Способ получения клеточной линии млекопитающего, продуцирующей терапевтический белок

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО,ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ БЕЛОК В изобретении предлагаются способы снижения уровней титруемого селектируемого требующегося давления, количества циклов амплификации и времени, необходимого для создания клеточных линий, экспрессирующих белок, путем изменения кодонов нужных открытых рамок считывания. Благодаря использованию адаптации кодона для этой цели, способы по изобретению неизменно обеспечивают достаточные выходы в более быстрых временных рамках, сберегая много недель в конструкторских работах с клеточной линией. Кроме того, способы по изобретению также создают клеточные линии с более низкими концентрациями агента селекции и амплификации,чем ранее достигнутые. Соответственно наблюдаются более низкие уровни маркера селекции и амплификации в итоговых клеточных линиях.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) В настоящем изобретении предлагается способ получения клеточной линии, которая способна секретировать терапевтический белок. Способ включает использование кодон-адаптированных последовательностей генов, что приводит как к сокращенным продолжительностям протокола, так и к снижению концентраций антифолата, требуемого при создании, например, клеточной линии, продуцирующей антитело, посредством системы селекции и амплификации. Клетки млекопитающего, такие как клетки CHO (клетки яичника китайского хомяка), NS0 и PerC6,обычно используют в биофармацевтической промышленности для изготовления биофармацевтических средств. Данные клетки конструируют генетически и затем селектируют так, чтобы обеспечить наблюдаемую экспрессию нужного белка с высоким титром, когда полученные клеточные линии культивируют в биореакторах. В настоящее время существует ряд способов конструирования и затем выбора лучших клеток для данной цели. Часто такие способы включают "амплификацию" для увеличения числа копий интегрированного вектора или векторов экспрессии для улучшения наблюдаемых выходов нужного белка. Такие способы "амплификации" хорошо описаны ранее у Bebbington и Hentschel (DNA Cloning Volume HI (IRLpress, 1987. Авторы объясняют, что ряд селектируемых маркеров (которые часто находятся в форме последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих ферменты, вовлеченные в метаболизм, и являются существенными для выживаемости клетки-хозяина в конкретных условиях среды культивирования) может быть функциональным образом связан с векторами экспрессии, сконструированными для экспрессии нужного белка, так что при селекции в отношении селектируемого маркера, также происходит селекция в отношении экспрессии нужного белка. Однако, так как после такой селекции полученные титры нужного белка обычно недостаточно высокие, селектированные клетки также подвергают режимам "амплификации". Эти режимы обычно включают воздействие на клетки некоторых токсичных лекарственных средств, которые ингибируют селектируемый маркер. Посредством такого ингибирования будут выбраны клетки, которые имеют повышенные уровни экспрессии данного маркера. Часто это также приводит к повышенным уровням экспрессии функциональным образом связанных кассет экспрессии. Такая повышенная экспрессия или "амплификация" обычно имеет место из-за геномных перестановок, что приводит к увеличенному числу копий селектируемого маркера и функциональным образом связанных кассет экспрессии. Часто посредством такой "со-амплификации" титры улучшаются достаточно, чтобы использовать полученные наилучшие клоны для продуцирования подходящих высоких уровней нужного белка или белков. Когда число копий вектора в отдельных клетках, подвергнутых режимам амплификации, исследовали дополнительно, оказалось, что вплоть до наступления "плато" продуцирования белка наблюдаемые уровни продуцирования обычно пропорциональны увеличению числа копий гена (Bebbington and Hentshcel там же). На сегодняшний день идентифицировано множество разных селектируемых маркеров, подходящих для амплификации, и так называемых амплифицируемых маркеров селекции. Каждый идентифицированный маркер также имеет ассоциированный агент "селекции и амплификации", добавляемый к среде для клеточной культуры во время режимов селекции и амплификации. Примеры таких комбинаций селектируемый маркер/агент включают: аденозиндезаминаза/дезоксикоформицин, аспартаттранскарбамилаза/N(фосфоацетил)-L-аспартат, дигидрофолатредуктаза/метотрексат, глутаминсинтетаза/метионинсульфоксимин, металлтионеин-I/тяжелый металл, множественная лекарственная устойчивость/адриамицин (смотри Bebbington and Hentschel там же, Kellems 1991; Current Opinion in Biotechnology 2: стр. 723-729). Кроме того, совсем недавно сообщалось, что антибиотические маркеры селекции, например маркеры, придающие устойчивость к неомицину/G418 и зеоцину, также можно в некоторых случаях использовать для увеличения числа копий и, таким образом, иногда их использовали в качестве маркеров селекции и амплификации в комбинации с подходящим когнатным селектируемым агентом селекции и амплификации (на основе антибиотика) (например Sauttle and Enenkel: Biotech Bioeng 2004 89 pp. 530538, и Kwaks et al: Nature Biotech 2003; 21; pp. 553-558). Несмотря на то, что существует ряд способов выбора наилучших генетически сконструированных клеток для этой цели, два наиболее часто используемых давления селекции представляют собой способы селекции на основе глутаминсинтетазы (GS) и дигидрофолатредуктазы (DHFR).GS-Способ включает связывание функциональным образом кассеты экспрессии глутаминсинтетазы с кассетами или кассетой экспрессии терапевтического белка. Полученные функциональным образом связанные векторы доставляют в клетки, и хромосомную интеграцию векторов селектируют посредством обеднения или удаления глутамина из среды, в которой культивируются клетки. Добавку ингибиторов глутаминсинтетазы, таких как метионинсульфоксимин (MSX) часто вводят в среду культивирования,чтобы обеспечить селекцию в отношении вышеуказанной активности глутаминсинтетазы больших, чем эндогенные уровни в клетках-хозяевах. Альтернативный DHFR-способ селекции включает связывание функциональным образом давления DHFR-селекции с таковым для кассеты или кассет экспрессии терапевтического белка. Функциональным образом связанные векторы доставляют в клетки, и хромосомную интеграцию векторов селектируют посредством удаления или обеднения нуклеозидов (например гипоксантина и тимидина). Обычно для DHFR-способа типичным является использование DHFR-негативных хозяйских штаммов, таких как CHO DG44 или CHO DUX-B11. Также типично использовать агенты се-1 022990 лекции и амплификации, такие как метотрексат (MTX). Добавление или ступенчатое титрование увеличивающихся количеств MSX- или MTX-агентов селекции и амплификации в соответствующих GS- и DHFR-системах селекции часто выполняют с целью усиления экспрессии посредством увеличения числа копий гена. Такие способы могут включать добавление агента селекции и амплификации непосредственно к клеточной культуре. Альтернативно агент можно добавлять к питательной среде перед использованием среды в такой клеточной культуре. Такое добавление или титрование таких агентов непосредственно либо к клеточным культурам, либо к среде,используемой затем для клеточной культуры, обычно называют "амплификацией". Например в GSсистеме уровни MSX могут быть добавлены или увеличены вплоть до и выше уровней концентрации 500 мкМ, в то время как для DHFR-системы уровни MTX-антифолата могут быть добавлены или увеличены вплоть до и выше уровней концентрации 1 мкМ. Используя такие агенты данным образом с последующим периодом культивирования, чтобы обеспечить селекцию клеток, которые растут в новой концентрации агента селекции, (каждая ступень концентрации называется "раундом" амплификации), было показано, что область генома, отвечающая за давление селекции, также может амплифицироваться, тем самым увеличивая число копий селектируемого маркера. Следовательно, когда селектируемый маркер является функциональным образом связанным с кассетами экспрессии терапевтического белка, эти кассеты также могут амплифицироваться. Используя подходящие агенты селекции и амплификации, при использовании GS- и DHFR-систем селекции, выходы нужных белков могут быть существенно улучшены вплоть до достижения "плато продуцирования" (см. Bebbington и Hentschel (выше. В результате клоны, которые растут при такой селекции и амплификации, затем подвергают скринингу на титр/выход,и лучшие клоны выбирают и дополнительно оценивают. При таком титровании и скрининге типично идентифицировать и затем перейти к одному клону для последующего продуцирования нужного белка или белков. Обычно как число "раундов" амплификации, так и концентрацию используемого агента селекции и амплификации, не устанавливают, или не фиксируют в протоколах селекции и амплификации. Вместо этого типично, что режимы селекции и амплификации постепенно становятся более строгими вплоть до точки, в которой приближаются к порогу или к плато продуцирования. Конкретно, при экспрессии антител авторы изобретения и другие исследователи наблюдали, что клоны, приближающиеся к данному плато, продуцируют конечные титры в современных расширенных моделях периодического культивирования на неполноценной среде и в биореакторах для продуцирования в диапазоне от 0,3 г до 1,5 г на литр. Это обычно соответствует клеточным продуктивностям (Qp) в диапазоне 10-100 пг/клетка/сутки в таких условиях периодического культивирования на неполноценной среде. Однако хорошо известно,что, несмотря на то, что Qp (в единицах пг/клетка/сутки) является важным показателем, он не является единственным определяющим фактором продуктивности, так как клоны с самым высоким Qp не всегда продуцируют самые высокие объемные титры. Недавний обзор смотри в Wurm 2004; Nature Biotechnology Vol 22; pp. 1393-1398. Способы селекции и амплификации успешно используют для создания клеточных линий, используемых в производстве для получения нужных белков, используемых в клинических испытаниях. Однако, несмотря на то, что титры, получаемые посредством методологии селекции и амплификации, являются достаточными, такие способы все еще являются нежелательными по ряду причин, включая время,стоимость и безопасность. Например, титрование агентов амплификации и селекции в протоколах "амплификации" клеточной линии приостанавливает селекцию клона и рост колонии, так как для завершения каждого раунда амплификации требуется месяц или более. Во-вторых, агенты селекции и амплификации, такие как метотрексат и метионина сульфоксимин, являются токсичными химическими веществами, которые должны быть удалены, если их следует применять терапевтически. В-третьих, в клетках млекопитающего может иметь место резистентность агента селекции и амплификации, что может приводить к менее строгому давлению селекции и, в результате, к клональной нестабильности и нестабильности выхода продукта. В-четвертых, амплификация иногда может происходить эписомально. Такие эписомы и любые функциональным образом связанные кассеты экспрессии не всегда наследуются одинаково во время деления клетки, что приводит к повышенной изменчивости и нестабильности культуры. Впятых, геномные перестройки, полученные в процессе протоколов амплификации, могут приводить к значительным изменениям в геноме клетки-хозяина, что приводит к вариабельным фенотипам у полученных клонов. В-шестых, побочные продукты агента селекции и амплификации, такие как полиглутаматный метотрексат, могут ингибировать дополнительные функции клеток (например Allegra et al 1985 JBiological Chem 260; 17 pp. 9720-9726). В-седьмых, многие из таких агентов селекции и амплификации также являются потенциально токсичными для операторов, вовлеченных в культивирование клеток и работу биореакторов, если они подвергаются воздействию высоких уровней. В-восьмых, также было обнаружено, что увеличение числа копий интегрированных векторов экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего может приводить к повышенной активности повторно индуцируемого сайленсинга генов(RIGS) при помощи клетки-хозяина, что в конечном счете может привести к снижению уровней экспрессии каждого из интегрированных векторов экспрессии (например, смотри McBurney MW et al Exp Cells В результате было бы очень желательно использовать методологию селекции и амплификации с пониженными уровнями агента селекции и амплификации с уменьшенным количеством раундов амплификации, в то же время по-прежнему достигая такого же конечного выхода терапевтического белка, такую, так чтобы время, требующееся для создания конечной клеточной линии было сокращено, и/или уровень нежелательного токсичного агента, необходимого для создания конечной линии, был снижен или полностью исключен в процессе создания, селекции и культивирования клеточной линии (М. Celinade la Cruz Edmonds et al (Mol Biotechnology 2006 34:179-190. При 64 тройных комбинациях пар оснований кодона и только 20 аминокислотах в течение многих десятилетий было известно о существовании избыточности в генетическом коде. Однако использование смещения кодона для усиления экспрессии не было реализовано до 1980-х. Например, в 1982 Bennetzenand Hall (J Biol Chem 257 pp. 3026-3031) обнаружили видо-специфичные смещения кодонов в сильно экспрессируемых генах как прокариот, так и эукариот. Также они заметили, что такое смещение являлось таксономически дивергентным. Следовательно вскоре стало понятно, что можно модифицировать использование кодонов открытых рамок считывания, чтобы увеличить экспрессию в рекомбинантных системах экспрессии. Например, Kotula и Curtis (Biotechnology NY (1991) 9: 1386-9 достигли значительно улучшенной экспрессии легкой цепи антитела млекопитающего в дрожжах при помощи адаптации кодонов открытой рамки считывания, так чтобы сдвинуть использование кодонов к кодонам, предпочитаемым сильно экспрессируемыми эндогенными дрожжевыми генами. Еще одним очень значительным примером была адаптация кодонов зеленого флуоресцирующего белка для улучшения экспрессии в клетках млекопитающего (Zolotukhin S J Virol (1996) 70: 4646-54 и Yang et al Nucleic Acids Res 1996 24:4592-3). Последние данные позволяют предположить, что путем повышения величины индекса адаптации кодонов (CAI) открытых рамок считывания, кодирующих тяжелые и легкие цепи антител, можно немного улучшить выходы продукции в клетках-хозяевах млекопитающих, когда полученные адаптированные кассеты экспрессии функциональным образом связывают с селектируемыми глутаминсинтетазными маркерами, и когда клетки инкубируют в присутствии MSX-агента селекции и амплификации. Эти данные (представленные на IBC 2005 Cell Line Development and Engineering Conference), позволили предположить, что в то время как средние уровни экспрессии значительно не улучшались, средний положительный клон в группе немного увеличивался (от 37,8 мкг/мл до 51,3 мкг/мл), но только когда открытые рамки считывания как тяжелой, так и легкой цепи были кодон-адаптированными. Совсем недавно М.Celina de la Cruz Edmonds et al (выше) также признали необходимость снизить уровни агента селекции и амплификации при создании сконструированных генно-инженерным путем клеточных линий, экспрессирующих нужные белки, с помощью режимов селекции и амплификации. Они продемонстрировали, что посредством модификации плотности посева трансфицированных клеток можно снизить уровни используемого MSX и уменьшить число недель, требующихся для создания и поддержания генетически сконструированной клеточной линии, экспрессирующей аналогичные или более высокие уровни нужного белка. В последней опубликованной работе были исследованы подходы с оптимизацией кодона в комбинации с использованием селектируемого маркера глутаминсинтетазы. Например, в работе, представленной Kawley et al (Molecular Biotechnology 2006 Vol 34; pp. 151-156) оценивается воздействие адаптации кодонов на последующие генерированные уровни экспрессии, однако, представленные результаты предполагают только минорные улучшения в достигаемых уровнях экспрессии. Совсем недавно Carton et al (Protein Expression and Purification 55 (2007) pp. 279-286) также исследовали влияние оптимизации кодона. Эта работа включает частичную кодоновую оптимизацию открытых рамок считывания тяжелой и легкой цепи антител посредством различных подходов. Такие модифицированные кодирующие последовательности затем экспрессировались в миеломных клетках в минигенных форматах (то есть содержащих интроны) в кассетах экспрессии, функциональным образом связанных с gpt-селектируемым маркером. Амплификационные подходы не обсуждались. В данной области техники существует необходимость снизить уровни агентов селекции и амплификации, требующихся при использовании систем экспрессии, функциональным образом связанных с аплифицируемыми селекционными маркерами. Изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предлагаются способы снижения уровней требуемого титруемого селектируемого давления, количества циклов амплификации, и времени, необходимого для создания клеточных линий, экспрессирующих белок, путем изменения кодонов нужных открытых рамок считывания. Используя для этой цели адаптацию кодонов, способы по изобретению неизменно обеспечивают достаточные выходы за более короткие сроки, экономя много недель во время опытных работ с клеточными линиями. Кроме того посредством способов по изобретению также создаются клеточные линии с более низкими концентрациями агента селекции и амплификации, чем достигались ранее. Соответственно наблюдаются более низкие уровни маркера селекции и амплификации в конечных клеточных линиях. В настоящем изобретении предложены способы получения клеточной линии, продуцирующей терапевтический белок, включающие стадии: а) получения первой полинуклеотидной последовательности, которая кодирует указанный терапевтический белок,б) изменения первой полинуклеотидной последовательности с получением второй полинуклеотидной последовательности, где индекс адаптации кодонов второй полинуклеотидной последовательности больше индекса адаптации кодонов первой полинуклеотидной последовательности, и первый полинуклеотид и второй полинуклеотид кодируют один и тот же терапевтический белок,в) трансформация по меньшей мере одной клетки с помощью второй полинуклеотидной последовательности со стадии (б) и третьей полинуклеотидной последовательности, которая кодирует маркер селекции, способный обеспечивать амплификацию второй полинуклеотидной последовательности в указанной клетке,г) культивирование указанной по меньшей мере одной клетки со стадии (в) для создания первой клеточной линии, содержащей множество клеток, в среде, которая содержит агент селекции в концентрации, подавляющей рост клеток указанной клеточной линии, экспрессирующих недостаточные уровни маркера селекции, кодируемого третьим полинуклеотидом со стадии (в), так, что плато продуцирования белка, кодируемого вторым полинуклеотидом, достигается посредством меньшего количества раундов амплификации и/или достигается при более низкой концентрации агента селекции, чем было бы необходимо для достижения аналогичного плато продуцирования указанного белка, продуцированного в клеточной линии, трансформированной первым полинуклеотидом. Во всех сравнительных способах, которые описаны в данном описании изобретения, если не указано иное, все остальные параметры, такие как протоколы амплификации или концентрации агентов селекции, остаются неизменными. В одном воплощении настоящего изобретения первую клеточную линию культивируют в биореакторах и продуцированный терапевтический белок очищают. В одном воплощении настоящего изобретения индекс адаптации кодонов второй полинуклеотидной последовательности составляет более 0,9, в другом воплощении индекс адаптации кодонов второй полинуклеотидной последовательности составляет более 0,91, в еще одном воплощении индекс адаптации кодонов второй полинуклеотидной последовательности составляет более 0,92, в еще одном дополнительном воплощении индекс адаптации кодонов второй полинуклеотидной последовательности составляет более 0,95. В другом воплощении настоящего изобретения уровень селективного агента, необходимый для достижения арифметической эквивалентности выхода продукции терапевтического белка, снижен до менее чем 50% по сравнению с количеством селективного агента, используемого для такого же способа с применением первой полинуклеотидной последовательности. В еще одном воплощении уровень селективного агента снижен до менее чем 25% по сравнению с количеством селективного агента, используемого для такого же способа с применением первой полинуклеотидной последовательности, в еще одном дополнительном воплощении уровень селективного агента снижен до менее чем 5% по сравнению с количеством селективного агента, используемого для такого же способа с применением первой полинуклеотидной последовательности, в еще одном дополнительном воплощении уровень селективного агента снижен до менее чем 3% по сравнению с количеством селективного агента, используемого для такого же способа с применением первой полинуклеотидной последовательности. В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ создания клеточной линии, продуцирующей терапевтический белок, включающий стадии: а) получения первой полинуклеотидной последовательности, которая кодирует терапевтический белок, и которая имеет значение индекса адаптации кодонов менее 0,9; б) получения второй полинуклеотидной последовательности, которая кодирует терапевтический белок, где индекс адаптации кодонов полинуклеотидной последовательности составляет более 0,9; в) трансформация клеточной линии с помощью второй полинуклеотидной последовательности, которая кодирует терапевтический белок, и третьей полинуклеотидной последовательности, которая кодирует маркер селекции, способный обеспечить амплификацию второго полинуклеотида; г) культивирование указанной по меньшей мере одной клетки со стадии (в) для создания первой клеточной линии, содержащей множество клеток, в среде, которая содержит агент селекции в концентрации, подавляющей рост клеток в указанной клеточной линии, которая экспрессирует недостаточные уровни маркера селекции, кодируемого третьим полинуклеотидом со стадии (с), такую что плато продуцирования белка, кодируемого вторым полинуклеотидом, достигается с помощью меньшего количества раундов амплификации и/или достигается при более низкой концентрации агента селекции, чем было бы необходимо для достижения аналогичного плато продуцирования указанного белка, продуцированного в клеточной линии, трансформированной первым полину клеотидом. В одном воплощении настоящего изобретения клеточная линия, подлежащая трансформации, является метаболически дефектной вследствие повреждения или ингибирования эндогенного клеточного фермента. В дополнительном воплощении настоящего изобретения клеточная линия, подлежащая трансформации, является дефектной в отношении пути синтеза нуклеозида. В одном воплощении настоящего изобретения терапевтический белок представляет собой антитело,его производное или антигенсвязывающий домен. В одном воплощении настоящего изобретения терапевтический белок представляет собой моноклональное антитело. В одном воплощении настоящего изобретения маркер селекции представляет собой полинуклеотид,кодирующий дигидрофолатредуктазу (DHFR), и агент селекции представляет собой антифолат. В дополнительном воплощении антифолат представляет собой метотрексат. В еще одном воплощении настоящего изобретения маркера селекции представляет собой полинуклеотид, кодирующий глутаминсинтетазу, и агент селекции представляет собой метионина сульфоксимин. В одном воплощении настоящего изобретения требуется только один раунд амплификации для достижения плато продуцирования белка. В одном воплощении настоящего изобретения конечный выход терапевтического белка составляет выше 0,3 г/л в партии, выращиваемой на неполноценной среде, в еще одном воплощении конечный выход составляет выше 0,5 г/л в партии, выращиваемой на неполноценной среде, в еще одном воплощении конечный выход составляет выше 0,8 г/л в партии, выращиваемой на неполноценной среде. В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация используемого MTX составляет менее 50 нМ, или менее 25 нМ, или менее 10 нМ. В дополнительном воплощении настоящего изобретения концентрация используемого MTX составляет 5 нМ. В еще одном воплощении изобретения только одна стадия амплификации и, следовательно, только одна концентрация агента селекции и амплификации в среде культивирования клеток требуется для достижения плато продуцирования белка в клетках, которые селектируются в указанной среде культивирования. В одном воплощении настоящего изобретения предложено антитело, полученное способом по изобретению. В дополнительном воплощении предложено антитело, полученное данным способом, где полученное антитело содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и имеет менее или точно 5% негликозилированной тяжелой цепи. В дополнительном воплощении тяжелая цепь антитела гликозилирована на 95%, или гликозилирована на 96%, или гликозилирована на 97%, или гликозилирована на 98%, или гликозилирована на 99%. В еще одном дополнительном воплощении антитело гликозилировано на 100%. В одном воплощении настоящего изобретения высокогликозилированное антитело представляет собой моноклональное антитело. В дополнительном воплощении высокогликозилированное антитело представляет собой антиамилоидное антитело. В еще одном воплощении антитело имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID 18 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO.19. В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, описанный в данном описании изобретения, где этот фрагмент представляет собой Fab,Fab', F(ab')2, Fv, биспецифическое антитело, двухвалентное антитело, трехвалентное антитело, тетравалентное антитело, миниантитело, выделенный вариабельный участок тяжелой цепи или выделенный вариабельный участок легкой цепи, белки сыворотки (например факторы роста, цитокины, альбумины и так далее) или их комбинаторное слияние. В еще одном воплощении изобретения предложена стабильно трансформированная клетка-хозяин,содержащая вектор, содержащий одну или более чем одну кассету экспрессии, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в данном описании изобретения. Например, такие клетки-хозяева могут содержать первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий тяжелую цепь. Альтернативно такие кассеты экспрессии могут быть скомбинированы перед доставкой. В еще одном воплощении настоящего изобретения предложена клетка-хозяин по изобретению,описанная здесь, где клетка является эукариотической, например является клеткой млекопитающего. Примеры таких клеточных линий включают Chinese Hamster Ovary, BHK, HEK-293, NSO или PerC6. (последние обзоры смотри в Wurm 2004: Nature Biotechnology 22; 11 стр. 1393-1398). Такие клетки-хозяева также могут содержать полезные генотипические и/или фенотипические модификации, например хозяйский штамм CHO-DG44 имеет копии со своим заблокированным dhfr-геном (дигидрофолатредуктаза), в то время как другие хозяева могли иметь заблокированный ген глутаминсинтетазы. Альтернативные модификации могут быть в комплексе ферментов, вовлеченных в гликозилирование белка (например Yamane-Ohnuki et al, Biotech Bioeng 2004 87: стр. 614-622, Kanda et al, Journal of Biotechnology, 2007 130: стр. 300-310, Imai-Nishiya et al BMC Biotechnol, 2007 7:84). Другие могут иметь полезные генотипические и/или фенотипические модификации апоптоза хозяина, путей экспрессии и выживания (например Tey etal Biotechnol Bioeng 2000 68: 31-43, Yallop et al Modern Biopharmaceuticals 2005 Chapter 3 pp. 779-807,Nivitchanyang et al Biotechnol Bioeng 2007 98:825-41, Figueroa et al Biotechnol Bioeng 2007 97:87-92). Эти и другие модификации одного хозяина или в комбинации могут быть созданы стандартными способами,такими как сверхэкспрессия нехозяйских или хозяйских генов, приемы "нокаута гена", приемы сайленсинга гена (например siRNA (малая интерферирующая РНК, или эволюция и селекция субштаммов с нужными фенотипами. Такие способы являются традиционными в данной области техники. В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен способ продуцирования терапевтического белка по изобретению, описанному в данном документе, включающий стадию культивирования клетки-хозяина в культуральной среде, например в культуральной среде, не содержащей сыворотку. В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен способ по изобретению, описанному здесь, где указанный терапевтический белок дополнительно очищают до по меньшей мере 95% или более (например 98% или более) в отношении указанного антитела, включающий культуральную среду, не содержащую сыворотки. В одном воплощении изобретения предложены векторы экспрессии млекопитающего, содержащие открытые рамки считывания, которые имеют значения CAI более 0,9 и которые кодируют антитела, полипептиды, родственные антителам, или их производные или слияния. В еще одном воплощении предложена первая клеточная линия, трансформированная второй полинуклеотидной последовательностью, имеющей индекс адаптации кодонов выше, чем у первой полинуклеотидной последовательности, где первый полинуклеотид и второй полинуклеотид кодируют один и тот же терапевтический белок, и дополнительно содержащая третью полинуклеотидную последовательность, которая кодирует маркер селекции, способный обеспечить амплификацию первой полинуклеотидной последовательности, где указанная первая клеточная линия продуцирует более высокий выход указанного терапевтического белка по сравнению со второй указанной клеточной линией, трансформированной указанным первым полинуклеотидом, кодирующим указанный терапевтический белок, при выращивании в селектирующей среде. В дополнительном воплощении предложена вторая клеточная линия, трансформированная второй полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует терапевтический белок и имеет индекс адаптации кодонов более 0,9, и дополнительно содержащая третью полинуклеотидную последовательность,которая кодирует маркер селекции, способный обеспечивать амплификацию второй полинуклеотидной последовательности, где указанная вторая клеточная линия продуцирует более высокий выход указанного терапевтического белка по сравнению с первой указанной клеточной линией, трансформированной первым полинуклеотидом, кодирующим указанный терапевтический белок, где указанный первый полинуклеотид имеет индекс адаптации кодонов менее 0,9, при выращивании в селектирующей среде. В одном воплощении настоящего изобретения значение CAI более 0,9 рассчитывают, используя систему EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) для количественной оценки CAI, как описано в табл. 6. В еще одном воплощении настоящего изобретения предложена клеточная линия, содержащая вектор или кассету экспрессии согласно предшествующим воплощениям, как описано в данном описании изобретения. В еще одном дополнительном воплощении предложена клеточная линия или ее потомство, получаемое способами по настоящему изобретению. В еще одном воплощении настоящего изобретения предложены клетки млекопитающего с геномами, содержащими интегрированные или эписомально поддерживаемые открытые рамки считывания,имеющие значения CAI более 0,9 (полученные с использованием EMBOSS таблицы частоты использования кодона Е. human. cut), которые кодируют антитела, полипептиды, родственные антителам, или их производные. По всему настоящему описанию изобретения и сопровождающей формуле изобретения термин "содержащий" и "содержит" включает "состоящий из" и "состоит из". То есть, "содержащий" и "содержит",как предполагается, означают вероятное включение других элементов или целых чисел, не указанных конкретно, где позволяет контекст. По всему настоящему описанию изобретения и сопровождающей формуле изобретения термин"плато продуцирования" означает уровень достигаемой экспрессии в продолжительно выращиваемых на неполноценной среде культурах клеток, когда в дополнительных раундах амплификации обычно получают менее чем 2-кратное увеличение относительно родительского амплифицированного клона. Если клоны спроектированы специально для продуцирования антител, клоны, продуцирующие от 0,3 г до 1,5 г на литр в стандартных продолжительно выращиваемых на неполноценной среде продуцирующих культурах, обычно можно считать достигающими данного плато продуцирования, при использовании проточных режимов продолжительного культивирования на неполноценной среде и составов среды. Одноклеточное субклонирование конечных клонов, достигающих плато продуцирования, может быть выполнено многими стандартными способами, включая проточную сортировку (например размещая клетку на лунку в 96-луночном планшете), отбор колоний на мягком агаре, или клонирование методом серийных разведений. Чтобы обеспечить рост одной клетки в лунках-реципиентах, иногда следует также использовать культуры с кондиционированной средой или временным питателем для поддержания роста иным образом размещенной единственной клетки. Если требуются живые питающие со-культуры,они легко могут содержать родительские клетки-хозяева без интегрированных селектируемых векторов,так как такие хозяйские клетки затем можно выбрать как только размещенный одноклеточный клон начинает успешно делиться. Термин "открытая рамка считывания" (ORF) при использовании в данном описании изобретения относится к нуклеиновокислотной кодирующей последовательности, кодирующей цепь или цепи нужного полипептида. Кодоны, содержащиеся в рамках таких ORF кодирующих последовательностей, могут быть смежными или альтернативно они могут содержать интроны. При включении такие интроны или вставочные последовательности затем обычно удаляют посредством реакций сплайсинга в клеткехозяине до образования конечной смежной открытой рамки считывания в зрелой мРНК.(например гетерологично экспрессируемого полипептида) в растворе (например в культуральной жидкости или в смеси для лизиса клеток или в буфере) и обычно выражается в виде мг/л или г/л. Увеличение выхода может относиться к абсолютному или относительному увеличению концентрации продукта, произведенного в двух определенных совокупностях условий. Термин "функциональным образом связанный" относится к использованию маркеров селекции и амплификации, применяемых для селекции клеток-хозяев, содержащих кассеты экспрессии, экспрессирующие нужные белковые продукты. Это может быть достигнуто клонированием маркера селекции и амплификации в той же плазмиде или векторе, которая содержит кассету экспрессии, экспрессирующую нужный белок, или, альтернативно, он может быть доставлен в клетку на отдельной плазмиде или векторе. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 - схематическое изображение векторов из основе RSV промотора, используемых в проектах 2, 3, 4, 5, 6(а), 6(б) и 7(а). Для оценок на основе промотора EF-1-альфа (из проектов 6 и 7) промотор RSV заменяли на промотор, производный от человеческого EF-1-альфа плюс первый интрон (смотри Kim DWGene 1990 91: 217-23). Его получали посредством PCR (полимеразной цепной реакции) из геномной ДНК человека. Данный промотор EF-1-альфа затем клонировали в этих вектора вместо промотора на основеRSV. Фиг. 2 - неадаптированная тяжелая цепь из проекта 5 со значением CAI 0,809 и использованная в проекте 5(а) SEQ ID NO: 10. Фиг. 3 - неадаптированная легкая цепь из проекта 5 со значением CAI 0,761 и использованная в проекте 5(а) SEQ ID NO: 11 ю Фиг. 4 - ORF тяжелой цепи из проекта 5(б) с увеличенным значением CAI (0,847). См. табл. 5. Смотри SEQ ID NO: 12. Фиг. 5 - ORF легкой цепи из проекта 5(б) с увеличенным значением CAI (0,833). См. табл. 5. Смотри SEQ ID NO: 13. Фиг. 6 - ORF тяжелой цепи из проекта 5 с увеличенным значением CAI (0,872). Данную последовательность использовали в проекте антитела 5(в). Смотри SEQ ID NO: 14. Фиг. 7 - ORF легкой цепи из проекта 5 с увеличенным значением CAI (0,894). Данную последовательность использовали в проекте антитела 5(в). Смотри SEQ ID NO: 15. Фиг. 8 - ORF тяжелой цепи из проекта 5 с увеличенным значением CAI (0,982). Данную последовательность использовали в проекте антитела 5(г). Смотри также SEQ ID 16. Фиг. 9 - ORF легкой цепи из проекта 5 с увеличенным значением CAI (0,976). Данную последовательность использовали в проекте антитела 5(г). Смотри также SEQ ID 17. Фиг. 10 - РНК тяжелой цепи и легкой цепи и уровни белка для проекта антитела 5. Фиг. 11 - подробная методология адаптации кодонов. Фиг. 12 - типичные NGHC данные продукта, полученные в ходе селекции конечного клона согласно проекту 5. Фиг. 13 - типичный титр, полученный от 097-7 (проект 5(г), 5 нМ MTX выбранного клона CAI HC 0,982, LC 0,976) с помощью приблизительно 3-месячных дополнительных опытных работ после конечной амплификациии и селекции конечной клеточной линии. Фиг. 14 - относительные уровни копии гена DHFR, и белка, и копии гена Neo, наблюдаемые в сконструированных клетках в различных проектах. Подробное описание изобретения Частоту использования кодонов в генах, кодирующих терапевтические полипептиды, продуцируемые согласно настоящему изобретению, измеряют и определяют с помощью индекса адаптации кодонов(CAI). Адаптация кодонов представляет собой адаптацию кодонов открытой рамки считывания к синонимичным кодонам, предпочтительным в генах человека/млекопитающего, при избегании введения нежелательных вторичных функций последовательностей, которые препятствуют экспрессию полученных открытых рамок считывания. Авторы изобретения обнаружили, что предпочтительные человеческие кодоны также являются очень подходящими, даже если последующая экспрессия планируется в клетках млекопитающего, не являющегося человеком (например клетки, полученные от хомяка). Однако, если наиболее предпочтительный кодон для любой данной аминокислоты различен у данного вида млекопитающего, тогда его также можно использовать вместо предпочтительного человеческого. "ЗначениеCAI", полученное для каждой открытой рамки считывания, указывает степень, в которой открытая рамка считывания адаптирована для использования синонимичных кодонов наиболее предпочтительных в ге-7 022990 нах человека/млекопитающего. В контексте настоящего изобретения значение CAI равное 1, означает,что используется наиболее оптимальный кодон для каждой аминокислоты в каждом положении кодона. Для оптимальных результатов в способах по настоящему изобретению гены, кодирующие терапевтический белок, имеют CAI достаточно близкий к 1, такой что нужный уровень экспрессии терапевтического белка достигается со значительно меньшим количеством агента селекции и амплификации и/или за более короткое время относительно наблюдаемого при экспрессии имеющейся в природе исходной последовательности, например CAI составляет по меньшей мере 0,9 или по меньшей мере 0,95, или по меньшей мере 0,975. Однако нет необходимости замещать все кодоны наиболее предпочтительными кодонами, или замещать все менее предпочтительные на более предпочтительные кодоны. Единственное требование состоит в том, чтобы полученная последовательность имела неестественно высокое значение CAI и не содержала элементов, нарушающих экспрессию. Имеющееся в продаже программное обеспечение, такое как Leto 1.0 (Entelechon, Regensburg, Germany), может спроектировать последовательность с подходящим высоким значением CAI. Для дополнительного вспомогательного руководства в проектировании кодонадаптированных последовательностей для использования в данном изобретении были проанализированы человеческие транскрипционные продукты базы данных 24044 RefSEQ (NMприсвоенные входящие номера), полученные от генома NCBI номер сборки 36. Диапазон значений CAI был рассчитан и составлял от 0,593 до 0,894 со средним значением 0,720. Самое высокое значение (0,894) для известного и экспрессированного гена (а не теоретического) в этой базе данных определяли при помощи кератинассоциированного белка 5-8 (KRTAP5-8; NM021046), и при помощи поздней ороговевшей оболочки 1 А(LCE1 A; NM178348). Кроме того база данных 21182 IgG кДНК человека выявила, что значения IgG меняются от 0,576 до 0,878 со средним значением 0,766. Для вспомогательного руководства специалистам в данной области техники, последовательности, подходящие для использования в данном изобретении, могут иметь значения CAI больше и выходящие за пределы самых высоких имеющихся в природе значений для человеческих генов, таких как поздний ген ороговения оболочки 1 А (LCE1A; NM178348). Более предпочтительно, следует использовать значения CAI более 0,9. Было обнаружено, что если адаптацию кодона выполняли вдоль более короткой последовательности (например только вариабельный участок), тогда наблюдался повышенный уровень высокопродуктивных клонов, однако, если адаптацию кодона выполняют по всей целой открытой рамке считывания,тогда охват (то есть количество) полученных высокопродуктивных клонов увеличивается еще больше(см. табл. 5). Из-за последовательности предпочтительных кодонов типичные подходы адаптации обычно по умолчанию также избегают ввода высокобалльной ARE (AU Rich Elements смотри Akashi et al Blood 1994; Vol 83 pp. 3182-3187 нестабильных последовательностей РНК. Однако иногда после адаптации кодонов имеет место требование удалить введенные элементы последовательности, нарушающей экспрессию. Они включают, но не ограничены ими:(1) функционирующие сайты сплайсинга,(2) области симметрии второго порядка (например прямые, обратные или палиндромные последовательности), которые значительно снижают уровни экспрессии и/или увеличивают скорости рекомбинации между последовательностями,(3) функционирующие нестабильные последовательности. В редких случаях, когда такие ненужные нарушающие элементы образуются во время адаптации,рекомендуется использовать менее предпочтительный, но не наименее предпочтительный человеческий кодон (если выбор не ограничен) для разрушения локальной последовательности для инактивирования функции. Небольшие отклонения от максимальных значений не будут значительно влиять на использование полученных открытых рамок считывания в данном изобретении. Признано также, что если небольшие области открытой рамки считывания остаются неадаптированными (например с сохранением полезных сайтов рестрикции), тогда они не будут значительно воздействовать на общее значение CAI. Если открытая рамка считывания кодирует слитый, гибридный или химерный белок, рекомендуется значение CAI увеличивать аналогично описанному выше. Снова такую адаптацию в отношении синонимичных кодонов, предпочитаемых клеткой-хозяином для экспрессии высокоэкспрессирующих эндогенных генов, следует выполнять для всех без исключения компонентов гена или родственной cDNA слитых или сконструированных открытых рамок считывания. Для полностью синтетических кодирующих последовательностей, присутствующих в белке (то есть последовательности, для которой не существует предшествующей последовательности), рекомендуется вводить неестественно высокие значения CAI человеческого гена точно таким же образом. В данном изобретении следует использовать открытые рамки считывания со значениями CAI выше и за пределами позднего человеческого гена ороговения оболочки 1 А. Настоящее изобретение, описанное здесь, первым описывает способ снижения уровней требующегося агента селекции и амплификации, требующегося времени и количества циклов амплификации, требующихся для создания генетически сконструированных клеточных линий, экспрессирующих нужные уровни белка, посредством адаптации кодонов открытых рамок считывания, кодирующих белок. Путем использования адаптации кодонов для данной цели достаточные выходы наблюдаются за более короткие временные рамки, и тем самым сберегается много недель в опытных работах с клеточной линией. Кроме того авторами изобретения также получены эквивалентные или улучшенные клеточные линии путем использования более низких концентраций агента селекции и амплификации, чем ими когда-либо ранее были достигнуты. Действительно, вероятно, что когда такие улучшения, как описано в данном описании изобретения, комбинируют со стандартной культурой клеток и улучшениями протокола посева, как описано у Celina de la Cruz Edmonds et al (выше), будут наблюдаться дополнительные снижения уровней агента селекции и амплификации, и дополнительное уменьшение времени, необходимого для получения эквивалентных или улучшенных выходов от генетически сконструированных клеточных линий. Настоящее изобретение пригодно для использования, когда терапевтический белок представляет собой гликопротеин. В то время как в предшествующей работе раскрыт тот факт, что можно контролировать гликозилирование белкового продукта посредством модификации продолжительности способа,температуры, pH, осмотического давления, компонентов среды и добавок и так далее (например смотриWO2002076578 и ссылки в ней), авторами изобретения было обнаружено, что адаптации кодонов открытых рамок считывания, кодирующих терапевтические полипептидные последовательности (в случае антительных терапевтических полипептидов), способна уменьшать уровни неполного гликозилирования и уровни пониженной занятости сайта независимо от подтипа клеток CHO, режимов селекции и амплификации, или среды культивирования. Данное неожиданное наблюдение впервые продемонстрировало, что можно воздействовать на профиль гликозилирования белка путем адаптации кодонов открытой рамки считывания. Таким образом,используя подходы кодонной адаптации, как описано в данном описании изобретения, можно обеспечить надежную технологию изготовления, которая зависит от последовательности гена, а не от условий,в которых выращивают клетку-хозяин. В свою очередь это обеспечивает более широкую возможность улучшения условий культивирования и режимов питания посредством циклов разработки традиционной среды и питания без чрезмерного опасения относительно полученного воздействия на гликопрофиль продукта. Степень адаптации кодонов можно измерить, используя способ, впервые описанный у Sharp and Li(Nucleic Acid Res 1987 15:1281-95). Sharp and Li предложили величину индекса адаптации кодонов (CAI),которую по существу получают из статистики кодонной предпочтительности, но нормализуют для каждой аминокислоты так, чтобы исключить влияния изменений аминокислотного состава в разных генах. Такой показатель CAI легко доступен (например посредством EMBOSS The European Molecular BiologyOpen Software Suite (смотри Rice et al 2000: Trends in Genetics 16; стр. 276-277. Для оценки открытых рамок считывания, предназначенных для использования в данном изобретении, сначала следует использовать подходящую справочную базу данных. Сначала следует оценить клетку-хозяина для применения, затем следует идентифицировать справочную таблицу использования соответствующих синонимичных кодонов (RSCU) для экспрессируемых генов в указанной клеткехозяине. Обычно база данных RSCU человека пригодна для сравнения при экспрессии, приводящей к открытой рамке считывания в любом типе клеток млекопитающего. Одним примером базы данных является база данных, предоставленная EMBOSS, в которой используется в качестве сравнения таблицу использования кодона Ehum.cut для определения предпочтений использования кодонов в клетках человека. Альтернативной справочной таблицей использования кодонов является таблица, описанная у Massaer etal (выше), в которой небольшое число высокоэкспрессируемых генов человека использованы для определения кодонной предпочтительности. Хотя эти две справочные таблицы явно сходятся в отношении наиболее предпочтительного кодона, для одной аминокислоты (аргинин) существует одно заметное расхождение. Следовательно, при конструировании открытых рамок считывания для использования в данном изобретении логично совместно рассматривать одни и те же таблицы использования кодонов для (1) определения наиболее предпочтительных кодонов для включения в открытую рамку считывания, и затем(2) последующего определения значения CAI открытой рамки считывания для гарантии того, что это значение является достаточно высоким, чтобы подходить для использования в данном изобретении. Например, если базу данных Massaer et al обычно используют для конструирования открытых рамок считывания для экспрессии в клетках человека и млекопитающего и, следовательно, кодон CGC считается наиболее предпочтительным для кодирования аргинина, тогда логично также использовать эти предпочтительные справочные данные при определении значения CAI полученных созданных открытых рамок считывания. Методика, которая описана в данном описании изобретения, особенно подходит при экспрессии антител или их производных и особенно эффективна при комбинировании с кассетами экспрессии, стимулируемыми промотором и элементами экспрессии, произведенными от альфа-гена EF-1. Кассеты экспрессии, стимулируемые другими промотором и элементами экспрессии (например произведенными отRSV LTR) также являются подходящими. В данной области техники хорошо известно, что элементы кассеты экспрессии (например промоторы, энхансеры, участки прикрепления к матриксу (MARS), изоляторы, нетранслируемые участки, вставочные последовательности, такие как интроны, и сайты полиадени-9 022990 лирования) можно объединять в множество разных комбинаций для создания подходящих кассет экспрессии, чтобы стимулировать экспрессию нужных открытых рамок считывания, и чтобы стимулировать экспрессии маркеров селекции и амплификации, используемых в данном изобретении. Как только клоны в протоколе развития любой данной клеточной линии приближаются к плато продуцирования при расширенном периодическом продуцировании на неполноценной среде, наблюдалось, что дополнительные лабораторные исследования лучше сосредоточить на таких методиках, как (1) одноклеточное клонирование лучших клонов, (2) разработка периодического процесса с подпиткой, (3) разработки процесса перфузионного типа, (4) заказ набора сред и питания и режимов и (5) дополнительная адаптация культуры. Например, как только достигается порог продуцирования для отдельного клона, его производные одноклеточные субклоны обычно являются более стабильными и высокопродуктивными, чем размноженные дочерние клоны, образованные посредством дополнительных условий селекции и амплификации в еще более строгих уровнях в отношении агента селекции и амплификации. Действительно, усиление селекции и амплификации конечных клонов, уже приближающихся к порогу продуцирования, часто приводит к нестабильности, и после начальных улучшений часто может в итоге приводить к аналогичным или даже более низким титрам в периодической культуре при продолжительном продуцировании на неполноценной среде, чем у амплифицированного родительского клона. Таким образом, хотя и признано, что в некоторые случаях редкий и неожиданный эпизод дополнительной амплификации может в некоторых случаях увеличивать титры более чем в 2 раза, как только порог экспрессии достигнут, существуют более надежные способы, которые могут быть использованы вместо этого для дальнейшего увеличения стабильных титров. Следующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение. Примеры Раньше методики DHFR-селекции использовались в более чем пятнадцати проектах антител. Во всех случаях при использовании данной методики были необходимы по меньшей мере два раунда амплификации и минимум 50 нМ MTX в качестве давления селекции и поддержания для получения клеточных линий с подходящими выходами. Типичные результаты, полученные в течение данного периода времени с помощью данной методики, представлены антителами 1, 2, 3 и 4 в табл. 1. Проект антитела 1 выполняли, используя стандартные методики, доступные в то время. Проекты антител 2-9 выполняли в соответствии с веществами и способами ниже. Изучали воздействие улучшения индекса адаптации кодонов (CAI) открытых рамок считывания. Первым для исследования было выбрано антитело 5. Данное исследование включало экспрессирование антительного продукта с открытых рамок считывания тяжелой и легкой цепи антитела дикого типа(то есть с неадаптированным кодоном) (зарегистрировано как антитело 5(а, открытых рамок считывания тяжелой и легкой цепи с широкой адаптацией кодонов вариабельного домена, кодирующего только последовательности (зарегистрировано как антитело 5(б) или 5(в или адаптацией кодонов полных открытых рамок считывания тяжелой и легкой цепи (зарегистрировано как антитело 5(г. Результаты данного исследования представлены в табл. 1-5. Пример 1. Вещества и способы. 1.1. Клонирование ДНК и конструирование вектора. Все клонирование ДНК выполняли с помощью хорошо известного фермента рестрикции, на основе субклонирования и методик сборки PCR (смотри Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition:Sambrook et al (CSH Laboratory Press. Показаны схематические представления векторов экспрессии и селекции (см. фиг. 1). Показанные векторы служат примером промотора RSV, однако были использованы разные промоторы в соответствии с табл. 1. Во всех других аспектах векторы оставались неизмененными. 1.2. Адаптация кодонов. В проектах, где исследовали CAI адаптированных ORF-последовательностей, их получали, используя нужные перекрывающиеся олигонуклеотиды, скомбинированные с помощью стандартного слияния в полимеразной цепной реакции (PCR) перед клонированием и подтверждением последовательности; все согласно стандартной методике (смотри Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition: Sambrooket al (CSH Laboratory Press) и Stemmer et al., Gene. 164(1): 49-53, 1995). Последовательности адаптированных участков ORF проекта 5(б) и 5(в) конструировали, используя предпочтительность кодонного использования согласно Massaer для клеток человека/млекопитающего (см. фиг. 11). Для проекта антитела 5(г), кодон-адаптированные последовательности ORF были сконструированы и созданы с помощью контрактного сервисного провайдера 1. Полученные ORF имели значение CAI более 0,9. Кодон-адаптированные последовательности, кодирующие вариабельные домены антитела для проекта антитела 6 конструировали и создавали с помощью контрактного сервисного провайдера 2. Данные вариабельные домены затем объединяли с адаптирующими кодон-адаптированными константными доменами, кодирующими последовательности проекта 5(г), с помощью стандартного субклонирования с помощью уникальных клонирующих сайтов, расположенных между константными и вариабельными участками (используя Spel для тяжелой цепи, BsiWI для легкой цепи) (проекты 6(б) и 6(г. Каждая из полученных ORF, кодирующих полноразмерное антитело для проекта 6(б) и 6(г) имела значение CAI более 0,9. Целые кодон-адаптированные ORF антитела проекта 7 конструировали и создавали с помощью контрактного сервисного провайдера 2, и полученные ORF имели значение CAI более 0,9. Для ORF проектов 8 и 9 использовали программный алгоритм Leto для конструирования последовательности вариабельного домена. Внутрирамочные полноразмерные открытые рамки считывания затем были образованы путем комбинирования данных последовательностей с подходящими последовательностями, кодирующими константный домен (снова с использованием сайтов Spel и BsiWI, как указано выше). Для антитела 8 - последовательности, кодирующие вариабельные домены, конденсировали с соответствующим константным доменом, кодирующим последовательности проекта 7. Для антитела 9 - вариабельный домен, кодирующий создаваемые последовательности, сливали с соответствующим константным доменом,кодирующим последовательности проекта 6 (г). Каждая из еще раз полученных ORF, кодирующих целые тяжелые и легкие цепи для проектов 8 и 9, имела значения CAI более 0,9. На фиг. 11(А). Последовательность легкой цепи, кодирующая CDR1 антитела проекта 5 показана в виде последовательности типичного образца. Показана аминокислотная последовательность данногоCDR. Пример потенциальной auuua нестабильности AU-обогащенного элемента (ARE) показывают заключенным в рамку и выделенным жирным шрифтом (см. также Akashi et al Blood 83: стр. 3182-3187). Кодон аргинина также выделен. Во-первых, способ усиленной адаптации кодонов приводил к увеличенному значению CAI вдоль всей ORF. Данное антитело использовали в проекте 5(б). Как показано, данный способ включал наиболее предпочтительные кодоны (например для Tyr), но не во всех случаях (например Leu). Во-вторых, для максимального значения CAI использовались наиболее предпочтительные кодоны согласно Massaer et al. Данную последовательность использовали в проекте антитела 5(в). В предложенной конечной последовательности использовались наиболее предпочтительные кодоны согласно более широкой базе данных, например доступной на веб-сайте базы данных Codon UsageDatabase. Данную последовательность антитела использовали в проекте 5(г). На фиг. 11(Б) - таблицы предпочтительности кодонов высоко экспрессируемых генов у человека, адаптированных по Massaer etal. На фиг. 11 (В) - таблицы предпочтения кодона для человеческих генов, адаптированных по базе данных Codon Usage Database (www.kazusa.orq.ip/codon) для Homo sapiens (содержащей 89533 CD's(38691091 кодонов. Пояснение: и для тяжелых, и для легких цепей ORF: уникальные сайты Hind III (5') и EcoR1 (3') обычно использовали для доставки открытых рамок считывания в вектора экспрессии. Все последовательности были подтверждены перед использованием в трансфекции. Примеры последовательностей смотри на фиг. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, где записаны исходные и адаптированные последовательности открытой рамки считывания проекта 5. Следует заметить, что в проекте 5 только 5(г) был достаточно кодон-адаптированным на участках открытых рамок считывания для получения значения CAI, превышающих 0,9. Для всех значений CAI, указанных в данном описании изобретения, для справки использовали таблицу частоты использования кодона Ehum.cut (доступна через EMBOSS). Эти значения рассчитывали, используя приложение индекса адаптации кодонов, которое использует методику, впервые описанную Sharp и Li (выше). Такое приложение является частью комплекта EMBOSS, версия 2.8.0, файлы использования кодонов Ehum.cut, и настройки параметров по умолчанию использовали для определения значений CAI последовательностей. Таблица 6. Таблица использования кодона Ehum.cut, полученная из EMBOSS. Колонка А: последовательность кодона; колонка В: кодируемая аминокислота; колонка С: доля использования данного кодона среди группы его дубликатов; колонка D: количество кодонов на 1000 кодонов; колонка Е: число раз, когда кодон наблюдался в группе данных, используемых для получения таблицы. 1.3. Клеточная культура. Адаптированные для суспензии клетки CHO DG44 согласно стандартной методике пассировали в среде, не содержащей компонентов животного происхождения, к которой они были заранее адаптированы. Данная среда состояла из основной композиции, содержащей аминокислоты, следовые элементы,витамины, глюкозу и дрожжевой гидролизат. В данную среду также добавляли рекомбинантный инсулин, липиды и нуклеозиды. Бикарбонат натрия добавляли к среде в качестве буфера. В данной области техники известно множество равноценных прописей сред, не содержащих компоненты животного происхождения. Первичную селекцию клеток, трансформированных вектором, выполняли путем удаления нуклеозида (для DHFR-селекции) и добавления G418 (для неомицин-фосфотрансферазной селекции). Для ранжирования титров: аналитические титры в 96-лунок были склонны к варьированию, вызванному клеточным ростом, величинами посевного материала, объемами разведения среды и кинетикой испарения в планшете. Следовательно титры, полученные в моделях продуцирования во встряхиваемых колбах,были более показательными в отношении порядка ранжирования клеточной линии в высокопродуктивных амплифицированных клеточных линиях. Для таких моделей все клетки засевали при одинаковой начальной плотности. В таких моделях также наблюдали за жизнеспособностью и ростом. 1.4. Подготовка ДНК перед трансфекцией. Равные количества (15 мкг) вектора экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи полностью линеаризовали (с Not 1) в реакционных пробирках Эппендорфа объемом 200 мкл и затем осаждали смесью этанол/ацетат натрия. Осадок после центрифугирования затем промывали в 70% этаноле, сушили на воздухе и ресуспендировали в 50 мкл воды с маркой "для молекулярной биологии". 1.5. Подготовка клеток CHO DG44 перед трансфекцией. 1,2107 клеток (на трансфекцию) из здоровых растущих клеток центрифугировали (1000 об/мин в течение 2-10 мин) в 15 или 50 мл пробирке, промывали 15 мл ледяного раствора PBS (фосфатный буферный раствор)/сахароза, снова центрифугировали и затем ресуспендировали в 800 мкл ледяного раствораPBS/сахароза. Эту клеточную суспензию затем добавляли к заранее подготовленной ДНК и оставляли на льду в течение 15 мин, затем переносили в охлажденную кювету для электропорации. 1.6. Электропорация. Кювету, содержащую подготовленную ДНК и клетки, электропорировали в Gene Pulser, установленном на 25 мкФ и 0,38 кВ, и затем возвращали на лед на 10 мин. Затем клетки удаляли и добавляли до 240 мл неселектирующей среды, и затем помещали в планшет в неселектирующей среде в кювете 4096 лунок в количестве 2-5103 клеток на лунку (то есть 50 мкл на лунку). Планшеты затем обертывали фольгой и инкубировали при 37C и 5% CO2 в течение 48 ч. 1.7. Селекция, амплификация и идентификация клона. Через 48 ч после электропорации 150 мкл селективной среды добавляли в каждую лунку. Данная селективная среда содержит G418 и не содержит нуклеозиды. После этого один раз в неделю 140 мкл среды осторожно заменяли свежей селективной средой, не нарушая осевший клеточный слой, и через 3-4 недель все растущие клоны (обычно рост составлял 0,1 колонии на лунку; то есть рост в 10 лунках на 96 луночный планшет) титровали в отношении продуцирования антител. Идентифицированные клоны с высоким рангом (обычно 20-100) затем масштабировали в той же самой селективной среде при помощи 24-луночных чашек и вплоть до 6-луночных чашек. Данные клоны затем помещали в планшет в количестве 1000 клеток/лунка в 96-луночной кювете (96-лунок на клон) и затем селектировали на селективной среде, также содержащей 5 нМ метотрексата, в объеме 200 мкл на лунку. После дополнительных двухтрех недель инкубации лучшие клоны еще раз масштабировали и затем еще раз помещали в планшет в количестве 1000 клеток на лунку, но в 50 нМ MTX. Эти клоны также отбирали в 96-луночных планшетах через 2-3 недель роста, и лучшие масштабировали и затем помещали в планшеты в количестве 1000 клеток на лунку в 96-луночные кюветы, но с 150 нМ MTX. Чтобы оценить конечные клоны в отношении потенциала продуцирования, лучшие клоны при 150 нМ MTX затем масштабировали и оценивали на моделях продуцирования во встряхиваемой колбе в отношении титра и качества образованного продукта. Лучшим клоном для проекта 5(а) являлся клон, обозначенный 17-9-6-1. Он генерировал конечный титр 0,3 г на литр в моделях продуцирования на неполноценной среде. Обратите внимание - уровни метотрексата и число раундов амплификации, требующихся на стадии 1.7, варьировалось в зависимости от проекта и того, были ли последовательности кодонадаптированными. 1.8. Анализ титра. Для образцов среды, полученных из 96-луночных планшетов, титр антител определяли с помощью автоматизированного 96-луночного сэндвич-ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) на анализаторе IGEN М-Series M8/384 (Bioveris, MaryLand, USA) в соответствии с рекомендациями производителя и стандартными методиками. Сэндвич состоял из магнитных шариков, покрытых стрептавидином,биотинилированного белка А и меченных рутением фрагментов F(ab)2. Сигнал, генерируемый тестируемым образцом, затем сравнивали с последовательным разведением эталонного стандарта антитела. В ходе высокочувствительного анализа вследствие аналитического разброса, скомбинированного с пере- 13022990 менными значениями клеточного роста в 96-луночных культурах, промежуточная точность и воспроизводимость анализа является относительно низкой для данного анализа для высокопродуктивных амплифицированных клеточных линий. Для образцов среды, полученных в модели продуцирования во встряхиваемой колбе и биореакторе, титр антител измеряли с помощью нефелометрического способа, при котором световой сигнал рассеивается нерастворимым иммунопреципитином в реакционном растворе, с использованием системы Beckman Coulter Image (Buckinghamshire, England) и рекомендации производителя и стандартные методики. Сигнал, образованный тестируемым образцом, опять сравнивают с последовательным разведением эталонного стандарта антитела. Все титры зарегистрированы как приблизительные. 1.9. Модели биореактора с встряхиваемой колбой (модели периодического продуцирования с продолжительным выращиванием на неполноценной среде). Обычно клетки высевали в стандартные встряхиваемые колбы для культуры ткани объемом 250 мл в количестве 800000 клеток на мл с вентилируемыми крышками, содержащие среду без компонентов животного происхождения, и до общего объема 120 мл. Эти колбы затем инкубировали при перемешивании в воздухе, обогащенном диоксидом углерода, и устанавливали температуры для стимулирования и поддержания клеточного роста. Различные условия тестировали для каждого клона - например различные температурные условия. В результатах, указанных здесь, в качестве примера приведен самый высокий титр для каждого тестируемого клона (в стандартных условиях). Обычно титры в конечной точки модели продуцирования, как сообщается в данном описании изобретения, регистрируют в такой точке,где жизнеспособность клеток снижается до приблизительно 50%, при определении с помощью анализа вытеснения трипанового синего на Vi-Cell (Beckman), с использованием стандартной настройки параметров Vi-Cell CHO и рекомендованный производителем протокол. Обычно данный титр в конечной точке получают через 10-20 суток инкубации. 1.10. Методика культивирования в биореакторе. На всех этапах использовали стандартные методики культивирования в биореакторе и оборудование. Обычно для получения посевного материала клетки масштабировали в большие объемы и пассировали два раза в неделю в повторяющемся 3-суточном, затем 4-суточном режиме. Для исследования, показанного в фиг. 13, посевные клетки затем использовали для инокулирования 3-литровых настольных биореакторов Applikon (2-литровый рабочий объем), функционирующих при следующих условиях процесса: температура 34C, контрольная точка pH 6,95, контрольная точка DO 30%. Как и в моделях встряхиваемой колбы, культивирование продолжали вплоть до снижения жизнеспособности клеток приблизительно до 50%. Такие биореакторы хорошо имитируют титр конечной точки как встряхиваемых колб, так и более крупных биореакторов, используемых для снабжения веществом для клинических исследований,и подобного. 1.11. Анализ RT-QPCR (количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией)(результаты смотри на фиг. 10). Экстракции РНК CHO и реакции RT-QPCR выполняли с помощью автоматизированной экстракции с двуокисью кремния, используя набор и протоколы для выделения РНК MagNA Pure и РНК High Performance (Roche). После обратной транскрипции с использованием произвольных гексамеров, выполняли реакцию PCR, используя ABI-7700 (Applied Biosystems), и анализировали при помощи алгоритма сравнительного количественного определения Ct, применяя стандартную методологию. Реакции были мультиплексными (18S+ ген-мишень [тяжелая цепь/легкая цепь]), 18S, являющийся наиболее распространенной мишенью, был ограничен праймером для предупреждения ингибирования целевых реакций. Зонды и фланкирующие пары праймеров, используемые для Q-PCR использовали согласно SEQ ID. NO: 1-9. Следует заметить, что указанные выше зонды/праймеры тяжелой цепи и легкой цепи не подходили для использования с проектом 5(г) из-за увеличенной адаптации кодонов ORF, выполненной в данном проекте, следовательно они исключены из фиг. 10(А). 1.12. Вестерн-блоттинг анализ (результаты см. на фиг. 10). Стандартные методики были использованы, которые описаны подробно в другом источнике (например смотри Sambrook et al выше). В кратком изложении экстракты поликлональных равноценных клеток изготавливали, используя лизис целых клеток и буфер для экстракции белков. Равные количества каждого экстракта затем нагревали, инкубировали с загрузочным буфером Лэммли, и затем загружали и прогоняли на SDS-Page гелях с трисглициновым подвижным буфером для разделения белковых фракций. Сразу после разделения белки блоттировали электропереносом на нитроцеллюлозные мембраны и затем зондировали с помощью целого анти-IgG человека (конъюгированного с HRP (пероксидазой хрена. Сигнал генерировали при инкубации с субстратом HRP и регистрировали с помощью рентгеновской пленки. Дополнительная более долгая экспозиция требовалась для обнаружения продукта с легкой цепью антитела для проекта 5(а). 1.13. Флуоресцентное окрашивание метотрексатом для определения уровней DHFR в клонах, продуцирующих нужный рекомбинантный белок. Каждый клон культивировали без метотрексата в течение 4-5 суток, затем добавляли 10 мкМ AlexaFluor 488 - Метотрексат (Molecular Probes/Invitrogen, Paisley) в течение 18-22 ч при 37C, 5% CO2 до 700000 живых клеток. Окрашенные клетки затем собирали и промывали средой и инкубировали при 37C, 5% CO2 в течение 30 мин. Собранные клетки еще раз промывали средой и затем ресуспендировали в среде, фильтровали и добавляли краситель пропидиум иодид для исключения живых/мертвых клеток(Sigma, St Louis), затем анализировали на BD FACS ARIA. Данные, представленные на фиг. 14(А), относятся только к селектированным живым клеткам. 1.14. qPCR-Анализ геномной ДНК в отношении уровней DHFR и Neo. Экстракцию геномной ДНК CHO выполняли, используя стандартные наборы от Qiagen. После количественного определения ДНК и нормализации с использованием показания спектрофотометра, выполняли PCR-реакцию, используя ABI-7700 (Applied Biosystems), и анализировали с помощью алгоритма сравнительного количественного определения Ct, используя стандартные методики. Зонды и фланкирующие пары праймеров, применяемые для Q-PCR, использовали в соответствии с SEQ ID.20-25. Результаты показаны на фиг. 14(Б). Пример 2. Экспрессия тяжелой и легкой цепей моноклинального антитела в клетках CHO. Неожиданно, при высокой оценке CAI ORF, но по-прежнему с естественным значением (то есть оценка менее самого высокой наблюдаемой в естественных ORF человека, например в позднем ороговении оболочки a LCE1 A; NM 1783480) проекта 5(в), образовал более высокий максимальный титр, чемCAI открытых рамок считывания с неестественно высокой оценкой из проекта 5(г), круг (количество) хороших продуцентов в 5 (г) был улучшен (см. табл. 5). Лучшие клоны 5(а), (в) и (г) затем амплифицировали и дополнительно оценивали. Для такой дополнительной оценки клоны 5(а) развивали в качестве контроля и для представления типичных титров проекта, наблюдаемых до результатов, описанных в данном описании изобретения. Результаты данной работы образовывали высокопродуктивный, стабильный клон (титр и рост наблюдались на продолжении 40 пассажей) из проекта 5(г) за неожиданно быстрое время и с пониженными уровнями амплификации. Более того, уровни метотрексата, требующегося для создания конечной клеточной линии из 5(г), были значительно более низкими (на 97% менее метотрексата) относительно уровней, требующихся для создания эквивалентных клеточных линий, экспрессирующих аналогичные или более низкие уровни такого же белкового продукта с открытых рамок считывания с неадаптированным кодоном из проекта 5(а) (см. табл. 1). Выполняли дополнительный подробный анализ - см. табл. 2-4. Для исследования, влияет ли на свойства связывания полученных рекомбинантных белков, образованных с помощью ORF с модифицированными значениями CAI, адаптация кодонов, характеристики связывания сравнивали и анализировали для антитела проекта 5, кодированного или ORF со значениемCAI 0,809 (HC)/0,761 (LC), или ORF со значением CAI 0,982 (HC)/0,976 (LC). Оба вещества получали в биореакторах и затем очищали с помощью эквивалентных режимов очистки. При таком сравнении было показано, что на характеристики связывания антитела не влияли изменения CAI для ORF, кодирующей данное антитело. Лучший продуцирующий клон из проекта 5(г), 097-7, как показано в табл. 1, был клонирован из одной клетки для гарантии клональности клеточной линии, при этом полученный титр лучшего подклона генерировал близкое к 2-кратному увеличение в продолжительных периодических культурах, выращиваемых на неполноценной среде, относительно неклонированного родителя. Титры, показанные на фиг. 13, генерируются периодическими культурами, выращиваемыми на неполноценной среде, в двух отдельных 3-литровых настольных биореакторах Applikon как описано в 1.10. Таблица 1 - для каждого проекта представлен конечный клон, выбранный для последующей дополнительной разработки и хранения. Также выделены 96-луночные титры (нг/мл), полученные для каждого конечного клона на каждой стадии развития его клеточной линии. Типичные данные, полученные до результатов, которые описаны в данном описании изобретения, представлены как проекты антител 1, 2, 3 и 4. Следует отметить, что проект 2 и проект 4 экспрессируют один и тот же продукт. Для проектов 2 и 4 все работы выполняли в двух независимых лабораториях, используя одинаковые векторы, клеткихозяева и протоколы, но разных операторов-лаборантов и оборудование. Все титры, показанные ниже при концентрациях MTX 0, 5, 50 и 150 нМ, представляют собой титры, полученные на 96-луночной стадии. Более высокие титры показали отсутствие значительного улучшения в моделях продуцирования на неполноценной среде и таким образом развитый клон с более низким MTX (см. табл. 2). FIO - только для информации, не требуется. Проект 6(а) останавливали до достижения плато вследствие лучших титров из проектов 6(б)-6(г). Таблица 5 - сравнение титров неамплифицированных клонов, образованных при помощи стандартного протокола трансфекции и селекции, и затем селектированных при удалении нуклеозида и добавлении G418. Все клеточные линии содержат одинаковые векторы, экспрессирущие одинаковое антитело(проекта 5), но с открытых рамок считывания, кодирующих с различными значениями CAI. Для проекта 5(а) (неоптимизированный) три дополнительные трансфекции были выполнены, но не показаны, так как результаты по существу представляли собой фон. На фиг. (А) "% титра 5 нг" относится к % лунок, после скринингового значения выше 5 нг/мл. "% титра 50 нг/мл" относится к % лунок, отобранных со значением выше 50 нг/мл. "Высший титр" относится к самому высокому значению титра из всех подвергнутых скринингу- "50 ое значение" относится к 50 ому лучшему титру из подвергнутых скринингу. "20 ая величина" относится к 20 ому лучшему титру из подвергнутых скринингу. В (Б), средние результаты для высшего, 20 ого и 50 ого титров, указанных в (А), представлены в формате гистограммы (А). Таблица 3. Подробный анализ титров в 96-луночных планшетах проектов, показан в табл. 1. Титр лучшего и 50-ого лучшего клона показан после селекции с добавлением G418 и удалением нуклеозида,но без добавления метотрексата. Таблица 4. Лучшие 20-100 клонов, которые обнаружили в проектах 5 и 6, затем масштабировали в 6-луночные кюветы, затем повторно помещали в 96 лунок в среде, содержащей 5 нМ метотрексата. Ниже показаны средний и высший титры растущих клонов, наблюдаемые в экспериментах 5 и 6, отобранные при концентрациях метотрексата антифолата 5 нМ (А 1) и 50 нМ (А 2) в 96-луночных кюветах. Таблица 2. Примеры плато продуцирования: пример (А) конечного выбранного клона для проекта 5(г) дополнительно амплифицировали в 50 нМ MTX. Показаны титры родительского клона (оттененные) в моделях продуцирования на неполноценной среде и полученный наивысший титр "амплифицированных" дочерних клонов. Также показаны аналогичные примеры (В, С, D, E, F, G). Для каждого примера указан наивысший титр дочернего клона после дополнительной амплификации. Показано, что ранее достижение более высоких титров в более ранний срок являются более полезным, чем попытка достижения более высоких титров при помощи дополнительных раундов амплификации. Пример 3. Антитела 6 и 7 и промотор EF-1a. Выполняли адаптацию кодона открытых рамок считывания как тяжелых, так и легких цепей антитела 6, опять с получением конечных значений CAI по всей ORF0,9. (см. табл. 1). Исходные/дикого типа и кодон-адаптированные открытые рамки считывания экспрессировались в векторах экспрессии промотора на основе RSV, а также в векторе экспрессии промотора на основе фактора элонгации 1-альфа(EF-1a) человека, где цис-действующий изолятор, энхансер и элементы экспрессии промотора замещали элементами от невирусного источника промоторов. Результаты данного исследования снова продемонстрировали, что значительно меньшее количество метотрексата требовалось для создания конечной высокопродуктивной клеточной линии, когда открытая рамка считывания нужного белка была сначала кодон-адаптированной. Действительно, трансфекцию 6(а), в которой антитело 6 кодировали с помощью неадаптированных ORF (то есть со значением CAI0,9), останавливали на стадии с концентрацией MTX 5 нМ, до образования клеток, приближающихся к плато продуцирования. Режим амплификации не поддерживали далее в трансфекции 6(а), так как было очевидно, что будет требоваться значительно больше ресурсов и время для создания клеточных линий, способных продуцировать выходы белка, эквивалентные выходам, уже полученным у клеточных линий, в которых использовали ORF0,9 (то есть трансфекции 6(б) и 6(г). Кроме того, при сравнении аналогичных векторов плюс или минус адаптация кодонов,обнаружили, что адаптация кодонов всегда снижала требующиеся уровни антифолата. И снова, адаптацию кодона для проекта 7 выполняли аналогично проекту 6 (см. табл. 1) и ORF с адаптированным кодоном (CAI0,9) экспрессировали в RSV, а также в вектор экспрессии на основе промотора EF-1a. И снова,и независимо от промотора, эквивалентные высокопродуктивные клеточные линии были получены за более короткое время и с меньшим количеством метотрексата от ORF с адаптированным CAI, по сравнению со всеми предшествующими проектами, в которых для кодирования рекомбинантных продуктов использовали неадаптированные ORF (обобщено в табл. 1). Пример 4. Уровни мРНК. Для дополнительного изучения данной методики влияние адаптации кодонов на уровни получаемой мРНК изучали в аналогичных поликлональных клеточных популяциях, экспрессирующих один и тот же продукт (антитело проекта 5) от одинаковых векторов, но с открытых рамок считывания с отличающимися значениями CAI. Клетки CHO совместно трансфицировали векторами экспрессии, кодирующими тяжелую цепь (HC) и легкую цепь (LC), кодирующими один и тот же белковый продукт (антитело проекта 5). Каждую трансфицированную популяцию поддерживали в виде поликлональных пулов. Каждая векторная пара кодирует одну и ту же тяжелую цепь (HC) и легкую цепь (LC) антитела, но с открытых рамок считывания с разными значениями CAI. Результаты данного эксперимента представлены на фиг. 10 и показывают, что наблюдается значительная кратность увеличения уровней мРНК, когда значение CAI повышено для единицы генетического кода как тяжелой, так и для легкой цепи относительно неадаптированных контролей. Эквивалентное повышение уровней РНК (относительно исходной неадаптированной последовательности) происходило во всех анализируемых адаптированных последовательностях. Аналогично и в пределах вестерн-блоттинг анализа, эквивалентное увеличение уровней внутриклеточного белка наблюдалось для всех адаптированных последовательностей. Однако, хотя и наблюдалась такая идентичность для уровней внутриклеточного белка, имело место различие в секретированных уровнях. Обнаружено, что клетки, содержащие открытые рамки считывания с неестественно высокой оценкой CAI, образовывали более высокие поликлональные титры. Это дополнительно подтверждает вывод, что количество высокопродуктивных клонов повышается, когда в протоколах развития клеточной линии используют открытые рамки считывания с неестественно высокой оценкой CAI. Фиг. 10(А). Внутриклеточные уровни РНК единицы генетического кода HC и LC измеряли с помощью RT Q-PCR: Все сигналы нормализовали по отношению к рибосомной РНК и кратность увеличения приведена относительно сигналов, образованных для исходных векторов HC и LC, кодируемых открытыми рамками считывания с неадаптированными кодонами. Ось Y: диапазон значений от 0 до 50 кратного увеличения сигнала РНК. Ось X: a(h) означает сигнал отрицательного контроля НС, полученный от экстрактов РНК, взятых от нетрансфицированных клеток (в двух повторах); b(h) означает сигнал HC,полученный от экстрактов РНК, происходящих из клеток, трансфицированных векторами экспрессии HC и LC с неадаптированными кодонами, которые использовали для проекта 5(а) (значения CAI 0,809 дляHC и 0,761 для LC); c(h) обозначает сигнал НС, полученный от экстрактов РНК, происходящих из клеток, трансфицированных кодон-адаптированными НС- и LC-векторами экспрессии, которые использовали для проекта 5(б) (значения CAI 0,847 для HC и 0,833 для LC); d(h) означает сигнал НС, полученный от экстрактов РНК, происходящих из клеток, трансфицированных дополнительными кодонадаптированными HC и LC векторами экспрессии, которые использовали для проекта 5(в) (значения CAI 0,872 для HC и 0,894 для LC). Сигналы легкой цепи, полученные от таких же экстрактов РНК, как описано выше, показаны как a(l), b(l), c(l) и d(l) соответственно.(В) - анализ "вестерн-блоттинг"; эквивалентные клеточные экстракты разделяли с помощью SDSPage, блоттировали и перепроверяли с антителами (конъюгированными с HRP) против продукта. Кон- 18022990 троль из нетрансфицированных клеток показан на полосе 1. Поликлональные клетки, экспрессирующие открытые рамки считывания тяжелой и легкой цепи продукта, представлены следующим образом; полосы 2 и 3; HC со значением CAI 0,809 и LC со значением CAI 0,761 (белок, экспрессированный из указанного выше эксперимента b(h) и b(l), векторы эквивалентны используемым в проекте 5(а); полосы 4 и 5;HC со значением CAI 0,847 и LC со значением CAI 0,833 (белок, экспрессированный из указанных выше эксперимента с (h) и с (l), векторы эквивалентны используемым в проекте 5(б); полосы 6 и 7; HC со значением CAI 0,872 и LC со значением CAI 0,894 (белок, экспрессированный из указанного выше эксперимента d(h) и d(l), векторы эквивалентны используемым в проекте 5(в); полосы 8 и 9; HC со значением(С) - титры 24-часового продукта, представленные в нг/мл для поликлональных клеток, описаны на фиг. 10 (В). Пример 5. Разные способы достижения высоких значений CAI. Пример (а) - проекта 8 и пример (б)- проекта 9. а) Для проекта 8 использовали программное обеспечение Leto для конструирования вариабельных доменов. Затем их сливали с идентичными константными доменами, ранее полученными для проекта 7, с помощью стандартной методики расщепления ферментом рестрикции и лигирования. Полученные ORF тяжелой цепи и легкой цепи оценивали как 0,954 и 0,919 соответственно. Затем их использовали в проекте развития клеточной линии и снова авторы изобретения получали клеточные линии с высоким выходом в более короткие временные рамки и с меньшим содержанием метотрексата, чем когда-либо раньше до адаптации кодона (см. табл. 1). б) Для проекта 9 опять использовали программное обеспечение Leto для конструирования вариабельных доменов. Затем их сливали с идентичными константными доменами, ранее образованными для проекта 6(г) с помощью стандартной методики расщепления ферментом рестрикции и лигирования. Полученные ORF тяжелой цепи и легкой цепи оценивали как 0,975 и 0,973 соответственно. Затем их использовали в проекте развития клеточной линии и снова авторы изобретения получали клеточные линии с высоким выходом в более короткие временные рамки и с меньшим содержанием метотрексата, чем когда-либо раньше до адаптации кодона (см. табл. 1). Пример 6. Воздействие на гликозилирование. Замечено, что уровни негликозилированной тяжелой цепи (NGHC) были значительно ниже при экспрессировании с кодон-адаптированных открытых рамок считывания по сравнению с уровнями, полученными при экспрессировании с неадаптированным открытыми рамками считывания даже при использовании для экспрессии в обоих случаях одинакового хозяина, среды культивирования и DHFRсистемы селекции и амплификации. Еще более интересно, что аналогичные высокие уровни NGHC также наблюдались, когда такие же неадаптированные открытые рамки считывания в качестве альтернативы экспрессировали в разных клетках-хозяевах, используемых при разных условиях культивирования, и с разным вектором, режим селекции и амплификации (Глутаминсинтетаза/MSX) (см. фиг. 12). Такая корреляция между адаптацией кодона открытой рамки считывания и пониженными уровнями негликозилированной тяжелой цепи указывает на то, что путем увеличения значения CAI открытой рамки считывания также можно улучшить качество продукта в целом. 6.1. Развитие клеточной линии с помощью системы селекции Lonza CHOK1SV и глутаминсинтетазы (фиг. 12). Конструирование вектора и развитие клеточной линии выполняли в соответствии с рекомендованными протоколами Lonza (Slough). Среда, используемая на всех этапах, представляла собой CD-CHO(Invitrogen). Открытые рамки считывания, используемые в антительном проекте 5(а), содержащие неадаптированные открытые рамки считывания, сначала субклонировали в векторы Lonza pEE14.4 (для легкой цепи) и рЕЕ 6.4 (для тяжелой цепи). Данные векторы затем объединяли в соответствии с рекомендованным протоколом Lonza в один двойной вектор гена, экспрессирующий тяжелые и легкие цепи. Данный вектор затем доставляли к штамму клеток-хозяев CHOK1, адаптированному к суспензии Lonza,названному CHOK1SV, используя электропорацию согласно рекомендованным инструкциям Lonza, и селектировали и амплифицировали путем удаления глутамина и добавления MSX, также согласно рекомендации. Полученные клоны титровали на 96-лунках и лучшие масштабировали во встряхиваемых колбах и дополнительно оценивали. Лучшие клоны были отобраны для получения продукта в крупномасштабных биореакторах. Дополнительные общие подробности данной технологии смотри в de La CruzEdmonds et al 2006 Molecular Biotechnology 34: 179-190). 6.2. Анализы продукта NGHC. Белок очищали от культурального супернатанта с помощью колонок для протеина А. Затем продукт анализировали с помощью капиллярного электрофореза SDS на оборудовании лаборатории на микросхемах Bioanalyzer (Agilent Technologies, Cheshire UK) в восстанавливающих условиях и согласно протоколу изготовителя. Негликозилированную тяжелую цепь наблюдают в виде немного более быстро двигающуюся относительно основных видов гликозилированной тяжелой цепи (см. фиг. 12 В). Фиг. 12 - табл. (А), представляющая репрезентативные данные со всех анализов. Также включено дополнительное исследование, предпринятое для экспрессии неадаптированных открытых рамок считывания в другом протоколе селекции и амплификации (глутаминсинтетаза/метотрексат), использующем другую клетку-хозяин, вектор, среду и режим культивирования (см. пример 6.1 выше). (В) Примерные следовые количества NGHC наблюдали от стартовых неадаптированных ORF против кодонадаптированных ORF. Этот анализ выполняли на продукте, очищенном из биореакторов эквивалентного размера (1000-литровых). В данных репрезентативных следовых верхних слоях, сбор клеточных культур из биореакторов, экспрессирующих продукт с неадаптированных ORF (CAI: HC 0,809, LC 0,761), получали тяжелую цепь с пониженным заполнением сайта (10% негликозилированной тяжелой цепи) относительно продукта, полученного с адаптированных ORF (CAI: HC 0.982, LC 0,976), которые содержали только на 1,5% негликозилированную тяжелую цепь. Пример 7. Влияние на уровни агентов селекции и амплификации в конечной клеточной линии. Добавление или ступенчатое титрование увеличивающихся количеств агента селекции и амплификации MTX в системе DHFR-селекции выполняют с целью усиления экспрессии путем увеличения числа копий гена. Для изучения влияния адаптации кодонов на число копий гена трансфицированной плазмидной ДНК использовали две разные полуколичественные методики (смотри разделы 1.13 и 1.14 относительно описания экспериментов). Сначала использовали FACS-анализ. Для этой цели конечные клеточные линии или их одноклеточные клоны для проектов 2, 3, 4, 5(г), 6(г) и 7(б) окрашивали флуоресцентным метотрексатом и анализировали посредством FACS. Результаты (показаны на фиг. 14 А) демонстрируют, что уровни метотрексата,указанные посредством средней интенсивности флуоресценции, и, следовательно, уровни DHFR, коррелируют с уровнем амплификации клеточной линии, то есть конечные клеточные линии, селектированные в 5 нМ MTX (проекты 5(г), 6(г) и 7(б, имеют самый низкие уровни DHFR, а конечные клеточные линии, селектированные в 150 нМ MTX (проект 3), имеют самые высокие уровни DHFR. Кроме того, qPCR для DHFR и Neo выполняли на геномной ДНК, выделенной из конечных клеточных линий или их одноклеточных клонов, для проектов 3, 4, 5(а), 5(г), 7(б) и 9. Результаты (показаны на фиг. 14 В) демонстрируют, что линии, селектированные в 5 нМ MTX (проекты 5(г), 7(б) и 9), имеют значительно более низкие ДНК уровни DHFR и Neo и следовательно более низкое число копий, чем линии, селектированные в 150 нМ MTX (проекты 3, 4 и 5 (а. Результаты, обсуждаемые выше, демонстрируют, что клеточные линии, полученные с кодонадаптированных ORF (проекты 5(г), 6(г), 7(б) и 9 для данного примера), имеют более низкое число копий гена по сравнению с линиями, произведенными с неадаптированных ORF (проекты 2, 3, 4, 5(а) для данного примера). Использование кодон-адаптированных ORF (CAI0,9), таким образом, приводит к созданию клеточных линий (по сравнению с клеточными линиями, полученными с неадаптированных ORF) с равными или более высокими титрами, с более низкими уровнями амплификации и более низким числом копий трансфицированной ДНК. Создание клонов, генерирующих эквивалентные или более высокие уровни антител с более низким числом копий, менее амплифицированными векторами экспрессии, является очень желательным. Например, было показано, что повторно индуцированный сайленсинг гена(RIGS) может быть вызван, когда число копий интегрированного вектора экспрессии увеличено, и что такой RIGS может затем приводить к пониженным уровням экспрессии таких векторов в клетках млекопитающего (например смотри McBurney MW et al Exp Cell Res 2002 274:1-8). Фиг. 14 (А). Диаграмму средней флуоресценции наблюдали для конечной клеточной линии для каждого из проектов 2, 3, 4, 5(г), 6(г) и 7(б). Окрашивание клеток для DHFR выполняли, как описано в разделе "Вещества и способы", пример 1. (Б) Уровни DHFR и Neo ДНК посредством qPCR на геномной ДНК из конечных клеточных линий для проектов 3, 4, 5(а), 5(г), 7 б) и 9. qPCR выполняли, как описано в разделе "Вещества и способы", пример 1. Для наблюдаемых уровней критериев самые низкие значения(наблюдались в проекте 7(б для DHFR и Neo принимали за 1, затем все другие величины наносили на диаграмму в виде относительного кратного увеличения по сравнению с ними. Также каждая величина,указанная ниже, показывает, получен ли белок, экспрессируемый анализируемой клеточной линии, сORF со значением CAI0,9 (Y=Да и N=Нет) и требуемые уровни MTX для создания клеточной линии (в нМ MTX). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения клеточной линии млекопитающего, продуцирующей по меньшей мере один терапевтический белок, включающий стадии: а) трансформации клеточной линии полинуклеотидной последовательностью, содержащей (1) последовательность, кодирующую терапевтический белок и имеющую индекс адаптации кодонов (CAI),который равен и превышает 0,9, и (2) последовательность, кодирующую маркер селекции, который также обеспечивает амплификацию указанной полинуклеотидной последовательности; б) проведения по меньшей мере одного раунда амплификации указанной полинуклеотидной последовательности в присутствии когнатного агента селекции и амплификации; и(в) селекции клеточной линии, когда достигнуто плато продуцирования терапевтического белка; где концентрация когнатного агента селекции и амплификации составляет 50% или менее от концентрации,необходимой для достижения эквивалентного выхода указанного белка, продуцируемого клеточной линией, трансформированной полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует терапевтический белок и имеет индекс адаптации кодонов менее 0,9. 2. Способ по п.1, где когнатный агент селекции и амплификации представляет собой MSX (метионина сульфоксимин) или MTX (метотрексат), и последовательность, кодирующая маркер селекции и амплификации, представляет собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую глутаминсинтетазу (GS) или дигидрофолатредуктазу (DHFR). 3. Способ по п.1 или 2, где для достижения эквивалентного выхода продукта требуется один раунд амплификации. 4. Способ получения клеточной линии млекопитающего, продуцирующей по меньшей мере один терапевтический белок, включающий стадии: а) получения первой полинуклеотидной последовательности, имеющей индекс адаптации кодонов менее 0,9 и кодирующей указанный по меньшей мере один терапевтический белок,б) изменения первой полинуклеотидной последовательности с получением второй полинуклеотидной последовательности, где индекс адаптации кодонов второй полинуклеотидной последовательности равен или превышает 0,9, причем и первая полинуклеотидная последовательность, и вторая полинуклеотидная последовательность кодируют один и тот же терапевтический белок,в) трансформации по меньшей мере одной первой клетки клеточной линии млекопитающего первой полинуклеотидной последовательностью со стадии (а) и третьей полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует маркер селекции, который также обеспечивает амплификацию первой полинуклеотидной последовательности в указанной клетке, и трансформации по меньшей мере одной второй клетки клеточной линии млекопитающего второй полинуклеотидной последовательностью со стадии (б) и указанной третьей полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует маркер селекции, который также обеспечивает амплификацию второй полинуклеотидной последовательности в указанной клетке;(г) культивирования указанной по меньшей мере одной первой клетки со стадии (в) для получения первой клеточной линии в среде, содержащей неизменную концентрацию когнатного агента селекции и амплификации, или в которой концентрацию когнатного агента селекции и амплификации постепенно увеличивают, где указанный агент селекции и амплификации (1) ингибирует рост клеток в указанной клеточной линии, которая экспрессирует недостаточные уровни маркера селекции и амплификации, кодируемого третьей полинуклеотидной последовательностью со стадии (в), и (2) увеличивает число копий первой полинуклеотидной последовательности в результате по меньшей мере одного раунда амплификации; культивирования указанной по меньшей мере одной второй клетки со стадии (в) для получения второй клеточной линии в среде, содержащей неизменную концентрацию когнатного агента селекции и амплификации, или в которой концентрацию когнатного агента селекции и амплификации постепенно увеличивают, где указанный агент селекции и амплификации (1) ингибирует рост клеток в указанной клеточной линии, которая экспрессирует недостаточные уровни маркера селекции и амплификации, кодируемого третьей полинуклеотидной последовательностью со стадии (в), и (2) увеличивает число копий второй полинуклеотидной последовательности в результате по меньшей мере одного раунда амплификации; и(д) селекции указанной второй клеточной линии после того, как было достигнуто плато продуцирования белка, кодируемого второй полинуклеотидной последовательностью в указанной второй клеточной линии, где указанная концентрация когнатного агента селекции и амплификации составляет 50% или менее от концентрации, необходимой для достижения эквивалентного выхода указанного белка, продуцируемого указанной первой клеточной линией, трансформированной первой полинуклеотидной последовательностью. 5. Способ по п.4, где плато продуцирования белка, кодируемого второй полинуклеотидной последовательностью и продуцируемого указанной второй клеточной линией, достигается при меньшем количестве раундов амплификации, чем необходимо для достижения эквивалентного выхода указанного бел- 28022990 ка, продуцируемого указанной первой клеточной линией, трансформированной первой полинуклеотидной последовательностью. 6. Способ по п.4 или 5, где вторую клеточную линию культивируют в биореакторах и продуцируемый клеточной линией терапевтический белок очищают. 7. Способ по любому из пп.4-6, где концентрация агента селекции и амплификации составляет менее 25%, или менее 5%, или менее 3% по сравнению с концентрацией агента селекции и амплификации,используемого для аналогичного способа с использованием первой полинуклеотидной последовательности. 8. Способ по любому из пп.1-7, где терапевтический белок, продуцируемый клеточной линией,представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент. 9. Способ по п.8, где антитело представляет собой моноклональное антитело. 10. Способ по любому из пп.1-9, где клеточная линия млекопитающего, подлежащая трансформации, является метаболически дефектной вследствие повреждения или ингибирования эндогенного клеточного фермента. 11. Способ по любому из пп.1 и 4-10, где клеточная линия млекопитающего, подлежащая трансформации, является дефектной по пути синтеза нуклеозида. 12. Способ по п.11, где последовательность, кодирующая маркер селекции и амплификации, представляет собой полинуклеотид, кодирующий дигидрофолатредуктазу (DHFR), и агент селекции и амплификации представляет собой антифолат. 13. Способ по п.12, где антифолат представляет собой метотрексат (MTX). 14. Способ по любому из пп.1 и 4-10, где последовательность, кодирующая маркер селекции и амплификации, представляет собой полинуклеотид, кодирующий глутаминсинтетазу, и агент селекции и амплификации представляет собой метионина сульфоксимин (MSX). 15. Способ по любому из пп.1 и 4-14, где для достижения плато продуцирования белка требуется только один раунд амплификации. 16. Способ по любому из пп.1-15, где конечный выход терапевтического белка, продуцируемого клеточной линией, составляет более 0,5 г/л в партии, выращиваемой на неполноценной среде. 17. Способ по любому из пп.2-13, 15 или 16, где концентрация используемого MTX (метотрексата)(а) равна или меньше 50 нМ или(б) составляет 5 нМ. 18. Способ по любому из пп.1-17, где клеточная линия млекопитающего представляет собой CHO(клетки яичника китайского хомяка) или NS0. 19. Применение полинуклеотидной последовательности, которая кодирует терапевтический белок,где индекс адаптации кодонов полинуклеотидной последовательности равен или превышает 0,9, для снижения: (1) требующихся уровней агента селекции и амплификации, который увеличивает число копий указанной полинуклеотидной последовательности, (2) количества раундов амплификации и (3) времени, требующихся в способе по любому из пп.1-18 для получения клеточной линии млекопитающего,продуцирующей указанный терапевтический белок. 20. Применение по п.19, где требуется только один раунд амплификации. 21. Продуцирующая терапевтический белок клеточная линия млекопитающего, трансформированная полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует терапевтический белок и имеет индекс адаптации кодонов, равный или превышающий 0,9, и дополнительно содержащая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует маркер селекции, который также обеспечивает амплификацию полинуклеотидной последовательности, где указанная клеточная линия продуцирует указанный белок с более высокий выходом по сравнению с клеточной линией, трансформированной указанной полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует указанный маркер селекции и амплификации, и полинуклеотидной последовательностью, кодирующей указанный терапевтический белок, где данная полинуклеотидная последовательность имеет индекс адаптации кодонов менее 0,9, полученная способом по любому из пп. 1-18; где указанную клеточную линию млекопитающего подвергают селекции в среде, содержащей 50 нМ или менее 50 нМ метотрексата (MTX) в качестве штатного агента селекции и амплификации. 22. Потомство клеточной линии по п.21. 23. Применение полинуклеотидной последовательности, которая кодирует тяжелую цепь антитела,где индекс адаптации кодонов полинуклеотидной последовательности равен или превышает 0,9, в способе по любому из пп.1-18 для получения антител, содержащих 5% или менее негликолизированных тяжелых цепей. 24. Применение по п.23, где антитела содержат:(1) 95% гликолизированных тяжелых цепей,(2) 96% гликолизированных тяжелых цепей,(3) 97% гликолизированных тяжелых цепей или(4) 98% гликолизированных тяжелых цепей. 25. Применение по любому из пп.23, 24, где антитело является моноклональным.