Способ лечения латентного туберкулеза

Rv3616c; (2) вариант последовательности белка Rv3616c или (3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c для применения в лечении или предупреждении латентного туберкулеза. В других аспектах изобретение относится к ассоциированным полинуклеотидам,слитым белкам и способам лечения или предупреждения латентного туберкулеза.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСОСМИТКЛАЙН БАЙОЛОДЖИКАЛС С.А. (BE); ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) Область изобретения Настоящее изобретение относится к полипептидам и полинуклеотидам для применения в лечении или предупреждении туберкулеза, в частности для применения в лечении или предупреждении латентного туберкулеза и в предупреждении или замедлении реактивации туберкулеза (и также к родственным способам). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим и иммуногенным композициям,содержащим указанные полипептиды и полинуклеотиды, и к способам диагностики туберкулеза (в частности, латентного туберкулеза). Предшествующий уровень техники Туберкулез (TB) представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией Mycobacterium tuberculosis и другими видами Mycobacterium. Это заболевание является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света. Считается, что более 2 млрд людей инфицированы бациллами TB, примерно с 9,2 млн новых случаев TB и 1,7 млн смертей ежегодно. У 10% инфицированных бациллами TB развивается активный TB, при этом каждый человек с активным TB в течение года заражает в среднем 10-15 других людей. Несмотря на то что ежегодные показатели коэффициентов заболеваемости достигли своего пика во всем мире, количество смертельных исходов и случаев туберкулеза по-прежнему растет ввиду роста численности населения (Всемирная организация здравоохранения, Tuberculosis Facts, 2008).Mycobacterium tuberculosis инфицирует людей через дыхательные пути. Альвеолярные макрофаги осуществляют захват этой бактерии, однако она способна выживать и пролиферировать благодаря ингибированию слияния фагосом с содержащими кислую среду лизосомами. Результатом является комплексный иммунный ответ, вовлекающий CD4+ и CD8+ T-клетки, в конечном итоге приводящий к образованию гранулмы. Важным для успешного действия Mycobacterium tuberculosis как патогена является тот факт, что изолированные, но не искорененные бактерии могут сохраняться в течение длительных периодов времени, в результате чего индивидуум остается восприимчивым к развитию впоследствии активного TB. Менее чем у 5% инфицированных индивидуумов активный TB развивается в первые годы после инфекции. Гранулма может сохраняться десятилетиями, и предполагают, что она содержит живыеMycobacterium tuberculosis в состоянии покоя, без кислорода и питательных веществ. Однако недавно выдвинуто предположение, что большая часть бактерий в состоянии покоя локализована в типах клеток,не являющихся макрофагами, распределенных по всему организму (Locht et al., Expert Opin. Biol. Ther.,2007, 7(11):1665-1677). Развитие активного TB происходит, когда баланс между природным иммунитетом хозяина и патогенным микроорганизмом изменяется, например, в результате иммуносупрессорного события (Anderson P., Trends in Microbiology, 2007, 15(1):7-13; Ehlers S., Infection, 2009, 37(2):87-95). Также предложена динамическая гипотеза, описывающая баланс между латентным TB и активнымTB (Cardana P.-J., InflammationAllergy - Drug Targets, 2006, 6:27-39; Cardana P.-J., Infection, 2009,37(2):80-86). Несмотря на то что инфекция может быть бессимптомной в течение значительного периода времени, активное заболевание в подавляющем большинстве случаев проявляется как острое воспаление легких, приводящее к повышенной утомляемости, потере массы, лихорадке и непрекращающемуся кашлю. При отсутствии лечения типичным результатом являются серьзные осложнения и смерть. Обычно туберкулез можно контролировать с использованием длительной терапии антибиотиками,хотя такое лечение не является достаточным для предупреждения распространения заболевания. Инфицированные индивидуумы могут в течение некоторого периода времени не проявлять симптомов, но быть заразными. Кроме того, несмотря на то что соблюдение схемы лечения является критическим, поведение пациента трудно контролировать. Некоторые пациенты не завершают курс лечения, что может приводить к неэффективности лечения и развитию лекарственной устойчивости. Мультирезистентный TB (MDR-TB) представляет собой форму, которая не отвечает на лекарственные средства первой линии. 5% всех случаев TB представляют собой MDR-TB, при этом в течение каждого года возникает приблизительно 490000 новых случаев MDR-TB. TB с широкой лекарственной устойчивостью (XDR-TB) возникает, когда помимо MDR-TB развивается резистентность к лекарственным средствам второй линии. По оценкам, ежегодно возникает 40000 новых случаев фактически неизлечимого XDR-TB (Всемирная организация здравоохранения, Tuberculosis Facts, 2008). Даже если полный курс лечения антибиотиками пройден, инфекция M.tuberculosis может не быть искоренена в инфицированном индивидууме, а может оставаться в виде латентной инфекции, которая может реактивироваться. Для того чтобы контролировать распространение туберкулеза, крайне важным являются эффективная вакцинация и точный ранний диагноз заболевания. Диагностику латентной TB инфекции обычно выполняют, применяя туберкулиновую кожную пробу, которая включает внутрикожное введение очищенного от белков туберкулина (PPD). Антигенспецифические T-клеточные ответы приводят к измеряемому уплотнению в месте инъекции через 48-72 ч после инъекции, что указывает на контакт с микобактериальными антигенами. Однако проблемой этого теста является чувствительность и специфичность, и индивидуумов, вакцинированных БЦЖ, не всегда-1 024826 можно легко отличить от инфицированных индивидуумов (это особенно важно в свете того факта, что БЦЖ не защищает от латентной инфекции). В общем, индивидуумы, получившие БЦЖ, но не инфицированные M.tuberculosis, демонстрируют реакцию на PPD менее 10 мм в диаметре, в то время как люди с реакцией на PPD более 10 мм в диаметре считаются инфицированными M.tuberculosis. Однако это правило не применимо к индивидуумам с иммуносупрессией вследствие ВИЧ-инфекции, которая может приводить к реакции на PPD менее 10 мм в диаметре; или в эндемичных странах, где люди, инфицированные нетуберкулезными микобактериями, могут демонстрировать реакцию на PPD более 10 мм в диаметре. В последние годы наблюдается прогресс в разработке анализов in vitro с использованием T-клеток,основанных на высвобождении интерферона- и использовании антигенов, которые более специфичны кM.tuberculosis, чем PPD, а именно ESAT-6 (6 кДа ранний секреторный антиген) и CFP-10(10 кДа белок культурального фильтрата). По-видимому, эти высокоспецифичные тесты имеют, по меньшей мере, такую же чувствительность, как и туберкулиновая кожная проба, и, кроме того, демонстрируют меньшую перекрестную реактивность, обусловленную вакцинацией БЦЖ. В качестве последнего обзора диагностики латентного TB см. Pai M.et al., Expert Rev. Mol. Diagn. 2006, 6(3):413-422. Однако,поскольку ESAT-6/CFP-10 являются антигенами ранней стадии, анализы, основанные наESAT-6/CFP-10, оптимально можно выполнить только на недавно инфицированных людях. Следовательно, идентификация новых антигенов, специфически ассоциированных с латентным туберкулезом,может помочь разработке более чувствительных методов анализа, с помощью которых можно было бы обнаружить долгосрочные латентные инфекции. Сохраняется потребность в эффективных стратегиях для лечения и предупреждения туберкулеза, в частности лечения и предупреждения латентного TB и предупреждения реактивации TB. Краткое изложение сущности изобретения В целом настоящее изобретение относится к идентификации Rv3616c в качестве антигена латентного TB и к родственным способам и применениям в предупреждении и лечении латентного TB и в предупреждении или замедлении реактивации TB. Согласно настоящему изобретению предложен полипептид, содержащий:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c,для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного TB. Следующий аспект изобретения относится к способу лечения или предупреждения латентного TB,включающий введение безопасного и эффективного количества полипептида, содержащего:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c; субъекту, нуждающемуся в этом,где указанный полипептид вызывает иммунный ответ, в частности, иммунный ответ против(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c,в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения латентного TB, представляющего собой другой аспект изобретения. Также предложен полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c; для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного TB. Следующий аспект изобретения относится к способу лечения или предупреждения латентного TB,включающему введение безопасного и эффективного количества полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c; субъекту, нуждающемуся в этом, где указанный полинуклеотид вызывает иммунный ответ, в частности иммунный ответ против Mycobacterium tuberculosis. Применение полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c,в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения латентного TB, представляющего собой другой аспект изобретения. В дополнение к этому, предложена фармацевтическая композиция, содержащая:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c; или(б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и(в) фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент,для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного TB. Кроме того, предложена иммуногенная композиция, содержащая:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c; или(б) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид из (а); и(в) неспецифический усилитель иммунного ответа,для применения в качестве лекарственного средства в лечении или предупреждении латентного TB. В дополнение к этому, предложено антитело или его фрагмент, которые специфично связываются с полипептидом, содержащим:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c,для применения в диагностике латентного TB (как, например, в способах диагностики латентного туберкулеза, включающих определение присутствия антитела или его фрагмента, которые специфично связываются с полипептидами по изобретению в биологическом образце, взятом у тестируемого субъекта). Также предложен способ лечения латентного TB, включающий стадии:(1) идентификация субъекта как имеющего латентную инфекцию TB (например, посредством анализов на основе PPD или T-клеток);(2) введение указанному субъекту безопасного и эффективного количества полипептида или полинуклеотида, как изложено здесь (например, в форме фармацевтической композиции или иммуногенной композиции). Также предложено применение полипептида по настоящему изобретению в изготовлении диагностического набора для идентификации латентного TB у тестируемого субъекта. В одном воплощении субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию, может иметь активный туберкулез (например, активную инфекцию M.tuberculosis). Во втором воплощении субъект может иметь латентный туберкулез (например, скрытую инфекцию M.tuberculosis). В третьем воплощении субъект может не иметь туберкулеза (например, не иметь инфекции M.tuberculosis). Субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию, может быть предварительно вакцинированным от туберкулеза (например, вакцинированным против инфекции M.tuberculosis), например вакцинированным бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ (BCG. Альтернативно, субъект, получающий полипептид, полинуклеотид или композицию по изобретению, может быть не вакцинированным предварительно от туберкулеза (например, не вакцинированным против инфекции M.tuberculosis), например не вакцинированным бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ). Описание графических материалов Фиг. 1. Выравнивание пептида Rv3616 с с полноразмерной последовательностью. Фиг. 2. PBMC-ответы на пептиды Rv3616c. Фиг. 3. Процент CD4 и CD8 клеток от иммунизированных CB6F1 мышей, экспрессирующих цитокины IFN- и/или IL-2, и/или TNF-, на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации). Фиг. 4. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) для антигенспецифического CD4-ответа у иммунизированных CB6F1 мышей. Фиг. 5. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) для антигенспецифического CD8-ответа у иммунизированных CB6F1 мышей. Фиг. 6. Процент CD4 и CD8 клеток от иммунизированных CB6F1 мышей, экспрессирующих цитокины IFN- и/или IL-2, и/или TNF-, на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации). Фиг. 7. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического CD4-ответа у иммунизированных CB6F1 мышей.-3 024826 Фиг. 8. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического CD8-ответа у иммунизированных CB6F1 мышей. Фиг. 9. Процент CD4 и CD8 клеток от иммунизированных C57BL/6 мышей, экспрессирующих цитокины IFN- и/или IL-2, и/или TNF-, на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации). Фиг. 10. Цитокиновый профиль на 21-е сутки (т.е. через 7 суток после второй иммунизации) для антигенспецифического CD4-ответа у иммунизированных C57BL/6 мышей. Фиг. 11. Процент CD4 и CD8 клеток от иммунизированных C57BL/6 мышей, экспрессирующих цитокины IFN- и/или IL-2, и/или TNF-, на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации). Фиг. 12. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического CD4-ответа у иммунизированных C57BL/6 мышей,Фиг. 13. Цитокиновый профиль на 35-е сутки (т.е. через 7 суток после третьей иммунизации) для антигенспецифического CD8-ответа у иммунизированных C57BL/6 мышей. Фиг. 14. Антигенспецифические CD4 T-клеточные ответы у ранее не подвергавшихся инфекции людей и людей с латентной инфекцией. Описание списка последовательностейSEQ ID NO: 26: полипептидная последовательность слитой конструкции M92.SEQ ID NO: 27: полипептидная последовательность слитой конструкции M103.SEQ ID NO: 28: полипептидная последовательность слитой конструкции M114.SEQ ID NO: 159: полипептидная последовательность Rv2707c из штамма H37Rv M.tuberculosis. Подробное описание В настоящее время вакцинация живыми бактериями является наиболее эффективным способом индукции защитного иммунитета. Наиболее часто используемой для этой цели микобактерией является бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ), авирулентный штамм M.bovis, который был разработан более 60 лет назад. Однако безопасность и эффективность БЦЖ являются предметом дискуссии: защищая от тяжелого проявления болезни у детей, БЦЖ не предотвращает возникновение латентного TB или реактивацию болезни легких во взрослой жизни. Кроме того, в некоторых странах, таких как Соединенные Штаты,широкую вакцинацию населения этим агентом не проводят. Почти все вакцины против TB нового поколения, которые в настоящее время находятся в стадии клинической разработки, были разработаны как вакцины прединфекционной профилактики. Они включают субъединичные вакцины, которые особенно эффективны в повышении иммунитета, индуцируемого-6 024826 предшествующей вакцинацией БЦЖ, и усовершенствованные живые микобактериальные вакцины, которые предназначены для того, чтобы заменить БЦЖ на более эффективные и/или безопасные штаммы. Несмотря на то что эти вакцины предназначены для улучшения устойчивости к инфекции, по всей вероятности они менее эффективны в качестве постинфекционных или терапевтических вакцин в случаях латентного TB (Lin M.Y. et al., Endocrine, MetabolicImmune Disorders - Drug Targets, 2008, 8:15-29). Показано, что некоторые белки, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях микобактериальной инфекции, обеспечивают высокую защитную эффективность в моделях вакцинации на животных. Тем не менее, вакцинация антигенами, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях инфекции, не может обеспечить оптимальный иммунный ответ на более поздних стадиях инфекции. Для адекватного контроля на более поздних стадиях инфекции могут потребоваться T-клетки, которые являются специфичными к определенным антигенам, которые экспрессируются на тот момент времени. Постинфекционные вакцины, которые нацелены непосредственно на находящиеся в состоянии покоя персистирующие бактерии, могут оказывать содействие в защите от реактивации TB, тем самым усиливая контроль над TB или даже давая возможность устранения инфекции. Поэтому вакцина, нацеленная на латентный TB, могла бы значительно и экономично снизить общие уровни зараженности TB. Субъединичные вакцины на основе антигенов поздних стадий также могут быть использованы в комбинации с антигенами ранних стадий для приготовления мультифазной вакцины. Альтернативно,антигены поздних стадий могли бы быть использованы для дополнения и улучшения вакцинации БЦЖ(либо путм усиления ответа на БЦЖ, либо путм разработки усовершенствованных рекомбинантных штаммов БЦЖ). Ранее показано, что Rv3616c, также известный как Mtb40 или HTCC1, вовлечен в иммунные ответы, ассоциированные с туберкулезом (см., например, WO 98/53075). В Al-Attiyah et al., Clin. Exp.Immunol. 2004, 138:139-144 показано, что Rv3616c хорошо распознается (посредством анализа пролиферации РМВС и продукции IFN-) у пациентов с туберкулезом легких. В работе Mustafa et al., Infect.Immun. 2006, 74(8):4566-4572 исследовано распознавание Rv3616c у крупного рогатого скота, инфицированного M.bovis и вакцинированного БЦЖ. Недавно на основании биоинформационного анализа полного генома M.tuberculosis (Zvi et al., BMCMedical Genetics, 2008, 1:18) и тестирования дифференциально экспрессируемых белков у индивидуумов,пораженных активной и латентной инфекцией (Schuck S.D. et al., PLoS ONE, 2009, 4(5):е 5590), была предложена группа вакцин-кандидатов против M.tuberculosis. В то время как макрофаги, как было показано, действуют в качестве главных эффекторов иммунитета к Mycobacterium, T-клетки являются преобладающими индукторами такого иммунитета. Существенную роль T-клеток в защите против туберкулеза иллюстрирует повышенная частота реактивации TB у индивидуумов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, вследствие связанного с этим истощения CD4+ T-клеток. Более того, показано, что адоптивный перенос CD4+ T-клеток, полученных на пике первичного иммунного ответа на M.tuberculosis, предоставляет защиту против M.tuberculosis дефицитным по T-клеткам мышам (Orme et al., J. Exp. Med., 1983, 158:74-83). Показано, что Mycobacterium-реактивные CD4+ T-клетки являются мощными продуцентами-интерферона (IFN-), для которого, в свою очередь, показано, что он запускает антимикобактериальные эффекты макрофагов у мышей (Flynn et al., J. Exp. Med., 1993, 178:2249-2254). В то время как роль IFNу людей менее понятна, исследования показали, что 1,25-дигидрокси витамин D3, либо сам по себе, либо в комбинации с IFN- или фактором некроза опухоли-альфа, активирует макрофаги человека для ингибирования инфекции M.tuberculosis. Кроме того, известно, что IFN- стимулирует макрофаги человека к продукции 1,25-дигидрокси витамина D3. Аналогично показано, что интерлейкин-12 (IL-12) играет роль в стимуляции устойчивости к инфекции, вызываемой M.tuberculosis. Для обзора иммунологии инфекции,вызываемой M.tuberculosis, см. ChanKaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and ControlMedicine, Chapter 150, p. 953-966 (16-е изд., Braunwald, et al., eds., 2005). В целом настоящее изобретение относится к идентификации Rv3616c в качестве TB антигена, ассоциированного с латентным TB, и к родственным способам и применениям в предупреждении и лечении латентного TB и в предупреждении или замедлении реактивации TB. Таким образом, согласно изобретению предложен белок Rv3616c, его вариант или его иммуногенный фрагмент либо полинуклеотид, кодирующий указанный белок, вариант или фрагмент, для применения в лечении или предупреждении латентного TB. Подходящим образом применение может быть специфично в лечении латентного TB (особенно лечении латентного TB). Альтернативно, применение может заключаться в предупреждении или замедлении реактивации TB (особенно замедлении реактивацииTB, например, на период времени в несколько месяцев, лет или даже на неограниченный период времени). Термин "виды Mycobacterium туберкулезного комплекса" включает такие виды, которые традиционно считаются вызывающими заболевание туберкулез, а также присутствующие в окружающей среде и условно-патогенные виды Mycobacterium, которые вызывают туберкулез и болезнь легких у иммуноло-7 024826 гически скомпрометированных (immune compromised) пациентов, таких как пациенты со СПИДом, например, M.tuberculosis, M.bovis или M.africanum, БЦЖ, M.avium, M.intracellulare, M.celatum,M.genavense, M.haemophilum, M.kansasii, M.simiae, M.vaccae, M.fortuitum и M.scrofulaceum (см., например, Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, p. 953-966 (16-е изд., Braunwald, et al., eds.,2005). Настоящее изобретение относится особенно к инфекции, вызываемой M.tuberculosis. Термин "активная инфекция" относится к инфекции (например, инфекции, вызываемойM.tuberculosis) с проявляющимися симптомами заболевания и/или поражениями (соответственно с проявляющимися симптомами заболевания). Термины "неактивная инфекция", "скрытая инфекция" или "латентная инфекция" относятся к инфекции (например, инфекции, вызываемой M, tuberculosis) без проявляющихся симптомов заболевания и/или поражений (соответственно без проявляющихся симптомов заболевания). Термин "первичный туберкулез" относится к клинической форме заболевания (проявлению симптомов заболевания), следующей непосредственно за инфекцией (например, инфекцией, вызываемойM.tuberculosis). См. Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, p. 953-966 (16-е изд., Braunwald,et al., eds., 2005). Термины "вторичный туберкулез" или "постпервичный туберкулез" относятся к реактивации скрытой, неактивной или латентной инфекции (например, инфекции, вызываемой M.tuberculosis). См.Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, p. 953-966 (16-е изд., Braunwald, et al., eds., 2005). Термин "реактивация туберкулеза" относится к более позднему проявлению симптомов заболевания у индивидуума, который имеет положительные результаты в тесте на инфекцию (например, в туберкулиновой кожной пробе, подходящим образом в анализе in vitro, основанном на использовании Tклеток), но не имеет очевидных симптомов заболевания. Положительный результат диагностического теста указывает на то, что индивидуум инфицирован, однако этот индивидуум может иметь или может не иметь ранее проявлявшихся активных симптомов заболевания, которые были подвергнуты лечению в достаточной степени для того, чтобы перевести туберкулез в неактивное или латентное состояние. Общепризнано, что способы предупреждения, замедления или лечения реактивации туберкулеза могут быть инициированы у индивидуума, демонстрирующего активные симптомы заболевания. Термин "туберкулез устойчивый к лекарственным средствам" относится к инфекции (например,инфекции, вызываемой M.tuberculosis), при которой инфицирующий штамм не останавливается в развитии или не убивается (т.е. является устойчивым к) одним или более чем одним так называемым химиотерапевтическим агентом "первой линии", эффективным в лечении туберкулеза (например, изониазидом,рифампином, этамбутолом, стрептомицином и пиразинамидом). Термин "мультирезистентный" туберкулез относится к инфекции (например, инфекции, вызываемой M.tuberculosis), при которой инфицирующий штамм устойчив к двум или более химиотерапевтическим агентам "первой линии", эффективным в лечении туберкулеза."Химиотерапевтический агент" относится к фармакологическому агенту, который известен и используется в данной области для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой M.tuberculosis). Типичные фармакологические агенты, используемые для лечения туберкулеза, включают амикацин,аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин,пиразинамид, рифамицины (т.е. рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны, но этим не ограничиваются. Химиотерапевтические агенты "первой линии" или "передовой линии", используемые для лечения туберкулеза, не обладающего лекарственной устойчивостью, включают изониазид, рифампин, этамбутол, стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты "второй линии", используемые для лечения туберкулеза,демонстрирующего лекарственную устойчивость к одному или более чем одному лекарственному средству "первой линии", включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту,циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин. Обзор таких фармакологических агентов приведен в главе 48 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman and Limbird eds., 2001. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Данные термины также применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или более чем один аминокислотный остаток представляет собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к природным полимерам аминокислот и неприродным полимерам аминокислот. Удобно, когда полипептид по настоящему изобретению будет состоять только из природных аминокислотных остатков, особенно таких аминокислот, которые кодируются генетическим кодом. Термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые подвергаются более поздним модификациям, например, гидроксипролин, -карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Термин "аналоги аминокислот" относится к соединениям,которые имеют такую же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, т.е.-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, как у природной аминокислоты. Термин "миметики аминокислот" относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют подобно природной аминокислоте. Удобно, когда аминокислота представляет собой природную аминокислоту или аналог аминокислоты,особенно природную аминокислоту и, в частности, те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом."Нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты,содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи в остове, которые являются синтетическими, природными и неприродными, которые имеют связывающие свойства,подобные связывающим свойствам эталонной нуклеиновой кислоты, и которые метаболизируются аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфоротиоаты,фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептидонуклеиновые кислоты (ПНК). Соответственно, термин "нуклеиновая кислота" относится к природным дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также полностью охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также подробно указанную последовательность (удобно, когда это относится к подробно указанной последовательности). Конкретно, замены вырожденных кодонов могут быть получены путем создания последовательностей, в которых третье положение в одном или более выбранных (или всех) кодонов содержит замены на остатки смешанных оснований и/или дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608(1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994. Термин "нуклеиновая кислота" используется взаимозаменяемо с терминами "ген", "кДНК", "мРНК", "олигонуклеотид" и "полинуклеотид". Аминокислоты здесь могут быть обозначены либо в соответствии с их общеизвестными трехбуквенными символами, либо в соответствии с однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре Международного союза по теоретической и прикладной химии/Международного биохимического союза (IUPAC-IUB). Аналогично, нуклеотиды могут быть обозначены в соответствии с их общепринятыми однобуквенными кодами. Под термином "последовательность белка Rv3616c", как он использован здесь, понимается полипептидная последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 1, или е гомолог из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса, например такого вида, как M.tuberculosis, M.bovis или M.africanum, или видаMycobacterium, который присутствует в окружающей среде или является условно-патогенным и который вызывает оппортунистические инфекции, такие как легочные инфекции, у хозяев с ослабленным иммунитетом (например, у пациентов со СПИДом), например, БЦЖ, M.avium, M.intracellulare, M.celatum,M.genavense, M.haemophilum, M.kansasii, M.simiae, M.vaccae, M.fortuitum и M.scrofulaceum (см., например, Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, p. 953-966 (16-е изд., Braunwald, et al., eds.,2005). Для обеспечения высокого показателя эффективности среди вакцинируемых реципиентов, компоненты вакцины должны быть высоко консервативными среди штаммов клинической значимости. Удобно, когда белок Rv3616c происходит из H37Rv M.tuberculosis (т.е. полипептидной последовательности,приведенной в SEQ ID NO: 1) или является его гомологом из другого штамма M.tuberculosis (такого как штаммы CDC1551, F11, Haarlem A и С). Штаммы M.tuberculosis, которые ассоциированы с лекарственной устойчивостью (например, MDR или особенно XDR), представляют собой особенно важную основу для последовательности белка Rv3616c. Представляющие интерес штаммы включают:CDC1551 - трансмиссивный и вирулентный штамм; семейство Haarlem (как, например, Haarlem A) - штаммы с лекарственной устойчивостью, обнаруженные в местах проживания большого количества людей. Члены семейства Haarlem из штаммовM.tuberculosis обнаружены во многих частях мира. Первый представитель данного семейства был открыт в Харлеме (Haarlem, The Netherlands);KZN4207 - чувствительный к лекарственным средствам изолят, полученный от пациентов КвазулуНатал (Южная Африка);KZN1435 - мультирезистентный (MDR) изолят, полученный от пациентов Квазулу-Натал (Южная Африка);KZN605 - изолят с широкой лекарственной устойчивостью (XDR), полученной от пациентов Квазулу-Натал (Южная Африка); С - широко распространенный в Нью-Йорке. В одном исследовании было обнаружено, что этот штамм наиболее часто встречается среди принимающих инъекционные преператы, и что он устойчив к химически активным промежуточным соединениям азота (Friedman et al. J. Infect. Dis. 1997, 176(2):478-9 024826 84); 94M4241A - выделенный в Сан-Франциско в 1994 г. от пациента, рожденного в Китае. Этот штамм ранее был изучен с использованием делеционного анализа генома (Gagneux et al., PNAS, 2006,103(8):2869-2873); 021987 - выделенный в Сан-Франциско в 2002 г. от пациента, рожденного в Южной Корее. Этот штамм ранее был изучен с использованием анализа делеционного анализа генома (Gagneux et al., PNAS,2006, 103(8):2869-2873);T92 - выделенный в Сан-Франциско в 1999 г. от пациента, рожденного на Филиппинах. Данные об этом штамме опубликованы в Hirsh et al. PNAS, 2004, 101:4871-4876;T85 - выделенный в Сан-Франциско в 1998 г. от пациента, рожденного в Китае. Данные об этом штамме опубликованы в Hirsh et al. PNAS, 2004, 101:4871-4876;EAS054 - выделенный в Сан-Франциско в 1993 г. от пациента, рожденного в Индии. Этот штамм ранее был изучен с использованием делеционного анализа генома (Gagneux et al., PNAS, 2006,103(8):2869-2873).Gagneux et al., PNAS, 2006, 103(8):2869-2873 и Herbert et al. Infect. Immun., 2007, 75(12):5798-5805 обеспечивают полезные знания в отношении группы известных существующих штаммов M.tuberculosis. Наиболее удобно, когда белок Rv3616c выбран из полипептидных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1 и 3-7, в частности SEQ ID NO: 1 и 3-6, например SEQ ID NO: 1. Представляющими особый интерес полинуклеотидами являются полинуклеотиды, содержащие последовательность, кодирующую (как, например, состоящие из последовательности, кодирующей):(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c. Полинуклеотиды соответствующим образом будут содержать (например, состоять из) вариант(а)SEQ ID NO: 2 или фрагмент(а) SEQ ID NO: 2, который кодирует иммуногенный фрагмент белкаRv3616c-родственные полипептиды по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие компоненты, сконструированные для усиления их иммуногенности или для улучшения этих антигенов в других отношениях. Например, улучшенному выделению полипептидных антигенов может способствовать добавление последовательности из остатков гистидина (широко известный как his-метка) к одному концу антигена. Термин "his-метка" относится к последовательности из остатков гистидина, в типичном случае из шести остатков, которые встроены в эталонную последовательность. Чтобы свести к минимуму нарушение активности, связанной с эталонной последовательностью, his-метку обычно встраивают на N-конце,обычно сразу же после инициирующего остатка метионина, или же на C-конце. Они обычно являются гетерологичными в отношении нативной последовательности, но их вводят, поскольку они облегчают выделение путем улучшения связывания белка со смолами для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC). Вообще, наличие или отсутствие his-метки не существенно с точки зрения индукции желаемого иммунного ответа против эталонного белка. Однако, чтобы избежать риска неблагоприятной реакции против самой his-метки, считается, что лучше всего свести к минимуму длину hisметки, например до четырех или менее чем четырех остатков, в частности, до двух остатков (или полностью исключить применение his-метки). Для того чтобы улучшить величину и/или широту охвата вызываемого иммунного ответа, композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержать многочисленные копии антигена по изобретению и/или дополнительных гетерологичных полипептидов (или полинуклеотидов,кодирующих их) из вида Mycobacterium (в частности, M.tuberculosis). Специалисту в данной области техники будет понятно, что если в комбинации используют несколько компонентов, то точная форма представления может быть различной. Например, компонент Rv3616c и дополнительная копия антигена по изобретению или дополнительный гетерологичный антигенный компонент могут быть представлены в виде:(1) двух индивидуальных полипептидных компонентов;(2) слитого белка, содержащего оба полипептидных компонента;(4) двух индивидуальных полинуклеотидных компонентов;(5) единого полинуклеотида, кодирующего два отдельных полипептидных компонента; или(6) единого полинуклеотида, кодирующего слитый белок, содержащий оба полипептидных компонента. Такая гибкость применима в равной мере к ситуациям, когда в комбинации используют три или более чем три компонента. Однако для удобства часто желательно, чтобы в случае, если присутствует несколько компонентов, они содержались в едином слитом белке или полинуклеотиде, кодирующем единый слитый белок. В одном воплощении изобретения все антигенные компоненты предложены в виде- 10024826 полипептидов (например, в едином слитом белке). В альтернативном воплощении изобретения все антигенные компоненты предложены в виде полинуклеотидов (например, единого полинуклеотида, например, полинуклеотида, кодирующего единый слитый белок). Термин "гетерологичный", когда он используется в отношении участков нуклеиновой кислоты, означает, что нуклеиновая кислота содержит две или более чем две подпоследовательности, которые не обнаруживаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе. Например,нуклеиновую кислоту обычно получают с помощью технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот,таким образом, что она имеет две или более последовательностей из неродственных генов, расположенных так, чтобы создать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор из одного источника, а кодирующая область из другого источника. Аналогично, термин "гетерологичный белок" означает, что белок содержит две или более чем две подпоследовательности, которые не обнаруживаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе (например, слитый белок). Термин "слитый полипептид" или "слитый белок" относится к белку, имеющему по меньшей мере два гетерологичных полипептида (например, по меньшей мере два полипептида из Mycobacterium sp.),связанных ковалентно либо непосредственно, либо через аминокислотный линкер. Полипептиды, образующие слитый белок, обычно связаны C-концом к N-концу, хотя они также могут быть связаны Cконцом к C-концу, N-концом к N-концу или N-концом к С-концу. Полипептиды слитого белка могут располагаться в любом порядке. Этот термин также относится к консервативно модифицированным вариантам, полиморфным вариантам, аллелям, мутантам, иммуногенным фрагментам и межвидовым гомологам антигенов, из которых составлен слитый белок. Антигены Mycobacterium tuberculosis описаны вCole et al., Nature, 393:537 (1998), в которой полностью раскрыт геном Mycobacterium tuberculosis. Антигены из другого вида Mycobacterium, соответствующие антигенам M.tuberculosis, можно идентифицировать, например используя алгоритмы сравнения последовательностей, как изложено здесь, или другие методы, известные специалистам в данной области техники, например, гибридизационные анализы и анализы связывания антител. Термин "слитый" относится к ковалентной связи между двумя полипептидами в слитом белке. Обычно полипептиды соединены посредством пептидной связи либо непосредственно друг с другом,либо через аминокислотный линкер. Возможно, пептиды могут быть соединены посредством непептидных ковалентных связей, известных специалистам в данной области. Типичные антигены M.tuberculosis, которые можно комбинировать с Rv3616c, включают один или более чем один (например, 1-5, как, например, 1-3, в частности 1) антиген из следующих (например, один или более чем один из (1)-(12:(1) Mtb8.4 (также известный как DPV и Rv1174c), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 102 в WO 97/09428 (кДНК в SEQ ID NO: 101) и в Coler et al., Journal of Immunology, 1998, 161:2356-2364. Особый интерес представляет последовательность зрелого Mtb8.4, у которого отсутствует лидерный сигнальный пептид (т.е. аминокислотные остатки 15-96 из SEQ ID NO: 102 вWO 97/09428). Полноразмерная полипептидная последовательность Mtb8.4 показана в SEQ ID NO: 8;(2) Mtb9.8 (также известный как MSL и RvO287), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 109 в WO 98/53075 (фрагменты MSL описаны в SEQ ID NO: 110-124 в WO 98/53075,причм SEQ ID NO: 119 и 120 представляют особый интерес) и также в Coler et al., Vaccine, 2009, 27:223233 (в частности, активные фрагменты показаны здесь на фиг. 2). Полноразмерная полипептидная последовательность Mtb9.8 показана в SEQ ID NO: 9;(3) Mtb9.9 (также известный как Mtb9.9A, MTI, MTI-A и Rv1793), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 19 в WO 98/53075 и в Alderson et al., Journal of Experimental Medicine, 2000, 7:551-559 (фрагменты MTI описаны в SEQ ID NO: 17 и 51-66 в WO 98/53075, причмSEQ ID NO: 17, 51, 52, 53, 56 и 62-65 представляют особый интерес). Несколько полипептидных вариантов MTI описаны в SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, 29 и 31 в WO 98/53075 и в Alderson et al., Journal of Experimental Medicine, 2000, 7:551-559. Полноразмерная полипептидная последовательность Mtb9.9 показана в(4) Ra12 (также известный как C-концевой антиген Mtb32A), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 10 в WO 01/98460 и в Skeiky et al., Journal of Immunology, 2004,172:7618-7682. Полноразмерная полипептидная последовательность Ra12 показана в SEQ ID NO: 11;(5) Ra35 (также известный как N-концевой антиген Mtb32A), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 8 в WO 01/98460 и в Skeiky et al., Journal of Immunology, 2004, 172: 76187682. Полноразмерная полипептидная последовательность Ra35 показана в SEQ ID NO: 12;(6) TbH9 (также известный как Mtb39, Mtb39A, TbH9FL и Rv1196), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 107 в WO 97/09428, а также в Dillon et al., Infection and Immunity,1999, 67(6): 2941-2950 и Skeiky et al., Journal of Immunology, 2004, 172: 7618-7682. Полноразмерная (FL) полипептидная последовательность TbH9 показана в SEQ ID NO: 13;(7) Mtb41 (также известный как МТСС 2 и Rv0915c), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 142 в WO 98/53075 (кДНК в SEQ ID NO: 140) и в Skeiky et al., Journal of Immunology, 2000, 165:7140-7149. Полноразмерная полипептидная последовательность Mtb41 показана в(8) ESAT-6 (также известный как esxA и Rv3875), полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 103 в WO 97/09428 (кДНК в SEQ ID NO: 104) и в Sorensen et al., Infection andImmunity, 1995, 63(5):1710-1717. Полноразмерная полипептидная последовательность ESAT-6 показана в(9) антигены комплекса Ag85 (например, Ag85A, также известного как fbpA и Rv3804c; или Ag85B,также известного как fbpB и Rv1886c), обсуждение которых приведено, например, в Content et al.,Infection and Immunity, 1991, 59:3205-3212 и в Huygen et al., Nature Medicine, 1996, 2(8):893-898. Полноразмерная полипептидная последовательность для Ag85A показана в SEQ ID NO: 16 (зрелый белок с остатками 43-338, т.е. не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес). Полноразмерная полипептидная последовательность для Ag85B показана в SEQ ID NO: 17 (зрелый белок с остатками 41-325, т.е. не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес);Immunology, 1995, 102:53-57 (представляющими особый интерес являются фрагменты, соответствующие остаткам 71-91, 21-40, 91-110 и 111-130). Полноразмерная полипептидная последовательность альфакристаллина показана в SEQ ID NO: 18;Immunology, 1996, 43:662-670. Полноразмерная полипептидная последовательность MPT64 показана вSEQ ID NO: 19 (зрелый белок с остатками 24-228, т.е. не имеющий сигнального пептида, представляющий особый интерес);(12) Mtb32 А, полипептидная последовательность которого описана в SEQ ID NO: 2 (полноразмерная), а остатки 8-330 в SEQ ID NO: 4 (зрелая форма) в WO 01/98460, особенно варианты, имеющие мутацию по меньшей мере в одной каталитической триаде (например, каталитический остаток серина, который может быть, например мутирован в аланин). Полноразмерная полипептидная последовательность для Mtb32 А показана в SEQ ID NO: 20. Зрелая форма Mtb32A имеющая мутацию Ser/Ala показана в(13) TB10.4, полноразмерная полипептидная последовательность для TB10.4 показана в(14) Rv1753c, полноразмерная полипептидная последовательность для Rv1753c из Mycobacterium(15) Rv2386c, полноразмерная полипептидная последовательность Rv2386c из Mycobacterium(16) Rv2707c, полноразмерная полипептидная последовательность Rv2707c из MycobacteriumHis-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении Mtb72f подходящим образом не содержит дополнительных остатков гистидина). Полипептидная последовательность для(б) комбинация компонентов Ra12, TbH9 и Ra35 с мутацией Ser/Ala (т.е. где каталитический остаток серина заменен на аланин), например, в форме слитого белка, такого как M72. Полипептидная последовательность M72 описана в SEQ ID NO: 4 в WO 2006/117240 (кДНК в SEQ ID NO: 3), где она возможно включает два рядом расположенных гистидина для облегчения получения; при использовании в настоящем изобретении M72 также может включать два рядом расположенных гистидина, хотя подходящим образом M72 может не содержать двух рядом расположенных гистидинов (т.е. остатки 4-725 в SEQ(кДНК в SEQ ID NO: 15), где она включает возможную His-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении Mtb71f подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 9-710 в SEQ ID NO: 16 из WO99/051748. Полипептидная последовательность для Mtb71f показана в(г) комбинация Mtb72f или M72 (подходящим образом без дополнительных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с Mtb9.8 и Mtb9.9, например, в слитом белке. Полипептидная последовательность для слитой конструкции M72-Mtb9.9-Mtb9.8 показана в SEQ ID NO: 26 (слитая конструкция M92); при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция M72-Mtb9.9-Mtb9.8 может дополнительно включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;(д) комбинация Mtb72f или M72 (подходящим образом без дополнительных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с Ag85B, например, в слитом белке, таком как Mtb103f. Полипептидная последовательность Mtb103f описана в SEQ ID NO: 18 в WO 03/070187 (кДНК в SEQ ID NO: 10), где она включает возможную His-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретенииMtb103f подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1016 в SEQ ID NO: 18 изWO03/070187. Также особый интерес представляет M103, т.е. Mtb103f, включающий мутацию Ser/Ala в компоненте Ra35; при использовании в настоящем изобретении М 103 подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1016 в SEQ ID NO: 18 из WO03/070187, где остаток Ser в положении 710 заменен на Ala. Полипептидная последовательность M103 показана в SEQ ID NO: 27, при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция M72-Mtb9.9-Mtb9.8 может дополнительно включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;(е) комбинация Mtb72f или M72 (подходящим образом без возможных остатков гистидина для облегчения экспрессии) с Mtb41, например, в слитом белке, таком как Mtb114f. Полипептидная последовательность Mtb114f описана в SEQ ID NO: 16 в WO 03/070187 (кДНК в SEQ ID NO: 9), где она включает возможную His-метку для облегчения очистки; при использовании в настоящем изобретении Mtb114f подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1154 в SEQ ID NO: 16 из WO03/070187. Также особый интерес представляет M114, т.е. Mtb114f, включающий мутацию Ser/Ala в компонентеRa35; при использовании в настоящем изобретении M114 подходящим образом соответствует аминокислотным остаткам 8-1154 в SEQ ID NO: 16 из WO 03/070187, где остаток Ser в положении 710 заменен наAla. Полипептидная последовательность M114 показана в SEQ ID NO: 28, при использовании в настоящем изобретении слитая конструкция M72-Mtb9.9-Mtb9.8 возможно может включать два рядом расположенных гистидина после инициирующего остатка метионина для облегчения получения;Dietrich et al., Journal of Immunology, 2005, 174(10):6332-6339, 190:2146-2153. Комбинации компонента Rv3616c и компонента Rv1753c представляют особый интерес. Очевидно,такие комбинации возможно могут содержать другие дополнительные антигенные компоненты (например, компонент M72). Другая представляющая интерес комбинация содержит компонент Rv3616c и компонент M72. Следующая представляющая интерес комбинация содержит компонент Rv3616c и компонентRv2386c. Другие представляющие интерес комбинации включают комбинации, содержащие компонентRv3616c и компонент Rv2707c. Дополнительная представляющая интерес комбинация содержит компонент Rv3616c и компонент альфа-кристаллин. Специалисту будет понятно, что комбинации не обязательно должны основываться на специфических последовательностях, описанных выше в (1)-(16) и (а)-(з), и что для получения такого же практического эффекта можно использовать консервативно модифицированные варианты (например, с идентичностью по меньшей мере 70%, как, например, с идентичностью по меньшей мере 80%, в частности, с идентичностью по меньшей мере 90% и особенно с идентичностью по меньшей мере 95%) или иммуногенные фрагменты (например, по меньшей мере 20% полноразмерного антигена, как, например, по меньшей мере 50% антигена, в частности, по меньшей мере 70% и особенно по меньшей мере 80%) описанных последовательностей. Каждая из вышеупомянутых индивидуальных антигенных последовательностей также раскрыта в(www.sanger.ac.uk/Projects/Mtuberculosis/) и в других местах. Многие из упомянутых выше антигенов также раскрыты в заявках на патент США 08/523435,08/523436, 08/658800, 08/659683, 08/818111, 08/818112, 08/942341, 08/942578, 08/858998, 08/859381,09/056556, 09/072596, 09/072967, 09/073009, 09/073010, 09/223040, 09/287849 и в патентных заявках PCTWO 97/09429, WO 98/16645, WO 98/16646, каждая из которых здесь включена посредством ссылки. Композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению также могут содержать дополнительные полипептиды из других источников. Например, композиции и слитые белки по изобретению могут включать полипептиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, где данный полипептид усиливает экспрессию антигена, например, NS1 белка вируса гриппа, (см., например,WO 99/40188 и WO 93/04175). Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть сконструированы на основе предпочтения кодонов у выбранного вида, например, у человека (в случае экспрессии in vivo) или у конкретной бактерии (в случае продуцирования полипептидов). Компонент Rv3616c также может быть введен с одним или более чем одним химиотерапевтическим агентом, эффективным против туберкулеза (например, инфекции, вызываемой M.tuberculosis). Примеры- 13024826 таких химиотерапевтических агентов включают, но не ограничиваются этим, амикацин, аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин, пиразинамид,рифамицины (т.е. рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин,кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны. Такая химиотерапия определяется решением лечащего врача, использующего предпочтительные комбинации лекарственных средств. Химиотерапевтические агенты "первой линии", используемые для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемойM.tuberculosis), не обладающего лекарственной устойчивостью, включают изониазид, рифампин, этамбутол, стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты "второй линии", используемые для лечения туберкулеза (например, инфекции, вызываемой M.tuberculosis), демонстрирующего лекарственную устойчивость к одному или более чем одному лекарственному средству "первой линии", включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту, циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин. Традиционные химиотерапевтические агенты обычно вводят в течение относительно длительного периода времени (приблизительно 9 месяцев). Сочетание применения традиционных химиотерапевтических агентов с введением компонента Rv3616c по настоящему изобретению может способствовать уменьшению продолжительности химиотерапевтического лечения (например, до 8, 7, 6, 5, 4, 3 месяцев или меньше) без уменьшения эффективности. Особый интерес представляет применение компонента Rv3616c вместе с бациллой КальметтаГерена (БЦЖ). Например, в форме модифицированной БЦЖ, которая рекомбинантно экспрессируетRv3616c (или его вариант или фрагмент, как изложено здесь). Альтернативно, компонент Rv3616c может быть использован для усиления ответа субъекта на вакцинацию БЦЖ либо путм совместного введения,либо путм повторной иммунизации после предыдущей вакцинации БЦЖ. Очевидно, что компонентRv3616c, когда его используют для усиления ответа субъекта на вакцинацию БЦЖ, может быть представлен в форме полипептида или полинуклеотида (возможно вместе с дополнительными антигенными компонентами, как описано выше). Специалисту будет понятно, что комбинации компонентов не обязательно вводят совместно и что они могут быть применены: по отдельности или в комбинации; одновременно, последовательно или в пределах короткого периода времени; и введены одинаковыми или разными путями. Тем не менее, для удобства обычно желательно (там где режимы введения совместимы) вводить комбинацию компонентов в виде единой композиции. Полипептиды, полинуклеотиды и композиции по настоящему изобретению в общем случае будут введены людям, но они эффективны и для других млекопитающих, включая домашних животных (например, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, морских свинок, хомячков, шиншилл) и сельскохозяйственных млекопитающих (например, коров, свиней, овец, коз, лошадей). Иммуногенныу фрагменты.T-клеточные эпитопы представляют собой короткие непрерывные отрезки из аминокислот, которые распознаются T-клетками (например, CD4+ или CD8+ T-клетками). Идентификация T-клеточных эпитопов может быть достигнута с помощью экспериментов по эпитопному картированию, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Paul, Fundamental Immunology, 3-е изд.,243-247 (1993); Beibarth et al., Bioinformatics, 2005, 21(Suppl. 1):i29-i37). Альтернативно, эпитопы можно предсказать, используя подходы, обсуждаемые в разделе "Примеры". Исходя из решающего значения T-клеточного ответа при туберкулезе очевидно, что фрагменты полноразмерного полипептида Rv3616c, содержащие по меньшей мере один T-клеточный эпитоп, будут иммуногенными и могут вносить вклад в иммунологическую защиту. Такие фрагменты называются здесь иммуногенными фрагментами. Иммуногенные фрагменты по настоящему изобретению обычно будут содержать по меньшей мере 9 следующих друг за другом аминокислот из полноразмерной полипептидной последовательности (например, по меньшей мере 10), как, например, по меньшей мере 12 следующих друг за другом аминокислот (например, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 следующих друг за другом аминокислот), в частности, по меньшей мере 50 следующих друг за другом аминокислот, как, например, по меньшей мере 100 следующих друг за другом аминокислот (например, по меньшей мере 200 следующих друг за другом аминокислот). Соответственно, иммуногенные фрагменты будут составлять по меньшей мере 20%,например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% длины полноразмерной полипептидной последовательности. Понятно, что в разнотипной аутбредной популяции, такой как люди, наличие различных типов HLA(антигенов тканевой совместимости человека) означает, что специфические эпитопы могут не распознаваться всеми членами популяции. Следовательно, чтобы максимизировать уровень распознавания и величину иммунного ответа на полипептид, как правило, желательно, чтобы иммуногенный фрагмент содержал множество эпитопов из полноразмерной последовательности (соответствующим образом все эпитопы).- 14024826 Конкретные фрагменты белка Rv3616c, которые могут быть использованы, включают фрагменты,содержащие по меньшей мере один CD4+ эпитоп, соответственно по меньшей мере два CD4+ эпитопа и в особенности все CD4+ эпитопы (как, например, эпитопы, описанные в разделе "Примеры" и вSEQ ID NO: 29-47, в частности эпитопы, ассоциированные с большинством HLA-аллелей, например эпитопы, ассоциированные с 2, 3, 4, 5 или более аллелями). Другие фрагменты белка Rv3616c, которые могут быть использованы, включают фрагменты, содержащие по меньшей мере один CD8 эпитоп, соответственно по меньшей мере два CD8 эпитопа и в особенности все CD8 эпитопы (как, например, эпитопы, описанные в разделе "Примеры" и вSEQ ID NO: 48-126, в частности эпитопы, ассоциированные с множеством HLA-аллелей, например эпитопы, ассоциированные с 2, 3, 4, 5 или более аллелями). Когда используют индивидуальный фрагмент полноразмерного полипептида, такой фрагмент считают иммуногенным, если он вызывает ответ, составляющий по меньшей мере 20%, подходящим образом по меньшей мере 50% и в особенности по меньшей мере 75% (как, например, по меньшей мере 90%) активности эталонной последовательности в анализе in vitro рестимуляции PBMC или цельной крови специфическими антигенами (например, рестимуляции в течение периода времени от нескольких часов до двух недель, как, например, до 1 суток, от 1 суток до 1 недели или 1-2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством измерения лимфопролиферации, продукции цитокинов в супернатанте культуры (измеряемых с помощью ELISA, CBA (Cytometric bead array) и т.д.) или определения параметров T- и B-клеточных ответов с помощью внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с применением антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как CD3, CD4, CD8, IL2 (интерлейкин-2),TNF (фактор некроза опухоли-), IFN (-интерферон), CD40L, CD69 и т.д.) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответствующим образом, фрагмент считается иммуногенным, если он вызывает ответ, составляющий по меньшей мере 20%, подходящим образом по меньшей мере 50% и в особенности по меньшей мере 75% (как, например, по меньшей мере 90%) активности эталонной последовательности в анализе T-клеточной пролиферации и/или продукции IFN-. В некоторых случаях для получения эквивалентного биологического ответа на саму полноразмерную последовательность можно использовать множество фрагментов полноразмерного полипептида (которые могут перекрываться или не перекрываться и могут охватывать или не охватывать полноразмерную последовательность целиком). Например, по меньшей мере два иммуногенных фрагмента (например, три, четыре или пять), как описано выше, которые в комбинации обеспечивают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе in vitro рестимуляции PBMC или цельной крови (например, в анализеT-клеточной пролиферации и/или продукции IFN-). Пептиды с SEQ ID NO: 127-156 представляют собой особенно интересные фрагменты (в частности пептиды в SEQ ID NO: 127-133 и 143-156). Варианты. Термин "варианты" или "консервативно модифицированные варианты" применяется как к аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновой кислоты. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновой кислоты, то термин "консервативно модифицированные варианты" относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или, когда нуклеиновая кислота не кодирует какую-либо аминокислотную последовательность, по существу к идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода любой заданный белок кодируется большим числом функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в любом положении, где аланин задается кодоном, данный кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов, не вызывая изменений в кодируемом полипептиде. Такие варианты нуклеиновых кислот приводят к "молчащим" или "вырожденным" вариантам, которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. Каждая приведенная здесь последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждый возможный молчащий вариант нуклеиновой кислоты. Специалисту будет понятно,что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина, и TGG, который обычно представляет собой единственный кодон для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности. Полинуклеотид по изобретению может содержать несколько молчащих вариантов (например, могут быть изменены 1-50, как, например, 1-25, в частности 1-5 кодонов и в особенности 1 кодон) по сравнению с эталонной последовательностью. Полинуклеотид по изобретению может содержать несколько не являющихся молчащими консервативных вариантов (например, могут быть изменены 1-50, как, например, 1-25, в частности 1-5 кодонов и в особенности 1 кодон) по сравнению с эталонной последовательностью. Не молчащими вариантами являются такие, которые вызывают изменение в кодируемой амино- 15024826 кислотной последовательности (либо путм замены, либо делеции, либо вставки аминокислотных остатков). Специалистам в данной области будет понятно, что конкретная полинуклеотидная последовательность может содержать как молчащие, так и не молчащие консервативные варианты. Что касается вариантов белковой последовательности, то специалисту будет понятно, что индивидуальные замены, делеции или вставки в полипептиде, приводящие к изменению, добавлению или делеции одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот, представляют собой "консервативно модифицированный вариант", когда данное изменение(я) приводит к замене аминокислоты функционально аналогичной аминокислотой или к замене/делеции/вставке остатков, которые, по существу, не затрагивают биологической функции данного варианта. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты присутствуют в дополнение к полиморфным вариантам, межвидовым гомологам и аллелям по изобретению и не исключают их. Полипептид по изобретению может содержать ряд консервативных замен (например, могут быть изменены 1-50, как, например, 1-25, в частности 1-10 аминокислотных остатков и в особенности 1 аминокислотный остаток) по сравнению с эталонной последовательностью. В общем случае такие консервативные замены будут попадать в пределы одной из групп аминокислот, определенных ниже, хотя в некоторых случаях могут быть возможны и другие замены без существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Каждая из следующих ниже восьми групп содержит аминокислоты, которые являются типично консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (A), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонин (T); 8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins, 1984). Соответственно, такие замены не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Варианты белков также могут включать такие варианты, где дополнительные аминокислоты вставлены по сравнению с эталонной последовательностью, например, такие вставки могут присутствовать в 1-10 местах локализации (как, например, 1-5 местах локализации, подходящим образом в 1 или 2 местах локализации, в частности в 1 месте локализации) и могут, например, включать добавление 50 или меньшего количества аминокислот в каждом месте локализации (как, например, 20 или меньше, в частности 10 или меньше, в особенности 5 или меньше). Соответственно, такие вставки не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Один из примеров вставок включает короткий участок остатков гистидина (например, 2-6 остатков) для облегчения экспрессии и/или очистки рассматриваемого антигена. Варианты белков включают такие варианты, где аминокислоты делетированы по сравнению с эталонной последовательностью, например, такие делеции могут присутствовать в 1-10 местах локализации(как, например, в 1-5 местах локализации, удобно, если в 1 или 2 местах локализации, в частности в 1 месте локализации) и могут, например, включать делецию из 50 или меньшего количества аминокислот в каждом месте локализации (как, например, 20 или меньше, в частности 10 или меньше, в особенности 5 или меньше). Соответственно, такие делеции не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Специалисту будет понятно, что конкретный варианты белка может содержать замены, делеции и вставки (или любую их комбинацию). Способы определения эпитопных участков антигена описаны и проиллюстрированы в разделе"Примеры". Варианты предпочтительно демонстрируют по меньшей мере примерно 70% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности (как, например, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99%) с соответствующей эталонной последовательностью. Термины "идентичный" или "процент идентичности" в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более чем двум последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичны на 70%, возможно идентичны на 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% в определенной области), при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или внутри указанной области, что измеряется с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством выравнивания вручную и- 16024826 визуального просмотра. О таких последовательностях далее говорится, что они "по существу идентичны". Это определение также относится к комплементу тестируемой последовательности. Возможно, идентичность существует в области, длина которой составляет по меньшей мере от примерно 25 до примерно 50 аминокислот или нуклеотидов, или возможно в области длиной 75-100 аминокислот или нуклеотидов. Подходящим образом, сравнение выполняют в окне, соответствующем полной длине эталонной последовательности. Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задать альтернативные параметры. Далее с использованием алгоритма сравнения последовательностей, на основании параметров программы, рассчитывают процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности. Термин "окно сравнения", как он используется здесь, содержит ссылку на сегмент, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с тем же числом следующих один за другим положений, после того, как эти две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по SmithWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания по NeedlemanWunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью поиска (вариантов) согласно методу подобия по PearsonLipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA, 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или с помощью выравнивания вручную и визуального просмотра (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (приложение к Ausubel et al., eds. 1995. Одним примером полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP формирует множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивного, попарного выравнивания с целью выявления взаимосвязи и процента идентичности последовательностей. Он также производит построение дерева или дендрограммы, показывающего(ей) соотношения между кластерами, используемые для выравнивания. PILEUP использует упрощение метода прогрессивного выравнивания по FengDoolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 (1987). Используемый метод аналогичен методу, описанному HigginsSharp, CABIOS, 5:151-153 (1989). Данная программа может выравнивать вплоть до 300 последовательностей, каждая с максимальной длиной 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее похожих последовательностей с образованием кластера из двух выровненных последовательностей. Затем этот кластер выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают путем простого удлинения попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Окончательное выравнивание достигается в результате серии прогрессивных попарных выравниваний. Программа действует путем определения специфических последовательностей и их аминокислотных или нуклеотидных координат для сравнения участков последовательностей и путем указания программных параметров. Используя PILEUP, сравнивают эталонную последовательность с другими тестируемыми последовательностями с целью определения соотношения процента идентичности последовательностей, используя следующие параметры: вес бреши по умолчанию (3.00), вес длины бреши по умолчанию (0.10) и взвешенные концевые бреши. PILEUP можно взять из пакета программ для анализа последовательностиGCG, например, версии 7.0 (Devereaux et al., Nuc, Acids Res., 12:387-395 (1984. Другим примером алгоритма, который является подходящим для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0,которые описаны в Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) и Altschul et al., J. Mol. Biol.,215:403-410 (1990), соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа с использованием BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (National Centerfor Biotechnology Information (NCBI (веб-сайт www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает, прежде всего, идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (HSP) посредством идентификации коротких "слов" длиной W в анализируемой последовательности, которые или соответствуют, или удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому баллу T при выравнивании со "словом" той же длины в последовательности из базы данных. T обозначает пороговый балл для соседнего "слова"(Altschul et al., выше). Эти изначальные соседние удачные "слова" (hits) действуют в качестве затравок для инициирования поиска вариантов с целью нахождения более длинных HSP, содержащих их. Удачные "слова" удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличен кумулятивный балл выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей кумулятивные баллы рассчитывают с использованием параметров M (балл - вознаграждение за пару соответ- 17024826 ствующих остатков; всегда 0) и N (штрафной балл за ошибочно спаренные остатки; всегда 0). Для расчета кумулятивного балла в отношении аминокислотных последовательностей используют матрицу баллов. Удлинение удачных "слов" в каждом направлении останавливается, когда: кумулятивный балл выравнивания падает на величину X от его максимально достигнутой величины; кумулятивный балл доходит до нуля или ниже вследствие аккумуляции одного или более чем одного выравнивания остатков с отрицательными баллами; или при достижении конца любой из двух последовательностей. ПараметрыBLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину "слова" (W), равную 11; математическое ожидание (E), равное 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию длину "слова", равную 3; и математическое ожидание (E), равное 10; и выравнивания (B) по матрице баллов BLOSUM62 (см. HenikoffHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989, равные 50; математическое ожидание (E), равное 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, KarlinAltschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993. Одной из мер сходства, предоставляемых алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность(P(N, которая дает указание на вероятность того, что совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будет случайным. Например, считается, что нуклеиновая кислота аналогична эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше чем примерно 0,2,более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001. Настоящее изобретение также распространяется на полинуклеотиды, содержащие первую нуклеотидную последовательность, которая селективно гибридизуется в умеренно жестких условиях (как, например, в жестких условиях) с комплементом второй нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий:(2) вариант последовательности белка Rv3616c или(3) иммуногенный фрагмент последовательности белка Rv3616c,для лечения или предупреждения латентного TB. Фраза "жесткие условия гибридизации" относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей подпоследовательностью-мишенью, обычно в сложной смеси, содержащей нуклеиновую кислоту, а ни с какими-либо другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и в разных обстоятельствах будут различаться. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecularacid assays" (1993). Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была примерно на 510C ниже, чем термическая точка плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных значениях ионной силы и pH. Tm представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью при равновесии (поскольку последовательности-мишени присутствуют в избытке, то при Tm 50% зондов в равновесии находятся в связанном состоянии). Жесткими условиями будут такие, при которых концентрация соли ниже примерно 1,0 М для ионов натрия, в типичном случае концентрация ионов натрия (или других солей) составляет примерно 0,011,0 М при pH 7,0-8,3, а температура равна по меньшей мере примерно 30C для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60C для длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путм добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал по меньшей мере в два раза превышает фон, возможно в 10 раз превышает фоновую гибридизацию. Типичные жесткие условия гибридизации могут быть следующими: 50% формамида, 5SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) и 1% SDS (додецилсульфат натрия), инкубация при 42C, или 5SSC, 1%SDS, инкубация при 65C, с промывкой в 0,2SSC и 0,1% SDS при 65C. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в жестких условиях, остаются попрежнему функционально эквивалентными, если полипептиды, которые они кодируют, являются по существу идентичными. Это имеет место, например, когда копия нуклеиновой кислоты создана с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом. В таких случаях нуклеиновые кислоты обычно гибридизуются в умеренно жестких условиях гибридизации. Типичные "умеренно жесткие условия гибридизации" включают гибридизацию в буфере из 40% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS, при 37C и промывку в 1SSC при 45C. Положительная гибридизация превышает фон по меньшей мере в два раза. Средние специалисты легко поймут, что для обеспечения- 18024826 условий аналогичной жесткости могут быть использованы альтернативные условия гибридизации и промывки. Фраза "селективно (или специфически) гибридизуется с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, когда данная последовательность присутствует в сложной смеси (например,суммарной клеточной или библиотечной ДНК или РНК). Во всяком случае, варианты полипептидной последовательности будут обладать, по существу, той же активностью, что и эталонная последовательность (в случае полинуклеотидов, варианты полинуклеотидных последовательностей будут кодировать полипептид, который обладает, по существу, той же активностью, что и эталонная последовательность). Под "по существу той же активностью" понимают по меньшей мере 50%, подходящим образом по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе in vitro рестимуляции PBMC или цельной крови специфическими антигенами (например, рестимуляции в течение периода времени от нескольких часов вплоть до двух недель, как, например, вплоть до одних суток, от 1 суток до 1 недели или 1-2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством измерения лимфопролиферации, продукции цитокинов в супернатанте культуры (измеряемых с помощью ELISA, CBA и т.д.) или определения параметровT- и B-клеточных ответов с помощью внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с использованием антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как CD3, CD4, CD8, IL2, TNF, IFN, CD40L,CD69 и т.д.) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответственно, под "по существу той же активностью" понимают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и в особенности по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе T-клеточной пролиферации и/или продукции IFN-. Полинуклеотидные композиции. Как он использован здесь, термин "полинуклеотид" относится к молекуле, выделенной в свободном от суммарной геномной ДНК состоянии из конкретного образца. Поэтому полинуклеотид, кодирующий полипептид, относится к сегменту полинуклеотида, который содержит одну или более чем одну кодирующую последовательность, уже, по существу, изолированному или очищенному от общей геномной ДНК видов, из которых получен данный полинуклеотид. Как будет понятно специалистам в данной области, полинуклеотиды по данному изобретению могут включать геномные последовательности, экстрагеномные и кодируемые плазмидами последовательности и более мелкие генно-инженерные сегменты генов, которые экспрессируют, или которые могут быть адаптированы для экспрессии, белки, полипептиды, пептиды и т.п. Такие сегменты могут быть выделены из природных источников или синтетически модифицированы человеком. Термин "выделенный", как он использован здесь, означает, что полинуклеотид, по существу, свободен от других кодирующих последовательностей и что данный полинуклеотид не содержит больших порций неродственной кодирующей ДНК, таких как большие хромосомные фрагменты или другие функциональные гены, или участки, кодирующие полипептиды. Выделенная нуклеиновая кислота отделена от других открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют белки, отличающиеся от тех, которые кодирует данный ген. Несомненно, это относится к сегменту ДНК, как он выделен изначально, и не исключает генов или кодирующих участков, позже добавленных к данному сегменту человеком. Как будет понятно специалисту в данной области, полинуклеотиды могут быть одноцепочечными(кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК(геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы гяРНК (гетерогенная ядерная РНК), которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК по типу "один-к-одному"("one-to-one"), и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но необязательно, находиться в пределах полинуклеотида по настоящему изобретению, и полинуклеотид может быть, но необязательно, соединен с другими молекулами и/или веществами-носителями. Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует антиген Mycobacterium или его часть) или могут содержать вариант или биологический либо функциональный эквивалент такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более чем одну замену, добавление, делецию и/или вставку, что также описано ниже, предпочтительно таких, чтобы иммуногенность кодируемого полипептида относительно эталонного белка не уменьшалась. Обычно влияние кодируемого полипептида на иммуногенность можно оценить, как изложено здесь. В дополнительных воплощениях настоящего изобретения предложены выделенные полинуклеотиды и полипептиды, содержащие различные отрезки следующих один за другим участков последовательности, идентичной одной или более чем одной последовательности, раскрытой здесь, или комплементарной одной или более чем одной последовательности, раскрытой здесь. Например, согласно этому изобретению предложены полинуклеотиды, которые содержат по меньшей мере примерно 30, 40, 50, 75, 100,- 19024826 150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или более следующих один за другим нуклеотидов эталонной последовательности, раскрытой здесь, а также все находящиеся между ними промежуточные отрезки. Легко понять, что "промежуточные отрезки" в этом контексте означают отрезки любой длины, находящейся между приведенными величинами, как, например, 30, 31, 32 и т.д.; 50, 51, 52, 53 и т.д.; 100, 101, 102, 103 и т.д.; 150, 151, 152, 153 и т.д.; в том числе все целочисленные значения в диапазонах 200-500; 500-1000 и т.п. Более того, специалистам в данной области будет очевидно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид как раскрыто здесь. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют относительно низкую идентичность с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Однако в настоящем изобретении особенно рассматриваются полинуклеотиды, которые варьируют вследствие различий при использовании кодонов,например полинуклеотиды, которые оптимизированы для отбора кодонов человека и/или приматов. Более того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, предложенные здесь, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей из базы данных). Идентификация и характеристика полинуклеидов. Полинуклеотиды могут быть идентифицированы, получены с использованием любого из множества общепризнанных методов и/или на них можно воздействовать с использованием множества общеспризнанных методов. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован, как описано более подробно ниже, путм скрининга на микрочипах кДНК. Такие скрининги могут быть проведены, например, с использованием микрочипа Synteni (Palo Alto, CA) в соответствии с инструкциями производителя (и, по существу, как описано в Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10614-10619 (1996) и Heller et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2150-2155 (1997. Альтернативно, полинуклеотиды могут быть амплифицированы на основании кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих белки, раскрытые здесь, таких как клетки M.tuberculosis. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого подхода на основании предложенных здесь последовательностей могут быть сконструированы сиквенс-специфические праймеры, и их можно приобрести или синтезировать. Амплифицированный участок полинуклеотида может быть использован для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК M.tuberculosis) с использованием хорошо известных методов. В таких методах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу,используя один или более чем один полинуклеотидный зонд или праймер, подходящих для амплификации. Предпочтительно, чтобы библиотека была отобрана по размеру для включения молекул большего размера. Библиотеки, полученные с использованием случайных праймеров также могут быть предпочтительны для идентификации 5'- и расположенных выше участков генов. Геномные библиотеки являются предпочтительными для получения интронов и протяженных 5'-последовательностей. Что касается методов гибридизации, то частичная последовательность может быть мечена (например, посредством "ник"-трансляции или концевого мечения с помощью 32P) с использованием хорошо известных методов. Затем бактериальную или бактериофаговую библиотеку обычно подвергают скринингу посредством гибридизации на фильтрах, содержащих денатурированные бактериальные колонииLaboratory Manual (2000. Гибридизующиеся колонии или бляшки отбирают и размножают, и ДНК выделяют для дальнейшего анализа. Клоны кДНК могут быть проанализированы с целью определения количества дополнительной последовательности посредством, например, ПЦР с использованием праймера из частичной последовательности и праймера из вектора. Для идентификации одного или более чем одного перекрывающегося клона могут быть созданы рестрикционные карты и частичные последовательности. Затем можно определить полную последовательность с использованием стандартных методов,которые могут вовлекать создание ряда делеционных клонов. Полученные перекрывающиеся последовательности затем могут быть собраны в единую непрерывную последовательность. Полноразмерную молекулу кДНК можно создать путм лигирования подходящих фрагментов, используя хорошо известные методы. Альтернативно, существуют многочисленные методы амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. В таких методах амплификацию обычно осуществляют с помощью ПЦР. Для осуществления стадии амплификации можно использовать любой из множества имеющихся в продаже наборов. Праймеры можно конструировать с использованием, например, программного обеспечения, хорошо известного в данной области. Праймеры предпочтительно имеют длину 22-30 нуклеотидов, имеют содержание GC по меньшей мере 50% и отжигаются с последовательностью-мишенью при температуре примерно 68-72C. Амплифицированный участок может быть секвенирован, как описано выше, и перекрывающиеся последовательности собраны в- 20024826 непрерывную последовательность. Одной такой методикой амплификации является инвертированная ПЦР (см. Triglia et al., Nucl. AcidsRes., 16:8186 (1988, в которой используют рестриктазы для создания фрагмента в известном участке гена. Затем этот фрагмент подвергают циркуляризации посредством внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР с применением дивергентных праймеров, полученных исходя из последовательности известного участка. В рамках альтернативного подхода последовательности,примыкающие к неполной последовательности могут быть восстановлены путм амплификации с использованием праймера к линкерной последовательности и праймера, специфичного к известному участку. Обычно амплифицированные последовательности подвергают второму раунду амплификации с использованием того же самого линкерного праймера и второго праймера, специфичного к известному участку. Вариант этой процедуры, в котором используют два праймера, инициирующие удлинение в противоположных направлениях от известной последовательности, описан в WO 96/38591. Другая такая методика известна как "быстрая амплификация концов кДНК" или RACE. Эта методика включает применение внутреннего праймера и внешнего праймера, который гибридизуется с поли-А участком или последовательностью вектора, для идентификации последовательностей, расположенных в 5'- и 3'-направлениях от известной последовательности. Дополнительные методики включают ПЦР с захватом(Lagerstrom et al., PCR Methods Applic, 1:111-19 (1991 и ПЦР-"прогулку" (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991. Другие способы, использующие амплификацию, также могут быть использованы для получения полноразмерной последовательности кДНК. В некоторых случаях существует возможность получения полноразмерной последовательности кДНК путм анализа последовательностей, приведенных в базе данных экспрессируемых маркерных последовательностей (EST, Expressed Sequence Tag), таких как те, которые доступны из GenBank. Поиски перекрывающихся EST обычно могут быть осуществлены с использованием хорошо известных программ (например, поиски NCBI BLAST), и такие EST могут быть использованы для создания непрерывной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК также можно получить путм анализа геномных фрагментов. Экспрессия полинуклеотидов в клетках хозяина. Полинуклеотидные последовательности или их фрагменты, кодирующие полипептиды по изобретению или слитые белки либо их функциональные эквиваленты, могут быть использованы в молекулах рекомбинантной ДНК для того, чтобы направить экспрессию полипептида в соответствующих клетках хозяина. Вследствие природной вырожденности генетического кода могут быть получены другие последовательности ДНК, которые кодируют, по существу, такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и эти последовательности могут быть использованы для клонирования и экспрессии указанного полипептида. Как будет понятно специалистам в данной области, в некоторых случаях может иметь преимущество получение полипептид-кодирующих нуклеотидных последовательностей, имеющих неприродные кодоны. Например, для увеличения скорости экспрессии белка или для продуцирования рекомбинантного РНК транскрипта, имеющего такие желаемые свойства, как период полувыведения, который продолжительнее такового у транскрипта, созданного из последовательности природного происхождения, могут быть выбраны кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина. Более того, можно конструировать полинуклеотидные последовательности, применяя способы, общеизвестные в данной области для того, чтобы изменять полипептид-кодирующие последовательности по ряду причин, включая, но этим не ограничиваясь, изменения, которые модифицируют клонирование,процессинг и/или экспрессию генного продукта. Например, для конструирования нуклеотидных последовательностей можно использовать перетасовку ДНК путем случайной фрагментации и вторичной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР. В дополнение к этому, сайт-направленный мутагенез можно использовать для вставки новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтения кодонов, получения сплайс-вариантов или введения мутаций и т.д. Природные, модифицированные или рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью для того, чтобы кодировать слитый белок. Например, скрининг пептидных библиотек в отношении ингибиторов полипептидной активности может быть полезным для кодирования химерного белка, который может распознаваться имеющимся в продаже антителом. Также слитый белок может быть сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между полипептид-кодирующей последовательностью и гетерологичной белковой последовательностью, так чтобы полипептид можно было отщепить и очистить от гетерологичной группировки. Последовательности, кодирующие желаемый полипептид, можно синтезировать, целиком или частично, используя химические способы, хорошо известные в данной области техники (см. Caruthers, M.H.(1980. Альтернативно, сам белок можно получить, используя химические способы синтеза аминокис- 21024826 лотной последовательности полипептида или его участка. Например, пептидный синтез может быть осуществлен с использованием различных твердофазных методов (Roberge et al., Science, 269:202-204(1995, а автоматизированного синтеза можно достичь, например, с использованием пептидного синтезатора ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA). Вновь синтезированный пептид можно в значительной степени очистить с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, Creighton, Proteins, Structures and MolecularPrinciples (1983 или других сравнимых методов, доступных в данной области. Состав синтетических пептидов может быть подтвержден аминокислотным анализом или секвенированием (например, процедурой деградации по Эдману). Кроме того, аминокислотную последовательность полипептида или любого его участка можно изменить в процессе прямого синтеза и/или скомбинировать, используя химические способы, с последовательностями из других белков или любого их участка с целью продуцирования вариантного полипептида. Для того чтобы экспрессировать желаемый полипептид, нуклеотидные последовательности, кодирующие этот полипептид или его функциональные эквиваленты, можно встроить в соответствующий экспрессирующий вектор, т.е. вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, могут быть использованы для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, и соответствующие транскрипционные и трансляционные контрольные элементы. Эти способы включают методы рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и методы генетической рекомбинации in vivo. Такие методы описаны вMolecular Biology (обновляемые ежегодно). Ряд систем экспрессирующий вектор/хозяин можно использовать для содержания и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. Они включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы,такие как бактерии, трансформированные рекомбинантными бактериофаговыми, плазмидными или космидными ДНК-экспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусными); растительные клеточные системы, трансформированные вирусными векторами экспрессии (например, на основе вируса мозаики цветной капусты (CaMV); вируса табачной мозаики(TMV или бактериальными векторами экспрессии (например, плазмидами Ti или pBR322); или животные клеточные системы."Контрольные элементы" или "регуляторные последовательности", присутствующие в экспрессирующем векторе, представляют собой нетранслируемые участки вектора - энхансеры, промоторы, 5'- и 3'-нетранслируемые участки, которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут варьировать по своей эффективности и специфичности. В зависимости от применяемых векторной системы и хозяина можно использовать любое количество подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фагмиды PBLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) или плазмиды PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) и т.п. В клеточных системах млекопитающих обычно предпочтительны промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Если необходимо создать клеточную линию, которая содержит множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, преимущество в использовании имеют векторы на основе SV40(обезьяньего вируса 40) или EBV (вируса Эпштейна-Барр) с соответствующим селектируемым маркером. В бактериальных системах количество экспрессирующих векторов может быть выбрано в зависимости от применения, предполагаемого для экспрессируемого полипептида. Например, когда требуются большие количества, например, для индукции антител, то можно использовать векторы, приводящие к высокому уровню экспрессии слитых белков, которые можно легко очистить. Такие векторы включают,но не ограничиваются этим, многофункциональные клонирующие и экспрессирующие в E.coli векторы,такие как BLUESCRIPT (Stratagene), в которых последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид, может быть лигирована в этот вектор в рамке считывания с последовательностями для аминоконцевого Met и последующих 7 остатков -галактозидазы, таким образом, что продуцируется гибридный белок; векторы pIN (Van HeekeSchuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509 (1989 и т.п. ВекторыpGEX (Promega, Madison, Wis.) также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-S-трансферазой (GST). Обычно такие слитые белки растворимы и могут быть легко очищены из лизированных клеток путм адсорбции на глутатион-агарозных гранулах с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Белки, полученные в таких системах, можно конструировать таким образом, чтобы включить сайты гепарина, сайты расщепления тромбином или протеазой фактор XA, с тем, чтобы при желании представляющий интерес клонированный полипептид можно было освободить от GST-группировки. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae могут быть использованы различные векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы- 22024826 и PGH. Другие векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, включают промоторы генов GAP (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), PGK (фосфоглицераткиназа), GAL (галактозидаза) и ADH (алкогольдегидрогеназа). В качестве обзоров см. Ausubel et al. (выше) и Grant et al., Methods Enzymol., 153:516-544 (1987) и Romas et al. Yeast, 8:423-88 (1992). В случаях использования растительных экспрессирующих векторов экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может управляться любым из множества промоторов. Например, вирусные промоторы, такие как промоторы 35S и 19S CaMV, могут быть использованы по отдельности или в комбинации с омега-лидерной последовательностью из TMV (Takamatsu, EMBO J., 6:307-311 (1987. Альтернативно, могут быть использованы растительные промоторы, такие как промоторы генов малой субъединицы RUBISCO (рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа) или белков теплового шока(Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science, 224:838-843 (1984) и Winter et al.,Results Probl. Cell Differ, 17:85-105 (1991. Эти конструкции могут быть введены в растительные клетки путем прямой трансформации ДНК или путм патоген-опосредованной трансфекции. Такие методы описаны в ряде обычно доступных обзоров (см., например, Hobbs в McGraw Hill Yearbook of Science andTechnology, p. 191-196 (1992. Систему (клеток) насекомых также можно использовать для экспрессии представляющего интерес полипептида. Например, в одной такой системе в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в Trichoplusia larvae используют вирус ядерного полиэдроза Autographacalifomica (AcNPV). Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в несущественный участок вируса, например, полиэдриновый ген, и поместить под контроль полиэдринового промотора. Успешная вставка полипептид-кодирующей последовательности будет делать полиэдриновый ген неактивным и давать рекомбинантный вирус, не имеющий белка оболочки. Затем рекомбинантные вирусы могут быть использованы для инфицирования, например, клеток S.frugiperda или Trichoplusia larvae, в которых может экспрессироваться представляющий интерес полипептид (Engelhard et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A., 91:3224-3227 (1994. В клетках-хозяевах млекопитающих обычно доступен ряд экспрессирующих систем на основе вирусов. Например, в случаях, где аденовирус используется в качестве экспрессирующего вектора, последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, могут быть лигированы в аденовирусный транскрипционный/трансляционный комплекс, состоящий из позднего промотора и трехкомпонентной лидерной последовательности. Вставку в несущественный участок E1 или E3 вирусного генома можно использовать для получения жизнеспособного вируса, способного экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (LoganShenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3655-3659 (1984. Дополнительно, для увеличения экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV). Обзоры способов и протоколов для работы с аденовирусными векторами приведены в Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Дополнительные ссылки, касающиеся применения аденовирусных векторов, можно найти в Adenovirus:A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004. Для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид, также могут быть использованы специфические сигналы инициации. Такие сигналы включают инициирующий кодон ATG и примыкающие последовательности. В тех случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, его инициирующий кодон и расположенные выше последовательности встроены в соответствующий экспрессирующий вектор, никаких дополнительных транскрипционных или трансляционных контрольных сигналов может не потребоваться. Однако в случаях, когда встроены только кодирующая последовательность или ее участок, необходимо обеспечить экзогенные трансляционные контрольные сигналы, включая инициирующий кодон ATG. Более того,инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания, чтобы гарантировать трансляцию всей вставки. Экзогенные трансляционные элементы и инициирующие кодоны могут быть различного происхождения, как природными, так и синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить путем включения энхансеров, которые являются соответствующими конкретной используемой клеточной системе, которая применяется, как, например, энхансеров, которые описаны в литературе(Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ, 20:125-162 (1994. Кроме того, можно выбрать штамм клеток хозяина по его способности модулировать экспрессию встроенных последовательностей или осуществлять процессинг экспрессируемого белка желательным образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются этим, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, при котором происходит расщепление "препро"-формы белка, также можно использовать для облегчения правильной вставки, фолдинга и/или функции. Различные клетки-хозяева, такие как клетки CHO (яичников китайского хомячка), HeLa, MDCK, HEK293 (почек эмбриона человека) иWI38, которые имеют специфический клеточный аппарат и специфические механизмы для таких посттрансляционных активностей, могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка.- 23024826 Для продолжительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом обычно предпочтительна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют представляющий интерес полинуклеотид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные точки инициации репликации и/или эндогенные элементы экспрессии и селектируемый маркерный ген в том же или в отдельном векторе. После введения вектора клетки можно оставить расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, прежде чем перевести их в селективную среду. Задача селектируемого маркера заключается в том, чтобы придать устойчивость к селекции, и его присутствие делает возможным рост и выделение клеток, успешно экспрессирующих введенные последовательности. Устойчивые клоны стабильно трансформированных клеток могут быть размножены с использованием методов культивирования тканей, подходящих для данного типа клеток. Для получения трансформированных клеточных линий можно использовать любое количество систем селекции. Они включают, но не ограничиваются этим, гены тимидинкиназы (tk) (Wigler et al., Cell,11:223-32 (1977 и аденинфосфорибозилтрансферазы (aprt) вируса простого герпеса (Lowy et al., Cell,22:817-23 (1990, которые могут быть использованы соответственно в tk.sup.- или aprt.sup.- клетках. Кроме того, в качестве основы для селекции можно использовать устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам; например dhfr (дигидрофолатредуктаза), который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A., 77:3567-70 (1980; npt (неомицинфосфотрансфераза), который придает устойчивость к аминогликозидам, неомицину и G-418(Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1-14 (1981; и als (ацетолактатсинтаза) или pat (фосфинотрицинацетилтрансфераза), которые придают устойчивость соответственно к хлорсульфурону и фосфинотрицину (Murry, выше). Были описаны дополнительные селектируемые гены, например, trpB (триптофансинтаза), который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или hisD (гистидинолдегидрогеназа), который позволяет клеткам утилизировать гистидинол вместо гистидина (HartmanMulligan,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:8047-51 (1988. Недавно применение видимых маркеров сделало популярным использование таких маркеров, как антоцианины, -глюкуронидаза и ее субстрат GUS, люцифераза и ее субстрат люциферин, причем их широко используют не только для идентификации трансформантов, но также для количественного определения величины временной или стабильной экспрессии белка, присущей конкретной векторной системе (Rhodes et al., Methods Mol. Biol., 55:121-131 (1995. Хотя наличие/отсутствие экспрессии маркерного гена предполагает, что представляющий интерес ген также присутствует, его присутствие и экспрессия могут нуждаться в подтверждении. Например,если последовательность, кодирующую полипептид, встраивают в последовательность маркерного гена,рекомбинантные клетки, содержащие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген можно разместить в тандеме с полипептид-кодирующей последовательностью под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно также указывает на экспрессию тандемного гена. Альтернативно, клетки хозяина, содержащие и экспрессирующие желаемую полинуклеотидную последовательность, можно идентифицировать различными методами, известными специалистам в данной области. Эти методы включают, но не ограничиваются этим, ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации и методы биоанализа или иммуноанализа белков, которые включают мембранные технологии, технологии в растворах или технологии на основе чипов для детекции и/или количественного определения нуклеиновой кислоты или белка. В данной области техники известно множество протоколов детекции и измерения экспрессии полинуклеотид-кодируемых продуктов с использованием либо поликлональных, либо моноклональных антител, специфичных к данному продукту. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ(ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) и метод флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Для некоторых применений предпочтительным может быть двухстадийный, основанный на моноклональных антителах иммунологический анализ, в котором используются моноклональные антитела, реагирующие с двумя неперекрывающимися эпитопами на указанном полипептиде, но также можно использовать анализ конкурентного связывания. Эти и другие анализы описаны, наряду с другими источниками, в Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) и Maddox et al., J. Exp. Med.,158:1211-1216 (1983). Большое разнообразие меток и методов конъюгирования известны специалистам в данной области,и их можно использовать в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения меченых гибридизационных или ПЦР-зондов для детекции последовательностей, относящихся к полинуклеотидам, включают олигомечение, "ник"-трансляцию, концевое мечение или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. Альтернативно, последовательности или любые их участки можно клонировать в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области,имеются в продаже и их можно использовать для синтеза РНК-зондов in vitro путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, например, T7, T3 или SP6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры можно проводить, используя различные имеющиеся в продаже наборы. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые могут быть использованы, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хеми- 24024826 люминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Клетки хозяина, трансформированные представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью, можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии и выделения белка из клеточной культуры. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может секретироваться или оставаться внутри клетки в зависимости от используемых последовательности и/или вектора. Как будет очевидно специалистам в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды, могут быть сконструированы таким образом, чтобы содержать в себе сигнальные последовательности, которые управляют секрецией кодируемого полипептида через мембрану прокариотических или эукариотических клеток. Другие рекомбинантные конструкции могут быть использованы для присоединения последовательностей, кодирующих представляющий интерес полипептид, к нуклеотидной последовательности,кодирующей полипептидный домен, который будет облегчать очистку растворимых белков. Такие облегчающие очистку домены включают, но не ограничиваются этим, металл-хелатирующие пептиды, такие как гистидин-триптофановые модули, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованных металлах, домены белка A, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе FLAGS-удлинения/аффинной очистки (Immunex Corp., Seattle,Wash.). Встраивание расщепляемых линкерных последовательностей, таких как линкерные последовательности, специфичные к фактору XA или энтерокиназе (Invitrogen, San Diego, Calif.), между доменом очистки и кодируемым полипептидом можно использовать для облегчения очистки. Один такой экспрессирующий вектор обеспечивает экспрессию слитого белка, содержащего представляющий интерес полипептид, и этот вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 гистидиновых остатков, находящихся перед тиоредоксиновым или энтерокиназным сайтом расщепления. Гистидиновые остатки облегчают очистку на IMIAC (аффинная хроматография с использованием иммобилизованных ионов металлов), как описано в Porath et al., Prot Exp. Purif., 3:263-281 (1992), в то время как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство для очистки желаемого полипептида из слитого белка. Обсуждение векторов, кодирующих слитые белки, приведено в Kroll et al., DNA Cell Biol., 12:441-453 (1993. Методы доставки полинуклеотидов in vivo. В дополнительных воплощениях генетические конструкции, содержащие один или более полинуклеотидов по изобретению, вводят в клетки in vivo. Этого можно достичь с использованием любого из различных хорошо известных подходов; некоторые из них приведены ниже с целью иллюстрации. 1. Аденовирус. Один из предпочтительных способов для in vivo доставки одной или более чем одной последовательности нуклеиновой кислоты включает применение аденовирусного экспрессирующего вектора. Подразумевается, что "аденовирусный экспрессирующий вектор" включает такие конструкции, которые содержат аденовирусные последовательности, достаточные для (а) поддержания упаковки конструкции и для (б) экспрессии полинуклеотида, клонированного в нем в смысловой или антисмысловой ориентации. Конечно, в контексте антисмысловой конструкции экспрессия не требует, чтобы продукт гена синтезировался. Экспрессирующий вектор содержит генно-инженерную форму аденовируса. Знание генетической организации аденовируса, представляющего собой вирус с линейной двухцепочечной ДНК, 36 т.п.н.,позволяет производить замену больших участков аденовирусной ДНК чужеродными последовательностями вплоть до 7 т.п.н. (GrunhausHorwitz, 1992). В противоположность ретровирусу, аденовирусная инфекция клеток хозяина не приводит к хромосомной интеграции, потому что аденовирусная ДНК может реплицироваться в виде эписомы без потенциальной генотоксичности. Кроме того, аденовирусы структурно стабильны, и после активной амплификации не отмечено никакой геномной перестройки. Аденовирус может инфицировать фактически все эпителиальные клетки независимо от стадии их клеточного цикла. До настоящего времени аденовирусная инфекция обнаруживается связанной, повидимому, только с легкой формой заболевания, такого как острое респираторное заболевание, у людей. Аденовирус особенно подходит для применения его в качестве вектора для переноса генов из-за среднего размера его генома, легкости манипулирования, высокого титра, широкого диапазона клетокмишеней и высокой инфекционности. Оба конца вирусного генома содержат инвертированные повторы длиной 100-200 пар оснований (ITR), которые представляют собой цис-элементы, необходимые для репликации и упаковки вирусной ДНК. Ранние (E) и поздние (L) участки генома содержат разные транскрипционные единицы, которые разделены точкой начала репликации вирусной ДНК. Участок E1 (E1A и E1B) кодирует белки, отвечающие за регуляцию транскрипции вирусного генома и нескольких клеточных генов. Экспрессия участка E2 (E2A и E2B) приводит к синтезу белков для репликации вирусной ДНК. Эти белки вовлечены в репликацию ДНК, экспрессию поздних генов и "отключение" клеткихозяина (Renan, 1990). Продукты поздних генов, включая большую часть капсидных вирусных белков,экспрессируются только после значительного процессинга одного первичного транскрипта под контролем главного позднего промотора (MLP). MLP (расположенный на 16,8 единицы карты) особенно эффективен в поздней фазе инфекции, и все мРНК, контролируемые этим промотором, содержат 5'-тройственную лидерную (TPL) последовательность, которая делает их предпочтительными мРНК для- 25024826 трансляции. В настоящей системе рекомбинантный аденовирус получают в результате гомологичной рекомбинации между "челночным" вектором и провирусным вектором. Вследствие возможной рекомбинации между двумя провирусными векторами в результате этого процесса может быть получен аденовирус дикого типа. Поэтому крайне необходимым является выделение единичного клона вируса из индивидуальной бляшки и проверка его геномной структуры. Получение и размножение существующих в настоящее время аденовирусных векторов, которые дефектны по репликации, зависит от уникальной линии хелперных клеток, обозначенной 293, которая представляет собой клетки почки эмбриона человека, трансформированные фрагментами ДНК Ad5 (аденовируса 5 серотипа), и которая конститутивно экспрессирует белки E1 (Graham et al., 1977). Поскольку участок E3 является необязательным в аденовирусном геноме (JonesShenk, 1978), существующие в настоящее время аденовирусные векторы с помощью клеток 293 несут чужеродную ДНК либо в участкеE1, либо D3, либо в обоих этих участках (GrahamPrevec, 1991). В природе аденовирус может упаковывать приблизительно 105% генома дикого типа (Ghosh-Choudhury et al., 1987), обеспечивая емкость приблизительно для 2 дополнительных т.п.н. ДНК. В сочетании с приблизительно 5,5 т.п.н. ДНК, которые могут быть заменены в участках E1 и E3, максимальная емкость существующих в настоящее время аденовирусных векторов составляет менее 7,5 т.п.н. или примерно 15% от общей длины вектора. Более 80% вирусного генома аденовируса остается в остове вектора и является источником трансмиссивной цитотоксичности. На этом дефектность по репликации E1-делетированного вируса не заканчивается. Например, при использовании доступных в настоящее время векторов с высокой множественностью заражения(MOI) наблюдалась утечка экспрессии вирусных генов (Mulligan, 1993). Хелперные клеточные линии могут происходить из клеток человека, таких как клетки почки эмбриона человека, мышечные клетки, гемопоэтические клетки или другие мезенхимальные или эпителиальные клетки эмбриона человека. Альтернативно, хелперные клетки могут происходить из клеток других видов млекопитающих, пермиссивных для аденовируса человека. Такие клетки включают, например,клетки Vero (клетки почки зеленой мартышки) или другие эмбриональные мезенхимальные или эпителиальные клетки обезьяны. Как указано выше, в настоящее время предпочтительной хелперной клеточной линией является линия 293.Racher et al. (1995) описали улучшенные способы культивирования клеток 293 и размножения аденовируса. В одном из форматов агрегаты природных клеток выращивают путем инокуляции индивидуальных клеток в силиконизированных вращающихся колбах объемом 1 л (Techne, Cambridge, UK), содержащих по 100-200 мл среды. После перемешивания при 40 об/мин оценивают жизнеспособность клеток с использованием трипанового синего. В другом формате используют микроносители Fibra-Cel(Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 г/л) следующим образом. Клеточный инокулят, ресуспендированный в 5 мл среды, добавляют к носителю (50 мл) в колбе Эрленмейера объемом 250 мл и оставляют в стационарном состоянии на 1-4 ч с перемешиванием время от времени. Затем среду заменяют на 50 мл свежей среды и начинают встряхивание. Для продуцирования вируса клетки оставляют расти до конфлюентности примерно 80%, после чего среду меняют (до 25% конечного объема) и добавляют аденовирус при MOI 0,05. Культуры оставляют в стационарном состоянии на ночь, после чего объем увеличивают до 100% и начинают встряхивание, которое продолжают в течение еще 72 ч. Помимо требования, чтобы аденовирусный вектор был дефектным или, по меньшей мере, условно дефектным по репликации, природа аденовирусного вектора, по-видимому, не является решающей для успешного практического применения изобретения. Аденовирус может представлять собой любой из 42 разных известных серотипов или подгрупп A-F. Аденовирус 5 типа подгруппы C является предпочтительным исходным материалом для получения условно дефектного по репликации аденовирусного вектора для применения в настоящем изобретении, поскольку аденовирус 5 типа является человеческим аденовирусом, о котором известно огромное количество биохимической и генетической информации, и исторически его используют для большинства конструкций, использующих аденовирус в качестве вектора. Как указано выше, типичный вектор по настоящему изобретению дефектен по репликации и не будет иметь аденовирусного участка E1. Таким образом, удобнее всего будет вводить полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес ген, в положение, из которого удалены E1-кодирующие последовательности. Однако положение вставки конструкции в аденовирусных последовательностях не критично для этого изобретения. Полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес ген, также может быть встроен вместо делетированного участка E3 в E3-замещающих векторах, как описано Karlsson et al.(1986), или в участок Е 4, где линия хелперных клеток или хелперный вирус комплементирует дефект Е 4. Аденовирус легко выращивать, им легко манипулировать, и он демонстрирует широкий круг хозяевin vitro и in vivo. Эта группа вирусов может быть получена с высокими титрами, например 109-1011 бляшкообразующих единиц на 1 мл, и они обладают высокой инфекционностью. Жизненный цикл аденовируса не требует интеграции в геном клетки-хозяина. Чужеродные гены, доставляемые посредством аденовирусных векторов, являются эписомными и, следовательно, имеют низкую генотоксичность в отношении клеток хозяина. Не сообщалось ни о каких побочных эффектах при исследованиях вакцинации аде- 26024826 новирусом дикого типа (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), что демонстрирует их безопасность и терапевтический потенциал в качестве векторов для переноса генов in vivo. Аденовирусные векторы использовали в экспрессии эукариотических генов (Levrero et al., 1991;Gomez-Foix et al., 1992) и разработке вакцин (GrunhausHorwitz, 1992; GrahamPrevec, 1992). Недавно исследования на животных показали, что рекомбинантный аденовирус может быть использован для генной терапии (Stratford-PerricaudetPerricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Исследования при введении рекомбинантного аденовируса в разные ткани включают инстилляцию трахеи (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), мышечную инъекцию (Ragot et al., 1993), периферические внутривенные инъекции (HerzGerard, 1993) и стереотактическую инокуляцию в головной мозг(Le Gal La Salle et al., 1993). Аденовирусные векторы могут происходить из человеческого аденовируса. Альтернативно, они могут происходить из аденовируса других видов, например шимпанзе, что может иметь преимущество, поскольку данные вирусные векторы не нейтрализуются антителами против человеческого аденовируса,циркулирующего в крови многих человеческих субъектов (см., например: Tatsis N. et al., Gene Therapy,2006, 13: 421-429). Аденовирус 35 типа, который является относительно редко встречающимся, и поэтому против самого этого вектора имеются низкие уровни предсуществующего иммунитета, использовали в качестве системы доставки в некоторых противотуберкулезных вакцинах, находящихся в стадии разработки (см.,например, Radosevic et al., Infection and Immunity, 2007, 75(8): 4105-4115). Аденовирус 35 типа также может быть особенно полезен в настоящем изобретении в качестве вектора для доставки. 2. Ретровирусы. Ретровирусы представляют собой группу вирусов, содержащих одноцепочечную РНК, характеризующихся способностью превращать свою РНК в двухцепочечную ДНК в инфицированных клетках посредством процесса обратной транскрипции (Coffin, 1990). Полученная ДНК затем стабильно интегрируется в клеточные хромосомы в виде провируса и направляет синтез вирусных белков. Интеграция приводит к сохранению последовательностей вирусных генов в реципиентной клетке и ее потомках. Ретровирусный геном содержит три гена: gag, pol и env, которые кодируют капсидные белки, фермент полимеразу и компоненты оболочки соответственно. Последовательность, обнаруженная выше гена gag, содержит сигнал для упаковки генома в вирионы. На 5'- и 3'-концах вирусного генома имеются две последовательности длинных концевых повторов (LTR). Они содержат сильные промоторные и энхансерные последовательности и также необходимы для интеграции в геном клетки-хозяина (Coffin, 1990). Для того чтобы создать ретровирусный вектор, нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или более представляющих интерес олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, встраивают в вирусный геном в место расположения определенных вирусных последовательностей для получения вируса, дефектного по репликации. Для получения вирионов конструируют "упаковывающую" клеточную линию, содержащую гены gag, pol и env, но не содержащую LTR и "упаковывающие" компоненты(Mann et al., 1983). Когда в эту клеточную линию вводят (например, путем осаждения фосфатом кальция) рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК, вместе с ретровирусными LTR и "упаковывающими" последовательностями, "упаковывающая" последовательность способствует упаковке транскрипта РНК рекомбинантной плазмиды в вирусные частицы, которые затем секретируются в культуральную среду(NicolasRubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, затем собирают, возможно концентрируют и используют для переноса генов. Ретровирусные векторы способны инфицировать широкий спектр клеточных типов. Однако для интеграции и стабильной экспрессии необходимо деление клеток хозяина (Paskind et al., 1975). Недавно был разработан новый подход, который делает возможным специфическое "прицеливание" ретровирусных векторов, основанный на химической модификации ретровируса путем химического присоединения остатков лактозы к вирусной оболочке. Благодаря этой модификации смогли осуществить специфическое заражение гепатоцитов через сиалогликопротеиновые рецепторы. Был применен другой подход для "прицеливания" рекомбинантных ретровирусов, в котором использовали биотинилированные антитела против ретровирусного оболочечного белка и против специфического клеточного рецептора. Антитела соединяли друг с другом через биотиновые компоненты путем использования стрептавидина (Roux et al., 1989). С использованием антител против антигенов класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости они продемонстрировали, что имеет место инфекция различных человеческих клеток, несущих такие поверхностные антигены, экотропным вирусом in vitroAAV (Ridgeway, 1988; HermonatMuzycska, 1984) представляет собой парвовирус, открытый в виде контаминации аденовирусных штаммов. Он является повсеместно распространенным вирусом (антитела имеются у 85% человеческой популяции в США), связи которого с какой-либо болезнью не установлены. Кроме того, его классифицируют как депендовирус, поскольку его репликация зависит от присутствия хелперного вируса, такого как аденовирус. Были выделены пять серотипов, из которых лучше всего охарактеризован AAV-2. AAV имеет одноцепочечную линейную ДНК, которая заключена в кап- 27024826 сидную оболочку с капсидными белками VP1, VP2 и VP3 с образованием икосаэдрического вириона с диаметром 20-24 нм (MuzyczkaMcLaughlin, 1988). ДНК AAV имеет длину приблизительно 4,7 тысяч оснований. Она содержит две открытые рамки считывания и фланкирована двумя ITR. В геноме AAV имеются два основных гена: rep и cap. Ген rep кодирует белки, ответственные за вирусные репликации, тогда как cap кодирует капсидный белок VP1-3. Каждый ITR образует T-образную шпилечную структуру. Эти концевые повторы являются единственными существенными цис-компонентами AAV для интеграции в хромосомы. Поэтому AAV может быть использован в качестве вектора со всеми вирусными кодирующими последовательностями, удаленными и замененными кассетой генов для доставки. Идентифицированы три вирусных промотора, и они обозначены как p5, p19 и p40 в соответствии с их положением на карте. Транскрипция с p5 и p19 приводит к продуцированию белков rep, а транскрипция с p40 приводит к продуцированию капсидных белков(HermonatMuzyczka, 1984). Существует несколько факторов, которые побуждали исследователей к изучению возможности использования rAAV (рекомбинантного AAV) в качестве экспрессирующего вектора. Один из них заключается в том, что необходимых условий для доставки гена для интеграции в хромосому хозяина удивительно мало. Необходимо иметь инвертированные повторы (ITR) размером 145 п.н., что составляет только 6% генома AAV. Это оставляет место в векторе для составления вставки ДНК длиной 4,5 т.н. Несмотря на то что такая несущая емкость может препятствовать доставке больших генов с использованиемAAV, она в достаточной степени подходит для доставки антисмысловых конструкций. Кроме того, AAV представляет собой хороший выбор в качестве средств доставки ввиду своей безопасности. Существует относительно сложный механизм его "высвобождения": для мобилизации rAAV требуются не только аденовирус дикого типа, но также гены AAV. Более того, AAV не является патогенным и не ассоциирован с каким-либо заболеванием. Удаление вирусных кодирующих последовательностей минимизирует иммунные ответы на экспрессию вирусных генов, и, следовательно, rAAV не индуцирует воспалительный ответ. 4. Другие вирусные векторы в качестве экспрессирующих конструкций. Для доставки олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина в качестве экспрессирующих конструкций в настоящем изобретении можно использовать другие вирусные векторы. Можно использовать векторы, происходящие из таких вирусов, как вирус оспы коров(Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), лентивирусы, полиовирусы и герпесвирусы. Также можно ожидать,что будут использованы другие векторы, происходящие из поксвирусов, как, например, векторы на основе вируса оспы птиц. Они обладают некоторыми привлекательными свойствами для различных клеток млекопитающих (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990). Благодаря недавнему открытию дефектных вирусов гепатита В было достигнуто новое понимание структурно-функциональной взаимосвязи разных вирусных последовательностей. Исследования in vitro показали, что вирус может сохранять способность к хелпер-зависимой упаковке и обратной транскрипции, несмотря на удаление вплоть до 80% его генома (Horwich et al., 1990). Это навело на мысль, что большие участки генома могут быть заменены чужеродным генетическим материалом. Гепатотропизм и персистенция (интеграция) являлись особенно привлекательными свойствами для печень-направленного переноса генов. Chang et al. (1991) ввели ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в геном вируса гепатита В утки в место расположения последовательностей, кодирующих полимеразу, поверхностную и предповерхностную (pre-surface) кодирующие области. Осуществили его котрансфецию вместе с вирусом дикого типа в клеточную линию гепатомы птиц. Для инфицирования первичных утиных гепатоцитов использовали культуральные среды, содержащие высокие титры рекомбинантного вируса. Стабильную экспрессию гена CAT детектировали в течение по меньшей мере 24 суток после трансфекции (Chang etal., 1991). Дополнительные "вирусные" векторы включают вирусоподобные частицы (VLP) и фаги. 5. Невирусные векторы. Для того чтобы осуществить экспрессию олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению, экспрессирующая конструкция должна быть доставлена в клетку. Эта доставка может быть осуществлена in vitro, как в лабораторных методах трансформации клеточных линий, или in vivo или ex vivo, как при лечении некоторых болезненных состояний. Как описано выше, один из предпочтительных механизмов доставки осуществляется через вирусную инфекцию, когда экспрессирующая конструкция инкапсулируется в инфекционную вирусную частицу. После доставки экспрессирующей конструкции в клетку нуклеиновая кислота, кодирующая желаемые олигонуклеотидные или полинуклеотидные последовательности, может располагаться и экспрессироваться в разных сайтах. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая такую конструкцию, может стабильно интегрироваться в геном клетки. Эта интеграция может осуществляться в специфическом положении и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замена генов), или она может интегрироваться в случайном, неспецифическом положении (генная аугментация). В следующих других воплощениях нуклеиновая кислота может стабильно поддерживаться в клетке в виде отдельного эписомного сегмента ДНК. Такие сегменты нуклеиновой кислоты или "эписомы" кодируют последова- 28024826 тельности, достаточные для поддержания и репликации независимо от клеточного цикла хозяина или синхронизироанно с ним. То, каким образом экспрессирующая конструкция доставляется в клетку, и где в клетке сохраняется нуклеиновая кислота, зависит от типа используемой экспрессирующей конструкции. В некоторых воплощениях изобретения экспрессирующая конструкция, содержащая одну или более олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, может просто состоять из голой рекомбинантной ДНК или плазмиды. Перенос такой конструкции может быть осуществлен, например,любым способом, который физически или химически увеличивает проницаемость клеточной мембраны. Это особенно применимо для переноса in vitro, но также может быть использовано для применения invivo. Dubensky et al. (1984) успешно инъецировали полиомавирусную ДНК в форме кальций-фосфатных преципитатов в печень и селезнку взрослых и новорожденных мышей, продемонстрировав активную вирусную репликацию и острую инфекцию. Benvenisty и Reshef (1986) также продемонстрировали, что прямая внутрибрюшинная инъекция осажденных фосфатом кальция плазмид приводит к экспрессии трансфицированных генов. Рассматривается возможность того, что ДНК, кодирующая представляющий интерес ген, также может быть перенесена аналогичным образом in vivo и может экспрессировать генный продукт. Другое воплощение изобретения, касающееся переноса в клетки экспрессирующей конструкции,представляющей собой голую ДНК, может включать бомбардировку частицами. Этот способ зависит от способности ускорять ДНК-покрытые бомбардирующие микрочастицы до высокой скорости, позволяющей им проходить через клеточные мембраны и проникать в клетки, не вызывая их гибели (Klein et al.,1987). Разработано несколько устройств для ускорения небольших частиц. В основе одного такого устройства лежит высоковольтный разряд с целью генерирования электрического тока, что в свою очередь обеспечивает движущую силу (Yang et al., 1990). Используемые микрочастицы состоят из биологически инертных веществ, таких как вольфрамовые или золотые гранулы. Выбранные органы, включая печень, кожу и мышечную ткань крыс и мышей, подвергали бомбардировке in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Для этого может потребоваться хирургическое воздействие на ткань или клетки с целью исключения любой мешающей ткани, находящейся между пушкой и органом-мишенью, то есть, обработка ex vivo. И снова, ДНК, кодирующая конкретный ген, может быть доставлена с помощью этого способа и кроме того может быть встроена. В качестве способа доставки также можно использовать бактерии (например, листерии, см.WO 2004/11048) и, в особенности, БЦЖ. Полипептидные композиции. Как правило, полипептид, используемый в данном изобретении, будет представлять собой выделенный полипептид (т.е. отделенный от тех компонентов, вместе с которыми его обычно можно обнаружить в природе). Например, природный белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех сопутствующих веществ в природной системе. Предпочтительно такие полипептиды являются чистыми по меньшей мере примерно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, не являющийся частью природного окружения. Полипептиды могут быть получены с использованием любого из множества хорошо известных методов. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые последовательностями ДНК, которые описаны выше,можно легко получить из последовательностей ДНК с использованием любого из различных экспрессирующих векторов, известных средним специалистам в данной области. Можно добиться экспрессии в любой подходящей клетке хозяина, которая трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки хозяина включают прокариоты, дрожжи и клетки высших эукариот, такие как клетки млекопитающих и клетки растений. Предпочтительно используемыми клетками хозяина являются E.coli, дрожжи или линия клеток млекопитающих, такая как COS (клетки африканской зеленой мартышки) или CHO(клетки яичников китайского хомячка). Супернатанты из подходящих систем хозяин/вектор, секретирующих рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, сначала могут быть сконцентрированы с использованием имеющегося в продаже фильтра. После концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящий матрикс для очистки, такой как аффинный матрикс или ионообменная смола. Наконец, для дальнейшей очистки рекомбинантного полипептида может быть использована одна или более чем одна стадия обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Полипептиды по изобретению, их иммуногенные фрагменты и другие варианты, имеющие меньше чем примерно 100 аминокислот и обычно меньше чем примерно 50 аминокислот, могут быть также получены способами синтеза с использованием методов, хорошо известных средним специалистам в данной области техники. Например, такие полипептиды могут быть синтезированы с использованием любого из коммерчески доступных твердофазных методов, таких как метод твердофазного синтеза по Меррифильду, в котором аминокислоты последовательно добавляют к растущей аминокислотной цепи. См.Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963). Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов имеется в продаже у таких поставщиков, как Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster