Терапевтическое применение т-вам(cd40l)-технологии для лечения заболеваний с участием клеток гладкой мускулатуры

1 Данная заявка претендует на приоритет заявки на патент Соединенных Штатов Америки под регистрационным номером 08/677730, зарегистрированной 8 июля 1996 г., содержание которой, таким образом, включается в качестве ссылки в настоящую заявку. Описываемое изобретение осуществлено при поддержке Правительства по гранту Национального института здравоохранения (NIH),33 K08-AR-0194, RO1-CA55713, RO1-AI-28367,RO1-AI-14969, HL21006, HL42833, HL50629 ВRO1-AI-14969 от Департамента здравоохранения и Human Services. Соответственно правительство США имеет некоторые права на данное изобретение. В тексте данной заявки в скобках даются различные ссылки. Посредством этого эти публикации в целом включаются в данную заявку в качестве ссылок для более полного описания уровня области техники, к которой относится данное изобретение. Полное библиографическое цитирование этих ссылок можно найти в тексте или под соответствующими номерами в списке, следующем за разделом "Подробности эксперимента". Предпосылки создания изобретенияCD40 является молекулой клеточной поверхности, экспрессируемой на многих клетках,и взаимодействует с 30-33 кД контррецептором активационно индуцируемых СD4+-Т-клеток,названным CD40L. Взаимодействия CD40LCD40 широко исследовались при взаимодействии Т- и В-клеток и являются существенными для зависимой от Т-клеток дифференцировки Вклеток и продуцирования IgG, IgA и IgE. CD40 также экспрессируется на моноцитах, дендритных клетках, эпителиальных клетках, эндотелиальных клетках и фибробластах. ЭкспрессияCD40 на этих клетках in vitro активируется цитокинами, наиболее заметно IFN-. Интересно,что исследования in vivo показали явную экспрессию активированных CD40 в очагах воспаления, например, в синовиальной мембране при ревматоидном артрите или в псориатических бляшках. Исследования in vitro с использованием моноклонального антитела (mAb) против СD40-клеток или СD40L+-клеток показывают,что CD40 функционально экспрессируется на моноцитах, дендритных клетках, эпителиальных клетках, эндотелиальных клетках и фибробластах. Например, взаимодействия CD40L-CD40 побуждают моноциты секретировать провоспалительные цитокины IL-I, IL1, IL-6 и TNF-,а дендритные клетки - секретировать TNF-. Взаимодействия CD40L-CD40 также промотируют моноциты и дендритные клетки для секреции хемокинов IL-8 и MIP1. Кроме того,лигирование CD40 усиливает опосредованное 2 дованные CD40 сигналы побуждают моноциты секретировать IL-10 и оксид азота и увеличивают продуцирование IL-6 фибробластами. Фибробласты также пролиферируют после взаимодействий CD40L-CD40. Наконец, эндотелиальные клетки и фибробласты после лигированияCD40 активируют факторы межклеточной адгезии. Сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, лечат различными лекарственными средствами, в том числе лекарственными средствами, снижающими уровень холестерина, бета-блокаторами, блокаторами кальциевых каналов и антикоагулянтами. Теперь показано, что клетки гладкой мускулатуры компетентны для экспрессии CD40. Это представляет основу лечения сосудистых заболеваний посредством ингибирования взаимодействий между CD40 иCD40-лигандом (также известным как Т-ВАМ,5 с 8 Аg, gp39 и TRAP). Другие болезни, затрагивающие гладкую мышцу, также лечатся посредством ингибирования взаимодействий CD40CD40L. Краткое изложение сущности изобретения Данное изобретение относится к способу ингибирования активации лигандом CD40 клеток гладкой мускулатуры, несущих CD40 на поверхности клеток, включающему приведение в контакт клеток с агентом, способным к ингибированию взаимодействия между CD40 лигандом и CD40 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации указанных клеток. Данное изобретение относится к способу ингибирования активации СD40-лигандом клеток гладкой мускулатуры, несущих CD40 на поверхности клеток, у субъекта, включающему введение указанному субъекту агента, способного к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта. Данное изобретение относится к способу лечения субъекта от зависимого от клеток гладкой мускулатуры заболевания, включающему введение указанному субъекту агента, способного к ингибированию взаимодействия между СD40-лигадном и CD40 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта, и посредством этого лечат болезнь, зависимую от клеток гладкой мускулатуры. Описание чертежей Фиг. 1 А - FACS-анализ покоящихся клеток гладкой мускулатуры аорты человека. Точечная линия представляет собой изотипное контрольное mAb; пунктирная линия представляет собойmAb против CD54; сплошная линия представляет собой mAb против CD40. Эта фигура показы 3 вает, что клетки гладкой мускулатуры конститутивно не экспрессируют CD40. Фиг. 1 Б - FACS-анализ клеток гладкой мускулатуры аорты человека после 72-часового присутствия в клеточной культуре IFN- (1000 Е/см 3). Эта фигура показывает активацию экспрессии CD40 клетки гладкой мускулатуры в ответ на IFN-. Фиг. 1 В - FACS-анализ клеток гладкой мускулатуры аорты человека после 72-часового присутствия в клеточной культуре IL-1 (1 нг/см 3). Не наблюдается активации экспрессииCD40 клетками гладкой мускулатуры. Фиг. 1 Г - FACS-анализ клеток гладкой мускулатуры аорты человека после 72-часового присутствия в клеточной культуре TNF- (200 Е/см 3). Не наблюдается активации экспрессииCD40 клетками гладкой мускулатуры. Фиг. 2 А-Ш - Координаты атомов кристаллической структуры растворимого внеклеточного фрагмента CD40L человека, содержащего остатки Glyll6-Leu261 (в Банке данных о белкахBrookhaven) (ПОСЛЕД.1). Фиг. 3 А-Б - CD40 экспрессируется in situ на клетках гладкой мускулатуры и макрофагах при повреждении при гомологичном атеросклерозе. Приводятся микрофотографии, полученные при двухцветных иммуногистохимических исследованиях, показывающие экспрессиюCD40 (коричневое окрашивание) на клетках гладкой мускулатуры (красное окрашивание) фиг. 3 А и макрофагах (красное окрашивание) у больного с атеросклерозом, связанным с трансплантацией - фиг. 3 Б. Фиг. 4 А-Б - Здоровая венечная артерия от пациента с идиопатической кардиомиопатией,окрашенная гематоксилином и эозином (фиг. 4 А) и mAb против CD40 (фиг. 4 Б). Фиг. 4 А: отмечается отсутствие утолщения интимы или воспалительного инфильтрата. Фиг. 4 Б: экспрессия CD40 ограничивается эндотелиальными клетками, выстилающими просвет сосуда. Отсутствует реактивность в отношении изотипного специфического контрольного mAb (не показано). (Фиг. 4 А, 4 Б х 25). Фиг. 5 А-Б - Фиброатероматозная бляшка в венечной артерии больного с ишемической кардиомиопатией, окрашенная гематоксилином и эозином (фиг. 5 А) и mAb против CD40 (фиг. 5 Б). Фиг. 5 А: фиброзная шапочка, перекрывающая частично обызвествленное атероматозное ядро, содержит многочисленные клетки зоны воспаления (стрелки). Фиг. 5 Б: большая часть клеток зоны воспаления в фиброзной шапочке определенно представляет собой CD40+ (стрелки). Соседние клетки гладкой мускулатуры интимы и эндотелиальные клетки также представляют собой CD40+. (Фиг. 5 А, 5 Б х 25). Фиг. 6 А-В - Раннее повреждение интимы,изобилующее пенистыми клетками, у пациента с коронарно-артериальной болезнью, связаннойCD40 (фиг. 6 Б, 6 В). Фиг. 6 А: повреждение интимы содержит многочисленные пенистые клетки, макрофаги и клетки гладкой мускулатуры. Фиг. 6 Б: в этом раннем повреждении приTCAD CD40 определенно экспрессируется на многих клетках интимы. Фиг. 6 В: в частности,пенистые клетки показывают обильное окрашивание по CD40. (Фиг. 6 А х 25, фиг. 6 Б х 50, фиг. 6 В х 400). Фиг. 7 А-Г - Воспалительный инфильтрат присутствует в фиброзной шапочке повреждения интимы при нативном СА, меченном mAb против CD40L (фиг. 7 А), контрольным mAb(фиг. 7 Б), mAb против CD4 (фиг. 7 В) и mAb против CD8 (фиг. 7 Г). Фиг. 7 А: характерная цитоплазматическая иммунореактивность и СD40L-иммунореактивность клеточной поверхности, которая ограничивается лимфоцитами. Фиг. 7 Б: то же повреждение, окрашенное иррелевантным изотипным перекрестно-типируемым контрольным mAb, не показывает иммуного окрашивания. Фиг. 7 В: фактически все лимфоциты в зонах повреждения при нативном СА(как и многие макрофаги и пенистые клетки) представляют собой CD4+, что наводит на мысль, что CD40L+-лимфоциты представляют собой СD4+-Т-клетки. Фиг. 7 Г: СD8+-Т-клетки редки в бляшках интимы при нативном СА(Фиг. 7 А, 7 Б x1000, фиг. 7 В, 7 Г х 400). Фиг. 8 А-В - Глубокие лимфоидные скопления в интиме при TCAD, меченные mAb против CD40L (фиг. 8 А), контрольным mAb (фиг. 8 Б) и mAb против CD4 (фиг. 8 В). Фиг. 8 А: приTCAD большинство СD40L+-клеток (стрелки) обнаруживаются в лимфоидных скоплениях внутри интимы и в удалении от эндотелиальной поверхности. Фиг. 8 Б: иррелевантное изотипное перекрестно-типируемое контрольное mAb не показывает клеточного окрашивания в таких лимфоидных скоплениях в интиме. Фиг. 8 В: то же лимфоидное скопление в интиме, описанное выше, содержит почти исключительно CD4+-Tклетки, что наводит на мысль, что в зонах повреждения CD40L экспрессируются на СD4+-Тклетках. (Фиг. 8 А-В х 400). Фиг. 9 А-Б - Очаг эндотелита при TCAD,окрашенный mAb против CD8 (фиг. 9 А) и mAb против CD40L (фиг. 9 Б). Фиг. 9 А: при TCAD СD8+-Т-клетки связываются с люминальными эндотелиальными клетками, характерными для эндотелита. Большинство СD8+-Т-клеток присутствует в очагах эндотелита, в то время как в лимфоидных скоплениях интимы, удаленных от эндотелиальной поверхности, они редко присутствуют. Фиг. 9 Б: клетки зоны воспаления в очагах эндотелита представляют собой CD40L. Подобным образом, экспрессии CD40L на эндотелиальных клетках не обнаруживается. (Фиг. 9 А-Б х 400). Фиг. 10 А-Б - Фиг. 10 А: двойное иммунное 5 окрашивание повреждения интимы при нативном СА mAb против CD40 (коричневое окрашивание) и маркером для макрофагов mAb против CD68 (красное окрашивание). Центральное скопление клеток (стрелки) показывает сильное окрашиванеие в случае как CD40, так и CD68. Фиг. 10 Б: двойное иммунное окрашивание в случае TCAD mAb против CD40 (коричневое окрашивание) и mAb против актина гладких мышц (красное окрашивание) показывает СD40+-клетки гладкой мускулатуры (стрелки). СD40-реактивность ограничивается клетками гладких мышц интимы (стрелки), в то время как медиальные миоциты являются CD40-. (Фиг. 10 А-Б х 400). Фиг. 11 А-Г - Серийные срезы при нативном СА, демонстрирующие реваскуляризацию интимы, и окрашенные mAb против CD34 (фиг. 11 А), против CD40 (фиг. 11 Б), против ICAM-1(фиг. 11 В) и против VCAM-1 (фиг. 11 Г). Фиг. 11 А: эндотелиальные клетки новых сосудов интимы, видимые при окрашивании CD34. Фиг. 11 Б: неоваскулярные эндотелиальные клетки интимы определенно экспрессируют CD40. Соседние клетки зоны воспаления также показывают CD40. Фиг. 11 В, фиг. 11 Г: очаги образования новых сосудов также показывают сильную эндотелиальную реактивность в случае ICAM-1(фиг. 11 В) и VCAM-1 (фиг. 11 Г). (Фиг. 11 А-11 Г х 400). Фиг. 12 А-В - Двойное иммунное мечение сильно воспаленной зоны повреждения интимы при нативном СА mAb против CD40 (коричневое окрашивание) и mAb против молекул адгезии ICAM-1 (красное окрашивание) (фиг. 12 А),mАb против VCAM-1 (фиг. 12 Б), и иррелевантным контрольным mАb (фиг. 12 В). Фиг. 12 А: фактически все CD40+-клетки (коричневое окрашивание) преобладающее количество макрофагов (длинные стрелки) и миоциты интимы(короткие стрелки) определенно реактивны в отношении ICAM-1 (красное окрашивание). Фиг. 12 Б: большое число СD40+-клеток зоны воспаления (коричневое окрашивание) и миоцитов интимы (стрелки) также реактивны в отношении VCAM-1 (красное окрашивание). Фиг. 12 В: то же повреждение интимы, дважды окрашенным - по CD40 (коричневое окрашивание) и иррелевантным изотипным перекрестнотипируемым контрольным Аb, замененнымmАb против ICAM-1 и против VCAM-1 (красное окрашивание). Различается только коричневое окрашивание, без красного, что указывает на отсутствие вмешательства методов регистрации в случае последовательного применения(Фиг. 12 А-12 В х 400). Фиг. 13 - Двойное иммунное окрашивание повреждения интимы при нативном СА mAb против р 65, метящим активированный NF-В 6 окрашивание). Активированный NF-В виден исключительно в ядрах СD40+-клеток (стрелки),большинство из которых представялет собой макрофаги. (х 400). Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к способу ингибирования активации лигандом CD40 клеток гладкой мускулатуры, несущих CD40 на своей поверхности, включающему приведение в контакт клеток с агентом, способным к ингибированию взаимодействия между CD40-лигандом и CD40 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток. В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент способен ингибировать любое взаимодействие между СD40-лигандом и CD40. Выражение "взаимодействие между СD40-лигандом иCD40 на клетках" относится к одному или нескольким аспектам, функциональным или структурным, взаимосвязи СD40-лиганд CD40. Поэтому в одном из вариантов воплощения изобретения агент, который ингибирует взаимодействие, может конкурентно связываться с СD40 лигандом и таким образом блокировать или уменьшать связывание СD40-лиганда с клеточным CD40. В другом варианте воплощения изобретения агент, ингибирующий взаимодействие,может связываться с CD40 или СD40-лигандом способом, при котором не ингибируется связывание СD40-лиганда с клеточным CD40, но который влияет на клеточный ответ на лигирование CD40, например, посредством изменения скорости функционального цикла клеточногоCD40 или комплекса СD40-агент, посредством изменения кинетики связывания CD40 с СD40 лигандом, или посредством изменения скорости или степени клеточной активации в ответ на лигирование CD40. В определенных вариантах воплощения изобретения несущие CD40 клетки гладкой мускулатуры представляют собой клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетки гладкой мускулатуры сосудов, клетки гладких мышц бронхов, клетки гладкой мускулатуры аорты, коронарные клетки гладкой мускулатуры, клетки гладких мышц легких или клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта. В более конкретных вариантах воплощения изобретения клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта представляют собой клетки гладких мышц пищевода, желудка или кишечника, в том числе, клетки гладкой мускулатуры тонкой кишки или толстой кишки(кишечник). В варианте воплощения данного изобретения указанный агент ингибирует связывание СD40-лиганда с CD40 на клетках. В варианте осуществления данного изобретения указанный агент представляет собой белок. В другом варианте воплощения данного 7 изобретения указанный агент представляет собой нонпротеин. Используемый здесь термин"нонпротеин" включает любое и все соединения или агенты, содержащие иные элементы, чем простые или конъюгированные полипептидные цепи. К ним относятся элементы, такие как аминокислоты с непептидными связями; небелковые аминокислоты, такие как -, - или -аминокислоты, аминокислоты в D-конфигурации или другие небелковые аминокислоты, в том числе гомоцистеин, гомосерин, цитруллин,орнитин, -аминомасляная кислота, канаванин,дьенколовая кислота или -цианоаланин; моносахариды, полисахариды или углеводные группы; жирные кислоты или липидные группы; нуклеотидные группы, минеральные группы; или другие небелковые элементы. В другом варианте воплощения данного изобретения указанный агент представляет собой псевдопептидное соединение. Псевдопептидное соединение может быть, по меньшей мере, частично неприродным. Псевдопептидное соединение может имитировать маленькую молекулу. Соединение может обладать увеличенной устойчивостью, эффективностью, возможностями и биологической доступностью по причине имитатора. Кроме того, соединение может иметь пониженную токсичность. Псевдопептидное соединение может обладать повышенной проницаемостью в слизистые оболочки и кишки. Такое соединение можно получить синтетическим путем. Соединение настоящего изобретения может включать L-, D- или неприродные аминокислоты, -, -дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочную кислоту (изоэлектрический аналог аланина). Пептидный скелет соединения может иметь по меньшей мере одну связь, замененную PSI[CH=CH] (Kempt et al. (1991), Intl. J. Peptide andProk. Res., 38, 237-241). Соединение может также включать трифтортирозин, n-Cl-фенилаланин, п-Вr-фенилаланин, поли-L-пропаргилглицин, поли-D,L-аллилглицин или поли-Lаллилглицин. В другом варианте воплощения настоящего изобретения псевдопептидное соединение с биологической активностью ингибирования взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках может иметь связь, пептидный скелет или аминокислотный компонент, замещенный подходящим имитатором. Примерами неприродных аминокислот, которые могут быть подходящими аминокислотными имитаторами,являются -аланин, Lаминомасляная кислота, Lаминомасляная кислота, Lаминоизомасляная кислота, Lаминокапроновая кислота, 7-аминогептановая кислота, L-аспарагиновая кислота, L-глутаминовая кислота, цистеин (ацетаминометил), NВос-NСВZ-L-лизин, N-Вос-NFmoc-L-лизин, L-метионинсульфон, L 004401 8 норлейцин, L-норвалин, NBocCBZ-Lорнитин, NBoc-NCBZ-L-opнитин, Вос-пнитро-L-фенилаланин,Вос-гидроксипролин,Boc-L-тиопролин (Blondelle, S.E., et al. (1994),Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 22802286; Pinilla, C, et al. (1995), Peptide Science, 37,221-240). В определенном варианте белок содержит антитело или его часть, способное к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом иCD40 на клетках. Антитело является мноклональным или поликлональным антителом. В более специфичном варианте моноклональное антитело связывается с эпитопом, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5 с 8 (АТСС, инвентарный номер НВ 10916). Примером такого моноклонального антитела является моноклональное антитело 5 с 8(АТСС, инвентарный номер НВ 10916). В другом варианте антитело специфически связывается с CD40. Одним из примеров антитела против CD40 является моноклональное мышиное антитело против CD40 человека, доступное отGenzyme Customer Service (продукт 80-3702-01,Кэмбридж, Миннесота). В других вариантах моноклональное антитело представляет собой химерное антитело, приматизированное антитело, гуманизированное антитело или антитело,включающее CDR-область от первого человека и каркас антитела от второго человека. Смысл терминов "химерное", "приматизированное" и "гуманизированное" антитело и способы их получения хорошо известны специалистам в этой области техники. См., например, международную публикацию РСТWO 90/07861, опубликованную 26 июля 1990 г.USA (1989), 86:10029. Способы получения приматизированных антител описываются, например, в международной публикации РСТ, соответствующей международной заявкеPCT/US 92/06194 (Idec Pharmaceuticals); и в работеNewman et al., Biotechnology (1992), 10:14551460, включенных в данную заявку в качестве ссылок. Вообще гуманизированное антитело представляет собой антитело, содержащее один или несколько гипервариабельных участков (CDR.) нечеловеческого антитела, функционально связанных с сегментами человеческой остовной области. Могут присутствовать, необязательно,дополнительные остатки, связанные с нечеловеческим антителом. Типично по меньшей мере одна тяжелая цепь или одна легкая цепь содержит нечеловеческие CDR. Типично, нечеловеческие CDR представляют собой мышиные CDR. Вообще приматизированное антитело является антителом, содержащим один или несколько гипервариабельных участков (CDR) антитела вида иного, чем не являющегося человеком примата, функционально связанных с 9 сегментами остовной области примата, не являющегося человеком. Могут присутствовать,необязательно, дополнительные остатки, связанные с видом, от которого происходит CDR. Типично, по меньшей мере одна тяжелая цепь или одна легкая цепь содержит CDR вида, который не является приматом, не представляющим человека. Типично, CDR являются CDR человека. Как правило, химерное антитело является антителом, легкая и/или тяжелая цепи которого содержат области от разных видов. Например,один или несколько сегментов вариабельной (V) области одного вида могут быть связаны с одним или несколькими сегментами константной(С) области другого вида. Типично, химерное антитело содержит сегменты вариабельной области мыши, связанные с сегментами константной области человека, хотя могут использоваться сегменты других видов млекопитающих. Моноклональное антитело 5 с 8 продуцируется гибридомной клеткой, депонированной 14 ноября 1991 г. Американской коллекцией типовых культур (АТСС), 12301 Parklawn Drive,Rockville, Maryland 20852, U.S.A., по условиям Будапештского договора о международном различении депозита микроорганизмов для целей патентной процедуры. Гибридоме соответствует инвентарный номер АТСС НВ 10916. В специфичном варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область легкой или тяжелой цепи. В другом специфическом варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область. Еще в одном специфическом варианте часть антитела содержит Fabфрагмент или антитело с одной цепью. Антитело с одной цепью получают из вариабельных областей, связанных белковыми спейсерами в одну белковую цепь. В другом варианте белок содержит растворимую внеклеточную область СD40-лиганда или его часть, или его вариант, способные к ингибированию взаимодействия между СD40 лигандом и CD40 на клетках; или растворимую внеклеточную область CD40, или его часть, или его вариант, способные к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках. В специфическом варианте растворимая внеклеточная область СD40-лиганда илиCD40 представляет мономер. В другом варианте растворимая внеклеточная область CD40 представляет олигомер. Варианты могут отличаться от встречающихся в природе CD40 или СD40-лиганда по аминокислотной последовательности или по признакам, к которым не относится последовательность, или по обоим моментам. Варианты по аминокислотной последовательности получаются тогда, когда одна или несколько аминокислот во встречающихся в природе CD40 или СD40-лиганде замещаются другой природной аминокислотой, производным аминокислоты 10 или ненативной аминокислотой. Особенно предпочтительными вариантами являются встречающиеся в природе CD40 или СD40 лиганд, или биологически активные фрагменты встречающихся в природе CD40 или CD40 лиганда, чьи последовательности отличаются от последовательности дикого типа одним или несколькими консервативными замещениями аминокислот, которые, как правило, имеют минимальное влияние на вторичную структуру и гидрофобный характер белка или пептида. Варианты также могут иметь последовательности,отличающиеся одним или несколькими неконсервативными заменами аминокислот, делециями или инсерциями, которые не разрушают биологической активности CD40 или СD40 лиганда. Консервативные замены включают,обычно, замену одной аминокислоты на другую с похожими характеристиками, например, замены в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин,глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. К неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин,лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярными нейтральными аминокислотами являются глицин,серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженными (основными) аминокислотами являются аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженными(кислыми) аминокислотами являются аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Другие консервативные замены можно взять из табл. 1, а еще ряд замен описан Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure (1988). Таблица 1 Консервативные аминокислотные замены Другие варианты в пределах данного изобретения представляют собой варианты с модификациями, увеличивающими стабильность пептида. Такие варианты могут содержать, например, одну или несколько непептидных связей (которые замещают пептидные связи) в пептидной последовательности. Также включаются варианты, содержащие иные остатки, чем встречающиеся в природе L-аминокислоты, такие как D-аминокислоты, или невстречающиеся в природе или синтетические аминокислоты,такие как - или -аминокислоты и циклические варианты. Включение в полипептид Dаминокислот вместо L-аминокислот может увеличить его устойчивость к протеазам. См., например, патент США 5219990. Пептиды данного изобретения можно также модифицировать посредством различных изменений, таких как инсерции, делеции и замены, либо консервативные, либо неконсервативные, когда такие изменения могут обеспечить некоторые преимущества при их применении. В других вариантах воплощения изобретения варианты с аминокислотными заменами,являющимися менее консервативными, также могут дать в результате нужные производные,например, если вызвать изменения заряда, конформации и других биологических свойств. Такие замены обычно включают, например, замену гидрофильного остатка на гидрофобный остаток, замену цистеина или пролина на другой остаток, замену остатка с небольшой боковой цепью на остаток с объемной боковой цепью,или замену остатка с общим положительным зарядом на остаток с общим отрицательным зарядом. Когда результат данной замены нельзя предсказать с уверенностью, производные можно легко проанализировать описанными здесь методами и определить наличие или отсутствие нужных свойств. Варианты в объеме данного изобретения включают белки и пептиды с аминокислотными последовательностями, имеющими по меньшей мере восемь процентов гомологии с внеклеточной областью CD40 или внеклеточной областью СD40-лиганда. Предпочтительнее, чтобы гомология последовательностей составляла по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. До тех пор, пока возможны замены в скелете, также возможно замещать функциональные группы, декорирующие скелет, группами,характеризующимися подобными признаками. Такие замещения, в первую очередь, будут консервативными, т.е. замещающая группа будет приблизительно того же размера, формы, гид 004401 12 рофобности и заряда, что и первоначальная группа. Модификации, не относящиеся к последовательности, могут включать, например, дериватизацию частей встречающихся в природеCD40 или СD40-лиганда in vivo или in vitro, а также изменения степени ацетилирования, метилирования, фосфорилирования, карбоксилирования или гликозилирования. В другом варианте воплощения изобретения белок, включающий внеклеточную область СD40-лиганда и CD40, подвергают химическим модификациям, при которых сохраняется активность. Например, белки можно амидировать,сульфировать, однократно или несколько раз галогенировать, алкилировать, карбоксилировать или фосфорилировать. Белок также можно один или несколько раз ацилировать, например,ацетильной группой, фарнезильной группой или жирной кислотой, которая может быть насыщенной, мононенасыщенной или полиненасыщенной. Жирная кислота также может иметь один или несколько атомов фтора. Данное изобретение также включает метиониновые аналоги белка, например, метионинсульфоновые и метионинсульфоксидные аналоги. Данное изобретение также включает соли белков, такие как аммониевые соли, в том числе алкил- или ариламмониевые соли, сульфаты, гидросульфаты,фосфаты, гидрофосфаты, дигидрофосфаты, тиосульфаты, карбонаты, бикарбонаты, бензоаты,сульфонаты, тиосульфонаты, мезилаты, этилсульфонаты и бензолсульфонаты. Растворимый мономерный СD40-L-белок может содержать всю или часть внеклеточной области CD40-L. Внеклеточная область CD40-L содержит домен, который связывается с CD40. Таким образом, растворимый CD40-L может ингибировать взаимодействие между CD40L и несущей CD40 клеткой. Данное изобретение предполагает, что sCD40-L может составлять целую внеклеточную область CD40-L или фрагмент или производное, содержащее домен,который связывается с CD40. Растворимый СD40-белок (sCD40) содержит внеклеточную область CD40. sCD40 ингибирует взаимодействие между CD40L и CD40 несущей клеткой. SCD40 может находиться в мономерной или олигомерной форме. В другом варианте воплощения данного изобретения белок, содержащий растворимую внеклеточную область CD40 или ее часть, содержит также Fc-область, слитую с внеклеточной областью CD40 или ее частью. В конкретном варианте воплощения изобретения Fcобласть способна к связыванию с протеином А или протеином G. В другом варианте Fc-область содержит IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1,IgА 2, IgM, IgD или IgE. Растворимый слитый СD40/Fс-белок можно получить с использованием обычных методов разрезания ферментами и лигирования фрагментов из нужных последовательностей. 13 Подходящими Fc-областями для слитого белка являются Fc-области, которые могут связываться с протеином А или протеином G, или которые способны к распознаванию антителом, которое можно использовать при очистке или регистрации слитого белка, содержащего Fcобласть. Например, Fc-область может представлять собой Fc-область человеческого IgG1 или мышиного IgG1. Данное изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок CD40/Fc. Хорошо известен способ создания растворимых форм мембранных молекул методами рекомбинантной технологии, при котором вырезаются последовательности, кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены. См., для общего представления, патент США 5057417, Hammonds et al. Кроме того,хорошо известны способы получения sCD40 и слитого белка CD40/FC. См., например, международную публикацию РСТWO 93/08207;Biologic Responses of Human В Cells", J. Immunol., vol. 149, pp. 655-60 (July 1992). В варианте воплощения данного изобретения агент отбирают методом скрининга. В конкретном варианте агент отбирают методом скрининга, включающим выделение образца клеток; культивирование образца в условиях, допускающих активацию несущихCD40 клеток; приведение в контакт образца с клетками, экспрессирующими белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой,имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916,или с белком, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, эффективными для активации СD40-несущих клеток; приведение в контакт образца с количеством агента, эффективным для ингибирования активации СD40 несущих клеток, если агент способен ингибировать активацию СD40-несущих клеток; и определение того, активируют ли клетки, экспрессирующие белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, или белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой,имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916,СD40-несущие клетки в присутствии этого агента. Образец клеток можно выделить из разных тканей, включая клеточные линии в культуре или клетки, извлеченные из животного,такие как клетки в суспензии твердой ткани,клетки, полученные при биопсии костного мозга, или клетки, выделенные из жидкости организма, такой как кровь или лимфа. В другом конкретном варианте воплощения изобретения агента (молекулу) отбирают, 004401 14 основываясь на трехмерной структуре растворимой внеклеточной области СD40-лиганда или его части, способных к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках. Указанный агент можно выбрать из библиотеки известных агентов, модифицировать известный агент на основе трехмерной структуры или спроектировать и синтезировать его заново, основываясь на трехмерной структуре. В конкретных вариантах воплощения изобретения агент (молекулу) проектируют посредством оптимизации структуры ведущего ингибирующего агента на основе трехмерной структуры комплекса растворимой области СD40 лиганда или его части с ведущим ингибирующим агентом. Ведущий ингибирующий агент представляет молекулу, которая идентифицирована, которая, когда ее приводят в контакт с СD40-лигандом, связывается и образует комплекс с растворимой внеклеточной областью СD40-лиганда, CD40 или их частями, причем посредством этого снижается способность входящего в комплекс или связанного СD40 лиганда или части CD40-лиганда активировать СD40-несущие клетки. В другом варианте ведущий ингибирующий агент может действовать посредством взаимодействия либо с внеклеточной областью СD40-лиганда или CD40, либо в тройном комплексе как с частью СD40-лиганда,так и с CD40, снижая способность входящего в комплекс с CD40 СD40-лиганда активировать СD40-несущие клетки. В способах изобретенияCD40-лиганд может быть или растворимым или связываться с клетками, такими как активированные Т-клетки, и может представлять или непроцессированный нативный СD40-лиганд, или его части. Пониженную способность активировать СD40-несущие клетки можно измерить различными способами. Одним из способов ее измерения может быть демонстрация того, что СD40-лиганд в присутствии ингибитора вызывает активацию СD40-несущих клеток в меньшей степени по сравнению с обработкой клеток подобным количеством СD40-лиганда без ингибитора при тех же условиях. На пониженную способность активировать СD40-несущие клетки может также указать потребность в более высокой концентрации комплекса ингибитора с СD40-лигандом по сравнению с несвязанным СD40-лигандом для получения одинаковой степени активации СD40-несущих клеток при одинаковых условиях. В крайнем случае, ингибитор, приведенный в контакт с CD40-лигандом,может быть неспособен активировать СD40 несущие клетки при концентрациях и при условиях, при которых возможна активация этих клеток несвязанным СD40-лигандом или его данной частью. Агент (молекулу) можно выбрать посредством скрининга с применением вычислительной техники с использованием кристаллической структуры растворимого фрагмента внеклеточ 15 ного домена человеческого CD40L, содержащего остатки Glyll6-Leu261 (ПОСЛЕД.1)(SCD40L (116-261. Кристаллическую структуру, используемую при методе скрининга, определяют с разрешением 2 А методом молекулярного замещения. Коротко, растворимый фрагмент внеклеточного домена человеческого СD40-лиганда,содержащего аминокислотные остатки с Gly 116 по С-концевой остаток Leu 261, сначала получают в растворимой форме, затем очищают и кристаллизуют. Кристаллы используют для сбора дифракционных данных. Молекулярное замещение и очистку осуществляют с помощью пакета программ XPLOR и программного обеспечения QUANTA (Molecular Simulations, Inc.). В частности, 3-мерную модель человеческогоSCD40L создают с использованием модели мышиного CD40L с применением программы моделирования гомологии белков QUANTA. Эту модель используют в качестве зонда для вычислений при кристаллографическом анализе и совершенствуют с использованием XPLOR. Этот способ определения кристаллической структурыsCD40L (116-261) приводятся на фиг. 2 А-Ш. Метод скрининга для отбора агента включает компьютерную разработку лекарственного средства и итеративную оптимизацию структуры, как описано ниже. Агент может представлять собой ингибитор, выбранный с использованием компьютерной разработки лекарственного средства. При использовании этого метода координаты кристаллической структуры SCD40L используют в качестве исходных данных для компьютерной программы, такой как DOCK", выдающей список молекулярных структур, которые, как ожидается, связываются с CD40L. Применение таких компьютерных программ хорошо известно. См., например, Kuntz, "Structure-Based Strategiesfor drug design and discovery". Science, vol. 257,p. 1078 (1992). Список молекулярных структур затем можно скринировать посредством биохимических анализов на связывание CD40L. Можно использовать биохимические анализы конкурентного типа, которые хорошо известны. См.,например, Bajorath et al., "Identification of residues of CD40 and its ligand which are critical forthe receptor-ligand interaction". Biochemistry, 34,p. 1833 (1995). Структуры, для которых обнаруживают связывание с CD40L, можно, таким образом, использовать в качестве агентов для настоящего изобретения. Такой агент может также представлять собой модифицированную или разработанную молекулу, определенную посредством интерактивных циклов оптимизации структуры. С использованием такого подхода небольшую молекулу ингибитора CD40L, най 004401 16 денную с применением вышеописанного компьютерного подхода или иного подхода, можно сокриталлизовать с sCD40L и кристаллической структурой комплекса, разрешенной посредством молекулярного замещения. Информацию,полученную с помощью молекулярного замещения, можно использовать для оптимизации структуры ингибиторов, выясняя, как молекулы взаимодействуют с CD40L. Молекулу можно модифицировать для улучшения ее физикохимических свойств, в том числе специфичности и аффинности к CD40L. В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент представляет собой небольшую молекулу. Используемый здесь термин"небольшая молекула" относится к соединению с молекулярной массой от 20 Д до 1106 Д,предпочтительно от 50 Д до 2 кД. Данное изобретение также относится к способу ингибирования у субъекта активации СD40-лигандом клеток гладкой мускулатуры,несущих CD40 на поверхности клеток, включающему введение указанному субъекту агента,способного к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках, причем указанный агент присутствует в количестве,эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта. В определенных вариантах воплощения СD40-несущие клетки гладкой мускулатуры представляют собой клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетки гладких мышц сосудов, клетки гладкой мускулатуры бронхов,клетки гладких мышц аорты, коронарные клетки гладкой мускулатуры, клетки гладкой мускулатуры легких или клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта. В более конкретных вариантах воплощения изобретения клетки гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта представляют собой клетки гладких мышц пищевода, желудка или кишечника, в том числе клетки гладкой мускулатуры тонкой кишки или толстой кишки (кишечник). В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент ингибирует связывание СD40-лиганда с CD40 на клетках. В одном из вариантов осуществления данного изобретения указанный агент представляет собой белок. В другом варианте воплощения данного изобретения указанный агент представляет собой нонпротеин. В определенном варианте осуществления данного изобретения белок содержит антитело или его часть, способные к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках. Антитело является моноклональным или поликлональным антителом. В более специфическом варианте моноклональное антитело специфически связывается с эпитопом, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5 с 8 (АТСС, инвентарный номер НВ 10916). Примером такого моноклонального ан 17 титела является моноклональное антитело 5 с 8(АТСС, инвентарный номер НВ 10916). В других вариантах моноклональное антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. В одном из конкретных вариантов часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область легкой или тяжелой цепи. В другом конкретном варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область. Еще в одном конкретном варианте часть антитела содержит гипервариабельный участок или вариабельную область. Еще в одном специфическом варианте часть антитела содержит Fab-фрагмент или антитело с одной цепью. В другом варианте белок содержит растворимую внеклеточную область СD40-лиганда или его часть, способные к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках; или растворимую внеклеточную область CD40, или его часть, способные к ингибированию взаимодействия между СD40 лигандом и CD40 на клетках. В специфическом варианте растворимая внеклеточная область СD40-лиганда или CD40 представляет собой мономер. В другом варианте растворимая внеклеточная область CD40 представляет собой олигомер. В другом варианте воплощения данного изобретения белок, содержащий растворимую внеклеточную область CD40 или его часть, содержит также Fc-область, слитую с внеклеточной областью CD40 или его частью. В определенном варианте воплощения изобретения Fcобласть способна к связыванию с протеином А или протеином G. В другом определенном варианте Fc-область содержит IgG, IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA, IgA1, IgA2, IgM, IgD или IgE. При введении белков они часто быстро выводятся из циркуляции, и, следовательно,можно добиться относительно кратковременного фармакологического действия. В результате для поддержания терапевтической эффективности могут потребоваться частые инъекции относительно больших доз биологически активных белков. Известно, что белки, модифицированные посредством ковалентного присоединения водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин, демонстрируют существенно более длительные периоды полувыведения из крови после внутривенной инъекции, чем соответствующие немодифицированные белки (Abuchowski et al., в "Enzymes asUSA, 84:1487-1491 (1987. Такие модификации могут также увеличить растворимость белка в водном растворе, устранить агрегацию, усилить физическую и химическую устойчивость белка и существенно уменьшить иммуногенность и антигенность белка. В результате нужной биологической активности in vivo можно достичь посредством менее частого введения таких полимернобелковых аддуктов, или введением их в меньших дозах, чем в случае немодифицированного белка. Присоединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) к белкам особенно полезно, поскольку ПЭГ обладает весьма низкой токсичностью в организме млекопитающих (Carpenter et al., 1971). Например, ПЭГ-аддукт аденозиндезаминазы одобрен в Соединенных Штатах Америки для применения людьми при лечении синдрома тяжелого сложного иммунодефицитного состояния. Второе преимущество, получаемое при конъюгации с ПЭГ, состоит в эффективном снижении иммуногенности и антигенности гетерологичных белков. Например, ПЭГ-аддукт человеческого белка может быть полезным для лечения болезни у других видов млекопитающих без риска возникновения тяжелой иммунной реакции. По одному из вариантов воплощения данного изобретения белок можно доставлять в устройстве для микроинкапсуляции, чтобы уменьшить или предотвратить иммунную реакцию хозяина против белка. Белок также можно доставлять инкапсулированным в оболочке, такой как липосома. Полимеры, такие как ПЭГ, можно подходящим образом присоединить к одному или нескольким аминокислотным остаткам в белке,таким как -аминогруппа аминоконцевой аминокислоты, -аминогруппы лизиновых боковых цепей, сульфгидрильные группы цис-теиновых боковых цепей, карбоксильные группы аспартильной или глутамиловой боковых цепей, карбоксильная группа карбоксиконцевой аминокислоты, тирозиновые боковые цепи, или к активированным производным гликозильных цепей, присоединенных к некоторым аспарагиновым, сериновым или треониновым остаткам. Описаны многочисленные активированные формы ПЭГ, подходящие для прямого взаимодействия с белками. Полезными ПЭГреагентами для взаимодействия с белковыми аминогруппами являются активные эфиры карбоновой кислоты или карбонатные производные, в особенности, те, в которых отщепляющиеся группы представляютN-гидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1 гидрокси-2-нитробензол-4-сульфонат. Производные ПЭГ, содержащие малеимидо- или галогенацетильные группы, являются полезными реагентами для модификации белка без сульфгидрильных групп. Подобным образом, ПЭГреагенты, содержащие аминогидразиновые или 19 гидразидные группы, полезны для взаимодействия с альдегидами, образующимися при периодатном окислении углеводных групп в белках. Субъект, которого можно лечить вышеописанными способами, представляет собой животное. Предпочтительно это животное является млекопитающим. Примерами млекопитающих, которых можно лечить, являются, но не ограничиваются перечисленным, человек,приматы (не человек), грызуны (в том числе крысы, мыши, хомяки и морские свинки), коровы, лошади, овцы, козы, свиньи, собаки и кошки. В одном из вариантов воплощения данного изобретения агент отбирают методом скрининга. В определенном варианте агент отбирают методом скрининга, включающим выделение образца клеток; культивирование образца в условиях, допускающих активацию несущихCD40 клеток; приведение в контакт образца с клетками, экспрессирующими белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой,имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916,или с белком, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, эффективным для активации СD40-несущих клеток; приведение в контакт образца с количеством агента, эффективным для ингибирования активации СD40 несущих клеток, если агент способен ингибировать активацию СD40-несущих клеток; и определение того, активируют ли клетки, экспрессирующие белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой, имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916, или белок, который специфически распознается моноклональным антителом 5 с 8, продуцированным гибридомой,имеющей инвентарный номер АТСС НВ 10916,СD40-несущие клетки в присутствии этого агента. Образец клеток можно выделить из разных тканей, включая клеточные линии в культуре или клетки, извлеченные из животного,такие как клетки в суспензии твердой ткани,клетки, полученные при биопсии костного мозга, или клетки, выделенные из жидкости организма, такой как кровь или лимфа. В другом определенном варианте воплощения изобретения молекулу (агент) выбирают,основываясь на трехмерной структуре растворимой внеклеточной области СD40-лиганда или его части, способных к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 ка клетках. Указанную молекулу можно выбрать из библиотеки известных молекул, модифицировать известную молекулу на основе трехмерной структуры или разработать и синтезировать ее заново, основываясь на трехмерной структуре. В конкретных вариантах воплощения изо 004401 20 бретения агент или молекулу разрабатывают посредством оптимизации структуры ведущего ингибирующего агента на основе трехмерной структуры комплекса растворимой внеклеточной области CD40-лиганда или его части с ведущим ингибирующим агентом. Способ лечения Данное изобретение относится к способу лечения субъекта от заболевания, зависимого от клеток гладкой мускулатуры, включающему описанный выше способ ингибирования активации CD40-лигандом клеток гладкой мускулатуры, несущих CD40 на своей поверхности, который включает введение указанному субъекту агента, способного к ингибированию взаимодействия между СD40-лигандом и CD40 на клетках, причем этот агент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования активации клеток у субъекта. В одном из вариантов воплощения данного изобретения зависящая от клеток гладкой мускулатуры болезнь представляет собой сосудистое заболевание. В конкретном варианте воплощения изобретения сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз. В другом варианте воплощения данного изобретения зависящая от клеток гладкой мускулатуры болезнь представляет собой желудочно-кишечное заболевание. В конкретном варианте воплощения изобретения желудочнокишечное заболевание выбирают из группы,состоящей из нарушения моторики пищевода,воспаления кишечника и склеродермии. В одном из вариантов воплощения изобретения зависящая от клеток гладкой мускулатуры болезнь представляет собой заболевание мочевого пузыря. Соединения данного изобретения можно вводить любым способом, который приемлем с медицинской точки зрения. Это могут быть инъекции посредством парентеральных способов, таких как внутривенное, внутрисосудистое,внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутриопухолевое, внутрибрюшинное,внутрижелудочковое, внутриэпидуральное введение, или другое, а также пероральный, назальный, офтальмический, ректальный, местный способы или ингаляция. Введение с отсроченным высвобождением также определенно включается в изобретение, с помощью таких средств,как инъекция разрушаемых имплантатов, непосредственно применяемых во время операции. Соединения вводят в любой дозе на массу тела и с любой частотой, которые приемлемы с медицинской точки зрения. Приемлемая дозировка включает интервал примерно от 0,01 до 200 мг на кг массы тела субъекта. Предпочтительный интервал доз составляет примерно 0,150 мг/кг. Особенно предпочтительна доза примерно в 1-30 мг/кг. Введение дозы повторяют с интервалами от ежесуточного до ежемесячного. При одной из предпочтительных схем приема 21 соединение согласно изобретению должно вводиться ежесуточно в первые трое суток лечения,после чего соединение вводят каждые 3 недели,причем каждое введение представляет собой внутривенное введение 5-10 мг на кг массы тела. По другой предпочтительной схеме соединение изобретения должно вводиться внутривенно ежесуточно в количестве 5 мг на кг массы тела в первые трое суток лечения, после чего соединение вводят подкожно или внутримышечно каждую неделю в количестве 10 мг на субъекта. При другой предпочтительной схеме необходимо вводить парентерально однократную дозу соединения изобретения в 20 мг на кг массы тела, после чего соединение вводят подкожно или внутримышечно каждую неделю в количестве 10 мг на субъекта. Соединения согласно изобретению можно вводить в виде однократной дозы в случае определенных показаний, таких как предотвращение иммунной реакции на антиген, воздействовующий на субъекта непродолжительное время,такой как экзогенный антиген, вводимый в определенный день лечения. Примеры такого антигена могут включать совместное введение соединения согласно изобретению вместе с генотерапевтическим вектором, или лечебным средством, таким как антигенный, фармацевтический продукт или продукт из крови. При показаниях, когда антиген присутствует постоянно, таких как регулирование иммунной реакции против трансплантированной ткани или постоянно вводимых антигенных фармацевтических средств, соединения согласно изобретению вводят в течение времени, соответствующего медицинским показаниям, на протяжении от суток или недель до всей жизни субъекта. Воспалительные реакции характеризуются покраснением, отеком, повышенной температурой тела и болью как следствиями расширения капилляров при отеке и миграции фагоцитарных лейкоцитов. Определение воспаления также дается у Gallin (Chapter 26, Fundamental Immunology, 2d Ed., Raven Press, New York, 1989,pp. 721-733), что включено в настоящее описание в виде ссылки. Данное изобретение можно лучше понять из приведенных далее подробностей эксперимента. Однако специалисту в этой области техники легко представить, что обсуждаемые конкретные способы и результаты только поясняют изобретение, более полно описанное в приведенной далее формуле изобретения. Подробности эксперимента Приведенные ниже примеры 1 и 2 показывают, что цитокины в зоне воспаления побуждают клетки гладкой мускулатуры экспрессировать CD40. Кроме того, в них показано, что опосредованные CD40L сигналы регулируют функции клеток гладкой мускулатуры. Пример 1. Чтобы исследовать, экспрессируют ли 22 клетки гладких мышц CD40, используют FACSанализ. В 6-луночных планшетах культивируют клетки гладких мышц аорты человека в средеM119 с добавлением 25% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 5% человеческой сыворотки, 90 мкг/мл гепарина, 15 мкг/мл энедотелиоцитарного фактора роста и 1% пенициллина-стрептомицина. Среду заменяют каждые 2-3 дня, и когда клетки почти сольются, их в течение 72 ч выращивают в присутствии или в отсутствие IFN- (1000 Е/см 3), IL-1 (1 нг/см 3) или TNF- (200 Е/см 3). Клетки собирают посредством обработки трипсином с ЭДТА, и посредством FACS-анализа с использованиемmAb против CD40 G28.5 определяют экспрессию CD40. Клетки также окрашивают изотопным отрицательным контрольным mAb, а в качестве положительного контроля используютmAb против CD54 (ICAM-1). Клетки гладкой мускулатуры конститутивно не экспрессируют CD40, как показано на фиг. 1 А. Однако IFN- в противополжность IL1 или TNF- активирует экспрессию CD40 клетками гладкой мускулатуры (фиг. 1 А, Б и В). Эти исследования показывают, что IFN- активизирует экспрессию CD40 на клетках гладкой мускулатуры аорты человека. Пример 2. Проверяют экспрессию CD40 на клетке гладкой мускулатуры in situ. Клетки, обнаруженные в средах здоровых сосудов, которые морфологически похожи на клетки гладких мышц, не реагируют с mAb против CD40. Однако клетки, которые морфологически схожи с клетками гладких мышц, обнаруженными в пределах зоны воспалительных повреждений при ускоренном атеросклерозе, связанном с трансплантацией, экспрессируют CD40 in situ. Эти исследования наводят на мысль, что цитокины в зоне воспаления побуждают клетки гладких мышц экспрессировать CD40. Кроме того, эти исследования показывают, что опосредованные CD40L сигналы регулируют функции клеток гладкой мускулатуры. Пример 3. СD40L+СD4+-Т-клетки и СD40+-клеткимишени присутствуют при атеросклерозе и гомологичной коронарно-артериальной болезни. Активированные эндотелиальные клетки (ЕС),макрофаги (Маc) и СD4+-Т-клетки присутствуют в начале в повреждениях при коронарном атеросклерозе (СА) и гомологичном кардиоатеросклерозе (ТА). Поскольку CD40L является индуцированной активацией молекулой поверхности СD4+-Т-клетки, которая доставляет контактзависимые активирующие сигналы к СD40+-клеткам-мишеням, включая ЕС (активированные IСАМ, VCAM и экспрессией Еселектина) и Маc (вызывает продукцию NO,TNF- и IL-1), авторы исследуют экспрессию in 23 Экспрессию CD40L и CD40 определяют с использованием mAb против CD40L 5 С 8, mAb против CD40 G28.5 или подходящих контрольных mAb. Замороженные срезы здоровых венечных артерий (n=3) не содержат Т-клеток, и экспрессия CD40 ограничивается ЕС. Напротив,повреждения, связанные с СА и ТА, содержат СD40L+СD4+-Т-клетки, что определяется посредством иммунного мечения серийных срезов. Кроме того, заметно активируется экспрессия CD40 в замороженных срезах от пациентов с СА и ТА на ЕС, проникающих мононуклеарных клетках, пенистых клетках и клетках гладкой мускулатуры интимы (SMC). Двухцветовой иммуногистохимический анализ фиксированной в парафине ткани с использованием специфических маркеров для SMC (актин гладких мышц) или Mac (HAM-56) подтверждает экспрессиюCD40 на этих клетках. Интересно, что SMC интимы, отдаленные от клеток зоны воспаления, и медиальные SMC представляют собой CD40+,что приводит к мысли, что медиаторы местного воспаления активируют экспрессию CD40 наSMC in vivo. Активация CD40 и СD40L+СD4+-Тклетки обнаруживаются на всех стадиях ТА и наиболее заметны в зонах ранних повреждений при СА, включая жировые полоски. Одновременно эти исследования приводят к мысли, что СD40L+-Т-клетки могут взаимодействовать сCD40+-клетками-мишенями при СА и ТА и вносят вклад в патогенез этих болезней, промотируя синтез молекул зоны провоспаления. Пример 4. CD40 экспрессируется на клетках гладкой мускулатуры и макрофагах в зонах повреждения при гомологичном атеросклерозе. Экспрессия CD40 in situ при нативном атеросклерозе или атеросклерозе, связанном с трансплантацией, исследуется с помощью двухцветного иммуногистохимического анализа. Иммуногистохимические исследования с двойным мечением осуществляют на венечных артериях, зафиксированных в 10% забуференном формалине и залитых парафином. Срезы освобождают от парафина в ксилоле, гидратируют и блокируют эндогенную пероксидазу 1/5% Н 2 О 2 в 80% спирте. Затем срезы переваривают 0,01% пепсином в НСl (рН 1,5) в течение 15 мин при 37 С. Затем срезы промывают в PBS и инкубируют с 10% лошадиной сывороткой в течение 20 мин для блокирования неспецифического окрашивания. Затем анти-СD40-окрашивание обнаруживают с помощью набора Vector ABCElite (Vector) с использованием последовательно в качестве проявителя биотинилированного вторичного антитела, авидинпероксидазного комплекса и 3,3'-диаминобензидина. Присутствие CD40 отмечают как коричневое окрашивание. После этого срезы промывают в PBS и снова блокируют с 10% лошадиной сыворотки. Затем срезы инкубируют в течение 1 ч с mAb,специфическими клетками гладкой мускулатуры (актин гладких мышц) или к макрофагам(НАМ 56). Первичные антитела затем конъюгировали со щелочной фосфатазой с использованием авидин-биотиновой системы (Vector). Вектор Red (Vector) используют для обнаружения активности щелочной фосфатазы, а окрашивание дает красный цвет. Следовательно,двукратно меченные клетки окрашиваются в коричневый цвет (CD40) и красный цвет (клетки гладких мышц или макрофаги). Чтобы проконтролировать взаимное влияние двух иммуногистохимических процедур, используемых для двухмаркерного анализа, серийные срезы каждого образца также окрашивают или актином гладких мышц для CD40, или НАМ 56. См. фиг. 3 А и Б. Контрольные срезы показывают такое же распределение иммунореактивности для каждого из первичных mAb, как и срезы с двойным окрашиванием. Пример 5. Распределение CD40L и CD40 при нативном коронарном атеросклерозе и коронарно-артериальной болезни, связанной с трансплантацией: корреляция экспрессии CD40 с присутствием факторов межклеточной адгезии, активированных NF-В в присутствии Тлимфоцитов. Т-клетки играют определенную роль в патогенезе нативного коронарного атеросклероза(СА) и коронарно-артериальной болезни, связанной с трансплантацией (TCAD), однако, механизм, с помощью которого Т-клетки взаимодействуют с другими клетками при таких повреждениях, известен не вполне. CD40L представляет собой индуцированную активацией молекулу на поверхности СD4+-Т-клетки, которая взаимодействует с СD4+-клеткамимишенями, включая макрофаги и эндотелиальные клетки, и вызывает продукцию молекул зоны провоспаления, в том числе ICAM-1 иVCAM-1. Кроме того, известно, что лигирование CD40 активирует фактор транскрипции NFВ. Чтобы исследовать, могут ли взаимодействия CD40L-CD40 играть роль в патогенезе СА или TCAD, осуществляют иммуногистохимические исследования экспрессии CD40L и CD40 на замороженных срезах венечных артерий, полученных от реципиентов кардиального аллотрансплантата с СА (n=9) или TCAD (n=9). При использовании двух разных mAb против CD40L находят, что экспрессия CD40L при СА и TCAD ограничена инфильтрующими лимфоцитами. При обоих заболеваниях экспрессия CD40 заметно активируется на эндотелиальных клетках интимы, пенистых клетках, макрофагах и клетках гладкой мускулатуры. Двойное иммунное окрашивание показывает, что многие СD40+клетки коэкспрессируют ICAM-1, VCAM-1 или активированную форму NF-В. Степень экспрессии CD40, ICAM-1 и VCAM-1 показывает значимую статистическую корреляцию с тяжестью заболевания и количеством лимфоцитов в интиме. В то же время эти исследования пока 25 зывают присутствие активированных CD40L+- и СD40+-клеток в очагах повреждения как при СА, так и при TCAD, и наводят на мысль, что опосредованные CD40L взаимодействия сCD40+-макрофагами, пенистыми клетками,клетками гладкой мускулатуры и/или эндотелиальными клетками могут вносить вклад в патогенез этих заболеваний. Ряд данных показывает, что опосредованные клетками иммунные механизмы вносят вклад в воспалительные повреждения (1-4), характерные для нативного коронарного атеросклероза (СА) (5-10) и коронарно-артериальной болезни, связанной с трансплантацией (TCAD)(11-13). Например, инфильтрирующие Т-клетки интимы, экспрессирующие маркеры активации,такие как CD25 и молекулы класса II ГКГС,присутствуют с начала развития повреждений сосудов при обоих заболеваниях (5, 14). Обычно в местах повреждения при обоих заболеваниях обнаруживаются активированные макрофаги,как цитокины, связанные с зависимыми от Тклеток иммунными реакциями, включая IFN-,IL-1 и TNF-, (5-17). В качестве другого доказательства того, что Т-клетки могут играть патогенную роль при СА, из фиброатероматозных СА-бляшек человека выделены клоны CD4+-Tклеток, которые пролиферируют и секретируютIFN- в присутствии окисленного LDL (18) основного элементам повреждений как при нативном СА, так и при TCAD (1, 19, 20). Кроме того, индуцированные гиперлипидимией атеросклеротические повреждения у мышей, обработанных mAb против CD4, уменьшаются (21). Подобным образом сосудистые повреждения при TCAD существенно корригируются, когда аллотрансплантаты подсаживают в линии мышей с генетическим дефицитом Т-клеток (13) или обработанных mAb против CD4 (13) или против IFN- (22). Одновременно эти данные позволяют уверенно предположить, что Тклетки и образовавшиеся из Т-клеток молекулыэффекторы участвуют в патогенезе этих заболеваний (9, 23, 24).CD40L представляет собой поверхностную молекулу с м.м. 30-33 кД, экспрессируемую на активированных СD4+-Т-клетках, которая доставляет контакзависимые сигналы к CD40+клеткам-мишеням, таким как В-клетки (25-29). Опосредованные CD40L сигналы являются существенно важными при развитии зависимых от Т-клеток гуморальных иммунных реакций invitro и in vivo (30). Неизвестно, что взаимодействия CD40L-CD40 также играют роль при опосредованных клетками иммунных реакциях in 26 зывает продукцию факторов, которые усиливают иммунные реакции и/или обладают провоспалительным действием. Например, взаимодействия CD40L-CD40 активируют экспрессию ГКГС класса II и костимулирующего фактораCD86 на макрофагах in vitro (38). Кроме того,лигирование CD40 с макрофагами вызывает продукцию цитокинов (TNF-, IL-1, IL-12),хемокинов (IL-8, MIP-1), окиси азота (NO) через индукцию синтеза NO (2), белкового тканевого фактора прокоагуляции и металлопротеиназ матрикса (33, 34, 39-42). Взаимодействия CD40L-CD40 активируют факторы межклеточной адгезии CD54 (ICAM-1), CD106(VCAM-1) и CD62E (Е-селектин) на эндотелиальных клетках (35-37). Многие из эффектов лигирования CD40 зависят от активации фактора транскрипции NF-B (43-45). Вместе с тем, эти данные приводят к представлению, что лигирование CD40 с различными клетками-мишенями может усилить опосредованную СD4+-Т-клетками воспалительную реакцию in vivo. В поддержку такого предположения выступает факт, что экспрессия CD40 активируется в почках больных с напоминающим волчанку гломерулонефритом, IgAнефропатией и АNСА+-гломерулонефритом, и в коже больных псориазом (35, 46). Кроме того,CD40L+-Т-клетки инфильтрируют почки больных с воспалительными болезнями почек (46). Поскольку взаимодействия Т-клеток с макрофагами, эндотелиальными клетками и, возможно,другими клетками играют роль в патогенезе СА и TCAD, в данном исследовании с помощью иммуногистохимических методов изучается экспрессия CD40L и CD40 при этих двух заболеваниях. CD40L экспрессируется на Т-клетках,а экспрессия CD40 активируется на эндотелиальных клетках, клетках гладкой мускулатуры,макрофагах и "пенистых" клетках в местах повреждения интимы при обоих заболеваниях. Кроме того, с использованием двойного иммунного окрашивания обнаруживается, что многие СD40+-клетки в этих повреждениях коэкспрессируют CD54, CD106 и активированную формуNF-B. Методы: человеческие венечные артерии Получают сегменты из главной левой венечной артерии или проксимальной части левой передней нисходящей артерии от эксплантированных сердец 23 реципиентов кардиального аллотрансплантата. Девять больных подвергаются ретрансплантации, поскольку у них развилась тяжелая коронарно-артериальная болезнь, связанная с трансплантацией (TCAD). У этих больных продолжительность существования первого аллотрансплантата составила от 38 до 103 месяцев. Десять больных получают кардиальные трансплантаты, потому что у них развилась тяжелая коронарно-артериальная болезнь и ишемическая кардиомиопатия. Кон 27 трольные венечные артерии без атеросклеротических изменений получают из эксплантированных сердец 4 больных; у 3 идиопатическая кардиомиопатия, у одного кардиальная саркома. Части каждого сосуда быстро замораживают в изопентане при -80 С и делают серийные срезы толщиной 4 мм на криостате (Reichert Histostat). Срезы помещают на покрытые сиалином предметные стекла, сушат на воздухе, фиксируют в холодном ацетоне в течение 1 мин, еще в течение 7 мин в холодной смеси ацетона с хлороформом (1:1) и хранят при -80 С. По одному срезу от каждой венечной артерии фиксируют в 10% формалине и окрашивают гематоксилином и эозином для гистологической оценки. Первичные антитела Гибридому G28.5 (IgG1) против CD40 закупают у Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд). mAb 5C8 (IgG2a) против CD40L генерируют так, как описано ранее (28). mAb, как G28.5, так и 5 С 8, очищают от асцитов с использованием колонки с протеиномmAb против CD40L (IgG1) закупают у Calbiochem (Сан-Диего, Калифорния). IgM - mAb против CD40 закупают у Caltag (Burlingame, Калифорния), и используют для исследований с двойным иммунным окрашиванием. Моноклональные антитела против CD3, CD4, CD8,CD34, CD68 (Novocastra, Burlingham, Калифорния, все IgGl) и актина гладкой мускулатуры(SMA) (DAKO, Carpinteria, Калифорния, IgG2a) используют для распознавания различных типов клеток бляшек интимы, в том числе, Т-клеток(CD34), макрофагов (CD68) и клеток гладкой мускулатуры (SMA). У CHEMICON (Temecula, Калифорния) закупают mAb против ICAM1 (IgG1) и против VCAM-1 (IgG1). Распределение активированного NF-В определяют с помощьюMANNHEIM), которое связывается с эпитопом на субъединице р 65 NF-В, блокированного IВ, и поэтому доступной только, когда NFВ активируется в результате диссоциации IВ(47). Изотипное контрольное mAb (Moрес 21,22) получают от SIGMA (Сент-Луис, Миссури). Иммуногистохимия Замороженные срезы промывают в забуференном фосфатом физиологическом растворе(PBS) и эндогенную пероксидазу блокируют 0,5% перекисью водорода. Срезы "блокируют" 10% козьей сывороткой и агрегированным Ig человека (80 мг/мл) в PBS и затем инкубируют в течение одного часа с указанным первичнымmAb или соответствующим контрольным mAb. Замороженные срезы миндалин с фолликулярной гиперплазией используют в качестве позитивного контроля для определения оптимального разведения каждого mAb. Первичное mAb, 004401 28 связанное с антигеном-мишенью, присоединяют к меченному биотином изотипному специфическому козьему антимышиному IgG1, IgG2a,IgG3 или IgM (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания), которое затем конъюгируют с авидин-биотин-пероксидазными комплексами(VECTOR ELITE KIT, VECTOR, Burlingham, Калифорния). Перокидазную активность обнаруживают с помощью хромогена (красный) 3-амино-9-этилкарбазола (АЕС, VECTOR,Burlingham, Калифорния), и срезы окрашивают контрастным веществом гематоксилином Майера (SIGMA, Сент-Луис, Миннесота). Иммуногистохимию с двойным окрашиванием используют для идентификации типов клеток, экспрессирующих CD40, и для определения распределения CD40 относительноICAM-1, VCAM-1 или активированного NF-В при атеросклеротических повреждениях. Все срезы сначала метят иммунно с помощью IgMmAb против CD40. Вторичное антитело представляет собой биотинилированный козий антимышиный IgM, который затем конъюгируют с авидин-биотин-пероксидазным комплексом. Хромоген, используемый для обнаружения присутствия IgM-mAb против CD40, представляет собой 3,3'-диаминобензидин (коричневое окрашивание). Срезы затем тщательно ополаскивают и инкубируют со вторым первичным mAb,имеющим мишенью или специфический маркер клеток гладкой мускулатуры (SMA), или макрофаги (CD68), лекоцитарные факторы адгезииNF-В. Все эти вторые первичные антитела представляют собой изотипы или IgG1 илиIgG2a или IgG3. Применяют соответствующее изотипное специфическое биотинилированное вторичное антитело и конъюгируют с комплексом авидина с биотином и щелочной фосфатазой (VECTOR, Burlingham, Калифорния). Активность щелочной фосфатазы регистрируют с помощью хромогена Vector Red (VECTOR,Burlingham, Калифорния). Взаимных помех при последовательно применяемых процедурах окрашивания избегают путем использования различных иммуноферментных методов (пероксидаза против щелочной фосфатазы) и изотипных специфических вторичных антител для каждого антигена-мишени. Кроме того, получают контрольные срезы с двойным мечением, в которых одно из двух первичных mАb замещают изотипным подобранным под пару контрольнымmAb. Полуколичественный анализ повреждений Степень атеросклеротических повреждений в каждом срезе определяют количественно по степени сужения просвета в сосуде по шкале от 0 до 4, на которой 0 указывает на отсутствие сужения, 1 соответствует сужению просвета менее 25%, 2 - сужению менее 50%, 3 - менее 90%, и 4 - сужению просвета свыше 90%. Каж 29 дое повреждение венечной артерии также оценивают на содержание в нем макрофагов в интиме, клеток гладких мышц, пенистых клеток,эндотелиальных клеток (неоваскуляризация)(48) и Т-клеток, причем 0 указывает на отсутствие клеток соответствующего типа, 1 на редкие отдельные клетки, 2 соответствует небольшим скоплениям клеток, 3 - наличию точечных плотных скоплений, и 4 соответствует наличию плотных скоплений по всей бляшке. Подобным образом, присутствие CD40, ICAM-1 и VCAM-1 оценивают по шкале от 0 до 4, на которой 0 указывает на отсутствие соответствующего фактора, 1 - на присутствие его на отдельных клетках,2 соответствует присутствию данного фактора на менее 50% всех клеток, 3 - на менее 90%, и 4- на более 90% всех клеток (49). Поскольку экспрессия CD40L в положительных образцах ограничивается отдельными клетками, ее наличие не поддается количественной оценке. Статистический анализ Различия в гистохимических оценках групп образцов анализируют с использованием параметрической процедуры по Kruskal-Wallis. Связь между переменными оценивают с использованием корреляции Спермана. Результаты: здоровые венечные артерии Сегменты венечных артерий от 4 контрольных больных не обнаруживают в интиме утолщения или воспаления, как показывает окрашивание НЕ (фиг. 4 А-Б). А именно, в интиме не регистрируются макрофаги, клетки гладкой мускулатуры или лимфоциты, и клетки не являются иммунореактивными в отношении какого-либо mAb против CD40L, используемого при этом исследовании. Иммуннореактивность в отношении CD40 присутствует и ограничивается эндотелиальными клетками, выстилающими просвет сосуда контрольных артерий (фиг. 4 Б). VCAM-1 или активированный NF-В не экспрессируются в контрольных сосудах, aICAM-1 слабо экспрессируется на редких сосудистых эндотелиальных клетках. Гистология нативного СА и TCAD У 7 из 10 пациентов с СА в сегментах венечных артерий обнаруживают заметные фиброатероматозные бляшки с внецентровым сужением, ацеллюлярными изобилующими липидами сердцевинами, холестериновыми щелями и перекрывающими фиброзными "шапочками". Клеточное сообщество повреждений наибольшее в "плечевых" участках, содержащих макрофаги и лимфоциты (фиг. 5 А). В очагах повреждения интимы также разбросаны клетки гладкой мускулатуры, макрофаги, пенистые клетки и центры неоваскуляризации. Бляшки от 3 больных с умеренными, ранними сосудистыми повреждениями являются внецентровыми небольшими, изобилующими макрофагами, "пенистыми" клетками и лимфоцитами. Паталогические изменения венечных артерий у 9 больных с TCAD обнаруживают кольце 004401 30 вое утолщение интимы с заметным сужением просвета (табл. 2). Таблица 2 Полуколичественная оценка (шкала 0-4) клеточного состава в очагах повреждения интимы при нативном коронарном атеросклерозеVCAM-1. Величины даются в виде среднего значениястандартное отклонение р 0,5 в случае СА или TCAD при сравнении с контролем по критерию Kruskal-Wallis Повреждения состоят из концентрических слоев клеток гладкой мускулатуры и интерстициального матрикса и имеется обильная инфильтрация макрофагов и лимфоцитов наряду с областями неоваскуляризации. В 4 венечных артериях, кроме концентрических слоев клеток гладкой мускулатуры, видны изобилиующие липидами атероматозные повреждения и "пенистые" клетки (фиг. 6 А-В). Субэндотелиальные скопления лимфоцитов ("эндотелит") и агрегаты лимфоцитов в адвентициальной оболочке также являются признаками, отмечаемыми в повреждениях при TCAD. Иммуногистохимический анализ экспрессии СD40L-при СА и TCAD В отличие от здоровых венечных артерий,свободных от инфильтрующихся лимфоцитов или экспрессирующих CD40 клеток, повреждения как при СА, так и при TCAD содержатCD40L+-клетки. При нативном атеросклерозе положительное иммунное окрашивание дляCD40L ограничивается меньшей частью лимфоцитов интимы. Окрашивание CD40L обычно слабое и наблюдается или в небольших цитоплазматических гранулах, или на поверхности клеток (фиг. 7 А-Г). При нативном СА большинство лимфоцитов интимы представляют собой СD4+-клетки; СD8+-Т-клетки встречаются только изредка (фиг. 7 А-Г). Анализ серийных срезов, окрашенных mAb против CD4 или противCD8, дает основания полагать, что СD40L+лимфоциты представляют собой главным образом СD4+-Т-клетки. Эндотелиальные клетки,клетки гладкой мускулатуры, макрофаги и "пенистые" клетки не взаимодействуют с какимлибо mAb против CD40L, используемом при этом исследовании. Окрашивания не отмечается с изотипными контрольными mAb. 31 В повреждениях при TCAD положительное иммунное окрашивание для CD40L также связано исключительно с лимфоцитами (фиг. 8 А-В). В отличие от СА в повреждениях приTCAD присутствуют как CD8+-, так и СD4+-Тклетки. Однако СD8+-Т-клетки обнаруживаются преимущественно в субэндотелиальных областях "эндотелита" (фиг. 9 А-Б), в то время как СD4+-Т-клетки локализуются в скоплениях глубоко в интиме вблизи внутренней эластической мембраны (фиг. 8 А-В) и адвентициальной оболочки венечных артерий. Экспрессия CD40L при TCAD в пространственном отношении коррелирует с CD4+-T-клетками в интиме и адвентициальной оболочке венечных артерий. ЧислоCD40L+-Т-клеток в повреждениях при TCAD больше, чем при СА. Как и в случае СА, эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, макрофаги или "пенистые" клетки в повреждениях при TCAD не взаимодействуют с каким-либо mAb против CD40L, используемым при этом исследовании (фиг. 9 А-Б). Эти данные показывают, что в повреждениях при нативном СА и TCAD присутствуют экспрессирующиеCD40 при СА и TCAD В отличие от слабой экспрессии CD40, ограниченной в здоровых венечных артериях люминальными эндотелиальными клетками (фиг. 4 А-Б), CD40-иммуннореактивность активируется и широко распространяется в повреждениях при нативном СА (фиг. 5 А-Б). Экспрессия CD40 отмечается на эндотелиальных клетках, клетках гладкой мускулатуры, макрофагах и "пенистых" клетках. Среднее число СD40-положительных клеток в местах повреждения интимы при нативном СА существенно выше, чем в контрольных артериях (2,20,7 против 0,50,6, табл. 2). Двойное иммунное окрашивание со специфическими маркерами макрофагов или клеток гладких мышц подтверждает, что эти клетки и "пенистые" клетки обеих линий дифференцировки экспрессируют CD40 (фиг. 10 А-Б). Интересно,что СD40+-клетки гладких мышц присутствуют в интиме в тесной связи с воспалительными инфильтратами, в то время как клетки гладкой мускулатуры в артериальных срезах не показывают положительной иммунологической реактивности в отношении CD40 (фиг. 10 А-В). Анализ серийных срезов, окрашенных CD40 или эндотелиальным маркером CD34, наводит на мысль, что эндотелиальные клетки, выстилающие интиму новых сосудов и адвентициальные сосуды сосудов, также определенно представляют собой CD40+ (фиг. 11 А-Г). В артериях от больных TCAD картина локализации экспрессии CD40 подобна случаю нативного СА. Однако средний показательCD40-иммунореактивности существенно выше при TCAD, чем при нативном СА или в случае контрольных артерий (табл. 2). Двойное иммун 004401 32 ное окрашивание показывает, что клетки гладкой мускулатуры интимы, макрофаги экспрессируют CD40 (фиг. 10 А-В). Однако пенистые клетки (фиг. 6 А-Б) и эндотелиальные клетки, выстилающие просвет сосуда, интима новых сосудов и адвентициальные сосуды сосудов, явно представляют собой CD40+. Итак, эти данные показывают, что эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, макрофаги экспрессируютCD40 как при нативном СА, так и при TCAD. Взаимосвязь экспрессии CD40 с факторами межклеточной адгезии и активацией NF- В в местах повреждений при Са и TCAD Макрофаги и эндотелиальные клетки при СА и TCAD экспрессируют факторы межклеточной адгезии, которые регулируют направление миграции лейкоцитов в очаги повреждения. Поскольку лигирование CD40 индуцирует активацию факторов межклеточной адгезии и активацию NF-В на клетках in vitro, спрашивается,связана ли экспрессия CD40 с коэкспрессией факторов межклеточной адгезии или NF-В в повреждениях при СА или TCAD. В первую очередь показывают, что при нативном СА люминальные эндотелиальные клетки проявляют фокальное положительное иммунное окрашивание в случае ICAM-1 с редко встречающимися эндотелиальными клетками, экспрессирующими VCAM-1. В противоположность этому, эндотелиальные клетки, выстилающие интиму новых сосудов адветициальные сосуды сосудов,определенно положительны в отношенииICAM-1 и VCAM-1 (фиг. 11 А-Г). Клетки гладкой мускулатуры интимы, макрофаги и "пенистые" клетки также умеренно определенно положительны в отношении ICAM-1 и VCAM-1(р 0,05) между показателями для CD40 и показателями для ICAM-1 (r=0,85) и VCAM-1(r=0,72). Число лимфоцитов в интиме значимо коррелирует с показателями для CD40 и факторов лейкоцитарной адгезии (табл. 3). Таблица 3 Корреляция показателей (0-4) для различных типов клеток в очагах повреждения интимы при СА(n=10) или TCAD (n=9) с показателями (0-4) для экспрессии CD40 и факторов адгезии (ICAM-1, VCAM1). Величины выражаются в виде коэффициента корреляции Спермана (интервал от -1 до 1, где "0" - отсутствие корреляции, а "-1" или "1" - полная корреляция). Тип клеток Т-лимфоциты Клетки гладких мышц СА 0,72 0,81 0,56 Клетки (SMA+)TCAD 0,12 0,38 0,02 Новые сосуды СА 0,69 0,72 0,53TCAD 0,85 0,87 0,77 р 0,05,р 0,01 ир 0,001 - уровень значимости для корреляции Спермана. 33 Из всех перечисленных типов клеток только показатель для лимфоцитов интимы значимо коррелирует с экспрессией CD40 и объемомICAM-1 и VCAM-1 в интимных бляшках как при СА, так и при TCAD, что наводит на мысль,что лимфоциты участвуют в индукции CD40 и факторов адгезии при обоих заболеваниях. Макрофаги и неоваскуляризация также показывают значимую корреляцию с экспрессиейCD40 при СА и TCAD. Двойное иммунное окрашивание повреждений при СА mАb против CD40 и mAb противICAM-1 или mAb против VCAM-1 показывает,что CD40 локализуются вместе с этими факторами адгезии на многих клетках (фиг. 12 А-В). Кроме того, в ядрах неоинтимных эндотелиальных клеток, макрофагов и клеток гладкой мускулатуры наблюдают активированный NFВ (фиг. 13), и двойное иммунное окрашивание показывает, что многие СD40+-клетки также экспрессируют активированный NF-B. При TCAD определенное положительное иммунное окрашивание для ICAM-1 и VCAM-1 присутствует на люминальных эндотелиальных клетках, в особенности, на клетках вблизи центров эндотелита. Эндотелиальные клетки интимы новых сосудов и адвентициальных сосудов сосудов определенно иммуннореактивны в отношении ICAM-1 и VCAM-1. Показатели для иммунного окрашивания факторов адгезии приTCAD выше, чем при СА или для здоровых венечных артерий (табл. 2). Существует значимая корреляция (р 0,05) между показателями дляVCAM-1 (r=0,89). Число лимфоцитов в интиме также значимо коррелирует с экспрессиейCD40, ICAM-1 и VCAM-1 (табл. 3). Как и в случае СА, двухцветовые иммуногистохимические исследования показывают, что многие CD40+клетки в повреждениях при TCAD коэкспрессируют ICAM-1 или VCAM-1 (фиг. 12 А-В). Иммунное окрашивание в случае активированной нуклеарной формы NF-В также более пространно распределяется при TCAD, чем при нативном СА. NF-В-положительные макрофаги и клетки гладких мышц представляют собой,сообразно, CD40+ (фиг. 13). Итак, эти исследования показывают, что в повреждениях как при нативном СА, так и при TCAD CD40 на многих клетках коэкспрессируется с факторами межклеточной адгезии и/или NF-B. Обсуждение Нативный атеросклероз (СА) и атеросклероз, связанный с трансплантацией (TCAD), являются воспалительными заболеваниями, посредованными комплексом взаимодействий между активированными Т-клетками, эндотелиальными клетками, макрофагами и клетками гладкой мускулатуры (2, 8, 12, 13, 17). Полагают, что Т-клетки играют определенную роль в патогенезе СА и TCAD, однако, механизмы, с 34 помощью которых они участвуют в этих процессах, не вполне ясны (5, 9, 50). Исследования показывают, что CD40L - индуцированная активацией молекула поверхности СD4+-Т-клетки доставляет контактзависимые активационные сигналы к экспрессирующим CD40 эндотелиальным клеткам и макрофагам, что приводит к продукции факторов провоспаления, таких как факторы межклеточной адгезии ICAM-1 иVCAM-1 (31, 32, 35-37), и активации фактора активации транскрипции NF-B (43-45, in vitro). Интересно, что TCAD на мышиных моделях, по меньшей мере, частично зависит от взаимодействий CD40L-CD40 (51). В исследованиях Larson с сотрудниками терапия с применениемmAb против CD40L заметно подавляет отторжение аллогенного гетеротопного трансплантата и частично блокирует связанную с этим вазопатию. Кроме того, TCAD на такой модели почти полностью предотвращается с помощью комбинации из mAb против CD40L и слитого белка СТLА 4-Ig-молекулы, блокирующей Тклеточные костимуляторные каскады реакций(51). Возможно, что взаимодействия CD40LCD40 могут принимать участие в патогенезе СА и/или TCAD у людей. Для изученния этой гипотезы также применяют иммуногистохимические методы, чтобы исследовать экспрессию и клеточное распределение CD40L и CD40 в здоровых и атеросклеротических венечных артериях. Здоровые венечные артерии не содержат экспрессирующихCD40L клеток, а СD40-иммуннореактивность в таких сосудах ограничивается люминальными эндотелиальными клетками. В противоположность этому в местах повреждений как при нативном СА, так и при TCAD, CD40L экспрессируется на лимфоцитах. Обнаружено, что САповреждения содержат незначительное количество СD8+-Т-клеток, в то время как в местах повреждений при TCAD СD8+-Т-клетки содержатся непосредственно вблизи люминального эндотелия ("эндотелита"), а СD4+-Т-клетки более глубоко в интиме и адвентициальной оболочке. На основании локализации и окрашивания серийных срезов mAb против CD4 или mAb против CD8 делается вывод, что CD40L+лимфоциты, наиболее вероятно, представляют собой СD4+-Т-клетки в повреждениях при обоих заболеваниях. С использованием двух различных mAb против CD40L обнаружено, что иммунореактивность в отношении CD40L является слабой и ассоциируется или с гранулярной, или цитоплазматической, или клеточной поверхностью. Подобная картина СD40L-иммунореактивности отмечается при исследовании экспрессии CD40L и CD40 при гломерулонефрите (46). Слабую и часто цитоплазматическую картину окрашивания при экспрессии CD40 в очагах воспаления можно связать с переходным характером экспрессии CD40L на активированных Тклетках (27-29) и тем фактом, что "зацепление"CD40 на клетках-мишенях индуцирует быструю отрицательную негативную модуляцию CD40L посредством рецепторопосредованного эндоцитоза (52) и терминальной стадии тромбоцитопоэза (53). Эти регуляторные механизмы, вероятно, служат для фокусирования опосредованныхCD40 сигнальных событий на соответствующих родственных клетках-мишенях. Обнаружено, что экспрессия CD40 заметно активируется на многих клетках в местах повреждений при обоих заболеваниях. Макрофаги и "пенистые" клетки, экспрессирующие CD40,особенно заметны в воспалительных инфильтратах "плечевых" участков, изобилующих липидами бляшек, которые, как известно, содержат плотные воспалительные инфильтраты (54,55). Экспрессия CD40 активируется также на люминальных эндотелиальных клетках при обоих заболеваниях, и это особенно заметно приTCAD. Эндотелиальные клетки интимы новых сосудов и адвентициальных сосудов сосудов при обоих заболеваниях представляют собой определенно CD40+. Экспрессирующие CD40 клетки гладкой мускулатуры присутствуют в интиме как при СА, так и при TCAD, обычно непосредственно вблизи воспалительных инфильтратов. Интересно, что клетки гладкой мускулатуры в средней части тех же сосудов представляют CD40-. IFN- активирует экспрессию CD40 на многих клетках in vitro (33, 35-37,56), в том числе на клетках гладкой мускулатуры, и этот эффект усиливается цитокинами, такими как IL-1 и TNF- (36). Следовательно,заметное активирование экспрессии CD40 на клетках многих типов в местах таких повреждений может являться следствием высвобождения цитокинов лезиональными Т-клетками, макрофагами и другими клетками. Двойное иммунное окрашивание показывает, что многие CD40+клетки также коэкспрессируют факторы межклеточной адгезии ICAM-1 и VCAM-1, а также активированную форму NF-В. Итак, данное исследование показывает присутствие СD40+-Тклеток и активированных СD40+-клетокмишеней в местах повреждений сосудов при нативном СА и TCAD. Ранние исследования показали, что CD40 экспрессируются на некоторых эпителиальноклеточных опухолях и В-клетках (57, 58). Позднее отмечалось, что CD40 конститутивно экспрессируется или индуцибелен на многих типах клеток in vitro (33-37, 56). Кроме того, все более очевидно, что взаимодействия CD40L-CD40 играют ключевую роль в опосредованных клетками воспалительных реакциях in vivo (31, 32). В этом отношении, последние сообщения показывают экспрессию CD40L и/или CD40 in situ при воспалительных заболеваниях человека (35,46, 59). Например, экспрессия CD40 активируется на макрофагах, проникающих в головной мозг больных с рассеянным склерозом (59), на 36 дермальных эндотелиальных клетках и кератиноцитах при псориазе (35), и на многих других клетках в почках больных с воспалительным гломерулонефритом (46). Кроме того, СD40+-Тклетки содержат воспалительные инфильтраты в головном мозге больных с рассеянным склерозом (59) и в почках больных с воспалительным гломерулонефритом (46). Следовательно,вероятно, что экспрессия CD40 активируется при многих воспалительных заболеваниях и представляет собой молекулярный механизм,который позволяет Т-клеткам доставлять провоспалительные сигналы ко многим клеткаммишеням. В связи с этим результаты, представленные здесь, показывающие, что при СА иTCAD активируется экспрессия CD40, и что в повреждениях обнаруживаются СD40L+инфильтрующие Т-клетки, служат в качестве доказательства предположения, что иммунные опосредованные воспалительные реакции играют роль в патогенезе этих заболеваний (5-7, 9,18, 21, 23, 50). Наблюдения, касающиеся СD40L-опосредованной активации эндотелиальных клеток и макрофагов in vitro, и исследования взаимодействий CD40L-CD40 в патогенезе мышиных моделей TCAD наводят на мысль о возможной патогенной роли взаимодействий CD40L-CD40 при СА и TCAD. Например, СD40Lопосредованные сигналы активируют экспрессию ICAM-1 и VCAM-1 на эндотелиальных клетках in vitro (35-37). Эти факторы межклеточной адгезии, регулирующие выход и задержку лейкоцитов в зонах воспаления, при СА иTCAD активируются на эндотелиальных клетках и особенно заметны на эндотелиальных клетках интимы новых сосудов и сосудов сосудов (49, 60). Следовательно, представляет интерес, что в повреждениях при СА и TCAD обнаруживаются многие CD40+-клетки, и, в особенности, эндотелиальные клетки интимы и эндотелиальные клетки сосудов сосудов, которые коэкспрессируют ICAM-1 и VCAM-1. Известно,что активация ICAM-1 и/или VCAM-1 зависит от активации NF-B (61). В настоящем исследовании также показано, что CD40+-интимные макрофаги, клетки гладкой мускулатуры экспрессируют активированную форму NF-В. Эти исследования означают, что СD40L+-СD4+-Тклетки могут при СА и TCAD индуцировать активацию факторов межклеточной адгезии наCD40+-клетках-мишенях, вероятно, частично посредством активации NF-B. Опосредованные CD40L сигналы также побуждают эндотелиальные клетки секретировать IL-6 и IL-8 (62) и промотируют прокоагулянтную поверхность посредством активирующего тканевого фактора и экспрессии регулирующего по типу отрицательной связи тромбомодулина. Что касается макрофагов, то взаимодействия CD40L-CD40 побуждают эти клеткиTNF-), хемокины, металлопротеиназы матрикса и экспрессировать тканевый фактор in vitro(33, 34, 38, 41, 42). Все эти провоспалительные факторы, вероятно, играют роль в патогенезе СА и TCAD (10, 17, 63-66). Лигирование CD40 с макрофагами также вызывает продукцию NO(39, 40). Интересно, что блокирование взаимодействий CD40L-CD40 в мышиных моделяхTCAD связано с регуляцией по типу отрицательной обратной связи экспрессии iNOS и редукцией повреждений при TCAD (51). Показано, что iNOS экспрессируется в местах повреждений при СА (67, 68), отторжении кардиального аллотрансплантата (69, 70) и TCAD (71, 72). При СА или TCAD опосредованные CD40L сигналы могут вовлекаться в промотирование продукции любого из этих факторов. Взаимодействия CD40L-CD40 на мышиных моделяхTCAD отчетливо имеют провоспалительный эффект (51), как и на моделях вызванного коллагеном артрита (73), напоминающего волчанку гломерулонефрита (74) и экспериментального аллергического энцефаломиелита (59). Осуществлено исследование (62) экспрессии CD40L и CD40 при каротидном атеросклерозе человека. Обнаружено, что CD40 активируется в местах повреждений и имеет широкое клеточное распределение. Сообщается, чтоCD40 значительно экспрессируется на клетках гладких мышц, эндотелиальных клетках и макрофагах в местах атеросклеротических повреждений, в то время как в настоящем исследовании с использованием двух различных mAb против CD40L экспрессия CD40L ограничивается Т-клетками. В данном случае экспрессииCD40L in situ на макрофагах, эндотелиальных клетках или клетках гладкой мускулатуры не наблюдается. Подобным образом обнаружено,что СD40-иммунореактивность ограничивается Т-клетками при других воспалительных заболеваниях, в том числе, при гломерулонефрите(46), ревматоидном артрите и хроническом синусите. Кроме того, Gerritse et al. сообщают, что экспрессия CD40L в бляшках при рассеянном атеросклерозе ограничивается CD4+-T-клетками(59). Несоответствия между приведенными здесь результатами и результатами, полученными Mach с сотрудниками, пока не понятно, но может быть связано с трудно уловимыми различиями в иммуногистохимических методах или в характере повреждений. Ссылки 1. Nilsson, J. 1993. Transplant Proc. 25:20632064. 2. Munro, J., and R. Cotran. 1988. Lab. Invest. 58:249-261. 3. Cramer, D., et al. 1992. J. Heart Lung 41 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ ингибирования у больного активации CD40-лигандом клеток, несущих на своей поверхности CD40, причем указанные CD40 несущие клетки являются клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетками гладкой мускулатуры сосудов, клетками гладкой мускулатуры аорты, коронарными клетками гладкой мускулатуры, клетками гладкой мускулатуры легких или клетками гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта, при этом указанный способ включает в себя стадию введения указанному больному терапевтически эффективного количества антитела, Fabфрагмента или одноцепочечного антитела, причем указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело способно ингибировать активацию указанных СD40-несущих клеток гладкой мускулатуры под действием СD40 лиганда у указанного пациента путем ингибирования взаимодействия между СD40-лигандом сCD40 на указанных клетках гладкой мускулатуры. 2. Способ по п.1, при котором указанные клетки гладкой мускулатуры желудочнокишечного тракта выбраны из группы, состоящей из клеток гладкой мускулатуры пищевода,клеток гладкой мускулатуры желудка, клеток гладкой мускулатуры кишечника и клеток гладкой мускулатуры тонкого кишечника. 3. Способ по п.1, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует связывание СD40-лиганда и CD40 на указанных клетках гладкой мускулатуры. 4. Способ по п.1, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает эпитоп, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5 с 8, продуцируемое гибридомой,имеющей регистрационный номер АТСС No.HB 10916. 5. Способ по п.1, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически узнает белок, с которым связывается моноклональное антитело 5 с 8, продуцируемое гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС No.HB 10916. 6. Способ по п.1, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает СD40-лиганд. 7. Способ по п.1, при котором указанное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклональных антител, поликлональных антител, химерных антител, гуманизированных антител, антител человека, приматизированных антител и антител, которые включают в себяCDR-область от первого человека и каркас антитела от второго человека. 8. Способ по п.6, при котором указанное моноклональное антитело является монокло 004401 42 нальным антителом 5 с 8, продуцируемым гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС No.HB 10916. 9. Способ по п.1, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело выбрано или создано путем структурной оптимизации ведущего ингибирующего антитела, Fab-фрагмента или одноцепочечного антитела на основе трехмерной структуры комплекса растворимой внеклеточной области СD40-лиганда или ее части с ведущим ингибирующим антителом, Fab-фрагментом или одноцепочечным антителом. 10. Способ по п.1, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует клеточную активацию СD40-лигандом СD40-несущих клеток гладкой мускулатуры, которые вовлечены в зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание. 11. Способ по п.10, при котором указанное зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание выбрано из группы, состоящей из сосудистого заболевания, заболевания мочевого пузыря и желудочно-кишечного заболевания. 12. Способ по п.11, при котором указанное желудочно-кишечное заболевание выбрано из группы, состоящей из нарушения моторики пищевода, воспалительного заболевания кишечника и склеродермии. 13. Способ по п.11, при котором указанным сосудистым заболеванием является атеросклероз. 14. Способ ингибирования активации СD40-лигандом клеток гладкой мускулатуры,несущих на своей поверхности CD40, включающий в себя стадию контактирования in vitro указанных клеток гладкой мускулатуры с антителом, Fab-фрагментом или одноцепочечным антителом, способным к ингибированию активации указанных CD40-несущих клеток гладкой мускулатуры лигандом CD40 путем ингибирования взаимодействия между СD40-лигандом иCD40 на указанных клетках гладкой мускулатуры, причем указанные клетки гладкой мускулатуры являются клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря, клетками гладкой мускулатуры сосудов, клетками гладкой мускулатуры аорты, коронарными клетками гладкой мускулатуры, клетками гладкой мускулатуры легких или клетками гладкой мускулатуры желудочнокишечного тракта. 15. Способ по п.14, при котором указанные клетки гладкой мускулатуры желудочнокишечного тракта выбраны из группы, состоящей из клеток гладкой мускулатуры пищевода,клеток гладкой мускулатуры желудка, клеток гладкой мускулатуры кишечника и клеток гладкой мускулатуры тонкого кишечника. 16. Способ по п.14, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует связывание 43 СD40-лиганда с CD40 на указанных клетках гладкой мускулатуры. 17. Способ по п.14, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает эпитоп, с которым специфически связывается моноклональное антитело 5 с 8, продуцируемое гибридомой,имеющей регистрационный номер АТСС No.HB 10916. 18. Способ по п.14, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически узнает белок, с которым связывается моноклональное антитело 5 с 8, продуцируемое гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС No.HB 10916. 19. Способ по п.14, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически связывает СD40-лиганд. 20. Способ по любому из пп.16-19, при котором указанное антитело выбрано из группы,состоящей из моноклональных антител, поликлональных антител, химерных антител, гуманизированных антител, антител человека, приматизированных антител и антител, которые включают в себя CDR-область от первого человека и каркас антитела от второго человека. 21. Способ по п.20, при котором указанное моноклональное антитело является моноклональным антителом 5 с 8, продуцируемым гибридомой, имеющей регистрационный номер АТСС No.HB 10916. 44 22. Способ по п.14, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело выбрано или создано путем структурной оптимизации ведущего ингибирующего антитела, Fab-фрагмента или одноцепочечного антитела на основе трехмерной структуры комплекса растворимой внеклеточной области СD40-лиганда или ее части с ведущим ингибирующим антителом, Fab-фрагментом или одноцепочечным антителом. 23. Способ по п.14, при котором указанное антитело, Fab-фрагмент или одноцепочечное антитело специфически ингибирует клеточную активацию СD40-лигандом CD40-несущих клеток гладкой мускулатуры, которые вовлечены в зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание. 24. Способ по п.23, при котором указанное зависимое от клеток гладкой мускулатуры заболевание выбрано из группы, состоящей из сосудистого заболевания, заболевания мочевого пузыря и желудочно-кишечного заболевания. 25. Способ по п.24, при котором указанное желудочно-кишечное заболевание выбрано из группы, состоящей из нарушения моторики пищевода, воспалительного заболевания кишечника и склеродермии. 26. Способ по п.24, при котором указанным сосудистым заболеванием является атеросклероз.