Моноклональные антитела анти-rhd

Дафтару Гаутам Винод (IN), Каундиня Джон, Синек Томас (US) Изобретение относится к анти-RhD моноклональным антителам RhD1 RhD2 и RhD3 и моноклональным антителам, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепей,имеющих первую, вторую и третью области, определяющие комплементарность (CDRs),которые являются идентичными или по существу идентичными первой, второй и третьейCDRs вариабельным областям тяжелой цепи и легкой цепи антитела RhD1, RhD2 или RhD3. Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи RhD1 представлены SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, раскрытые в описании. Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи RhD2 представленыSEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, раскрытые в описании. Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи RhD3 представлены SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, раскрытые в описании. Кроме того,раскрыты полинуклеотиды, экспрессирующие векторы и экспрессирующие системы, кодирующие тяжелые и/или легкие цепи указанных антител; клетки, трансформированные экспрессирующими векторами или системами; способы получения указанных антител; описываются фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела и способы ингибирования или предупреждения иммунизации при использовании указанных антител.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БХАРАТ СИРУМС ЭНД ВЭКСИНС ЛТД. (IN) Область изобретения Данное изобретение относится к получению и применению анти-резус D моноклональных антител и их антиген-связывающих фрагментов. Предпосылки и известный уровень техники Антиген D системы резус (также называемый в данной области как RhD-антиген, резус-фактор и/или Rh-фактор) представляет собой антиген, который может присутствовать на поверхности эритроцитов человека. Тех индивидуумов, эритроциты которых содержат данный антиген, обычно называют"RhD-положительными", тогда как индивидуумов, эритроциты которых не содержат данный антиген,называют "RhD-отрицательными". Человек, который является RhD-отрицательным и никогда не подвергался воздействию RhDантигена, не будет продуцировать антитела анти-RhD (антитела против RhD-антигена). Однако переливание RhD-положительной крови RhD-отрицательному индивидууму приведет к сенсибилизации (иммунизации) RhD-отрицательного человека к RhD-антигену. Это может приводить к ряду осложнений. В частности, в случае, когда RhD-отрицательная женщина производит на свет RhD-положительного ребенка, существует опасность небольших количеств крови ребенка, проникающих в материнское кровообращение, вызывая у матери выработку антител анти-RhD. Хотя данное обстоятельство обычно не причинит вреда первому ребенку, в случае если теперь уже иммунизированная мать беременеет другим RhDположительным ребенком, тогда материнские анти-RhD антитела могут проникать через плаценту и атаковать клетки крови младенца, приводя к состоянию, известному как гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН). Следовательно, антитела анти-RhD обычно вводят RhD-отрицательным пациентам, у которых существует опасность воздействия RhD-положительной крови, для предупреждения пациента от иммунизации к RhD-положительной крови. Например, RhD-отрицательному пациенту могут быть предоставлены антитела анти-RhD: перед и/или вскоре после рождения или аборта RhD-положительного ребенка; после любого инцидента во время беременности, который может привести к кровотечению через плаценту; в виде обычной профилактической меры во время беременности или перед или вскоре после любого переливания компонентов крови, содержащих RhD-положительные эритроциты. Обычно используемые анти-RhD антитела были поликлональными антителами, полученными из плазмы крови RhD-отрицательных добровольцев, которые были неоднократно иммунизированы противRhD-положительных эритроцитов. Однако применение поликлональных антител имеет ряд общепризнанных недостатков, не последними из которых являются постоянная потребность в большом количестве доноров-добровольцев, достаточном для удовлетворения потребности на антитела, и риск заражения препарата антитела любыми вирусами, или другими патогенами, которые могут содержаться в донорской крови. В то время как поликлональные антитела представляют собой антитела, секретируемые рядом различных плазматических клеток, и таким образом представляют собой смесь молекул иммуноглобулинов,секретируемых против специфического антигена и потенциально распознающих различные эпитопы,моноклональные антитела получены из клеток, которые все являются клонами одной родительской клетки, и таким образом представляют собой гомогенную популяцию антител, как хорошо известно в данной области. Клеточные линии, из которых получают моноклональные антитела, создают и культивируют invitro, а это означает, что у моноклональных антител существует возможность получения по мере необходимости как в больших количествах, так и с высокой степенью чистоты. Таким образом, моноклональные анти-RhD антитела имеют ряд потенциальных преимуществ над препаратами поликлональных антиRhD антител, которые обычно были использованы. Был описан ряд способов получения моноклональных антител человека вообще и человеческих моноклональных анти-RhD антител в частности. Например, ЕР-А 2-0251440 раскрывает гетерогибридому,продуцирующую моноклональное анти-RhD антитело, образованную слиянием клеток несекретирующейIg мышиной миеломы с популяцией лимфоцитов человека, трансформированных вирусом ЭпштейнаБарра (EBV), продуцирующей анти-RhD Ig. Патент США US 5665356 описывает получение моноклональных анти-RhD антител человека, имеющих некоторые определенные свойства, продуцируемых путем культивирования отобранных Влимфоцитов человека, трансформированных EBV. Патент США US 6312690 описывает получение моноклональных анти-RhD антител рекомбинантными методами. Отбирали человеческую иммортализованную EBV линию клеток, продуцирующую анти-резус D моноклональное антитело, называемую D7C2. Последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой (Н) и легкой цепей (L) D7C2, клонировали, секвенировали и встраивали в рекомбинантный бакуловирусный экспрессирующий вектор под контролем сильного бакуловирусного промотора. Клетки насекомых, трансфицированные рекомбинантным бакуловирусом, культивировали, и рекомбинантное моноклональное антитело D7C2 извлекали из супернатанта клеток. Патент США US-A1-2003/0175969 описывает способ получения моноклональных анти-RhD антител, способных активировать эффекторные клетки, экспрессирующие FcyRIII, содержащий а) очистку моноклональных антител, полученных из клеточных линий, выбранных из гетерогибридом В-1 024722 лимфоцитов человека, или рекомбинантных клеточных линий животного или человека (таких как клетки СНО-K, СНО-Lec10, СНО Lec-1, СНО Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vera, Molt-4, COS-7, HEK293,YB2/0, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 и P3X63Ag8.653); b) добавление каждого антитела, полученного на стадии а), в другую реакционную смесь, содержащую RhD-положительные эритроциты, эффекторные клетки, содержащие клетки, экспрессируюшие FCYRIII, поливалентные IgGs; и с) определение процента лизиса клеток-мишеней и выбор моноклональных антител, которые активируют эффекторные клетки,вызывая существенный лизис RhD-положительных эритроцитов. Патент США US 6475787 раскрывает способ получения моноклональных антител, в котором подходящую эукариотическую клетку хозяина трансформируют последовательностью ДНК, кодирующей тяжелую цепь антитела, и последовательностью ДНК, кодирующей легкую цепь антитела, причем данные две последовательности являются связанными с различными амплифицируемыми маркерными генами, для обеспечения дифференциальной амплификации ДНК тяжелой и легкой цепи, для того, чтобы оптимизировать относительное число копий гена ДНК тяжелой и легкой цепей. В предпочтительном варианте изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО), которая является DHFR-дефицитной (т.е. неспособной к образованию дигидрофолатредуктазы), один из амплифицирующихся маркерных генов представляет собой амплифицирующийся маркерный ген аденозиндезаминазы (ADA), и другой представляет собой ген DHFR. Затем амплификация ДНК, кодирующей одну цепь антитела и связанной с геном ADA, может быть выполнена обработкой рекомбинантных клеток возрастающими концентрациями 2'-деоксикоформицина, тогда как амплификацию ДНК, кодирующей другую цепь антитела, и связанную с геном DHFR, выполняют обработкой клетки возрастающими концентрациями метотрексата (МТХ). Тем не менее, остается потребность в дополнительных моноклональных анти-RhD антителах и способах их получения. Описание изобретения В соответствии с первым аспектом данного изобретения обеспечивают выделенное моноклональное анти-RhD антитело, содержащее:a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую первую, вторую и третью CDRs (области, определяющие комплементарность), которые являются идентичными или идентичными по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, имеющую первую, вторую и третью CDRs, которые являются идентичными или идентичными по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 4; илиb) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую первую, вторую и третью CDRs, которые являются идентичными или идентичными по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRsSEQ ID NO: 6, и вариабельную область легкой цепи, имеющую первую, вторую и третью CDRs, которые являются идентичными или идентичными по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRsc) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую первую, вторую и третью CDRs, которые являются идентичными или идентичными по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRsSEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, имеющую первую, вторую и третью CDRs, которые являются идентичными или идентичными по существу соответствующим первой, второй и третьейCDRs SEQ ID NO: 12, где две CDRs являются "по сущесту идентичными", если они имеют последовательности аминокислот, которые предпочтительно по крайней мере на 80% идентичны и/или отличаются не более чем на одну аминокислоту, и где CDRs моноклинального антитела определяют с помощью программы IMGTN-QUEST. В применении здесь термин "анти-RhD антитело" относится как к полным антителам, так и к их фрагментам, которые имеют специфичность связывания с RhD-антигеном. Аффинность/специфичность связывания антитела может быть измерена различными анализами в виде известных любому специалисту, и которые могут быть реализованы обычным способом любым специалистом с обычной квалификацией в данной области. Например, антитела, распознающие RhD-антиген и специфически связывающиеся с RhD-антигеном, могут быть детерминированы с использованием одного или нескольких стандартных способов, известных любому специалисту с обычной квалификацией в данной области, такими как,но не ограничиваются ими: методы ИФА/ELISA (пер., ИФА/ ELISA, методы иммуноферментного анализа/твердофазного иммуноферментного анализа), например конкурентного ИФА (иммуноферментный анализ); методы проточной цитометрии; и/или ADCC (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности,АЗКЦ). Приводимые в качестве примеров способы конкурентного ИФА, проточной цитометрии и ADCC описывают более подробно в примерах, которые следуют. Как хорошо известно в данной области, полные антитела обычно образованы из одной или двух тяжелых, или одной или двух легких цепей. Каждая тяжелая и легкая цепи содержат вариабельную область и константную область. Вариабельные области (также называемые вариабельными доменами) обуславливают специфичность связывания антигена антителом. Каждый вариабельный домен состоит из областей, определяющих комплементарность (CDRs, из которых обычно существует три, названные CDR1,CDR2 и CDR3), перемежающихся с более консервативными областями, известными как каркасные об-2 024722 ласти. При укладке антитела (пер., фолдинге), для принятия правильной четвертичной структуры, CDRs тяжелой и легкой цепи образуют вместе антиген-связывающий сайт. Константная область тяжелой цепи состоит из трех или более константных доменов и зависит от класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG илиIgM) и изотипа (например, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) антитела. Она (пер., константная область тяжелой цепи) является идентичной для всех антител одного и того же класса и изотипа, но отличается в антителах различных изотипов. Константная область легкой цепи состоит из одного константного домена, константный домен которой содержит один из двух изотипов, каппа или лямбда, и является также идентичной во всех антителах одного и того же изотипа. Константные области антител обычно опосредуют связывание антитела с тканями организма-хозяина или факторами. Фрагменты антител в соответствии с данным изобретением обычно включают в себя, по меньшей мере, CDRs и достаточно каркасных областей для специфического связывания антигена. Приводимые в качестве примера типы фрагмента включают в себя, но не ограничиваются ими, Fab'-фрагмент (состоящий из вариабельного домена и константного домена как легкой, так и тяжелой цепей), F(ab')2 -фрагмент(два Fab'-фрагмента связаны дисульфидным мостиком в шарнирной области), Fv -фрагмент (состоящий только из вариабельных доменов только легкой и тяжелой цепей) и другие типы фрагмента, известного специалисту с обычной квалификацией в данной области.SEQ ID NOs: 2 и 4 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей моноклонального анти-RhD антитела, называемого здесь RhD1, и описанного ниже более подробно. Первая, вторая и третья CDRs SEQ ID NO: 2 соответственно представляют собой аминокислоты 45-52,аминокислоты 70-77 и аминокислоты 116-138 SEQ ID NOs: 2. Первая, вторая и третья CDRs SEQ ID NO: 4 соответственно представляют собой аминокислоты 45-53, аминокислоты 71-73 и аминокислоты 110119 SEQ ID NOs: 4.SEQ ID NOs: 6 и 8 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей моноклонального анти-RhD антитела, называемого здесь RhD2, и описанного ниже более подробно. Первая, вторая и третья CDRs SEQ ID NO: 6 соответственно представляют собой аминокислоты 45-52,аминокислоты 70-77 и аминокислоты 116-138 SEQ ID NOs: 6. Первая, вторая и третья CDRs SEQ ID NO: 8 соответственно представляют собой аминокислоты 45-53, аминокислоты 71-73 и аминокислоты 110119 SEQ ID NOs: 8.SEQ ID NOs: 10 и 12 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей моноклонального анти-RhD антитела, называемого здесь RhD3, и описанного ниже более подробно. Первая, вторая и третья CDRs SEQ ID NO: 10 соответственно представляют собой аминокислоты 4554, аминокислоты 72-78 и аминокислоты 117-138 SEQ ID NOs: 10. Первая, вторая и третья CDRs SEQ IDNO: 12 соответственно представляют собой аминокислоты 49-54, аминокислоты 72-74 и аминокислоты 111-120 SEQ ID NOs: 12. Таким образом, антитела в соответствии с первым аспектом данного изобретения содержат вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, имеющие первую, вторую и третью области, определяющие комплементарность (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), которые являются идентичными или идентичными по существу первой, второй и третьей областям, определяющим комплементарность (CDR1, CDR2 иCDR3) антитела RhD1, RhD2 или RhD3. В применении здесь, и как указано выше, две CDRs являются "идентичными по существу", если они имеют аминокислотные последовательности, которые предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичны и/или отличаются не более чем на одну аминокислоту. Более предпочтительно последовательности по меньшей мере на 90% идентичны и/или отличаются не более чем на одну аминокислоту. Предпочтительно, чтобы когда происходят аминокислотные замены, такие замены являлись консервативными заменами. Когда CDRs двух антител являются, по меньшей мере, идентичными по существу,разумно предположить, что полученный антигенсвязывающий сайт двух антител будет иметь сходные антигенсвязывающие свойства. Например, антитела RhD1 и RhD2 имеют высокое сходство CDRs, как может быть видно из фиг. 1 и 2 (описанных ниже более подробно), и оба (пер., антитела) имеют высокую аффинность связывания для RhD-антигена. Более предпочтительно CDRs антитела являются идентичными CDRs RhD1, RhD2 или RhD3. В применении здесь, термин "выделенное моноклональное антитело" относится к антителу, которое было получено моноклональными способами, и которое было выделено из антител других типов. Другими словами, единственными другими присутствующими антителами будут антитела, продуцируемые клетками одной и той же клеточной линии (т.е. все клетки, происходящие из одной и той же родительской клетки) в виде клетки, которая продуцировала моноклональное антитело. Это, конечно, в отличие от, например, поликлональных антител, когда антитела составляют смесь различных антител, происходящих из различных плазматических клеток. В предпочтительном варианте осуществления выделенное моноклональное анти-RhD антитело содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, которые по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, наиболее предпочтительно на 100% идентичны соответствующим вариабельным областям тяжелой и легкой цепей антитела RhD1, RhD2 или RhD3, с которыми его CDRs,-3 024722 по меньшей мере, идентичны по существу. Таким образом, в данном варианте осуществления антитело содержит или:a) вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентична вариабельной области SEQ ID NO: 2 и имеет первую, вторую и третью CDRs, которые идентичны или идентичны по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентична вариабельной области SEQ ID NO: 4 и имеет первую, вторую и третью CDRs, которые идентичны или идентичны по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 4; илиb) вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентична вариабельной области SEQ ID NO: 6 и имеет первую, вторую и третью CDRs, которые идентичны или идентичны по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 6, и вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентична вариабельной области SEQ ID NO: 8 и имеет первую, вторую и третью CDRs, которые идентичны или идентичны по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 8; илиc) вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентична вариабельной области SEQ ID NO: 10 и имеет первую, вторую и третью CDRs, которые идентичны или идентичны по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 80, 90, 95, 98 или 100% идентична вариабельной области SEQ ID NO: 12 и имеет первую, вторую и третью CDRs, которые идентичны или идентичны по существу соответствующим первой, второй и третьей CDRs SEQ ID NO: 12. Способы идентификации вариабельных областей антитела и CDRs, сравнения и сопоставления аминокислотных последовательностей и определения % идентичности между двумя аминокислотными последовательностями хорошо известны в данной области. Как указано выше, CDRs, антитела могут быть определены с использованием программного обеспечения, например программы IMGT/VQUEST(http://imgt.cines.fr/IMGT vquest/share/textes/) с использованием значений параметров, устанавливаемых по умолчанию. Вариабельные области и константные области антитела могут быть определены с использованием сравнения с базами данных известных иммуноглобулиновых последовательностей, таких как, IMGT/GENE-DB (http://imqt.cines.fr/IMGT GENE-DB/GENElectlivret=O) или V-BASE(http.V/vbase. mrc-cpe.cam.ac.uk/). Аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот, или для полных антител или для их специфических частей, могут быть сопоставлены и определен % их идентичности с использованием ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/), ClustalW2,(http://www.ebi.ac. uk/Tools/clustalw2/) или GAP,(http://qenome.cs.mtu.edu/align/align.html) с использованием значений параметров по умолчанию или с использованием патентованных программ, например Vector NTI v.10.3. В предпочтительном варианте осуществления антитело дополнительно содержит константный домен легкой цепи и по меньшей мере один константный домен тяжелой цепи. Константный домен легкой цепи может быть или каппа, или лямбда типа. Константный домен тяжелой цепи является предпочтительно константным доменом класса IgG. Таким образом, в данном варианте осуществления антитело может, например, быть Fab'-фрагментом или F(ab')2-фрагментом, как обсуждалось выше, или антитело может быть полным антителом. В случае полного антитела предпочтительно все константные домены тяжелой цепи представляют собой домены IgG (т.е. антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG). В конкретном предпочтительном варианте осуществления константный домен или область означает константный домен или область IgG 1 или IgG 3. Предпочтительно все константные домены(как легкой, так и тяжелой цепей) представляют собой константные домены человека. В соответствии со вторым аспектом данного изобретения обеспечивают выделенный полинуклеотид, кодирующий легкую и/или тяжелую цепь антитела в соответствии с первым аспектом. В применении здесь термин "выделенный полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, который был выделен из клеточного окружения (то есть он не присутствует в клетке или организме), и он может быть в очищенной форме (т.е. не содержащим по существу других полинуклеотидов, белков и клеточных компонентов), формы части композиции, содержащей другие полинуклеотиды и/или соединения. Термин "кодирующий легкую цепь" относится не только к последовательностям, кодирующим полные легкие цепи, но также к последовательностям, кодирующим их фрагменты (например, только вариабельный домен), когда антитело, подлежащее экспрессии, представляет собой фрагмент антитела, как описано выше. Аналогично, термин "кодирующий тяжелую цепь" относится не только к последовательностям,кодирующим полные тяжелые цепи, но также к последовательностям, кодирующим их фрагменты (такие как, только вариабельный домен, или вариабельный домен плюс один или несколько (константных доменов), но не все константные домены), где антитело, подлежащее экспрессии, представляет собой фрагмент антитела, как описано выше. Приводимые в качестве примера последовательности нуклеиновых кислот включают в себя релевантные кодирующие последовательности SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 и 11, последовательности которых являются кодирующими последовательностями для соответственно аминокислотных (пер., последова-4 024722 тельностей) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 и 12. Таким образом, например, если антитело содержит вариабельные области идентичные вариабельным областям SEQ ID NOs: 2 и 4 (тяжелая и легкая цепи антиRhD антитела, названного RhD 1), тогда приводимая в качестве примера последовательность нуклеиновой кислоты могла бы содержать участки SEQ ID NOs: 1 и 3, которые кодируют указанные вариабельные области. Альтернативно такие последовательности нуклеиновых кислот могли быть модифицированы для оптимизированной экспрессии (т.е. транскрипции и/или трансляции) в желаемой клетке-хозяина,например, с использованием способов, известных любому специалисту в данной области. Например, оптимизация последовательности нативной (пер., природной) нуклеиновой кислоты может содержать одно или несколько из: оптимизации распределения GC и AT/GC участков (для усиления стабильности мРНК); удаления ингибирующих мотивов (таких как преждевременные polyA-сигналы); удаления криптических сайтов сплайсинга (для предупреждения альтернативного, ошибочного сплайсинга мРНК); оптимизации вторичной структуры мРНК (во избежание жестких шпилек, возможно останавливающих трансляцию); оптимизации открытых рамок считывания (для устранения вторичных или альтернативных рамок считывания); и использование оптимизации кодона (для устранения редких кодонов, которые могут замедлять трансляцию). В соответствии с третьим аспектом данного изобретения обеспечивают экспрессирующую систему,содержащую один или несколько экспрессирующих векторов и в том числе кодирующие последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела в соответствии с первым аспектом. Экспрессирующий вектор (векторы) может быть любого типа, используемого в данной области, таким как, например, плазмиды и вирусные векторы. Экспрессирующие векторы данного изобретения предпочтительно являются плазмидами. В дополнение к последовательностям, кодирующим цепь антитела, вектор (векторы) будет (будут) включать в себя необходимые регуляторные последовательности для правильной транскрипции и трансляции кодирующих последовательностей в надлежащей клеткехозяина, например подходящие промоторы и сигнал полиаденилирования (полиА-последовательность). Дополнительно вектор (векторы) может (могут) содержать последовательность Kozak для повышенной эффективности экспрессии, и/или последовательность, кодирующую сигнальный пептид для посттрансляционного транспорта цепей антитела (например, для секреции антител). Дополнительный предпочтительный признак представляет собой присутствие одного или нескольких генов устойчивости к антибиотикам и/или других форм селективных маркеров, обеспечивающих селекцию клеток, которые были стабильно трансфицированы вектором, и/или которые демонстрируют более сильную экспрессию последовательностей, кодирующих антитело, как обсуждается ниже более подробно. Промоторы и полиА-последовательности, используемые для направления экспрессии последовательностей, кодирующих легкую и тяжелую цепи, могут быть любого типа, используемого в данной области. Известны всевозможные промоторы и полиА-последовательности, причем выбор подходящих промоторов и полиА-последовательностей для использования в выбранной клетке-хозяина находится полностью в пределах способностей специалиста с обычной квалификацией в данной области. Например, подходящие промоторы для использования в клетке-хозяина млекопитающего включают в себя ранний и поздний (промотор) SV40, (промотор) фактора элонгации 1 (EF-1) и цитомегаловирусный(CMV) промоторы. Подходящие полиА-последовательности включают в себя полиА - последовательности SV40, гормона роста крупного рогатого скота (BGH), тимидинкиназы (TK) и гормона роста человека(hGH). В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи, управляются промотором фактора элонгации 1 альфа (hEF-1) человека и полиА последовательностью BGH. В одном варианте осуществления экспрессирующая система содержит экспрессирующий вектор,который включает в себя как кодирующую последовательность легкой цепи, так и кодирующую последовательность тяжелой цепи. В альтернативном варианте осуществления последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи, переносятся отдельными векторами, экспрессирующая система, содержащая первый экспрессирующий вектор, в том числе кодирующую последовательность, кодирующую легкую цепь; второй экспрессирующий вектор, в том числе кодирующую последовательность, кодирующую тяжелую цепь. В данном варианте осуществления один или оба из указанных первого и второго экспрессирующих векторов могут включать в себя селективный маркер дигидрофолатредуктазы (dhfr). Данный маркер содержит кодирующую DHFR последовательность, которую соединяют с подходящим промотором и последовательностями полиаденилирования, предпочтительно ранним промотором SV40 (SV40E) и полиАпоследовательностями. DHFR позволяет синтез de novo предшественника ДНК - тимидина. Таким образом, трансфицированием линии клетки-хозяина, которая является DHFR-дефицитной (т.е. которая сама по себе является не способной продуцировать DHFR), любой квалифицированный в данной области специалист может затем отбирать клетки, которые имеют стабильно интегрированный вектор в их геном,выращиванием клеток в среде, дефицитной по дезоксирибонуклеозидам и рибонуклеозидам. Кроме того,после выделения успешно трансфицированных клеток экспрессия желаемой кодирующей последова-5 024722 тельности (последовательностей) (т.е. легкой и/или тяжелой цепи) может быть амплифицирована применением ингибитора DHFR - метотрексата (МТХ), который заставляет некоторые клетки реагировать путем амплификации больших областей ДНК, окружающих ген dhfr. В предпочтительном варианте осуществления один из указанных первого и второго экспрессирующих векторов включает в себя ген устойчивости к антибиотикам (последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает устойчивость к антибиотику, о котором идет речь), но не включает в себя кодирующую DHFR последовательность, и другие указанные экспрессирующие векторы включают в себя кодирующую DHFR последовательность, но не включают в себя ген, обеспечивающий устойчивость к одному и тому же антибиотику, как указанный ген устойчивости к антибиотику. Ген устойчивости к антибиотику может быть любого типа, используемого в данной области. Например, подходящие гены устойчивости к антибиотику для придания устойчивости клетки-хозяина млекопитающих включают в себя: гены устойчивости к аминогликозиду (например, неомицину, гигромицину В), такие как гены неомицинфосфотрансферазы (npt) и гигромицинВ фосфотрансферазы (hpt, hph); гены устойчивости к аминонуклеозиду (например, пуромицину), такие как гены пуромицин N-ацетилтрансферазы (рас); гены устойчивости к гликопептиду (например, блеомицину и флеомицину), такие как ген ble; и гены устойчивости к пептидил-нуклеозиду (например, бластицидину), такие как гены bls, bsr или bsd. Как и в случае с селективным маркером dhfr, ген устойчивости к антибиотику может, по мере необходимости, быть соединен с любым подходящим промотором и последовательностями полиаденилирования. Предпочтительными являются ранний промотор SV40 (SV40E) и поли(А)-последовательности. В конкретном предпочтительном варианте осуществления ген устойчивости к антибиотику содержит кодирующую неомицинфосфотрансферазу (NPT) последовательность. Затем клетки, стабильно трансфицированные вектором, в том числе кодирующей NPT последовательностью, могут быть отобраны путем выращивания клеток в среде, содержащей неомицин, или аналог неомицина, такой как G418,токсическое действие которого нейтрализуется NPT. Таким образом, описанный выше вариант осуществления, в котором один вектор имеет селективный маркер dhfr и другой имеет селективный ген устойчивости к антибиотику, делает возможным отбор только тех клеток, которые имеют стабильно интегрированные оба вектора в их геном, путем выращивания клеток в среде, дефицитной по дезоксирибонуклеозидам и рибонуклеозидам, и содержащей подходящий антибиотик (такой как неомицин или подходящий аналог, в случае, когда ген устойчивости к антибиотику представляет собой ген npt). Клетки, которые не трансфицировали, или трансфицировали только одной плазмидой не сохранят жизнеспособность в процессе отбора. Кроме того, поскольку котрансфицированные плазмиды часто интегрируют в одну точку генома, то дальнейший рост успешно трансфицированных клеток при возрастающих концентрациях МТХ, может все еще быть использован для эффективной амплификации экспрессии цепей антитела, кодируемых обоими векторами (т.е. для амплификации экспрессии последовательностей как тяжелой, так и легкой цепей). Наряду с тем должно быть отмечено, что в данном варианте осуществления вектор, несущий селективный маркер dhfr, не включает в себя ген, обеспечивающий устойчивость к одному и тому же антибиотику, как ген устойчивости к антибиотику, переносимый другим вектором, он, и на самом деле оба вектора, могут дополнительно содержать другой ген устойчивости к антибиотику, обеспечивающий устойчивость к дополнительному антибиотику. К тому же, дополнительный ген антибиотика может быть любого типа, применяемого в данной области. Например, когда один вектор, но не оба, несет последовательность, кодирующую NPT (обеспечивающую устойчивость к неомицину и его аналогам), то оба вектора могут успешно дополнительно содержать ген устойчивости к ампициллину (AmpR), с целью обеспечения устойчивости к ампициллину при встраивании в бактериальную клетку-хозяина. Другие гены устойчивости к антибиотикам, которые обычно используют для придания устойчивости в бактериальных хозяевах включают в себя: гены -лактамазы (обеспечивающие устойчивость к -лактамным антибиотикам, таким как ампициллин и другие пенициллины), например ТЕМ-1 -лактамаза; гены, обеспечивающие устойчивость к аминогликозидам, таким как стрептомицин, канамицин, тобрамицин и амикацин; и гены устойчивости к тетрациклину (т.е. тетрациклин, доксициклин, миноциклин, окстетрациклин), такие как гены tetA. В соответствии с четвертым аспектом данное изобретение обеспечивает клетку, трансформированную экспрессирующей системой в соответствии с третьим или четвертым аспектами. Клетки-хозяина для применения в данном изобретении могут быть любого подходящего типа. Однако в предпочтительном варианте осуществления клетки-хозяина (клетка, подлежащая трансфицированию) представляет собой эукариотическую клетку, более предпочтительно клетку позвоночного, наиболее предпочтительно клетку млекопитающего. Доступны различные подходящие клетки-хозяина млекопитающего, такие как перечисленные в US-A1-2003/0175969, упомянутом выше. Предпочтительные клетки-хозяина млекопитающего включают в себя все варианты клеток СНО, такие как СНО K1 и dhfrдефицитные СНО (DG44, DXB11); HEK293; BHK; COS-1 и COS-7; NSO; и PER.C6. Предпочтительные клетки-хозяина представляют собой клетки яичника китайского хомячка (СНО), в частности dfhrдефицитные клетки СНО (клетки dfhr-CHO). Клетки-хозяина могут быть трансфицированы экспресси-6 024722 рующими векторами с использованием стандартных способов и условий трансфекции, таких, которые известны в данной области. Приводимые в качестве примера условия трансфекции обеспечивают в примерах, которые следуют. В соответствии с пятым аспектом данное изобретение обеспечивает способ получения моноклональных антител, содержащий культивирование рекомбинантных клеток в соответствии с четвертым аспектом, и извлечение моноклонального антитела из среды для культивирования. Приводимые в качестве примера питательные среды и условия обеспечивают в примерах, которые следуют, но любые подходящие условия роста и коммерческие или изготовленные по заказу среды для выращивания могут быть использованы, в виде обычно применяемых в данной области. Кроме того любой общепринятый способ очистки секретируемых антител из среды для выращивания может быть применен, причем приводимые в качестве примера способы снова обрисовывают ниже. В соответствии с шестым аспектом данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело в соответствии с первым аспектом и фармацевтически приемлемый носитель. Моноклональные антитела могут быть приготовлены в виде желательных в зависимости от предполагаемого способа введения. Например, моноклональные антитела могут быть приготовлены для инъекции (например, внутримышечной) аналогично традиционным композициям поликлональных анти-D. Приводимые в качестве примера дозировки находятся в пределах от 150 до 300 мкг (как измерено титром агглютинации, как описано ниже более подробно). Приводимые в качестве примера носители включают в себя забуференный фосфатом физиологический раствор и глициново-солевой буферный раствор. Композиция может содержать моноклональные антитела только одного типа (т.е. единственные антитела, присутствующие в композиции, представляют собой антитела, продуцируемые клетками одной и той же клеточной линии). Альтернативно композиция может содержать комбинацию более чем одного типа моноклонального антитела. Например, композиция может содержать два или несколько различных типов моноклональных антител, которые находятся в соответствии с первым аспектом изобретения, например комбинацию двух или всех трех моноклональных антител RhD1, RhD2 и/или RhD3. Альтернативно или дополнительно, композиция могла бы содержать в дополнение к моноклональным антител в соответствии с первым аспектом данного изобретения, другие моноклональные антитела анти-RhD в виде, например, известных в данной области. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере одно моноклональное антитело, которое имеет константный домен или область IgG 1, и по меньшей мере одно моноклональное антитело, которое имеет константный домен или область IgG 3. В случае, когда композиция содержит комбинацию более чем одного типа моноклонального антитела, предпочтительно, чтобы композиция содержала не более чем 50 различных типов моноклональных антител. Более предпочтительно композиция содержит самое большее 25, 20, 15, 10 или 5 различных типов. В соответствии с седьмым аспектом данное изобретение обеспечивает способ ингибирования или предупреждения иммунизации RhD-отрицательного человеческого пациента против RhD-положительной крови, содержащий введение профилактически эффективного количества моноклонального антитела в соответствии с первым аспектом, или фармацевтической композиции в соответствии с шестым аспектом. Специфические показания и/или обстоятельства, при которых моноклональные антитела могут быть введены, соответствуют показаниям и/или обстоятельствам, при которых вводят существующие поликлональные антитела анти-RhD. В соответствии с восьмым аспектом данное изобретение обеспечивает применение моноклонального антитела в соответствии с первым аспектом или фармацевтическую композицию в соответствии с шестым аспектом для ингибирования или предупреждения иммунизации RhD-отрицательного человеческого пациента против RhD-положительной крови. В соответствии с девятым аспектом данное изобретение обеспечивает применение моноклонального антитела в соответствии с первым аспектом в производстве лекарственного средства для ингибирования или предупреждения иммунизации RhD-отрицательного человеческого пациента против RhDположительной крови. Изобретение дополнительно иллюстрируют в нижеследующих неограничивающих примерах со ссылкой также на прилагаемые чертежи, в которых: на фиг. 1 представлено сопоставление аминокислотных последовательностей тяжелых цепей моноклональных антител RhD1, RhD2 и RhD3, в котором вариабельные области были подчеркнуты и области,определяющие комплементарность, выделены полужирным (шрифтом) и затенены; на фиг. 2 представлено сопоставление аминокислотных последовательностей легких цепей моноклональных антител RhD1, RhD2 и RhD3, в котором вариабельные области были подчеркнуты и области,определяющие комплементарность, выделены полужирным (шрифтом); на фиг. 3 представлена карта плазмидного вектора рСВ 3; на фиг. 4 представлена карта плазмидного вектора рСВ 11; на фиг. 5 представлена карта рСВ 3, содержащего последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела анти-RhD (RhD НС); на фиг. 6 представлена карта рСВ 11, содержащего последовательность, кодирующую легкую цепь антитела anti-RhD (RhD LC); на фиг. 7 представлена кривая зависимости от дозы, получаемая в результате анализа ADCC (пер.,антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, ADCC), на которой цитотоксичность графически изображают в зависимости от логарифма концентрации антитела, при которой эритроциты были предварительно сенсибилизированы; на фиг. 8 представлен пример линейной регрессии, выполненной по релевантным точкам данных,взятых из фиг. 7. Списки последовательностей, которые существуют в количестве 48, обеспечивают перед чертежами. Списки последовательностей также обеспечивают отдельно в прилагаемом CD (пер., компактдиске) в электронном виде. Примеры Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) и В-клеток из периферической крови здоровых добровольцев, гипериммунизированных резус D (RhD)-положительными эритроцитами. Кровь здоровых RhD-отрицательных добровольцев, многократно иммунизированных эритроцитами, выделенными из здоровых RhD-положительных субъектов одной и той же группы крови АВО, получали в клинике. В течение четырех недель после последней иммунизации проверяли титр анти-RhD в сыворотке, у добровольцев забирали кровь, их мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) отделяли от других популяций клеток крови центрифугированием в градиенте Ficoll-Hypaque(Pharmacia), и клетки или использовали свежими, или криоконсервировали для более позднего использования. Т-клетки истощали обычной реакцией розеткообразования с эритроцитами барана, обработанными 2% S-(2-аминоэтил)изотиомочевины бромидом гидробромидом (АЕТ), и полученные обогащенные Вклетки трансформировали вирусом Эпштейна-Барр (EBV). Трансформация EBV. Поскольку было показано, что активация EBV является предпочтительной для последующего слияния В-клеток человека с соответствующим партнером для слияния, обогащенные В-клетки трансформировали EBV с использованием отработанного супернатанта клеточной линии мартышки В 95-8 в качестве источника вируса. В-клетки, ресуспендированные в полной среде IMDM (Gibco) с 30% фетальной телячьей сывороткой (FCS), высевали в 96-луночные планшеты при концентрации между 5103 и 2,5104 клеток/лунку. Супернатант В 95-8 добавляли в лунки в количестве, изменяющемся от 5% до 40% суммарного объема. Планшеты инкубировали в CO2-инкубаторе с 5% увлажнением при 37 С в течение от двух до четырех недель перед скринингом. Скрининг планшетов на трансформанты, секретирующие антитела анти-RhD. Супернатанты трансформированных В-клеток подвергали скринингу на наличие антител анти-RhD методом конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). Принцип теста состоит в следующем: меченое ссылочное моноклональное антитело анти-RhD с известной аффинностью связывания и специфичностью (Brad-5; NIBSC) конкурирует с немеченым антителом (в данном случае, секретируемыми антителами в супернатантах) за связывание с RhD-положительными эритроцитами. Ингибирование связывания ссылочного моноклонального антитела (mAb) указывает на наличие RhD-специфических антител, которые связываются с одним и тем же иммунодоминантным эпитопом как ссылочное mAb. Степень ингибирования связывания ссылочного mAb коррелирует с концентрацией и аффинностью интерферирующих антител.RhD-положительные эритроциты (гаплотип R2R2; ImmucorGamma), обработанные папаином, фиксировали глутаральдегидом и иммобилизовали на дне 96-луночных плоскодонных планшетов для тестирования. После тщательной промывки и блокирования планшетов, супернатанты от трансформированных В-клеток, стандартов и отрицательных контролей добавляли в лунки, и планшеты инкубировали в течение 30-60 мин при комнатной температуре (RT). Планшеты промывали три раза. Добавляли биотинилированное ссылочное mAb и планшеты инкубировали в течение 30 дополнительных минут при RT. Планшеты снова промывали и инкубировали со вторичным реагентом, конъюгатом экстравидинщелочная фосфатаза ExtrAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate (Sigma) в течение 30 мин при RT. После еще одной стадии промывки добавляли субстрат р-нитрофенил-фосфат Sigma Fast PNPP (p-NitrophenylPhosphate) (Sigma). При развитии окраски в достаточной мере, взаимодействие останавливали 3 N NaOH и связывание ссылочного mAb определяли считыванием оптических плотностей (при 405 нм) на спектрофотометре для прочтения планшет (планшет-ридере) (Bio-Rad). Данные анализировали с использованием пакета программного обеспечения, поставляемого с планшет-ридером. Слияние клеток. Так как В-клетки человека, трансформированные EBV, являются нестабильными и могут быстро перестать продуцировать антитела, то слияние с подходящим партнером для слияния обычно необходимо для продления их времени жизни и обеспечения их субклонирования. Таким образом, любые культуры трансформированных В-клеток, которые продуцировали антитела, ингибирующие связывание биоти-8 024722 нилированного ссылочного антитела с эритроцитами RhD+, в виде оцененного ИФА (смотри выше), сливали с гетерогибридомой K6H6/В 5 человека или стандартным способом с полиэтиленгликолем (PEG) или электрослиянием. Электрослияние выполняли с использованием установки для электрослияния (Eppendorf Multiporator) и буфера для электрослияния (Eppendorf) в соответствии с инструкциями производителя. Субклонирование гибридом. Субклоны выращивали на фидерных слоях, сформированных из клеточной линии фибробластов крайней плоти новорожденного CCD-1114Sk (ATCC, пер., Американская коллекция типовых культур). Фидерный слой поддерживали в среде IMDM (пер., среде Дульбекко DMEM в модификации Искова),содержащей 2-20% фетальной телячьей сыворотки (FBS), в зависимости от роста клеток. Планшеты с фидерным слоем обрабатывали УФ-светом в день субклонирования. В клеточных линиях, подлежащих субклонированию, производили подсчет, готовили подходящие разведения для высева приблизительно 0,3 клетки/лунку и суспензии клеток пипетировали в 96-луночные планшеты, содержащие фидерный слой. Каждую клеточную линию высевали по меньшей мере в два планшета. Культуры подпитывали каждые 3-4 дня. Супернатанты лунок, обнаруживающие рост гибридом, анализировали методом ИФА обычно в течение 3-4 недель. Гибридомные клоны, отобранные для создания рекомбинантных клеточных линий. Гибридомные клоны, отобранные для создания рекомбинантных антител, перечислены в табл. 1(ниже). Каждому клону присваивали упрощенное обозначение применительно к созданию рекомбинантной клеточной линии. Таблица 1 Обозначение антител анти-RhD Выделение РНК. Тотальную РНК из клеток гибридомы очищали с использованием реагента Trizol (Invitrogen) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем с дополнительной стадией экстракции РНК хлороформом для удаления следов фенола. Спектрофотометрическое количественное определение РНК выполняли при 260 нм, при условии, что 1 ОЕ (пер., оптическая единица) эквивалентна 40 мкг/мл РНК. Синтез первой цепи кДНК. Первую цепь кДНК синтезировали с использованием системы Super Script III First-Strand System(Invitrogen) для RT-PCR (пер., ОТ-ПЦР, полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) в соответствии с протоколом, предложенным поставщиком. Олиго d(T) праймер из набора использовали во всех случаях для праймирования (пер., затравки) реакций. Гидролиз РНК. Удаление молекул РНК из реакции с обратной транскрипцией выполняли расщеплением РНКазой Н (RNaseH) (системы для ОТ-ПЦР Super Script III First-Strand System for RT- PCR) в соответствии с инструкциями производителя. Первую цепь кДНК очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Присоединение "хвоста" к первой цепи кДНК. Для облегчения амплификации первой цепи кДНК с неизвестной 3'-последовательностью "хвост" поли-(А) (пер., "полиаденильный хвост") присоединяли к каждому 3'-концу каждой кДНК для создания определенного сайта праймирования. Для этой цели использовали рекомбинантную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (Invitrogen). Реакцию проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Продукт реакции подвергали очистке с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen). ПЦР-амплификация тяжелых (HCs) и легких(LCs) цепей Ig. Праймеры (SEQ ID NOs: 13-19), применяемые для ПЦР-амплификации последовательностей, кодирующих тяжелую и легкую цепи, с первой цепи кДНК перечислены ниже (в каждом праймере подчеркнут сайт рестрикции для EcoRI). Прямой праймер (совпадающий с поли(А)-выступающим концом первой цепи кДНК). Для всех цепей:(Stratagene). Обычно первые пять циклов праймировали только с прямым праймером; температура отжига составляла 45 С. После этого добавляли обратный, генспецифический, праймер и ПЦР удлиняли еще на 30-35 циклов при температуре отжига 50-65 С. Полученные фрагменты очищали в геле с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), субклонировали в клонирующий вектор pBluescript и секвенировали. Субклонирование ПЦР-продуктов в клонирующем векторе Bluescript. Очищенные ПЦР-продукты лигировали с использованием набора Quick Ligation Kit (NEB) в клонирующий вектор pBluescript (Stratagene) разрезали EcoRV. Бактериальные клетки DH5 трансформировали полученной ДНК и распределяли на поверхности чашек с LB, с добавлением 40 мкг/мл ампициллина и с предварительно внесенными 50 мкл 20 мг/мл Xgal и 25 мкл 200 мг/мл изопропилD-1 тиогалактопиранозида (IPTG). Колонии были сине/белые, отобранные на наличие инсерта. Выделение плазмидной ДНК и секвенирование. Отобранные белые колонии выскребали и размножали. ДНК выделяли с использованием набораQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Контрольное расщепление выполняли с использованием EcoRI (как прямой, так и обратный ПЦР-праймеры содержали сайт EcoRI). Инсерты в плазмидах, дающие ожидаемое распределение расщепления, секвенировали (Biotech Core). Последовательности, кодирующие RhD1, RhD2 и RhD3, и аминокислотные последовательности. Аминокислотные последовательности тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) RhD1, RhD2 и RhD3 и соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные тяжелую и легкую цепи,изложены в прилагаемой распечатке последовательности, как дополнительно описано ниже. Последовательности анализировали с помощью базы данных и программного обеспечения IMGT(imgt.cines.fr). Более конкретно последовательности константных областей определяли из базы данных IMGT/GENE-DB геномных последовательностей Ig (http://imqt.cines.fr/IMGT GENE-DB/GENEIectliyret=O) путем отбора видов, локуса, типа гена, группы (пропущенной подгруппы) и функциональных свойств (например, вид: Homosapiens, локус: IGH, тип гена: константный, группа: IGHC, функциональное свойство: функциональный),и поиска базы данных - из полученного в результате списка, желаемый изотип (например, IGG 1) выбирали для идентификации подходящей референсной последовательности (последовательностей)IMGT/LIGM-DB для сравнения с последовательностью RhD; вариабельные области определяли вычитанием константных областей и(http://imgt.cines.fr/IMGT vquest/share/textes/) путем отбора видов иммуноглобулина (человек), загрузкой нуклеотидной последовательности цепи полного антитела, или только вариабельной области, в форматFASTA, и посредством анализа последовательности с помощью параметров по умолчанию IMGT/VQUEST. Для дополнительной информации по базам данных IMGT7V-QUEST и IMGT/GENE-DB см. такжеV-BASE (база данных всех последовательностей вариабельной области зародышевой линии;http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) также может быть применена для определения, или подтверждения, концов вариабельной области. При выравниваниях любой специалист может найти последовательности зародышевой линии сигнальных пептидов, V-сегментов, D-сегментов (в случае необходимости) и Jсегментов всех тяжелых и легких цепей. Будет очевидно из анализа IMGT какие сегменты использованы в данной цепи антитела. Затем любой специалист может сослаться на конкретный J-сегмент в V-BASE для определения точного окончания.SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность кодирующей области RhD1 НС. Нуклеотиды 1-57 кодируют сигнальный пептид. Нуклеотиды 58-448 кодируют вариабельную область, нуклеотиды 133-156 которой кодируют CDR1, нуклеотиды 208-231 кодируют CDR2 и нуклеотиды 346-414 кодируют CDR3. Нуклеотиды 449-1437 кодируют константную область (причем константная область является константной областью гамма 1 или IgG1). Аминокислотная последовательность RhD1 НС представлена в виде SEQ ID NO: 2.SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность кодирующей области RhD1LC. Нуклеотиды 1-57 кодируют сигнальный пептид. Нуклеотиды 58-388 кодируют вариабельную область, нуклеотиды 133-159 которой кодируют CDR1, нуклеотиды 211-219 кодируют CDR2 и нуклеотиды 328-357 кодируют CDR3. Нуклеотиды 389-705 кодируют константную область (причем константная область является константной областью лямбда). Аминокислотная последовательность RhD1 LC представлена в виде SEQ ID NO: 4.SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность кодирующей области RhD2 НС. Нуклеотиды 1-57 кодируют сигнальный пептид. Нуклеотиды 58-448 кодируют вариабельную область, нуклеотиды 133-156 которой кодируют CDR1, нуклеотиды 208-231 кодируют CDR2 и нуклеотиды 346-414 кодируют CDR3. Нуклеотиды 449-1437 кодируют константную область (причем константная область является константной областью гамма 1 или IgG1). Аминокислотная последовательность RhD2 НС представлена в виде SEQ ID NO: 6.SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность кодирующей области RhD2LC. Нуклеотиды 1-57 кодируют сигнальный пептид. Нуклеотиды 58-388 кодируют вариабельную область, нуклеотиды 133-159 которой кодируют CDR1, нуклеотиды 211-219 кодируют CDR2 и нуклеотиды 328-357 кодируют CDR3. Нуклеотиды 389-705 кодируют константную область (причем константная область является константной областью лямбда). Аминокислотная последовательность RhD2 LC представлена в виде SEQ ID NO: 8.SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность кодирующей области RhD3 НС. Нуклеотиды 1-57 кодируют сигнальный пептид. Нуклеотиды 58-448 кодируют вариабельную область, нуклеотиды 133-162 которой кодируют CDR1, нуклеотиды 214-234 кодируют CDR2 и нуклеотиды 349-414 кодируют CDR3. Нуклеотиды 449-1578 кодируют константную область (причем константная область является константной областью гамма 3 или IgG 3). Аминокислотная последовательность RhD3 НС представлена в виде SEQ ID NO: 10.SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность кодирующей области RhD3LC. Нуклеотиды 1-66 кодируют сигнальный пептид. Нуклеотиды 67-391 кодируют вариабельную область, нуклеотиды 145-162 которой кодируют CDR1, нуклеотиды 214-222 кодируют CDR2 и нуклеотиды 331-360 кодируют CDR3. Нуклеотиды 392-711 кодируют константную область (причем константная область является константной областью каппа). Аминокислотная последовательность RhD3 LC представлена в виде SEQ ID NO: 12. Выравнивания аминокислотных последовательностей RhD1-RhD3. Аминокислотные последовательности RhD1-RhD3 сопоставляли выравниванием с помощью программы ClustalW (vvww.ebi.ac.uk/Tools/clustalw), с использованием значений параметров по умолчанию из веб-сайта. Полученные в результате выравнивания HCs и LCs изображены на фиг. 1 и 2 соответственно. Вариабельная область каждой последовательности была подчеркнута и CDRs выделены жирным шрифтом (причем первая встречающаяся CDR, при чтении последовательностей слева направо и сверху вниз, означает CDR1, вторая означает CDR2, и третья означает CDR3). В случае, когда одна и та же аминокислота встречается во всех трех цепях при выравнивании, эту аминокислоту идентифицируют в виде ниже релевантной аминокислоты в нижней последовательности (последовательности RhD3). Аналогичным образом GAP (http://genome.cs.mtu.edu/aliqn/aliqn.html) с использованием значений параметров по умолчанию (максимальное совпадение (Мах Match) = 11; минимальное ошибочное спари- 11024722 вание (Min Mismatch) = -4; штраф (penalty) открывания гэпа = 10; штраф (penalty) удлинения гэпа = 2) может быть применена для сопоставления выравниванием и определения процента идентичности между индивидуальными парами последовательностей или их отрезков. При таком сравнении, вариабельные области легких цепей RhD1 и RhD2 на 94% идентичны (104 совпадения (matches), 6 ошибочных спариваний (пер, несовпадений) (mismatches), 0 пропусков (gaps), оценка сходства 540), области CDR1 на 88% идентичны (8 совпадений (matches), 1 ошибочное спаривание (mismatch), 0 пропусков (gaps), оценка сходства 43), области CDR2 на 100% идентичны (3 совпадения (matches), 0 ошибочных спариваний(matches), 1 ошибочное спаривание (mismatch), 0 попусков (gaps), оценка сходства 43). Вариабельные области тяжелых цепей RhD1 и RhD2 на 94% идентичны (123 совпадения (matches), 7 ошибочных спариваний (mismatches), 0 пропусков (gaps), оценка сходства 650), области CDR1 на 87% идентичны (7 совпадений (matches), 1 ошибочное спаривание (mismatch), 0 пропусков (gaps), оценка сходства 37), области(gaps), оценка сходства 41) и области CDR3 на 95% идентичны (22 совпадения (matches), 1 ошибочное спаривание (mismatch), 0 пропусков (gaps), оценка сходства 131). Экспрессирующие векторы. Два плазмидных экспрессирующих вектора, названных рСВ 3 и рСВ 11, конструируют для экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела в клетках СНО dhfr. рСВ 3. Данную плазмиду иллюстрируют на фиг. 3. Компоненты данной плазмиды перечислены в табл. 2. Таблица 2 Компоненты экспрессирующего вектора рСВ 3 рСВ 11. Данную плазмиду иллюстрируют на фиг. 4. Компоненты данной плазмиды перечислены в табл. 3. Таблица 3 Компоненты экспрессирующего вектора рСВ 11 Инсерция рекомбинантных иммуноглобулиновых генов в экспрессирующие векторы. Вторую ПЦР использовали для амплификации HCs и LCs вместе с подходящими сайтами рестрикции, добавленными таким образом, чтобы фрагменты могли быть встроены (пер., инсертированы) в экспрессирующие векторы. Конструирование ген-специфичных прямых праймеров происходило на основе полученных последовательностей. Консенсусный мотив Kozak (GCCACC), известный для повышения эффективности эукариотической трансляции, включали в каждый прямой праймер (табл. 5). Праймеры (SEQ ID NOs: 20-27) для инсерции HCs и LCs RhD1-RhD3 в экспрессирующие векторы были следующими.RhD3 НС. Прямой GSP: Обратный праймер, используемый для всех тяжелых цепей:RhD3 LC. Прямой GSP: Обратный праймер: Цикл ПЦР для инсерцйи HCs и LCs RhD1-RhD3 в экспрессирующие векторы содержал следующие этапы: Конструирование варианта IgG3 RhD1 антитела. Вариант IgG3 RhD1 конструировали в виде химеры между вариабельной областью RhD1 и константной областью RhD3. Химеризация использовала преимущество идентичных 5'-концов константных областей RhD1 (IgG1) и RhD3 (IgG3). Обратный праймер, специфический для вариабельного доменаRhD1, конструировали для перекрывания трех кодонов константной области и для введения молчащих мутаций, которые создавали сайт рестрикции Nhel. Идентичные модификации вводили в константную область 5' -конца RhD3 прямым праймером. Сайт рестрикции Nhel делал возможным подходящее клонирование в рамке считывания амплифицированного вариабельного домена RhD1 перед константной областью RhD3. Это выполняли в два этапа. Сначала амплифицировали константную область НС IgG3 RhD3 антитела, разрезали ферментамиXbal и EcoRI и лигировали в вектор рСВ 3, расщепленный Xbal/EcoRI. На втором этапе эту промежуточную плазмиду повторно разрезали эндонуклеазами Xbal и Nhel, и амплифицированную вариабельную область RhD1, расщепленную теми же ферментами, встраивали. Праймеры (SEQ ID NO: 28-31), используемые для конструирования варианта IgG3 RhD, были следующими. Праймеры, используемые для амплификации константной области RhD3. Прямой: Обратный: Праймеры, используемые для амплификации вариабельного домена RhD1. Прямой: Обратный: Цикл ПЦР для конструирования варианта IgG3 RhD содержал следующие этапы:thermostable DNA-polymerase (Stratagene). Экспрессирующие векторы, содержащие клонированные гены антител. Кодирующие последовательности RhD1 НС, RhD1 LC, RhD2 НС, RhD2 LC, RhD3 НС, RhD3 LC,RhD1 V3C НС (химера, состоящая из вариабельного домена тяжелой цепи RhD1 и константной области тяжелой цепи RhD3) в виде инсертированных (пер., встроенных) в экспрессирующие векторы, в том числе также добавленные мотивы Kozak и сайты рестрикции, представлены в виде SEQ ID NOs: 32, 33, 34,35, 36, 37 и 38 соответственно. Фиг. 5 представляет собой карту рСВ 3, иллюстрирующую расположение инсертированной тяжелой цепи антитела анти-RhD, и фиг. 6 представляет собой карту рСВ 11, иллюстрирующую расположение инсертированной легкой цепи антитела анти-RhD (причем расположение инсерции является одним и тем же, независимо от подлежащих экспрессии специфических тяжелой или легкой цепи RhD1, RhD, RhD3 или RhD1V3C). Оптимизация генов. Кодирующие последовательности антител RhD1 и RhD3 оптимизировали с помощью GENEARTAG, используя алгоритмы собственной разработки. Оптимизированные кодирующие последовательностиRhD1 НС, RhD1 LC, RhD3 НС и RhD3 LC предоставлены в виде SEQ ID NOs: 39, 40, 41 и 42 соответственно. Клонирование оптимизированных генов RhD1 в экспрессирующих векторах. Оптимизированные гены RhD1 субклонировали в экспрессирующие векторы рСВ. Для добавления сайтов рестрикции, необходимых для клонирования, кодирующие области амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, перечисленных ниже. Каждый амплифицированный фрагмент инсертировали в соответствующий вектор и проверяли секвенированием. Праймеры (SEQ ID NOs: 43-46), которые использовали для присоединения сайтов рестрикции, совпадающих с экспрессирующими векторами рСВ для оптимизированных генов RhD 1, являются следующими. Оптимизированная RhD1 LC. Прямой: Обратный: Оптимизированная RhD1 LC. Прямой: Обратный: Сайты Xbal и BamH1 в праймерах подчеркнуты. Оптимизированные кодирующие последовательности RhD1 НС и RhD1 LC в виде инсертированных (пер., встроенных) в экспрессирующие векторы, в том числе присоединенные мотивы Kozak и сайты рестрикции, предоставлены в виде SEQ ID NOs: 47 и 48. Культура клеток. Среда для выращивания. Среду для выращивания МЕМ использовали на всех стадиях опытных работ с клеточной линией СНО. Компоненты, композиция и поставщики материалов показаны в табл. 4. После добавления всех компонентов полную среду фильтровали через фильтр 0,22 мкм (фильтр Stericup-GP, 0,22 мкм, Millipore или эквивалентный). Среда для замораживания. Состав среды для замораживания, используемой для криоконсервации клеток, приводят в табл. 5. Таблица 5 Компоненты среды для замораживания. Среда для замораживания 1 Среда для замораживания 2 Поддержание клеток. Дигидрофолатредуктаза (ДГФР)-дефицитные клетки СНО DXB11 выращивали в среде для выращивания клеток-хозяина 1 или 2 (табл. 4) и распределяли каждые 3-4 дня. Измерения плотности клеток и жизнеспособности. Плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность клеток определяли с использованием метода исключения с трипановым синим и гемоцитометра (Hausser Scientific). Стабильная трансфекция и амплификация в метотрексате (МТХ). Клетки СНО DXB11 котрансфицировали равными количествами плазмидной ДНК, кодирующей легкую и тяжелую цепи IgG человека (табл. 6). Трансфекции выполняли с использованием реагента липофектамин 2000 (Invitrogen), следуя рекомендациям производителя. Стабильные трансфектанты отбирали с использованием селективной среды для трансфектантов (табл. 4). Таблица 6 Условия для типичной трансфекиии клеток СНО DXB 11 Трансфицированные клетки культивировали в течение 2 дней при температуре 37 С и 5% СО 2 в среде для выращивания клеток-хозяина 1 или 2 перед началом процесса отбора путем замены среды для выращивания на селективную среду для трансфектантов (табл. 4). На протяжении процесса отбора истощенную (питательную) среду удаляли и заменяли на свежую(питательную) среду в случае необходимости. После того как процесс отбора завершали и трансфицированые клетки возобновляли рост, клетки или переносили в селективную среду для трансфектантов (табл. 4), содержащую различные уровни МТХ (Calbiochem) для амплификаци генов антител, или субклонировали (смотри ниже). В этом случае отбирали 12 наиболее продуцирующих клонов и объединяли для дальнейшей амплификаци в МТХ. Клонирование из одной клетки. Для того чтобы отобрать клоны из одной клетки, стабильно трансфицированные клетки высевали в подходящее число плоскодонных 96-луночных планшетов при 0,5-1 клеток на лунку. На протяжении процесса рост клеток и состояние мониторировали под микроскопом. Клетки культивировали в течение приблизительно двух недель перед отбором наиболее продуцирующих клонов скринингом с помощью метода ELISA. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Титры антител на протяжении всех стадий развития клеточной линии оценивали с использованием набора (пер., для количественного определения IgG человека методом ELISA) Human IgG ELISA Quantitation Kit (Bethyl Laboratories) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, планшеты дляELISA Nunc Maxisorp ELISA покрывали Fc-специфическим козьим поликлональным антителом противIgG человека в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Планшеты инкубировали в течение ночи при 4 С. На следующий день планшеты промывали три раза и блокировали в течение 1 ч порошковым обезжиренным молоком, растворенным в буфере для отмывки. После стадии отмывки пробы и стандарты пипетировали в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с последующими тремя промывками. Затем вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена(HRP) добавляли в каждую лунку и планшеты опять инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывали три раза в буфере для отмывки, ополаскивали один раз дистиллированной водой и подсушивали постукиванием. Добавляли субстрат, содержащий тетраметилбензидин (ТМВ), в каждую лунку и давали развиться окраске в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали серной кислотой и планшеты считывали на планшет-ридере (Bio- Rad, Molecular Dynamics или Dynex Technologies) при 450 нм. Данные анализировали с помощью пакета программного обеспечения, поставляемого с планшет-ридером. Экспрессия рекомбинантных антител из клеточных пулов, стабильно трансфицированных неоптимизированными кДНК. Схему трансфекций (выполненных в соответствии с табл. 6) и обозначений трансфицированных клеток обеспечивают в табл. 7. Таблица 7 Установленное название для трансфицированных пулов Обычно лучшей экспрессии добивались при субклонировании трансфицированных клеток после процесса отбора, клоны ранжировании по продуцированию антител посредством ELISA, и только пулы 12-ти наиболее продуцирующих клонов амплифицировали в МТХ. Амплификация отобранных, но несубклонированных трансфектантов давала пулы, обнаруживающие слабое продуцирование, хотя и за более короткое время. Одну типичную схему МТХ-амплификации показывают ниже. Отобранные клетки (0 нМ МТХ) переносили параллельно в селективную среду для трансфектантов,содержащую 50 или 100 нМ МТХ (стадия 1). Клетки, извлеченные со стадии 1, размножали и распределяли в 200 и 500 нМ МТХ (стадия 2). Клетки, которые выжили после стадии 2, размножали и подвергали амплификации в 100 нМ МТХ(стадия 3). На каждой стадии оценивали продуктивность антител посредством ELISA (табл. 8). Таблица 8 Примеры продуктивности неамплифицированных и амплифицированных пулов 12 наилучших клонов Пулы, дающие наилучшие титры антител, размножали в колбах для культуры тканей в селективной среде для трансфектантов (без МТХ и генетицина, и содержащей FBS с низким содержанием телячьихIgG вместо обычной FBS). Супернатанты из этих культур собирали и использовали для очистки антител. Экспрессия антител RhD1 и RhD3 посредством трансфицированных и амплифицированных клональных популяций клеток, адаптированных для бессывороточной среды. Поскольку уровни экспрессии антител, полученные из клеточных пулов (табл. 8), были не столь высоки как хотелось, то процессы трансфекции, отбора и амплификации выполняли заново, на этот раз с применением стадии субклонирования (как описано выше) после каждой стадии амплификации, к тому же после начальной стадии отбора, с тем, чтобы получить клональные клеточные линии (клоны из одной клетки), экспрессирующие амплифицированные уровни антитела анти-RhD. А именно клетки СНО DXB11 трансфицировали плазмидами, кодирующими тяжелую и легкую цепи или RhD1, или RhD3. Трансфекцию и отбор стабильно трансфицированных клеток выполняли в основном тем же самым способом, как описано выше. Затем трансфицированные клетки субклонировали и полученные клоны подвергали скринингу на продуцирование антител. Наиболее продуктивные клональные клеточные линии амплифицировали. После амплификаци клетки снова субклонировали и наиболее продуктивные клоны подвергали дополнительному раунду амплификции и субклонирования. Селективные среды и среды для амплификации, используемые для первой и второй стадий амплификации, перечислены в табл. 9. Конечные лучшие продуцирующие клональные клеточные линии (полученные после обоих раундов амплификации) адаптировали к росту в суспензии в коммерческих бессывороточных средах (ISCHOCD4, Irvine Scientific). Эту задачу выполняли или в качалочных колбах, или в роллерных флаконах путем засева клеток в смеси 1:1 конечной среды для амплификации (табл. 9) и бессывороточной среды, содержащей один и тот же уровень МТХ, и затем постепенно повышая соотношение бессывороточной среды на протяжении периода от четырех до шести недель, до того как клетки становились полностью способными к росту в 100%-ной бессывороточные среде. Максимальные продуктивности наиболее продуцирующих клональных клеточных линий RhD1 иRhD3 до и после адаптации к бессывороточной среде перечислены в табл. 9. Супернатанты этих трех культур снова собирали и использовали для очистки антител. Таблица 9 Селективные среды и среды для амплификации для пяти отобранных клонов RhD. Включены данные проуктивности до и после адаптации бессывороточным средам Очистка антител. рН супернатантов культур доводили до рН 7,2 1 N NaOH. Каждый супернатант фильтровали через фильтр 0,2 мкм и наносили на колонку с протеином А, предварительно уравновешенную в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Колонку промывали PBS для удаления любого несвязанного материала из культурального супернатанта. Антитело, связанное с протеином А в колонке, элюировали 0,1 М глицином (рН 2,5). Элюат нейтрализовали 2 М Трис-буфером, доведенным до рН 8,0. Элюат, содержащий моноклональное антитело, диализовали против PBS. Концентрацию антитела анти-RhD определяли реакцией агглютинации с использованием D-положительных эритроцитов. Концентрацию антител определяли спектрофотометрически при 280 нм с использованием значения оптической плотности 1,4 OD для раствора 1 мг/мл на основе коэффициента молярной экстинкции для моноклонального антитела человека. Количественное определение анти-D реакцией гемагглютинации. Уровни антитела анти-RhD в супернатантах и очищенном антителе определяли количественно измерением агглютинации обработанных бромелином RhD-положительных эритроцитов с помощью автоматического анализатора Technicon Autoanalyzer system, как описано ранее Gunson et. al. (H.H. Gunson,P.K. Phillips, and F. Stratton J. din. Path., 1972, 25, 198-205. Поликлональные антитела анти-RhD из NIBSC(пер., Национальный Институт Биологических Стандартов и Контроля, Великобритания) использовали в качестве стандарта (2-й международный стандарт 01/572). Вкратце, обработанные бромелином RhD-положительные эритроциты инкубируют с различными концентрациями антител анти-RhD. Клеткам позволяют агглютинировать на протяжении периода времени. Агглютинированные клетки удаляют в автоматический анализатор, а остальные эритроциты лизируют с помощью детергента. Оптическую плотность высвобождаемого гемоглобина измеряют спектрофотометрически. Концентрации анти-D проб рассчитывают с помощью стандартного графика, полученного из различных концентраций стандарта анти-D. Проточная цитометрия. Каждое моноклональнее антитело анти-RhD человека серийно разводили 1 к 3 вниз от 0,5 мг/мл для приготовления 15 разведений. Каждое разведение добавляли к 1-5105 RhD-положительных или RhDотрицательных эритроцитов человека (RBCs), в случае с иным образом совместимых генотипов, приготовленных с папаином для выработки антигенных компонентов RhD, более доступных для антител. Анти-IgG антитело человека, меченное флуоресцеин-изотиоционатом (FITC), использовали в качестве вторичного антитела для окраски антител, связанных с RBCs. Пробы анализировали на приборе FACSort (Becton-Dickinson) (пер., приборе для сортинга клеток с возбуждением флуоресценции). Популяцию RBC регулировали на основе сигналов рассеяния вперед(FS) и бокового рассеяния (SS). Флуоресценцию RhD-отрицательных проб считали фоновой (флуоресценцией), поскольку эти клетки не имеют RhD-антиген, который является мишенью для антител антиRhD. Таким образом, RhD-отрицательные клетки, инкубированные с конкретной концентрацией антитела, служили в виде отрицательного контроля для RhD-положительных клеток, инкубированных с одним и тем же разведением антитела. Затем специфическую флуоресценцию и процентное содержание RhDположительных клеток, связанных антителом анти-RhD (и окрашенных меченными FITC анти-IgG человека), определяли для каждого разведения антитела анти-RhD на основе разности между уровнем флуоресценции в RhD-положительных и RhD-отрицательных пробах. Для каждого антитела анти-RhD процент положительных клеток, связанных антителом, наносили на график против логарифма концентрации антитела и из этого графика оценивали ЕС 50. Это обеспечивало основную информацию об аффинности связывания и специфичности антител для RhD-антигена. Анализ ADCC. Эффективность антител анти-RhD в устранении RhD-положительных эритроцитов in vivo и таким образом применении антител для предотвращении иммунизации RhD-отрицательного индивидуума,подверженного действию RhD-положительной крови, измеряли с использованием анализа антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Анализ ADCC был на основе метода, описанного Miescher et al. (British Journal of Haematology 2000 111: 157-166). RhD-положительные эритроциты обрабатывали папаином и затем метили флуоресцентным красителем 5- (и 6) карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира. Меченые эритроциты предварительно инкубировали с различными концентрациями (0,1-50 нг/мл) антител анти-RhD в течение 1 ч. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) добавляли к суспензии эритроцитов и инкубировали в течение 18 ч в СО 2 инкубаторе при 37 С. Величину лизиса клеток-мишеней в конце инкубации определяли измерением высвобождения красителя из лизированных RBCs в супернатант с помощью флуориметра. Процент цитотоксичности рассчитывали в соответствии с нижеследующей формулой:Fcdet = максимальная флуоресценция контроля (полученная лизисом RBCs детергентом (1% ТритонХ 100;Fcmed = фоновая флуоресценция контроля (спонтанное высвобождение красителя из RBCs в отсутствие PBMCs и антитела). Затем процент цитотоксичности изображали графически против логарифма концентрации антитела,при которой эритроциты были предварительно инкубированы, и эти данные использовали для расчета ЕС 50, т.е. эффективной концентрации антитела, вызывающей 50% максимального специфического лизиса, достижимого этим антителом. В виде примера, фиг. 7 представляет собой график процента цитотоксичности снова против концентрации антитела, произведенного из результатов анализа ADCC с использованием стандарта NIBSC (поликлональных антител анти-RhD). Эта зависимость доза-эффект теоретически дает сигмоидальную кривую с почти линейной средней областью. Для выполнения линейной аппроксимации в этой области прямая линия может быть подогнана к имеющим отношение точкам данных с помощью линейной регрессии с использованием подходящего пакета программного обеспечения (например, Microsoft Excel). Фиг. 8, например, представляет собой линейную регрессию, выполненную на релевантных точках данных из фиг. 7. Затем уравнение, представляющее эту прямую линию, может быть применено для расчета ЕС 50. Например, для данных на фиг. 7, где максимальный специфический лизис,вызываемый стандартным поликлональным антителом NIBSC, составлял приблизительно 88% по сравнению с лизисом, индуцированным детергентом (100%), ЕС 50 рассчитывали для значения специфического лизиса, равняющемуся 44%. Результаты реакции гемагглютинации и анализа ADCC. Результаты анализов гемагглютинации и ADCC, выполненные в соответствии с процедурами, описанными выше, показаны ниже в табл. 10. Титры агглютинации выражали в виде микрограмм активного(связывающего RhD-антиген) антитела на 1 мг белка. Значения ЕС 50 определяли из двух независимых экспериментов. Таблица 10 Титры агглютинации и значения ЕС 50 для антител RhD 1, RhD3 и RhD4. Контрольное поликлональное антитело (стандарт NIBSC) и две серии контрольного моноклонального антитела включены для сравнения Композиции. Очищенные моноклональные антитела анти-RhD могут быть приготовлены для введения с использованием любого подходящего пути. Обычно антитела вводят инъекцией. При таких обстоятельствах антитело обычно готовят в виде жидкой суспензии антител в подходящем буферном растворе. Приводимые в качестве примера буферы включают в себя забуференный фосфатом физиологический раствор (20 мМ фосфатный буфер (рН 6,8, содержащий 150 мМ NaCl) и глициново-солевой буфер (0,3 М глицин,содержащий 0,15 М NaCl, доведенный до рН 6,5). Предпочтительные композиции содержат как моноклональные антитела, имеющие константную область IgG 1, так и моноклональные антитела, имеющие константную область IgG 3. Таким образом,предпочтительными являются композиции, содержащие RhD1-антитела (которые являются изотипомIgG 1), в сочетании с RhD3-антителами (которые являются изотипом IgG 3) и/или RhD4-антителами (которые состоят из тяжелой цепи V3C RhD1 и легкой цепи RhD1).