Рецептор нейротрофного фактора, полученного из глиальной клеточной линии

1 Область изобретения Настоящее изобретение относится к рецепторам нейротрофного фактора, полученного из глиальной клеточной линии (GDNF), и охватывает нуклеотидные и аминокислотные последовательности, кодирующие GDNF-рецептор(GDNFR). Изобретение касается также терапевтических подходов к лечению GDNF-зависимых заболеваний. Предпосылки создания изобретения Нейротрофный фактор, происходящий из глиальной клеточной линии (GDNF), был первоначально выделен и клонирован из крысиных клеток В 49 как эффективный нейротрофный фактор, усиливающий выживание допаминергических нейронов среднего мозга (Lin et al.,Science, 260, 1130-1132, 1993). Недавние исследования показали, что данная молекула обладает рядом других биологических активностей,оказывая воздействие на нейроны нескольких типов как центральной, так периферической нервной системы. В центральной нервной системе (ЦНС, CNS) млекопитающих GDNF предотвращает обусловленную аксотомией гибель моторных нейронов спинного мозга и лица (Liet al., Nature, 373, 344-346, 1995; Yan et al., Nature, 373, 341-344, 1995; Henderson et al., Science,266, 1062-1064, 1994; Zurn et al., Neuroreport, 6,113-118, 1994), а также предотвращает естественную программированную гибель моторных нейронов птиц (Oppenheim et al., 1995, supra). Местное введение GDNF защищает нигральные допаминергические нейроны от дегенерации,обусловленной аксотомией (Kearns and Gash,Brain Research, 672, 104-111, 1995; Beck et al.,Nature, 373, 339-341, 1995) или нейротоксинамиet al., Nature, 373, 335-339, 1995). Кроме того,местное введение GDNF индуцирует образование отростков допаминергических нейронов,увеличивает уровень допамина, норадреналина и серотонина, что улучшает моторное поведение (Tomac et al., 1995, supra). Относительно недавно было показано, чтоGDNF является мощным трофическим фактором для норадренергических нейронов мозга и клеток Пуркинье. Подсадка фибробластов, эктопически экспрессирующих GDNF, предотвращает индуцированную 6-гидроксидопамином дегенерацию и улучшает фенотип взрослых норадренергических нейронов in vivo (Arenas etal., Neuron, 15, 1465-1473, 1995), тогда как экзогенно введенный GDNF эффективно улучшает выживание и морфологическую дифференцировку эмбриональных клеток Пуркинье in vitro(Mount et al., Proceedings Of the National Academy Of Sciences, U.S.A., 92, 9092-9096, 1995). В периферической нервной системе GDNF повышает выживание нейронов узловатых, ци 002924 2 лиарных и симптических ганглиев, а также небольшой популяции эмбриональных сенсорных нейронов в дорсальных корешковых ганглияхYan et al., 1995, supra; Henderson et al., 1994, supra). GDNF также усиливает экспрессию вазоактивного кишечного пептида и мРНК препротахикинина-А в культивируемых нейронах верхнего шейного ганглия (SCG), влияя тем самым на фенотип SCG-нейронов и индуцируя образование пучковидных отростков (Trupp et al.,1995, supra). Экспрессия GDNF выявляется в различных типах клеток и в различных структурах нервной системы. В центральной нервной системе экспрессия мРНК GDNF показана при помощи обратно-транскриптазной цепной реакции (RTPCR) у эмбрионов и взрослых крыс в полосатом теле, главной мишени допаминергической нигральной иннервации, а также в других областях, включая гиппокампус, кору, таламус, перегородку, мозжечок, спинной мозг и продолговатый мозг (Arenas et al., 1995, supra; Poulsen et al.,Neuron, 13, 1245-1252, 1994; Springer et al., Experimental Neurology, 127, 167-170, 1994; Stroemberg et al., Experimental Neurology, 124, 401412, 1993; Schaar et al., Experimental Neurology,124, 368-371, 1993). У человека транскриптыGDNF были выявлены в полосатом теле с наивысшими уровнями в каудальных и нижних областях коры. Обнаружимые количества были также отмечены в гиппокампусе, коре и спинном мозге, но не в мозжечке (Schaar et al., Experimental Neurology, 130, 387-393, 1994;Springer et al., 1994, supra). В периферической нервной системе экспрессия мРНК GDNF отмечена в DRG и SCG крыс в первый день после рождения, в седалищном нерве и в первичных культурах неонатальных Шванновских клеток(Тrupp et al., 1995, supra; Hoffer et al., Neuroscience Letters, 182, 107-11, 1994; Henderson et al.,1994, supra; Springer et al., 1994, supra). Кроме того, недавние исследования показали, что транскрипты GDNF широко экспрессируются в периферических органах, не имеющих отношения к нервной системе, включая постнатальные семенники и почки, эмбриональные вибриссные подушки, желудок и кожу. Низкий уровень экспрессии обнаруживается в эмбриональных мышцах, надпочечниках и зачатках конечностей, а также в постнатальных легких, печени и яичниках (Trupp et al., 1995, supra; Henderson etal., 1994, supra). Однако биологическое значение экспрессии GDNF в не нейрональных тканях остается неясным. Подробное описание получения и характеристики белковых продуктов GDNF можно найти в заявке на патент США 08/182,183, поданной 23 мая 1994 и родственных заявках (см. 3 также PCT/US 92/07888, WO 93/06116, поданную 17 сентября 1992, и заявку на Европейский патент 92921022.7, публикацияЕР 610 254), упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок. Дополнительные белковые продукты GDNF описаны в заявке на патент США 08/535,681, поданной 28 сентября 1995,упоминаемой в настоящем описании в качестве ссылки. Термин белковый продукт GDNF включает биологически активные синтетические или рекомбинантные белки GDNF и их аналоги, а также их химически модифицированные производные. К аналогам GDNF относятся делеционные варианты, такие как усеченные белки GDNF, а также инсерционные и заместительные варианты GDNF. Этим термином охватываются также белки GDNF, обладающие существенной гомологией с GDNF человека. Терапия на основе GDNF Терапия на основе GDNF применима в случае повреждения нервов при таких состояниях, когда подвергаются риску выживание и/или соответствующая функция одного или нескольких типов нервных клеток. Подобные повреждения нервов могут быть вызваны самыми различными причинами. Повреждения одного или нескольких типов нервных клеток могут быть обусловлены следующими факторами: (1) физическое повреждение, вызывающее дегенерацию аксонных отростков и/или тела нервных клеток в месте повреждения; (2) временное или постоянное нарушение кровоснабжения отдельных частей нервной системы, например, при инсульте; (3) намеренное или случайное воздействие нейротоксинов, таких как некоторые химиотерапевтические агенты (например, цисплатин) для лечения рака или дезоксицитидин(ddC) для лечения СПИДа; (4) хронические метаболические заболевания, такие как диабет или дисфункция почек, и (5) нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона,болезнь Альцгеймера и амиотрофический латеральный склероз (ALS), которые являются результатом дегенерации специфических популяций нейронов. Ряд исследований указывает на то, что терапия на основе GDNF особенно полезна при лечении таких нейродегенеративных состояний,как дегенерация допаминергических нейронов черного вещества при болезни Паркинсона. Существующие в настоящее время подходы к лечению болезни Паркинсона являются паллиативными и направлены на повышение уровней допамина в полосатом теле (стриатуме). Ожидаемый эффект терапии на основе GDNF состоит не только в повышении допаминергической нейротрансмиссии в допаминергических нервных окончаниях (что приводит к ослаблению симптомов), но и в торможении, или даже в прекращении прогрессии дегенеративных процессов и восстановлении поврежденного нигростриатального пути с восстановлением функ 002924 4 ции. GDNF может быть также применен для лечения других форм повреждений или нарушений функции допаминергических нервных клеток у больных людей. Подобные повреждения и дисфункции могут наблюдаться при шизофрении и других видах психозов. Существующая терапия подобных состояний является симптоматической. Применяются препараты,действующие на допаминовые рецепторы или сайты связывания допамина. Данный подход основан на предположении о том, что неправильное функционирование допаминергических нейронов, иннервирующих обладающие рецепторами популяции нейронов, может участвовать в патогенезе заболевания. Рецепторы В настоящее время охарактеризованы и проклонированы многочисленные рецепторы,осуществляющие связывание и ответ на белковые факторы, включая рецепторы инсулина,тромбоцитарного ростового фактора, эпидермального ростового фактора и им подобных,фибробластных ростовых факторов, различных интерлейкинов, гематопоэтических ростовых факторов и цилиарного нейротрофического фактора (U.S. 5,426,177). Результаты исследований указывают на тот факт, что некоторые рецепторы могут связывать несколько (родственных) ростовых факторов, а один и тот же фактор может связываться и активировать несколько родственных рецепторов (см., например, Lupu etal., Science, 249, 1552-1555, 1990; Dionne et al.,EMBO J., 9:2685-2692, 1990; Miki et al., Science,251:72-75, 1991). Большинство рецепторов могут быть широко охарактеризованы как имеющие внеклеточную часть или домен, ответственный за специфическое связывание белкового фактора, трансмембранный домен, проникающий через мембрану, и внутриклеточный домен,который часто вовлечен в передачу сигнала при связывании белкового фактора с внеклеточной частью рецептора. Хотя многие рецепторы состоят из одной полипептидной цепи, некоторым рецепторам для связывания своего белкового фактора с высокой аффинностью и обеспечения последующего функционального ответа требуется две или более отдельных субъединиц (см.,например, Hempstead et al., Science, 243:373-375,1989; Hibi et al., Cell, 63:1149-1157,1990). Внеклеточная и внутриклеточная части данного рецептора могут иметь общие структурные особенности с соответствующими областями других рецепторов, что дает основания говорить об эволюционном и функциональном родстве различных рецепторов. Такое родство может быть весьма далеким и просто отражать повторное использование конкретных доменных структур. Например, многие различные рецепторы, связывающие неродственные факторы,используют иммуноглобулиновые домены своих внеклеточных частей, тогда как другие рецепторы используют домены цитокинового 5 рецептора своих фактор-связывающих областей (см., например, Akira et al., The FASEB J.,4:2860-2867, 1990). Большое число рецепторов с различающимися внеклеточными связывающими доменами кодируют тирозин-специфические протеинкиназы, активирующиеся в ответ на связывание фактора (см., например, Ullrich andSchlessinger, Cell, 61:203-212, 1990). Механизмы, с помощью которых связывание фактора активирует процесс передачи сигнала, изучены слабо, даже в случае тирозинкиназных рецепторов. Активация передачи сигнала также не слишком хорошо изучена и для других рецепторов, у которых внутриклеточный домен кодирует домен с неизвестной функцией, или у которых фактор-связывающий компонент ассоциирован с другим белком неизвестной функции(см., например, Hibi et al., Cell, 63:1149-1157,1990). Способ действия GDNF in vivo не прояснен окончательно, частью из-за отсутствия информации о рецепторе GDNF. Две группы исследователей независимо обнаружили, что введенный в стриатум меченный [125I] GDNF может обратно переноситься допаминергическими нейронами в черное вещество (Тоmас et al., Proceedings Of the National Academy Of Sciences,U.S.A., 92, 8274-8278, 1995; Yan et al., 1995, supra). Наблюдался также обратный транспорт[125I]-GDNF моторными нейронами спинного мозга, сенсорными нейронами DRG и нейронами В-слоя нервной сетчатки. Все эти феномены обратного транспорта могут быть специфически ингибированы 100-кратными или более высокими концентрациями немеченого GDNF, что дает основание предполагать насыщаемый, обусловленный рецептором, процесс транспорта. Рекомбинантный GDNF in vitro способен в очень низких концентрациях усиливать выживание и повышать захват допамина культивируемыми допаминергическими нейронами. Наблюдаемая полумаксимальная эффективная концентрация (EC50) GDNF для данных нейронов составляет от 0.2 до 1.6 пМ (Lin et al., 1993,supra). Было также показано, что GDNF в низких концентрациях способствует выживанию диссоциированных моторных нейронов. Показано, что (EC50) GDNF для моторных нейронов лежит в пределах от 5 до 10 фМ, что ниже, чем в случае допаминергических нейронов (Hendersonet al., 1994, supra). Взятые в совокупности, данные результаты указывают на то, что экспрессируемый указанными клетками рецептор(ы) GDNF имеет(ют) очень высокие аффинности связывания лиганда. Как в случае членов семейства TGF-, широкое диверсифицированное распространение в тканях и разнообразные биологические функцииGDNF в различных популяциях клеток, дают основание полагать, что могут существовать различные типы рецепторов GDNF или комплексов рецепторов. Эксперименты по насыще 002924 6 нию и конкурентному связыванию [125I]- GDNF куриными симпатическими нейронами Е 10 показали, что данные нейроны экспрессируют сайты связывания GDNF, отличающиеся от таковых на допаминергических и моторных нейронах. Полумаксимальная концентрация насыщения и полумаксимальная концентрация ингибирования GDNF для этих сайтов связывания находятся в пределах от 1 до 5 нМ (Тrupp et al.,1995, supra). Аналогично, (EC50) GDNF для поддержания выживания симпатических нейронов(Тruрр et al., 1995, supra). Для лучшего понимания механизма, с помощью которого GDNF активирует передачу сигнала, опосредующую его воздействие на клетки, было бы желательно идентифицировать рецептор (рецепторы), которые связывают данный белковый фактор и отвечают на него. Для целей терапии на основе GDNF было бы также желательно идентифицировать и сделать возможным получение дополнительных молекул,которые обеспечивают или усиливают передачу сигнала GDNF. Кроме того, идентификация рецептора GDNF обеспечила бы разработку эффективных диагностических подходов, например, при определении возможного терапевтического эффекта терапии на основе белка GDNF для конкретного больного. Далее, белковый рецептор GDNF может являться ключевым компонентом в методах идентификации дополнительных молекул, которые связываются с рецептором и обеспечивают нужную биологическую активность. Краткое описание изобретения Согласно настоящему изобретению заявлены нуклеотидные последовательности, кодирующие белок рецептора нейротрофного фактора, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 2 и 4 (SEQ. ID. Nos. 2 и 4), а также его биологически эквивалентные аналоги. Белок рецептора нейротрофного фактора и белковые продукты, заявленные в настоящем изобретении, обозначены как белок рецептора нейротрофного фактора, полученного из глиальной клеточной линии (GDNFR), и соответствующие белковые продукты. Новые GDNFRs функционально охарактеризованы по способности специфически связывать GDNF с высокой аффинностью и действовать как часть молекулярного комплекса, который опосредует или усиливает передачу сигналаGDNF. Белковые продукты GDNFR обычно получают в виде растворимого белка рецептора и,по существу, в очищенной форме. К другому аспекту настоящего изобретения относится получение белковых продуктовGDNFR методами рекомбинантных технологий. При альтернативном осуществлении изобретения белки GDNFR синтезируют химическими методами или сочетанием рекомбинантных и химических методов. 7 Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, белки GDNFR могут быть гликозилированными или негликозилированными. Дериватизация белка GDNFR обычно предусматривает присоединение белка GDNFR к водорастворимому полимеру. Например, белокGDNFR может быть конъюгирован с одной или более молекулой полиэтиленгликоля для снижения преципитации белкового продуктаGDNFR в водной среде. К другим объектам настоящего изобретения относятся различные полинуклеотиды, кодирующие белки GDNFR. Данные нуклеотидные и аминокислотные последовательности были использованы для экспрессии GDNFR в эукариотических и прокариотических клеткаххозяевах и при этом продукт экспрессии или его производное характеризовались по способности связывать GDNF, образуя комплекс, опосредующий активность GDNF, что приводило к повышению связывания допамина допаминергическими клетками. Полинуклеотиды могут также применяться для целей клеточной или генной терапии. К приемлемым нуклеотидным последовательностям относятся последовательности, приведенные на фигурах, а также вырожденные последовательности, природные аллельные варианты и модифицированные последовательности, полученные в соответствии с настоящим изобретением. Примерами нуклеотидных последовательностей служат последовательности, которые кодируют белок рецептора нейротрофного фактора, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 2 и 4 (SEQ. ID.Nos. 2 и 4), способного образовывать комплекс с нейротрофным фактором, полученным из глиальной клеточной линии (GDNF), и обуславливать клеточный ответ на GDNF или его биологически эквивалентные аналоги. К указанным последовательностям относятся: (а) последовательность, приведенная на фиг. 1 (SEQ. ID. No 1) и представленная нуклеотидами, кодирующими аминокислоты от Met1 до Ser465, или приведенная на фиг. 3 (SEQ. ID. No 3) и представленная нуклеотидами, определяющими синтез аминокислот от Met1 до Ser468, кодирующая рецептор нейротрофного фактора (GDNFR), способный образовывать комплекс с нейротрофным фактором, полученным из глиальной клеточной линии (GDNF), и обуславливать клеточный ответ на GDNF; (б) нуклеотидная последовательность, которая (1) гибридизуется с комплементарной последовательностью (а) и (2) кодирует аминокислотную последовательность с активностью GDNFR; и (в) нуклеотидная последовательность, которая (1) в силу вырожденности генетического кода гибридизуется с комплементарной последовательностью (а) и (2) кодирует аминокислотную последовательность с активностью GDNFR. В настоящем изобретении представлены также векторы, нуклеотидные 8 последовательности которых функционально связаны с одним или более оперативным элементом, способным влиять на амплификацию или экспрессию нуклеотидной последовательности. Заявлены также клетки-хозяева, содержащие такие векторы. Обычно, клетку-хозяина выбирают среди клеток млекопитающих или бактериальных клеток, таких как COS7 и E.coli,соответственно. К другому аспекту настоящего изобретения относятся векторы, содержащие кодирующие белки GDNFR полинуклеотиды, функционально связанные с последовательностями,обеспечивающими амплификацию и/или контролирующими экспрессию. Для экспрессии белков GDNFR такими векторами могут быть трансформированы или трансфицированы как прокариотические, так и эукариотические клетки-хозяева. В объем настоящего изобретения также включены методы рекомбинантного получения белка GDNFR, при том, что данные трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева выращивают на приемлемой питательной среде и экспрессируемый клеткамиGDNFR выделяют из клеток-хозяев и/или из питательной среды. Настоящим изобретением также предусмотрено применение кодирующихGDNFR полинуклеотидов и векторов, содержащих такие полинуклеотиды, для целей клеточной или генной терапии. Клетки-хозяева могут быть также отобраны в отношении их пригодности для имплантации человеку, при том, что клетки экспрессируют и секретируют рецептор нейротрофного фактора. Клетки-хозяева могут быть заключены в полупроницаемые мембраны, пригодные для имплантации человеку. Клетки-хозяева могут быть трансформированы или трансфицированыex vivo. Таким образом, примерное устройство для лечения повреждения нервов включает: (а) полупроницаемые мембраны, пригодные для имплантации; и (б) клетки, инкапсулированные в мембраны, при том, что клетки экспрессируют и секретируют рецептор нейротрофного фактора. Материал мембраны выбирают таким образом, чтобы он был проницаем для белка рецептора нейротрофного фактора, но непроницаем для материалов, неблагоприятных для инкапсулированных клеток. Описаны также способы рекомбинантного получения заявленного в настоящем изобретении рецептора нейротрофного фактора. Примерный способ включает: (а) культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную последовательность, которая кодирует рецептор нейротрофного фактора, имеющего, например,аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 2 и 4 (SEQ. ID. Nos. 2 и 4), способный образовывать комплекс с нейротрофным фактором, полученным из глиальной клеточной линии (GDNF), и обуславливать клеточный ответ на GDNF или его биологически экви 9 валентные аналоги; (б) поддержание указанных клеток-хозяев в условиях, обеспечивающих экспрессию данного рецептора нейротрофного фактора в указанных клетках; и (в) дополнительно, выделение данного рецептора нейротрофного фактора, экспрессируемого указанными клетками. Клетки-хозяева могут быть как прокариотическими, так и эукариотическими клетками. Если используется система бактериальной экспрессии, метод предусматривает дополнительный этап переукладки рецептора нейротрофного фактора. В объем настоящего изобретения включен также выделенный и очищенный белок, представленный аминокислотной последовательностью SEQ. ID. Nos. 2 и 4 (фиг. 2 и 4), способный образовывать комплекс с нейротрофным фактором, полученным из глиальной клеточной линии (GDNF), и обуславливать клеточный ответ на GDNF или его биологически эквивалентные аналоги. К примерным аналогам относятся (без ограничения перечисленными) белки, имеющие аминокислотные последовательности от Ser18 доPro446, oт Asp25 дo Leu447 и от Суs29 до Cys442, как обозначено на фиг. 2 (SEQ. ID. No. 2), а также белки, имеющие аминокислотные последовательности от Met17 до Pro449 и от Суs29 до Суs443,как обозначено на фиг. 4 (SEQ. ID. No. 4). Заявленные в настоящем изобретении белки могут быть гликозилированными или негликозилированными и быть получены с помощью рекомбинантных технологий или химическим синтезом. В объем настоящего изобретения включены также нуклеотидные последовательности, кодирующие белок рецептора, представленный указанными аминокислотными последовательностями. Описаны также фармацевтические композиции, включающие заявленный белок рецептора в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Для облегчения производства, хранения, обращения, доставки и/или повышения эффективности в состав композиций могут входить другие разнообразные материалы. Другим аспектом настоящего изобретения является терапевтическое применение гена и белков GDNFR. Например, циркулирующий или растворимый белок GDNFR может быть использован сам по себе или в сочетании с GDNF для лечения болезней или повреждений нервной системы путем повышения активности трансмембранной передачи сигнала GDNF. Так, заявленные согласно настоящему изобретению белки и фармацевтические композиции можно использовать для обработки неправильно функционирующих допаминергических нервных клеток при болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и амиотрофическом латеральном склерозе. Альтернативно, рекомбинантный генGDNFR может быть введен в клетки или ткани,которые получат преимущество от повышенной чувствительности к GDNF, например, в мотор 002924 10 ные нейроны больных, страдающих амиотрофическим латеральным склерозом. Кроме того,GDNFR можно применять для блокирования активности GDNF в тех случаях, когда она является нежелательной. GDNFR можно использовать для подтверждения того факта, что наблюдаемые эффекты GDNF опосредованыGDNFR. В качестве другого объекта изобретения заявлены зонды GDNFR, которые могут применяться для идентификации клеток и тканей, отвечающих на GDNF в норме и патологии. Альтернативно, зонды можно использовать для обнаружения нарушений экспрессии GDNFR у больного, страдающего от связанного с GDNF расстройства. В качестве другого объекта изобретения заявлены зонды GDNFR, в том числе на основе нуклеиновых кислот и антител, которые могут быть использованы для идентификации GDNFродтвенных молекул. Например, согласно настоящему изобретению, заявлены такие молекулы, которые образуют комплекс с GDNFR и потому участвуют в осуществлении его функции. В качестве другого примера, настоящее изобретение относится к молекулам рецептора,которые гомологичны или антигенно перекрестно-реактивны, но не идентичны GDNFR. Настоящее изобретение также применимо для разработки тест-систем на связывание и функциональную активность GDNF на основе соответствующего рецептора. Например, в тестсистемах для обнаружения активности GDNF могут быть использованы клетки, экспрессирующие большие количества GDNFR и потому крайне чувствительные к очень низким концентрациям GDNF или GDNF-подобных молекул. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, растворимый GDNFR может применяться для связывания или обнаруженияGDNF или GDNF-подобных молекул. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, заявлены экспериментальные модельные системы для изучения физиологической роли GDNFR. К этим системам относятся тесты с использованием анти-GDNFR антител или олигонуклеотидных зондов, а также модели на животных, таких как трансгенные животные,которые экспрессируют большие количестваGDNFR и потому гиперчувствительны к GDNF,или животные, полученные с использованием технологии эмбриональных стволовых клеток, у которых эндогенные гены GDNFR делетированы из генома. Анти-GDNFR антитела будут связываться с пептидной частью белка рецептора нейротрофного фактора. К таким антителам относятся моноклональные или поликлональные антитела. Альтернативно, для облегчения детекции к белку GDNFR могут быть присоединены иммунологические метки, для которых уже существуют антитела. К таким меткам относятся (без ограничения перечисленными)myc-последовательности. Другие последовательности-метки, такие как полигистидин,также были использованы для обнаружения и очистки с применением металлохелатирующих колонок. Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны для квалифицированного специалиста из дальнейшего описания, детально раскрывающего варианты применения настоящего изобретения. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1), кодирующая рецептор нейротрофного фактора, полученного из глиальной клеточной линии человека(GDNFR). Аминокислотная последовательность полноразмерного белка GDNFR кодируется нуклеотидными остатками с 540 по 1934; на фиг. 2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) полноразмерного белка GDNFR человека; на фиг. 3 - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3), кодирующая GDNFR крысы. Аминокислотная последовательность полноразмерного белка GDNFR кодируется нуклеотидными остатками с 302 по 1705; на фиг. 4 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) полноразмерного белкаGDNFR крысы. на фиг. 5 - сопоставление и сравнение фрагментов последовательностей кДНКGDNFR человека; на фиг. 6 - идентификация экспрессирующих GDNFR клеточных линий, полученных из клеток Neuro-2A; на фиг. 7 А и 7 В - результаты равновесного связывания [125I]GDNF с клетками, экспрессирующими GDNFR; на фиг. 8 - результаты химического перекрестного связывания [125J] GDNF с GDNFR иRet, экспрессируемым в клетках, экспрессирующих GDNFR; на фиг. 9 - результаты индукции аутофосфорилирования с-Ret под действием GDNF в клетках, экспрессирующих GDNFR; на фиг. 10 - результаты индукции аутофосфорилирования с-Ret под действием GDNF и растворимого GDNFR; на фиг. 11 - результаты блокирования аутофосфорилирования с-Ret под действием белка слияния Ret-Fc; на фиг. 12 - результаты индукции аутофосфорилирования c-Ret под действием GDNF в моторных нейронах; на фиг. 13 - модель передачи сигналаGDNF посредством GDNFR и Ret. Подробное описание изобретения Нейротрофный фактор, полученный из глиальной клеточной линии (GDNF), является 12 мощным нейротрофным фактором, обладающим широким спектром биологических активностей в отношении клеток различных типов как центральной, так и периферической нервной системы. Он представляет собой гликозилированный димер, соединенный дисульфидными связями, который отдаленно родственен (меньше 20% гомологии) представителям суперсемейства трансформирующего фактора- (TGF). Способность GDNF повышать выживаемость допаминергических нейронов и нейронов других популяций свидетельствует о его терапевтическом потенциале для лечения болезни Паркинсона, а также других форм повреждения нервов и неврологических дисфункций. В отличие от интенсивного изучения распределения и биоактивности GDNF, не было сообщений об идентификации рецептора или рецепторов, опосредующих связывание GDNF клеткой, и тем самым запускающих внутриклеточную передачу сигнала и клеточный ответ. Настоящее изобретение основывается на обнаружении высокоаффинного рецептора, впервые найденного на поверхности культивируемых клеток сетчатки, взятых у крыс вскоре после рождения. Данные рецепторы обладают способностью связывать GDNF с аффинностью, сопоставимой с таковой для рецепторов, обнаруживаемых в допаминергических и моторных нейронах; допаминергических нейронах среднего мозга (Lin et al., 1993, supra; Sauer et al., 1995,supra; Kearns and Gash, 1995, supra; Beck et al.,1995, supra; Tomac et al., 1995a, supra), лицевых и спинномозговых моторных нейронах (Li et al.,1995, supra; Oppenheim et al., 1995, supra; Yan etet al., 1994, supra). Рецепторная молекула была названа GDNF-рецептором (GDNFR), поскольку она является первым известным компонентом рецепторной системы GDNF. Согласно настоящему изобретению, в заявке также впервые описано экспрессионное клонирование белкаGDNFR и приведены его свойства. Клетки, модифицированные для экспрессии рекомбинантного рецептора, связывают GDNF с высокой аффинностью. С использованием теста на захват допамина и связывания [125I]-GDNF культивируемыми клетками были обнаружены высокоаффинные рецепторы GDNF на поверхности фоторецепторных клеток крысы. Как далее описано в разделе Примеры, изучение фоторецепторных клеток привело к выделению кДНКового клона,использованного для экспрессионного клонирования рецептора GDNFR. Нуклеотидная последовательность GDNFR кодирует белок, состоящий из 468 аминокислот с 31 остатком цистеина и тремя потенциальными сайтами N-гликозилирования. Затем нуклеотидная последовательность клона крысиной кДНК была использована для выделения человеческого гомолога, кото 13 рый оказался почти идентичен рецептору крысы на аминокислотном уровне. Последовательность кДНК GDNFR человека кодирует белок из 465 аминокислот, в котором положения всех остатков цистеина и потенциальных сайтов Nгликозилирования совпадают с таковыми у рецептора крысы. Столь высокая степень консервативности в отношении первичной последовательности указывает на важную роль данного рецептора в осуществлении биологической функции GDNF. Как обсуждалось выше, многие рецепторы состоят из трех доменов: внеклеточного или поверхностного домена, ответственного за специфическое связывание белкового фактора; трансмембранного домена,проникающего сквозь клеточную мембрану; и внутриклеточного или цитоплазматического домена, который обычно участвует в инициации передачи сигнала при связывании внеклеточным доменом белкового фактора. Однако было установлено, чтоGDNFR не имеет структурного сходства или сходства по последовательностям ни с каким из известных белков (например, консенсусными последовательностями, характерными для рецепторных киназ или рецепторов цитокинов), не имеет цитоплазматического домена, не имеет Сконцевых заряженных остатков, характерных для трансмембранного домена и заякорен в клеточной мембране гликозилфосфатидилинозитольной (GPI) связью, как более подробно описано ниже. Хотя отсутствие внутриклеточного каталитического домена исключает прямое участие в трансмембранной передаче сигнала,высокая аффинность связывания и строгая эволюционная консервативность последовательностей дают основания говорить о важности данного фактора для осуществления функцииGDNF. Поскольку у GDNFR отсутствует цитоплазматический домен, считается, что данный рецептор должен действовать в сочетании с одной или более дополнительной молекулой, которая участвует в трансмембранной передаче сигнала. Обнаружено, что трансгенные мыши, у которых отсутствует ген GDNF, не имеют почек и нежизнеспособны. Трансгенные мыши с утратой протоонкогена c-ret (Schuchardt et al., Nature,367, 380-383, 1994) имеют сходный фенотип. Протоонкоген c-ret кодирует рецепторную тирозинкиназу (RTK), нормальная функция которой еще не выяснена. Все RTKs имеют сходную топологию: у них есть внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сегмент, содержащий каталитический протеин-тирозинкиназный домен. Связывание лиганда приводит к активации киназного домена и фосфорилированию специфических субстратов в клетке, которые участвуют во внутриклеточной передаче сигнала. В соответствии с настоящим изобретением описано установление того факта, что растворимая фор 002924 14 ма GDNFR может быть применена для опосредования связывания GDNF с протоонкогеном cret, приводя тем самым к клеточному ответу наGDNF, а также модифицируя его специфичность в отношении определенного типа клеток. Подобные компоненты рецепторов, обозначенных как рецепторы альфа, обладают лиганд-связывающей специфичностью, но не могут передавать сигнал сами по себе. К ним относятся компоненты рецепторных систем цилиарного нейротрофного фактора (CNTF) и интерлейкина-6 (IL-6). Подобно GDNFR, но в отличие от рецептора IL-6, рецептор CNTF связывает свой лиганд с высокой аффинностью, имеет гидрофобный С-конец, не имеет цитоплазматического домена и заякорен в клеточной мембране GPI-связью (Davis et al., 1991). Для осуществления передачи сигнала CNTF сначала связывается с рецептором CNTF, образуя комплекс, способный связывать gp130. Затем этот неактивный комплекс связывается с рецепторомLIF и образует активный передающий комплекс(Davis et al., Science, 260, 1805-1807, 1993). Как и в случае настоящего изобретения, для того,чтобы происходила передача сигнала, должен присутствовать рецептор CNTF (лигандспецифичный связывающий компонент), но он не обязательно должен быть связан с мембраной(Economides et al., Science, 270, 1351-1353,1995). Как описано далее, белок GDNFR может быть заякорен на клеточной поверхности, а может быть получен и в растворимой форме. В любом случае белок GDNFR образует лигандный комплекс с GDNF, лигандный комплекс связывается с рецептором на клеточной поверхности и запускает внутриклеточную передачу сигнала. Таким образом, растворимая формаGDNFR может быть использована для потенцирования действия GDNF и/или модификации его специфичности в отношении типа клеток.GDNFR не имеет родства ни с одним из известных рецепторов. Каких либо указаний на родственные последовательности в базах данных GenBank и Washington University-Merck обнаружено не было. Экспрессированная последовательность tag (EST), обнаруженная в базе данных Washington University-Merck EST, обнаружила 75% гомологии с небольшой частью кодирующей области GDNFR (приблизительно 340 нуклеотидов из 521 нуклеотида последовательности, генерированной с 5'-конца клона). Данный клон (GenBank Н 12981) был выделен из олиго-dT-праймированной библиотеки мозга ребенка и направленно клонирован в векторLafmid BA (Hillier, L. et al., неопубликованные данные). 3'-конец клона Н 12981 был просеквенирован, но какой-либо гомологии с какой-либо частью GDNFR обнаружено не было. Появление гомологии между клоном Н 12981 и GDNFR на коротком участке с последующим исчезновением этой гомологии дает основание считать, что 15 клон Н 12981 представляет скорее несплайсированный транскрипт или артефакт клонирования, нежели транскрипт кДНК bona fide. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением осуществлено клонирование белка GDNFR, что стало возможным за счет метода отбора клеток-мишеней, экспрессирующих GDNFR. Благодаря разработке способа обогащения GDNFR-кодирующих последовательностей в объем настоящего изобретения вошли методы очистки белка GDNFR и прямое клонирование GDNFR-кодирующей ДНК. В данном описании приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности GDNFR,что позволяет воспроизводить данные молекулы, а также различные аналоги GDNFR. С учетом указанной информации белковые продуктыGDNFR могут быть выделены или генерированы любым известным квалифицированному специалисту способом. Описаны также различные способы рекомбинантного и синтетического получения белка GDNFR. Под термином белковый продуктGDNFR понимается биологически активный очищенный природный, синтетический или рекомбинантный GDNFR, аналоги GDNFR (например, гомологи GDNFR и варианты, включая инсерционные, заместительные или делеционные варианты), а также его химически модифицированные производные. Аналоги GDNFR являются, по существу, гомологичными аминокислотным последовательностям GDNFR, приведенным на фиг. 2 и 4 (SEQ. ID. Nos:2 и 4). Термин биологически активный означает, что белковый продукт GDNFR с высокой аффинностью связывает GDNF и опосредует или усиливает индуцированную GDNF передачу сигнала. С помощью настоящего описания квалифицированный специалист может определить,имеет ли полипептидный аналог GDNFR, по существу, ту же самую биологическую активность что и белковые продукты GDNFR, приведенные на фиг. 2 и 4. Термин существенно гомологичная аминокислотная последовательность означает аминокислотную последовательность с определенной степенью сходства или гомологии с аминокислотными последовательностями GDNFR,приведенными на фиг. 2 и 4, при том, что данная гомологичная последовательность имеет биологическую активность или функцию, сходные с таковыми, описанными для аминокислотных последовательностей GDNFR. Как очевидно квалифицированному специалисту, относительно большое число индивидуальных аминокислотных остатков или их групп может быть заменено, перестроено (например, в обратном порядке) или полностью делегировано из аминокислотной последовательности без последствий для трехмерной конфигурации или активности молекулы. Подобные модификации вполне могут быть осуществлены квалифицированным 16 специалистом с учетом настоящего описания. Способы получения и идентификации таких модифицированных последовательностей более подробно описаны ниже. Предпочтительно,чтобы степень гомологии существенно гомологичного белка (пептида) была равна или превышала 70% (т.е. находилась в пределах от 70 до 100% гомологии). Так, предпочтительная существенно гомологичная аминокислотная последовательность GDNFR может иметь степень гомологии, равную или большую 70%, с аминокислотными последовательностями, обозначенными как SEQ. ID. Nos:2 и 4. Более предпочтительно, чтобы степень гомологии была равна или превышала 85%. Еще более предпочтительно, чтобы она была равна или превышала 90%,и, наиболее предпочтительно, чтобы она была равна или превышала 95%. Процент гомологии вычисляют как процент аминокислотных остатков, обнаруживаемых в одной последовательности белка при сопоставлении с идентичными или сходными аминокислотными остатками второй сравниваемой последовательности белка. Так, в случае гомологии GDNFR, степень гомологии последовательностей может быть определена оптимальным сопоставлением аминокислотных остатков в сравниваемой молекуле с таковыми в референсном полипептиде GDNFR, последовательность которого обозначена как SEQ. ID. Nos:2 и 4, или кодируемого нуклеотидными последовательностями, приведенными на фигурах, для того чтобы максимизировать совпадения остатков двух последовательностей. Как очевидно квалифицированному специалисту, такое сопоставление может учитывать соответствующие консервативные замены остатков и не будет учитывать усечения и внутренние делеции или инсерции в сравниваемых последовательностях путем введения пробелов по мере необходимости; см. например, Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, при том, что в среднем три или четыре пробела на 100 аминокислот могут быть введены для облегчения такого сопоставления (р. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.,1972; упоминаемый в настоящем описании в качестве ссылки). По завершении сопоставления можно определить процент совпадений, вычисляемый как число совпадающих остатков в сравниваемом полипептиде, поделенное на общее число остатков в сравниваемом полипептиде. Считается также, что последовательностиGDNFR, заявленные в настоящем изобретении,могут быть использованы для получения участка слитого белка или химерного белка, обладающего, по меньшей мере отчасти, активностью GDNFR. Сопоставление и определение гомологии такого белка могут быть осуществлены с использованием того участка слитого белка или химерного белка, который имеет отношение к активности GDNFR. 17 К источникам таких существенно гомологичных белков GDNFR относятся белки GDNFR млекопитающих других видов, имеющие высокую степень гомологии с белком GDNFR человека. Например, степень гомологии между описанными в настоящем изобретении белкамиGDNFR человека и крысы составляет около 93%. Существенно гомологичные белки GDNFR могут быть получены от таких млекопитающих за счет перекрестной реактивности с антителами к аминокислотным последовательностямGDNFR SED ID NOs:2 и 4. Альтернативно, они могут быть экспрессированы нуклеотидными последовательностями, выделенными гибридизацией с геном (или с сегментами гена), который кодирует GDNFR SED ID NOs:2 и 4, или который гибридизуется с последовательностью,комплементарной нуклеотидным последовательностям SED ID NOs:2 и 4. Приемлемые условия гибридизации более подробно описаны далее. Новые продукты белка GDNFR обычно выделяют и очищают с получением белковых продуктов GDNFR, по существу, свободных от нежелательных веществ, которые могли бы препятствовать использованию данных полипептидов по прямому назначению. Например, предпочтительные белковые продукты GDNFR могут быть, по существу, свободны от присутствия другого (т.е. не GDNFR) белкового материала человеческого происхождения или патогенов. Предпочтительно, белковые продукты GDNFR на 80% свободны от других белков, которые могут присутствовать в препаратах в силу способа, используемого для производства белкового продукта GDNFR. Более предпочтительно,белковые продукты GDNFR на 90% свободны от других белков, особенно предпочтительно на 95% свободны от других белков и наиболее предпочтительно более чем на 98% свободны от других белков. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет уникальное преимущество в виде нуклеотидных последовательностей для производства гомогенных белков GDNFR. Заявлены также разнообразные вариантыGDNFR, включая варианты с дополнениями,делениями и заменами. Например, может быть получена серия делеционных варинтов путем удаления одного или нескольких аминокислотных остатков с амино- и/или карбокси-конца белка GDNFR. Если исходить из разработок предсказания сайта отщепления сигнального пептида, описанных von Heijne (von Heijne, Nucleic Acids Research, 14, 4683-4690,1986), первым аминокислотным остатком белка GDNFR,который должен участвовать в связыванииGDNF, является Ser18, как показано для полноразмерной аминокислотной последовательностиGDNFR человека на фиг. 2 (SEQ ID NO:2). Аминокислотные остатки от Met1 до Ser18 расположены в амино-терминальной гидрофобной области и, по-видимому, являются частью по 002924 18 следовательности сигнального пептида и потому не включаются в зрелую форму рецепторного белка. Аналогично, последним аминокислотным остатком белка GDNFR, необходимым, повидимому, для связывания GDNF, являетсяSer446. Аминокислотные остатки от Leu447 доSer465 расположены в карбокси-терминальной гидрофобной области и участвуют в GPI заякоривании белка на клеточной поверхности. Так считается, что любой или все остатки отMet1 до Ser18 и/или от Leu447 до Ser465 (как обозначено на фиг. 2 (SEQ ID NO:2 могут быть удалены из белка без воздействия на связываниеGDNF белком GDNFR, если при этом остается ядерная последовательность от Аlа 19 до Pro446. С применением известных методов анализа показано, что к N-терминальным усечениям могут относиться и удаления одного или нескольких аминокислотных остатков до (и включая) Gly24. Так усеченные аналоги GDNFR могут включать делецию одного или нескольких аминокислотных остатков как с одного, так и с обоих концов молекулы, при том, что аминокислотная последовательность от Asp25 до Pro446 или Leu447 образует основу ядра молекулы. В настоящее изобретение включены и дополнительные аналоги GDNFR с аминокислотными остатками отSer18 до Рro449, как показано для аминокислотной последовательности GDNFR на Фиг. 4 (SEQID NO:4), например, аналоги с делецией одного или нескольких аминокислотных остатков в гидрофобных районах, обозначенных как аминокислотные остатки от Met1 до Ser18 и/или отPro449 до Ser468. Кроме того, считается, что один или несколько аминокислотных остатков могут быть удалены с одного или обоих амино- или карбокси-концов, при том, что в полноразмерной последовательности остаются первый и последний остатки цистеина. Преимущество сохранения остатков цистеина состоит в соответствующем внутримолекулярном связывании белкаGDNFR. Как показано для полноразмерной аминокислотной последовательности GDNFR человека на фиг. 2 (SEQ ID NO:2), любой или все аминокислотные остатки от Met1 до Asp28 могут быть удалены с амино-конца и при этом остается первый остаток цистеина, который становится Cys29. Аналогично, любой или все аминокислотные остатки от Gly443 до Ser465 могут быть удалены с карбокси-конца без удаления последнего остатка цистеина, который становится Cys442. Другие аналоги GDNFR могут быть получены с использованием аминокислотных остатков от Cys29 до Суs443, как показано для аминокислотной последовательностиGDNFR на фиг. 4 (SEQ ID NO:4), например,делецией всей или части терминальных областей от Met1 до Asp28 и/или от Ser444 до Ser468. Как очевидно квалифицированному специалисту, по тем же причинам указанные идентифицированные аминокислотные остатки мо 19 гут быть заменены, а не делетированы без воздействия на функцию белка GDNFR. Альтернативно, эти идентифицированные аминокислотные остатки могут быть модифицированы внутриостаточными инсерциями или терминальными добавками без эффекта на функцию белкаGDNFR. В качестве одного из вариантов осуществления изобретения могут быть осуществлены комбинации одной или нескольких делеций,замен и добавлений. Заявленные белки GDNFR или нуклеиновые кислоты могут быть использованы для разработки методов лечения или способов производства медикаментов. Подобному лечению подлежат состояния, характеризующиеся избыточной продукцией белка GDNF, когда присутствующий GDNFR, особенно в растворимой форме, может образовывать комплекс и тем самым инактивировать избыточный белок GDNF. Терапевтический эффект может быть достигнут получением растворимого рецептора (например,GDNFR-связывающего домена) или получением популяции клеток, содержащих такой GDNFR, и их трансплантацией нуждающемуся реципиенту. Заявленный белок GDNFR может быть использован для терапии больных с дефектными рецепторами GDNF. Например, индивидуум с дефектными GDNFR может быть пролечен путем получения и введения растворимого рецептора, или получением популяции клеток, содержащих такой недефектный GDNFR, и их трансплантацией индивидууму. Или, например,индивидуум может иметь неадекватное количество рецепторов GDNF и содержащие такие рецепторы клетки могут быть трансплантированы для повышения числа доступных рецепторовGDNF у индивидуума. Подобные композиции могут быть использованы в сочетании с введением GDNF. Считается также, что белковые продукты GDNFR могут быть использованы для лечения состояний, отвечающих на активацию рецепторной тирозинкиназы c-ret. Другим аспектом настоящего изобретения является преимущество новых композиций, в которых GDNFR применяется для стабилизации фармацевтических составов белка GDNF. Другим аспектом настоящего изобретения является возможное применение GDNFR для скрининга соединений на антагонистическую активность. Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны квалифицированному специалисту. Например, к дополнительным применениям относятся новые тестсистемы, трансгенные животные и получение антител. Модельные системы Согласно настоящему изобретению заявлены тест-системы, при помощи которых может быть обнаружена активность GDNFR или активность, сходная с активностью GDNF, являющаяся результатом взаимодействия с пептидом или пептидным соединением. Такое обна 002924 20 ружение возможно посредством измерения повышенного физиологического ответа клетки или клеточной линии, экспрессирующих молекулыGDNFR, заявленные в настоящем изобретении. Физиологический ответ может быть обусловлен любым биологическим эффектом GDNF, включая (но не ограничиваясь перечисленным) потребление допамина, растягивание нейритов,повышенную выживаемость клеток и их рост, а также транскрипционную активацию определенных нуклеотидных последовательностей(например, элементов промотор/энхансер или структурных генов), GDNF-связанный процессинг, трансляцию или фосфорилирование, а также индукцию вторичных процессов в ответ на процессы, прямо или косвенно индуцированные GDNF. Например, может быть создана модельная система для изучения эффектов избыточной активности GDNF. В такой системе ответ клетки на GDNF может быть повышен путем увеличения числа рецепторов GDNF на поверхности клеток модельной системы в сравнении с немодифицированными клетками. Может быть также разработана система для селективного увеличения числа рецепторов GDNF на клетках, которые в норме экспрессируют GDNFR. Для гарантированной экспрессии GDNFR ген GDNFR может быть поставлен под контроль приемлемой промоторной последовательности. Может возникнуть необходимость помещения генаGDNFR под контроль конститутивного и/или тканеспецифического промотора, включая (без ограничений перечисленными) промотор енолазы, специфичной для нейронов центральной нервной системы, промотор нейрофиламентов и промотор тирозингидроксилазы, под контроль индуцибельного промотора (такого, как металлотионеиновый промотор), УФ-активируемый промотор, содержащийся в длинном концевом повторе вируса иммунодефицита человека (Valery et al., 1988, Nature, 333:78-81) или промоторCMV (содержащийся, например, в векторе рСМХ) или промоторы, регулируемые в ходе развития. Путем увеличения числа клеточных рецепторов к GDNF можно повысить ответ на эндогенный GDNF. Если модельная система содержит небольшое количество GDNF или не содержит его совсем, GDNF может быть введен в систему. Необходимость во введении в систему дополнительного количества GDNF может возникнуть при оценке эффектов избыточной активности GDNF. Суперэкспрессия GDNF (или секретируемого GDNF) может быть одним из методов изучения эффектов повышенных уровней GDNF на клетки, уже экспрессирующиеGDNFR. Терапия на основе GDNFR С другой стороны, при некоторых состояниях повышенная отвечаемость на GDNF может иметь положительный эффект. Так можно пред 21 ставить благоприятный результат повышения числа или аффинности связывания рецепторовGDNF у больных, страдающих заболеванием,поддающимся терапии на основе GDNF. Это может быть обеспечено посредством генотерапии, когда достигается избирательная экспрессия рекомбинантного GDNFR соответствующими клетками, например, при использовании генов GDNFR под контролем тканеспецифических или индуцибельных промоторов, или же при локализованном инфицировании дефектным по репликации вирусом, несущим рекомбинантный ген GDNFR. Считается, что состояния, при которых терапия на основе GDNFR или сочетанная терапия GDNF/GDNFR может принести пользу,включают, но не ограничиваются перечисленными, нарушения функционирования моторных нейронов, в том числе амиотрофический латеральный склероз, неврологические расстройства, связанные с диабетом, болезнью Паркинсона, болезнью Альцгеймера и хореей Хантингтона. Дополнительные показания для терапии на основе GDNFR или сочетанной терапииGDNF/GDNFR приведены выше и включают также лечение следующих заболеваний: глаукомы или других болезней и состояний, связанных с дегенерацией клеток ганглиев сетчатки; сенсорных нейропатий, вызванных повреждениями или дегенерацией сенсорных нейронов; таких патологических состояний, как наследственные дегенерации сетчатки и ретинопатии,обусловленные возрастом, болезнью или травмой, при которых происходит дегенерация фоторецепторов, ответственная за потерю зрения; повреждений или дегенеративных состояний сенсорных клеток внутреннего уха, таких как волосяные клетки и слуховые нейроны, с целью предотвращения и/или лечения потери слуха в силу различных причин. Трансгенные животные Другим аспектом настоящего изобретения является возможное применение рекомбинантного гена GDNFR для инактивации или нокаута эндогенного гена (например, путем гомологичной рекомбинации) и создания таким образом дефицитных по GDNFR клеток, тканей или животных. Например, может быть сконструирован рекомбинантный ген GDNFR, содержащий инсерционную мутацию, которая инактивируетGDNFR. Такой конструкт под контролем соответствующего промотора может быть введен в клетку, например в эмбриональную стволовую клетку, любым обычным методом, включая трансфекцию, трансдукцию, инъекцию и т.д. Содержащие данный конструкт клетки можно отобрать, например, по устойчивости к антибиотику G-418. Затем идентифицируют клетки,утратившие интактный ген GDNFR (например,Саузерн-блоттингом, Нозерн-блоттингом или тестом на экспрессию). Утратившие интактный ген GDNFR клетки затем могут быть слиты с 22 ранними эмбриональными клетками для получения трансгенных животных, дефицитных поGDNFR. Сравнение таких животных с животными, не экспрессирующими эндогенныйGDNF, показало бы, совпадают ли полностью эти два фенотипа или нет, принимая во внимание наличие дополнительных GDNF-подобных факторов или рецепторов. Таких животных можно использовать для идентификации специфических популяций нейронов и процессов invivo, в норме зависящих от GDNF. Можно ожидать, что эти популяции и процессы будут изменены у животных, не экспрессирующихGDNFR и потому не отвечающих на GDNF. Диагностические применения Согласно настоящему изобретению,GDNFR-зонды могут применяться для идентификации клеток и тканей, отвечающих на GDNF в норме и патологии. В соответствии с настоящим изобретением заявлены способы идентификации клеток, отвечающих на GDNF, путем обнаружения экспрессии GDNFR в данных клетках. Об экспрессии GDNFR могут свидетельствовать транскрипция мРНК GDNFR или продукция белка GDNFR. Экспрессия GDNFR может быть обнаружена с применением зондов,которые идентифицируют нуклеиновую кислоту или белок GDNFR, или же путем обнаружения маркерных последовательностей, искусственно добавленных к белку GDNFR. Среди многообразных зондов, которые могут быть применены для обнаружения экспрессии GDNFR, имеется нуклеотидный зонд, который можно использовать для обнаруженияGDNFR-кодируемой РНК любым известным методом, включая (без ограничения перечисленными) гибридизацию in situ, Нозернблоттинг или различные варианты ПЦР. Заявленные согласно изобретению нуклеотидные продукты могут быть помечены обнаружимыми маркерами (такими, как радиоактивные метки или неизотопные метки, подобные биотину) и использованы в реакциях гибридизации для локализации гена GDNFR человека и/или локализации других родственных генов на хромосомной карте. Они могут также применяться для идентификации нарушений функционирования гена GDNFR человека на уровне ДНК и использоваться в качестве генных маркеров для идентификации соседствующих генов и их возможных повреждений. Заявлены также наборы, в состав которых входят подобным образом меченные материалы. Заявленные в соответствии с изобретением полипептидные продукты могут быть помечены путем ассоциации с обнаружимым маркерным веществом или меткой (например, радиоактивным изотопом, флуоресцентным или хемилюминесцентным веществом, ферментом или другой меткой, доступной квалифицированному специалисту) с тем, чтобы получить реагенты,применимые для обнаружения и количествен 23 ной оценки GDNF в плотной ткани и жидких образцах, таких как кровь или моча. Подобные продукты могут быть также использованы для обнаружения клеток и тканей, отвечающих наGDNF в норме и патологии. Другой возможный тест на наличие GDNF в исследуемом образце предусматривает приведение исследуемого образца в контакт с пептидом GDNFR, иммобилизованным на твердой подложке, с образованием GDNFR-связанногоGDNF. GDNFR-связанный GDNF может быть дополнительно приведен в контакт с детектирующим реагентом, таким как меченное GDNFспецифичное антитело, с образованием обнаружимого продукта. Подобные тесты могут быть осуществлены с помощью устройств для анализа испытуемых образцов. В общем виде подобные устройства включают твердую подложку,покрытую GDNFR или содержащую GDNFR. Способ анализа образца на наличие GDNF может включать обеспечение контакта образца с тест-реагентом, представляющим собой белокGDNFR, при том, что данный белок GDNFR реагирует с GDNF, присутствующим в тестируемом образце, и образует обнаружимый продукт реакции, указывающий на наличие GDNF. Заявленные тест-реагенты могут представлять собой часть набора или промышленный образец. В частности, промышленный образец может состоять из упаковочного материала и одного или нескольких препаратов заявленных согласно настоящему изобретению нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. Такие упаковочные материалы должны включать этикетку, указывающую, что препарат используется для обнаружения GDNF, GDNFR или дефектов GDNFR в биологическом образце. Так, в набор могут дополнительно включаться материалы для проведения подобных анализов,например, реагенты для проведения анализа 24 белков, гибридизационного анализа ДНК или РНК, ПЦР-анализа крови, мочи или образцов тканей. Анти-GDNFR антитела Согласно настоящему изобретению, белокGDNFR, его фрагменты и производные могут быть использованы в качестве иммуногена для получения анти-GDNFR антител. Чтобы повысить вероятность анти-GDNFR иммунного ответа, можно проанализировать аминокислотную последовательность GDNFR и идентифицировать те части молекулы, которые могут быть ассоциированы с повышенной иммуногенностью. Например, аминокислотные последовательности можно подвергнуть компьютерному анализу для идентификации поверхностных эпитопов и построить компьютерные модели,позволяющие судить о гидрофильности, вероятности быть представленными на поверхности,гибкости, антигенного индекса, амфифильной спирали, амфифильной плоскости и вторичной структуре GDNFR. Альтернативно, можно сравнить аминокислотные последовательностиGDNFR различных биологических видов, идентифицировать относительно негомологичные области, которые скорее всего окажутся иммуногенными для различных видов. В соответствии с изобретением заявлены также полипептидные фрагменты, в которых повторяется часть непрерывной аминокислотной последовательности или вторичных конформаций GDNFR, которые могут обладать одной (например, иммунологической) активностью GDNFR млекопитающих, но не обладать другими активностями (например, GDNFсвязывающей активностью). Таким образом,получение антител может включать и получение антипептидных антител. С использованием последовательностей GDNFR были синтезированы следующие пептиды: Пептиды SJP-6, 7 и 8 идентичны GDNFR человека и крысы. Пептиды SJP-9 и 10 получены на основе последовательности GDNFR крысы и каждый отличается одной аминокислотой от аналогичных последовательностей человека. С применением пептидных или других участковGDNFR в соответствии с известными из уровня техники методами могут быть получены как моноклональные, так и поликлональные антитела. Моноклональные антитела, направленные против GDNFR, могут быть получены любым известным способом, обеспечивающим продукцию молекул антител перевиваемыми клеточ ными линиями в культуре. Например, могут применяться гибридомная технология, первоначально разработанная Келером и Мильштейном для получения моноклональных антителMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, Inc. pp.77-96, 1985) и им подобные. Для терапевтического применения могут быть получены человеческие моноклональные антитела или химерные антитела типа человекмышь (или химерные антитела других видов). 25 Из уровня техники известны многочисленные способы их получения (Teng et al., Proc. Natl.al., Immunology Today 4:72, 1983; Olsson et al.,Meth. Enzymol., 92:3-16, 1982). Могут быть сконструированы молекулы химерных антител,состоящие из мышиных антиген-связывающих доменов и человеческих константных областей(Morrison et al., Ргос. Natl. Acad. Sci.U.S.A.,81:6851, 1984; Takeda et al., Nature, 314:452,1985). Различные подходы, известные из уровня техники, могут применяться для получения поликлональных антител. Для получения антител различные животные-хозяева, к которым относятся (без ограничения перечисленными) кролики, мыши, крысы и т.д. могут быть иммунизированы инъекцией белка GDNFR, или его фрагмента или производного. Для повышения иммунологического ответа могут применяться различные адъюванты, выбор которых определяется видом иммунизированного животного. К приемлемым адъювантам относятся (но не ограничиваются перечисленными) адъювант Фрейнда (полный и неполный), такие минеральные гели, как гидроокись алюминия, такие поверхностно активные вещества, как лизолецитин, полиолы типа Плюроник, полианионы,пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины моллюсков, динитрофенол и такие адъюванты,предназначенные для введения человеку, какparvum. Кроме того, известными методами может быть получен молекулярный клон антител к эпитопу GDNFR. Методы рекомбинантных ДНК(см., например, Maniatis et al., Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,1982) могут быть применены для конструирования нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулу моноклонального антитела или ее антиген-связывающий фрагмент. Молекулы антител очищают известными методами, например, иммуноадсорбцией или иммуноаффинной хроматографией, такими хроматографическими методами, как жидкостная хроматография высокого разрешения, или их комбинацией и т.п. В настоящем изобретении заявлены молекулы антител, а также фрагменты таких молекул антител. Известными методами могут быть получены фрагменты антител, содержащие идиотип молекулы. Например,такие фрагменты включают (без ограничения перечисленными): F(аb')2-фрагмент, который может быть получен путем расщепления молекулы антитела пепсином; Fab'-фрагменты, получаемые восстановлением дисульфидных мостиков в F(аb')2-фрагменте и Fab'-фрагменты, которые могут быть получены обработкой молекулы антитела папаином или восстанавливающим агентом. 26 Подобные молекулы, обладающие селективным связыванием, могут сами по себе являться альтернативой белка GDNFR и входить в состав фармацевтических препаратов. Рекомбинантная экспрессия белка GDNFR В настоящем изобретении заявлены различные полинуклеотиды, кодирующие белкиGDNFR. Продукт экспрессии (или его производное) характеризуется способностью специфически связывать GDNF с высокой аффинностью. Это связывание запускает взаимодействие с сигнальными молекулами, тем самым обеспечивая или усиливая активность GDNF, например, направленную на повышение потребления допамина допаминергическими клетками. Полинуклеотиды могут быть также использованы для целей клеточной терапии или генной терапии. В настоящем изобретении заявлены новый белок GDNFR и последовательности ДНК, кодирующие полные рецепторы или их участки. К новым нуклеотидным последовательностям,заявленным в настоящем изобретении, относятся последовательности, пригодные для обеспечения экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах полипептидных продуктов, которые обладают, по меньшей мере, частью первичной структурной конформации и одним или более из биологических свойств рекомбинантного GDNFR человека. Нуклеиновые кислоты могут быть выделены и очищены с тем, чтобы использовать нужную кодирующую область для получения заявленных полипептидов. Альтернативно, нуклеотидная последовательность может быть использована для диагностических целей, как более подробно описано ниже. Примерами последовательностей ДНК, заявленных в настоящем изобретении, служат нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности GDNFR, приведенные на фиг. 2 и 4 и обозначенные как SEQ ID Nos: 2 и 4. Кроме того, заявленные в настоящем изобретении нуклеотидные последовательности конкретно включают: (а) любую из последовательностей ДНК, приведенных на фиг. 1 и 3 (и комплементарные нити); (б) последовательность ДНК, которая гибридизуется (в условиях гибридизации,описанных в разделе, посвященном скринингу кДНКовой библиотеки, или в эквивалентных условиях, или в более жестких условиях) с последовательностью ДНК, обозначенной в пункте (а), или ее фрагментами; (в) последовательность ДНК, которая в силу вырожденности генетического кода будет гибридизоваться с последовательностью ДНК, обозначенной в пункте (а). Конкретно, упомянутые в пунктах (б) и(в) последовательности включают геномные последовательности ДНК, кодирующие аллельные вариантные формы GDNFR человека и/или кодирующие GDNFR млекопитающих других видов, а также искусственные последовательно 27 сти ДНК, кодирующие GDNFR, фрагментыGDNFR и аналоги GDNFR. При этом последовательности ДНК могут содержать кодоны, облегчающие транскрипцию и трансляцию информационной РНК в микробных хозяевах. Такие искусственные последовательности могут быть легко сконструированы в соответствии с известными из уровня техники методами и методами, описанными в настоящей заявке. Методы рекомбинантной экспрессии, осуществляемые в соответствии с приведенным ниже описанием, могут быть применены для получения таких полинуклеотидов и экспрессии различных белков GDNFR. Например, путем введения нуклеотидной последовательности,кодирующей GDNFR, в соответствующий вектор, квалифицированный специалист может легко получить большие количества нужной нуклеотидной последовательности. Затем последовательности могут быть использованы для получения проб для гибридизации или праймеров для амплификации. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий GDNFR, может быть введен в вектор экспрессии. При введении вектора экспрессии в соответствующие клеткихозяева можно получить большие количества нужного белка. Как видно из дальнейшего описания, существуют многочисленные системы хозяин/вектор, пригодные для получения нужных нуклеотидных последовательностей и/или продукции GDNFR белков. К ним относятся, но не ограничиваются перечисленными, плазмидные,вирусные и инсерционные векторы и прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. Квалифицированный специалист может адаптировать систему хозяин/вектор для наращивания и экспрессии гетерологичной ДНК с целью получения или экспрессии заявленных в настоящем изобретении последовательностей. При помощи рекомбинантных технологий заявленные в настоящем изобретении белкиGDNFR легко получить в коммерческих количествах с высокой степенью чистоты. Кроме того, как следует из настоящего описания, и что очевидно квалифицированному специалисту,нуклеотидные последовательности включают вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки GDNFR, приведенные на фигурах, нуклеотидные последовательности,кодирующие варианты белков GDNFR, а также нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются (предпочтительно в жестких условиях гибридизации) с данными нуклеотидными последовательностями (Maniais et al.,Molecular Cloning, (A Laboratory Manual), ColdSpring Harbor Laboratory, стр. 387-389, 1982). Примером гибридизации в жестких условиях служит гибридизация в 4 х SSC при 62-67 с последующей отмывкой в 0.1 х SSC при 62-67 в течение часа. Альтернативно, жесткую гибридизацию можно провести в 45-55%-ном фор 002924 28 мамиде, 4 х SSC при 40-45. В объем настоящего изобретения также включены последовательности ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 в мягких условиях гибридизации и которые кодируют варианты IL-1ra. Примерами таких мягких условий гибридизации могут служить гибридизация в 4 х SSC при 45-55 С или гибридизация в 30-40%-ном формамиде при 40-45. Получение полинуклеотидов, кодирующихGDNFR Как следует из описания настоящего изобретения, нуклеотидные последовательности,кодирующие полноразмерный полипептидGDNFR, или его фрагменты, могут быть получены различными способами, включая (но не ограничиваясь перечисленными) химический синтез, скрининг геномных и кДНКовых библиотек, скрининг экспрессионных библиотек и/или ПЦР-амплификацию кДНК. Данные методы, а также и другие, пригодные для выделения нуклеотидных последовательностей, известны из уровня техники и описаны в следующих руководствах: Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringBerger and Kimmel (1987), Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques,Vol.152, Academic Press, Inc., San Diego, CA,(1987). Предпочтительными нуклеотидными последовательностями, кодирующими GDNFR,являются последовательности млекопитающих. Химический синтез нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок GDNFR,проводят в соответствии с методами, хорошо известными из уровня техники, описанными,например, Engels et al., (1989) ( Angew. Chem.Intl. Ed., 28:716-734). Указанные методы включают среди прочих фосфотриэфирный, фосфорамидатный и Н-фосфонатный методы синтеза нуклеотидных последовательностей. Большие нуклеотидные последовательности, например,длиннее 100 нуклеотидов, могут быть синтезированы в виде нескольких фрагментов. Затем фрагменты лигируют друг с другом и получают нуклеотидную последовательность для экспрессии полноразмерного полипептида GDNFR или его фрагментов. Альтернативно, искомые нуклеотидные последовательности можно получить при скрининге соответствующих кДНКовых библиотек(например, библиотеки, полученной из одной или нескольких тканей, в которых экспрессируется данный белок) или геномных библиотек(библиотеки, полученной из тотальной геномной ДНК). Источником для получения кДНКовой библиотеки обычно служит ткань любого вида, в которой GDNFR экспрессируется в приемлемых количествах. Обычно источником для получения геномной библиотеки может служить 29 любая ткань или ткани млекопитающего, в которой имеется ген, кодирующий GDNFR. Библиотека может быть проскринирована на наличие кДНК/гена GDNFR с применением одного или более нуклеотидных зондов (таких,как олигонуклеотиды, кДНК или фрагменты геномной ДНК, полученные на основе представленных в настоящем описании последовательностей), которые будут избирательно гибридизоваться с кДНК GDNFR или геном (генами), присутствующим(и) в библиотеке. Используемые для такого скрининга пробы обычно представляют собой небольшой фрагмент нуклеиновой кислоты GDNFR того же или сходного вида, что и вид животного, из которого получена библиотека. Альтернативно, зонды могут быть вырожденными, что обсуждается далее. Обычно скрининг библиотеки проводят путем отжига олигонуклеотидного зонда или кДНК с клонами библиотеки в условиях такой жесткости, которая предотвращает не специфическое связывание, но делает возможным связывание (гибридизацию) с зондом или праймером тех клонов, которые обладают значительным уровнем гомологии. Обычно параметры жесткости гибридизации и последующих отмывок зависят от размера (т.е. числа нуклеотидов) кДНК или олигонуклеотидного зонда, а также от того, является ли зонд вырожденным. При составлении гибридизационной смеси учитывается также вероятность идентификации клона(т.е. скринируется кДНКовая или геномная библиотека; в случае кДНКовой библиотеки вероятность того, что в ней присутствует представляющая интерес кДНК, велика). Когда в качестве зонда используют фрагмент ДНК (такой, как кДНК), то условия гибридизации выбирают, как описано Ausubel et al.,eds. supra. После гибридизации содержащий библиотеку блот отмывают в условиях подходящей жесткости, которая зависит от таких факторов, как размер зонда, ожидаемая гомология зонда и клона, характер скринируемой библиотеки, число скринируемых клонов и т.д. Далее приведены примеры жестких отмывочных растворов, которые обычно имеют низкую ионную силу и применяются при сравнительно высоких температурах: 1) 0,015 М NaCl, 0,005 МEDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7,2 и 1% SDS при 40-50 С; 3) 0,2 x SSC, 1% SDS при 50-65 С. Имеется ряд примерных протоколов отмывки в жестких условиях когда для скрининга кДНКовых или геномных библиотек используют олигонуклеотидные зонды. Например, в одном из протоколов используется 6 х SSC с 0,05% пирофосфата натрия при температуре от 35 до 63 С в зависимости от длины зонда. Например, зонд, состоящий из 14 оснований, отмывают при 35-40 С, из 17 - при 45-50 С, из 20 при 52-57 С и из 23 - при 57-63 С. При усиленном неспецифическом (фоновом) связывании 30 температура может быть повышена на 2-3 С. В другом протоколе для отмывки используется хлорид тетраметиламмония (ТМАС). В состав одного из жестких отмывочных растворов входят 3 М ТМАС, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, и 0,2% SDS. Другим удобным методом получения нужной нуклеотидной последовательности является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В этом случае из ткани, экспрессирующей GDNFR, экстрагируют поли(А)+РНК или тотальную РНК. Затем с помощью фермента обратной транскриптазы получают кДНК на матрице РНК (РТПЦР). К кДНК добавляют два праймера (олигонуклеотиды), обычно комплементарные двум различным областям кДНК GDNFR, а также полимеразу, например Taq полимеразу. При этом полимераза амплифицирует область кДНК между праймерами. Если метод получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих нужный белокGDNFR, требует использования олигонуклеотидных праймеров или зондов (например, ПЦР,скрининг кДНКовых и геномных библиотек),отобранные в качестве зондов или праймеров олигонуклеотидные последовательности должны иметь адекватную длину и быть достаточно недвусмысленными, чтобы минимизировать неспецифическое связывание, которое может иметь место при скрининге библиотек или ПЦРамплификации. Действительная последовательность зондов или праймеров обычно основывается на консервативных или высоко гомологичных последовательностях или участках того же или сходного гена другого организма, подобно тому, как в настоящем изобретении использована последовательность нуклеиновой кислоты крысы. Дополнительно, зонды или праймеры могут быть полностью или частично вырожденными, т.е. представлять собой смесь зондов/ праймеров, в совокупности кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность, но использующих для этого различные кодоны. Альтернатива получению вырожденных зондов состоит во введении инозина в некоторые или во все кодоны, положение которых варьирует в зависимости от вида. Олигонуклеотидные зонды или праймеры могут быть получены методами химического синтеза ДНК, как описано выше. В объем настоящего изобретения также включены белки GDNFR, основанные на нуклеотидных последовательностях, кодирующихGDNFR, а также их мутантные или вариантные последовательности. Мутантные или вариантные последовательности включают такие последовательности, которые содержат одну или более замену, делецию или инсерцию нуклеотидов в сравнении с последовательностью дикого типа, что приводит к экспрессии вариантов аминокислотных последовательностей в сравнении с аминокислотной последовательностью дикого типа. В некоторых случаях могут встречаться 31 природные мутанты или варианты аминокислотной последовательности GDNFR, что обусловлено существованием природных аллельных вариаций. Белки GDNFR, основанные на таких встречающихся в природе мутантах или вариантах, также включены в объем настоящего изобретения. Получение синтетических мутантных последовательностей хорошо известно из уровня техники и описано, например, Wells etal., (Gene, 34:315, 1985) и Sambrook et al., supra. В некоторых случаях может возникнуть необходимость получения нуклеотидных или аминокислотных вариантов природногоGDNFR. Нуклеотидные варианты (отличающиеся по одному или нескольким нуклеотидам от GDNFR дикого типа или природногоGDNFR) могут быть получены путем сайтнаправленного мутагенеза или ПЦРамплификацией с праймерами, имеющими нужные точечные мутации (см. Sambrook et al., supra и Auzubel et al., supra, где приведены описания методов мутагенеза). Для получения подобных вариантов может быть применен химический синтез с использованием методов, описанных Engels et al., supra. Могут быть использованы и другие методы, известные квалифицированному специалисту. Предпочтительными нуклеотидными вариантами являются такие, которые содержат замены нуклеотидов, обеспечивающие предпочтение определенных кодонов в клетках-хозяевах, используемых для рекомбинантного получения GDNFR. Другими предпочтительными вариантами являются такие, которые содержат консервативные замены аминокислот (например, когда заряд или полярность боковой цепи исходной природной аминокислоты не меняется существенно при замене на другую аминокислоту) в сравнении с диким типом,и/или такие замены, которые приводят к образованию новых сайтов гликозилированая и/или фосфорилирования GDNFR, или же приводят к делеции существующих сайтов гликозилированая и/или фосфорилирования GDNFR. Векторы кДНК или геномную ДНК, кодирующую нужный белок GDNFR, встраивают в векторы для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. Могут быть использованы коммерчески доступные векторы или же вектор конструируют специально. Возможные векторы включают(без ограничения перечисленными) космиды,плазмиды или модифицированные вирусы, но векторная система должна быть совместима с выбранными клетками-хозяевами. К подходящим векторам клонирования относятся (без ограничения перечисленными) бактериофаги, в частности производные фага лямбда, плазмиды(Stratagene, La Jolla,CA. Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клетки-хозяева трансформацией, трансфекцией, инфицировани 002924 32 ем, электропорацией или другими известными методами. Например, кодирующая GDNFR нуклеиновая кислота может быть встроена в вектор клонирования, который использован для трансформации, трансфекции или инфицирования соответствующей клетки-хозяина так, что при этом образуются многочисленные копии нуклеотидной последовательности. Указанное может быть достигнуто лигированием фрагмента ДНК в вектор клонирования, имеющий комплементарные липкие концы. Если в векторе клонирования не представлены комплементарные сайты рестрикции, использованные для фрагментирования ДНК, то концы молекул ДНК могут быть энзиматически модифицированы. Может оказаться полезным встроить сайты рестрикционного эндонуклеазного расщепления в олигонуклеотидные праймеры, использованные в полимеразной цепной реакции, с тем чтобы облегчить встраивание полученной нуклеотидной последовательности в векторы. Альтернативно, любой нужный сайт может быть получен путем лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) с концами ДНК; эти лигированные линкеры могут представлять собой специфические химически синтезированные олигонуклеотиды, кодирующие последовательности, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции. При альтернативном подходе разрезанный вектор и кодирующая GDNFR нуклеотидная последовательность могут быть модифицированы добавлением гомополимерных хвостов. В конкретных случаях трансформация клеток-хозяев рекомбинантными молекулами ДНК, в которые встроены выделенный ген GDNFR, кДНК или синтезированная последовательность ДНК, позволяет получить многочисленные копии гена. Так, кодирующая GDNFR нуклеотидная последовательность может быть получена в больших количествах при выращивании трансформантов,выделении молекул рекомбинантной ДНК из трансформантов и, при необходимости, извлечении встроенного гена из выделенной рекомбинантной ДНК. Выбор и конструкция соответствующего вектора будут зависеть от следующих факторов: 1) будет ли вектор использован для амплификации ДНК или для экспрессии ДНК; 2) от размера ДНК, предназначенной для встраивания в вектор и 3) от того, какие клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, насекомых,дрожжей, грибов, растений или бактерий) будут трансформированы вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты, набор которых определяется его функцией (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и совместимостью с гипотетической клеткой-хозяином. Для экспрессии ДНК компоненты вектора могут включать(без ограничения перечисленными): сигнальную последовательность, начало репликации, один или несколько селективных или маркерных ге 33 нов, энхансерные элементы, промоторы, последовательность терминации транскрипции и т.д. Указанные компоненты могут быть получены из природных источников или синтезированы известными методами. Заявленные в соответствии с настоящим изобретением векторы содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок GDNFR,функционально связанную с одним или более контролирующим амплификацию или экспрессию элементом или со сходным функциональным элементом, способным каким-либо образом влиять на амплификацию или экспрессиюGDNFR-кодирующей нуклеотидной последовательности в выбранной клетке-хозяине. Векторы экспрессии, содержащие вставки нуклеотидных последовательностей GDNFR,могут быть идентифицированы тремя общими подходами: (а) ДНК-ДНК гибридизацией; (б) по наличию или отсутствию функции маркерного гена и (в) по экспрессии встроенных последовательностей. При первом подходе наличие чужеродной нуклеотидной последовательности,встроенной в вектор экспрессии, может быть установлено путем ДНК-ДНК гибридизации с использованием зондов, содержащих последовательности,гомологичные встроеннойGDNFR-кодирующей нуклеотидной последовательности. При втором подходе рекомбинантная система вектор/хозяин может быть идентифицирована и отобрана на основе наличия или отсутствия определенных функций маркерного гена (например, активность тимидинкиназы,устойчивость к антибиотикам, трансформированный фенотип, образование телец включения в бакуловирусной системе и т.п.), обусловленного введением чужеродной нуклеотидной последовательности в вектор. Например, если кодирующая GDNFR нуклеотидная последовательность встроена в векторе в последовательность маркерного гена, содержащие GDNFRвставку рекомбинанты могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. При третьем подходе рекомбинантные векторы экспрессии можно идентифицировать путем обнаружения чужеродного белкового продукта, экспрессируемого рекомбинантной нуклеотидной последовательностью. Такие тесты могут основываться на физических или функциональных свойствах экспрессируемого белкового продукта GDNFR, например, на связывании белка GDNFR с GDNF или с антителом,непосредственно распознающим GDNFR. Сигнальная последовательность Сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или же являться частью ДНК GDNFR, встроенной в вектор. Нативная ДНК GDNFR кодирует сигнальную последовательность на амино-концевом участке белка, которая отщепляется в ходе посттрансляционного процессинга белка с образованием зрелого белка GDNFR. В объем настоящегоGDNFR с нативной сигнальной последовательностью, так же, как и полинуклеотиды GDNFR,в которых нативная сигнальная последовательность удалена и заменена гетерологичной сигнальной последовательностью. Гетерологичная сигнальная последовательность должна быть выбрана таким образом, чтобы она могла распознаваться клеткой-хозяином, в частности, разрезаться сигнальной пептидазой. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную сигнальную последовательность GDNFR, сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью, выбранной, например, из группы, включающей лидерные последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы или стабильного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах нативную сигнальную последовательность GDNFR можно заменить лидерными последовательностями дрожжевой инвертазы, альфа фактора или кислой фосфатазы. Для экспрессии в клетках млекопитающих нативная сигнальная последовательность приемлема, хотя другие сигнальные последовательности млекопитающих могут оказаться удобнее. Начало репликации Векторы клонирования и экспрессии обычно включают в свой состав нуклеотидные последовательности, обеспечивающие вектору возможность репликации в одном или нескольких типах клеток-хозяев. В случае вектора клонирования такая последовательность позволяет вектору реплицироваться независимо от хозяйской хромосомной ДНК и включает начало репликации или автономно реплицирующуюся последовательность.Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов. Начало репликации плазмидыpBR322 приемлемо для большинства грамотрицательных бактерий, а различные другие начала репликации (например, вируса SV40, вирусов полиомы, аденовируса, VSV или BPV) пригодны для векторов, предназначенных для клонирования в клетках млекопитающих. Обычно начало репликации не является необходимым для векторов, предназначенных для экспрессии в клетках млекопитающих (например, начало репликации SV40 часто используют только потому, что оно содержит ранний промотор). Селективный ген Векторы клонирования и экспрессии обычно содержат селективный ген. Данный ген кодирует маркерный белок, необходимый для выживания или роста трансформированной клетки-хозяина при выращивании на селективной культуральной среде. Нетрансформированные вектором клетки не будут содержать селективного гена и потому не выживут в данной культуральной среде. Типичные селективные гены кодируют белки, которые а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токси 35 нам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину; б) комплементируют ауксотрофные недостаточности или в) предоставляют критически важные питательные вещества, недоступные из культуральной среды. Другие селективные гены используют для амплификации экспрессируемых генов. Амплификация представляет собой процесс, при котором гены, кодирующие нужный белок, и гены,необходимые для роста клеток, тандемно повторяются снова и снова в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примерами селективных маркеров, подходящих для клеток млекопитающих, служат дигидрофолатредуктаза (DHFR) и тимидинкиназа. Трансформированные клетки млекопитающих выращивают под селективным давлением, при котором, благодаря перенесенному вектором маркеру, выживают только истинные трансформанты. Селективное давление обеспечивается культивированием трансформированных клеток в условиях последовательно повышающейся концентрации селективного агента в среде, что приводит к амплификации селективного гена и ДНК, кодирующей GDNFR. В результате этого на амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества GDNFR. Например, клетки, трансформированные селективным геном DHFR, были впервые выделены путем культивирования всей совокупности трансформантов в культуральной среде с метотрексатом, конкурентным антагонистом DHFR. Подходящими клетками-хозяевами для DHFR дикого типа являются клетки яичника китайского хомячка, дефицитные по активности DHFRNatl. Acad. Sci. U.S.A., 77(7):4216-4220). Трансформированные клетки затем культивировали при повышающихся концентрациях метотрексата. Это приводило к синтезу множественных копий гена DHFR и, сопутствующим образом,многочисленных копий другой ДНК, присутствующей в векторе экспрессии, например ДНК,кодирующей GDNFR. Промотор Как экспрессионные векторы, так и векторы клонирования обычно содержат промотор,который распознается хозяйским организмом и функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей GDNFR. Промоторы представляет собой нетранслируемые последовательности, расположенные выше (5') стартового кодона структурного гена (обычно в пределах 100-1000 пар оснований), которые контролируют транскрипцию и трансляцию конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, в частности, кодирующей GDNFR. Промоторы обычно подразделяют на два класса: индуцибильные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибильные промоторы индуцируют усиление транскрипции ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на какие-либо 36 изменения в условиях культивирования, например температурный сдвиг или наличие или отсутствие какого-либо питательного вещества. Известно большое число промоторов, распознаваемых разнообразными клетками-хозяевами. Промотор может быть функционально связан с ДНК, кодирующей GDNFR, путем рестрикционного удаления существующего промотора из ДНК и вставкой в вектор нужной промоторной последовательности. Нативная промоторная последовательность GDNFR может быть использована для контроля амплификации и/или экспрессии ДНК GDNFR. Гетерологичный промотор, однако, является более предпочтительным, поскольку он допускает более высокий уровень транскрипции и обеспечивает более высокий уровень выхода экспрессируемого белка в сравнении с нативным промотором при том, что он совместим с выбранной клеточной системой экспрессии. К промоторам, удобным для использования в прокариотических хозяевах, относятся бета-лактамазный и лактозный промотор; промотор щелочной фосфатазы и триптофановая(tpr) промоторная система и такие гибридные промоторы, как tac промотор. Приемлемы также и другие известные бактериальные промоторы. Их нуклеотидные последовательности опубликованы, что позволяет квалифицированному специалисту лигировать их с нужными последовательностями ДНК с применением линкеров или адаптеров, необходимых для создания желаемых сайтов рестрикции. Из уровня техники известны также удобные промоторные последовательности для использования в клетках дрожжей. Дрожжевые энхансеры предпочтительно использовать вместе с дрожжевыми промоторами. Известны промоторы для использования в клеткаххозяевах млекопитающих, включая промоторы,выделенные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус(SV40). К другим удобным промоторам млекопитающих относятся гетерологичные промоторы млекопитающих, например, промоторы теплового шока и промотор актина. Для получения белков GDNFR в клетках СНО может использоваться промотор SRa (Takebe et al., Mol. Cell.Biol. 8(1):466-472, (1988. Приемлемым экспрессионным вектром может служить векторpDSRa2. Плазмидные конструкты pDSRa2, содержащие соответствующую кДНК GDNFR,могут быть получены в соответствии со способом, описанным в соавторской заявке США 501,904, поданной 29 марта 1990 (см. также заявку на Европейский патент 90305433( публикацияЕР 398 753), поданную 18 мая 1990 37 г. и WO 90/14363 (1990), упоминаемые в данном описании в качестве ссылок). К другим промоторам, которые могут представлять интерес для контроля экспрессииGDNFR, относятся (без ограничения перечисленными) промотор ранней области SV40 (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); промотор CMV; промотор, содержащий 3' длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., Cell, 22:787-797, 1980); промотор тимидинкиназы вируса герпеса (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 78:14411445, 1981); регуляторные последовательности гена металлотионеина (Blinster et al., Nature,296:39- 2, 1982); прокариотические векторы экспрессии с бета-лактамазным промотором(De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,80:21-25, 1983). Также представляют интерес следующие контролирующие экспрессию последовательности клеток животных, проявляющие тканеспецифичность и использованные при создании трансгенных животных: контролирующая область гена эластазы I, активная в ацинарных клетках поджелудочной железы(Swift et al., Cell, 38:639-646,1984; Ornitz et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 50:399-409,1986; MacDonald, Hepatology,7:425-515, 1987); контролирующая область гена инсулина, активная в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, Nature, 315:115-122, 1985); контролирующая область иммуноглобулинового гена,активная в лимфоидных клетках (Grosschedl etBiol., 7:1436-1444, 1987); контролирующая область вируса молочных желез мышей, активная в семенниках, молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., Cell, 45:485-495,1986); контролирующая область гена альбумина, активная в печени (Pinkert et al., Genes andDevel., 1:268-276, 1987); контролирующая область гена альфа-фетопротеина, активная в печени (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:16391648, 1985; Hammer et al., Science, 235:53-58,1987); контролирующая область гена альфа 1 антитрипсина, активная в печени (Kelsey et al.,Genes and Devel., 1:161-171, 1987); контролирующая область гена бета-глобина, активная в миелоидных клетках (Mogram et al., Nature,315:338-340, 1985; Kollias et al., Cell, 46:89-94,1986); контролирующая область гена основного белка миелина, активная в олигодендроцитных клетках мозга (Readhead et al., Cell, 48:703-712,1987); контролирующая область гена легкой цепи 2 миозина, активная в скелетных мышцах(Sani, Nature, 314,283-286, 1985); контролирующая область гена гонадотропин-рилизинг гормона, которая активна в гипоталамусе (Mason et 38 Энхансерный элемент В вектор может быть введена энхансерная последовательность для усиления транскрипции в клетках высших эукариот последовательностей ДНК, кодирующих GDNFR. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной 10-300 пар оснований,которые влияют на промотор, усиливая транскрипцию. Энхансеры относительно ориентированы и их активность зависит от положения. Они могут быть расположены как с 5'-конца, так и с 3'-конца транскрипционной единицы. Известны энхансерные последовательности ряда генов млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Обычно, однако, используют вирусные энхансеры. Примерами энхансерных элементов,активирующих эукариотические промоторы,служат энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансер аденовируса. При том, что энхансер может быть встроен в вектор как в 5'положении, так и 3'-положении по отношению к фрагменту ДНК GDNFR, обычно он занимает 5'положение относительно промотора. Терминация транскрипции Экспрессионные векторы, применяемые в эукариотических клетках-хозяевах (дрожжи,грибы, насекомые, растения, животные, человек или содержащие ядра клетки других многоклеточных организмов), обычно содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Подобные последовательности обычно находятся в 5'- (и иногда в 3'-) нетранслируемых областях эукариотических ДНК или кДНК. Данные области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующейGDNFR. Конструирование приемлемых векторов,содержащих один или более из перечисленных выше компонентов вместе с нужной, кодирующей GDNFR последовательностью, может быть проведено стандартными методами лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК разрезают, кроят и заново лигируют в нужном порядке для получения необходимых плазмид. Чтобы убедиться в том, что сконструирована правильная последовательность, лигирующей смесью трансформируют E.coli и трансформантов отбирают известными способами, например, по устойчивости к ампициллину или тетрациклину, как описано выше. Затем из трансформантов выделяют плазмиды, подвергают рестрикционному анализу и/или секвенированию для подтверждения наличия нужного конструкта. Могут быть использованы также и векторы, обеспечивающие транзисторную экспрессию ДНК, кодирующей GDNFR, в клетках млекопитающих. Вообще говоря, транзисторная 39 экспрессия предусматривает использование вектора экспрессии, который способен эффективно реплицироваться в клетках-хозяевах, так что в клетках аккумулируется множество копий экспрессионного вектора и затем синтезируются большие количества нужного белка, кодируемого вектором экспрессии. Каждая система транзисторной экспрессии, состоящая из соответствующего вектора экспрессии и клеток-хозяев,обеспечивает возможность удобной идентификации белков, кодируемых клонированными ДНК, а также возможность быстрого скрининга данных белков в отношении нужных биологических или физиологических свойств. Так, системы транзиторной экспрессии особенно полезны при идентификации вариантов белков. Выбор и трансформация клеток-хозяев Клетки-хозяева (например, бактериальные,клетки млекопитающих, насекомых, дрожжей или растений), трансформированные нуклеотидной последовательностью для экспрессии рекомбинантного белка GDNFR, также включены в объем настоящего изобретения. Трансформированные клетки-хозяева культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих экспрессию нуклеотидной последовательности. Выбор приемлемых клеток-хозяев, а также методов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и получения и очистки продукта хорошо известны из уровня техники. См., например, Gething and Sambrook, Nature,293:620-625 (1981) или, альтернативно, KaufmanHowley et al., Патент США No. 4,419,446. В настоящем описании приведены дополнительные методы и материалы. Трансформированные клетки-хозяева культивируют в подходящей среде и экспрессируемый белок GDNFR собирают, выделяют и очищают из культуральной среды (или из клеток, если он экспрессируется внутриклеточно) с использованием известных из уровня техники методов. Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфическими механизмами трансляции, посттрансляционного процессинга и модификации (например, гликозилирования или разрезания) белков. Для получения нужной модификации и процессинга экспрессируемого чужеродного белка должны быть выбраны соответствующие клеточные линии или хозяйские системы. Например, для получения негликозилированного белкового продукта можно выбрать бактериальную систему экспрессии. Экспрессию в дрожжах используют для получения гликозилированного продукта. Экспрессию в клетках млекопитающих применяют для получения нативного гликозилирования гетерологичного белка GDNFR. Кроме того, различные системы экспрессии вектор/хозяин могут в различной степени влиять на такие реакции процессинга, как протеолитическое разрезание. 40 К приемлемым клеткам-хозяевам для экспрессии заявленных векторов относятся клетки прокариот, дрожжей и клетки высших эукариот. Такие эукариотические микроорганизмы, как нитчатые грибы, могут быть приемлемыми хозяевами для экспрессии белков GDNFR. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, являются наиболее широко используемыми низшими эукариотами-хозяевами, однако,хорошо известны и широко доступны представители и других родов, видов и штаммов. Белок GDNFR можно экспрессировать в гликозилированной форме в каких-либо клетках-хозяевах, полученных из многоклеточного организма. Такие клетки-хозяева обеспечивают сложный процессинг и гликозилирование белка. В принципе, можно использовать культуру любых клеток высших эукариот, позвоночных и беспозвоночных, включая клетки растений и насекомых. Наращивание клеток позвоночных в культуре (культура тканей) является хорошо известным подходом. Примерами полезных клеточных линий млекопитающих могут служить(но не ограничиваются перечисленными) клетки почки обезьяны линии CV1, трансформированные SV40 (COS-7), линия клеток почки эмбриона человека (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре), клетки почки хомячка и клетки яичника китайского хомячка. К другим приемлемым линиям клеток млекопитающих относятсяHeLa, мышиные клетки L-929, линии клеток 3 Т 3, полученные из мышей Swiss, Balb-c илиNIH, а также линии клеток хомячка ВНК или НаК. К приемлемым клеткам-хозяевам относятся также и клетки прокариот. К прокариотическим клеткам-хозяевам относятся (но не ограничиваются перечисленными) бактериальные клетки, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы (например, E.coli,Bacilli, такие как В.subtilis; Pseudomonas, такие как P.aeruginosa, Salmonella typhymurium илиSerratia marcescans). Например, различные штаммы E.coli (HB101, DH5a, DH10 и МС 1061) хорошо известны в биотехнологии как клеткихозяева. Различные штаммы Streptomyces spp. также могут быть использованы. Предпочтительными клетками-хозяевами для получения белков GDNFR являются бактериальные клетки(например, Escherichia coli) и клетки млекопитающих (такие, как клетки яичника китайского хомячка, клетки COS и т.д.). Клетки-хозяева могут быть трансфицированы (или трансформированы) описанными выше векторами экспрессии или клонирования. Клетки культивируют в подходящей питательной среде. Среда может быть соответствующим образом модифицирована, чтобы обеспечить индукцию промоторов, селекцию трансформантов или амплификацию генов, кодирующих 41 нужные последовательности. Трансфекцию и трансформацию проводят стандартными методами, хорошо известными квалифицированному специалисту, выбор которых диктуется типом клеток-хозяев. Например, для клеток млекопитающих, не имеющих клеточной стенки, может быть применена методика кальций-фосфатной преципитации. Можно также использовать электропорацию, микроинъекцию и другие известные методы. Культивирование клеток-хозяев Трансформированные клетки, используемые для получения заявленных в настоящем изобретении белков GDNFR, культивируют в приемлемой среде. При необходимости в состав среды могут вводиться гормоны и/или другие ростовые факторы (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный ростовой фактор),соли (такие как хлорид натрия, соли кальция,магния и фосфаты), буферы (такие как HEPES),нуклеозиды (такие как аденозин и тимидин),антибиотики (такие как гентамицин), микроэлементы (неорганические соединения, конечная концентрация которых не превышает микромолей), а также глюкоза или другой источник энергии. Могут также вводиться и другие добавки в соответствующих концентрациях, что очевидно для квалифицированного специалиста. Приемлемые для конкретных клеток-хозяев культуральные условия, такие как температура,рН и т.д., также хорошо известны квалифицированному специалисту. Полученный белок GDNFR может быть выделен и очищен с использованием стандартных методов, включающих хроматографию (например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и хроматографию исключения по размеру), центрифугирование,дифференциальное растворение или любые другие стандартные методы очистки белков. В частности, белок GDNFR может быть выделен на аффинной колонке, содержащей GDNF или анти-GDNFR антитела, привязанные к твердому субстрату. Гомологичная рекомбинация Кроме того, имеется возможность получения белков GDNFR гомологичной рекомбинацией или рекомбинантными методами с использованием контролирующих элементов, введенных в клетки уже содержащие ДНК, кодирующую GDNFR. Например, методы гомологичной рекомбинации можно использовать для модифицирования клетки, содержащей в норме транскрипционно молчащий ген GDNFR или слабо экспрессируемый ген, и таким образом получить клетку, которая экспрессируетGDNFR. Гомологичная рекомбинация представляет собой метод, первоначально разработанный для таргетинга (нацеливания) генов для индукции или коррекции мутаций в транскрипционно-активных генах (Kucherlapati, Prog. In 42 Первоначальный подход был разработан как метод введения специфических мутаций в конкретные области генома млекопитающих (Thomas et al., (1986), Cell, 44:419-428; Thomas andet al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,85:8583-8587) или для коррекции специфических мутаций в дефектных генах (Doetschman etal., (1987), Nature, 330: 576-578). Примерами могут служить методы, описанные в патенте США 5,272,071 (ЕР 91 90 3051; публикация ЕР 505 500; PCT/US 90/07642, международная заявкаWO 91/09955), упоминаемые в настоящем описании в качестве ссылок). Посредством гомологичной рекомбинации,последовательность ДНК, которая должна оказаться встроенной в геном, может быть направлена в специфическую область представляющего интерес гена. Достигается это прикреплением ее к нацеливающей ДНК. Нацеливающая ДНК - это ДНК, комплементарная (гомологичная) некоторой области геномной ДНК. Небольшие фрагменты нацеливающей ДНК, комплементарные конкретной области генома, входят в контакт с родительской нитью ДНК во время процесса репликации ДНК. Общим свойством перенесенной в клетку ДНК является способность гибридизоваться и потому рекомбинировать с другими фрагментами эндогенной ДНК через области общей гомологии. Если такая комплементарная нить прикреплена к олигонуклеотиду, содержащему мутацию или другую последовательность ДНК, она также встраивается во вновь синтезируемую нить в результате рекомбинации. В результате функционирования системы проверки считывания появляется вероятность того, что новая последовательность ДНК будет служить матрицей. Таким образом,перенесенная ДНК оказывается встроенной в геном. Если известна последовательность конкретного гена, в частности, нуклеотидная последовательность, пре-про-последовательность или последовательность, контролирующая экспрессию GDNFR, можно синтезировать (или получить другим способом, например соответствующей рестрикцией нативной ДНК в специфических сайтах, ограничивающих нужную область), фрагмент ДНК, комплементарный выбранной области гена. Такой фрагмент служит нацеливающей последовательностью при введении в клетку и будет гибридизоваться с гомологичной ему областью генома. Если подобная гибридизация происходит при репликации ДНК, то такой фрагмент ДНК и любые прикрепленные к нему дополнительные последовательности будут работать как фрагменты Оказаки и будут встроены во вновь синтезируемую дочернюю нить ДНК. Прикрепленными к фрагментам нацеливающей ДНК оказываются такие участки ДНК,которые могут влиять на экспрессию белкаGDNFR. Например, промотор/энхансер, супрессор или экзогенный элемент, модулирующий транскрипцию, встраиваются в геном клеткихозяина в такой ориентации и близости, которые достаточны для влияния на транскрипцию ДНК, кодирующей нужный белок GDNFR. Контролирующие элементы не кодируют GDNFR,но осуществляют контроль над частью ДНК,присутствующей в хозяйском геноме. Так, экспрессия белков GDNFR может быть достигнута не трансфекцией собственно ДНК, кодирующей ген GDNFR, а использованием нацеливающей ДНК (содержащей области гомологии с представляющим интерес эндогенным геном), соединенной с регуляторными сегментами ДНК,которые обеспечивают эндогенные последовательности распознаваемыми сигналами транскрипции белка GDNFR. Варианты GDNFR В контексте настоящего описания под термином аналоги GDNFR понимаются полипептиды, в которых были делегированы (делегированные варианты), вставлены (варианты с дополнениями) или заменены (варианты с заменами) аминокислоты в аминокислотной последовательности природных полипептидовGDNFR, включая приведенные на фиг. 2 и 4(SEQ ID NOs: 2 и 4). Такие варианты получают введением соответствующих нуклеотидных замен в ДНК, кодирующую полипептид, или химическим синтезом нужного полипептида invitro. Как понятно квалифицированному специалисту, в аминокислотной последовательности зрелого GDNFR человека могут быть произведены многие комбинации делеций, вставок и замен с тем, что конечная молекула будет обладать активностью GDNFR. Основываясь на приведенном описании аминокислотных последовательностей GDNFR,можно сконструировать и получить различные нуклеотидные последовательности, применимые для рекомбинантной (например, микробной) экспрессии полипептидов с первичными конформациями, отличающимися от приведенных на фигурах в терминах идентичности или локализации одного или более остатков. Способы мутагенеза для замены, вставки или делеции одного или более выбранных аминокислотных остатков, кодируемых нуклеотидными последовательностями, приведенными на фиг. 2 и 4,хорошо известны из уровня техники (см., например, патент США 4,518,584, упоминаемый здесь в качестве ссылки). При конструировании вариантов с заменами имеется две главных переменных: локализация сайта мутации и природа мутации. При конструировании вариантов GDNFR, содержащих замены, выбор сайта мутации и природы мутации будут зависеть от модифицируемых характеристик GDNFR. Сайты мутации могут быть модифицированы индивидуально или серийно, например, (1) первоначальной модификацией консервативных 44 аминокислот с последующей более радикальной заменой в зависимости от полученных результатов, (2) делецией аминокислотного остаткамишени или (3) введением аминокислотных остатков по соседству с локализованным сайтом. Предпочтительны консервативные замены от 1 до 30 последовательных аминокислот. При помощи протеолитических ферментов могут быть также получены N-терминальные и Стерминальные делеционные варианты белкаGDNFR. Для делеционных вариантов GDNFR характерны делеции размером от 1 до 30 последовательных остатков, более типично от 1 до 10 последовательных остатков и наиболее типично от 1 до 5 последовательных остатков. ВозможныN-концевые и С-концевые внутренние делеции. Делеции могут быть произведены в областях слабой гомологии с последовательностямиGDNFR не человека с целью модификации активности GDNFR. Делеции в областях существенной гомологии с последовательностями GDNFR не человека, по-видимому, могут оказаться более существенны для значительной модификации биологической активности GDNFR. Число последовательных делеций обычно определяется таким образом, чтобы сохранить четвертичную структуру белкового продукта GDNFR в задействованном домене, например, цистеиновые сшивки. Примеры делеционных вариантов включают усеченный белковый продукт GDNFR, утративший N-концевые или С-концевые аминокислотные остатки. Например, можно получить растворимый рецептор путем элиминации области пептида, участвующей в гликозилфосфатидилинозитольном (GPI) заякоривании рецептора GDNFR в цитоплазматической мембране. В случае вариантов GDNFR, содержащих дополнения, каждый полипептид может включать амино- или карбокситерминальные добавки, длина которых может составлять от одного остатка до ста и более остатков, а также внутренние или медиальные вставки одного или многих аминокислотных остатков. Заявленные полипептиды могут включать инициирующий метиониновый остаток (в положении -1 в соответствии с первым аминокислотным остатком нужного полипептида). Размер внутренних вставок может колебаться в пределах от 1 до 10 аминокислотных остатков, более типично, от 1 до 5 аминокислотных остатков и, наиболее типично, от 1 до 3 аминокислотных остатков. Примеры N-концевых вариантов GDNFR с дополнениями включают GDNFR, содержащие гетерологичную N-концевую сигнальную последовательность для облегчения секреции зрелого GDNFR из рекомбинантных клеток-хозяев и, таким образом, облегчения сбора клеток и увеличения биодоступности. Такие сигнальные последовательности в целом могут быть полу 45 чены (гомологичные последовательности) из клеток-хозяев соответствующих видов. Дополнения могут также включать аминокислотные последовательности, полученные из последовательностей других нейротропных факторов. Например, белок слияния GDNF и GDNFR может быть получен при участии связывающей последовательности или без нее с образованием одномолекулярной целостной терапевтической единицы. Варианты GDNFR с заменами представляют собой молекулы GDNFR, в которых один или более аминокислотных остатков удалены и замещены другими остатками. Такие варианты включают аллельные варианты, которые характеризуются природными изменениями нуклеотидной последовательности в популяции вида,что может приводить или не приводить к изменениям в аминокислотной последовательности. В другом случае такие варианты могут включать замещение одного или последовательных аминокислотных остатков в одном или более участках. Специфические мутации в аминокислотной последовательности GDNFR могут приводить к модификации сайта гликозилирования(например, серинового, треонинового или аспарагинового). Отсутствие гликозилирования или частичное гликозилирование является результатом замены или делеции аминокислот в любом аспарагин-связанном сайте гликозилирования или в любом сайте молекулы, модифицированном добавлением O-связанного углеводорода. Аспарагин-связанный сайт гликозилирования представляет собой трипептидную последовательность, которая специфически распознается соответствующими клеточными ферментами гликозилирования. Эти трипептидные последовательности имеют структуру Asn-Xaa-Thr илиAsn-Xaa-Ser, где Хаа может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Различные аминокислотные замены или делеции одной или обоих аминокислот в первом или третьем положении сайта гликозилирования (и/или аминокислотные делеции во втором положении) приводят к отсутствию гликозилирования модифицированной трипептидной последовательности. Так, экспрессия соответствующим образом измененных нуклеотидных последовательностей приводит к получению вариантов, негликозилированных по данному сайту. Альтернативно, аминокислотная последовательность GDNFR может быть модифицирована добавлением сайтов гликозилирования. Один из методов идентификации аминокислотных остатков GDNFR или областей для мутагенеза назван аланин-сканирующим мутагенезом и описан Cunningham и Wells (Science,244:1081-1085, 1989). При данном подходе идентифицируют аминокислотный остаток или группу целевых остатков (например, такие заряженные остатки, как Arg, Asp, His, Lys, Glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочти 002924 46 тельно аланином или полиаланином) для изменения взаимодействия аминокислот с окружающей водной средой внутри или вне клетки. Такие остатки, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, затем вычищают путем введения дополнительных или альтернативных остатков в места замен. Таким образом,сайт для введения модификации в аминокислотную последовательность оказывается предетерминированным и для оптимизации осуществления мутации в данном сайте проводят сканирование аланина или случайный мутагенез, а полученные варианты GDNFR скринируют в отношении оптимального сочетания нужной активности и степени этой активности. К сайтам, представляющим особый интерес для заместительного мутагенеза, относятся те сайты, в которых обнаруживаемые в GDNFR аминокислоты существенно отличаются по наличию боковых цепей, заряду и/или гидрофобности от GDNFR других биологических видов. Также представляют интерес сайты, в которых конкретные остатки GDNFR идентичны таковым в GDNFR-подобных белках. Эти положения обычно важны для сохранения биологической активности белка. Исходно, данные сайты модифицируют путем замен, вводимых относительно консервативным способом. Такие консервативные замены приведены в табл. 2 под заголовком Предпочтительные замены. Если подобные замены приводят к изменению биологической активности, то далее проводят более существенные замены (Возможные замены). Могут быть также произведены и другие добавления или делеции с последующим скринингом активности полученных полипептидов. Таблица 2. Замены аминокислот Возможные замены Исходный Предпочтиостаток тельные замены Аlа (А) 47 Консервативные модификации аминокислотной последовательности (и соответствующие модификации кодирующей ее нуклеотидной последовательности) GDNFR могут привести к образованию белков с аналогичными природному GDNFR функциональными и химическими характеристиками. Наоборот, существенные модификации функциональных и/или химических свойств GDNFR могут быть достигнуты отбором замен, которые значительно различаются по эффекту на поддержание (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, сохранение плоской или спиральной структуры, (б) заряда или гидрофобности белка в сайте замены или (в) числа боковых цепей. Встречающиеся в пророде остатки подразделяют на несколько групп на основе общих свойств боковой цепи: 1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val,Leu, Ile; 2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser,Thr; 3) кислые: Asp, Glu; 4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) остатки, влияющие на ориентацию цепи:Gly, Pro и 6) ароматические: Тrp, Туr, Phe. К неконсервативным заменам могут относиться замены одного из членов группы на другой. Такие заменяющие остатки могут вводиться в области GDNFR человека, гомологичные или не гомологичные белкам GDNFR нечеловеческого происхождения или в негомологичные области молекулы. Таким образом, к белкам GDNFR, их аналогам или производным относятся (без ограничения перечисленными) те биологически активные молекулы, аминокислотная последовательность которых представлена полной или частичной аминокислотной последовательностью,приведенной на фиг. 2 и 4 (SEQ ID Nos. 2 и 4). Белки будут включать также измененные последовательности, в которых биологически эквивалентные аминокислотные остатки заменены остатками, приводящими к молчащим заменам. Например, один или несколько аминокислотных остатков последовательности могут быть заменены другой аминокислотой сходной полярности, которая действует как функциональный эквивалент, приводя к молчащим изменениям. Заменяющие аминокислоты могут быть выбраны среди других членов класса, к которому принадлежит заменяемая аминокислота. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. К полярным нейтральным аминокислотам относятся глицин, серин, треонин,цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. К положительно заряженным аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин. К отрицательно заряженным аминокислотам относятся аспа 002924 48 рагиновая кислота и глутаминовая кислота. Считается также, что белки GDNFR, их аналоги,фрагменты или производные могут быть различным образом модифицированы во время или после трансляции, например, фосфорилированием, гилкозилированием, поперечным сшиванием, ацилированием, протеолитическим разрезанием, связыванием с молекулой антитела,мембранной молекулой или другим лигандом. В. Производные GDNFR Квалифицированным специалистом, с учетом приведенного описания, могут быть получены химически модифицированные производные GDNFR и аналогов GDNFR. К приемлемым для дериватизации веществам относятся водорастворимые полимеры. Водорастворимые полимеры предпочтительны, поскольку связанный с ними белок не будет преципитировать в водной среде, в частности в физиологической среде организма. Предпочтительно, полимер должен быть фармацевтически приемлемым для приготовления терапевтического продукта или композиции. Квалифицированный специалист сможет выбрать нужный полимер с учетом изложенных соображений и в зависимости от того, будет ли конъюгат полимер/белок применяться терапевтически и, если будет, с учетом желаемой дозы,времени циркуляции и устойчивости к протеолизу и других соображений. В эффективности дериватизации убеждаются, вводя дериват соответствующим образом (например, осмотическим насосом или, более предпочтительно, инъекцией или вливанием, или оральным, пульмонарным или другим способом) с последующей оценкой эффективности. К удобным водорастворимым полимерам относятся (но не ограничиваются перечисленными) полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт,поливинилпирролидон,поли-1,3-диоксолан,поли-1.3.6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (в виде гомополимеров или случайных сополимеров), декстран или поли(n-винилпирролидон),полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропилен оксида и этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол), поливиниловый спирт их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества для производства из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любой молекулярный вес и быть разветвленным или неразветвленным. Для полиэтиленгликоля предпочтительный молекулярный вес составляет около 2 100 кДа (понятие около означает, что в препарате полиэтиленгликоля некоторые молекулы будут весить больше, а некоторые меньше в сравнении с указанным молекулярным весом). В зависимости от желательного терапевтического 49 профиля (например, продолжительности контролируемого высвобождения; возможных эффектов на биологическую активность; простоты обращения; степени (или отсутствия ее) антигенности и других известных эффектов водорастворимого полимера на терапевтический белок) могут применяться полимеры с другим молекулярным весом. Количество прикрепляемых молекул полимера может варьировать и квалифицированный специалист может убедиться в их влиянии на функцию белка. Возможна монодериватизация или ди-, три-, тетра- или какая-либо другая комбинированная дериватизация с той же самой или отличной химической группой (например,при использовании таких полимеров, как полиэтиленгликоли с различным молекулярным весом). Отношение молекул полимера к молекулам белка (или пептида) тоже может варьировать, так же, как и их концентрации в реакционной смеси. В целом, оптимальное соотношение(с точки зрения эффективности реакции, когда не имеется избытка непрореагировавших белка или полимера) определяется такими факторами,как желаемая степень дериватизации (т.е. моно-,ди-, три- и т.д.), молекулярным весом выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или нет, а также условиями реакции. Молекулы полиэтиленгликоля (или другие химические группы) должны прикрепляться к белку с учетом возможного влияния на функциональные и антигенные домены белка. Разработан ряд методов связывания, доступных квалифицированному специалисту. См., например,ЕР 0 401 384, упоминаемую в настоящем описании в качестве ссылки (связывание ПЭГа с GCSF), см. также Маliс et al., Exp.Hematol.,20:1028-1035,1992 (пэгирование GM-CSF с использованием трезил хлорида). Так, например,полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан с белком через реактивную группу, например, свободную амино- или карбоксильную группу. Реактивными считаются те группы, с которыми может связаться активированная молекула полиэтиленгликоля. К аминокислотным остаткам со свободной аминогруппой относятся остатки лизина и N-концевые аминокислотные остатки. К аминокислотным остаткам со свободной карбоксильной группой относятся остатки аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С-концевые аминокислотные остатки. Для прикрепления молекул полиэтиленгликоля в качестве реактивных групп могут быть использованы сульфгидрильные группы. Для терапевтических целей предпочтительней прикрепление к аминогруппе, такой как аминогруппа лизина или N-концевая аминогруппа. Если желательно сохранить возможность связывания с рецептором, надо избегать прикрепления к остаткам, важным для связывания с рецептором. 50 При желании может быть получен химически модифицированный по N-концу белок. Используя полиэтиленгликоль для получения заявленных композиций, можно выбрать водорастворимый полимер соответствующего молекулярного веса, разветвленности и т.д., определить соотношение водорастворимого полимера и белка (или пептида) в реакционной смеси, тип осуществляемой реакции и метод выделения определенного химически модифицированного по N-концу белка. Способ получения препарата химически модифицированного по N-концу белка (например, отделение, если необходимо,данной формы от других монодериватизированных форм) может представлять собой очистку химически модифицированного по N-концу белка из популяции молекул химически модифицированного белка. Избирательная N-концевая химическая модификация может быть проведена путем восстановительного алкилирования, при котором используется различающаяся реактивность различных типов первичных аминогрупп (лизина против N-концевых), доступных для дериватизации в конкретном белке. В соответствующих условиях реакции достижима существенная селективная дериватизация белка по N-концу с полимером, содержащим карбонильную группу. Например, можно избирательно прикрепить водорастворимый полимер к Nконцу белка проведением реакции при таком значении рН, которое позволяет использовать преимущество в различии между рКа-аминогруппы остатков лизина и -аминогруппы Nконцевого остатка белка. При такой избирательной дериватизации прикрепление водорастворимого полимера к белку контролируемо: конъюгация с полимером происходит преимущественно по N-концу белка без существенной модификации других реактивных групп, таких,как аминогруппы боковых цепей лизина. При использовании восстановительного алкилирования водорастворимый полимер должен относиться к полимерам, описанным выше, и иметь один реактивный альдегид для связывания с белком. Может быть использован пропиональдегид полиэтиленгликоля, содержащий один реактивный альдегид. Настоящим изобретением предусмотрено применение производных GDNFR, экспрессируемого в клетках прокариот, или его вариантов, соединенных, по меньшей мере, с одной молекулой полиэтиленгликоля, а также применение GDNFR и его вариантов, соединенных с одной или несколькими молекулами полиэтиленгликоля посредством ацильной или алкильной связи. Пэгирование может быть проведено любой реакцией пэгирования, известной из уровня техники. См. например, Focus on Growth Factors, 3 51 описании работы, относящиеся к пэгированию. Пэгирование можно осуществить за счет реакции ацилирования или реакцией алкилирования с реактивной молекулой полиэтиленгликоля(или аналогичного реактивного водорастворимого полимера). Пэгирование ацилированием обычно предусматривает реагирование активного эфирного производного полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белком GDNFR или его вариантом. Любая известная или открытая впоследствии реактивная молекула ПЭГ может быть использована для проведения пэгирования белка GDNFR или его варианта. Предпочтительным активированным эфиром ПЭГ является ПЭГ, этерифицированныйN-гидроксисукцинимидом (NHS). Под термином ацилирование понимаются все без ограничений следующие виды связей между терапевтическим белком и таким водорастворимым полимером, как ПЭГ: амидная, карбаматная,уретановая и им подобные. См. BioconjugateChem., 5: 133-140, 1994. Условия реакции можно выбрать из известных из уровня техники пэгирования или разработать независимо, но в любом случае они должны исключать такие параметры температуры, рН и растворители, которые могли бы инактивировать модифицируемый белок GDNFR или его вариант. Пэгирование ацилированием обычно приводит к образованию полипэгированного белка или варианта GDNFR. Предпочтительно, связующим звеном будет являться амид. Также предпочтительно, чтобы полученный продукт был по существу (т.е. 95%) моно-, ди- или трипэгированным. Однако могут образовываться отдельные формы с более высокой степенью пэгирования, что зависит от конкретных условий реакции. При желании из смеси могут быть выделены более очищенные пэгированные формы при помощи стандартных методов очистки,к которым относятся, среди прочих, диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография и электрофорез. Пэгирование алкилированием обычно предусматривает реагирование терминального альдегида производного ПЭГа с белком или вариантом GDNFR в присутствии восстанавливающего агента. Пэгирование алкилированием может также приводить к получению полипэгированного белка. Можно подобрать условия реакции для предпочтительного пэгирования только-аминогрупп на N-конце белка (т.е. получения монопэгированного белка). При монопэгировании и полипэгировании группы ПЭГа предпочтительно связываются с белком через -СН 2-NНгруппы. С учетом роли -СH2-группы такой тип связи обозначается как алкильная связь. Дериватизация посредством восстановительного алкилирования с получением монопэгированного продукта использует дифференциальную реактивность различных типов первич 002924 52 ных аминогрупп (лизина против N-концевых),доступных для дериватизации в конкретном белке. Реакцию проводят при таком значении рН, которое позволяет использовать преимущество в различии между рКа аминогрупп остатков лизина и аминогруппы N-терминального остатка белка. При такой избирательной дериватизации прикрепление водорастворимого полимера, содержащего такие реактивные группы,как альдегидные, к белку, контролируемо: конъюгация с полимером происходит преимущественно по N-концу белка без существенной модификации других реактивных групп, таких,как аминогруппы боковых цепей лизина. Другим важным аспектом настоящего изобретения является использование по существу гомогенного препарата конъюгата монополимер/белок(или вариант) GDNFR, к которому молекулы полимера прикреплены, по существу, (т.е.95%) в одной локализации. Конкретно, если используется полиэтиленгликоль, в объем настоящего изобретения включено применение пэгированного белка GDNFR или его варианта,в котором отсутствуют возможно антигенные соединительные группы, а молекула полиэтиленгликоля непосредственно соединена с белком GDNFR или его вариантом. Так, к заявленным в настоящем изобретении белковым продуктам GDNFR относятся также и пэгированные белки или вариантыGDNFR, в которых группы ПЭГа присоединены через ацильные или алкильные группы. Как обсуждается выше, эти продукты могут быть монопэгированными или полипэгированными (например, содержать 2-6, а предпочтительно 2-5 групп ПЭГа). Группы ПЭГа обычно присоединяются к белку через а- или е-аминогруппы аминокислот, но считается также, что группы ПЭГа могут быть присоединены к любой аминогруппе белка, которая достаточно реактивна для присоединения группы ПЭГа в приемлемых условиях реакции. Молекулы полимера, используемые как для ацилирования, так и для алкилирования,могут быть выбраны из описанных выше водорастворимых полимеров. Выбранный полимер должен быть модифицирован с тем, чтобы иметь одну реактивную группу, такую как активный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования, так, чтобы степень полимеризации могла контролироваться в соответствии с заявленными методами. Примером реактивного альдегида ПЭГа служит пропиональдегид полиэтиленгликоля, который стабилен в воде,или его моно-(C1-C10)алкокси- или арилоксипроизводные (см. патент США 5,252,714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Для реакции ацилирования выбранный полимер (полимеры) должен иметь одну реактивную эфирную группу. Для восстановительного алкилирования, как в настоящем 53 случае, выбранный полимер (полимеры) должен иметь одну реактивную альдегидную группу. Обычно водорастворимый полимер не выбирают из встречающихся в природе гликозильных остатков, поскольку такого рода дериватизация гораздо лучше осуществима в системах рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих. Полимер может иметь любой молекулярный вес и быть разветвленным или неразветвленным. Примером используемого водорастворимого полимера служит полиэтиленгликоль. Этим понятием объединяются любые формы ПЭГа, которые были использованы для дериватизации других белков, такие как моно-(C1-C10) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль. Вообще говоря, химическая дериватизация может быть проведена в любых приемлемых условиях, применимых для реакции биологически активного вещества с активированной молекулой полимера. Методы получения пэгированного белка GDNFR обычно предусматривают два этапа: (а) реакцию белкового продуктаGDNFR с полиэтиленгликолем (например, реактивным эфиром или альдегидным производным ПЭГа) в условиях, при которых белок оказывается соединенным с одной или более группами ПЭГа, и (б) выделение продукта (продуктов) реакции. Вообще говоря, оптимальные условия реакции ацилирования зависят в каждом конкретном случае от известных параметров и желаемого результата. Например, чем выше отношение ПЭГ:белок, тем выше процент полипэгированного продукта. Восстановительное алкилирование приводит к образованию по существу гомогенной популяции продукта монополимер/белок GDNFR и обычно состоит из следующих этапов: (а) реакции белка GDNFR или его варианта с реактивной молекулой ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования при значении рН, приемлемом для избирательной модификации ааминогрупы на аминоконце данного белкаGDNFR или его варианта, и (б) выделения продукта (продуктов) реакции. Для получения существенно гомогенной популяции монополимер/белок (или вариант)GDNFR условия реакции восстановительного алкилирования должны быть подобраны так,чтобы обеспечивать избирательное прикрепление водорастворимого полимера к N-концу белка GDNFR или его варианта. При этих условиях реакции обычно используется преимущество в различии между рКа аминогрупп остатков лизина и -аминогруппы N-концевого остатка белка(рКа представляет собой такое значение, при котором 50% аминогрупп протонировано, а 50%- нет). Значение рН также влияет на используемое отношение полимер:белок. Вообще, если значение рН ниже, требуется больший избыток полимера по сравнению с белком (т.е. чем меньше доступно N-концевых реактивных 002924 54 аминогрупп, тем больше полимера требуется для достижения оптимальных условий). Если значение рН выше, отношение полимер:белок также должно возрастать (т.е. доступно больше реактивных групп, соответственно требуется меньше молекул полимера). Для целей настоящего изобретения значение рН обычно находится в пределах 3-9, предпочтительно 3-6. Другим важным фактором является молекулярный вес полимера. В целом, чем выше молекулярный вес полимера, тем меньше молекул полимера может быть прикреплено к белку. Аналогично, при оптимизации этих параметров необходимо учитывать разветвленность полимера. Обычно, чем выше молекулярный вес полимера (или чем более он разветвлен), тем выше отношение полимер:белок. Вообще, для рассматривемых здесь реакций пэгирования предпочтительный средний молекулярный вес полимера составляет от 2 до 100 кДа. Предпочтительный средний молекулярный вес полимера составляет от 5 до 50 кДа, а особенно предпочтительный - от 12 до 25 кДа. Отношение водорастворимого полимера к белку GDNFR (или варианту) обычно колеблется в пределах от 1:1 до 100:1, предпочтительно (для полипэгирования) от 1:1 до 1:20 и (для монопэгирования) от 1:1 до 5:1. При использовании приведенных выше условий восстановительное алкилирование обеспечивает селективное прикрепление полимера к любому белку GDNFR или его варианту, имеющему -аминогруппу на аминоконце, и приводит к получению, по существу, гомогенного препарата конъюгата монополимер/белок (или вариант) GDNFR. Термин конъюгат монополимер/белок (или вариант) GDNFR используется для обозначения композиции, представленной одной молекулой полимера, прикрепленной к молекуле белка GDNFR или варианта белка(или вариант GDNFR) обычно включает молекулу полимера, локализованную на N-конце, а не боковых аминогруппах лизина. Препарат обычно состоит более чем на 90% из конъюгата монополимер/белок (или вариант) GDNFR,предпочтительнее, более чем на 95% из конъюгата монополимер/ белок (или вариант) GDNFR,при этом оставшаяся часть молекул в реакцию не вступает (т.е. белок без полимерных групп). Считается также, что белковый продуктGDNFR, используемый для получения пэгированных молекул, может представлять собой слитый белок или связанные молекулы GDNFR и GDNFR. Для восстановительного алкилирования восстанавливающий агент должен быть стабилен в водном растворе и предпочтительно восстанавливать только Шиффово основание, образовавшееся на начальных этапах восстановительного алкилирования. Подходящие восстанавливающие агенты могут быть выбраны из 55 группы, включающей борогидрид натрия, цианоборогидрид натрия, диметиламин боран, триметиламин боран и пиридин боран. Особенно удобным восстанавливающим агентом является цианоборогидрид. Другие параметры реакции,такие как растворитель, время реакции, температуры и способ очистки продуктов, определяют конкретно для каждого случая, основываясь на опубликованной информации по дериватизации белков водорастворимыми полимерами (см. процитированные публикации). С. Фармацевтические композиции белкового продукта GDNFR Фармацевтические композиции белкового продукта GDNFR обычно включают терапевтически или профилактически эффективные количества белкового продукта GDNFR в смеси с одним или более фармацевтически и физиологически приемлемым композиционным материалом, выбор которого (которых) определяется способом введения. К таким удобным композиционным материалам относятся (без ограничения перечисленными) антиоксиданты, консерванты, оцветители, отдушки и разбавляющие агенты, эмульгирующие агенты, суспендирующие агенты, растворители, наполнители, буферы, векторы доставки, разбавители, растворители и/или фармацевтические адъюванты. Например, приемлемыми носителями являются вода для инъекций, физиологический раствор или искусственная спинно-мозговая жидкость с возможными добавками других материалов,обычных для предназначенных для парентерального введения составов. Нейтральный буферный раствор или раствор, содержащий сывороточный альбумин, являются другими примерами носителей. Термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель обозначает композиционный материал (материалы), пригодный(ые) для осуществления или улучшения доставки белкового продукта GDNFR в виде фармацевтической композиции. Первичный растворитель в носителе может быть по своей природе как водным, так и неводным. Кроме того, носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые материалы для модификации или поддержания рН, вещества для поддержания осмолярности, вещества для поддержания вязкости, прозрачности,цвета, стерильности, стабильности, скорости растворения или запаха фармацевтической формы. Аналогично, носитель может содержать дополнительные материалы для модификации или поддержания скорости высвобождения белкового продукта GDNFR или для повышения адсорбции и проникновения белкового продуктаGDNFR через гемато-энцефалический барьер. После приготовления фармацевтические композиции могут храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого или дегидратированного или лио 002924 56 филизированного порошка. Такие композиции могут храниться в виде готовых к применению форм или форм, требующих растворения перед введением (например, лиофилизированных). Оптимальный фармацевтический состав для данного белка может быть определен квалифицированным специалистом в зависимости от способа введения и желаемой дозировки (см.,например, Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), стр.1435-1712 ( работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобожденияin vivo и скорость клиренса in vivo заявленных белков и их производных. В объем изобретения включены также такие эффективные формы, как (1) составы медленного высвобождения, (2) ингаляционные аэрозоли или (3) составы, активные при оральном применении. Могут быть получены фармацевтические композиции белкового продуктаGDNFR для парентерального введения. Такие терапевтические композиции для парентерального введения обычно представлены в виде свободных от пирогенов парентерально-приемлемых водных растворов, содержащих белковый продукт GDNFR в фармацевтически приемлемом носителе. Одним из предпочтительных растворителей является физиологический раствор. В состав фармацевтических композиций белкового продукта GDNFR могут входить конкретные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и.д. или же липосомы. Применяется также гиалуроновая кислота, которая может способствовать более продолжительному сохранению препарата в циркуляции. Особенно удобным растворителем для парентеральных инъекций является стерильная дистиллированная вода, в которую белковый продукт GDNFR введен в виде стерильного изотонического раствора, соответствующим образом подготовленного. Другие фармацевтические композиций могут предусматривать сочетание белкового продукта GDNFR с таким агентом,как инъецируемые микросферы или липосомы,обеспечивающие медленное или поддерживаемое высвобождение белка, введенного депоинъекцией. Другой приемлемый способ введения белкового продукта GDNFR предусматривает применение имплантируемых устройств доставки препаратов, содержащих белковый продукт GDNFR. Заявленные в настоящем изобретении препараты могут включать и другие компоненты,например парентерально-приемлемые консерванты, агенты для создания тоничности, сорастворители, увлажняющие агенты, комплексирующие агенты, буферные агенты, антимикробные вещества, антиоксиданты и сурфактанты,хорошо известные из уровня техники. Напри 57 мер, к агентам, обеспечивающим тоничность,относятся галиды щелочных металлов (предпочтительно хлорид натрия или калия), маннитол, сорбитол и т.д. К приемлемым консервантам относятся (без ограничения перечисленными) бензалкониум хлорид, тимеросал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен,хлоргексидин, сорбитовая кислота и т.д. В качестве консерванта может также использоваться перекись водорода. Примерами приемлемых сорастворителей служат глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Примерами приемлемых комплексирующих агентов служат кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин. К приемлемым сурфактантам или увлажняющим агентам относятся эфиры сорбитана,такие полисорбаты, как полисорбат 80, трометамин, децитин, холестерин, тилоксапал и т.д. В качестве буферов могут использоваться такие обычные буферы, как боратный, цитратный,фосфатный, бикарбонатный или Tris-HCl. Композиционные компоненты используют в концентрациях, которые приемлемы для области и способа введения. Например, буферы используют для поддержания физиологического(или слегка более низкого) значения рН композиции, обычно в пределах рН от 5 до 8. Могут быть получены фармацевтические композиции для ингаляции. Например, белковый продукт GDNFR может быть введен в состав сухого порошка для ингаляции. Для аэрозольного применения белковый продуктGDNFR может быть введен в состав жидкого пропелланта. Растворы могут быть также распыляемыми. Считается, что определенные фармакологические формы, содержащие белковый продуктGDNFR, должны применяться для орального введения. Для введения таким способом белковый продукт GDNFR должен быть соединен с носителями, обычно используемыми для приготовления твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, может быть сконструирована капсула для высвобождения активного начала композиции в той точке желудочно-кишечного тракта, где биодоступность максимальна, а пресистемная деградация минимальна. Для облегчения абсорбции белкового продукта GDNFR в состав композиции могут входить дополнительные материалы. Могут использоваться наполнители, отдушки, легкоплавкие воска, растительные масла, любриканты,суспендирующие агенты, разрыхляющие агенты и связующие вещества. Другие составы могут предусматривать использование эффективного количества белкового продукта GDNFR в смеси с нетоксичными наполнителями, удобными для производства таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или другом приемлемом носителе можно получить единичные дозы растворов. К 58 приемлемым наполнителям относятся (без ограничений перечисленными) инертные наполнители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция,такие связующие, как крахмал, желатин или гуммиарабик, или такие любриканты, как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Для квалифицированного специалиста очевидна возможность получения других фармакологических форм белкового продуктаGDNFR, включая композиции, содержащие белковый продукт GDNFR в сочетании с белковым продуктом GDNF. Из уровня техники известны способы поддерживаемой или контролируемой доставки фармацевтических композиций с помощью липосомных носителей, биодеградируемых микрочастиц или пористых шариков, а также депо-инъекций. См., например, Supersaxo et al., описание применения пористых полимерных микрочастиц для контролируемого высвобождения фармацевтических композицийD. Введение белкового продукта GDNFR Белковый продукт GDNFR может быть введен парентерально различными способами,включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, транспульмонарный, трансдермальный, внутриоболочечный и интрацеребральный. Кроме того, те белковые факторы, которые неспособны преодолевать гемато-энцефалический барьер, могут быть введены непосредственным образом интрацеребрально или же применяться в ассоциации с другими элементами, которые будут способствовать их переносу через барьер. Например, белковый продукт GDNFR может быть введен интрацеребровентрикулярно или в субарахноидальное пространство головного или спинного мозга. Белковый продуктGDNFR может быть введен интрацеребрально непосредственно в паренхиму мозга. Белковый продукт GDNFR может быть введен экстрацеребрально в такой форме, когда он химически модифицирован или упакован с тем, чтобы преодолевать гемато-энцефалический барьер, или же вместе с одним или несколькими агентами,облегчающими проникновение белкового продукта GDNFR через этот барьер. Например, показано, что конъюгат NGF с моноклональными антителами к трансферриновому рецептору доставляется в мозг посредством связывания с трансферриновыми рецепторами. Для достижения желаемого уровня белкового продукта GDNFR могут быть назначены повторные ежедневные или менее частые инъекции или же белковый продукт GDNFR можно вливать постоянно или периодически при помощи программируемого имплантируемого насоса. Имплантаты медленного высвобождения,содержащие нейротрофный фактор, заключенный и биодеградируемый полимерный матрикс, 59 также могут использоваться для доставки белкового продукта GDNFR. Частота введения и дозировка будут зависеть от фармакокинетических параметров конечной формы белкового продукта GDNFR, а также способа и места введения. Независимо от способа введения можно рассчитать конкретную дозу, исходя из веса тела, поверхности тела или размера органа. Для определения соответствующей дозировки каждой из перечисленных выше фармакологических форм могут потребоваться уточняющие вычисления, которые обычно выполняются квалифицированным специалистом и входят в круг его обычных обязанностей. Соответствующие дозировки могут быть уточнены на основе данных типа доза-ответ. Окончательная дозировка и частота введений будут зависеть от способа лечения конкретного повреждения или состояния и должны определяться практикующим врачом. Вообще говоря, эффективное количество заявленных полипептидов GDNFR будет определяться с учетом различных факторов, модифицирующих действие лекарств, например таких как возраст,состояние больного, вес тела, пол и диета, острота какой-либо инфекции, время введения и других клинических факторов. См. руководствоRemington's Pharmaceutical Sciences, supra, стр. 697-773, упоминаемое здесь в качестве ссылки. Считается, что, если GDNFR используют для усиления действия GDNF, выбираемая дозаGDNFR должна быть аналогичной таковой при терапии GDNFR; если GDNFR используют как антагонист GDNFR, то доза GDNFR должна быть в несколько раз выше дозы GDNF. Дозировка может быть рассчитана на одно или несколько ежедневных или более редких введений и может предусматривать сочетанное применение описанных выше композиций. Необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается приведенными дозировками. Считается, что постоянное введение или постоянное высвобождение белковых продуктовGDNFR может иметь преимущество при лечении конкретных заболеваний. Когда постоянное введение осуществляется с помощью механических средств, например, инфузионного насоса,могут быть использованы другие подходы к обеспечению такого (или почти такого) характера введения. Например, химическая дериватизация или инкапсулирование могут привести к получению фармакологических форм поддерживаемого высвобождения, что скажется на постоянном присутствии белка в кровотоке в предсказуемых на основе дозировки количествах. Так, к белковым продуктам GDNFR относятся дериватизированные белки или белки,введенные в состав таких композиций, которые будут влиять на такое поддерживаемое высвобождение. Для обеспечения нужных суточных или недельных дозировок могут быть получены 60 фармакологические формы белковых продуктовGDNFR может быть введен сочетанно с GDNF. Альтернативно, белковые продукты GDNFR иGDNF могут вводиться раздельно, как последовательно, так и одновременно. Заявленный в настоящем изобретении белковый продукт GDNFR может быть использован для лечения нервных заболеваний в сочетании с одним или несколькими другими ростовыми факторами. Кроме того, другие факторы или другие молекулы, включая химические соединения, могут быть применены вместе с белковым продуктом GDNFR. Считается, что для лечения болезни Паркинсона белковый продуктGDNFR может быть использован сам по себе или сочетанно с введением Levodopa, при том,что GDNFR будет усиливать активность эндогенного GDNF и тем самым способствовать поступлению в нейроны более высоких концентраций допамина. Как указывалось выше, считается, что дополнительные нейротрофные или нейровспомогательные факторы могут оказаться полезными или необходимыми для лечения конкретных популяций нервных клеток или отдельных типов повреждений или заболеваний. К другим факторам, которые могут быть использованы в сочетании с GDNFR или с комбинациейGDNFR/GDNF, относятся такие митогены, как инсулин, инсулиноподобные ростовые факторы,эпидермальный ростовой фактор, вазоактивный ростовой фактор, полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза, интерферон и соматостатин, такие нейротрофные факторы, как фактор роста нервов (NGF), нейротрофный фактор, полученный из мозга (BDGF), нейротрофин-3, нейротрофин-4/5, нейротрофин-6, инсулиноподобный ростовой фактор, цилиарный нейротрофный фактор, кислый и основный фибробластные ростовые факторы, фибробластный ростовой фактор-5, трансформирующий ростовой фактор- , кокаин-амфетамин регулируемый транскрипт (CART) и другие ростовые факторы, такие как эпидермальный ростовой фактор, фактор подавления лейкемии (LIF), интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы так же, как и молекулы и материалы, являющиеся функциональными аналогами перечисленных факторов. Клеточная терапия и генная терапия на основе белкового продукта GDNFR Еще один аспект изобретения относится к клеточной терапии на основе белкового продукта GDNFR, например интрацеребральной имплантации клеток, продуцирующих белковый продукт GDNFR. Данный вариант осуществления изобретения предусматривает имплантацию больным клеток, способных синтезировать и секретировать биологически активную форму