Пептиды антисекреторного фактора, регулирующие патологические изменения проницаемости

1 Настоящее изобретение относится к новым антисекреторным факторам, обладающим способностью регулировать транспорт жидкости и/или воспалительные реакции, а также свойствами полинуклеиновой регуляции; к полинуклеиновым кислотам, кодирующим указанные факторы; и к их использованию. Все клетки и ткани организма в значительной степени зависят от постоянно присутствующей в организме нормальной жидкостной среды, а также от адекватного кровоснабжения. Расстройство одной или обеих этих поддерживающих систем может иметь роковые последствия. Что касается жидкостного дисбаланса, то существуют две принципиально различные системы: А. Отек, который характеризуется аномальной аккумуляцией жидкости в межклеточном тканевом пространстве или в полостях организма; или В. Обезвоживание, которое, строго говоря,означает потерю лишь воды, однако, фактически, этот термин используют для описания как потери воды, так и потери ионов. Наиболее распространенными формами отеков или обезвоживания являются: диарея; воспалительные заболевания кишечника; отек головного мозга; астма; ринит; конъюктивит; артрит; глаукома; различные формы аномального внутричерепного давления(повышенного или пониженного); изменение давления в среднем ухе, такое как болезнь Меньера; дерматит; химические или физические повреждения кожи и желез вместе с прилегающей к ним кожей, например мастит; различные формы эндокринных нарушений, таких как несахарный диабет, синдром Конна, синдром Кушинга и болезнь Аддисона; заболевания почек,такие как пиелонефрит и гломерулонефрит; болезни обмена веществ, такие как микседема, и острая интермиттирующая порфирия; побочные эффекты, возникающие в процессе лечения различными лекарственными средствами, такими как антидиабетические лекарственные средства,трициклические антидепрессанты, цитостатики,барбитураты, наркотические средства и аналоги наркотических средств. Диарея возникает в результате изменения проницаемости кишечника для электролитов и воды. Эти расстройства часто вызываются бактериальными энтеротоксинами, такими какEscerichia coli, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae и Clostridium difficile. Указанные расстройства могут быть также вызваны кишечным воспалением. Поскольку поглощение воды в организме животного сочетается с поглощением электролитов и питательных веществ, то животные с диареей часто страдают от недостаточности питания, что приводит к замедлению суточного прироста массы выкармливаемого животного. Организм противодействует этим реакциям посредством нейро 001201 2 гормональных механизмов, таких, как высвобождение соматостатина и опиоидных пептидов из интернейронов в слизистой оболочке кишечника. Эти полипептиды обладают способностью к восстановлению нормальной секреции жидкости и устранению диареи. Описанный недавно антисекреторный фактор (AF) был частично очищен из гипофиза свиньи, и было показано, что этот фактор нормализует патологическую секрецию жидкости,индуцированную различными энтеротоксинами. Высокие уровни AF в молоке свиноматки способствуют защите вскармливаемых поросят от неонатальной диареи. Для лечения диареи у человека и животных широко используются противомикробные лекарственные средства. Они также используются в качестве пищевых добавок в корм для свиней, телят и цыплят. Однако из-за быстрого развития в кишечнике резистентных бактерий,использование антибиотиков для лечения энтеритов обычно не практикуется в медицине, а их использование в ветеринарии также сведено до минимума. Другие противопоносные лекарственные средства препятствуют секреции в слизистой оболочке кишечника. Поскольку эти лекарственные средства направлены против организмахозяина, то маловероятно, что в организме будет развиваться резистентность против таких лекарственных средств. Лекарственными средствами этого типа являются нейроактивные лекарственные средства, такие как фенотиазины и тиоксантены. Однако, в большинстве стран, лекарственные средства такого типа не применяются для лечения диареи из-за некоторых вызываемых ими серьезных побочных эффектов. Другими лекарственными средствами являются производные опиатов, такие, как кодеин и лоперамид. Поскольку эти лекарственные средства действуют посредством ингибирования кишечной перистальтики, то они также ингибируют вывод патогенных бактерий из кишечника, а поэтому такие лекарственные средства не рекомендуются для применения против дизентирийных бактерий или паразитов. Недавно стали использоваться производные соматостатина, но в настоящее время они имеют ограниченное применение из-за трудности их введения, а также из-за их возможного влияния на эндокринную регуляцию роста. До настоящего времени, антисекреторный фактор (AF) не использовался непосредственно для лечения диареи или недостаточности питания из-за трудности получения чистого препарата этого белка. Однако, аналогичные белки можно было индуцировать у домашних животных, которым давали специальную пищу (патент SE9000028-2). Свиньи, получавшие такое питание, продуцировали высокие уровниAF-подобных белков и обнаруживали значительное увеличение суточного привеса по срав 3 нению с соответствующим контролем. AF у крыс, подвергнутых контрольному заражению токсином А от С.difficile, обеспечивал защиту животных не только от кишечной секреции, но также и от воспаления и кровотечения в кишечнике. Основной задачей настоящего изобретения является получение нового рекомбинантного белка и его гомологов и фрагментов (пептидов) для использования в целях нормализации патологического транспорта жидкости. В целом, эти белки и пептиды называются антисекреторными факторами (AF). AF также частично ингибируют, или полностью предупреждают развитие воспалительных реакций различной этиологии. Такая нормализация транспорта жидкостей в организме или подавление воспалительных реакций достигается путем использования белков или пептидов. Кроме того, белки или пептидыAF с успехом абсорбируются через различные мембраны слизистых оболочек, не теряя, при этом, своей эффективности (по сравнению с внутривенным введением). Поэтому существует множество схем лечения, и правильное введение белка или пептида позволяет быстро восстановить нарушенный жидкостный баланс (воды и ионов) в организме, устранить воспалительные реакции, либо то и другое. В целом, рекомбинантный белок AF (rAF),а также его гомологи и фрагменты могут быть использованы для иммунодетекции; а также в качестве пищевых добавок в корм для молодняка; и в качестве противопоносных средств и лекарственных средств для лечения заболеваний, включая отек, обезвоживание и/или воспаление. Целями настоящего изобретения являются: Рекомбинантный белок, имеющий, в основном, аминокислотную последовательность,показанную в SEQ ID No:1, или его гомологи или фрагменты. Фрагмент рекомбинантного белка с SEQID No:1, где указанный фрагмент выбирают из группы, включающей:e) аминокислоты 1-80 аминокислотной последовательности SEQ ID No:1. Пептид X1VCX2 Х 3KX4R, соответствующий фрагменту, состоящему из аминокислот 35-42 рекомбинантного белка с SEQ ID No:1, где Х 1= 1 или отсутствует, Х 2 представляет Н, R или К; Х 3 представляет S, L или другую нейтральную аминокислоту; а Х 4 представляет Т или А. Поликлональные антитела против рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность, показанную вSEQ ID No:1, или его гомологов или фрагментов. 4 Композиция для нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций, содержащая в качестве главного активного ингредиента эффективное количество рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность SEQ ID No:1, или его гомологов или фрагментов. Использование рекомбинантного белка,имеющего, в основном, аминокислотную последовательность SEQ ID No:1, или его гомологов или фрагментов для изготовления композиции в целях нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций. Пищевой продукт для нормализации патологического транспорта жидкостей и/или подавления воспалительных реакций у позвоночных, содержащий в качестве активного агента рекомбинантный белок, имеющий, в основном,аминокислотную последовательность SEQ IDNo:1, или его гомологи или фрагменты; или организм, способный продуцировать указанный белок или его гомологи или фрагменты. Способ нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций в организме позвоночных,заключающийся во введении указанному позвоночному эффективного количества рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательность SEQ ID No:1,или его гомологов или фрагментов, или микроорганизма, продуцирующего указанный белок или его гомологи или фрагменты. Использование специфических антител против рекомбинантного белка, имеющего, в основном, аминокислотную последовательностьSEQ ID No:1, или его гомологов или фрагментов для детекции указанного белка или его фрагментов в организме. Нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантный белок, имеющий, в основном,аминокислотную последовательность SEQ IDNo:1, или его гомологи или фрагменты. Использование нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантный белок, имеющий, в основном, аминокислотную последовательностьSEQ ID No:1, или его гомологи или фрагменты,для продуцирования соответствующих белков или их гомологов или фрагментов и для получения зондов или праймеров для детекции присутствия нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный антисекреторный фактор в организме. Вектор, содержащий нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантный белок,имеющий, в основном, аминокислотную последовательность SEQ ID No:1, или его гомологи или фрагменты. Штамм организма, за исключением человека, способный продуцировать белок, имеющий, в основном, аминокислотную последова 5 тельность SEQ ID No:1, или его гомологи или фрагменты. В качестве организмов, способных продуцировать рекомбинантный белок, могут быть использованы организмы различных типов, таких, как рекомбинантные бактерии и эукариотические организмы, например, дрожжи, растения и позвоночные за исключением человека. Несмотря на десятилетние усилия, направленные на очистку AF стандартными биохимическими методами, попытки получить гомогенную форму AF не увенчались успехом. Однако,был разработан новый способ получения полуочищенного AF для иммунизации и отбора сыворотки иммуногистохимическим методом с использованием подходящей антисыворотки. С помощью такой антисыворотки, в настоящее время стало возможным клонировать рекомбинантную кДНК человека, экспрессирующую AF в E.coli. Была определена последовательность новой кДНК, и было показано, что эта последовательность является уникальной. Благодаря определению этой последовательности были сконструированы олигонуклеотидные зонды, которые гибридизируются с РНК гипофиза человека и свиньи. Размер этой РНК, около 1400 пар оснований, соответствует размеру секвенированной кДНК, включающей 1309 пар оснований +poly(А)-хвост. Было показано, частичная кДНКпоследовательность от гипофиза крысы идентична соответствующей кДНК-последовательности человека, что свидетельствует о том, что структура генов AF является аналогичной у животных различных видов. Такая консервативность AF-генов позволяет использовать олигонуклеотидные зонды для идентификации AFкодирующей РНК и ДНК от различных видов животных. Кроме того это позволяет экспрессировать рекомбинантный AF в биологически активной форме. Белок AF в форме слитого белка с глутатион-s-трансферазой был в больших количествах экспрессирован в E.coli и очищен до гомогенности с помощью аффинной хроматографии. Было показано, что после расщепления слитого белка тромбином, рекомбинантный AF (rAF) обладал исключительно сильным действием,дающим полумаксимальное ингибирование 44 нг (10-12 моль) секреции жидкости, индуцированной холерным энтеротоксином в кишечнике крыс. С использованием методов генной инженерии были продуцированы более мелкие фрагменты rAF. При этом, было показано, что небольшая последовательность, состоящая из 7-8 аминокислот, сохраняет свою активность. Это было подтверждено с помощью химического твердофазного синтеза, с помощью которого был продуцирован октапептид и было показано,что исходя из молярного соотношения, он имеет почти такое же биологическое действие, как иrAF. Посредством сайтнаправленного синтеза был сконструирован ряд последовательностей внутри активного центра, и было показано, что могут быть осуществлены замены нескольких аминокислот, которые не оказывают какоголибо неблагоприятного действия на биологическую активность. Секрецию жидкости измеряли с помощью модели кишечной петли, а именно: участок(петлю) тонкой кишки перевязывали двумя нитями для хирургических швов; и в петлю инъецировали определенное количество энтеротоксина. Испытуемые антисекреторные лекарственные средства инъецировали за один час до и через два часа после стимуляции токсином. Эту инъекцию осуществляли тремя различными путями: внутривенно, интраинтестинально и интраназально. Жидкость аккумулировалась в петле через 5 ч после введения токсина. Секрецию жидкости измеряли исходя из массы аккумулированной жидкости на один сантиметр кишки. Последовательность белка определяли прямым методом аминокислотного секвенирования и непрямым методом путем расшифровки кДНК-последовательности. Было установлено, что рекомбинантныйAF имеет очень низкую токсичность или низкую степень системного действия, поскольку у крыс, которым вводили дозы, 100-кратно превышающие дозы, вызывающие полумаксимальное ингибирование, не наблюдалось токсичных реакций. Поскольку эти дозы являются эффективными при инъекции в тонкий кишечник, то они могут быть введены перорально. В отличие от испытанных препаратов натурального AF, которые являются эффективными только при их введении до заражения токсином, рекомбинантные AF-ингибиторы секреции обладают также эффективностью при их введении после заражения токсином. Поэтому rAF может быть использован как в профилактических, так и в терапевтических целях. Кроме того было показано, что rAF и его пептидные фрагменты ингибируют цитотоксические реакции и воспалительные реакции в кишечнике, вызванные токсином A Clostridiumdifficile. С помощью теста на проникающую способность красителя было показано, что rAF и его фрагменты нормализуют патологические изменения проницаемости, индуцированные холерным энтеротоксином, не только в слизистой кишечника, но также и в сосудистом сплетении (plexus choroideus), которое регулирует давление жидкости в головном мозге. Антисыворотка против rAF была продуцирована в кроликах и использована в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA). Этот анализ может быть использован для измеренияAF в физиологических жидкостях или в пище. Ниже описан способ очистки антител против AF (натурального или рекомбинантного) с 7 помощью аффинной хроматографии на колонках с агарозой, связанной с rAF. Было также показано, что эти антитела являются эффективными для обнаружения AF в срезах тканей, осуществляемого методами иммуногистохимического анализа, и для детекцииAF в Вестерн-блот-анализе. Более подробное описание настоящего изобретения приводится в нижеследующих неограничивающих примерах, которые сопровождаются прилагаемыми ниже рисунками. Пример 1. Антитела против AF, продуцированные для клонирования кДНК. Антисекреторный фактор получали из крови свиньи посредством аффинной хроматографии на агарозе и изоэлектрического фокусирования. К одному литру крови свиньи (содержащей противосвертывающие вещества) добавляли 1 г тиосульфата натрия и 1 мг фенилметилсульфонилфторида. Клетки крови отделяли путем центрифугирования, и прозрачную плазму элюировали на колонке с Сефарозой 6 В(Pharmacia LKB Biotehnology Stockholm), причем, объем геля соответствовал примерно 10% объема раствора. После промывки тремя объемами фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS=0,15 М NaCl, 0,05 М фосфат натрия, рН =7,2), колонку элюировали двумя объемами 1 М -метил-D-глюкозида, растворенного в PBS. Элюат концентрировали и диализовали против воды на ультрафильтре "Omega 10k flowthrough" (Filtron Technology Corp.). Затем, фракции разделяли путем изоэлектрического фокусирования в градиенте амфолина (Pharmacia) при рН=4-6 на 400 мл-колонке для изоэлектрофокусирования (LKB, Sweden). Фракцию,имеющую изоэлектрическую точку между 4,7 и 4,9, собирали, а затем диализовали против PBS. Затем, частично очищенный AF делили на небольшие аликвоты и использовали для продуцирования антисыворотки у кроликов в соответствии с ранее описанным методом. Кроликов иммунизировали и полученные сыворотки анализировали на их способность окрашивать внутриклеточный материал в срезах гипофиза человека (метод, описанный в примере 6). Лишь одна из полученных сывороток показала специфическое и отчетливое внутриклеточное окрашивание без окрашивания белков внеклеточного матрикса. Эту антисыворотку отбирали на скрининг библиотеки кДНК/лямбда-фага GT11 от гипофиза человека, экспрессирующей белки в E.coli. Пример 2. Скрининг кДНК-библиотек от гипофиза и головного мозга человека. 5'-фрагмент кДНК-библиотеки от нормального гипофиза человека, происходящего от тканей, полученных из пула 9 пациентов белой расы [Caucasian - жарг. (расистский термин) означает относящийся к кавказской расе, белый 8 плотности 3 х 104 бляшкoобразующих единиц на 150 мм-чашку с Y1090 E.coli. AF абсорбировали 0,5 объемами лизата Y1090 E.coli в течение 4 ч при температуре 23 С, затем разводили в отношении 1:400, и осуществляли скрининг как описано YoungDavis (1). Конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антикроличьи антитела были использованы в качестве "вторых" антител (Jackson). Положительные бляшки собирали, элюировали в среду с фаговой суспензией [20 мМ Трис-НСl(рН 7,5), 100 мМ NaCI, 10 мМ МgSO4, 2% желатин], а затем снова засевали и скринировали до тех пор, пока не были протестированы все положительные бляшки. Реклонирование кДНК - фаговую ДНК отColi, клетки Top 1 или клетки BL21 (все три от фирмы Stratagene). rAF или рекомбинантные пептиды были получены в клетках BL21, если это не оговорено особо (2). Амплификация кДНК с помощью PCR для получения отсутствующего 5'-конца кДНК использовали PCR-метод, называемый РАСЕ(быстрая амплификация концов кДНК - rapidamplification of cDNA ends). Набор для модифицированного RACE-метода, который генерирует 5'-RACE-Ready кДНК посредством якорного олигонуклеотида, лигированного с 3'-концом кДНК-молекул головного мозга человека, поставлялся фирмой Clontech Laboratories. 5'конец амплифицировали из части 5'-RACEReady-кДНК в две стадии PCR-амплификации с использованием 5'-праймера, комплементарного якорному праймеру и двум специфическим к внутригенному ("гнездовому") гену 3'-PCRпраймерам А и В (А = основания 429-411, а В = основания 376-359; фиг. 1a). Кроме того различные более мелкие части RACE-фрагмента амплифицировали для экспрессии соответствующих пептидов и анализировали на их биологические свойства. В таблице 1 показано положение основания и аминокислоты начала и конца этих олигонуклеотидных фрагментов и их соответствующих пептидов. Свиная и коровья кДНК (Clontech Laboratories) были использованы в качестве матрицы для амплификации фрагментов, соответствующих N3 в таблице 1. Была также проведена модификация последовательности методом сайт-направленного мутагенеза, причем в этом методе различные олигонуклеотиды, соответствующие положениям 168193, синтезировали для последовательной замены аминокислот 35-42 (положения показаны в мент клонировали в вектор pGex-1T с использованием EcoR1-сайта, встроенного в якорный и ген-специфический праймер. Для оценки последовательности, полученной RACE-методом,двухцепочечную кДНК от гипофиза и головного мозга человека (Clontech) амплифицировали с использованием пары праймеров C/D, содержащих внешний рестрикционный EcoR1-сайт(фиг.1b). Праймеры были сконструированы так,чтобы амплифицировалась полная открытая рамка считывания (ORF). PCR-продукты нужного размера от гипофиза и головного мозга гидролизовали ферментом EcoR1, а затем выделяли и клонировали в плазмидный вектор pGex1T. Секвенирoвание ДНК и олигонуклеотидов- ДНК от плазмиды pGex-1T использовали в качестве матрицы для секвенирования вставок методом терминации дидезокси-цепи (15) с использованием набора Sequenase version 2,0 (U.S.Biochemical Corp.). Исходные прямые и обратные праймеры, копирующие области pGex-1T непосредственно выше или ниже от вставленной ДНК, были получены от Pharmacia. Последующие праймеры были синтезированы (Scandinavian Gene Synthesis AB) на основе полученных данных о последовательностях. Во избежание обмена оснований под действием полимеразы Taq в 5'-RACE-методе были секвенированы три различных PCR-клона. Были собраны данные о нуклеотидной последовательности и выведенной белковой последовательности и проанализированы с использованием MacVector 4,1 (Eastman ChemicalCo.). Для определения соответствующей аминокислотной последовательности кДНК-вставок,используемые кодоны различных рамок считывания сравнивали и получали одну большую открытую рамку считывания. Идентификацию данных ДНК-последовательностей и белковых последовательностей проводили с помощьюEntrez CD-ROM-диска (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA). Молекулярное клонирование и анализ последовательности кДНК - поливалентные антисыворотки против белка AF от свиньи были использованы для скрининга кДНК от гипофиза человека. Два клона, экспрессирующих иммунореактивный AF, выделяли, а затем высвобождали из лямбда-фага, и снова клонировали вPharmacia. Размеры вставок, полученные с помощью рестрикционного анализа, составляли 1100 и 900 п.о., соответственно. ДНКсеквенирование двух клонов выявило полную гомологию, за исключением одной заменыRACE-методом. Этот фрагмент имеет полную 10 длину 376 п.о. (не включая синтетического нуклеотидного "плеча" у 5'-конца). Полная реконструированная кДНК содержала 1309 пар оснований и следовала за poly А-хвостом, который предшествовал сигналу полиаденилирования(фиг.1, положения 1289-1295). Была также идентифицирована открытая рамка считывания(ORF) размером в 1146 п.о. (положения 631208). Пример 3. Экспрессия белка AF млекопитающего из рекомбинантных плазмид. Конструирование и очистка слитых белков- кДНК-клоны, полученные путем иммунологического скрининга и PCR-амплификации целой кДНК, лигировали в вектор pGex-1T. Этот вектор позволяет экспрессировать E.coli чужеродные белки в слитые с С-концом 26 кДаглутатион-3-трансферазы Schistosoma japonicum(GST), которые могут быть аффинно очищены в неденатурирующих условиях при помощи набора, предоставленного фирмой Pharmacia. Для этого, ночные культуры E.coli, трансформированные рекомбинантными плазмидами pGex1T", разводили в свежеприготовленной среде,и выращивали в течение 3 ч при температуре 37 С. Экспрессию белка индуцировали 0,1 мМIPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид),и после 4-часового выращивания при температуре 30 С клетки осаждали и ресуспендировали в PBS. Клетки подвергали лизису путем обработки ультразвуком, а затем обрабатывали 1%ным Тритоном Х-100 и центрифугировали при 12000 х г в течение 10 мин; супернатант, содержащий экспрессированные слитые белки, очищали путем пропускания лизатов через глутатионагарозу (Pharmacia). Слитые белки либо элюировали посредством конкурентного связывания со свободным глутатионом, либо гидролизовали в течение ночи путем обработки 10 ед. коровьего тромбина для отщепления AF-белка от GST-аффинного хвоста. В целом, метод с использованием плазмиды pGex и очистку белков или пептидов проводили в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам отPharmacia. Последовательность и размер рекомбинантных AF-белков - для подтверждения кодирующей последовательности, полноразмерный транскрипт выделяли путем PCR-амплификации кДНК гипофиза и головного мозга. С использованием пары праймеров C/D была выделена последовательность в 1215 п.о., идентичная последовательности клона-4 (фиг.1). Открытая рамка считывания, кодирующая 382 аминокислоты,имеет вычисленную молекулярную массу 41,14 кДа и рI = 4,9. Клоны-1, 2 и 3 AF, а также олигонуклеотиды N1-N5 (фиг.1 и таблица 1) лигировали в плазмидный вектор pGex-1T так, чтобы ORF совпадала с рамкой белка глутатион-S-трансферазы (GST). Затем, эти конструкции трансфор 11 мировали в E.coli, а экспрессию гибридных белков индуцировали посредством IPTG. Очищенные слитые белки и расщепленный тромбином белок или пептид AF подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН и Вестерн-блоттингу с использованием антисыворотки против свиного антисекреторного фактора (фиг.2). Окрашивание белков кумасси бриллиантовым голубым выявило дискретные полосы для каждого белка за исключением белка GST-AF-1,что свидетельствовало о его разложении на более мелкие компоненты. Твердофазный пептидный синтез - более мелкие пептиды (P7 -P18 в таблице 1) продуцировали (K.J. Ross-Petersen AS) на твердой фазе в синтезаторе пептидов Applied Biosystems. Чистота каждого пептида составляла 93-100%, как показала обращеннофазовая ВЭЖХ на Deltapak С 18, 300 А, проведенная в линейном градиенте 0,1% трифторуксусной кислоты в воде/ацетонитриле. Аминокислотное секвенирование - для дополнительного подтверждения ORF идентифицированной открытой рамки считывания проводили анализ последовательности белка. Чистые белки AF подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН (10% макропластины геля 14), и белки переносили на мембрану Problot (Applied Biosystems) посредством электроблоттинга (Bio-Rad). Пятна, визуально наблюдаемые после окрашивания Ponceau S, вырезали из блота, и первые 20 аминокислот белка секвенировали методом автоматического расщепления по Эдману на автоматическом секвенаторе (Applied Biosystems). Были определены N-концевые последовательности клона-2 и клона-3, что указывает на точное соответствие аминокислот 63-75 и 130140 предсказанной последовательности, соответственно (фиг.1). Сравнение с другими последовательностями белка, имеющимися в GenBank, выявило, что последовательность rAF (фиг.1) является уникальной во всех своих частях и не похожа ни на одну известную последовательность. В результате анализа, проведенного по методу Kyte-Doollittle (22), было выявлено, что первые 10 остатков белка являются относительно гидрофобными и могут составлять сигнальный пептид, который отщепляется до экзоцитоза белка. Эта интерпретация подтверждается Вестерн-блот-анализом (фиг.3), в котором было обнаружено, что рекомбинантный белок имеет немного большую молекулярную массу, чем белковый экстракт, полученный из гипофиза. Однако, такое различие может быть обусловлено пятью дополнительными аминокислотами рекомбинантного белка, образующими сайт расщепления тромбином слитого белка. Пример 4. Продуцирование и анализ антисыворотки/против rAF. Антисыворотка против рекомбинантного слитого белка GST-AF -Антитела против очи 001201 12 щенных гибридных белков GST-AF-1, GST-AF2 и расщепленного тромбином чистого белкаAF-1 (=rAF) для использования в ELISA, в Вестерн-блот-анализе, и для иммуногистохимических исследований продуцировали в кроликах. Каждому кролику вводили 100 мкг антигена в 1 мл PBS, смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда; причем, каждую иммунизацию распределяли на 8-10 порций, которые вводили чрезкожно в спинку животного. Через 3 и 5 недель вводили две бустер-инъекции 50 мкг антигена, причем, последнюю бустер-дозу вводили без использования полного адъюванта Фрейнда. Через 6 дней после последней бустеринъекции, у кроликов брали кровь, получали сыворотку и полученные препараты хранили при -20 С. Чувствительность антисыворотки определяли методом дот-блотанализа. GST-AF2 наносили на нитроцеллюлозную мембрануECL в 1/5- разведении, и антисыворотку разводили 1:1000. Мембраны блокировали 1% альбумином бычьей сыворотки (BSA) в PBS при 4 С в течение 16 ч, а затем инкубировали в течение полутора часов с 1:800-разведенной кроличьей антисывороткой против GST-AF или против свиного AF. Блоты проявляли с использованием конъюгированного со щелочной фосфатазой козьего антитела против кроличьих иммуноглобулинов, а затем 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и п-нитро-тетразолиевого синего (BoehringerMannheim). В этом тесте теоретический предел для детекции антигена составлял около 1 нг. Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле и иммуноблоттинг - электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН (ПААГ-ДСН) экстрактов человеческого и свиного гипофиза и чистых AF-белков осуществляли в 10% акриламидном геле (минипластины геля), в основном,как описано Laemmli (4), за исключением того,что бис-акриламид, используемый в качестве перекрестносшивающего агента, заменяли N,N'диаллилтартардиамидом с соответствующей молярностью. В качестве маркера электрофоретического фронта использовали пиронин Y(Sigma). Заранее окрашенный эталон молекулярных масс закупали у BDH. Затем белки либо окрашивали кумасси бриллиантовым голубым,либо электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу ECL (Amersham) с размером пор 0,45 мм для иммуноблотинга. Последующее инкубирование с BSA, анти-lgG антителом, конъюгированным со щелочной фосфатазой, проводили точно так же, как и для дот-блот-анализа, описанного выше. Как указывалось выше, окрашивание кумасси бриллиантовым голубым не выявило дискретной полосы для белка GST-AF-1, что вероятно, обусловлено его протеолитической деградацией на более мелкие компоненты. Однако в Вестерн-блот-анализе, полноразмерный белок дал значительно более сильный сигнал, чем его расщепленные продукты (фиг.2b). Сильная ре 13 акция с антисывороткой против свиного AF свидетельствовала о том, что рекомбинантные белки действительно имеют такую же иммунореактивность, что и AF. Молекулярная масса полноразмерного белка составляет приблизительно 60 кДа, что превышает точное значение молекулярной массы, составляющее 41139 Да, и оцененное исходя из аминокислотного состава. Кроме того белки были также подвергнуты иммуноблотингу и зондированию с использованием антисыворотки против GST-AF-2, которая связывается с расщепленными тромбином белками (фиг.3). Антисыворотка против рекомбинантногоGST-AF-2 реагировала с нативным белком AF,имеющим кажущуюся молекулярную массу 60 кДа, и с некоторыми более мелкими компонентами, являющимися, по всей вероятности, продуктами ферментативного расщепленияELISA для определения концентрации AF ELISA - Анализ осуществляли с использованием антител против AF-1 и AF-2 методом, описанным ранее (5). Как показано на фиг.3b, чувствительность теста с использованием неочищенной антисыворотки составляла в пределах 110 мкг белка, тогда, как чувствительность теста с использованием аффинноочищенного антитела составляла в пределах 5-50 нг белка. Пример 5. Нозерн-блот-анализ РНК гипофиза. Нозерн-блот-анализ - Гипофиз человека был получен посмертно из клиники Sahlgrenska(с разрешения Министерства здравоохранения Швеции (Swedish Health and Welfare Board); 2 положения о трансплантации органов 1975:190). Гипофиз для получения РНК экстрагировали методом ChroczynskySacchi (6) с использованием тиоцианата гуанидиния-РНК. Полиаденилированную РНК отбирали с использованием готового набора (Pharmacia) и колонок с oligodТ-целлюлозой. Кроме того, использовали пул мРНК из гипофиза человека, полученного от 107 индивидуумов и закупленного у Clontech. 5 мкг каждого образца poli(A+)РНК обрабатывали глиоксалем и подвергали электрофорезу в 1,2% агарозном геле (7). После капиллярного щелочного переноса в течение 3 ч в 0,05 МNaOH на нейлоновые мембраны Hybond N+(Amersham), проводили предварительную гибридизацию и гибридизацию в течение 24 ч при 42 С каждую. Раствор для гибридизации содержал 50% формамида, 5 х SSPE, 10 х раствор Денхардта, 250 мкг/мл денатурированной низкомолекулярной ДНК и 50 мкг/мл полиадениловой кислоты. Блоты зондировали с использованием четырех различных антисмысловых 28 п.о.-олигонуклеотидов, содержащих нуклеотиды в положениях 132-105 (праймер Е), 297-270(праймер Н) последовательности, показанной на фиг.1; зонды метили по 3'-концам терминальной[ ]ddATP (Amersham), и очищали на никколонках (Pharmacia). Затем проводили пять промывок в 5xSSPE/0,1% ДСН -0,5xSSPE/0,1 % ДСН при 42 С в течение 30 мин каждую, причем, последнюю промывку повторяли. Фильтры экспонировали с пленкой Hyperfilm MP (Amersham) в течение 7 дней. Экспрессия в гипофизе - нозерн-блотанализ осуществляли с использованием смеси четырех олигонуклеотидных зондов, гибридизирующихся с различными последовательностями, находящимися в клонированной кДНК(фиг.4). Зонды гибридизировались лишь с одной полосой около 1400 п.о. в мРНК, выделенной из гипофиза. Наиболее сильный сигнал был получен с использованием человеческого материала,а материал, полученный от свиньи, давал также перекрестную реакцию. Пример 6. Распределение AF в срезах гипофиза. Виды и ткани - Гипофиз человека был получен после вскрытия из клиники Sahlgrenska (с разрешения Министерства здравоохранения Швеции (Swedish Health and Welfare Board); 2 положения о трансплантации органов 1975:190). Препараты гипофиза замораживали при -70 С,за исключением препаратов, используемых для гистологического анализа, которые фиксировали в течение 24 ч в 4% параформальдегиде, растворенном в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS=0,15M NaCl, 0,05 М фосфат натрия, рН 7,2), а затем переносили в 7,5% сахарозу в PBS. Гипофизы от 5-7 месячных свиней, полученные со скотобойни,выдерживали во время их транспортировки на сухом льду, и замораживали при -70 С вплоть до их использования. 2-3-месячных крыс Sprague-Dawley для биоанализа получали от ВКUniversal AB, Sollentuna, Sweden. Кролики (новозеландские белые) для иммунизации были получены от Lidkoping Kaninfarm, Sweden. Иммуногистохимия - фиксированные гипофизы замораживали в жидком азоте, и получали криосрезы толщиной 7 мкм. 5-10 срезов от каждого образца, содержащих различные участки гипофиза, были фиксированы на предметных стеклах микроскопа. Срезы блокировали в 5%ном обезжиренном сухом молоке и инкубировали с "первой" кроличьей антисывороткой (против слитого белка GST-AF-2), разведенной в отношении 1:4000-1:8000, во влажной камере в течение ночи при 4 С. После промывания в буфере, образцы инкубировали в течение 1 ч при 23 С со свиной антисывороткой против кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированной со щелочной фосфатазой и разведенной в отношении 1:50 (Dako A/S). Иммунную реакцию визуализировали с использованием субстратов фосфатазы, как описано ранее (8). Контрольные срезы инкубировали с иммунной сывороткой,абсорбированной избытком GST-AF-2-белка, 15 или проводили все стадии инкубирования, за исключением стадии в присутствии "первого" антитела. Распределение AF в срезах гипофиза - Распределение AF в срезах человеческого гипофиза исследовали с помощью иммуногистохимического анализа (фиг.5). Во всех исследованных образцах, умеренное количество клеток в аденогипофизе было окрашено, что, очевидно, связано с тем, что иммуноокрашенный материал локализован в гранулах цитоплазмы; причем,предварительная абсорбция иммунной сыворотки с помощью избыточного количества GSTAF-2-белка приводила к отмене сигнала. В задней части гипофиза (нейрогипофиза) окрашивания не наблюдалось. Распределение иммунореактивного материала в гипофизе продемонстрировало лишь внутриклеточное распределение AF в секретирующих клетках передней доли (аденогипофиз). Белками, секретирующимися из этой доли гипофиза, являются гормоны роста, тиротропин,кортикотропин, пролактин и лютенизирующий гормон. Перенос этого гормона из внутриклеточных участков в сосудистую систему стимулируется рилизинг-факторами, продуцируемыми нейроэндокринными клетками в гипоталамусе. Пример 7. Биологическая активность рекомбинантного AF (rAF). Антисекреторная активность - Антисекреторную активность измеряли с использованием описанной ранее (9) модели кишечной петли крысы. Петлю тонкой кишки подвергали контрольному заражению 3 микрограммами холерного энтеротоксина. Перед и после заражения холерным энтеротоксином инъецировали либо различные дозы очищенного белка AF-1, либо(мг/см). Каждый AF-препарат испытывали, по крайней мере, на шести крысах. Для статистического анализа данных использовали критерий Фишера (PLSD). Биологическая активность белка rAF Биологическую активность чистого белка rAF клона-1, продуцированного в E.coli, тестировали на крысах. Способность rAF ингибировать секрецию кишечной жидкости при его внутривенном введении за 20-30 с до стимуляции тонкой кишки холерным энтеротоксином продемонстрирована на фиг. 6. У контрольных животных,которым был инъецирован лишь один буфер,инъекция холерного энтеротоксина вызывала заметную секрецию, 4129 мг жидкости на см кишки. В отличие от контрольных животных,которым был введен лишь один буфер (р 0,01,n=6), чистый rAF вызывал заметное дозозависимое ингибировние секреции жидкости,индуцированной холерным энтеротоксином. 9 нг белка клона-1 оказалось достаточным для снижения ответной реакции на 34%, а 44 нг(10-12 моль) и 220 нг давало 46%- и 78%-ное снижение реакции, соответственно. Биологическая активность рекомбинантного AF превышала активность любого известного нам энтеротоксина или нейропептида, модифицирующего транспорт электролитов. Кроме того, уровень активности человеческого rAF в крысах оказался неожиданно высоким, что, вероятно, обусловлено консервативностью структуры молекулы rAF в различных видах животных. Эта гипотеза подтверждается перекрестной реактивностью между материалами, полученными от человека и свиньи в Вестерн-блот-анализе и Нозерн-блот-анализе. Сравнивали способность 0,5 мкг rAF ингибировать кишечную секрецию при его внутривенной инъекции за 20-30 с до и через 90 мин. после заражения холерным энтеротоксином(фиг. 7). Оба режима введения давали значительное ингибирование по сравнению с контрольными животными (р 0,01, n=6). Таким образом, в отличие от натурального AF, рекомбинантный белок является также эффективным при его введении после заражения токсином,что позволяет использовать rAF для терапевтического лечения диареи. 3 мкг rAF инъецировали в петлю длиной 810 см, расположенную непосредственно возле петли, зараженной холерным энтеротоксином.rAF вводили либо за 20-30 с до, либо через 90 мин после заражения токсином. Как показано на фиг. 8, обе испытуемые группы обнаруживали значительное снижение секреции жидкости по сравнению с контролем (р 0,01, n=6); тогда как между этими двумя испытуемыми группами какого-либо отличия не наблюдалось. Эти эксперименты дают основание предположить, чтоrAF является активным после перорального введения и может быть использован в качестве добавки в корм животного, при условии, что он не вызывает серьезных побочных эффектов. В вышепривeденных примерах, rAF продуцировали в клетках XL-1 Epicurian Coli. В этих клетках большинство продуцированныхrAF распадается на более мелкие пептиды. При продуцировании rAF в клетках BL21, разлагается лишь небольшая часть rAF, тогда, как при продуцировании в клетках Тор 1, деградации вообще не наблюдается. Неожиданно было обнаружено, что биологическая активность пропорциональна степени разложения, то есть, чем больше разложение, тем выше активность. Поэтому были продуцированы различные более короткие фрагменты для оценки их возможной биологической активности. Как показано в таблице 1, эти фрагменты были протестированы путем их внутривенного введения до заражения холерным энтеротоксином способом, описанным выше для интактного rAF. Пептиды, экспрессированные клоном 2 и 3, и протестированные в количествах 0,1, 1 и 10 мкг, не давали какого-либо эффекта в отно 17 шении ответной реакции на заражения токсином. В противоположность этому, один микрограмм пептида, экспрессированного RACEфрагментом (клон 4), давал заметный эффект. Из этого RACE-фрагмента было получено большое количество более коротких конструкций, которые были экспрессированы в pGex-1 лямбда. Как показано в таблице 1, было установлено, что активный центр расположен между остатками 35-51. Для более точного определения активного сайта были получены три небольших пептида методом твердофазного синтеза. Два из этих пептидов, пептид 35-46 (Р 3) и пептид 35-42 (P1), были активными; при этом,последний октапептид IVCHSKTR (P1) был активным в дозе менее, чем 1 нг, то есть, он был почти таким же активным, как и интактный rAF,исходя из молярного соотношения. В противоположность этому, более короткий гексапептидVCHSKT (P2) не давал какого-либо эффекта при его тестировании в дозе, составляющей от 1 нг до 10 мкг. Пептид X1VCX2X3KX4R, соответствующий фрагменту P1 человека, но с некоторыми изменениями и/или делециями, был также продуцирован с помощью сайт-направленного мутагенеза и тестирован на биологическую активность. Было также проведено сравнение последовательностей кДНК, полученных от быка и свиньи. Эти исследования дают основания предположить о наличии следующих изменений и/или делеций:X1 = 1 или отсутствует,X2 представляет Н, R или К; Х 3 представляет S, L или другую нейтральную аминокислоту; Х 4 представляет Т или А. Код Таблица 1 Ингибирование секреED50 ции, вызванной холерпмоль ным токсином Положение пар оснований в SEQ IDNo:1, которые были экспрессированы в конструкции, полученной из кДНК AF и pGex-1-.Положения аминокислотных остатков(SEQ ID No:1) в AF в начале и в конце синтезированного пептида.Ингибирование секреции жидкости,индуцированной холерным энтеротоксином в перевязанной кишечной петле крысы; количество (пмоль), вызывающее полумаксимальное ингибирование (ED50), указано для активных пептидов.Эти пептиды продуцировали методом твердофазного синтеза. 18 Действие rAF на воспаление слизистой оболочки кишечника было также протестировано на модели кишечной петли крысы. Для этого 20 крыс заражали 0,5 мкг токсина А от Clostridium difficile (10), и воспаление и секрецию жидкости измеряли через 2,5 и 5 ч, соответственно(10 + 10) крыс. Половине крыс в каждой группе внутривенно вводили 100 нг rAF за 30 с до заражения; а другой половине вводили буфер PBS в качестве контроля. После этого, крыс забивали, петли вырезали, и среднюю 2-3 см- часть вырезанных петель замораживали на сухом льду. Затем, замороженные образцы разделяли на толстые 8 мкм-срезы с использованием криостата Leica. Срезы окрашивали для того, чтобы продемонстрировать действие щелочных фосфатаз посредством ферментной гистохимии. Щелочные фосфатазы экспрессировались кишечными эпителиальными клетками, и окрашивание позволяло провести количественную оценку и целостность кишечного эпителия. Полученные результаты (фиг.9) выявили обширное поражение кишечной слизистой оболочки у контрольных крыс: через 2,5 ч наблюдалось отделение эпителиальных клеток от базальной мембраны вместе с некротической тканью, тогда как интенсивное кровотечение наблюдалось через 5 ч. В противоположность этому, у животных, обработанных rAF, не наблюдалось отделения клеток, некроза или кровотечения. Секреция жидкости, индуцированная токсином А, была также ингибирована в пределах 1994 - 1375 мг/см через 2,5 ч (р 0,01) и в пределах 4213 - 2036 мг/см через 6 ч (5 крыс на группу, р 0,01). Аналогичный эксперимент проводили с использованием 0,5 мкг пептида IVCHSKTR (= Р 1) вместо белка rAF. Октапептид оказывал то же самое действие на кишечное воспаление и секрецию жидкости, индуцированные токсином А, как показано на фиг.9. Токсичность - Для теста на токсичностьrAF, его вводили в большой дозе, 50 мкг на 1 крысу. Во время наблюдения в течение 1 недели, какой-либо заметной токсической реакции зарегистрировано не было. Пример 8. Биологическая активность rAF по отношению к кишечной проницаемости. Для оценки действия rAF на проницаемость для органического вещества, растворенного в крови, проводили тест с использованием голубого Эванс методом, описанным ранее (11). Эксперимент проводили, как описано выше в примере 7 и фиг.5 путем введения внутривенной инъекции rAF перед заражением холерным энтеротоксином. Секреция жидкости не была измерена, но тем не менее, через 90 мин после заражения токсином внутривенно вводили 1 мл 1,5 % раствора голубого Эванса в PBS. Этот краситель попадал в кровоток в течение 5 мин. После этого, крысу подвергали транскардиальной перфузии через левый желудочек правое предсердие (с помощью перистальтического насоса [Cole Parmer Instruments, Chicago, I11.,USA]) с использованием 200 мл раствора (4 С) Олсвера в PBS (отношение 1/1) в течение примерно 150 с при эфирной анестезии. Эта процедура была предпринята для удаления всего ЕВ(голубого Эванс), присутствующего в сосудистой системе, с сохранением лишь ЕВ в интерстициальной ткани для проведения детекции посредством формамидной экстракции красителя. Результаты, представленные в таблице 2,указывают на то, что заражение холерным энтеротоксином значительно (р 0,001) увеличивает количество ЕВ, которое может быть экстрагировано из кишечной ткани (примерно 43%), в то время как внутривенная инъекция 1 ВrТ перед заражением холерным энтеротоксином предупреждает это увеличение, то есть, количество ЕВ, экстрагированого из ткани в группе 1 (контрольная), не отличается от количества ЕВ в группе 3 (1 rAF + СТ). Груп па 1 2 3 Результаты, представленные на фиг. 10 и 11, демонстрируют выход азокрасителя (голубого Эванс) в тонкую кишку и в соответствующее сосудистое сплетение из боковых желудочков головного мозга после кишечного заражения холерным энтеротоксином с предварительной обработкой и без обработки крыс пептидом Р 1(IVCHSKTR). Эксперименты осуществляли следующим образом: самцов крыс Sprague-Dawley весом 350 грамм поддерживали в условиях голодания в течение 18 ч перед экспериментальной процедурой, но со свободным доступом к воде. В каждой группе было по шесть крыс. Пептид Р 1,холерный энтеротоксин (СТ), и PBS вводили,как показано в таблице 3. Группа А В С Внутривенное введение 1 (P1 iv) проводили в объеме 2 мл PBS, пероральное введение проводили в объеме 5 мл, а внутривенное введение 2 проводили с использованием 1,5 мл 3% голубого Эванса, растворенного в PBS. Для анестезии во время осуществления всех инъекций был использован эфир. Внутривенную инъекцию Р 1 (0,5 мкг) илиPBS проводили в течение за 10-15 с до перорального заражения 100 микрограммами СТ илиPBS; через 60 мин после перорального заражения; затем крыс анестезировали эфиром и внут 20 ривенно вводили голубой Эванс. Для уравновешивания краситель вводили еще через 30 мин, а затем, крыс снова анестезировали эфиром, и посредством интракардиальной перфузии через левый желудочек вводили 250 мл раствора Олсвера в PBS (50/50) для удаления всего красителя, присутствующего в сосудистой системе. После этой перфузионной обработки, осуществленной в течение примерно 2-3 мин, проводили флуоресцентный анализ, который указывал на то, что краситель присутствовал лишь вне сосудистой системы. Головной мозг и часть тонкой кишки были отобраны и заморожены на сухом льду, а затем были получены криостатные срезы толщиной 8 мкм. Эти срезы сушили воздухом и помещали в заливочную среду, содержащую ксилол. Срезы анализировали под флуоресцентным микроскопом Zeiss с использованием комбинации фильтров, идентичной той, что была использована для флуоресценции, испускаемой родамином. Результаты, представленные на фиг.10 и 11, показали, что интенсивность флуоресценции(белый цвет) имеет одинаковую величину как в тонкой кишке (фиг.10), так и в сосудистом сплетении (фиг. 11) для группы A (P1 iv + СТ ро) и С (PBS iv + PBS ро). По сравнению с высокой интенсивностью флуоресценции в тонком кишечнике, а также в сосудистом сплетении в группе В (PBS iv + СТ ро), полученные результаты явно показали, что инъекция октапептида,введенная до заражения токсином, ингибирует СТ-индуцированную сосудистую проницаемость для голубого Эванс. Эти результаты дают основание предположить, что такой вывод справедлив не только в отношении сосудистой системы тонкого кишечника, но также и для сосудистого сплетения бокового желудочка головного мозга. В заключение следует отметить, что внутривенное введение октапептида IVCHSKTR приводит к ингибированию индуцированного холерным эндотоксином экстраваскулярного проникновения голубого Эванс в тонкую кишку, а также в сосудистое сплетение центральной нервной системы. Таким образом, действие rAF и его пептидных производных не ограничивается лишь тонким кишечником, а также распространяется на кровеносные сосуды центральной нервной системы. Этот факт свидетельствует о том, что rAF и его пептидные производные могут быть использованы для нормализации аномального внутричерепного давления, изменения давления в среднем ухе и различных форм изменения проницаемости кровеносных сосудов.Scand J Gastroenterol 1994, 29:38 - 46. Описание рисунков Фиг. 1 а и его продолжение 1b. Нуклеиновокислотная последовательность и выведенная аминокислотная последовательность нового белка человека. Подтвержденная аминокислотная последовательность подчеркнута. Фиг. 1 с. Горизонтальная карта, иллюстрирующая клонированную кДНК и олигонуклeотидные праймеры. Фиг. 2. ДНС-полиакриламидный минигель,окрашенный кумасси бриллиантовым голубым(А), и иммуноблот, зондированный с использованием антисыворотки против свиного AF (В). Дорожки, обозначенные цифрами без дефисов,содержат глутатион-агароза-очищенные GSTAF слитые белки AF-1, AF-2 и AF-3, а линии,обозначенные цифрами с дефисами, содержат слитые белки, расщепленные тромбином. Эталонные молекулярные массы (R), (BDH), указаны слева. Слитый белок GST-AF-1 подвержен высокой степени разложения, однако, иммуноблот-анализ выявил лишь полноразмерный белок и продукт спонтанного расщепления тромбином. В белке GST-AF-3 был обнаружен 26 кДапродукт, который, вероятно, является глутатином-3-трансферазным "хвостом", который был экспрессирован независимо. Фиг. 3 а. Вестерн-блот-анализ с использованием антисыворотки против рекомбинантного белка AF-2. Слева - свиной (Р) и три человеческих (H1, H2, Н 3) гипофиза; справа - три рекомбинантных белка AF-1, AF-2 и AF-3 (см. фиг. 2); а в центре - стандартная молекулярная масса(R). Фиг. 3b. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) rAF с использованием неочищенной антисыворотки и аффинноочищенных антител, продуцированных в кроликах. 22 Фиг. 4. Авторадиограмма Нозерн-блотов РНК, выделенной из гипофиза человека и свиньи (р = пул, a i = индивидуальный материал). В каждую лунку было введено 5 мкг очищенной мРНК; были использованы 3'-концевые 32 Рмеченные олигонуклеотидные зонды; авторадиограмму проявляли через 7 дней. Фиг. 5. Криосрезы аденогипофиза, окрашенного антисывороткой против рекомбинантного белка GST-AF-2. А. Срезы, инкубированные с иммунной сывороткой; указаны отдельные клетки с различной степенью позитивной иммунореактивности (заштрихованные стрелки). Многие клетки были совершенно неокрашенными (незаштрихованные стрелки). В. Серийные срезы для А, инкубированных с иммунной сывороткой, предварительно абсорбированной избыточным количеством рекомбинантного белка GST-AF-2. Специфического окрашивания клеток не наблюдалось. С и D. Более увеличенное изображение иммунопозитивных клеток,демонстрирующее цитоплазматическое окрашивание эндокринных клеток; n = ядро, с = цитоплазма. Фиг. 6. Тест на биологическую активность рекомбинантного белка AF-1, направленную на ингибирование индуцированной холерным энтеротоксином секреции жидкости. Возрастающие дозы белка инъецировали крысам внутривенно; 3 мкг холерного энтеротоксина инъецировали в кишечную петлю; через 5 ч измеряли количество жидкости, аккумулированной в петле (мг/см кишки). Каждое значение представляло собой среднюю величину + ср.кв.ош. для группы из шести животных. Фиг. 7. Биологическая активность внутривенно инъецированного rAF; 0,5 мкг rAF вводили за 20-30 сек. или через 90 мин. после введения 3 мкг холерного энтеротоксина в кишечную петлю крысы. Фиг. 8. Биологическая активность внутривенно инъецированного rAF; 3 мкг rAF вводили за 20-30 с или через 90 мин после введения 3 мкг холерного энтеротоксина в кишечную петлю крысы; rAF инъецировали в область, находящуюся примерно в 5 см от петли, в которую был инъецирован энтеротоксин. Фиг. 9. А (х 2,5) контрольные (PBS) петли,где в кишечной полости (L) виден клеточный дебрис, однако, остальная слизистая оболочка осталась неокрашенной, что позволяет предположить о полной деструкции эпителиальной выстилки. В (0,5 мкл Р 1 до заражения токсином): явно видно четкое изображение эпителиальной выстилки, образующей ворсинки,что позволяет видеть трансформированную и нормальную слизистую оболочку кишки. L = кишечная полость. Линии = 500 мкм. С (х 10): показана поврежденная слизистая оболочка РВS-обработанной контрольной группы; и D: показана соответствующая слизистая экспериментальной (P1-обработанной) группы. Черная 23 стрелка указывает на эпителиальную выстилку,LP = собственная пластинка слизистой оболочки, mm = мышечная слизистая оболочка; незаштриховання стрелка указывает на клетки крипта. Линии = 100 мкм. Е (х 25): показана поврежденная слизистая оболочка контрольной (РВSобработанной) группы, и F: показана соответствующая увеличенная слизистая крыс, подвергнутых P1-обработке до заражения токсином. Линии = 50 мкм. Фиг. 10. Флуоресценция голубого Эванс в образцах тощей кишки, взятых от трех групп крыс, обработанных холерным энтеротоксином(СТ) или контрольным буфером (PBS); предварительную обработку проводили антисекреторным пептидом Р 1 или контрольным буфером(PBS). LP = собственная пластинка слизистой оболочки. Черная стрелка указывает на выстилку эпителиальных клеток; незаштрихованная стрелка указывает на клетки крипта. Линии = 100 мкм. Фиг. 11. Флуоресценция голубого Эванс в образцах сосудистого сплетения, взятых от крыс, и показанных на фиг. 10. Линии = 50 мкм. Список последовательностейSEQ ID No:1: Тип последовательности: нуклеотидная с соответствующей аминокислотной последовательностью Длина последовательности: 1309 пар оснований + poly(А)-хвост Цепочечность: одноцепочечная Топология: линейная Тип молекулы: кДНК Организм-источник: человек Промежуточный экспериментальный источник: гипофиз Отличительные признаки: от 63 до 1208 п.о. зрелого белка от 1289 до 1295 п.о. poly(А)сигнальной последовательности. 25 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантный антисекреторный фактор, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No:1, или его гомолог, обладающий, по существу, аналогичной биологической активностью. 2. Фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1, содержащий, по крайней мере, 7-8 аминокислот и обладающий, по существу, аналогичной биологической активностью. 3. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-42 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1. 4. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-46 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1. 5. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-51 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1. 6. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 35-80 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1. 7. Фрагмент по п.2, состоящий из аминокислот N 1-80 аминокислотной последовательности рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1. 8. Пептид, соответствующий фрагменту рекомбинантного антисекреторного фактора по п.3 и имеющий аминокислотную последовательность:X1 отсутствует или представляет собой Ilе,Х 2 представляет собой His, Arg или Lys,Х 3 представляет собой Ser, Leu или другую нейтральную аминокислоту, а Х 4 представляет собой Thr или Аlа. 9. Композиция для нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций у животного, в том числе человека, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество рекомбинантного антисекреторного фактора или его гомолога по п.1 или его фрагмента по пп.2-7. 10. Применение рекомбинантного антисекреторного фактора по п.1 для приготовления композиции по п.9. 11. Применение рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7 для приготовления композиции по п.9. 12. Способ нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций в организме позвоночного, в том числе человека, заключающийся в том, что животному, в том числе человеку, вводят эффективное количество рекомбинантного анти 001201 26 секреторного фактора или его гомолога по п.1 или его фрагмента по любому из пп.2-7. 13. Пищевой продукт для нормализации патологического транспорта жидкости и/или подавления воспалительных реакций в организме позвоночного, в том числе человека, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п.1 или его фрагмент по любому из пп.2-7. 14. Поликлональное антитело, специфичное к рекомбинантному антисекреторному фактору или его гомологу по п.1 или его фрагменту по любому из пп.2-7. 15. Применение антитела по п.14 для обнаружения антисекреторного фактора или его гомолога по п.1 или его фрагмента по любому из пп.2-7 в организме позвоночного, в том числе человека. 16. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п.1. 17. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7. 18. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п.16 для получения рекомбинантного антисекреторного фактора или его гомолога по п.1. 19. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п.17 для получения фрагмента рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7. 20. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п.16 для получения зонда или праймера для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антисекреторный фактор или его гомолог по п.1, в организме позвоночного, в том числе человека. 21. Применение последовательности нуклеиновой кислоты по п.17 для получения зонда или праймера для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антисекреторного фактора по любому из пп.2-7. 22. Вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.16 или п.17. 23. Штамм прокариотических клеток,трансформированных вектором по п.20. 24. Штамм эукариотических клеток, за исключением клеток человека, трансформированных вектором по п.20. 25. Штамм прокариотических клеток, способных продуцировать рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п.1 или фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7. 26. Штамм эукариотических клеток, за исключением клеток человека, способных продуцировать рекомбинантный антисекреторный фактор или его гомолог по п.1 или фрагмент рекомбинантного антисекреторного фактора по любому из пп.2-7.