяти начинает увеличиваться.LFA3TIP характеризуется хорошей переносимостью и не вызывает серьезных вредных эффектов. Незначительное временное зависящее от дозы уменьшение абсолютного числа лимфоцитов периферической крови по сравнению с уровнями, предшествующими вливанию, наблюдалось у всех субъектов, которым вводили LFA3TIP. Это уменьшение относится к общему числу лимфоцитов CD2, CD4 и CD8, но не затрагивает лимфоциты CD19. Пример 2. Лечение ревматоидного артрита. Для эксперимента по лечению СD2-связывающим агентом, таким как LFA3-TIP, были отобраны пациенты, страдающие ревматоидным артритом (RA). Это вещество получали и хранили аналогично примеру 1 и вводили пациентам в дозах примерно от 7,5 до 10 мг один раз в неделю в течение 12-24 недель. Для определения оптимальной дозы и схемы введения выполняли параллельные исследования с использованием вышеуказанных разных схем лекарственного лечения. У пациентов брали пробы периферической крови и отделяли лимфоциты при помощи центрифугирования в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3105) анализировали при помощи проточной цитометрии (FACSTARPLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA), как указывалось выше. Состояние пациентов контролировали по нескольким показателям, включая оценки припухлости и болезненности суставов, которые являются частью стандартизированных исследований "ACR 20". См. Felson, D.T. et al., "American College of Rheumatology Core Set of Disease Activity Measurements for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials", Arth. Rheum.,26: 729-740 (1993). Пример 3. Лечение воспалительного заболевания кишечника (IBP), болезни Крона и колита. Воспалительное заболевание кишечника является общим термином, относящимся к группе хронических воспалительных поражений желудочно-кишечного тракта неизвестной этиологии. Неспецифический язвенный колит (UC) и болезнь Крона, две основные формы идиопатического воспалительного заболевания кишечника (IBD) у человека, являются широко распространенными и плохо изученными заболеваниями (Kirsner, J.B., et al., eds., Inflammatory Bowel Disease: 3rd ed., Lea and Febiger, Philadelphia(1988); Goldner, F.H., et al., Idiopathic Inflammatory Bowel Disease, in Stein, J.H., ed., Internal Medicine, Little BrownCo., Boston, pp. 369-380 (1990); Cello, J.P., et al., Ulcerative Colitis, in Sleisenger, M.H., et al.,eds., Gastrointestinal Disease: Pathophysiology Diagnosis Management, W.B. Saunders Co., Philadelphia, p. 1435 (1989. Поскольку причины возникновения воспалительного заболевания кишечника неизвестны,возможными этиологическими причинами считаются инфекционные, иммунологические, наследствен- 19005948 ные или психологические факторы. При хроническом воспалительном заболевании кишечника часто имеют место вторичные внекишечные проявления, такие как артрит и перихолангит. Фармакотерапия воспалительного заболевания кишечника включает в себя введение противовоспалительных средств,таких как сульфасалазин (активное соединение, являющееся 5-аминосалицилатом, по-видимому, подавляет синтез простагландина) и глюкокортикоиды. Болезнь Крона или региональный илеит представляет собой заболевание, характеризующееся воспалением части тонкого кишечника. Это заболевание обычно сопровождается коликами в области брюшной полости, аномалией кишечника, потерей веса и небольшой лихорадкой. Живот обычно вздут, и кишечник на ощупь уплотнен. Может возникнуть непроходимость кишечника, и в этом случае необходима срочная операция. Причина возникновения этого заболевания неизвестна. Первичным поражением является гиперплазия лимфоидной ткани в подслизистой основе кишечника и лимфатических узлах. Болезнь Крона является хроническим заболеванием желудочно-кишечного тракта и поражает чаще всего подвздошную кишку, толстую кишку или обе эти кишки. Это заболевание можно отличить от неспецифического язвенного колита дифференциальной диагностикой. Патология неспецифического язвенного колита обычно относится к более поверхностному поражению слизистой оболочки, в отличие от болезни Крона, которая проникает в глубь слизистой оболочки и трещин кишечника (Riddell, R.H., ed., Pathology of Drug-induced and Toxic Diseases, Churchill Livingstone,New York (1982); Morrison, B.C., et al., eds., Gastrointestinal Pathology, 2d ed., London (1979); FenoglioPreiser, C.М., et al., eds., Gastro-intestinal Pathology: An Atlas and Text. Raven Press, New York (1989);Goldman, H., et al., Hum. Pathol. 13:981-1012 (1982. Неспецифический язвенный колит обычно поражает прямую кишку и приближается, не проникая внутрь, к непораженным сегментам, которые являются признаками болезни Крона. Приемлемые животные модели для IBD можно разделить на природные и экспериментально созданные животные модели. К сожалению, имеется всего несколько спонтанных и редко встречающихся моделей воспаления кишечника, возникающих вследствие генетического дефекта; большинство моделей не являются идиопатическими, а вызваны бактериями или другими инфекциями (например, гиперплазия,криптические абсцессы, язвы у мышей, зараженных Bacillus psyliformnis, и хомяков, зараженных "палочковидными бактериями") (Strober, W., Dig. Dis. Sci. 33 Suppl.: 3S-10S (1988. Редкие формы спонтанного неспецифического язвенного колита и гранулематозного энтероколита также встречаются у крыс и лошадей. Кроме того, в качестве спонтанной модели неспецифического язвенного колита и аденокарциномы кишечника используют игрунков и тамаринов (Clapp, N.K., et al., eds., Dig. Dis. Sci. 33 Suppl.: 1S-158S(1988. Экспериментальные животные модели неспецифического язвенного колита получают, включая в корм токсические вещества, фармакологические средства или другие химические вещества, присутствующие в окружающей среде, вводя животным вещества, полученные у пациентов, или манипулируя иммунной системой животного (Strober, W., Dig. Dis. Sci. 33 Suppl.: 3S-10S (1988); Beekan, W.L., Experimental inflammatory bowel disease, in: Kirsner, J.B., et al., eds., Inflammatory Bowel Disease, Lea and Febiger,Philadelphia, pp. 37-49 (1988); Onderdonk, А.В., Dig. Dis. Sci. 33 Suppl.: 40S-44S (1988. Потенциальную терапевтическую эффективность и механизмы действия СD2-связывающего агента при лечении болезни Крона можно исследовать при помощи животной модели с использованием тамаринов. См., например, J. Madara et al., "Characterization of Spontaneous Colitis in Cotton-Top Tamarin (Saguinus oedipus) and Its Response to Sulfasalazine", Gastroenterology, 88, pp. 13-19 (1985). Получают исходный раствор CD2-связывающего агента (например, LFA3TIP) в стерильном физиологическом растворе и плацебо в качестве контрольного вещества (только физиологический раствор) и вводят их десяти тамаринам (СТТ) с симптомами спонтанного колита (такими как диарея и другие; см. выше, Madara et al.). Одной группе из пяти тамаринов внутривенно вводят CD2-связывающий агент, а другой группе из пяти тамаринов внутривенно вводят плацебо. Тамаринов, получающих CD2-связывающий агент, инъецируют 1 мг агента в день (то есть около 2 мг/кг/день из расчета массы тела тамарина, равной примерно 1/2 кг) в течение восьми дней (в 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 дни испытания). Образцы ткани толстой кишки берут у животных на биопсию через день (в 0, 2, 4, 6, 8 и 10 дни испытания). Данные биопсии используют для определения индекса острого воспаления у каждого животного, что позволяет произвести полуколичественный анализ течения колита. (См. выше Madara et el.). У животных берут пробы периферической крови и отделяют лимфоциты центрифугированием в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3105) анализируют при помощи проточной цитометрии (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA),как указывалось выше. Полученные результаты свидетельствуют об избирательном уменьшении эффекторных Т-клеток памяти и показывают, что лечение СD2-связывающим агентом вызывает значительное(р 0,01) снижение индекса острого воспаления. В эксперименте с участием людей для лечения СD2-связывающим агентом, таким как LFA3-TIP,выбирают субъектов, страдающих IBD. Это вещество получают и хранят аналогично примеру 1 и вводят пациентам в дозах примерно от 7,5 до 10 мг в неделю в течение 12-24 недель. Для определения оптимальной дозы и схемы введения выполняют параллельное исследование, используя вышеуказанные разные схемы введения. У пациентов берут пробы периферической крови и отделяют лимфоциты центри- 20005948 фугированием в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3105) анализируют при помощи проточной цитометрии (FACSTAR PLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA), как указывалось выше. Состояние пациентов контролируют по нескольким показателям, включая индекс активности болезни Крона (Kjeldsen, J. and Schaffalitzky de Muckadell, O.B., Scand. J. Gastroenterol. 28: 1-9 (1993). Пример 4. Лечение увеита. Увеит является заболеванием, поражающим разные части глаза, в том числе переднюю и заднюю камеры глаза, а также стекловидное тело. Увеит, воспаление сосудистой оболочки глазного яблока, является причиной ухудшения зрения примерно у 10% населения в Соединенных Штатах. Панувеит представляет собой воспаление всей увеальной (сосудистой) оболочки глаза. Увеит задней камеры диагностируется как хориоретинит, и увеит передней камеры диагностируется как иридоциклит. Продукты воспалительного процесса, то есть клетки, фибрин, избыток белка, обычно присутствуют в жидком теле глаза, включая переднюю камеру, заднюю камеру и стекловидное тело, а также ткани, подвергающиеся воспалительному процессу. Увеит может возникнуть после хирургического или травматического повреждения глаза в качестве одного из элементов аутоиммунного нарушения, такого как ревматоидный артрит,болезнь Бехчета, анкилозирующий спондилоартрит, саркоидоз, а также как обособленное обусловленное иммунной реакцией заболевание глаза, то есть паропланит, иридодиклит и т.д., причина которого до сих пор неизвестна и которое возникает вследствие конкретных системных заболеваний, вызывающих отложение комплексов антиген-антитело в увеальных тканях. Все вместе эти нарушения определяются как неинфекционный увеит. Лечение млекопитающих В этом эксперименте использовали трех павианов. Животных анестезировали кетамином (30 мг/кг) при выполнении всех процедур. Специальное устройство, содержащее 6 мг LFA3-TIP, имплантировали в правый глаз, а контрольное устройство, содержащее только полимер, имплантировали в левый глаз. У обезьян была хорошо выраженная форма увеита, поэтому криоскопию не производили. Все устройства имплантировали на расстоянии 3 мм от края в нижнем височном квадранте. Животных анестезировали через 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 2 месяца, 4 месяца и 6 месяцев и обследовали при помощи обратной офтальмоскопии и электроретинографии. Электроретинографию выполняли в соответствии с описанием,за исключением того, что получали средние значения 5 реакций с помощью клинического усредняющего устройства Nicolet CA-1000 (Madison, Wis.) и импульсной лампы СKА Ganzfeld (Gaithersburg, Md.). По истечении 6 мес. пробу крови анализировали ВЭЖХ с целью обнаружения циклоспорина (предел обнаружения = 25 нг/мл). Через 6 месяцев животных умерщвляли высокой дозой пентобарбитала и через левый желудочек сердца сразу же вливали формалин с 10% буфера. Глаза помещали в фиксатив и затем в парафин, рассекали и исследовали в хирургических масках с целью обнаружения признаков токсичности. Брали пробу периферической крови и отделяли лимфоциты центрифугированием в градиенте плотности гипакфиколла. Клетки (примерно 3105) анализировали при помощи проточной цитометрии (FACSTARPLUS, Becton Dickinson, San Jose, CA). Фармакокинетика В этом эксперименте использовали двадцать четыре животных (группа 1). CD2-связывающий агент смешивали с исходными растворами этанола и воды в соотношении 50:50 в концентрации 1 мкг/20 мкл и 10 мкг/20 мкл. В исходный раствор добавляли также меченный тритием СD2-связывающий агент (1 мкСi/20 мл). Животных анестезировали кетамином (60 мг) и ксилазином (20 мг) и расширяли зрачок,закапывая в глаз одну каплю гидрохлорида фенилэфрина (2,5%) и тропикамида (1%). СD2-связывающий агент вводили инъекционной иглой 30 в стекловидное тело через верхнюю прямую мышцу на расстоянии примерно 5 мм от края. Первой группе из двенадцати животных вводили дозу, равную 1 мкг в 20 мкл, и второй группе из 12 животных вводили дозу, равную 10 мкг в 20 мкл. Инъекцию делали в среднюю часть стекловидного тела с особой осторожностью, чтобы не повредить хрусталик. В первой группе, которой вводили 1 мкг дозу, по 3 животных умерщвляли через 0,5, 3,6 и 24 ч. Во второй группе, которой вводили 10 мкг дозу, по 3 животных умерщвляли через 0,5, 6, 24 и 48 ч. Глаза удаляли и сразу же замораживали при -70 С. Ткани для анализа получали так, как описано ниже. Период полувыведения из стекловидного тела и объем распределения определяли, выполняя регрессионный анализ с построением графика концентрации в зависимости от времени. Лечение В этом эксперименте использовали одиннадцать животных. CD2-связывающий агент, находящийся в устройстве с пролонгированным высвобождением, вводили в правый глаз. Устройство, содержащее только полимеры, вводили в левый глаз. Прежде чем ввести указанные устройства в глаза, выполняли офтальмоскопию и электроретинографию (ERG). Скотопические и фотопические электроретинограммы(ERG) регистрировали для обоих глаз, используя электроды в контактных линзах (ERG-Jet) с двухканальным клиническим устройством усреднения сигналов (Cadwell 5200, Kennewick, Wash.) и импульсную установку Ganzfeld (Cadwell VPA-10, Kennewick, Wash.). Электроретинограммы адаптированного к темноте глаза получали после темновой адаптации в течение по меньшей мере 30 мин при 0,33 Гц и ус- 21005948 редняли данные для 20 стимулирующих вспышек. Электроретинограммы адаптированного к свету глаза получали при 2,8 Гц после световой адаптации в течение по крайней мере 5 мин и также усредняли данные для 20 вспышек. У полученных волн определяли амплитуды и время ожидания. Чтобы максимально уменьшить влияние индивидуальных и ежедневных изменений (13-15), реакции ERG оценивали, используя отношение амплитуды экспериментального глаза (правого) к амплитуде контрольного глаза (левого). При одинаковых амплитудах экспериментального и контрольного глаза отношение равно 1. Уменьшение указанного отношения отражает относительное уменьшение амплитуды экапериментального глаза. Исследования повторяли в 1, 7, 14 день и затем через каждые две недели в течение последующих 6 месяцев. Трех животных умерщвляли через 6 недель и двух животных умерщвляли через 16 недель. Для оценки обратимой токсичности устройство удаляли у 3 животных через 16 недель. Этих животных обследовали каждую неделю в течение двух месяцев и затем умерщвляли. Оставшихся двух животных умерщвляли через 26 недель. Сразу же после умерщвления животным вливали фиксатив (формалин с 10% буфера или 6% глутаральдегид) через левый желудочек сердца. Глаза удаляли и помещали в фиксатив. Три образца размером 3 мм 6 мм, полученных из заднего полюса глазного яблока, помещали в парафин или пластик и делали срезы. Один срез из каждого образца исследовали в хирургических масках с целью обнаружения признаков токсичности. Пример 5. Лечение псориатического артрита. В этом примере дано описание клинических результатов и реакции ткани на воздействие СD2 связующего агента у субъектов, страдающих псориатическим артритом. Псориатический артрит возникает у 5-8% пациентов, страдающих псориазом, и является обычным хроническим ревматическим заболеванием, которое может привести к сильному поражению суставов,если его не лечить. Недавно выполненные клинические исследования были направлены на выявление неблагоприятных прогностических признаков. Инвазивный метод лечения на ранней стадии рекомендован пациентам со значительным воспалением суставов и наличием определенных антигенов HLA. Псориаз и псориатический артрит считаются типичными заболеваниями, опосредованными Т-клетками. Иммунопатогенные данные позволили установить, что эта болезнь обусловлена HLA класса I и важная роль в ней принадлежит Т-клеткам CD8+. Построение исследования В этом примере описано экспериментальное исследование в фазе II типичного СD2-связывающего агента с участием пациентов, страдающих псориатическим артритом. Это исследование охватывает трехмесячный период лечения, в течение которого пациентам делают еженедельные внутривенные инъекции СD2-связывающего агента. Влияние этого агента на псориатические поражения кожи и артрит измеряют клиническими и лабораторными методами в начале, в середине и в конце периода лечения. До начала лечения через 4 недели и после окончания лечения производят биопсию синовиальной жидкости для иммуногистологических исследований стандартизированными методами. До начала лечения через 4 и 12 недель и после трехмесячного лечения производят биопсию кожи для иммуногистологических исследований стандартизированными методами. Группа больных, участвующих в исследовании Число обследуемых субъектов Субъектов, страдающих псориатическим артритом, обследуют с целью отбора пациентов для участия в исследовании, при этом они должны удовлетворять нижеследующим критериям: 1) Мужчины или женщины в возрасте от 18 до 70 лет включительно. 2) Женщины не должны быть способны к деторождению (стерилизованы хирургическим путем или в возрасте по меньшей мере через один год после наступления менопаузы) или должны иметь отрицательную пробу на наличие беременности во время обследования и пользоваться эффективными противозачаточными средствами в течение по меньшей мере одного месяца до введения испытуемого лекарственного средства, во время исследования и в течение 6 месяцев после лечения. 3) Пациенты должны удовлетворять критериям диагностики псориатического артрита. 4) Пациенты должны иметь клинически выраженную картину артрита по меньшей мере одного коленного сустава и 3 других суставов, утреннюю тугоподвижность суставов, длящуюся по меньшей мере 30 мин, и реакцию оседания эритроцитов (РОЭ), равную по меньшей мере 28 мм. 5) Пациентам должен быть поставлен диагноз бляшкообразного псориаза более чем за 12 месяцев до введения первой дозы лекарственного средства. 6) Показатель PASI у пациентов должен быть равен 12 или больше. 7) Пациенты должны прекратить прием всех иммуномодулирующих лекарственных средств, таких как метотрексат, циклоспорин и кортикостероиды, и всех других соединений, используемых для лечения псориаза и/или псориатического артрита, за исключением средств нестероидной противовоспалительной терапии (NSAID) по меньшей мере за четыре недели до обследования. 8) Абсолютный подсчет лимфоцитов CD4+ у пациентов должен соответствовать или быть выше нижнего предела нормального количества в течение 14 дней до введения первой дозы. Схема леченияCD2-связывающий агент вводят в виде внутривенной инъекции ударной дозы, равной 7,5 мг, один- 22005948 раз в неделю, причем общее количество вводимого средства равно 12 дозам. Изменение схемы лечения Следующая доза исследуемого лекарственного средства может быть введена субъекту, удовлетворяющему нижеследующим требованиям: абсолютное количество лимфоцитов периферической крови у субъекта через 24 ч после введения первой дозы должно превышать 67% нижнего предела нормального показателя, превышающего 50% исходного измерения у данного субъекта; абсолютное количество лимфоцитов CD4+, измеренное до введения предыдущей дозы, должно превышать 300 клеток/мм 3. При несоответствии любому из вышеуказанных критериев введение очередной дозы субъекту отменяют, и этого субъекта подвергают повторному обследованию на следующей неделе. Если у субъекта наблюдается продолжительное уменьшение абсолютного количества лимфоцитов периферической крови или абсолютного количества лимфоцитов CD4+ в течение более 28 дней, введение испытуемого лекарственного средства полностью прекращают. Прекращение введения испытуемого лекарственного средства и выведение субъектов из исследования В следующих разделах описаны критерии для прекращения введения испытуемого лекарственного средства и критерии для выведения субъектов из исследования. График событий Испытания и оценки Все пробы крови для гематологического анализа и анализа субпопуляции лимфоцитов берут в одно и то же время дня, чтобы предотвратить влияние изменений, происходящих в течение суток. Нижеследующие испытания и оценки должны быть выполнены в указанные периоды времени до введения каждой дозы испытуемого лекарственного средства, за исключением особо оговоренных случаев. Полное физикальное обследование выполняют во время 5, 9 и 13 посещения. Измерение показателей жизненно важных функций производят во время 1-13 и 15-17 посещений. Массу тела измеряют во время 1-13 и 15-17 посещений. Анализ мочи проводят во время 5, 9, 13 и 17 посещения. Химический анализ крови выполняют во время 5, 9, 13 и 17 посещения. Гематологическое исследование выполняют во время 1-17 посещений. Первый лабораторный анализ выполняют за 48 ч до введения первой дозы испытуемого лекарственного средства. Все другие исследования выполняют за 24 ч до введения каждой дозы. Анализ субпопуляции лимфоцитов выполняют во время 1-17 посещений. Тест на наличие беременности и анализ мочи у женщин выполняют во время 5, 13 и 17 посещения. Количественное измерение иммуноглобулинов IgG, IgA и IgM выполняют во время 13-го посещения.PASI определяют во время 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13-17 посещений. Ногти исследуют во время 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13-17 посещений.sIL-2R и sCD27 измеряют во время 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13-17 посещений. Пункционную биопсию кожи пораженного участка, не подвергающегося воздействию солнечного света, выполняют во время 1, 5, 13 посещения и необязательную биопсию выполняют во время 17-го посещения. Основные показатели по программе ACR измеряют во время 1, 5, 9, 13 и 17 посещения. Критерии улучшения показателей по программе ACR определяют во время 5, 9, 13 и 17 посещения. Артроскопическую биопсию синовиальной оболочки колена производят во время 1, 5 и 13 посещения. Оценка эффективности Клиническая оценка эффективности. Артрит. Все оценки эффективности лечения артрита должны быть выполнены одним исследователем/ревматологом для каждого обследуемого субъекта: измерение основных показателей и их улучшения по программе ACR. Поражение кожи. Все оценки эффективности лечения поражения кожи должны быть выполнены одним исследователем/дерматологом для каждого обследуемого субъекта: Оценка PASI. Исследование ногтей. Лабораторная оценка эффективности. Артроскопическая биопсия синовиальной оболочки. Иммуногистологическое исследование синовиальной оболочки. Сывороточные маркеры активности псориаза.- 23005948 Биопсия кожи. Иммуногистологическое исследование кожи. Оценка безопасности. Клиническая оценка безопасности. Физикальное обследование. Показатели жизненно важных функций (температура, частота сердечных сокращений, частота дыхания и кровяное давление в положении лежа на спине). Масса тела. Наблюдение с целью выявления инфекции. Наблюдение за неблагоприятными показателями. Лабораторная оценка безопасности. Гематология: клинический анализ крови с определением лейкоцитарной формулы и подсчетом тромбоцитов выполняют через 24 ч после введения дозы, и результаты анализа контролирует исследователь в каждом научно-исследовательском центре. Химический анализ крови: натрий, калий, хлорид, бикарбонат, азот мочевины крови, креатинин,кальций, фосфат, альбумин, общий белок, щелочная фосфатаза, общий билирубин, ALAT, ASAT и гамма-глутамилтрансаминаза. Анализ мочи. Оценка безвредности продукта и безопасности испытания. Количественное определение субпопуляции лимфоцитов периферической крови при помощи проточной цитометрии с использованием хорошо выраженных маркеров субпопуляции для Т-лимфоцитов(CD4, CD8). Статистический отчет и аналитический план Величина группы обследуемых субъектов. Экспериментальное исследование с участием 10 субъектов считается достаточным для оценки безопасности и эффективности. Данные, полученные при испытании СD2-связывающих агентов, таких как слитый белок LFA-3/IgG1, свидетельствуют о значительном влиянии на общее количество лимфоцитов и субпопуляции CD4 и CD8. Описание конечных точек исследования. Конечные точки первичного клинического исследования эффективности испытуемого лекарственного средства при лечении артрита и псориаза соответствуют концу лечения через 12 недель. Промежуточные конечные точки клинического исследования эффективности соответствуют 4 и 8 неделям лечения. Конечная точка первичного исследования безопасности соответствуют концу периода наблюдения после окончания лечения продолжительностью 3 месяца. Промежуточные конечные точки определения иммуногистологических изменений состояния кожи и синовиальной оболочки соответствуют двум периодам времени: через 4 недели и через 12 недель лечения. Статистические методы, используемые при выполнении объективных анализов. Общий метод анализа заключается в установлении различий между параметрами клинического и лабораторного исследования, измеренными до начала и в конце лечения. Для этого используют, например, односторонний дисперсионный анализ или анализ ковариансы либо логистическую регрессию. Реакции должны быть преобразованы до выполнения анализа. В случае необходимости можно использовать непараметрические методы. Клинические анализы эффективности. Определяют количественное отношение субъектов, характеризующихся 20% улучшением на основании измерения основных показателей по программе ACR. Определяют количественное отношение субъектов, характеризующихся 50% ухудшением показателей по сравнению с исходными данными на основании оценки PASI. Другие измерения эффективности включают в себя минимальную оценку PASI,общую оценку эритемы, общую оценку уплотнения, общую оценку шелушения и оценку состояния ногтей. Лабораторные анализы эффективности. Иммуногистологические исследования синовиальной оболочки и кожи и определение уровней сыворотки в маркерах активности псориаза позволяют получить данные, которые сравнивают с исходными показателями. Несмотря на то, что авторы изобретения описали несколько вариантов осуществления изобретения,очевидно, что основные варианты могут быть изменены для получения других вариантов, при осуществлении которых применяются способы согласно данному изобретению. Поэтому должно быть понятно,что в объем данного изобретения входят все альтернативные варианты осуществления изобретения и модификации, которые приведены в вышеизложенном описании изобретения и в прилагаемой формуле изобретения; это изобретение не ограничивается конкретными вариантами его осуществления, приведенными здесь в качестве примера.(ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Способ модуляции эффекторных Т-клеток памяти и композиции(iv) АДРЕС ДЛЯ ОТПРАВКИ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ: