Способ получения клеточной популяции

Номер патента: 63

Опубликовано: 30.04.1998

Автор: Бурдули Маради Александровна

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ получения клеточной популяции, включающий выделение живых клеток и введение их в ооциты, отличающийся тем, что в качестве живых клеток используют сперматиды, после выделения их помещают в эмбриональную жидкость, затем сливают полученную суспензию под давлением, величина которого обеспечивает целостность клеточных мембран, в зиготоподобные клетки и инъецируют полученные андроиды в оплодотворенные ооциты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве ооцитов используют куриные яйца.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что давление обеспечивается пропусканием суспензии через шприц одноразового пользования двумя-тремя вращательными движениями поршня.

Текст

Смотреть все

1 Изобретение принадлежит к биологии развития и медицине. Аналогичный случай нашли в диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук "Ранние этапы образования гибридом, продуцирующих моноклональные антитела". Цой Л.А. М.: 1985. Получение лимфоцитов из селезенки. Мышь забивали, вскрывали брюшную полость и выделяли селезенку, поместив ее в чашку Петри со средой Дульбекко, тщательно очищали и переносили либо в другую чашку, либо в стеклянный гомогенизатор (Доинсе) с неплотно притертым поршнем в 20 мл среды Дульбекко. В первом случае клетки "вычесывали" из селезенки пинцетом, во втором - выдавливали двумя-тремя вращательными движениями. Суспензию клеток осторожно пипетировали и переносили в пробирки. Через 5 мин, когда кусочки селезеночной капсулы и крупные комочки слипшихся клеток оседали на дно, суспензию пипеткой осторожно переносили в центрифужный стакан объемом 50 мл, подслаивали на дно 5 мл сыворотки и центрифугировали, надосадочную жидкость сливали и оставляли стерильно до употребления. Слияние клеток. В стеклянную центрифужную пробирку вносили миеломные клетки и лимфоциты в различных соотношениях: 1:2, 1:5, 1:10. Суспензию клеток тщательно перемешивали и центрифугировали 7 мин при 1000 об/мин. Супернатант сливали, а осадок разрыхляли осторожным потряхиванием пробирки. К полученному осадку медленно добавляли 1 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) в течение 1 мин. Затем пробирку на протяжении 1 мин медленно покачивали, после чего добавляли теплую среду Дульбекко в течение 5 мин до общего объема 20 мл. Взвесь клеток центрифугировали 7 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспензировали в селективной среде ГАТ (Гипоклантин, Аминоптерин,Тимидин) и вносили по 0,2 мл в 96-луночную панель. В опытах сливали клетки мышиной миеломы с лимфоцитами из селезенки мышей, иммунизированных определенным антигеном. Образующиеся в результате клетки гибридной миеломы или "гибридомы" обладают и способностью лимфоцитов вырабатывать специфические антитела, и свойством миеломных клеток оставаться бессмертными. Клонируя отдельные гибридные клетки, получали клоны, производящие большое количество идентичных антител к одной антигенной детерминате. Такие индивидуальные клоны можно поддерживать неопределенно долго и в любой момент использовать для получения моноклональных антител в культуре. Прототипом изобретения служат данные экспериментальных исследований Э.М. Де Робертис и Дж.Б. Гердон, изложенные в статье"Пересадки генов и анализ развития". "Молекулы и клетки", выпуск седьмой. М.: Мир, 1982,с.78-93. Ученые ставили опыты с использованием в качестве пробирки нормальных живых клеток, где нормально функционируют гены из других клеток, введенные с помощью метода микроинъекций. Целью исследователей была разработка метода, сочетающего точность экспериментов в пробирке с естественной средой живой клетки. Таким методом явился метод введения очищенных макромолекул в ооциты лягушки. Ооциты - предшественники яйцеклеток представляют собой удобную экспериментальную модель из-за их большого размера, устойчивости к экспериментальным воздействиям (в них можно инъецировать те или иные вещества в количестве, составляющем до 5% их объема,без каких-либо последствий и наличия их жизнеспособности в культуре, они остаются живыми и функционируют в течение нескольких недель в простом солевом растворе). Ооциты особенно пригодны для эмбриологических исследований, поскольку природа их предопределена; они становятся яйцами, а затем зародышами и уже содержат большую часть молекулярных механизмов, необходимых для раннего развития. Ядра соматических клеток выделяют с помощью мягких методов, обрабатывают лизолецитином - фосфолипидом, который внедряется в наружную мембрану ядра, и в каждый ооцит инъецируют большое число таких ядер. Опыты с микроинъекциями ставились для того, чтобы выяснить содержит ли ооцит вещества, регулирующие активность гена. Суть изобретения и исходящий из него технический результат. Зигота - идеальная зародышевая клетка; из нее равновероятно может быть получен любой из клеточных типов, входящих в организм данного вида. Любая другая клетка, кроме зиготы,не в состоянии дать начало другим клеточным популяциям. Для биологии развития известны партеногенетическая форма развития, когда зигота образуется только из гаплоидных женских гамет, и андрогенез, когда в яйцеклетке образуется ядро слиянием двух сперматозоидов. Для биологии развития известно не только то, что зиготу образуют гиплоидные клетки, но и то, что гаметы имеют блокаду на мейоз; без редуктивного деления они стареют и становятся непригодными для оплодотворения; в таком случае соматические и половые клетки идентичны, так как реальное различие между ними очевидно после мейоза, что и определяет гаплоидный набор хромосом гамет; во многих экспериментах стимулируют женские гаметы для партеногенетического развития. Соматические клетки имеют диплоидное число хромосом, в отличии от гамет, не слива 3 ются друг с другом, не могут образовать зиготоподобную клетку. Однако, общеизвестно, что в различных тканях, особенно в экспериментальных условиях в культурах тканей, число хромосом подвергается большим колебаниям; анэуплоидия наблюдается при злокачественном росте тканей. В литературе нет данных о возможности слияния в экспериментальных условиях двух гаплоидных сперматидов. Поэтому, весьма вероятно, неизвестно, что может дать такая зиготоподобная клетка-андроид. Надо полагать, что при слиянии мужских гамет образуется клеточная популяция, отличающаяся от клеточной популяции, полученной при слиянии разных гаплоидных клеток. Однако, не исключено, что в клеточных популяциях, полученных после слияния однородных гамет, могут формироваться конструкции, образовывающиеся при слиянии разных гамет. Экспериментальная система, с помощью которой возможно выделение и слияние гаплоидных сперматидов в зиготоподобную клетку,инъекцирование андроида в яйцо и получение тканевой культуры, может быть использована для изучения механизма как нормального, так и патологического роста. Общее описание метода. Изучены потенциальные свойства андроида с помощью экспериментальной системы, которая включает выделение гаплоидных клеток,предшественников сперматозоидов-сперматидов, помещение сперматидов в питательной среде, слияние их в зиготоподобную клетку под давлением и инъецирование полученного андроида в яйцо. Конкретный пример осуществления метода. Опыты проводились в природных условиях. Под эфирным наркозом вскрывали брюшную полость петуха, вырезали семенники и переносили в стерильную чашку Петри в теплой питательной среде. Питательную среду - эмбриональную жидкость - собирали из 12 дневных куриных эмбрионов. Для этого яйца располагали вверх воздушной полостью, протирали спиртом, удаляли верхнюю часть скорлупы и отсасывали шприцем эмбриональную жидкость. После удаления оболочки семенники измельчали ножницами, полученную кашицу переносили в центрифужные пробирки, подслаивали на дно 5 мл теплой питательной среды и центрифугировали 5 мин при 400-500 об/мин; через 5 мин, когда крупные комочки слипшихся клеток оседали на дно, суспензию осторожно переносили в стерильные пробирки, добавляли по 5 мл теплой среды и опять центрифугировали 5 мин 200-300 об/мин, оставляли на 5 мин, затем суспензию переносили в шприцах одноразового 4 пользования и сливали клетки под давлением; полученные андроиды инъецировали в оплодотворенных куриных яйцах, где было начато за 1,2,3 и больше дней развитие эмбрионов. Часть яиц оставляли без инъекции для контроля возраста эмбриона. С целью морфологического изучения материал брали через 24 и 48 ч и спустя 3,5,7,9,10,11,12,14 суток после инъекции и фиксировали в 12%-ном растворе нейтрального формалина. После фиксации объекты заливали в целлоидин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Эффективность метода подтверждается полученными результатами: андроиды в яйце размножаются. Гистологическое изучение материала показывает, что: 1. По истечении 24 ч после инъекции материал представлен однослойной клеточной культурой, состоящей из однотипных, круглых клеток с круглыми ядрами, расположенными в центре тел клеток. Среди названных клеток изредка встречаются фигуры митоза. 2. По истечении 48 ч после инъекции материал представлен однослойной клеточной культурой, состоящей из круглой и округлой формы клеток с круглыми и овальными ядрами,расположенными в центре тел клеток. 3. Спустя 3 и 5 суток после инъекции материал представляет собой однослойную клеточную культуру, однако расположение клеток имеет определенную ориентацию, проявляющуюся образованием столбиков, состоящих из 10-12 рядов круглых и округлых клеток. Столбики прямолинейные или образуют петли. 4. Спустя 12 суток после инъекции материал представляет собой тканевую культуру,состоящую из дериватов экто и мезодермы и создающую организмоидный тип строения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1.Способ получения клеточной популяции,включающий выделение живых клеток и введение их в ооциты, отличающийся тем, что в качестве живых клеток используют сперматиды,после выделения их помещают в эмбриональную жидкость, затем сливают полученную суспензию под давлением, величина которого обеспечивает целостность клеточных мембран,в зиготоподобные клетки и инъецируют полученные андроиды в оплодотворенные ооциты. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ооцитов используют куриные яйца. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что давление обеспечивается пропусканием суспензии через шприц одноразового пользования двумя-тремя вращательными движениями поршня.

МПК / Метки

МПК: C12N 5/06, C12N 5/16

Метки: способ, клеточной, популяции, получения

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/3-63-sposob-polucheniya-kletochnojj-populyacii.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения клеточной популяции</a>

Похожие патенты