Способ диагностирования болезни альцгеймера, нейродегенерации при синдроме дауна или легкого когнитивного нарушения у субъекта (варианты) и набор для осуществления способа

СПОСОБ ДИАГНОСТИРОВАНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА,НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ ПРИ СИНДРОМЕ ДАУНА ИЛИ ЛЕГКОГО КОГНИТИВНОГО НАРУШЕНИЯ У СУБЪЕКТА (ВАРИАНТЫ) И НАБОР ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА Приведено описание способов диагностирования нейродегенеративного заболевания, такого как болезнь Альцгеймера, легкое когнитивное нарушение и нейродегенерация при синдроме Дауна, с использованием глутаминилциклазы в качестве диагностического/прогностического индикатора. Кроме того, описан набор для осуществления этих диагностических способов. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования, диагностирования и прогностирования нейродегенеративного заболевания, такого как болезнь Альцгеймера (AD), легкое (умеренное) когнитивное нарушение (MCI) и нейродегенерация при синдроме Дауна (NDS), с использованием глутаминилциклазы (QC) в качестве диагностического/прогностического индикатора. Предпосылки создания изобретения Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой нейродегенеративное заболевание, которое приводит к деменции. Понятия "болезнь Альцгеймера" и "альцгеймеровская болезнь", оба, используются в данной области, они являются эквивалентными и их применяют взаимозаменяемо в настоящем описании и в других местах. Период от первого выявления AD до конца жизни составляет от нескольких лет до 15 лет, во время которого у пациента происходит прогрессивное развитие потери как умственной функции, так и способности контролировать функции организма. Для прогрессирования заболевания характерна существенная вариабельность. В то время как у большинства пациентов наблюдается постепенное постоянное прогрессирование заболевания (снижение оценки психического статуса ежегодно в среднем на 3-4 балла по 30-балльной краткой шкале оценки психического статуса Фольштейна), примерно для 30% страдающих AD пациентов характерно наличие пролонгированной начальной фазы плато, которая продолжается в течение нескольких лет (Haxby J.V. et al., Individual trajectories of cognitive decline inpatients with dementia of the Alzheimer type, J. Clin. Exp. Neuropsychol, 14, 1992, p. 575-592). Для определенной подгруппы пациентов характерно взрывообразное быстро прогрессирующее ухудшение, приводящее к смерти в течение нескольких лет (Mann U. et al., Heterogeneity in Alzheimer's disease: Progressionrate segregated by distinct neuropsychological and cerebral metabolic profiles, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry,55, 1992, p. 956-959). У других пациентов (примерно 10% популяции) сохраняется медленно прогрессирующее течение заболевания, характеризующееся лишь постепенным ухудшением от года к году (GrossiD. et al., Senile dementias, II International Symposium, Paris: John Libbey Eurotext, 1988, p. 97-99.). Патологическая, химическая и молекулярная основа этой гетерогенности остается неясной. Распознавание вариабельности в прогрессировании заболевания AD является важной клинической оценкой и может объяснять трудности, связанные с диагностикой при "нетипичных" случаях. Хотя в определенных случаях встречаются семейные проявления AD, вероятно, в большинстве случаев AD не является семейной, и до настоящего времени (см. ниже) не выявлено простого биологического маркера этой болезни. Существующие в настоящее время методы, применяемые для диагностирования AD, основаны на анализе спинномозговой жидкости (СМЖ) или ткани головного мозга, полученной после смерти пациентов. Так, среди существующих в настоящее время маркеров следует отметить маркеры, относящиеся к белкам, которым присущи особенности, обнаруженные в головном мозге страдающих болезнью Альцгеймера пациентов после их смерти. Нейрофибриллярные сплетения в основном состоят из гиперфосфорилированного тау-белка, т.е. белка цитоскелета. Нейритная бляшка содержит коровый амилоидный белок, большая часть которого представлена состоящим из 42 аминокислот пептидом (А 42), полученным в результате протеолитического расщепления более крупного белка-предшественника. Другая форма этого белка, полученная из этого же белка-предшественника, содержит только 40 аминокислот (А 40). Отложения этого белка обнаружены в головном мозге пораженных AD пациентов. Однако изменения тау- и вышеописанных амилоидных бета-пептидов встречаются недостаточно часто, и их уровень недостаточен для диагностики, и поэтому результаты анализа крови в отношении этих белков, по-видимому, недостаточно точно коррелируют с AD. Помимо А-пептидов, характеризующихся вариабельным С-концом, часто встречаются модифицированные на N-конце А-пептиды (Saido Т.С. et al., Dominant and differential deposition of distinctN-концевому укорочению, затрагивающему две аминокислоты, в результате чего становится доступным глутаматный остаток, который затем циклизуется с формированием пироглутамата (рЕ), что приводит к образованию пептидов А 3(рЕ)-42 (Saido Т.С. et al. Dominant and differential deposition of distinct betaamyloid peptide species, A N3(pE), in senile plaques. Neuron 14, 1995, p. 457-466; Saido T.C., Yamao H.,Iwatsubo Т. и Kawashima S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited inhuman brain. Neurosci. Lett. 215, 1996, p. 173-176). В альтернативном варианте рЕ может формироваться в результате '-расщепления с помощью ВАСЕ 1, что приводит к образованию А N11(рЕ)-42 (Naslund, J.Abeta species in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 112, 2006, p. 163-174). В частности, установлено, что А N3(pE)-42 является основным компонентом отложений А при спорадической и семейной болезни Альцгеймера (Saido Т.С. et al., Dominant and differential deposition of distinctheterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 1996, p. 173-176), и, как установлено в ряде исследований, они могут играть основную роль в патогенезе AD. Например, продемонстрирована нейротоксичность пептидов А N3pE-42 (Russo С. et al., Pyroglutamate-modified amyloidbeta-peptides-AbetaN3(pE)-strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 2002,p. 1480-1489) и установлен тот факт, что рЕ-модификация укороченных на N-конце А-пептидов обусловливает устойчивость к расщеплению большинством аминопептидаз, а также к действию Арасщепляющих эндопептидаз (Russo С. et al., Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides-AbetaN3(pE)strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 2002, cc, 1480-1489; Saido T.C.Alzheimer's disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19,1998, p. 69-75). Циклизация глутаминовой кислоты с образованием рЕ приводит к потере N-концевого заряда, что обусловливает усиленную агрегацию А N3pE по сравнению с немодифицированными А-пептидами (Не W. и Barrow C.J., The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senilepeptides (in vitro). Biochemistry, 45, 2006, p. 12393-12399). Таким образом, снижение образования А N3pE-42 должно дестабилизировать пептиды, делая их более чувствительными к расщеплению, и это,в свою очередь, предупреждает формирование более высокомолекулярных агрегатов А и повышает продолжительность существования нейронов Однако уже в течение продолжительного времени не удается выяснить, как происходит рЕмодификация А-пептидов. При создании настоящего изобретения было установлено, что глутаминилциклаза (QC) обладает способностью катализировать образование А N3pE-42 в мягких кислотных условиях, и что специфические ингибиторы QC предупреждают формирование А N3pE-42 in vitro и поэтому ингибирование глутаминилциклазы представляет собой новую терапевтическую концепцию лечения причин, вызывающих болезнь Альцгеймера (Schilling S., Hoffmann Т., Manhart S., Hoffmann M. и Demuthcyclase - a novel therapeutic concept for the causative treatment of Alzheimer's disease. Nature Medicine 14,2008, p. 1106-1111). В настоящее время, по-видимому, отсутствует удовлетворительный диагностический маркер для выявления наличия AD или для выявления индивидуума, у которого, хотя и обнаружены нормальные когнитивные ответы, тем не менее, должна неминуемо или с большой долей вероятности развиться AD. Ассоциированное с возрастом когнитивное хроническое прогрессирующее заболевание (AACD) и легкого когнитивное нарушение (MCI) представляют собой понятия, применяемые для идентификации индивидуумов, которые ощущают ухудшение когнитивной способности, что вскоре приводит к деменции. Эти понятия являются эквивалентными, MCI является в настоящее время в большей степени принятым понятием, и их применяют взаимозаменяемо в настоящем описании. Согласно критериям (Всемирная организация здравоохранения) для установления диагноза требуется регистрация самим индивидуумом или членами его семьи снижения когнитивной функции, которое является постепенным и имеет место по меньшей мере в течение 6 месяцев. Могут существовать трудности с любыми областями познания(хотя ухудшение памяти имеет место в огромном большинстве случаев), и они должны подтверждаться наличием патологической характеристики при количественных оценках когнитивной способности относительно данных, доступных для здоровых индивидуумов соответствующего возраста и уровня образования (т.е. пациента сравнивают со здоровыми индивидуумами такого же возраста). В таких тестах характеристика должна находиться на уровне, который по меньшей мере на 1 единицу SD (старческая деменция) ниже среднего значения для соответствующей популяции. Может иметь место ситуация, когда не обнаружена ни деменция, или выраженная депрессия, ни реакция на лекарственные средства. Может не присутствовать ни церебральное, ни системное заболевание или состояние, для которых известно, что они вызывают церебральную когнитивную дисфункцию. В экспериментах, проведенных при создании настоящего изобретения, все пациенты, которых классифицировали как CDR.5 ("находящаяся под вопросом деменция" по клинической рейтинговой шкале деменции, и которые подпадали под указанные исключения, также рассматривались как удовлетворяющие критериям AACD/MCI. Примерно у 1/3 страдающих болезнью Альцгеймера пациентов выявлен четко выраженный обособленный период ухудшения памяти, который предшествовал более глобальному ухудшению умственных способностей. (Haxby J.V.Neuropsychology 14, 1992, p. 575-592.) При использовании критериев AACD/MCI, в которых рассматриваются другие области помимо ухудшения памяти, процент идентифицируемых предвестников болезни,вероятно, является более высоким. К счастью, не у всех индивидуумов с AACD/MCI происходит прогрессирование заболевания. При тестировании установлено, что у значительного числа индивидуумов имеет место стабильные не прогрессирующие расстройства памяти. Попытки прогнозировать начало AD, MCI или NDS или осуществлять мониторинг их развития предпринимались с ограниченным успехом. При создании настоящего изобретения было установлено,что количество QC в биологическом образце, полученном из организма индивидуума, которое отклоняется от эталонного количества у контрольного индивидуума, может положительно коррелировать со статусом неврологического заболевания. Таким образом, корреляция присутствия QC со статусом заболевания представляет собой положительный и более прямой тест, предназначенный для диагностирования пациента, страдающего одним из описанных выше нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, в изобретении предложен легко выполнимый тест, проводимый с использованием биологического образца, который предназначен для прогнозирования, диагностирования и прогностирования AD, MCI и NDS с применением QC в качестве диагностического маркера. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение основано на открытие того факта, что количество глутаминилциклазы (QC) в биологическом образце, полученном из организма пациента, страдающего AD или MCI, повышено по сравнению с количеством QC в биологическом образце, полученном из организма обычного (т.е. здорового) контрольного индивидуума. Установление того факта, что количество QC отличается при этих неврологических заболеваниях от количества в образцах из организма здоровых контрольных индивидуумов, является основой для разработки теста, предназначенного для диагностирования AD, MCI или NDS у индивидуума. Таким образом, способы диагностирования AD, MCI или NDS, предлагаемые в настоящем изобретении, которые заключаются в оценке количества QC в образце из организма пациента, представляют собой значительное усовершенствование современной клинической диагностической оценки пациентов, страдающих указанными нейродегенеративными заболеваниями. Основываясь на установленных при создании изобретения различиях в количестве QC, которое присутствует в биологическом образце, полученном из организма пациента, по сравнению с количеством, обнаруженным в образце из организма здоровых контрольных индивидуумов, можно сделать заключение о выраженной корреляции между количеством QC и вероятностью диагностирования нейродегенеративного заболевания. Статистически значимое повышение количества QC относительно контрольных образцов с большей долей вероятности позволяет предположить, что пациент страдает AD, NDS или MCI. Нормальное количество QC, которое определяют как количество QC, характерное для QC в контрольном образце, выделенном из здоровой популяции соответствующего возраста, свидетельствует о том, что у пациента нет нейродегенеративного заболевания, такого как AD, MCI или NDS. Положительный признак наличия нейродегенеративного заболевания,основанный на выявленном повышенном или пониженном количестве QC в биологическом образце относительно контрольного образца, полученного из здоровых индивидуумов, как правило, рассматривают в сочетании с другими факторами для окончательного определения конкретного заболевания. Таким образом, повышенные или пониженные уровни QC у тестируемого индивидуума следует обычно рассматривать в сочетании с другими признанными клиническими симптомами AD-, MCI- или NDS-связанных состояний для получения окончательного диагноза нейродегенеративного заболевания. Таким образом, первым объектом данного изобретения является способ диагностирования болезни Альцгеймера (AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения(MCI) у субъекта, включающий определение количества глутаминилциклазы (QC) или ее изоформы в образце мозга или спинномозговой жидкости (СМЖ), полученного от указанного субъекта; и сравнение установленного количества QC в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством QC, характерным для контрольной группы; где повышение по меньшей мере на 10% количества QC в тестируемом образце мозга или СМЖ относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия AD, NDS или MCI. Кроме того, в данном изобретении описан способ диагностирования болезни Альцгеймера (AD),нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения (MCI) у субъекта,включающий определение количества глутаминилциклазы (QC) или ее изоформы в образце мозга или СМЖ, полученного от указанного субъекта; и дополнительное определение количества А N3pE-X в данном образце, где X обозначает целое число, выбранное из 38, 40 и 42; сравнение установленного количества QC и А N3pE-X в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством QC и А N3pE-X,характерным для контрольной группы; где повышение по меньшей мере на 10% количества QC и АN3pE-X в тестируемом образце мозга или СМЖ относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия AD, NDS или MCI. И, наконец, третьим объектом данного изобретения является способ диагностирования болезни Альцгеймера (AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения(MCI) у субъекта, включающий определение количества глутаминилциклазы (QC) или ее изоформы в образце мозга или СМЖ, полученном от указанного субъекта; и дополнительное определение количество хемокина, где хемокин выбирают из CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 и фракталкина; сравнение установленного количества QC и хемокина в вышеуказанном образце мозга или СМЖ с количеством QC и хемокина, характерным для контрольной группы; повышение по меньшей мере на 10% количества QC и хемокина в тестируемом образце относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия AD, NDS или MCI. В предпочтительном варианте осуществления заявленных изобретений QC представляет собой человеческую QC или ее изоформу, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, в наиболее предпочтительном человеческая QC имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. При этом количество QC можно определять иммунотурбидиметрическим анализом, иммунофлуоресцентным анализом, иммунодиффузионным анализом, твердофазным иммуноферментным анализом(ELISA), радиоиммуноанализом (РИА), вестерн-блоттингом, анализом активности белка, нозернблоттингом, ПЦР, жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР), масс-спектрометрией(МС), газовой хроматографией (ГХ), газовой хроматографией-масс-спектрометрией (ГХ-МС), жидкостной хроматографией - масс-спектрометрией (ЖХ-МС) и жидкостной хроматографией-тандемной массспектрометрией (ЖХ-МС/МС). Причем в одном из предпочтительных вариантов осуществления заявленных способов ее количество определяют с помощью антитела, которое специфически связывается сQC или ее изоформой, или путем измерения ферментативной активности QC или ее изоформы, или на основе уровня мРНК QC или ее изоформы. При определении количества А N3pE-X в образце X может быть равно 42, или 40, или же 38. Возможен вариант осуществления заявленных изобретений, когда комбинацию А N3pE-42, и/или А N3pE-40, и/или А N3pE-38 определяют одновременно с QC. В случае предпочтительного осуществления способа дополнительно определяемый хемокин представляет собой CCL2. Четвертым объектом данного изобретения является способ диагностирования болезни Альцгеймера(AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения (MCI) у субъекта, который включает биологический образец мозга или СМЖ указанного субъекта; приводят в контакт биологический образец с антителом, которое связывается с глутаминилциклазой (QC) или ее изоформой; определяют количество образовавшегося иммунного комплекса в качестве показателя количества QC в биологическом образце и сравнивают установленное количество в вышеуказанном образце с количеством QC, характерным для контрольной группы субъектов; повышение по меньшей мере на 10% количества QC в тестируемом образце относительно контрольной группы является положительным индикатором наличия AD, NDS или MCI. И, наконец, для осуществления последнего способа заявлен набор, предназначенный для диагностирования болезни Альцгеймера (AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения (MCI), который включает антитело, связывающееся с QC или его изоформой, и принятый стандарт количества QC, характерного для контрольной группы. Краткое описание чертежей На чертежах показано следующее. На фиг. 1 а) показаны результаты анализа уровней транскриптов QC, полученные с помощью количественной ОТ-ПЦР. Общую РНК выделяли из образцов человеческой новой коры головного мозга (неокортекс) (область 22 по Бродманну) из здоровых престарелых индивидуумов и из головного мозга ADпациентов с различными указанными стадиями (этапами) заболевания по Брааку. Уровень транскриптовQC стандартизовали относительно концентрации гена "домашнего хозяйства". На фиг. 1 б) показаны результаты анализа QC, полученные методом вестерн-блоттинга, из тех же вариантов и областей головного мозга, которые использовались для анализа мРНК QC. Количество экстрагированного растворимого белка стандартизовали относительно массы ткани. На фиг. 1 в) показаны результаты количественной оценки концентраций А N3(pE)-42 (обозначен как А 3(pE)-42) и А 1-42 (А 1-42) из тех же вариантов и областей головного мозга, полученные с помощьюELISA при анализе экстрактов, которые получали с использованием ДСН и муравьиной кислоты, образцов человеческого неокортекса. Обнаружено значительное повышение концентраций пептида AN3(pE)-42 на ранних стадиях AD по сравнению с существенно более умеренным повышением концентраций пептидов А 1-42. На фиг. 1 г) показаны результаты выявления методом иммуногистохимии общего содержания А-пептидов с помощью антитела 4G8 и А N3(рЕ)-42-пептидов в области 22 по Бродманну в образцах из организма здоровых престарелых индивидуумов и страдающих разными стадиями AD индивидуумов. В образцах из организма здоровых престарелых индивидуумов обнаружены редкие А-бляшки, но в этих отложениях отсутствовала иммунореактивность в отношении А N3(pE)-42. Однако при всех стадиях На фиг. 2 приведены результаты определения уровня генной экспрессии QC и CCL2 в стимулированных ТНР-1-клетках. На фиг. 3 приведены - результаты определения удельной активности QC в кондиционированной среде ТНР-1-клеток. Последовательности амилоидных пептидов и хемокинов Описание вариантов осуществления изобретения Настоящее изобретение относится к эффективному и быстрому способу диагностирования in vitro нейродегенеративного заболевания путем непосредственного определения количества QC в биологическом образце, взятом из организма пациента, и сравнения установленного количества QC с количествомQC, характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов. Повышенный уровень QC, выявленный в биологическом образце, взятом из организма индивидуума, является положительным индикатором AD или MCI, или NDS. Таким образом, в настоящем изобретении продемонстрировано, что уровень QC последовательно и значительно повышен в биологических образцах, взятых из организма страдающих AD, NDS или MCI пациентов, по сравнению с контрольным образцом, взятом из организма здоровых индивидуумов. Таким образом, способы диагностирования AD, MCI или NDS,предлагаемые в настоящем изобретении, заключающиеся в оценке количества QC в образце, взятом из организма пациента, представляют собой значительное усовершенствование современной клинической диагностической оценки пациентов, страдающих указанными нейродегенеративными заболеваниями. Таким образом, в изобретении предложен способ решения вопроса, может или индивидуум страдать AD, MCI или NDS, с использованием QC в качестве биологического маркера. Глутаминилциклаза или глутаминил-пептидциклотрансфераза (QC, КФ 2.3.2.5) катализирует внутримолекулярную циклизацию N-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, pGlu) и выделением в свободном состоянии аммиака и внутримолекулярную циклизацию N-концевых остатков глугамата с образованием пироглутаминовой кислоты и выделением в свободном состоянии воды.QC впервые была выделена Мессером (Messer) из латекса тропического растения Carica papaya в 1963 г. (Messer M., Nature, 4874, 1963, p. 1299). Спустя 24 года соответствующая ферментативная активность была обнаружена в гипофизе животных (Busby W.H.J. et al., J. Biol. Chem. 262, 1987, p. 8532-8536;Fischer W.Н. и Spiess J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1987, p. 3628-3632). Для QC млекопитающих превращение Gln в pGlu с помощью QC было обнаружено для предшественников TRH (тиреолиберин) иGnRH (гонадолиберин) (Busby W.H.J. et al., J. Biol. Chem. 262, 1987, p. 8532-8536; Fischer W.H. и Spiess J.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1987, p. 3628-3632). Кроме того, предварительные эксперименты по выявлению локализации QC позволили выявить ее совместную локализацию с предполагаемыми продуктами катализа в бычьем гипофизе, что является дополнительным доказательством ее функции в синтезе пептидных гормонов (Bockers Т.М. et al., J. Neuroendocrinol. 7, 1995, p. 445-453). В противоположность этому физиологическая функция растительной QC все еще остается неясной. Предполагается, что фермент из С.papaya играет роль в защите растений от патогенных микроорганизмов (El Moussaoui А. et al., CellMol. Life Sci. 58, 2001, p. 556-570). В настоящее время на основе сравнительного анализа последовательностей были выявлены предполагаемые QC из других растений (Dahl S.W. et al., Protein Expr. Purif, 20,2000, p. 27-36). Однако физиологическая функция этих ферментов все еще остается неясной. Известные выделенные из растений и животных QC обладают строгой специфичностью в отношении L-глутамина в N-концевом положении субстратов, и было установлено, что их кинетические характеристики описываются уравнением Михаэлиса-Ментена (Pohl Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,1991, p. 10059-10063; Consalvo A.P. et al., Anal. Biochem. 175, 1988, p. 131-138; Gololobov M.Y. et al., Biol.Chem. Hoppe Seyler, 377, 1996, p. 395-398). Однако сравнение первичной структуры QC из С.papaya и высококонсервативных QC млекопитающих не выявило никакой гомологии последовательностей(Dahl S.W. et al., Protein Expr. Purif, 20, 2000, p. 27-36). В то время как растительные QC, вероятно, принадлежат к новому семейству ферментов (Dahl S.W. et al., Protein Expr Purif, 20, 2000, p. 27-36), установлено, что QC млекопитающих обладают выраженной гомологией последовательностей с бактериальными аминопептидазами (Bateman R.С. et al., Biochemistry, 40, 2001, p. 11246-11250), что позволило сделать заключение о различном эволюционном происхождении QC из растений и животных. Гостранова (Gostranova) и соавторы обнаружили, что глутаминилциклазная активность является характерной особенностью спинномозговой жидкости у пациентов, страдающих рассеянным склерозом, и контрольных пациентов (Gostranova et al., Clin. Chim Acta., 389 (1-2), 2008, p. 152-159). Обнаружены различные изоформы QC, т.е. белки, подобные глутаминил-пептидциклотрансферазе(QPCTL) (WO 2008/034891). Для этих новых белков характерно выраженное сходство последовательностей с последовательностью глутаминилциклазы, например, для QPCTL из организма человека (обозначена далее как изо-QC) (GenBank, регистрационный номер NM 017659). Различные изоформы белка, такие как QC или человеческий изо-QC, можно получать также из одного гена с помощью разнообразных механизмов, включая альтернативный сплайсинг РНК, посттрансляционный протеолитический процессинг и специфический для клетки тип гликозилирования. Таким образом, понятия "глутаминилциклаза", "QC" и "изо-QC" в контексте настоящего описания относятся кQC в ее нативной форме, а также к любой из ее изоформ. Предпочтительными для применения согласно настоящему изобретению являются человеческая QC или ее изоформы, которые имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5. Более предпочтительным для применения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, является человеческий белок QPCTL, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или еще более предпочтительно в SEQ ID NO: 3. Еще более предпочтительными для применения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, являются сплайсинговые формы человеческого белка QPCTL, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. Наиболее предпочтительной для применения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении,является человеческая QC, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную вSEQ ID NO: 1. Таким образом, первым объектом изобретения является способ диагностирования вероятности наличия болезни Альцгеймера (AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения (MCI) у индивидуума, заключающийся в том, что:(а) определяют количество глутаминилциклазы (QC) или ее изоформы в биологическом образце из организма указанного индивидуума;(б) сравнивают установленное количество QC в биологическом образце с количеством QC, характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов,где повышенное количество QC в указанном биологическом образце относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличия AD, NDS или MCI. При создании настоящего изобретения было продемонстрировано, что повышенное количество QC в биологическом образце может коррелировать с повышенным количеством укороченных на N-конце и пироглутаминированных пептидов амилоида-бета, таких, например, как А N3pE-42, и/или А N3pE-40,и/или А N3pE-38. Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ диагностирования вероятности наличия болезни Альцгеймера (AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения (MCI) у индивидуума, заключающийся в том, что:(а) определяют количество глутаминилциклазы (QC) или ее изоформы в биологическом образце из организма указанного индивидуума;(б) дополнительно определяют количество А N3pE-X;(в) сравнивают установленное количество QC и А N3pE-X в биологическом образце с количествомQC и А N3pE-X, характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов,где повышенное количество QC и А N3pE-X в указанном биологическом образце относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличия AD, NDS или MCI и где X обозначает целое число, выбранное из 38, 40 и 42. В предпочтительном варианте осуществления изобретения X обозначает 42. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X обозначает 40. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения X обозначает 38. Предпочтительными являются также способы, в которых не только одну форму укороченных наN-конце и пироглутамированных пептидов амилоида бета, но и комбинацию А N3pE-42, и/или АN3pE-40, и/или А N3pE-38 выявляют в сочетании с QC. Предпочтительными являются также способы, в которых не только одну форму укороченных наN-конце и пироглутамированных пептидов амилоида бета, но и комбинацию А N3 рЕ-42, и/или АN3pE-40, и/или А N3pE-38, и/или пептидов, встречающиеся при семейных деменциях альцгеймеровского типа, таких как pGluABri или pGluADan, выявляют в сочетании с помощью QC. Понятие "pGlu-А" или "А N3pE" относится к укороченным на N-конце формам А, которые начинаются на остатке глутаминовой кислоты в положении 3 в аминокислотной последовательности А и в которых указанный остаток глутаминовой кислоты циклизован с образованием остатка пироглутаминовой кислоты. В частности, pGlu-A в контексте настоящего описания означает те фрагменты, которые участвуют в или которые ассоциированы с амилоидными патологиями, включая (но не ограничиваясь только ими) pGlu-A3-38, pGlu-А 3-40, p-Glu-A3-42. При создании настоящего изобретения продемонстрировано также, что повышенные уровни QC в биологическом образце могут коррелировать с повышенным уровнем хемокина, такого, например, какCCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 и фракталкин. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ диагностирования болезни Альцгеймера (AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения (MCI) у индивидуума, заключающийся в том, что:(а) определяют количество глутаминилциклазы (QC) или ее изоформы в биологическом образце из организма указанного индивидуума;(б) дополнительно определяют количество хемокина;(в) сравнивают установленное количество QC и хемокина в биологическом образце с количествомQC и хемокина, характерным для контрольного образца из организма здоровых индивидуумов,-7 025107 где повышенное количество QC и хемокина в указанном биологическом образце относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличияAD, NDS или MCI. В предпочтительном варианте осуществления изобретения хемокин имеет происхождение из организма млекопитающих. Более предпочтительно хемокин представляет собой человеческий хемокин. Более предпочтительно хемокин представляет собой человеческий CCL2. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения любой из указанных выше способов диагностирования болезни Альцгеймера (AD), нейродегенерации при синдроме Дауна (NDS) или легкого когнитивного нарушения (MCI) можно осуществлять также in vitro в биологическом образце из организма индивидуума. Понятие "индивидуум" относится к млекопитающему, которое поражено или может быть поражено нейродегенеративным заболеванием, таким как AD, MCI или NDS. Предпочтительно понятие "индивидуум" относится к человеку. Понятие "биологический образец" относится к любому источнику биологического материала,включая (но не ограничиваясь только ими) периферическую кровь, плазму, лимфоциты, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, эпителий, фибробласты или любой другой образец, содержащий белок QC. В предпочтительном варианте осуществления изобретения уровень QC определяют в образце общей воды, полученном из организма млекопитающего, наиболее предпочтительно человека. Понятие"общая вода организма" относится ко всем жидкостям, которые присутствуют в организме человека,включая (но не ограничиваясь только ими) кровь, лимфу, мочу и спинномозговую жидкость (СМЖ), содержащим QC. Образцом крови может служить образец плазмы или образец сыворотки или фракции,полученные из этих образцов. Образец можно обрабатывать до применения, как в случае получения плазмы из крови, разведения вязких жидкостей и т.п. Предпочтительно образец плазмы обрабатывают антикоагулянтом, таким как ЭДТК. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения количество QC определяют в образце крови, полученном из организма индивидуума, более предпочтительно в образце плазмы. Таким образом, настоящее изобретение предпочтительно относится к описанному выше способу, заключающемуся в том, что осуществляют следующие стадии: получают образец плазмы из организма индивидуума; определяют количество QC в образце плазмы; сравнивают установленное количествоQC в образце плазмы с количеством QC в контрольном образце плазмы из организма здоровых индивидуумов, где повышенное количество QC относительно контрольного образца из организма здоровых индивидуумов является положительным индикатором наличия AD, NDS или MCI. Установлено, что повышенные количества QC коррелируют с наличием AD, NDS и MCI и их можно применять для диагностирования указанных заболеваний."Повышенное количество" QC (или ее изоформы) означает, что количество QC, определенное в образцах из организма индивидуумов, выше среднего количества QC, характерного для контрольного образца из организма здорового индивидуума, с учетом диапазона ошибок эксперимента, известного специалисту в данной области. Предпочтительно количество QC, определенное в образцах из организма индивидуумов, превышает на 10% среднее количество QC, характерное для контрольного образца из организма здорового индивидуума. Более предпочтительно количество QC (или ее изоформы), определенное в образцах из организма индивидуумов, превышает на 25% или еще более предпочтительно на 50% или 75 % среднее количество QC, характерное для контрольного образца из организма здорового индивидуума. Наиболее предпочтительно количество QC (или ее изоформы), определенное в образцах из организма индивидуумов, в несколько раз превышает среднее количество QC, характерное для контрольного образца из организма здорового индивидуума, например в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз."Контрольный образец из организма здорового(ых) индивидуума(ов)" означает биологический образец такого же типа, полученный из организма индивидуума, например полученный по меньшей мере из одного здорового контрольного индивидуума соответствующего возраста или из организма пациента в более ранний момент времени. В одном из вариантов осуществления изобретения контрольный образец из организма здорового индивидуума получают из организма пациента в более ранний момент времени. Контрольный образец из здоровой популяции соответствующего возраста можно выделять из образцов требуемой популяции здоровых, имеющих соответствующий возраст контрольных индивидуумов, в семейном анамнезе которых отсутствуют AD, MCI или NDS. Например, уровень QC в плазме, более высокий, чем уровни QC в контроле, при определении в образцах соответствующей контрольной популяции определенного размера, свидетельствует о наличии AD, NDS или MCI. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что образец из организма индивидуума, подлежащего диагностированию, оценивают относительно образцов из здоровых контрольных индивидуумов соответствующего возраста и что существенное повышение или понижение количества QC в образце белков из организма индивидуума определяют на основе сравнения с контрольными образцами, применяемыми в данном анализе. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения количество QC или ее изоформы определяют на основе либо уровня белка, либо уровня мРНК указанной QC или ее изоформы. Определение или количественную оценку уровня QC в биологическом образце из организма можно осуществлять любыми методами, известными в данной области. Такие методы включают, например (но не ограничиваясь только ими), иммунотурбидиметрический анализ, анализ на основе иммунофлуоресценции, иммунодиффузии, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ(РИА), вестерн-блоттинг, анализ активности белка или для определения уровня мРНК QC нозернблоттинг или анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, ПЦР в реальном времени. Можно применять также жидкостную хроматографию высокого разрешения (ЖХВР), массспектрометрию (МС) и газовую хроматографию (ГХ), а также их различные конфигурации, включая такие системы, как газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС), жидкостная хроматографиямасс-спектрометрия (ЖХ-МС) и жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХМС/МС). Когда определение QC осуществляют методами, известными в данной области для выявления пептидов, предпочтительным является применение методов иммунологического выявления с использованием антител, фрагментов антител, рекомбинантных антител и т.п. Таким образом, такое определение QC включает (но не ограничиваясь только ими) применение антител, которые специфически связываются сQC или ее изоформами, с получением иммунного комплекса, а также реагентов, предназначенных для выявления образования иммунного комплекса. Наиболее предпочтительными методами выявления, основанными на применении одного или нескольких антител, являются иммунотурбидиметрический анализ, анализ на основе иммунофлуоресценции, иммунодиффузии, ELISA, РИА и т.п. Указанные антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Методы получения поликлональных или моноклональных антител хорошо известны в данной области. Обзор см. у Harlow иnew tool in biology and medicine. Ann. Rev. Biochem. 50, 1981, p. 657-680), обе публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки. Получение моноклональных антител описано у Kohler и Milstein(Kohler G. и Milstein С., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature,256, 1975, p. 495-497), публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки. Антитела, предлагаемые в изобретении, могут относиться к любому изотипу, например IgG или IgA, а поликлональные антитела представляют собой антитела одного изотипа или смеси изотипов. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения антитело к QC представляет собой моноклональное антитело. Хотя антитела к QC доступны от широкого разнообразия коммерческих поставщиков, антитела, предназначенные для применения в различных иммуноанализах, которые представлены в настоящем описании, можно получать стандартными методами. Кроме того, моноклональное антитело к QC обладает способностью распознавать QC в ее нативной форме, а также любую из ее изоформ. Таким образом, любое моноклональное антитело, которое специфически распознает QC, включая ее изоформы, можно применять в указанном способе для количественной оценки QC. Предпочтительными являются моноклональные антитела, которые специфически распознают QC,но дают слабую перекрестную реакцию с изоформами QC или вообще не обладают перекрестной реактивностью. В альтернативном варианте предпочтительными являются моноклональные антитела, которые специфически распознают конкретную изоформу QC, но дают слабую перекрестную реакцию с QC или вообще не обладают перекрестной реактивностью. Приемлемыми антителами к QC являются, например, антитела, которые поступают в продажу от фирмы Abnova (Тайпей-Сити, Тайвань), например мышиное поликлональное антитело (каталожныйН 00025797-В 01 Р) и кроличье поликлональное антитело (каталожныйH00025797-D01P). Приемлемым антителом к QPCTL является, например, мышиное поликлональное антитело, которое поступает в продажу от фирмы Abnova (Тайпей-Сити, Тайвань, каталожныйН 00054814-В 01 Р). Кроме того, в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, можно применять фрагменты, выведенные из этих моноклональных антител, такие как Fab, F(ab)2, ssFv (одноцепочечный фрагмент вариабельной области) и другие напоминающие антитело конструкции, которые сохраняют вариабельную область антитела, при условии, что они обладают способностью к связыванию, характерной для исходного антитела. Такие фрагменты, как правило, получают, например, путем ферментативного расщепления антител папаином, пепсином или другими протеазами. Специалисту в данной области хорошо известно, что моноклональные антитела или их фрагменты можно модифицировать с целью их различного применения. Так, антитела, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой рекомбинантные,например химерные (например, сконструированные на основе мышиной вариабельной области, ассоциированной с человеческой константной областью), гуманизированные (каркас константной области человеческого иммуноглобулина в сочетании с гипервариабельным участком антитела животного, например,полученным из мышиного антитела), и/или одноцепочечные антитела. Антитело, специфическое в отношении QC или ее изоформ, применяемое в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, можно метить с помощью соответствующей метки и идентифицировать в биологическом образце на основе присутствия метки. Метка позволяет выявлять антитело, когда оно связано с QC. Примерами меток являются (но не ограничиваясь только ими) следующие метки: радиоизотопы (например, 3 Н, 14 С, 35S, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, фосфат лантанида), люминесцентные метки, ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, бетагалактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные метки и биотинильные группы. Методы конъюгации или мечения антител, указанные выше, может легко осуществлять обычный специалист в данной области (см., например, Inman, "Methods In Enzymology", т. 34, Affinity Techniques,Enzyme Purification: часть В, под ред. Jakoby и Wichek, изд-во Academic Press, New York, 1974, с. 30 иWilchek и Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications", Anal. Biochem 171, 1988, p. 132). Для диагностических применений антитело к QC находится либо в свободном состоянии или является иммобилизованным на твердой подложке, такой как пробирка, гранула или любая другая общепринятая подложка, применяемая в данной области. Для осуществления иммобилизации применяют прямые или косвенные методы. "Прямые методы" включают пассивную адсорбцию (нековалентное связывание) или ковалентное связывание между подложкой и реагентом. Под "косвенными методами" подразумевают, что сначала к твердой подложке присоединяют антитело к реагенту, которое взаимодействует с реагентом. В косвенных методах можно применять также систему лиганд-рецептор, например молекулу,такую как витамин, связывают с реагентом и соответствующим рецептором, иммобилизованным на твердой фазе. Иллюстрацией такой системы является биотин-стрептавидин. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что иммунный комплекс образуется междуQC в биологическом образце и антителом и что любой несвязанный материал удаляют до выявления комплекса. Очевидно, что антитело, предлагаемое в изобретении, применяют для определения количества QC в биологическом образце, таком, например, как кровь, плазма, лимфоциты, спинномозговая жидкость, моча, слюна, эпителий и фибробласты. Как известно, в данной области, определение связывания указанного антитела можно осуществлять с использованием широкого разнообразия форматов иммуноанализов, включая (но не ограничиваясь только ими) иммунотурбидиметрический анализ (агглютинация), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (РИА) (см., например, "Principles and Practice of Immunoassay", под ред. Christopher P. Price и David J. Neoman, изд-во Stockton Press, New York, N.Y., 1991 и "CurrentProtocols in Molecular Biology", под ред. Ausubel et al., изд-во John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1987,обе публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). Выявление можно осуществлять с помощью колориметрических или радиоактивных методов или других общепринятых методов, известных специалисту в данной области. Другие стандартные методы, известные в данной области, описаны в"Methods in Immunodiagnosis", 2-е изд., под ред. Rose и Bigazzi, изд-во John Wiley and Sons, New York,1980 и у Campbell et al., "Methods of Immunology", изд-во W. A. Benjamin, Inc., 1964; US 4366241; 4376110; 4517288 и 4837168, описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Обзор общих методов иммуноанализов см. также в "Methods In Cell Biology", т. 37, под ред. Asai, изд-воAcademic Press, Inc. New York, 1993, "Basic And Clinical Immunology", 7-е изд., под ред. Stiles и Terr,1991). Указанные анализы, предназначенные для определения QC, могут представлять собой прямые, косвенные, конкурентные или неконкурентные иммуноанализы, известные в данной области (см., например,"Principles and Practice of Immunoassay", под ред. Christopher P. Price и David J. Neoman, изд-во StocktonWiley and Sons, New York, N.Y., 1987 и Oellirich M., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 1984, p. 895-904,которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). Неконкурентные иммуноанализы представляют собой анализы, в которых количество QC определяют непосредственно. В "сэндвич"-анализе, например, антитела к QC можно связывать прямо с твердым субстратом, на котором они иммобилизованы. Эти иммобилизованные антитела затем "захватывают"QC, которая присутствует в биологическом образце. Иммобилизованную таким путем QC затем связывают с несущим метку агентом, таким как вторичное антитело к человеческой QC, несущее метку. В конкурентом иммунном анализе количество антигена, присутствующее в биологическом образце,определяют косвенно после добавления известного количества меченого антигена в образец и определения количества меченого антигена, связанного с антителами. Например, известное количество в данном случае меченой QC добавляют в биологический образец, затем образец приводят в контакт с антителами к QC. Количество меченой QC, связанной с антителом к QC, обратно пропорционально концентрацииQC в биологическом образце. Это является результатом того, что чем большее количество меченой QC выявлено, тем меньшее количество QC в биологическом образце может конкурировать с меченой QC. Изобретение относится также к диагностическим наборам, предназначенным для осуществления анализов с целью диагностирования AD, MCI или NDS у индивидуума. Так, настоящее изобретение можно воплощать на практике с помощью диагностического набора, который включает по меньшей мере одно антитело, специфическое в отношении QC и ее изоформ, которые представлены в настоящем описании, а также любые реагенты, предназначенные для выявления иммунных комплексов, которые содержат антитело, связанное с QC. Как правило, набор может включать индивидуальное антитело, кото- 10025107 рое специфически распознает QC и ее изоформы. С одной стороны, набор может включать первичное антитело, которое специфически распознает QC и ее изоформы, а также вторичное антитело, конъюгированное с дающей сигнал меткой и обладающее способностью связываться с первичным антителом или в сайте, отличном от сайта, с которым связывается первичное антитело. Дающая сигнал метка, связанная с вторичным антителом, может представлять собой (но не ограничиваясь только ими) фермент, такой как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. Наборы могут включать также другие реагенты, предназначенные для осуществления анализа, такие как буферы, твердая подложка, растворы и т.п. Набор может содержать также инструкции по осуществлению метода с использованием одного или несколько антител для диагностических анализов. Примеры Пример 1. Образование А N3pE-42 и экспрессия QC in vivo. В головном мозге млекопитающих обнаружено широкое распространение QC, при этом значительная экспрессия выявлена в гиппокампе и коре головного мозга. Для оценки того, может ли коррелировать уровень экспрессии QC при AD с образованием А N3pE-42, анализировали уровень мРНК QC и концентрации белка в образцах новой коры головного мозга после смерти (фиг. 1 а, б). Важно отметить,что при создании изобретения обнаружена повышающая регуляция мРНК QC и белка в образцах головного мозга страдавших AD пациентов по сравнению со здоровыми престарелыми людьми. Более того,значительные концентрации А N3pE-42 обнаружены в образцах, полученных из страдавших AD пациентов, в отличие от не имеющих деменции индивидуумов, что подтверждает роль QC в образовании АN3pE-42 (фиг. 1 в). С другой стороны, ELISA-анализ позволил выявить высокие концентрации А х-42 в образцах, полученных из здоровых контрольных индивидуумов соответствующего возраста, и их существенно меньшее повышение на ранних стадиях AD (фиг. 1 в). Эти данные подтверждались результатами иммуногистохимического анализа с использованием антител, которые выявляют общий А (4G8), или специфическими для А N3pE-42 (фиг. 1 г). Заметная иммунореактивность в отношении А обнаружена в срезах головного мозга, полученных из всех групп. В отличие от этого, окрашивание в отношении АN3pE-42 отсутствовало в образцах, полученных из организма здоровых престарелых людей, но оказалось специфическим для тканей головного мозга страдавших AD пациентов, у которых уровень загрузки АN3 рЕ-42-иммунореактивным бляшками оказался практически таким же высоким, что и общая плотность А-бляшек. Материалы и методы. Человеческая ткань головного мозга. Точный диагноз AD во всех случаях, описанных в этом исследовании, базировался на присутствии нейрофибриллярных сплетений и нейритных бляшек в гиппокампальном образовании и неокортикальных областях и на соответствии критериям Национального института неврологических и коммуникативных расстройств и инсульта (National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke(NINDS и ассоциации болезни Альцгеймера и родственных нарушений (Alzheimer's Disease and RelatedDisorders Association (ADRDA. Ткань головного мозга (область 22 по Бродманну) из таких же вариантов применяли для количественной оценки концентраций мРНК QC, белка QC и А N3pE-42. В целом,анализировали 10 контрольных вариантов и 10 AD-случаев, каждый на стадиях по Брааку I-II и V-VI. Группы подбирали по полу и возрасту (контроль: в среднем 726,6 года; AD I-II: в среднем 733,1 года;AD V-VI: в среднем 776,6 года). Средний промежуток времени до взятия образца после смерти (PMI) был аналогичным для всех групп и составлял от 26 до 96 ч. Продолжительность PMI никогда не влияла ни на выявление QC с помощью анализа методом вестерн-блоттинга, ни на количественную оценку А с помощью ELISA. Для обнаружения мРНК QC с помощью кОТ-ПЦР использовали только образцы ткани,для которых PMI составлял менее 48 ч. Количественная оценка мРНК и QC методом вестерн-блоттинга. Образцы тканей гомогенизировали с использованием гомогенизатора типа Precellys с помощью керамических гранул диаметром 1,4 мм (5000 об/мин, 30 с, фирма Peqlab). РНК выделяли с помощью набора NucleoSpin RNA II (фирма Macherey Nagel) согласно инструкциям производителя. Аликвоты по 100 нг РНК подвергали обратной транскрипции с получением кДНК с помощью произвольных праймеров(фирма Roche) и Superscript II (фирма Invitrogen). Количественную ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью устройства типа Rotorgene 3000 (фирма Corbett Research) с использованием набора для анализа QPCT QuantiTect Primer Assay (QT00013881, фирма Qiagen), а также набора QuantiTect SYBRQC, применяемой в качестве внешнего стандарта (полноразмерная QC, клонированная в вектореpcDNA3) с дублированием. Для подтверждения результатов ПЦР получали кривые плавления продукта и подтверждали строение отдельных ампликонов с помощью электрофореза на агарозном геле. Абсолютные количества определяли с использованием программы Rotorgene, версия 4.6 в режиме количественного определения. Для стандартизации использовали два наиболее стабильно экспрессируемых гена "домашнего хозяйства" HPRT и GAPDH (фирма geNorm). Для анализа методом вестерн-блоттинга образцы головного мозга (50 мг) гомогенизировали в буфере (1 мл), содержащем 10 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМNaCl, 5 мМ ЭДТК и 0,5% Тритон Х-100 и 10% глицерина. Ткань гомогенизировали путем нескольких ходов поршня в гомогенизаторе Downs и подвергали ультразвуковому шоку (310 с). Полученный гомогенат осветляли центрифугированием при 2000g в течение 25 мин. В целом 12 мкг белка из каждого образца разделяли с помощью ДСН-ПААГ в трис-глициновом буфере. QC выявляли с помощью очищенных кроличьих антител к рекомбинантной человеческой QC. Для визуализации мембраны с блотами инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (фирма Cell Signaling) вWest Pico System (фирма Pierce) согласно протоколу производителя. Пример 2. Определение уровня генной экспрессии QC и CCL2 в стимулированных клетках ТНР-1. Клетки клеточной линии человеческого моноцитарного лейкоза ТНР-1 культивировали в суспензии(5105 клеток/мл среды) в RPMI-1640 (среда Rosewell Park Memorial Institute 1640 (фирма Invitrogen,содержащей 10% FCS (=FBS, фетальная бычья сыворотка (фирма Invitrogen и 60 мкг/мл гентамицина(фирма Invitrogen) при 37 С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО 2 и 95% воздуха. Для изучения стимулирующего действия QC и CCL2 высевали 2106 клеток в 24-луночный планшет (фирма Greiner) в 1 мл культуральной среды без FCS, содержащей различные концентрации липополисахаридов (LPS; фирма Sigma). После инкубации в течение 24 ч среду удаляли из клеток центрифугированием (5 мин 300g). Выделение РНК осуществляли с помощью набора Nucleo-Spin RNA II (фирма MachereyNagel) с последующим определением концентрации РНК. С использованием набора Superscript II ReverseTranscriptase фирмы Invitrogen 1 мкг РНК транскрибировали в кДНК. Уровень генной экспрессии QC и CCL2 определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием циклера Rotor-Gene 3000. С помощью операционной программы, применяемой в методе сравнения, можно осуществлять сравнение изменения уровня генной экспрессии стимулированных зондов и нестимулрованного контроля. Для стандартизации использовали эталонный генYWHAZ (активирующий белок тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы). Результаты представлены на фиг. 2. Пример 3. Определение удельной активности QC в кондиционированной среде ТНР-1-клеток. 5106 ТНР-1-клеток высевали в 5 мл среды RPMI-1640 (фирма Invitrogen) без фенолового красного и FCS в колбы для суспензий с площадью дна 25 см 2 (фирма Greiner) и стимулировали различными концентрациями LPS (фирма Sigma). После инкубации в течение 24 ч при 37 С и в атмосфере, содержащей 5% СО 2, клетки отделяли от среды, количество которой снижали центрифугированием (4000g), используя концентраторы U-Tube 6-10 (фирма Merck, Novagen) с MWCO (номинально отсекаемая молекулярная масса) 10 кДа, до конечного объема 250 мкл. Для анализа концентрации белка использовали метод Брэдфорда. Для определения удельной активности QC применяли предназначенный для внутреннего пользования метод ЖХВР. Результаты представлены на фиг. 3. Пример 4. Определение активности QC. Флуориметрические анализы. Все измерения осуществляли с помощью устройства BioAssay Reader HTS-7000Plus для микропланшетов (фирма Perkin Elmer) при 30 С. Активность QC оценивали флуориметрически с помощью H-Gln-bNA. Образцы включали 0,2 мМ флуорогенный субстрат, 0,25 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма Unizyme, Хоршам, Дания) в 0,2 М Трис/HCl, рН 8,0, содержащем 20 мМ ЭДТК, и аликвоту,соответствующим образом разведенную QC в конечном объеме 250 мкл. Длины волн возбуждения/испускания составляли 320/410 нм. Реакции анализа инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность QC определяли с помощью стандартной кривой для b-нафтиламина, полученной в условиях анализа. Одну единицу определяли как количество QC, которое катализирует образование 1 мкмольpGlu-bNA из H-Gln-bNA в минуту в описанных условиях. Во втором флуорометрическом анализе активность QC определяли с использованием в качестве субстрата H-Gln-AMC. Реакции осуществляли при 30 С, используя ридер для микропланшетов NOVOStar (фирма BMG labtechnologies). Образцы включали флуорогенный субстрат в различных концентрациях, 0,1 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма Qiagen) в 0,05 М Трис/HCl, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК и аликвоту, соответствующим образом разведенную QC в конечном объеме 250 мкл. Длины волн возбуждения/испускания составляли 380/460 нм. Реакции анализа инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность QC определяли с помощью стандартной кривой для 7-амино-4 метилкумарина, полученной в условиях анализа. Кинетические данные оценивали с помощью программы GraFit. Спектрофотометрический анализ QC. В этом анализе активность QC определяли спектрофотометрически с помощью непрерывного метода анализа, который был разработан путем адаптации ранее описанного прерывистого анализа(Bateman R.С.J., J. Neurosci. Methods, 30, 1989, p. 23-28) с использованием глутаматдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Образцы включали соответствующий субстрат QC, 0,3 мМ НАДН,14 мМ -кетоглутаровую кислоту и 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы в конечном объеме 250 мкл. Реак- 12025107 ции инициировали, добавляя QC, и осуществляли мониторинг снижения абсорбции при 340 нм в течение 8-15 мин. Начальные скорости оценивали и ферментативную активность определяли с помощью стандартной кривой для аммиака, полученной в условиях анализа. Оценку всех образцов осуществляли при 30 С с помощью ридера для микропланшетов либо SPECTRAFluor Plus, либо Sunrise (оба прибора фирмыTECAN). Кинетические данные оценивали с помощью программы GraFit.