Противомикробная профилактика и лечение заболеваний, вызванных вирусом иммунодефицита человека и другими инфекциями

1 Область техники Настоящее изобретение относится к вирусу иммунодефицита человека, в особенности к способам лечения и профилактики заболеваний,вызванных этим вирусом и другими микробными инфекциями. Отмечалось, что во всем мире имеется около 22 миллионов человек, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), наибольшая доля новых случаев ВИЧ-инфекции наблюдалась в Африке и Карибском регионе. Типичное развитие ВИЧ-инфекции разделяется на несколько стадий: 1) передача вируса; 2) острый ретровирусный синдром; 3) сероконверсия; 4) клинический латентный период с наличием персистентной генерализованной лимфоаденопатии (ПГЛ) или без нее; 5) раннесимптомная ВИЧ-инфекция, известная вначале как связанный со СПИД комплекс, или ССК, а позднее названная "В-симптомы" в соответствии с классификацией Федерального центра контроля инфекционных заболеваний CDC (Center of Disease Control) 1993 г.; 6) синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) (индикаторное условие СПИД, согласно критериям CDC 1987 г. и пересмотренным критериям CDC 1993 г., соответствует количеству клеток CD4200/мм 3); и 7) развитая ВИЧ-инфекция, характеризуемая количеством клеток CD450/мм 3. Клетки CD4 являются лимфоцитами, представляющими собой мишени для ВИЧ. В 1993 г. CDC изменил определение СПИД, включив сюда всех пациентов с количеством CD4 200/мм 3; это определение относится к пациентам на стадиях 4-7 независимо от симптомов. Начальный острый ретровирусный синдром сопровождается резким падением количества клеток CD4, высокой вирусемией в культивируемой плазме и высокими концентрациями в плазме РНК ВИЧ. С развитием реакции накопления цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) наблюдается ослабление клинических симптомов и снижение высокого уровня вирусемии в плазме, выражаемой содержанием РНК ВИЧ. Количество клеток CD4 постепенно снижается в течение нескольких лет и затем более резко падает за 1,5-2 г до установления диагноза СПИД. Концентрации РНК ВИЧ в плазме относительно стабильны вплоть до поздней стадии развития ВИЧ, когда количество клеток CD4 снижается до уровня 200/мм 3 и клиническая картина характеризуется сопутствующими инфекциями,опухолями, истощением и неврологическими расстройствами. Обычно у около 10% пациентов можно поставить диагноз СПИД раньше снижения количества клеток CD4 до уровня 200/мм 3. В настоящее время средний срок от достижения уровня клеток CD4, равного 200/мм 3, до вызываемых СПИД осложнений составляет 12-18 мес. При отсутствии анти-ВИЧ терапии или профилактики средний срок от заражения вирусом до появления оснований для 2 диагноза СПИД составляет около 10 лет, а срок жизни после появления связанных со СПИД осложнений составлял ранее около 1 г. Полное развитие картины от сероконверсии до смерти при отсутствии анти-ВИЧ лечения для среднестатистического пациента занимает около 10 лет. Указывалось, что средний срок от ВИЧ сероконверсии до СПИД составлял 7 лет для получавших переливание крови, 10 лет для гемофиликов, 10 лет для наркоманов и 8-12 лет для мужчин-гомосексуалистов. Выяснилось,что с учетом качества ухода скорости прогрессирования симптомов не зависят от пола, расы и категории группы риска. Для пациентов в возрасте 16-24 лет в момент установления сероконверсии среднее время жизни равнялось 15 годам, для пациентов в возрасте выше 35 лет - 6 годам. Заражение ВИЧ может произойти при половом контакте, при введении лекарств вместе с зараженной кровью, при введении наркотиков инфицированными иглами или при внутриутробном переносе вируса. Отмечалось, что ВИЧинфекция с ранней симптоматикой, называемая также острым ретровирусным синдромом, происходит в указанных выше категориях риска с вероятностью 50-90%. Этот синдром отмечался также у 7 из 8 работников здравоохранения,зараженных ВИЧ после профессионального контакта. Срок от заражения до появления первых симптомов обычно составляет 2-4 недели,но инкубационный период может достигать 6 недель. Типичными симптомами являются повышение температуры, аденопатия, фарингит,сыпь, состоящая из эритематозных прыщевидных пятен с язвочками диаметром 5-10 мм на лице и теле, а иногда на конечностях, в том числе на ладонях и подошвах, или на слизистой оболочке рта, пищевода или гениталий, боль в мышцах или суставах, понос, головная боль,увеличение печени и селезенки, молочница,тошнота и рвота. Неврологические симптомы могут быть представлены менингоэнцефалитом,периферийной невропатией, параличом лицевых мышц, синдромом Гвилена-Баре, плечевым невритом, повреждением нервных корешков,ухудшением способности к узнаванию и психозом. Острая стадия болезни обычно сопровождается высоким уровнем вирусемии ВИЧ с р 24 антигенемией, вирусемией плазмы и высокими титрами ВИЧ в одноядерных клетках периферийной крови. Первой наблюдается реакция накопления цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), она на несколько недель опережает ощутимую гуморальную реакцию. Реакция ЦТЛ сопровождается снижением концентрации ВИЧ в периферийной крови на 3-5 логарифмов. В течение этой острой фазы заболевания высокий уровень вирусемии может сопровождаться распространением (диссеминированием) вируса в центральной нервной системе и лимфатической ткани. 3 Лимфатическая ткань служит главным резервуаром, где ВИЧ содержится и реплицируется. Установлено, что заражение нелимфоидных органов высокими количествами ВИЧ имеет место на поздних стадиях болезни. Обнаружено, что наличие симптомов (в большей степени, чем асимптоматическая сероконверсия) и затягивание болезни более чем на 14 дней, коррелирует с более быстрым развитием СПИД. Обычно у медицинского персонала сероконверсия с позитивным анализом сыворотки на ВИЧ наблюдается через 6-12 недель после заражения при переливании крови или ранении иглами. Средний срок составляет 63 дня. Реакция ЦТЛ сопровождается резким снижением количества вируса в крови, ослаблением в клинической картине острого ретровирусного синдрома и возвратом к уровню количества клеток CD4, превышающему уровень, считающийся нормальным в большинстве лабораторий. ВИЧ-инфицированный пациент утрачивает клинические симптомы и обычно при физическом осмотре не обнаруживает болезненных проявлений за исключением персистентной генерализованной лимфоаденопатии (ПГЛ), выраженной увеличенными лимфатическими узлами. Исследования лимфатических узлов обнаруживают высокие концентрации ВИЧ в виде внеклеточного вируса, вовлеченного в процессы, связанные с фоликулярными дендритными клетками в центрах прорастания, а также в виде внутриклеточного вируса, преимущественно в латентной форме. Лимфатическая ткань служит главным резервуаром ВИЧ, причем фоликулярные дендритные клетки фильтруют и захватывают свободный вирус и инфицированные клетки CD4, и вирусная нагрузка на одноядерные клетки периферической крови относительно низка. По мере прогрессирования болезни ВИЧ разрушает структуру лимфатического узла. При вирусологических исследованиях пациентов с асимптоматической ВИЧ-инфекцией обнаруживаются высокие скорости репликации ВИЧ с ежедневной продукцией в среднем 109 вирионов. Репликация вируса сопровождается массированной деструкцией и ежедневной продукцией 109 клеток CD4. Возобновление клетокCD4 в организме, так что полное замещение всех клеток происходит каждые 15 дней. СПИД считают следствием непрерывной интенсивной репликации ВИЧ-1, приводящей к прекращению деятельности CD4-лимфoцитoв из-за вируса и иммунологических реакций. Развитая ВИЧ-инфекция имеет место у пациентов с количеством клеток CD4 50/мм 3. Такие пациенты имеют малую вероятность выживания, средний срок жизни составляет 12-18 месяцев. Фактически все пациенты, умирающие от осложнений, связанных с ВИЧ, имеют количество клеток CD4 в этом диапазоне. 4 Уровень техники Комитет по пищевым продуктам и лекарствам (КПП) ("FoodDrug Administration",FDA) утвердил много ингибиторов обратной транскриптазы (ОТ). ОТ-энзимы превращают вирусную РНК в ДНК. Ингибиторы ОТ способны прервать этот процесс. Ингибитор ОТ AZTWellcome продает под торговыми марками Ретровир (Retrovir) и зидовудин (zidovudine), утвержден КПЛ в 1987 г. Ингибитор ОТ ddl, который фирма Bristol-Myers Squibb продает под торговыми марками Видекс (Videx) и диданозин, утвержден КПЛ в 1991 г. Ингибитор ОТddC, который фирма Hoffman-LaRoche продает под торговыми марками HIVID и дидезоксицитидин, утвержден КПЛ в 1992 г. Ингибитор ОТd4T, который фирма Bristol-Myers Squibb продает под торговыми марками Церит (Zerit) и ставудин (stavudine), утвержден КПЛ в 1994 г. Ингибитор ОТ ЗТС, который фирма Glaxo Wellcome продает под торговыми марками Эпивир(Epivir) и ламивундин (lamivundine), утвержден КПЛ в 1995 г. Ингибитор ОТ Nevirapine, который фирма Boehringer Ingelheim продает под торговой маркой Вирамун (Viramune), утвержден КПЛ в 1996 г. Сейчас КПЛ утвердил три ингибитора протеазы для лечения ВИЧ-инфекции. Первым ингибитором протеазы, утвержденным КПЛ,был Сагинавир (Saquinavir), который фирмаHoffman-LaRoche Laboratories продает под торговой маркой Инвираза (Invirase). Другой ингибитор протеазы, Ритонавир (Ritonavir), который фирма Abbott Laboratories продает под торговой маркой Норвир (Norvir), получил утверждение КПЛ в марте 1996, как и Индинавир (Indinavir),который фирма MerckСо продает под торговой маркой Криксиван (Crixivan). Ингибиторы протеазы имеют иной механизм действия, нежели утвержденные до них анти-ВИЧ лекарства, такие как аналоги нуклеозидов AZT и ЗТС, продаваемые фирмой GlaxoWellcome под торговыми марками зидовудинd4T, продаваемые фирмой Bristol-Myers Squibb под торговыми марками диданозин (didanosine) и ставудин (stavudine), а также ddC, продаваемый фирмой Roche Laboratories под торговой маркой дидезоксицитидин (dideoxycitidine). Ингибиторы протеазы блокируют фермент, необходимый ВИЧ для завершения его цикла репликации и формирования новых жизнеспособных вирусов. Без этого фермента-протеазы не могут синтезироваться полноценные структурные вирусные белки и образуется дефектный, неинфекционный вирус. Аналоги же нуклеозидов блокируют другой фермент, а именно обратную транскриптазу. Это воздействие может прерывать образование на вирусной РНК вирусной ДНК, которая может затем встраиваться в ДНК клеток человека. Заявляется, что комбинация 5 одного или более ингибиторов обратной транскриптазы с ингибитором протеазы, иногда называемая "коктейль", подавляет репликацию ВИЧ на двух стадиях цикла репликации. Клинические исследования, в которых сагинавир комбинировали с AZT, ddC или с обоими этими препаратами, демонстрируют более значительное снижение частиц ВИЧ в крови (показателя,который иногда называют вирусной нагрузкой) и большее увеличение количества клеток CD4(Т-лимфоцитов) в сравнении с результатом применения только ингибиторов обратной транскриптазы. Иногда коктейли оказывались токсичными и неэффективными для некоторых пациентов. К тому же пока для комбинаций(коктейлей) из ингибиторов ОТ и протеазы не удавалось продемонстрировать полноценной клинической эффективности, выраженной в увеличении длительности жизни или уменьшении скорости прогрессирования болезни. Тем не менее, врачи начинают относиться к ВИЧинфекции как к хроническому заболеванию,доступному для лечения, а не как к смертному приговору. Ингибитор протеазы сагинавир был утвержден КПЛ для применения в комбинации с ингибиторами обратной транскриптазы у пациентов с развитым СПИД. Некоторые пациенты могут переносить указанные ингибиторы без гематологических или неврологических токсических проявлений, обычных для аналогов нуклеозидов. Некоторые обычно прописываемые лекарства, включая рифампин, рифабутин, фенобарбитал, дилантин и дексаметазон, могут существенно снижать уровни ингибитора протеазы сагинавира в плазме, и их необходимо исключать для пациентов, принимающих сагинавир. Была отмечена устойчивость вирусов к ингибитору протеазы сагинавиру и к другим анти-ВИЧ лекарствам. Ингибиторы протеазы ритонавир и индинавир оказываются более эффективными против ВИЧ, чем обычный курс сагиновира. Ингибитор протеазы ритонавир требует хранения на холоду. Его обычно применяют в комбинации с аналогами нуклеозидов (лекарства типа AZT) или для монотерапии. На ранних стадиях изучения 32 пациента получали ритонавир вместе с AZT и ddC. Через 20 недель среднее количество клеток CD4 поднялось от начального уровня 83 клеток/мм 3 до 106 клеток/мм 3. Вирусная нагрузка, как мера количества вирусных копий в крови, снижалась почти в 100 раз. Доза ритонавира составляла 600 мг перорально дважды в день,для чего требовалось 12 капсул ежедневно. Лекарство выпускается в капсулах по 100 мг. Довольно обычные побочные эффекты включают желудочно-кишечные расстройства с тошнотой,рвотой и поносом. Другие побочные эффекты состоят в окоченелости и одеревенелости, в особенности вокруг рта, и в воспалении печени типа одной из форм гепатита. 6 Для ингибитора протеазы индинавира процесс получения утверждения КПЛ был ускорен,так как при применении комбинацииAZT+ЗТС+индинавир исследования продемонстрировали повышение количества клеток CD4 в среднем примерно на 100 клеток/мм 3 и снижение вирусной нагрузки почти в 100 раз. Индинавир принимают в дозе 800 мг перорально 3 раза в день (2 капсулы, 3 раза в день). В отличие от ритонавира индинавир можно принимать на пустой желудок для улучшения всасывания. По сравнению с ритонавиром индинавир дает меньше побочных эффектов в пищеварительном тракте и, по-видимому, вообще лучше переносится некоторыми пациентами. Его основным побочным эффектом является появление камней в почках. Это лекарство частично выводится в моче и при недостаточном поступлении воды в организм может кристаллизоваться с образованием камней. Ингибитор протеазы индинавир может также действовать на печень, вызывая повышение в крови уровней билирубина, желчного пигмента, образующегося при разрушении эритроцитов. Ингибитор протеазы индинавир может также вызывать взаимодействие лекарств. Анализ устойчивости к ингибиторам протеазы не был полностью завершен. Ингибиторы протеазы сагинавир и ритонавир сейчас могут обойтись пациенту примерно в 600 долларов США в месяц. Стоимость ингибитора протеазы индинавира примерно на 30% ниже. Стоимость комбинации из 3 лекарств AZT+ЗТС+ингибитор протеазы ритонавир для одного пациента может стоить больше 1000 долларов США в месяц. Комбинации (коктейли) ингибиторов ОТ и ингибиторов протеазы могут стоить до 25 тыс. долларов в год. Хотя ингибиторы протеазы могут быть эффективными, медики и общество еще не разрешили проблему помощи пациентам в оплате этих дорогостоящих лекарств. Вирус простого герпеса (ВПГ), который обычно называют "вирус герпеса" или "герпес",вызывает соответствующее инфекционное заболевание, которое также достигло критических масштабов на уровне нации. По оценке Американской общественной организации здравоохранения (АООЗ) число инфицированных составляет 70-80% от всего населения и ежегодно возрастает на 500 тыс. человек. Распространены 2 типа вируса герпеса: вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) и вирус простого герпеса 2 типа(ВПГ-2). Герпес проникает в тело человека через небольшие повреждения ткани эпидермы,обычно при контакте с зараженным человеком,и характеризуется высыпанием, после примерно 4 дней инкубационного периода, одного или более пузырьков, обычно группами. Типичный ход болезни начинается с продромальной стадии, она продолжается до высыпания пузырьков, затем следует изъязвление, срастание поражений, их рассасывание и латентный период. 7 Болезнь может длиться несколько недель, в среднем 2-3 недели. У некоторых людей с иммунологическими нарушениями болезнь может продолжаться несколько месяцев. Пузырьки могут возникать в любых местах на коже или слизистой оболочке, обычно на губах, в виде простудных болячек, на гландах, слизистой оболочке рта, конъюнктиве и роговице, гениталиях, анальной слизистой оболочке и околоанальной ткани. Симптомы герпеса: паховая припухлость,боли, повышение температуры, общее недомогание, головная боль, боль в мышцах и опухшие гланды. Некоторые пациенты с поражением тройничного нерва из-за ротового герпеса испытывают мучительные боли в тканях лица,трудности при глотании, еде, у них опухает лицо. У пациентов с затронутым крестцовым нервом наблюдаются опухание и боли в верхних областях ног и серьезные затруднения при ходьбе. Инфекция ВПГ является рецидивирующей,вирус сохраняется в нервных узлах и затем дает повторные вспышки под воздействием пока неизвестных причин. Рецидив герпетических инфекций может быть вызван чем угодно, например, перегревом на солнце, недостатком какихто питательных веществ, стрессом, менструациями, иммуносупрессией, некоторыми видами пищи, лекарствами, болезнью с повышением температуры и т.д. Недавно вирус герпеса был выделен из ткани сердца. Заражение ВПГ-1 и ВПГ-2 представляет серьезную опасность для здоровья и часто вызывает слепоту, повышает риск возникновения рака шейки матки, приводит к асептическому менингиту и энцефалиту, вызывает смерть новорожденных, вирусемию и т.д. Разрушительные последствия этой болезни лежат за пределами чисто медицинского аспекта человеческих страданий: ВПГ приводит не только к серьезным психологическим и эмоциональным нарушениям, но и к значительным экономическим потерям для нации и всего мира. Были предложены различные способы лечения герпеса, включающие местное применение таких лекарств, как поводон-йодин, йодоксиуридин, трифтортимидин или ацикловир. Степень успешности этих способов лечения была неодинаковой. Большинство предшествующих способов лечения вызвали разочарование. Для системного воздействия на ВПГ в некоторой степени был эффективен ацикловир при пероральном применении. Однако он способен лишь прерывать репликацию вируса. Ацикловир неэффективен для лечения развитого инфекционного процесса ни при системном,ни при местном применении. Описаны штаммы вируса, устойчивые к ацикловиру. Индивидуумы с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) имеют серьезные нарушения иммунитета и особенно серьезно страдают от ВПГ. 8 К тому же индивидуумы со СПИД могут быть носителями устойчивых к ацикловиру штаммов ВПГ, что может сделать ацикловир неэффективным. Таким образом, важно разработать безопасный и успешный медицинский способ для лечения и профилактики чрезвычайно серьезных осложнений, связанных с ВИЧ и другими инфекционными заболеваниями. Сущность изобретения Разработаны усовершенствованные способ лечения и лекарство, которое при систематическом применении подавляет связывание вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) с клеткамимишенями и предотвращает распространение ВИЧ. Преимуществом предлагаемых способа и лекарства является возможность с их помощью предотвращать заражение ВИЧ и другими вирусами при сексуальном контакте. Существенно,что усовершенствованные способ лечения и лекарство безопасны, более дешевы и эффективны. Усовершенствованное лекарство, называемое также Вирацея 2 ВИЧ-4 (Viracea 2 HIV-4),представляет собой новый лечебный состав,рецепт, антимикробное соединение и раствор. Новый противомикробный способ лечения и новое противомикробное лекарство эффективны при системном лечении первичного ВИЧ и могут быть полезны для лечения других микробных инфекций, включающих вирус ветряной оспы (герпес зостер) и цитомегаловирус, но не ограниченных ими. В некоторых случаях желательно поверхностное применение нового лекарства. Хотя новые лекарство и антимикробное соединение особенно полезны благодаря сильному подавлению ВИЧ-инфекции, они могут быть использованы для лечения других заболеваний, вызванных микроорганизмами, такими как вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы,стафилококки, стрептококки, микобактерии,аденовирус, арбовирус, аренавирус, анаэробные бациллы, пикорнавирус, коронавирус, синцитиальный вирус, вирус простого герпеса, вирус ветряной оспы и цитомегаловирус, а также таких заболеваний, как грипп, парагрипп, целлюлит, энцефалит и менингит. Хотя способ лечения и лекарство особенно полезны для ингибирования ВИЧ и других инфекционных заболеваний у человека (Homosapiens), их можно также использовать в ветеринарных целях для подавления вирусных и бактериальных инфекций и инфекционных заболеваний таких животных, как собаки, кошки,птицы, лошади, коровы, овцы, свиньи (свиноматки и боровы) и другие сельскохозяйственные животные, а также грызуны и другие животные,содержащиеся в зоопарках. К преимуществу усовершенствованных способа лечения и лекарства по настоящему изобретению относятся неожиданные, необы 9 чайно хорошие результаты. Легкость применения антимикробного раствора может обеспечивать немедленное всасывание при парентеральном введении. При введении может появляться легкое ощущение зуда. В течение нескольких минут после введения во рту может появляться слабый вкус лекарства. Начальные испытания invitro новых способа лечения и лекарства продемонстрировали необычайно сильное ингибирующее действие на ВИЧ. Желательно, чтобы новое лекарство было приготовлено из легкодоступных и общеупотребимых ("over the counter"(OTC реагентов или продуктов, и чтобы оно обеспечивало безопасное, удобное и дешевое лечение. Желательно, чтобы новое лекарство (лекарственный состав) включали в себя ингибиторы микробов, которые ингибируют, подавляют и останавливают микробные инфекции при вызванных микробами заболеваниях. Ингибиторы микробов представляют собой антимикробные изоляты, растительные экстракты или фитохимикалии, полученные, по меньшей мере, из части одного или нескольких специально выбранных растений, перечисленных ниже. Ингибиторы микробов могут представлять собой ингибиторы вирусов, предназначенные для подавления заболеваний, вызванных такими вирусами, как ВИЧ, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1),вирус простого герпеса типа 2 (ВПГ-2), вирус ветряной оспы (герпес зостер), цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы,аденовирус, арбовирус, аренавирус, пикорнавирус, коронавирус и синцитиальный вирус, а также таких заболеваний, как вирусный грипп,вирусный парагрипп, вирусный энцефалит и вирусный менингит. Ингибиторы микробов могут представлять собой также ингибиторы бактерий, предназначенные для подавления таких бактерий как стафилококки, стрептококки, микобактерии и анаэробные бациллы, а также для лечения таких бактериальных заболеваний как целлюлит, бактериальный энцефалит и бактериальный менингит. В некоторых случаях ингибиторы микробов могут включать ингибиторы грибов. Улучшенные результаты можно получить,если Echinacea и Commophora (называемая также Commiphora) или другие растения не используют в составе лекарства в их исходном, необработанном и неизмельченном состоянии. Для еще лучшего эффекта из лекарства можно исключить: арабинозу, бетаин, целлюлозу, медь,фруктозу, жирные кислоты, галактозу, глюкозу,железо, калий, белок, смолу, сахарозу и ксилозу. Усовершенствованный способ лечения обеспечивает новый способ и процесс для применения в лечении указанных выше инфекционных заболеваний. При некоторых инфекционных заболеваниях ингибиторы микробов можно наносить и выдерживать на инфицированной микробами области (участке или по 002423 10 верхности) до тех пор, пока внешние симптомы и физические проявления инфекции в районе инфицированной области не исчезнут, спадут или рассосутся. Лекарство можно вводить путем инъекции шприцем, подъязычным введением,распылением, смазыванием, присыпанием, смазыванием помазком, губкой, щеткой, поливом,размазыванием, покрыванием или нанесением плотного слоя на инфицированные микробами области, такие как лимфатические узлы, лимфатическая система, Т-клетки, слизистая оболочка полости рта и носа, ткань влагалища, ткань губ,ректальная ткань, анальная ткань, околоанальная ткань, губы, ткань кожи, ткань глаз, конъюнктива и веки. Для лечения или профилактики передачи ВИЧ половым путем предпочтительно ингибиторы микробов или антимикробное соединение систематически вводить шприцем в задний проход или влагалище. Их можно вводить таким способом от 4 до 20 раз в день в течение от 4 до 18-дней подряд вплоть до существенного снижения вирусной нагрузки у пациентов, зараженных ВИЧ, т.е. до уменьшения количества ВИЧ и вируса СПИД в организме. Предпочтительно, чтобы усовершенствованное лекарство, лечебный состав или антимикробное соединение представляли собой фитохимический концентрат, который комбинируют и вводят одновременно или последовательно с поверхностно-активным веществом,питательным веществом и носителем, растворителем или разбавителем, чтобы получить противомикробный лекарственный раствор. Питательное вещество служит катализатором, активатором, инициатором действия фитохимикалиев, питательной добавкой и вспомогательным носителем. Питательным веществом может быть одно или несколько соединений из следующего набора: водорастворимый витамин,жирорастворимый витамин, витамин А, комплекс витаминов В (В-витаминный комплекс),витамина D, витамин Е, витамин К, витамин В 1,витамин В 2, витамин В 5, витамин В 6, витамин В 12, витамин В 15, и, преимущественно, фолацин или фолиевая кислота. Для достижения этой цели полезный противомикробный раствор содержит наряду с растительными экстрактами поверхностно-активный антимикробный детергент. Предпочтительными поверхностно-активными веществами(ПАВ) являются катионные ПАВ, которые могут быть одиночным представителем или любым числом представителей таких хлоридов четвертичного аммония, содержащих 6-18 атомов углерода, как хлорид алкилбензилдиметиламмония, смеси хлорида алкилбензилдиметиламмония, хлорид алкилдиметил/этилбензиламмония, хлорид н-алкилдиметилбензиламмония,хлорид бензалкония, хлорид диизобутилфенокиэтоксиэтилдиметилбензиламмония, хлорид N(С 12C14C16)-диметилбензиламмония, хлорид ок 11 тилдецилдиметиламмония, хлорид дидецилдиметиламмония, хлорид диоктилдиметиламмония, хлорид диалкилдиметиламмония, хлорид диалкилметилбензиламмония, хлорид октилдецилдиметиламмония, хлорид диметилбензиламмония, хлорид лаурилдиметилбензиламмония, о-бензил-р-хлорфенол, хлорид дидерилдиметиламмония, хлорид доктилдиметиламмония,хлорид алкил-(С 14 С 12 С 16)-диметилбензиламмония, причем предпочтительно это хлорид алкилбензилдиметиламмония и наиболее предпочтительно - хлорид бензалкония. Интервал активности катионного ПАВ может составлять от 5 до 90%, но для наилучших результатов от 8 до 20%. Четвертичные аммониевые соли являются коммерческими легко доступными продуктами. В некоторых случаях может быть полезным использование других ПАВ, таких как диметилсульфоксид, ПАВ на основе гликолевой кислоты, ферментные ПАВ, амфолитные ПАВ,цвиттерионные ПАВ и неионные ПАВ. ПАВ могут содержать детергенты, смачивающие вещества, эмульгаторы, пеногасители и/или добавки, уменьшающие поверхностное натяжение. Носители полезны для смешивания компонентов, поддержания компонентов в растворе и обеспечения простого способа нанесения раствора на обрабатываемую область пульверизатором, капельным способом или аппликатором. При применении водного раствора для получения лучших результатов предпочтительно использование стерильного водного носителя и растворителя, в некоторых случаях может быть желательным применение других жидких или твердых носителей, таких как глицерин, минеральное масло, окись кремния, масло из семян хлопчатника, кокосовое масло, растительное масло, масло из семян, рыбий или животный жир, спирт, тальк, мука, пчелиный воск, воск карнаубы, бета-каротин, чесночное масло, камфорное масло, растворимые витамины, растворимые соли, масло из семян рапса, ореховые масла, оливковое масло, липосомы, аскорбиновая кислота, масло вечернего первоцвета, пикногенол, масло из виноградных семян, ланолин,Этоцин, коллаген, алоэ вера, пчелиная пыльца,маточное молочко, сульфат хондроитина А,морские растения, ЭДТА, жирные кислоты, травы, лецитин, биофлавиноиды, масла или порошки из зерен злаков, водоросли, чаи, уксусы, ацидофил, клеточные соли, аскорбиновые кислоты,"hydra 5", экстракты желез, аминокислоты, псилиум, производные растительных веществ или другие стерильные носители. Растительные экстракты, выделенные антимикробные вещества (изоляты) или фитохимикалии, участвующие в предлагаемых новых лекарстве и способе лечения, могут содержать: смолу камеди мирры, секвитерпены, курценон,дигидрофуранодиен-6-он, 2-метоксифурандиен,элемол, уксусную кислоту, альфа-амирон, арабинозу, альфа-бис-аболен, гамма-бис-аболен, 002423 12 кадинен, кампестерол, холестерол, коричный альдегид, коммиферин, альфа-коммифоровую кислоту, бета-коммифоровую кислоту, гаммакоммифоровую кислоту, коммифориновую кислоту, м-крезол, тминовый спирт, тминовый альдегид, дипентен, элемол, 3-эпи-альфа-амирин, эугенол, фуранодиен, фуранодиенон, галактозу, камедь, хираболен, альфа-хирабомиррол, бета-хирабомиррол, хираборезен, лимонол, 4-О-метилглюкуроновую кислоту, ннонацезан, бета-ситостерол, ксилозу, каропилены (карофилены), линдерстерол (линдестерол),арабинозу, бетаин, медь, эхинацен, эхинацин В,эхинакозид, эхинолон, ферменты, фруктозу,жирные кислоты, галактозу, глюкозу, глюкуроновую кислоту, инулин, -инулоид, железо, пентадекадиен, соединения полиацелилена, полисахариды - в том числе арабиногалактан, но не исчерпывающиеся им; калий, белок, смолы,рамнозу, сахарозу, серу, таннины, витамины А,С и Е, алкиламиды, апигенин, арабиногалактан,аскорбиновую кислоту, этилацетата бегеновой кислоты, борнеол, борнилацетат, кофейную(3,4-дигидрокси-транс-3-фенилакриловую; 3,4 дигидроксикоричную) кислоту, 2-О-кофеоил-3(5-альфа-карбоксибета)-3,4-дигидроксифенил,2-О-кофеоил-3-О-кумароилвинную кислоту, 6 О-кофеоилэхинакозид, 2-О-кофеоил-3-О-ферулоилвинную кислоту, 2-О-кофеоилвинную кислоту, кальций, карбонат, бета-каротин, карофиллен, эпоксид карофиллена, хлорид, хлорогеновую кислоту, цикориевую кислоту, метиловый эфир цикориевой кислоты, кобальт, цианадин-3-О-(бета-D-глюкопиранозид), цинадин-3(6-О-малонил-бета-D-глюкопиранозид), цинарин, изобутиламид дека-(2 е,4 е,6 е)-триеновой кислоты, дезрамнозилвербаскозид, 3,5-дикофеоилхинную кислоту, 4,5-О-дикофеоилхинную кислоту, 2,3-О-диферулоилвинную кислоту,изобутиламид додека-(2 е,4 е)-диеновой кислоты,додека-2,4-диен-1-ил-изовалерат, изобутиламид додека-(2 е,6z,8 е,10 е)-тетраеновой кислоты, эписхобунол, бета-фарнезол, 2-O-ферулоилвинную кислоту, гермакрен, гептадека-(8z,11z)диен-2-он, гетероксилан, гумилен-(8 е,12 е)-10 гидрокси-4,10-диметил-4,11-додекадиен-2-он,13-гидроксиоктадека-(9z,11 е,15z)-триеновую кислоту, инулин, железо, изохлорогеновую кислоту, изорамнетин-3-рутинозид, изотуссилагин, кемпферол, кемпферол-3-глюкозид, кемпферол-3-нутинозид, лимонол, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид,магний,марганец,2 метилтетрадека-5,12-диен,2-метилтетрадека 6,12-диен, метил-п-гидроксициннамат, марцен,ниацин, пальмитиновую кислоту, пентадека(8z,11z)-диен-2-он, пентадека-(8z,13z)-диен-11 лин-2-он, пентадека-8 ен-2-он, пентадека-(8z)ен-2-он, пентадека-(8z)-ен-11,13-диен-2-он, 1 пентадецен, пента-(1,8z)-диен, фосфор, альфапинол, бета-пинол, полиацетилены, понтикэпоксид,калий,белок,кверцетагетин-7 глюкозид, кверцетин, кверцетин-3-галактозид, 13 кверцетин-3-глюкозид, кверцетин-3-робинозид,кверцетин-3-ксилозид, кверцетин-3-ксилозилгалактозид, рамноарабиногалактан, рибофлавин,рутин, рутозид, селен, силикат, бета-ситостерол,ситостерол-3-бета-о-глюкозид, натрий, стигмастерол, сульфат, винную кислоту, тетрадека(8z)-ен-11,13-диен-2-он, тиамин, н-триаконтанол, тридека-1-ен-3,5,7,9,10-пентаин, туссилагин, ваналин, вербаскозид. Для получения наилучших результатов фитохимические экстракты содержат вышеуказанные фитохимикалии, за исключением арабинозы, бетаина, целлюлозы,меди, фруктозы, жирных кислот, галактозы,глюкозы, железа, калия, белка, смол, сахарозы и ксилозы. Растительные экстракты, антимикробные изоляты и фитохимикалии могут быть разделены, экстрагированы и выделены из частей таких растений, как Pimpinella anisum, Myroxylon,Arctostaphylos, Carum, Capsicum, Eugenia mytacea, Coriandrum, Inula, Allium, Gentiana, Juniperus, Calendula, Origanum, Mentha labiate, Commiphora, Plantago, Rosmarinus, Ruta, Lamiaceae,Meliosa, Baptisa, Artemisa, Sage, Mentha, Parthenium integrifolium, Eucalyptus, Asteriacea, причем предпочтительны (1) из растений рода Echinacea семейства Astericaea (крестоцветные), а именноEchinacea purpurea, Echinacea angustifolium,(Echinacea pallidae), Echinacea vegetalis, Echinacea atribactilus и их культивируемые варианты, а также (2) из растений рода Commophora, а именно Commophora myrrha, Commophora molmol, Commophora erythraea и их культивируемые варианты. Для наилучших результатов фитохимикалии и антимикробные изоляты представляют собой экстракты из Echinacea purpurea,Echinacea angustifolia и Commophora myrrha. Заявляемые технология, способ лечения и лекарство дают весьма привлекательные, неожиданные, необычайно хорошие и устойчивые результаты. Тесты показывают, что противомикробный раствор (лекарство) и способ лечения крайне полезны, так как они способны контролировать ВИЧ-инфекцию, подавляют связывание вирусных частиц ВИЧ с клеткамимишенями, действуют как профилактические подавители микробов, продлевают латентный период ВИЧ и других заболеваний, и существенно ингибируют ВИЧ и другие вирусы, будучи при этом в целом безопасными для пациента и окружающей среды. Более детальное разъяснение изобретения дано ниже в описании и прилагаемой формуле. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Предлагаются противомикробное средство и лечение для подавления вируса иммунодефицита человека или ВИЧ. Желательно, чтобы противомикробное анти-ВИЧ средство и лечение полностью ингибировали ВИЧ, так же как и другие заболевания, вызванные микробными инфекциями, и при этом были безопасны и не 002423 14 токсичны для людей, животных и окружающей среды. Анти-ВИЧ противомикробное средство и лекарство могут содержать ПАВ и растительное вещество, предоставляющее растительный экстракт, фитохимикалии, антимикробный изолят,противовирусный изолят, противомикробный ингибитор и противовирусный ингибитор. Предпочтительный противомикробный состав может содержать: ПАВ, водный разбавитель,питательное вещество и растительное вещество из рода Echinacea (Е) семейства Asteracea, виды:puprurea, angustifolia, pallidae, vegetalis, atribactilus и их культивируемые варианты, а также растительное вещество из рода Commiphora,виды Commiphora myrrha, Commiphora molmol,Commiphora erythraea и их культивируемые варианты. Предпочтительные растительные вещества представляют собой экстракты и изоляты,включающие фитохимикалии из Echinacea иCommiphora myrrha, Echinacea purpurea, Echinacea pallidae и Echinacea angustofolia. Для наилучших результатов способ лечения и противомикробное вещество (лекарство) содержат катионное ПАВ; фитохимикалии из Echinacea purpurea, Echinacea angustofolia и Commiphora myrrha, стерильный водный разбавитель и фолацин. Отношение Commiphora myrrha к Echinacea purpurea и Echinacea angustofolia предпочтительно находится в интервале от 1:2 до 1:4. ПАВ обеспечивает некоторое разрыхление тканей на уровне клеточной поверхности и имеет широкий спектр антимикробного действия. ПАВ этого типа могут представлять собой четвертичные соли аммония, имеющие 6-18 атомов углерода. Предпочтительно ПАВ типа четвертичных солей аммония представляют собой смесь хлоридов алкилдиметилбензиламмония,которым может быть галоидный бензалконий(бромид бензалкония, хлорид бензалкония),причем наиболее предпочтителен хлорид бензалкония. В воздействии на ВИЧ может быть применен 100% активный водный раствор, но можно использовать и концентрат. Раствор может содержать различные весовые концентрации ПАВ от 0,005 до 0,8%, предпочтительно от 0,02 до 0,30%, наиболее предпочтительно от 0,02 до 0,26%. Фитохимикалии из растений Echinacea демонстрировали выраженную активность против бактерий, вирусов и некоторых грибов. Точный механизм действия неизвестен. При испытаниях заявляемого противомикробного средства с поверхностным применением против ВИЧ, ВПГ-1 и ВПГ-2 оно было эффективно в лечении инфекционных вспышек простого герпеса. При испытаниях in vitro оно проявляло подавляющую активность против ВИЧ-1, ВПГ-1 и ВПГ-2. Фитохимический концентрат содержит в своем составе следующие выделенные компоненты, растительные экстракты, микробныеD, кариофиллен, эпоксид кариофиллена, антоцианины, пирролизидиновые алкалоиды, липофильные амиды, изобутиламиды, полиацетилены, смолу камеди мирры, курцеренон (типа фураноэудесмана), дигидрофуранодиен-6-он, 2 метоксифурандиен (типа фураноэлемена), эламол, линдестерол (типа фураногермакрена), алкиламиды, апигенин, арабиногалактан, аскорбиновую кислоту, этилацетата бегеновой кислоты, бетаин, кофейную кислоту, 2-O-кофеоил-3(5-альфа-карбоксибета)-3,4-дигидроксифенил, 2-O-кофеоил-3-О-кумароилвинную кислоту, 6-O-кофеоилэхинакозид, 2-O-кофеоил 3-О-ферулоилвинную кислоту, 2-O-кофеоилвинную кислоту, кальций, карбонат, бета-каротин,карофиллен, эпоксид карофиллена, хлорид, хлорогеновую кислоту, цикориевую кислоту, метиловый эфир цикориевой кислоты, кобальт, цинадин-3-О-(бета-D-глюкопиранозид), цинадин 3-(6-O-малонил-бета-D-глюкопиранозид), цинарин, изобутиламид дека-(2 е,4 е,6 е)-триеновой кислоты, дезрамнозилвербаскозид, 3,5-дикофеоилхинную кислоту, 4,5-O-дикофеоилхинную кислоту, 2,3-O-диферулолвинную кислоту, изобутиламид додека-(2 е,4 е)-диеновой кислоты,додека-2,4-диен-1-ил-изовалерат, изобутиламид додека-(2 е,6z,8 е,10 е)-тетраеновой кислоты, эписхобунол, бета-фарнезол, 2-O-ферулоилвинную кислоту, гермакрен, гептадека-(8z,11z)-диен-2 он, гетероксилан, гумилен-(8-12,е)-10-гидрокси 4,10-диметил-4,11-додекадиен-2-он, 13-гидроксиоктадека-(9z,11 е,15z)-триеновую кислоту,инулин, железо, изохлорогеновую кислоту, изорамнетин-3-рутинозид, изотуссилагин, кемпферол,кемпферол-3-глюкозид,кемпферол-3 нутинозид, лимонол, лютеолин, лютеолин-7 глюкозид, магний, марганец, 2-метилтетрадека 5,12-диен, 2-метилтетрадека-6,12-диен, метил-пгидроксициннамат, марцен, ниацин, пальмитиновую кислоту, пентадека-(8z,11z)-диен-2-он,пентадека-(8z,13z)-диен-11-лин-2-он, пентадека 8-ен-2-он, пентадека-(8z)-ен-2-он, пентадека(8z)-ен-11,13-диен-2-он, 1-пентадецен, пента(1,8z)-диен, фосфор, альфа-пинол, бета-пинол,понтик-эпоксид, калий, белок, кверцетагетин-7 глюкозид, кверцетин, кверцетин-3-галактозид,кверцетин-3-глюкозид, кверцетин-3-робинозид,кверцетин-3-ксилозид, кверцетин-3-ксилозилгалактозид, рамноарабиногалактан, рибофлавин, 002423 16 рутин, рутозид, селен, силикат, бета-ситостерол,ситостерол-3-бета-о-глюкозид, натрий, стигмастерол, сульфат, винную кислоту, тетрадека(8z)-ен-11,13-диен-2-он, тиамин, н-триаконтанол, тридека-1-ен-3,5,7,9,10-пентаин, туссилагин, ваналин, вербаскозид, секвитерпены; уксусную кислоту, альфа-амирон, арабинозу, альфа-бис-аболен, гамма-бис-аболен, кадинен,кампестерол, холестерол, коричный альдегид,коммиферин, альфа-коммифоровую кислоту,бета-коммифоровую кислоту, гамма-коммифоровую кислоту, коммифориновую кислоту, мкрезол, тминовый спирт, тминовый альдегид,дипентен, элемол, 3-эпи-альфа-амирин, эугенол,фуранодиен, фуранодиенон, галактозу, камедь,хираболен,альфа-хирабомиррол,бетахирабомиррол, хираборезен, лимонол, 4-Oметилглюкуроновую кислоту, н-нонацезан, бета-ситостерол, ксилозу, каропилены (карофилены), смолу камеди мирры, курценон, дигидрофуранодиен-6-он и 2-метоксифурандиен. Для получения наилучших результатов антимикробные изоляты фитохимических экстрактов содержат по весу (отнесенному к общему весу заявляемого лечебного состава): эхинакозид - 0,3-9%, PSI (4-O-метилглюкуроноарабиноксилан с Mr = 35 КДа) и PSII (кислый рамноарабиногалактан с Mr = 450 КДа) - 0,1-7%,цинарин (1,5-ди-О-кофеоилхинная кислота) и цикориевую кислоту (2,3-ди-О-кофеоилвинная кислота) и их производные - 0,1-10%, эхинолон-0,2-4%, эхинацин В - 0,2-8%, эхинацеин - 0,16%, антоцианины, включающие цианидин 3-О-D-глюкопиранозид и 3-O-(6-O-малонилDглюкопиранозид, - 0,2-7%, пирролизидиновые алкалоиды, включающие туссилагин и изотуссилагин, - 0,01-0,06%, изомерные додекаизобутиламиды и 2 Е,4 Е,8Z,10 Е/Z-тетраеновую кислоту - 0,003-0,009% и кариофилены - 0,012%, а также фитохимикалии Commiphora myrrha, включающие смолу камеди мирры, курценон, дигидрофуранодиен-6-он; 2-метоксифурандиен, линдерстерол (линдестерол), секвитерпены, уксусную кислоту, альфа-амирон, арабинозу, альфа-бис-аболен, гамма-бис-аболен, кадинен, кампестерол, холестерол, коричный альдегид, коммиферин, альфа-коммифоровую кислоту, бета-коммифоровую кислоту, гаммакоммифоровую кислоту, коммифориновую кислоту, м-крезол, тминовый спирт, тминовый альдегид, дипентен, элемол, 3-эпи-альфаамирин, эугенол, фуранодиен, фуранодиенон,галактозу,камедь,хираболен,альфахирабомиррол, бета-хирабомиррол, хираборезен, лимонол, 4-O-метилглюкуроновую кислоту,н-нонацезан, бета-ситостерол, ксилозу, каропилены (карофилены) и линдерстерол (линдестерол). Фитохимический концентрат может включать по весу от 2 до 90% лекарственного состава и раствора, предпочтительно не менее 15%,наиболее предпочтительно 40%-60%. 17 Разбавитель растворяет хлорид бензалкония (ПАВ) и фитохимические концентраты и может служить носителем в пульверизаторах,пробирках и капельницах. Предпочтительно разбавитель представляет собой водный разбавитель, наиболее предпочтительно - стерильный водный разбавитель. Отношение воды в водном растворе к хлориду бензалкония может быть от 30000:1 до 250:1, наиболее предпочтительно - от 5000:1 до 750:1. Отношение воды к объединенным концентратам хлорида бензалкония и фитохимикалиев может составлять величину в интервале от 2:1 до 100:1, предпочтительно от 4:1 до 40:1, а для наилучших результатов - от 6:1 до 20:1. Для получения наилучших результатов в усовершенствованных способе противомикробного лечения и лекарстве (подавителе микробов) против герпеса используют по весу: хлорид бензалкония - от 0,02 до 0,3%, причем чтобы избежать токсичности, это содержание должно быть предпочтительно менее 0,26%, фитохимикалии Echinacea и Commiphora - от 40 до 60%,питательное вещество - от 0,01 до 25%, наиболее предпочтительно от 2 до 12%, стерильная вода - от 20 до 60%, наиболее предпочтительно от 29,74 до 59,8%. Желательно, чтобы лекарство(подавитель микробов) содержало витаминное питательное вещество, которое служит питательным носителем и обеспечивает синергичный эффект в комбинации с Commiphora myrrha, Echinacea purpurea и Echinacea angustifolia. Питательное вещество может представлять собой одно или несколько следующих веществ: витамин А, комплекс витаминов В, витамина D,витамин Е, витамин К, водорастворимый витамин, жирорастворимый витамин, витамин В 1,витамин В 2, витамин В 5, витамин В 6, витамин В 12, витамин В 15, и, предпочтительно, фолацин или фолиевая кислота. Хотя вода является предпочтительным разбавителем и водным носителем, в ряде случаев может быть желательным применение других носителей для облегчения прохождения концентрата через шприц или пульверизатор или для повышения растворимости и эффективности действия. В некоторых случаях может оказаться желательным также введение агента,регулирующего вязкость. Более того, поскольку установлено, что срок годности усовершенствованного лекарства оценивается в два года, может оказаться необходимым добавлять подходящий консервант. При предпочтительном способе использования в качестве противомикробного агента против ВИЧ следует применять лекарственный раствор (лекарство) системно, вагинально или ректально. Введение лекарства может осуществляться: инъекцией шприцем, распылением,намазыванием, капельным способом или иными способами. Введение или поверхностное нанесение раствора (лекарства) следует осуществ 002423 18 лять при коитусе. Могут быть противопоказаны анионные мыла и анионные детергенты, в особенности мыла, содержащие белок. Перед введением лекарства обрабатываемую область предпочтительно следует промыть, очистить и обсушить. При использовании в качестве антивирусного агента применительно к ВИЧ лекарство можно вводить шприцем в объеме разовой дозы в задний проход или во влагалище или использовать иные способы. Хлорид бензалкония Предпочтительным ПАВ является хлорид бензалкония. Хлорид бензалкония в виде водного раствора - коммерческий продукт, выпускаемый под торговым знаком Зефиран (Zephiran) фирмой Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (ранееWinthrop Labs). Он представляет собой быстродействующее антиинфекционное ПАВ с умеренно длительным периодом действия. Это ПАВ активно против бактерий и некоторых вирусов, грибов и простейших. Считается, что к нему устойчивы споры бактерий. В зависимости от концентрации растворы хлорида бензалкония являются бактериостатиками или бактерицидами. Точный механизм противобактерийного действия хлорида бензалкония неизвестен, но считается, что он связан с инактивацией ферментов. Активность хлорида бензалкония обычно повышается с увеличением температуры и рН. Грамположительные бактерии более чувствительны к действию хлорида бензалкония, чем грамотрицательные бактерии. К сожалению, хлорид бензалкония инактивируется мылами, анионными детергентами,сывороткой крови и некоторыми белками. По этим причинам он отвергнут многими лабораториями. Если хлорид бензалкония в одиночку применяли и испытывали при поверхностном нанесении in vivo, он был неэффективен против инфекционных вспышек, вызванных вирусом простого герпеса. При испытаниях in vitro против ВИЧ, ВПГ-1 и ВПГ-2 хлорид бензалкония обнаружил слишком высокий уровень токсичности для клеток даже при больших разбавлениях, что неприемлемо для лекарства. Химическая формула одного из типов хлорида бензалкония приведена ниже. Могут быть использованы также и другие типы хлорида бензалкония. Хлорид бензалкония Фитохимикалии В то время как применение необработанной, неэкстрагированной Echinacea обычно нежелательно для лечения ВИЧ и герпеса при интрамуральном введении, такое введение становится возможным после должного фильтрования. Существенным оказывается тот факт, что 19 некоторые (но не все) из выделенных компонентов и растительных экстрактов из Echinacea иCommiphora, как описано выше, обеспечивают фитохимикалии, антимикробные изоляты, растительные экстракты и ингибиторы микробов,имеющие или проявляющие антимикробную активность, которая оказывается эффективной в лечении болезней, вызванных ВИЧ и вирусом герпеса, а также и других инфекционных заболеваний. Как указано выше, фитохимический концентрат содержит в своем составе следующие выделенные компоненты, растительные экстракты, ингибиторы микробов и антимикробные изоляты: полисахариды, эхинацен, эхинацеин,эхинакозид (эфир кофейной кислоты), эхинолон, эхинадиол, ферменты, глюкуроновую кислоту, инулоид, пентадекадиен, соединения полиацелилена, арабиногалактан, рамнозу, PSI (4O-метилглюкуроноарабиноксилан с Мr = 35 КДа), PSII (кислый рамноарабиногалактан с Мr(типа фураноэлемена), эламол, линдестерол (типа фураногермакрена), алкиламиды, апигенин,арабиногалактан, аскорбиновую кислоту, этилацетата бегеновой кислоты, бетаин, кофейную кислоту,2-O-кофеоил-3-(5-альфа-карбоксибета)-3,4-дигидроксифенил, 2-O-кофеоил-3-Окумароилвинную кислоту,6-O-кофеоилэхинакозид, 2-O-кофеоил-3-О-ферулоилвинную кислоту, 2-O-кофеоилвинную кислоту, кальций,карбонат, бета-каротин, карофиллен, эпоксид карофиллена, хлорид, хлорогеновую кислоту,цикориевую кислоту, метиловый эфир цикориевой кислоты, кобальт, цинадин-3-О-(бета-Dглюкопиранозид),цинадин-3-(6-O-малонилбета-D-глюкопиранозид), цинарин, изобутиламид дека-(2 е,4 е,6 е)-триеновой кислоты, дезрамнозилвербаскозид,3,5-дикофеоилхинную кислоту, 4,5-O-дикофеоилхинную кислоту, 2,3O-диферулолвинную кислоту, изобутиламид додека-(2 е,4 е)-диеновой кислоты, додека-2,4 диен-1-ил-изовалерат, изобутиламид додека(2 е,6z,8 е,10 е)-тетраеновой кислоты, эписхобунол, бета-фарнезол, 2-O-ферулоилвинную кислоту, гермакрен, гептадека-(8z,11z)-диен-2-он,гетероксилан,гумулен-(8 е,12 е)-10-гидрокси 4,10-диметил-4,11-додекадиен-2-он, 13-гидроксиоктадека-(9z,11 е,15z)-триеновую кислоту,инулин, железо, изохлорогеновую кислоту, изорамнетин-3-рутинозид, изотуссилагин, кемпферол,кемпферол-3-глюкозид,кемпферол-3 002423 20 нутинозид, лимонол, лютеолин, лютеолин-7 глюкозид, магний, марганец, 2-метилтетрадека 5,12-диен, 2-метилтетрадека-6,12-диен, метил-пгидроксициннамат, марцен, ниацин, пальмитиновую кислоту, пентадека-(8z,11z)-диен-2-он,пентадека-(8z,13z)-диен-11-лин-2-он, пентадека 8 ен-2-он, пентадека-(8z)-ен-2-он, пентадека(8z)-ен-11,13-диен-2-он, 1-пентадецен, пента(1,8z)-диен, фосфор, альфа-пинол, бета-пинол,понтик-эпоксид, калий, белок, кверцетагетин-7 глюкозид, кверцетин, кверцетин-3-галактозид,кверцетин-3-глюкозид, кверцетин-3-робинозид,кверцетин-3-ксилозид, кверцетин-3-ксилозилгалактозид, рамноарабиногалактан, рибофлавин,рутин, рутозид, селен, силикат, бета-ситостерол,ситостерол-3-бета-о-глюкозид, натрий, стигмастерол, сульфат, винную кислоту, тетрадека(8z)-ен-11,13-диен-2-он, тиамин, н-триаконтанол, тридека-1-ен-3,5,7,9,10-пентаин, туссилагин, ваналин, вербаскозид, секвитерпены, уксусную кислоту, альфа-амирон, арабинозу, альфа-бис-аболен, гамма-бис-аболен, кадинен,кампестерол, холестерол, коричный альдегид,коммиферин, альфа-коммифоровую кислоту,бета-коммифоровую кислоту, гамма-коммифоровую кислоту, коммифориновую кислоту, мкрезол, тминовый спирт, тминовый альдегид,дипентен, элемол, 3-эпи-альфа-амирин, эугенол,фуранодиен, фуранодиенон, галактозу, камедь,хираболен, альфа-хирабомиррол, бета-хирабомиррол, хираборезен, лимонол, 4-O-метилглюкуроновую кислоту, н-нонацезан, бетаситостерол, ксилозу, каропилены (карофилены),линдерстерол (линдостерол), каропилены (карофилены), курценон, дигидрофуранодин-6-он,2-метоксифурандиен и линдерстерол (линдестерол). Химические формулы некоторых растительных экстрактов из Echinacea приведены ниже: Химические формулы некоторых растительных экстрактов из Commiphora myrrha приведены ниже: Иногда Мирра (myrrha) имеет также следующие названия: myrrh, mirre, myrrhis, gummigum, gruggal resin, Heerabol myrrh, myrrhe, Manniliche myrrhe, Oponapax и Hirabol myrrh. Мирра может представлять собой смолу камеди, получаемую из надрезов на коре деревьев видаCommiphora myrrha, т.е. миррового дерева. Мирра может представлять собой также бальзамический сок из Balsamodendron myrrha, т.е. Арабского мирта (Arabian myrtle), колючего дерева. Кроме того, Мирра может быть экстрагирована из Osmorhiza или Washingtonia, которые иногда называют также бутень душистый(Sweet cicely). Область распространения дерева мирры - Эритрея, Абиссиния, Сомали, Йемен,Судан и другие районы. Виды коммифоры (Commiphora), продуцирующие мирру, представляют собой кусты или небольшие деревья с большими острыми шипами на стволе. Растения имеют неодинаковые тройчатые листья, а небольшие цветы сгруппированы в концевые венчики. На коре делают насечки и из каналов для смолы получают лекарство "мирр". Мирра представляет собой высушенную на воздухе маслянисто-клейкую смолу, выделяющуюся из коры растений вида Commiphora species. Материал представляет собой неоднородные округленные зерна или комочки различных размеров с отверстиями, имеющие цвет от темно-коричневого и почти черного до светлого или темного оранжево-коричневого; некоторые части могут иметь цвет желтый или от бесцветного до бледно-желтого. Поверхность большей частью покрыта порошком с цветом от серого до желто-серого. Комки разламываются полукружьями и дают тонкие прозрачные фрагменты. Мирра может иметь душистый аромат,терпкий ароматный запах и горький, ароматный,иногда раздражающий вкус. При жевании она может прилипать к зубам. Состав камедной смолы Commiphora molmol и других видов Commiphora близок к составу смолы мирры DAB10. В литературе имеются значительные противоречия относительно источников мирры и идентичности используемых видов Commiphora. Обычную (hirabol) мирру получают, по-видимому, из Commiphora myrrha. 22 Считается, что сомалийская мирра получена изmyrrha и Commiphora molmol неясна. Источником абиссинской мирры являются Commiphoramadagascariensis или Commiphora abyssinica. Опонапакс (Ороnарах), который часто называют также bisabol myrrh или perfumed bdellium, получают, по-видимому, из Commiphora erythraea(Ehrenb) или Ороnарах. Состав мирры очень сложен и известен только частично. От 40 до 60% мирры растворяется в этаноле и представляет собой смолу и эфирное масло. Мирра почти полностью состоит из секвитерпенов. Основными компонентами секвитерпенов являются: фураносеквитерпены типа гермакрена элемана, эудесмана и гваиана. Кроме этого, имеются углеводороды секвитерпенов, например, - и -элемен,-бурбонен, кариофиллен, гумилен и секвитерпеновые спирты, например, элемол. Предполагают, что наличие некоторых из фураносеквитерпенов типично для фармацевтической мирры. Необработанные камедь или сок мирры содержат 20% белков и 65% углеводородов, состоящих из галактозы, 4-O-метилглюкуроновой кислоты и арабинозы. Химическими компонентами Commophora myrrhaphyto являются уксусная кислота,альфа-амирон, арабиноза, альфа-бис-аболен,гамма-бис-аболен, кадинен, кампестерол, холестерол, коричный альдегид, коммиферин, альфа-коммифоровая кислота, бета-коммифоровая кислота, гамма-коммифоровая кислота, коммифориновая кислота, м-крезол, тминовый спирт,тминовый альдегид, дипентен, элемол, 3-эпиальфа-амирин, эугенол, фуранодиен, фуранодиенон, галактоза, камедь, хираболен, альфахирабомиррол, бета-хирабомиррол, хираборезен, лимонол, 4-O-метилглюкуроновая кислота,н-нонацезан, бета-ситостерол, ксилоза, каропилены (карофилены), смола камеди мирры, курценон, дигидрофуранодиен-6-он, 2-метоксифурандиен и линдерстерол (линдестерол). Настойка мирры может обладать противовоспалительным действием. На макро- и микроскопическом уровне мирра может представлять собой коричневато-желтый порошок, состоящий из желтоватых осколков или сферических зерен различных размеров вместе с мелким гранулированным материалом, набухающим в воде. В препаратах для микроскопии с хлоралгидратом наблюдаются лишь небольшие фрагменты ткани растительного происхождения: красноватокоричневые фрагменты луба, отдельные или сгруппированные многоугольные или продолговатые клетки зерен, частично с утолщенными,одeревеневшими стенками с углублениями, с коричневатым содержимым; фрагменты паренхимы с утонченными стенками и склерохиматические волокна, а также неоднородные - от призматических до многоугольных - кристаллы оксалата кальция. 23 Мирру необходимо держать в плотно закрытых емкостях для защиты от света и влаги. Лучше использовать осушитель, т.к. углеводородная часть лекарства легко впитывает влагу. Предпочтительно не хранить мирру в виде порошка. Фолиевая кислота Для получения наилучших результатов предпочтительным питательным веществом является фолиевая кислота. Фолиевая кислота,имеющая также названия: фолацин, птероилглутаминовая кислота, а также foldine, folaemin,foliamin, folicet, folipac, folletes, folsan, folvite,incafolic, millafol или cytofol, представляет собой желтый кристаллический водорастворимый витамин группы комплекса витаминов В, необходимый для роста и репродукции клеток. Фолиевая кислота функционирует как кофермент с витаминами B12 и витамином С при разрушении и утилизации белков и при образовании нуклеиновых кислот и гема в гемоглобине. Кроме того, фолиевая кислота повышает аппетит и стимулирует образование соляной кислоты в пищеварительном тракте. Эта кислота хранится в печени и может синтезироваться бактериальной микрофлорой желудочно-кишечного тракта. Недостаток фолиевой кислоты может приводить к задержкам роста, появлении седины, воспалению языка, стоматиту, нарушениям пищеварения и диарее, а также быть причиной мегалобластической анемии. Указанный дефицит вызывается неадекватным приемом витаминов с пищей, недостаточной адсорбцией и аномалиями метаболизма. Потребность в фолиевой кислоте возрастает при беременности, в детском возрасте и при стрессах. Фолиевая кислота чувствительна к теплу и свету, и при длительном хранении значительная часть витамина утрачивается. Она нетоксична и эффективна в снятии состояний специфической недостаточности. Химическая формула фолиевой кислоты приведена ниже. Фолиевая кислота (птероилглутаминовая кислота) Структура фолиевой кислоты приведена ниже: 24 Молекула фолиевой кислоты содержит глутаминовую кислоту, п-аминобензойную кислоту и птерин; комбинация птерина и паминобензойной кислоты носит название "птеройная кислота". Приведенная структура является птероилглутаминовой кислотой из печени. Фолиевая кислота, продуцируемая бактериями,содержит три остатка глутаминовой кислоты,соединенных -глутамильной связью. Многие ткани животных содержат птероилгептаглутаминовую кислоту, при этом остатки глутаминовой кислоты опять-таки соединены -глутамильной связью. Синтетические птероилглутаминовые кислоты, в которых молекулы глутаминовой кислоты соединены -глутамильной связью,активны в тестах на рост бактерий; птероил-глутаминовые кислоты эффективны как в бактериях, так и в лечении макроцитной анемии у человека. Фермент животных тканей гидролизует природные птероилполиглутаматные соединения до птероилмоноглутаминовой кислоты и свободной глутаминовой кислоты. Другая структурная формула птероилглутаминовой кислоты (PteGlu1) приведена ниже Метилтетрагидрофолат Фолиновая кислота (Citrovorum factor) Структуры и номенклатура фолиевой кислоты (птероилглутаминовой кислоты) Главные части молекулы фолиевой кислоты содержат птеридиновое кольцо, связанное метиленовым мостиком с парааминобензойной кислотой, которая присоединена амидной связью к глутаминовой кислоте. Хотя птероилглутаминовая кислота является обычной фармацевтической формой фолиевой кислоты, она не является ни основным аналогом фолата в пище, ни активным коферментом в клеточном метаболизме. После адсорбции PteGlu1 быстро восстанавливается в 5, 6, 7 и 8 положениях до тетрагидрофолиевой кислоты (H4PteGlu1), которая затем действует как акцептор нескольких одноуглеродных единиц. Они прикрепляются либо в 5-м, либо в 10-м положении птеридинового кольца или связывают эти атомы с образованием нового пятичленного кольца. 25 Витамин B12 и фолиевая кислота являются необходимыми компонентами пищи человека. Недостаток любого из этих витаминов приводит к нарушениям в синтезе ДНК в любой клетке,где происходит репликация хромосом и деление. Поскольку наиболее драматические изменения происходят в тканях с наибольшей скоростью возобновления и деления клеток, к недостатку этих витаминов наиболее чувствительна кроветворная система. Клинически самым ранним свидетельством такого недостатка является мегастобластная анемия, при которой нарушение в синтезе ДНК приводят к характерным морфологическим аномалиям в клеткахпредшественниках костного мозга. В результате образуются аномальные макроцитные эритроциты и пациент приобретает острую анемию. Метилкобаламин способствует реакции метионин-синтетазы, которая необходима для нормального метаболизма фолата. Метильные группы, предоставляемые метилтетрагидрофолатом (CH3H4PteGlu1), используются в образовании метилкобаламина, который затем служит донором метильных групп для перевода гомоцистеина в метионин. Это взаимодействие фолат-кобаламин кардинально важно для нормального синтеза пуринов и пиримидинов и,следовательно, ДНК. Реакция метионинсинтетазы в значительной степени отвечает за контроль над оборотом фолатных кофакторов,за поддержание внутриклеточных концентраций фолилполиглутаматов, а также, через синтез метионина и его продукта, S-аденозилметионина, за поддержание нескольких реакций метилирования. Поскольку метилтетрагидрофолат является основным аналогом фолата, поставляемым в клетки, перенос метильной группы на кобаламин необходим для получения достаточных количеств тетрагидрофолата(H4PteGlu1), субстрата в нескольких метаболических стадиях. Тетрагидрофолат является предшественником в образовании внутриклеточных фолилполиглутаматов, он также служит акцептором одноуглеродных единиц в переводе серина в глицин с образованием в результате 5,10-метилентетрагидрофолата (5,10-CH2H4PteGlu). Последнее производное служит донором метиленовых групп для дезоксиуридилата в синтезе тимидилата, чрезвычайно важной реакции в синтезе ДНК. В этом процессе 5,10CH2H4PteGlu превращается в дигидрофолат(H2PteGlu). Цикл затем завершается восстановлением H2PteGlu до H4PteGlu дигидрофолатредуктазой, этот этап может быть блокирован такими антагонистами фолата, как метотрексат. Другие пути синтеза также приводят к получению 5,10-метилентетрагидрофолата. Фолат может транспортироваться в ткани в виде СН 3 Н 4 РtеGlu1. Печень активно восстанавливает и метилирует PteGlu1 (а также Н 2- илиH4PteGlu1) и затем транспортирует СН 3 Н 4 РtеGlu1 в желчь для реадсорбции в ки 002423 26 шечнике с последующим возвратом в ткани. СН 3 Н 4 РtеGlu действует как донор метильных групп в образовании метилкобаламина и как источник H4PteGlu и других аналогов фолата,как описано выше. Фолат хранится внутри клеток в виде полиглутаматов. Таблица А. Биосинтез фолиевой кислоты Биосинтез фолиевой кислоты показан ниже. Символ "PPP" обозначает трифосфат. Поверхностно-активные вещества Хотя хлорид бензалкония является предпочтительным ПАВ для получения наилучших результатов, в некоторых случаях может быть желательным использование других четвертичных аммониевых ПАВ или других ПАВ. Четвертичным аммониевым соединением может быть хлорид дикокодимония, известный также как хлориды дикокоалкилдиметиламмония, хлорид дикокодиметиламмония или хлориды ди-С 8-18-алкилдиметиламмония. Он может быть использован в комбинации с изопропанолом, например, с 20-30% изопропанолом. Предпочтительный источник четвертичного соединения содержит: 70-80% четвертичного аммониевого соединения и менее 0,03% хлористого метила, имеет удельный вес около 0,87 при 45 С, давление паров 33 мм рт.ст. при 20 С,начальную точку кипения 82 С при 760 мм рт.ст. и летучесть 20-30%. Он производится компанией Witco Corporation, США, под фабричной маркой CarSpray 300. Четвертичный компонент может обладать дезинфицирующими свойствами и быть фунгицидом, пригодным для подавления грибных и дрожжевых инфекций. Могут быть полезными и другие четвертичные аммониевые соединения, как, например,препарат под фабричной маркой Jet Quat 2C-75,выпускаемый фирмой Jetco Chemicals, Inc.,США, препараты под фабричными маркамиCarSpray 400 и Carnauba Spray 200, выпускаемые фирмой Witco Corporation, США, содержа 27 щие 9% денатурированный этиловый спирт вещества, такие как препарат под фабричной маркой ВТС 2125 М, выпускаемый компаниейStephan Company, США, или продукты MAQU,содержащие хлорид налкилдиметилбензиламмония,выпускаемые компанией Mason Chemical Company, США: LC12S (67% С 12, 25% С 14, 7% С 16, 1% С 18),МС 1416 (5% С 12, 60% С 14, 30% С 16, 5% С 18),МС 1412 (40% С 12, 50% С 14, 10% С 16), стеариловая паста или хлопья SC-18 (5% С 16, 95% С 18), ТС-76 или MQ-2525 (5% С 12, 60% С 14,30% С 16, 5% С 18) и МС 6025-50% (25% С 12,60% С 14, 15% С 16). Jet Quat 2C-75 содержит: 50-75% хлорида четвертичного дикокодиметиламмония, 20-50% изопропилового спирта и имеет удельный вес 0,888 и точку кипения 82 С. CarSpray 400 содержит: 55-65% соединений четвертичного аммония, 20-30% аминов,ненасыщенные алкилированные и этоксилированные С 14-18 и С 16-18, 10-20% изопропанола,менее 0,03% хлористого метила и имеет удельный вес около 0,88 при 24 С, давление паров 33 мм. рт.ст. при 20 С, начальную точку кипения 82 С при 760 мм рт.ст. и летучесть 10-20%."Carnauba Spray 200" содержит: 50-60% соединений четвертичного аммония, 10-20% изопропанола, 15-25% воды, 1-10% алкилированного воска "carnauba", менее чем 0,03% хлористого метила и имеет удельный вес около 0,90 при 25 С, давление паров 33 мм. рт.ст. при 20 С,начальную точку кипения 82 С при 760 мм. рт.ст. и летучесть 20-40%. Неионные ПАВ являются поверхностноактивными соединениями, которые не ионизуются в водном растворе. Благодаря наличию у них окисленной цепи (например, цепи полиоксиэтилена) они часто проявляют гидрофильные свойства, при этом лиофильная часть молекулы является производным жирных кислот, фенолов,спиртов, амидов или аминов. Типичными соединениями являются полиэтиленоксидные конденсаты алкилфенолов, например, продукт конденсации, образованный 1 молем нонилфенола и 10 молями этиленоксида, и продукты конденсации алифатических спиртов и этиленоксида, например, продукт конденсации, образованный 1 молем тридеканола и 12 молями этиленоксида. Неионные ПАВ могут представлять собой этоксилаты фенола, содержащие продукт конденсации этиленоксида и алкилфенола или алифатического спирта. Неионные ПАВ предпочтительно содержат нонолфенолэтоксилат (как,например, Т-DET) и/или октафенолэтоксилат. Неионные ПАВ являются продуктами реакции этиленоксида и нонолфенола и/или октафенола. Отношение фенола к этиленоксиду может быть в интервале от 2:20 до 4:16 и предпочтительно составляет около 8:12. Неионные синтетические ПАВ могут представлять собой неионные детергенты. Эти 28 ПАВ можно также получать конденсированием этиленоксида с гидрофобным основанием, полученным конденсацией пропиленоксида с пропиленгликолем. Гидрофобная часть молекулы,которая, как очевидно, нерастворима в воде,имеет молекулярный вес примерно от 1200 до 2500. Добавление радикалов полиоксиэтилена к указанной гидрофобной части способствует увеличению водорастворимости молекулы в целом и жидкостный характер продукта может быть сохранен вплоть до точки, где содержание полиоксиэтилена достигает примерно 50% общего веса продукта конденсации. Другие неионные синтетические ПАВ могут включать: полиэтиленоксидные конденсаты алкилфенолов,например, продукты конденсации алкилфенолов или диалкилфенолов, у которых алкильная группа содержит примерно от 6 до 12 атомов либо в прямой цепи, либо в разветвленной цепи,с этиленоксидом. Этиленоксид может присутствовать в количествах от 8 до 25 молей этиленоксида на моль алкилфенола. Алкильный заместитель в таких соединениях может быть получен от полимеризованного пропилена, диизобутилена, н-октена или н-нонена. Неионные ПАВ могут быть также получены путем конденсации этиленоксида с продуктом реакции пропиленоксида и этилендиамина,например, соединения, содержащие по весу от примерно 40% до примерно 80% полиоксиэтилена и имеющие молекулярный вес от примерно 5000 до примерно 11000, получают в реакции этиленоксидных групп с гидрофобным основанием, представляющим собой продукт реакции этилендиамина с избытком пропиленоксида,при этом основание имеет молекулярный вес порядка 2500-3000. Другие неионные ПАВ включают продукт конденсации алифатических спиртов, имеющих от 8 до 18 атомов углерода либо в прямой, либо в разветвленной цепи, с этиленоксидом, например, продукт конденсации спирта из кокосовых орехов и этиленоксида при отношении от 10 до 30 молей этиленоксида на моль спирта из кокосовых орехов, при этом фракция спирта из кокосовых орехов имеет от 10 до 14 атомов углерода. Далее, неионные ПАВ включают длинноцепные третичные аминоксиды, соответствующие общей формулеR1R3R2NО,где R1 - алкильный радикал с количеством атомов примерно от 8 до 18, a R2 и R3, каждый соответственно, либо метильный, либо этильный радикалы. Стрелка в формуле представляет собой условное обозначение семиполярной связи. Примеры аминоксидов, пригодных для использования, включают диметилдодециламиноксид,диметилоктиламиноксид, диметилдециламиноксид, диметилтетрадециламиноксид и диметилгексадециламиноксид. 29 Другие неионные ПАВ могут включать длинноцепные третичные фосфиноксиды, соответствующие общей формулеRR'R"PО,где R - алкильный, алкенильный или моногидроксиалкильный радикал, имеющий длину цепи от 10 до 18 атомов углерода, а R' и R" каждый алкильная или моногидроксиалкильная группы,содержащие от 1 до 3 атомов углерода. Стрелка в формуле представляет собой условное обозначение семиполярной связи. Примеры подходящих фосфиноксидов включают диметилдодецилфосфиноксид,диметилтетрадецилфосфиноксид, этилметилтетрадецилфосфиноксид, цетилдиметилфосфиноксид, диметилстеарилфосфиноксид, цетилэтилпропилфосфиноксид, диэтилдодецилфосфиноксид, диэтилтетрадецилфосфиноксид,дипропилдодецилфосфиноксид,бис-(2-гидроксиметил)додецилфосфиноксид,бис-(2-гидроксиэтил)додецилфосфиноксид, (2 гидроксипропил)метилтетрадецилфосфиноксид,диметилолеилфосфиноксид и диметил(2-гидроксидодецил)фосфиноксид. В некоторых случаях может оказаться полезным использование других ПАВ, таких как другое катионное ПАВ, амфолитное ПАВ или цвиттерионное ПАВ. Катионные ПАВ могут включать катионные детергенты. ПАВ такого типа представляют собой соединения, которые ионизуются в водной среде с образованием катионов, содержащих лиофильную группу. Обычно такие соединения являются четвертичными аммониевыми солями, содержащими алкильную группу длиной от примерно 12 до примерно 18 атомов углерода, как, например, хлорид лаурилбензилдиметиламмония. Амфолитные ПАВ являются соединениями, имеющими как анионные, так и катионные группы в одной и той же молекуле. Типичными примерами таких молекул являются производные алифатических аминов, содержащие длинную цепь с количеством атомов углерода от примерно 8 до примерно 18 и анионную водорастворимую группу, например, карбоксисульфо-, сульфо- или сульфатогруппу. К амфолитным детергентам относятся, например, натриевый 3-додециламинопропан сульфонат, натриевый N-метилтаурат и родственные соединения,как, например, дизамещенные более высокими алкилами аминокислоты, бетаины, тетины,сульфатированные длинноцепные олефиновые амины и сульфатированные производные имидазолина. Цвиттерионные ПАВ могут включать синтетические детергенты. ПАВ такого типа обычно являются производными алифатических четвертичных аммониевых соединений, у которых алифатический радикал может представлять собой либо прямую, либо разветвленную цепь, и у которых один из алифатических заместителей содержит примерно от 8 до 18 атомов углерода, 002423 30 а другой содержит анионную водорастворимую группу, например, карбокси-, сульфо- или сульфатогруппу. Примерами соединений, подпадающих под это определение, являются: 3-(N,Nдиметил-N-гексадециламмонио)-пропан-1-сульфонат и 3-(N,N-диметил-Nгексадециламмонио)-2-гидроксипропан-1-сульфонат. Клиническая фармакология В том случае, когда фитохимикалии изEchinacea и Commiphora (антимикробные изоляты, растительные экстракты и микробные ингибиторы) смешивали, объединяли и применяли вместе с ПАВ, предпочтительно хлоридом бензалкония, питательным веществом-носителем,предпочтительно фолиевой кислотой, и стерильным водным носителем, наблюдали неожиданные и необычайно хорошие результаты в лечении ВИЧ и других инфекционных заболеваний, и эффективности лекарства (подавителя микробов), резко повышались. Существенно,что при испытаниях in vitro уникальное соединение демонстрировало неожиданную и необычайно хорошую антивирусную активность против ВИЧ, включая ингибирование связывания ВИЧ с клетками-мишенями. Если синергичное лекарство испытывали in vivo при поверхностном применении, инфекция вирусом простого герпеса немедленно останавливалась. Если синергичное лекарство испытывали in vitro, токсичность ПАВ - хлорида бензалкония существенно понижалась до безопасного уровня и повышался уровень ингибирующей активности против ВИЧ, ВПГ-1 и ВПГ-2. Демонстрировали и наблюдали синергизм взаимодействия и смешивания фитохимикалиев Echinacea и Commiphora, фолиевой кислоты и ПАВ, поскольку при смешивании компонентов была видна быстрая растворимость, и благодаря свойствам компонентов в растворе возникала небольшая адгезивная способность. Более того, химические свойства фитохимикалиев Echinacea и Commiphora, сурфактантного питательного вещества-носителя и водного носителя повышали стабильность и увеличивали реакционную способность, что полезно в лечении инфекционных заболеваний. Лекарство может быть нанесено в различных разбавлениях на слизистую оболочку рта и носа, ткань влагалища, губную ткань, анальную и околоанальную ткань, ткань пениса, кожную ткань, открытую подкожную ткань, а в более высоких разбавлениях может быть использовано при глазных инфекциях. Предпочтительным является ректальное или вагинальное введение. При варьировании и подборе концентраций возможно системное введение лекарства. Может быть противопоказано применение лекарства в вагинальных и анальных входах, в плотных перевязочных материалах, в ушных каналах, в изолирующих перевязочных материалах, гипсовых повязках или облатках для проглатывания, 31 т.к. такое применение может вызвать воспаление или химические ожоги. Не следует рекомендовать применение лекарства против анаэробных грибных инфекций, так как некоторые грибы могут быть устойчивыми к нему. Примеры 1-7. Испытания in vivo. Начальный этап испытаний in vivo с поверхностным применением лекарства был предпринят для оценки эффектов способа лечения и лекарства по настоящему изобретению у 7 испытуемых, позитивных по ВПГ-1 или ВПГ-2. Испытуемым наносили поверхностно лекарство,содержавшее ПАВ - хлорид бензалкония в водном растворе (в отношении 1:750) в сочетании с растительным веществом из Echinacea purpurea в форме порошка, содержащим перечисленные выше фитохимикалии. Нанесение состава производилось в 2 этапа: сначала пораженную область или пузырек увлажняли ПАВ - хлоридом бензалкония в водном растворе распылением,намазыванием или капельным способом; затем с помощью тампона или присыпанием вручную на увлажненную зараженную область наносили покрытие из порошкообразных фитохимикалиев. Важным аспектом такого лечения было обеспечение полного покрытия пораженной области в течение всей длительности заболевания. Поэтому для полного покрытия больной области лечебным составом его при необходимости наносили повторно. Из семи человек шестеро были женщины и один - мужчина. К началу исследования возраст мужчины составлял 38 лет, а женщины имели возраст 8, 27, 30, 32, 38 и 39 лет. В течение примерно шести недель было двенадцать вспышек инфекции. Девять из них относились к ВПГ-2,генитальному герпесу, а три - к ВПГ-1, простудным болячкам на губах. У 8-летней и 27 летней женщин были ВПГ-1, простудные болячки. У 30-, 38- и 39-летних женщин был ВПГ 2, генитальный герпес. У 38-летней были к тому же ВПГ-1, простудные болячки. У мужчины был ВПГ-2, генитальный герпес. Все испытуемые имели точно установленную историю болезни, и можно было идентифицировать стандартный ход их заболевания. Для получения объективных данных ни один из испытуемых не имел представления об испытательном характере лечения и ничего не знал о действии лекарства. При повторных тестах испытуемым было сказано, что среди образцов лекарства могут быть препараты плацебо. В семи случаях антимикробное соединение(лекарство) наносили на продромальной стадии непосредственно на ткань. В пяти случаях антимикробное соединение наносили прямо на пузырьковые высыпания. При необходимости для поддержания постоянного покрытия антимикробное вещество наносили повторно. Наблюдения: при каждом нанесении лекарства каждый индивидуум (испытуемый) отмечал ощущение пощипывания в течение не 002423 32 скольких секунд. Они отмечали также, что имелось прочное сцепление лекарства (антимикробного соединения) с пузырьками или пораженной областью. Сцепление состава с эпителиальной тканью оставалось значительным даже после принятия душа или обмывания водой этой области. Результаты: результаты исследования семи человек с применением обсуждаемых способа лечения и лекарства неожиданно оказались необычайно хорошими и весьма устойчивыми. В каждом случае испытуемый с удовлетворением отмечал, что как только состав (лекарство) наносили на пораженную область, боль полностью прекращалась в течение 10-20 мин, тогда как никакие средства до этого боль не снимали. В семи случаях, когда соединение (лекарство) вводили на продромальной стадии, испытуемые отмечали, что прекращалась боль, пропадали все симптомы, которые до этого развивались,вплоть до развитой вспышки заболевания, и вспышки больше никогда не возобновлялись. Все внешние симптомы и физические проявления герпеса исчезали в течение нескольких часов после нанесения лекарства. В пяти случаях,когда соединение (лекарство) наносили на пузырьковые высыпания, испытуемые отмечали,что боль прекращалась в течение нескольких минут, жжение, зуд и раздражение пропадали через 2-4 ч, а пузырьки подсыхали и исчезали через 21 ч. Во всех случаях после нанесения лекарства пропадали другие, более серьезные,болезненные симптомы, как то: повышение температуры, недомогание, паховые припухлости, мокнущие болячки и болезненное мочеиспускание. При доведении лечения до конца, если испытуемым давали порцию состава (лекарства) для испытания при последующих вспышках,отмечалось, что когда проявлялись первые признаки вспышки, сигнализирующие о ее продромальной стадии, они немедленно наносили соединение (лекарство) в соответствии с инструкциями, и вспышка полностью останавливалась и исчезала. Существенно, что те испытуемые, для которых были обычными несколько вспышек заболевания в течение года, отмечали, что у них значительно удлинялись латентные периоды. После трехлетних завершенных испытаний одна из испытуемых, у которой, по ее заявлению,перед применением данного лекарства, были ежемесячные вспышки заболевания в течение четырех лет, теперь свидетельствовала, что после применения этого лекарства у нее больше года не было вспышки. Дополнительные наблюдения: один испытуемый, мужчина, свидетельствовал, что после первоначального нанесения лекарства на продромальной стадии вспышки заболевания он только через примерно 30 ч обнаружил, что забыл после принятия душа повторно нанести состав (лекарство). Вследствие этого появились 33 и начали сливаться друг с другом несколько пузырьков. Он нанес состав (лекарство) повторно и после этого поддерживал хорошее покрытие пораженной области составом. После этого вспышка прекратилась в течение 21 ч таким же образом, как было описано у других испытуемых. По данным другого наблюдения, состав(лекарство) может иметь ослабленное действие или быть менее эффективным в присутствии некоторых белков или мыл. Одна из испытуемых женщин, по-видимому, слишком усердно мыла пораженную область перед нанесением состава (лекарства). Это произошло при третьей вспышке после успешного применения состава(лекарства) при двух предыдущих вспышках. В данном случае после нанесения состава (лекарства) не было привычного ощущения пощипывания и избавления от симптомов. Она обратилась за консультацией через примерно 24 ч, и за это время вспышка развилась до стадии полного высыпания пузырьков со всеми вышеуказанными симптомами заболевания. Ей посоветовали тщательно отмыть с пораженной области все остатки мыла, осушить эту область и повторно нанести состав (лекарство). После выполнения этих инструкций она отметила, что после нанесения лекарственного состава вспышка полностью прекратилась, как это было при двух предыдущих вспышках. Примеры 8-13. Дерматологические и ветеринарные испытания. С целью выявить возможную дерматологическую аллергическую реакцию, индуцированную лекарственным составом (лекарством),были проведены испытания на животных. Использовались шесть животных: три кроликасамки (возраст неизвестен), две собаки (одна 2 летняя сука и один 9-летний кобель) и один 3 летний кастрированный кот. В этих испытаниях на животных на внутреннюю поверхность ушной раковины каждого животного наносили вышеуказанный состав (лекарство) по вышеуказанному способу. Во всех случаях обрабатываемую область покрывали соединением на 24 ч,что соответствовало времени применения лекарства у людей. Испытания, проведенные на шести животных, показали отсутствие признаков дерматологического воспаления или аллергической реакции. Пример 14. Вышеуказанное лекарственное соединение, содержащее ингибиторы вирусов, было испытано также на вызванной вирусом папилломы бородавке на морде 2-летней кастрированной чистопородной лошади. Бородавки, вызванные вирусом папилломы, трудно поддаются лечению. Диаметр бородавки составлял 25 мм. Антимикробное соединение (лекарство) наносили дважды в день. Размер бородавки измеряли при каждом нанесении. 34 Результаты: совершенно неожиданно размер бородавки при нанесении на нее лекарства резко уменьшался (примерно на 3 мм в день), и на 5-й день она полностью исчезла. Наблюдалась следующая картина: вначале началась деградация поверхностных слоев бородавки с появлением больших эритематозных папул. Затем,что примечательно, бородавка не просто уменьшалась в размере путем отшелушивания или отслаивания, она утончались в точке прикрепления к эпидермису субъекта и отпала, еще сравнительно цельная и без прогрессирующего рубцевания. В дальнейших долгосрочных испытаниях настоящего изобретения in vivo, которые были начаты на первых семи испытуемых в апреле 1989 г. и продолжались затем в течение 7 лет,проведено лечение около 100 инфекционных вспышек с помощью лекарства в различных концентрациях, как описано выше. Во всех случаях были получены следующие необычайно хорошие результаты: 1. Боль исчезала в течение нескольких минут; 2. Если состав применялся на продромальной стадии, никаких вспышек не возникало; 3. Вспышка проходила в течение 21 ч, если лекарство применяли на стадии высыпания. Испытания in vitro В Чикагском университете в лабораториях клинической микробиологии для определения ингибирующей активности in vitro способа лечения и соединения (лекарства) было предпринято лабораторное испытание. Оно было проведено заместителем директора, имеющим степень Ph.D., и адъюнкт-профессором патологии. Испытание in vitro лекарственного состава,именуемого далее "лекарство", дало необычайно хорошие результаты. Было установлено, что способ лечения и состав имеют неожиданную и необычайно высокую ингибирующую активность по отношению к ВПГ-1 и ВПГ-2. Патолог заявил, что он испытывал "сотни" других соединений и никогда не видел ничего сравнимого с данным соединением. Далее следуют описания проведенных испытаний лекарства и результатов, полученных в Чикагском университете. Для облегчения интерпретации некоторых из этих научных данных и результатов испытаний вводятся следующие термины:"МНС" относится к минимальной необходимой среде (Minimal Essential Medium, MEM). Это культуральная среда, используемая в лабораториях для роста клеток, на которых проводят испытания."Фибробласт" - мезенхимная клетка человека (клетка соединительной ткани, крови, кости, лимфосистемы и хряща)."ИK50" относится к ингибирующей концентрации. Как обычно для этого испытания была выбрана предельная величина 50%-го ин 35 гибирования. Следующее за этим обозначением число показывает наибольшее разбавление,дающее ингибирование менее 50%. Таким образом, это есть определение предельной величины. Если графа под соответствующим разбавлением оставлена пустой, это означает, что при этом разбавлении наблюдалась токсичность,либо результаты испытаний не могли быть должным образом зафиксированы, либо не было получено объяснимых данных. Если в графе под соответствующим разбавлением поставлен дефис (-), это означает,что не было стерильных бляшек вируса (ВПГ) и что наблюдается полное подавление герпеса. Примеры 15-17. В этих испытаниях in vitro были использованы следующие лекарства (лекарственные препараты): Лекарство 1 = ПАВ - хлорид бензалкония в водном растворе при соотношении 1:750. ПАВ в водном растворе перед использованием фильтровали и разбавляли в равном объеме двукратной (2 х) МНС для получения разбавления 1:1500 в однократной (1 х) МНС. Лекарство 2 = порошок Echinacea (фитохимикалии) в водном растворе. Этот препарат экстрагировали настаиванием в тепле в стерильной воде. Экстрагированные фитохимикалии центрифугировали и фильтровали перед использованием. Фильтрованные фитохимикалии разбавляли равным объемом х 2 МНС для получения неразбавленного препарата в 1 х МНС. Лекарство 3 = порошок Echinacea (фитохимикалии) экстрагировали и объединяли с ПАВ - хлоридом бензалкония методом холодного настаивания. Объединенный препарат центрифугировали и фильтровали перед использованием и разбавляли в равном объеме 2 х МНС для получения неразбавленного препарата в 1 х МНС. 1. Три планшета с 24 ячейками инокулировали фибробластами. Три различных экстракта(для сравнения) при 5 концентрациях состава использовали для проверки антивирусной активности при следующих концентрациях этого состава: неразбавленный, 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16 в 1 х МНС. На каждом планшете имелись 4 контрольных ячейки с МНС без лекарства. 2. Ростовую среду удаляли из ячеек и добавляли в каждую ячейку верхней половины каждого планшета по 200 мкл ВПГ-1. ВПГ-1 разбавляли в отношении 1:5000 (2,0 мкл рабочего раствора ВПГ-1 в 10 мл МНС). Титр вируса составлял 3-106 мл-1. Таким же образом в каждую ячейку нижней половины каждого планшета добавляли по 200 мкл ВПГ-2. ВПГ-2 разбавляли в отношении 1:2000 (5,0 мкл рабочего раствора ВПГ-2 в 10 мл МНС). Титр вируса составлял 6-105 мл-1. 36 3. Планшеты инкубировали при 37 С в течение 2 ч. 4. Инокулят вируса удаляли и в 4 ячейки добавляли по 1 мл МНС, содержавшей лекарства 1-3. Концентрация лекарства по отношению к МНС указана ниже. Концентрация Лекарство (мкл) МНС (мкл) 5. Результаты: ВПГ-1, жидкое покрытие,лекарство добавлено немедленно после адсорбции вируса. Планшет 1. Лекарство 1 загрязнено бактериями. Роста нет, возможны обломки клеток. Планшет 2. Лекарство 2 загрязнено бактериями. Роста нет, возможны обломки клеток. Планшет 3. Лекарство 3. Результаты приведены ниже в табл. 2 и 3. Таблица 2. Лекарство 3, ВПГ-1, результаты испытаний Концентра- Нераз 1:2 1:4 1:8 1:16 ция бавл. стерильных токсичн. токсичн. 6 12 бляшек: 54 стерильных токсичн. токсичн. 4 16 бляшек: 42 среднее: 48 ИК 50 5 14 1:16 Таблица 3. Лекарство 3, ВПГ-2, результаты испытаний Концентра- Нераз 1:2 1:4 1:8 1:16 ция бавл. стерильных токсичн. токсичн. 22 32 бляшек: 46 стерильных токсичн. токсичн. 21 28 бляшек: 49 среднее: 48 ИК 50 22 30) очень маленькие стерильные бляшки. Примечания: Испытания лекарственного средства (Лекарство 3) дали превосходные результаты. Клетки выглядели хорошо и не содержали загрязнений. При меньших разбавлениях препараты, по-видимому, токсичны для некоторых клеток. Этот препарат имел неожиданно высокую ингибирующую активность. Примеры 18-20. Три планшета с 24 ячейками инокулировали фибробластами и следующими лекарствами. Тест-лекарство 1 А = ПАВ - хлорид бензалкония в водном растворе. ПАВ -хлорид бензалкония готовили разбавлением в воде в отношении 1:375 (32 мкл в 12,0 мл стерильной воды). Фильтровали перед использованием. Разбавляли равным объемом 2 х МНС для получения разбавления 1:750 в 1 х МНС. Разбавление делали для поддержания нужного соотношения. Тест-лекарство 2 А = порошок Echinaceapurpurea (фитохимикалии) в водном растворе. Этот препарат представлял собой раствор с концентрацией 50 мг/мл (300 мг в 6,0 мл воды) порошка Echinacea purpurea в стерильной воде. Смесь перемешивали и помещали в холодильник на 4 ч. Препарат порошка Echinacea центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин при 10 С и фильтровали перед использованием, а затем разбавляли равным объемом 2 х МНС, получая неразбавленный препарат в 1 х МНС. Тест-лекарство 3 А = порошок Echinacea- хлориде бензалкония. Этот препарат представлял собой раствор с концентрацией 50 мг/мл(300 мг в 6,0 мл хлорида бензалкония, 1:375). Смесь перемешивали и помещали в холодильник на 4 ч. Смесь фитохимикалиев и ПАВ центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин при 10 С и фильтровали перед использованием, а затем разбавляли равным объемом 2 х МНС, получая неразбавленный препарат в 1 х МНС. 1. Для проверки трех препаратов лекарств использовали 3 планшета. Концентрации, требуемые для проверки противовирусной активности, составляли 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16 в 1 х МНС. На каждом планшете имелись 4 контрольных ячейки, содержавшие МНС без лекарства. 2. Ростовую среду удаляли из ячеек и добавляли в каждую ячейку верхней половины каждого планшета по 200 мкл ВПГ-1. ВПГ-1 разбавляли в отношении 1:5000 (2,0 мкл рабочего раствора ВПГ-1 в 10 мл МНС). Титр вируса составлял 3-106 мл-1. 3. Планшеты инкубировали при 37 С в течение 4 ч. 4. Инокулят вируса удаляли и в 4 ячейки добавляли по 1 мл МНС, содержавшей лекарства 1 А-3 А. Концентрация Лекарство (мкл) МНС (мкл) 5. Результаты: ВПГ-1, жидкое покрытие,состав добавлен немедленно после адсорбции вируса. Таблица 5. Лекарство 1 А, ВПГ-1, результаты испытаний Концентрация 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 стерильных токсич. токсич. токсич. токсич. токсич. бляшек: 70 стерильных бляшек: 68 стерильных бляшек: 58 стерильных бляшек: 74 средн.70 ИК 50 1:32 Примечания: эти ячейки содержали поверх клеток тонкий осадок. По-видимому, хлорид бензалкония осаждается вместе с белком в ростовой среде. 38 Таблица 6. Лекарство 2 А, ВПГ-1, результаты испытаний Концентрация 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 стерильных 9 12 бляшек: 72 стерильных 7 8 бляшек: 74 стерильных 4 12 бляшек: 79 стерильных 7 11 бляшек: 71 среднее:70 ИК 50 1:32 Примечания: Хотя имелось некоторое количество стерильных бляшек, они были очень мелкие. Таблица 7 -Лекарство 3 А, ВПГ-1, результаты испытаний Концентрация 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 стерильных токсич. токсич. токсич. токсич. бляшек: 72 стерильных бляшек: 68 стерильных бляшек: 67 стерильных бляшек: 70 среднее:70 ИК 50 1:32 Примечания: хотя наблюдалась небольшая токсичность, это лекарство было очень эффективно в подавлении вируса, не наблюдалось никаких стерильных бляшек. Примеры 21-24. Четыре планшета с 24 ячейками инокулировали фибробластами. Тест-лекарство 1 Б = ПАВ - хлорид бензалкония в водном растворе. Хлорид бензалкония готовили разбавлением в воде в отношении 1:1000 (10 мкл в 10,0 мл стерильной воды). Фильтровали перед использованием и разбавляли равным объемом 2 х МНС для получения разбавления 1:2000 в 1 х МНС (500 мкл лекарства + 500 мкл 2 х МНС). Тест-лекарство 2 Б = порошок Echinaceapurpurea (фитохимикалии) в водном растворе. Этот препарат представлял собой раствор с концентрацией 50 мг/мл порошка Echinacea purpurea в стерильной воде (250 мг в 5,0 мл воды). Смесь перемешивали и помещали в холодильник на 4 ч. Препарат порошка Echinacea центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин при 10 С и фильтровали перед использованием, а затем разбавляли равным объемом 2 х МНС, получая неразбавленный препарат в 1 х МНС (500 мкл лекарства + 500 мкл 2 х МНС). Тест-лекарство 3 Б = порошок Echinaceapurpurea (фитохимикалии), растворенный в ПАВ хлориде бензалкония. Этот препарат представлял собой раствор с концентрацией 50 мг/мл(250 мг в 5,0 мл хлорида бензалкония, 1:1000). Смесь перемешивали и помещали в холодильник на 4 ч. Смесь фитохимикалии Echinacea и ПАВ центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин при 10 С и фильтровали перед использованием, а затем разбавляли равным(разбавитель), затем смешанный с ПАВ - хлоридом бензалкония при отношении 1:1000. Этот препарат представлял собой раствор с концентрацией 50 мг/мл порошка Echinacea purpurea в стерильной воде (250 мг в 5,0 мл воды). Смесь перемешивали и помещали в холодильник на 4 часа. Водные фитохимикалии центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин при 10 С и фильтровали перед использованием. Этот препарат разбавляли равным объемом хлорида бензалкония при отношении 1:1000, получая смесьEchinacea-хлорид бензалкония. Эту смесь затем разбавляли равным объемом 2 х, чтобы получить препарат, разбавленный в отношении 1:4, в 1 х МНС (500 мкл лекарства 1 и 250 мкл лекарства 2 + 500 мкл 2 х МНС). 1. Для проверки четырех препаратов лекарств использовали 4 планшета. Концентрации, требуемые для проверки антивирусной активности, составляли: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и 1:320 в 1 х МНС. На каждом планшете имелись 4 контрольных ячейки, содержавшие МНС без лекарства. 2. Ростовую среду удаляли из ячеек и добавляли в каждую ячейку двух верхних рядов каждого планшета по 200 мкл ВПГ-1. ВПГ-1 разбавляли в отношении 1:5000 (2,0 мкл рабочего раствора ВПГ-1 в 10 мл МНС). Титр вируса составлял 3-106 мл-1. Таким же образом в каждую ячейку нижней половины каждого планшета добавляли по 200 мкл ВПГ-2. ВПГ-2 разбавляли в отношении 1:2000 (5 мкл рабочего раствора ВПГ-2 в 10 мл МНС). Титр вируса составлял 6-105 мл-1. 3. Планшеты инкубировали при 37 С в течение 4 ч. 4. Инокулят удаляли и в 4 ячейки добавляли по 1 мл МНС, содержавшей лекарства 14. Концентрация Лекарство (мкл) МНС (мкл) Результаты: ВПГ-1, жидкое покрытие, лекарство добавлено немедленно после адсорбции вируса. Таблица 9. Лекарство 1 Б, ВПГ-1, результаты испытаний Концентра 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 ция стерильных токсич. токсич. токсич. токсич. 15 бляшек: 37 стерильных 18 бляшек: 45 среднее: 41 ИК 50 Примечания: некоторая токсичность, подсчет трудно произвести. ВПГ-2, жидкое покрытие, лекарство добавлено немедленно после адсорбции вируса. 40 Таблица 10. Лекарство 1 Б, ВПГ-2, результаты испытаний Концентра 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 ция стерильных токсич. токсич. токсич. токсич. 21 бляшек: 38 стерильных 17 бляшек: 42 среднее: 40 19 ИК 50 1:320 Примечания: токсичность слишком велика для точного подсчета. Таблица 11. Лекарство 2 Б, ВПГ-1, результаты испытаний Концентра 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 ция стерильных 2 8 23 24 44 бляшек: 39 стерильных 3 18 11 28 38 бляшек: 40 среднее: 40 3 13 17 26 ИК 50 1:80 Примечания: мелкие стерильные бляшки. Таблица 12. Лекарство 2 Б, ВПГ-2, результаты испытаний Концентра 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 ция стерильных 21 33 бляшек: 48 стерильных 22 38 бляшек: 52 среднее: 50 21,5 35,5 ИК 501: 20 Таблица 13. Лекарство 3 Б, ВПГ-1, результаты испытаний Концентра 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 ция стерильных 1 17 31 37 бляшек: 44 стерильных 16 28 27 бляшек: 46 среднее: 45 17 30 32 ИК 50 1:40 Примечания: Несмотря на некоторую токсичность, лекарство очень эффективно, нет стерильных бляшек. Таблица 14. Лекарство 3 Б, ВПГ-2, результаты испытаний Концентра 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 ция мало клеток 11 27 30 35 стерильных 10 32 бляшек: 44 среднее: 44 11 29,5 ИК 50 1:20 Примечания: тест труден для хорошего подсчета. Однако лекарство имеет достаточно высокую ингибирующую активность. Таблица 15. Лекарство 4 Б, ВПГ-1, результаты испытаний Концентра 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 ция стерильных токсич. токсич. токсич. 33 бляшек: 47 стерильных 28 бляшек: 48 среднее:48 30 ИК 50 1:320 41 Примечания: лекарство слишком токсично при высоких дозах. Тем не менее, имеется ингибирующая активность при разбавлении 1:320. Таблица 16. Лекарство 4 Б, ВПГ-2, результаты испытаний Концентра 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 ция стерильных токсич. токсич. токсич. 2 16 бляшек: 38 стерильных 4 20 бляшек: 40 среднее: 39 3 18 ИК 50 1:640 Примечания: Токсичность вызвана, повидимому, наличием хлорида бензалкония. Лекарство при разбавлении 1:320 обнаруживает очень высокую ингибирующую активность. В испытаниях in vitro в примерах 21-24 были использованы необработанные и неочищенные материалы. Однако испытания продемонстрировали необычайно высокую вирусингибирующую активность и, по-видимому,синергизм действия компонентов. В предшествующих испытаниях in vitro,где лекарства 3, 3 А и 3 В представляли собой фитохимикалии, экстрагированные из Echinacea purpurea и смешанные с ПАВ - хлоридом бензалкония, полученное в итоге лекарство обнаруживало более высокую противовирусную активность и наиболее заметный синергизм действия компонентов (Echinacea purpurea и хлорид бензалкония). Это может быть предположительно объяснено участием обоих компонентов в стабильности и повышенной активности. Хлорид бензалкония в синергичной смеси проявлял меньшую токсичность, а синергетическая комбинация (лекарство) имело более высокую противовирусную активность, в особенности против ВПГ-2. Тесты на ВИЧViracea-1 и Viracea-2 были испытаны для оценки их анти-ВИЧ активности в модельных исследованиях с острой инфекцией. Были проведены также дополнительные исследования,чтобы определить пределы и механизм действия этих двух соединений. Соединения Viracea-1 и Viracea-2 применяли в виде растворов. Пропись приготовления включала фильтрование раствора и центрифугирование. Высокую тестовую концентрацию,используемую в каждом анализе, варьировали от разбавления 1:5 до разбавления 1:100 в культуральной среде для клеток. Каждое соединение до использования хранили при 70 С. В этих испытаниях использовали следующие лекарстваViracea 2 = Поддержание и количественный учет клеточных линий и рабочих суспензий вируса Клетки, используемые в скрининговых испытаниях препаратов, были обозначены как 42 клеточная линия CEM-SS. Эти клетки очень чувствительны к заражению ВИЧ, быстро образуют многоядерные синцитии и в конечном итоге убиваются ВИЧ. Их легко поддерживать (27 х 103 клеток на мл) в культуральной средеRPMI 1640, дополненной 10% сывороткой теленка, глутамином и антибиотиками. Клетки пересевают дважды в неделю с разведением 1:20. Номер пассажа записывается каждую неделю и клетки выбрасывают после 20 недель пассирования. Затем размораживают и используют для анализов свежие клетки CEM-SS. Порции исходных клеток CEM-SS хранят замороженными под жидким азотом в 1 мл флаконахNUNC в 90% сыворотке теленка и 10% диметилсульфоксиде (ДМСО). После размораживания и культивирования в течение двух недель они стандартно готовы для использования в анализах первичного скрининга. Перед заменой долго пассируемой клеточной линии новые клетки CEM-SS проверяют в соответствии с протоколом анализа скрининга с использованием очередной порции инфекционного вируса иAZT. Если на новых клетках инфекционность вируса значительно отличается или AZT оказывается менее активным, чем ожидалось, новые клетки в программе скрининга не используют. На всех линиях клеток (см. выше) стандартно проводят проверку на микоплазму. Препараты вируса готовят и титруют на клетках CEM-SS, разделяют на аликвоты по 5 мл и замораживают при -135 С. После размораживания неиспользованный вирус выбрасывают, чтобы избежать изменения инфекционного титра. Оптимизационные анализы зафиксировали падение титра вируса на один логарифм в первом цикле замораживания-размораживания и менее значительное падение титра при последующих циклах замораживания - размораживания. Препараты вируса готовят заражением ВИЧ 5 х 105 клеток CEM-SS в объеме 200 мкл с такой множественностью заражения, чтобы обеспечить полную гибель клеток на 7-й день после заражения (множественность около 0,05 для изолята IIIB ВИЧ-1 и 0,01 для изолята RF ВИЧ-1). Заражение продолжают в течение 1 часа при 37 С, затем клетки переносят во флакон Т 25 и доводят объем до 2 мл. Через 1 день после заражения объем доводят до 5 мл, а на 2-й день увеличивают объем до 10 мл. Начиная с 4 го дня, клетки осаждают в центрифуге, надосадочную жидкость отбирают и сохраняют, а клетки ресуспендируют в 10 мл аликвоте свежей культуральной среды. Полная ежедневная смена среды, не допускающая роста в ней клеток в течение более длительного времени, обеспечивает относительную чистоту вирусного инокулюма, используемого в первичном скрининге, от питательных веществ среды при заражении им клеток. Для используемой реакции окрашивания (ХТТ) необходимо, чтобы концентрация глюкозы оставалась высокой. Если в 43 ячейках глюкоза израсходована вследствие роста клеток, метаболическое превращение тетразолия в продукт формазан невозможно. Бесклеточные супернатанты от массированно зараженных клеток отбирали на 4-й, 5-й,6-й и 7-й дни. При каждодневном отборе аликвоту супернатанта отбирают отдельно для использования в определении титра. Определения титра включают измерение активности обратной транскриптазы, определение числа инфекционных частиц титрованием конечного разведения или измерением числа стерильных бляшек (в клетках CEM-SS), а также количественное определение кинетики убиения клеток. Было установлено, что максимальные количества инфекционного вируса при высокой степени инфекции клеточных культур продуцируются,когда выживаемость клеток падает ниже 50%-го уровня. Поскольку тест первичного скрининга количественно оценивает защитные эффекты соединения по его способности ингибировать индуцированные ВИЧ цитопатогенные эффекты, для определения количества вируса на ячейку, необходимого в тесте первичного скрининга,обычно используют то количество вируса, которое необходимо, чтобы убить клетки CEM-SS за 6 дней. Каждый ежедневный сбор титруют по протоколу теста первичного скрининга с ХТТ,причем делали двукратные серийные разведения вируса, начиная с 50 мкл вирусной суспензии на ячейку для получения высокой тестконцентрации. Способ окрашивания красителем тетразолием ХТТ используют для определения точного количества вируса, необходимого, чтобы убить все клетки CEM-SS в каждой ячейке, и это минимальное количество вируса используют в осуществлении всех первичных испытаний. Такие же методы применяют для приготовления всех вирусных изолятов, используемых в лаборатории, включая штаммы лабораторного происхождения ВИЧ-1, ВИЧ-2 и синцитиального вируса. Использованные клинические изоляты пассировали на свежих клетках человека, способы выращивания этих клеток и получения вирусных сборов описаны ниже. Микротитровальный антивирусный анализ ХТТ Приготовление клеток Клетки CEM-SS или другие определенные линии клеток человека, использованные в данных экспериментах, для использования в данном тесте пассировали во флаконах Т-150. За один день до проведения анализа клетки расщепляли в отношении 1:2, чтобы к моменту заражения они находились в экспоненциальной фазе роста. В день анализа клетки дважды промывали культуральной средой и ресуспендировали в свежей культуральной среде. Подсчет общего числа клеток и степени выживаемости производили с помощью гемоцитометра и способа исключения красителя трипана голубого. Для клеток, используемых в анализе, выживаемость 44 была больше 95%. Клетки осаждали в центрифуге и ресуспендировали в культуральной среде при концентрации 2,5 х 104 клеток в мл. Клетки вносили в планшеты с препаратами в объеме 50 мкл. Приготовление вируса Предварительно титрованную аликвоту вируса брали из замораживателя (-80 С) и медленно размораживали до комнатной температуры в боксе с биологической защитой. Вирус ресуспендировали и разбавляли в культуральной среде таким образом, чтобы количество вируса, вносимого в каждую ячейку в объеме 50 мкл, соответствовало определенному ранее количеству вируса, полностью убивающему клетки на 6-й день после заражения. Обычно для вирусных сборов, получаемых с изолятом IIIB ВИЧ, требовалось добавлять 5 мкл вируса на ячейку. Потенция сборов RF вируса, требующих 0,5-1 мкл вируса на ячейку, была в 5-10 раз больше. Расчеты концентрации 50%-го ингибирования для культур ткани (KИKT50) по титрованию конечных разведений в клетках CEM-SS показали, что в этих анализах множественность заражения находилась в интервале от 0,005 до 2,5. Формат планшетов Формат планшетов для анализа был стандартизован и содержал ячейки контроля клеток(только клетки), ячейки контроля вируса (клетки с вирусом), ячейки контроля токсичности препарата (клетки только с препаратом), ячейки колориметрического контроля препарата (только препарат) и экспериментальные ячейки (препарат с клетками и вирусом). Примеры 25-48. Окрашивание планшетов для скрининга методом ХТТ После инкубации в течение 6 дней при 37 С в СО 2-термостате тестовые планшеты анализировали путем окрашивания красителем тетразолием ХТТ. ХТТ-тетразолий метаболизируется митохондриальными ферментами метаболически активных клеток с превращением в растворимый продукт формазан, что позволяет проводить быстрый количественный анализ ингибирования индуцированной ВИЧ гибели клеток испытываемыми анти-ВИЧ препаратами. На 6-й день после заражения планшеты удаляли из термостата и просматривали. Планшеты для микротитрования имеют ячейки с круглым дном, что обеспечивает быстрый макроскопический анализ активности данного испытываемого препарата путем оценки размера клеточного слоя. Результаты макроскопических наблюдений подтверждали и уточняли при последующем микроскопическом анализе. Раствор ХТТ готовили только как рабочий раствор в фосфатносолевом буфере (ФСБ) при концентрации 1 мг/мл. Раствор феназинметосульфата (ФМС) готовили при концентрации 15 мг/мл в ФСБ и хранили в темноте при -20 С, рабочий раствор рически при 450 нм с помощью автоматическоХТТ/ФМС готовили непосредственно перед го сканирующего прибора для измерений в использованием, разбавляя ФМС 1:100 в ФСБ и планшетах Vmax plate reader фирмы Molecular добавляя 40 мкл к 1 мл раствора ХТТ. В каждуюDevices. На основании полученных значений ячейку планшета вносили 50 мкл раствора процента снижения цитопатогенного эффекта и ХТТ/ФМС и планшет инкубировали повторно процента выживания клеток рассчитывали инпри 37 С в течение 4 час. Вместо крышек плангибирующие концентрации MK25, 5095 и токсишеты закрывали адгезивной пленкой, закрытые планшеты несколько раз переворачивали для ческие концентрации TK25, 5095, a также другие перемешивания образующегося растворимого индексы. формазана и анализировали их спектрофотометТаблица 17. Антивирусная активность in vitro. Анализ способом ХТТ для Viracea 1 Таблица 20. Антивирусная активность in vitro Анализ способом ХТТ для Viracea 2 Примечания: ОП - оптическая плотность; ЦПЭ - цитопатогенный эффект. Примеры 49-54. Анализ активности обратной транскриптазы. Была использована реакция обратной транскриптазы (ОТ), основанная на микротитровании. Меченый тритием тимидинтрифосфат(ТТФ) ресуспендировали в дистиллированной воде при концентрации 5 Кюри/мл. Готовили рабочий раствор, содержащий поли(рА) и олиго(дТ), который хранили при -20 С. Буфер для реакции ОТ готовили заново в день испытаний,он содержит 125 мкл 1 М ЭГТА, 125 мкл дистиллированной Н 2 О, 125 мкл тритона Х-100, 50 мкл 1 М трис (рН 7,4), 50 мкл 1 М дитиотреитола и 40 мкл 1 М МgСl2. Эти три раствора смешивали в следующем соотношении: 1 часть ТТФ, 2,5 части раствора поли(рА):олиго(дТ), 2,5 части реакционного буфера и 4 части дистиллирован ной воды. 10 мкл этой реакционной смеси помещали в планшет с ячейками с круглым дном для микротитрования, добавляли 15 мкл содержащего вирус супернатанта и перемешивали. Планшет инкубировали при 37 С в течение 60 мин. После завершения реакции реакционный объем наносили на полоски фильтровальной бумаги, промывали 6 раз каждый раз по 5 мин 5% натрийфосфатным буфером, 2 раза по 1 мин дистиллированной водой, 2 раза по 1 мин 70% этанолом и высушивали. Высушенную полоску фильтровальной бумаги помещали в пластиковый мешочек для проб, добавляли сцинтилляционную жидкость для счета бета-излучения и мешочек заплавляли. Включенную радиоактивность регистрировали с помощью сцинтилляционного счетчика Wallac Microbeta. Таблица 23. Viracea-1: Моноцитные клетки периферической крови/штамм ROJO Таблица 24. Viracea-1: Моноцитные клетки периферической крови/штамм ROJO Таблица 25. Viracea-2: Моноцитные клетки периферической крови/штамм ROJO(Enzyme Linked Immunosorbent Analysis - анализ на иммуносорбенте с присовокупленным ферментом) Использовали наборы реактивов дляELISA фирмы Coulter. Анализ проводили согласно рекомендациям поставщика. Перед анализом ELISA обычным способом проводили пробы активности обратной транскриптазы и полученные значения использовали для оценки включенной радиоактивности в указанной пробе с целью определения степени разбавления образцов, необходимой для ELISA. В каждом анализе получали контрольные кривые для более точного определения количества капсидного белка в каждом образце. Для получения результатов проводили спектрофотометрический анализ при 450 нм на автоматизированном анализаторе планшетов Molecular Device Vmax. Концентрации белка Р 24 рассчитывали по результатам измерений оптической плотности с исполь зованием компьютерной программы Soft Max фирмы Molecular Devices. Инфекционные частицы Количество инфекционных частиц определяли методом стерильных бляшек на клеткахCEM-SS в соответствии с методом количественного определения инфекционности для ВИЧ 1 и ВИЧ-2. Планшеты для микротитрования с 96 ячейками и плоским дном покрывали 50 мкл раствора поли-L-лизина с концентрацией 50 мкг/мл на 2 ч при 37 С. Затем ячейки промывали ФСБ и помещали в каждую ячейку 2,5 х 105 клеток CEM-SS, где они фиксировались на дне. Количество добавленных клеток было достаточным для образования монослоя клеток CEMSS в каждой ячейке. Затем добавляли вируссодержащий супернатант, полученный из каждой ячейки в тесте с ХТТ, включая ячейки с контролем вируса и контролем клеток, и из каждого серийного разведения испытываемого препарата. Количество синцитиев подсчитывали в этом 96-ячеечном планшете для микротитро 51 вания с плоским дном с помощью инвертированного микроскопа Olympus CK2 на 4-й день после заражения. Каждый синцитий был результатом действия одного инфекционного вириона ВИЧ. Анти-ВИЧ активность в свежих клетках человека: анализ в свежих Т-лимфоцитах человека Свежие лимфоциты периферической крови человека (ПКЛ) получали от доноровдобровольцев Красного Креста, серонегативных по ВИЧ и ВПГ. Кровь подвергали лейкофорезу,разбавляли 1:1 ФСБ Дальбеко, наслаивая поверх 14 мл градиента плотности Ficoll-Hypaque в 50 мл центрифужной пробирке. Центрифугировали пробирки в течение 30 мин при 600 g. Зону PBL осторожно отсасывали аспиратором из образующегося раздела фаз и промывали СФБ дважды низкоскоростным центрифугированием. После последней промывки количество клеток определяли по исключению красителя трипанового голубого, ресуспендировали при концентрации 1 х 107 клеток/мл в среде RPMI 1640 с 15% сыворотки теленка (СТ), 2 мМ L-глутамина, 4 мкг/мл ФГА-Р и инкубировали при 37 С в течение 48-72 ч. После окончания инкубации клеткиRPMI 1640 с 15% СТ, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина,10 мкг/мл гентамицина и 20 ед/мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (ИЛ-2). Клетки PBL поддерживали в этой среде при концентрации 1-2 х 106/мл со сменой среды каждые две недели до использования по протоколу испытаний. Для анализа в PBL собирали стимулированные ФГА-Р клетки, по меньшей мере, от двух нормальных доноров, помещали их в свежую среду при концентрации 2 х 106/мл и высевали во внутренние ячейки 96-микроячеечного микропланшета с круглодонными ячейками в объеме 50 мкл на ячейку. Разведения испытуемых лекарств готовили в двукратной концентрации в пробирках для микротитрования и 100 мкл раствора каждой концентрации помещали в соответствующие ячейки в стандартном формате. В каждую тестовую ячейку вносили 50 мкл определенного заранее разведения рабочего раствора вируса. Ячейки только с клетками и вирусом предназначали для контроля вируса. Отдельные планшеты идентично заполняли препаратами без вируса для исследований цитотоксичности лекарств в системе тестирования с ХТТ. В стандартном анализе в PBL (множественность заражения, МЗ: 0,2) анализ завершали на 7-й день после сбора свободных от клеток образцов супернатантов для определения активности обратной транскриптазы. В анализе в PBL с низкой МЗ (0,02) образцы супернатантов собирали на 6-й, 11-й и 14-й дни после заражения и анализировали на активность ОТ. Меченый тритием тимидинтрифосфат (ТТФ) ресуспенди 002423 52 ровали в дистиллированной воде при концентрации 5 Кюри/мл. Готовили рабочий раствор,содержащий поли(рА) и олиго(дТ), который хранили при -20 С. Буфер для реакции ОТ готовили заново в день испытаний, он содержит 125 мкл 1 М ЭГТА, 125 мкл дистиллированной Н 2 О,110 мкл додецилсульфата натрия (ДСН), 50 мкл 1 М трис (рН 7,4), 50 мкл 1 М дитиотреитола(ДТТ) и 40 мкл 1 М МgСl2. Эти три раствора смешивали в следующем соотношении: 2 части ТТФ, 1 часть раствора поли(рА):олиго(дТ) и 1 часть реакционного буфера. 10 мкл этой реакционной смеси помещали в планшет с круглым дном для микротитрования, добавляли 15 мкл содержащего вирус супернатанта и перемешивали. Планшет инкубировали при 37 С в течение 60 мин на водяной бане с твердым держателем для предотвращения погружения планшета. После завершения реакции реакционный объем наносили на полоски бумаги DE81, промывали 5 раз каждый раз по 5 мин 5% натрийфосфатным буфером, 2 раза по 1 мин дистиллированной водой, 2 раза по 1 мин 70% этанолом и высушивали. К каждому образцу добавляли сцинтиллятор Opti-Fluor О, включенную радиоактивность регистрировали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Wallac 1450Microbetaplus. В параллельных культурах на 7-й день измеряли включение меченого тритием тимидина. В каждую ячейку вводили импульсную метку 1 мкКюри меченого тритием тимидина и клетки собирали 18 ч спустя на фильтровальную бумагу из стекловолокна с помощью сборщика клеток Scatron. Фильтры высушивали, помещали в сцинтилляционные флаконы с 1 мл сцинтилляционного коктейля, включенную радиоактивность регистрировали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Packard Tri-Carb 1900 TR. Примеры 55-78. Анти-ВИЧ активность в свежих клетках человека: анализ в свежих моноцитных макрофагах человека. Для выделения адгезирующих клеток 3 х 106 клеток периферической крови, стимулированных не РHА, ресуспендировали в ФСБ Хэнкса с кальцием, магнием и 10% сывороткой АВ человека. Клетки помещали в 24-ячеечный планшет для микротитрования на 2 ч при 37 С. Неадгезировавшие клетки удаляли 6-кратным энергичным промыванием. Адгезировавшие клетки культивировали в течение 7 дней в культуральной среде RPMI 1640 с 15% сывороткой теленка. В течение этого инкубационного периода культуры осторожно просматривали на предмет оценки формирования сплошного монослоя. Клетки заражали моноцитотропными штаммами ВИЧ-1 BaL или ADA и подобранной парой из AZT-чувствительного и AZTустойчивого изолятов вируса. Каждый из этих изолятов вируса был получен из Национальной лаборатории приобретенного иммунодефицита по программе "Исследовательские и референсные реагенты для СПИД". Из зараженных культур адгезировавших клеток периферической крови отбирали сборы каждого из этих вирусов с высоким титром и хранили аликвотами по 1 мл при -80 С. Монослои моноцитных макрофагов заражали с МЗ 0,1. Испытуемые в этом тесте на моноцитных макрофагах соединения добавляли к монослоям незадолго до заражения, чтобы максимально повысить возможность выявления активных соединений. Через два дня после заражения среду декантировали и для удаления избытка вируса культуры дважды промыли отработанной средой. Добавили свежую среду, как таковую, или среду, содержащую соответствующую концентрацию лекарств, и продолжали инкубацию еще 54 5 дней. На 7-й день после заражения определяли жизнеспособность клеток тестом на исключение красителя тетразолия ХТТ или трипанового голубого, а также проводили анализ ELISA для определения продукции сердцевинного антигена ВИЧ р 24. Наборы реактивов для ELISA получали от фирмы "Coulter". В каждом анализе получали контрольные кривые для точного определения количества капсидного белка в каждом образце. Для получения результатов проводили спектрофотометрический анализ при 450 нм на автоматизированном анализаторе планшетов Molecular Devices Vmax. Концентрации белка р 24 рассчитывали по результатам измерений оптической плотности с использованием компьютерной программы Soft Max фирмы Таблица 29. Тест для "Viracea-1" на макрофагах Активность Р-24, пг/мл Таблица 30. Тест для "Viracea-2" на макрофагах. Определение токсичности по оптической плотности Таблица 31. Определение анти-ВИЧ активности на макрофагах (р 24) для Viracea2-4 Таблица 33. Определение анти-ВИЧ активности на макрофагах (р 24) для Viracea2-5 Таблица 35. Определение анти-ВИЧ активности in vitro на макрофагах для Viracea 1 Таблица 37. Определение анти-ВИЧ активности in vitro на макрофагах для Viracea 2 Примеры 79-90. Определение ингибирования связывания и слияния. В этих анализах использовали клеткиHeLa-CD4-LTRgalactosidase, в которых происходит индуцированная белком tat трансактивация гена -галактозидазы под действием промотора длинного концевого повтора (ДКП) ВИЧ-1. С помощью этого анализа определяли количественно как степень связывания инфекционных вирионов с клетками, так и межклеточные слияния. Инфицированные клетки обра зуют синцитии, которые легко подсчитываются под микроскопом после инкубации их с X-gal. Анализ ингибирования связывания ВИЧ включал высев 1 х 104 клеток HeLa-CD4-LTR-galactosidase в объеме 200 мкл в микротитровальные планшеты с 96 ячейками с плоским дном клетки инкубировали в течение ночи, среду удаляли и заменяли 100 мкл ISIS 5320 в различных концентрациях или контрольным соединением. Через час в каждую ячейку вносили 100 мкл среды, содержащей вирус. Клетки инкубировали еще 1 ч и монослой тщательно про 59 мывали для удаления несвязанного вируса и внеклеточного соединения. Через 48 ч клетки фиксировали и окрашивали X-gal. Затем подсчитывали количество голубых многоядерных клеток с помощью инвертированного микроскопа. Анализ ингибирования межклеточного слияния проводили также в микротитровальных планшетах на 96 ячеек с плоским дном. КлеткиHeLa-CD4-LTRgalactosidase (5 х 103) вносили в каждую ячейку и инкубировали с испытуемым соединением в течение 1 часа перед добавлением 5 х 103 клеток HL2/3 (28). Клетки инкубировали еще 48 ч, фиксировали и окрашивали X-gal. Число голубых синцитиев подсчитывали под микроскопом. Для окрашивания клетки фикси 002423 60 ровали раствором 1% формальдегида и 0,2% глутарового альдегида, окрашивали фиксированные клетки раствором 4 мкМ ферроцианида калия, 4 мкМ феррицианида калия, 2 мкМMgCl2 и 0,4% X-gal в ФСБ. Транс-активацию экспрессии -галактозидазы тестировали также методом ELISA. Клеточные экстракты готовили замораживанием-размораживанием и анализировали активность -галактозидазы в соответствии с рекомендациями поставщика. РезультатыELISA количественно определяли с помощью спектрофотометрии при 450 им на автоматизированном анализаторе микротитровальных планшетов Molecular Devices Vmax. Таблица 39. Анализ слияния клеток по -галактозидазе: Viracea1/SK1 Таблица 40. Анализ слияния клеток по -галактозидазе: Viracea1/SK1 Таблица 41. Анализ слияния клеток по -галактозидазе: Viracea2/SK1 Таблица 42. Анализ слияния клеток по -галактозидазе: Viracea2/SK2