Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей
Номер патента: 13944
Опубликовано: 30.08.2010
Авторы: Хейскала Марджа, Дегро Джули, Летюрк Дидье Дж., Мориарти Энн, Питерсон Пер А., Джексон Майкл Р.
Формула / Реферат
1. Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), способной одновременно презентировать до пятнадцати пептидных молекул, включающий:
a) получение клеточной линии насекомых из яиц Drosophila melanogaster;
b) создание плазмиды pRmHa-3 на основе вектора экспрессии pRmHa-1, где указанная плазмида pRmHa-3 включает промотор металлотионеина, консенсусные последовательности реакции на металл и ген алкогольдегидрогеназы, несущий сигнал полиаденилирования, выделенный из Drosophila melanogaster;
c) встраивание в указанную плазмиду pRmHa-3 комплементарной ДНК, кодирующей А2.1 HLA класса I, b-2-микроглобулин и связывающие и костимулирующие молекулы, в частности В7.1, В7.2, ICAM-1 и LFA-3, где А2.1 может быть замещен любой молекулой HLA класса I;
d) трансфекцию указанных клеток насекомых стадии (а) плазмидой phshneo и указанной плазмидой pRmHa-3, содержащей комплементарную ДНК;
e) получение нпАПК путем контактирования клеток насекомых стадии (d) с CuSO4для индукции экспрессии трансфицированных генов в указанных клетках насекомых.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная нпАПК способна одновременно презентировать примерно до десяти пептидных молекул.
3. Неприродная антигенпрезентирующая клеточная линия (нпАПК), полученная способом, охарактеризованным в любом из пп.1, 2, из клеток Drosophila melanogaster, трансфицированных нуклеиновой кислотой, которая экспрессирует HLA молекулы класса I человека, связывающие и костимулирующие молекулы, причем указанная нпАПК способна презентировать до пятнадцати различных пептидных молекул.
4. Неприродная антигенпрезентирующая клеточная линия по п.3, отличающаяся тем, что указанная нпАПК способна одновременно презентировать до десяти различных пептидных молекул.
5. Неприродная антигенпрезентирующая клеточная линия по п.4, отличающаяся тем, что указанная нпАПК одновременно презентирует одну или несколько из следующих десяти пептидных молекул: тирозиназу369-377, тирозиназу207-216, gp100209-217, gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, С-лектин8-16, Рес6020-29 и Рес6025-33.
6. Способ лечения ракового заболевания у субъекта, включающий:
a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая одновременно презентирует до пятнадцати пептидных молекул, ассоциированных с указанным раковым заболеванием, в соответствии со способом по п.1, причем каждая из указанных пептидных молекул составляет примерно шесть-двенадцать аминокислот в длину;
b) сбор моноцитов периферической крови у указанного субъекта или подходящего донора и выделение из них CD8+ клеток;
c) стимуляцию указанных CD8+ клеток указанной клеточной линией нпАПК;
d) добавление указанных CD8+ клеток в среду, которая содержит цитокин, выбранный из группы, состоящей из ИЛ-2, ИЛ-7, или в кондиционированную ростовую среду (CGM), причем указанные цитокины могут быть использованы индивидуально или в сочетании;
e) смешивание несуспендированных моноцитов периферической крови подпункта (b) или истощенных по CD8 моноцитов периферической крови, оставшихся после стадии выделения подпункта (b), собранных у указанного субъекта или подходящего донора, примерно с 1-50 мкг/мл одного из указанных пептидов, которые одновременно могут быть презентированы указанной нпАПК;
f) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови достаточной дозой g-излучения, необходимой для стерилизации всех компонентов суспензии, за исключением желательных моноцитов периферической крови;
g) выделение прилипающих моноцитов периферической крови из облученной суспензии моноцитов периферической крови стадии (f);
h) добавление к указанным прилипающим моноцитам периферической крови примерно 1-50 мкг/мл каждого из указанных пептидов;
i) объединение указанных CD8+ клеток подпункта (d) с указанными прилипающими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять CD8+ клеток к одному моноциту периферической крови;
j) введение субъекту CD8+ клеток подпункта (i).
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный цитокиновый компонент представляет собой ИЛ-2 или сочетание ИЛ-2 и ИЛ-7.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная доза g-излучения составляет примерно 3000-7000 рад, предпочтительно примерно 5000 рад.
9. Способ по п.6, отличающийся тем, что стадия добавления (d) включает добавление указанных CD8+ клеток в среду, содержащую ИЛ-2 и ИЛ-7.
10. Способ по п.6 или 9, отличающийся тем, что указанные пептидные молекулы составляют примерно от восьми до десяти аминокислот в длину.
11. Способ по п.6 или 9, отличающийся тем, что раковое заболевание представляет собой меланому.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная нпАПК презентирует десять пептидов.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанные пептиды представляют собой тирозиназу369-377, тирозиназу207-216, gp100209-217, gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, С-лектин8-16, Рес6020-29 и Рес6025-33.
Текст
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕПРИРОДНОЙ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩЕЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ И ПРИМЕНЕНИЕ ЛИНИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ Т-Клеточные реакции часто снижаются у людей с ослабленной иммунной системой. Авторы разработали способ выделения, стимуляции и размножения "наивных" цитотоксических Тлимфоцитарных (ЦТЛ) предшественников антигенспецифичных эффекторов, способных лизировать опухолевые клетки in vivo. Такая ex vivo процедура дает полностью функциональные эффекторы. Искусственные антигенпрезентирующие клетки (нпАПК; Drosophila melanogaster) трансфицировали HLA класса I человека и определили вспомогательные молекулы, которые используются для стимуляции CD8+ Т-клеток у нормальных доноров и у раковых больных. Молекулы класса I, экспрессируемые с высокой плотностью на поверхности клеток Drosophila, являются пустыми, это позволяет эффективно нагрузить их множеством пептидов, что приводит к генерированию поликлональных ответов, распознающих опухолевые клетки, эндогенно экспрессирующие специфические пептиды. Генерируемые ответы являются сильными, антигенспецифичными и воспроизводимыми, если пептидный эпитоп представляет собой идентифицированный иммуноген. Такая искусственная система экспрессии антигена может быть адаптирована для лечения большинства видов рака у значительной части населения. 013944 Предпосылки создания изобретения Рак продолжает оставаться основной проблемой здравоохранения, несмотря на значительный прогресс, сделанный в области его лечения. Стандартные приемы лечения - химиотерапия, лучевая терапия,хирургическое вмешательство - и сочетание указанных трех направлений лечения зачастую не могут привести к длительному излечиванию. Во многих случаях проходивший лечение раковый больной через некоторый период времени испытывает рецидивы болезни, проблему усложняет также тяжесть для пациента указанных выше методов лечения. Другой фактор, усложняющий разработку способов лечения рака, заключается в том, что, как было показано, рак вызывается не каким-то одним биологическим агентом или фактором, но скорее сочетанием таких агентов или факторов. В отличие от большинства стратегий медицинского воздействия, при которых в центре внимания при лечении находится одна единственная причина в виде одного агента или явления, вызывающих состояние болезни, терапия рака требует принимать во внимание множество биологических факторов. В последние годы исследования были направлены на разработку методов лечения рака, при которых задействуется собственная иммунная система пациента. Один такой подход включает адоптивную иммунотерапию. Адоптивная иммунотерапия направлена на использование собственных клеток пациента с целью генерирования цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) для лечения опухолевых или раковых клеток. Однако указанная методика остается в большей части недоказанной как жизнеспособная клиническая стратегия для лечения больных людей. Кроме проблем идентификации соответствующих эпитопов для иммунизации ЦТЛ, современные методики не дают способа презентации достаточного числа различных эпитопов на АПК, с тем чтобы адекватно нацеливать множество антигенов на эффективное лечение рака. Настоящее изобретение отвечает на насущные потребности, а также дает другие благоприятные эффекты. Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к неприродным антигенпрезентирующим клеткам (нпАПК), способным к презентации одновременно до десяти или более различных пептидов, способам получения нпАПК и к способам использования указанных нпАПК для лечения рака. Краткое описание чертежей Фиг. 1: на фигуре графически представлено взаимодействие CD8+ клеток, известных также как цитотоксические Т-лимфоциты, с антигенпрезентирующими или клетками-мишенями, в данном случае опухолевыми клетками. Фиг. 2, планы А и В: указанная фигура представляет собой двухплановое графическое изображение механизмов цитоза, опосредованного лимфоцитами. Фиг. 3: на данной фигуре показаны результаты эксперимента, в котором испытывалось несколько различных пептидов в конкурентном анализе для идентификации соединений, связывающих пептиды,которые могли бы использоваться для введения множества пептидов в клетки Drosophila, экспрессирующие пустые молекулы класса I человека. Фиг. 4, планы А-С: на данной фигуре показан результат эксперимента, в котором три меланомных пептида исследуют на способность повышать уровень ЦТЛ при добавлении их в качестве единственных эпитопов в клетки Drosophila. У одного донора активность ЦТЛ проявилась к каждому из пептидов, в случае их добавления к трем разным препаратам Drosophila. Специфичность ответа сравнивается с контрольным НВс пептидом, представляющим собой высокоаффинный связывающий фактор. Фиг. 5, планы А-С: на данной фигуре показан результат серии экспериментов, в которых к каждой клетке Drosophila добавляют до четырех разных пептидов. ЦТЛ активность для каждого из представленных пептидов отмечается после трехнедельной стимуляции и графически изображена на данном чертеже. Фиг. 6, планы А-С: на фигуре показана активность ЦТЛ после проведения трех различных процедур первичной стимуляции in vitro. Фиг. 7, планы А и В: на фигуре показана сравнительная способность клеток Drosophila и дендритных клеток вырабатывать ЦТЛ ответ на единичный пептидный эпитоп в результате осуществления процедур стимуляции. Фиг. 8: на данной фигуре показано, что дендритные клетки, проявляющие либо зрелый, либо незрелый фенотип, не столь эффективны, как клетки Drosophila с точки зрения вырабатывания специфических ЦТЛ ответов в случае использования определенных пептидов для стимуляции клеток. Фиг. 9, планы А-С: на данной фигуре показана ЦТЛ активность, вызываемая единственным донором в трех разных процедурах стимуляции in vitro, в случае презентации четырех пептидов. Фиг. 10: на данной фигуре показана ЦТЛ активность, вырабатываемая к десяти пептидам, введенным в клетки Drosophila. Фиг. 11: на данной фигуре показана пептидсвязывающая способность HER-2 пептидов (826, 835,861 и 863) в клетках Drosophila, трансфицированных человеческой молекулой HLA-A2.1 класса I. Фиг. 12: на данной фигуре показаны противопептидный и противоопухолевый ответ в случаеMART-1 специфичных эффекторных клеток. В Т 2 клетки был введен MART-1 пептид или отрицательный контроль (НВс). Malme3M представляет собой линию меланомы, а Malme3 представляет собой неопухолевую клеточную линию. Фиг. 13, планы А и В: на данной фигуре показано тетрамерное окрашивание HER-2-специфичныхCD8 эффекторных клеток от двух разных доноров. Фиг. 14: на данной фигуре показан ответ на пептид HER-2 эффекторных клеток, оцениваемый в Т 2 клетках, несущих пептид. Фиг. 15, планы А-D: на данной фигуре показана повышенная гибель клеток клеточной линии опухоли яичника (НТВ-77) при трансфекции HLA-А 2.1. Фиг. 16: на данной фигуре показана повышенная гибель клеток клеточной линии рака молочной железы (НТВ-133) при трансфекции HLA-A2.1. Фиг. 17: на данной фигуре показана необходимость предварительной обработки -интерфероном для достижения лизиса клеток опухолевой клеточной линии НТВ-77/А 2.1. Фиг. 18, планы А и В: на данном графике показано, что поверхностная экспрессия HLA-A2 и HER-2 не затрагивается индукцией -интерфероном в двух клеточных линиях (НТВ-77 и НТВ-77/А 2.1). Фиг. 19: на данном графике показано, для какого белка повышается уровень мРНК в клетках НТВ 77/А 2.1 после индукции -интерфероном. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему:a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул, ассоциированных с раком,предпочтительно примерно десять разных пептидных молекул одновременно, причем каждый пептид составляет примерно шесть-двенадцать аминокислот в длину, предпочтительно от восьми до десяти аминокислот в длину, и присутствует в диапазоне концентраций примерно от 10 нМ до примерно 100 мкМ;b) сбор CD8+ клеток у указанного субъекта или подходящего донора;c) стимуляцию указанных CD8+ клеток указанной клеточной линией нпАПК;d) добавление указанных CD8+ клеток в среду, которая содержит цитокин, такой как ИЛ-2, ИЛ-7,или в подходящую ростовую среду (CGM), содержащую предпочтительно ИЛ-2 или сочетание ИЛ-2 и ИЛ-7;e) смешивание несуспендированных моноцитов периферической крови или, альтернативно, моноцитов периферической крови, истощенных по CD8+, собранных у указанного субъекта или подходящего донора, с примерно 10-50 мкг/мл пептида;f) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови достаточной дозой гаммаизлучения, необходимой для предупреждения пролиферации указанных клеток в суспензии, такой как доза в диапазоне примерно 3000-7000 рад, предпочтительно примерно 5000 рад, и альтернативно, суспензия моноцитов периферической крови может быть обработана цитостатическими средствами, включающими митомицин С, но которые не ограничиваются им;g) выделение прилипших моноцитов периферической крови;h) внесение к указанным прилипшим моноцитам периферической крови примерно 10 нг/мл 10 мкг/мл каждого из указанных пептидов;i) объединение указанных CD8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять CD8+ клеток к одному моноциту периферической крови;j) необязательную стимуляцию указанной объединенной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение примерно шести-семи дней;k) необязательную стимуляцию указанной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;l) необязательное тестирование суспензии CD8+ клеток на соответствующую ЦТЛ активность и необязательную оценку ЦТЛ на чистоту, стерильность и содержание эндотоксина; иm) прививание CD8+ суспензии указанному субъекту. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака у субъекта, включающему:a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул, ассоциированных с раком,предпочтительно примерно десять пептидов одновременно, причем каждый пептид составляет примерно от восьми до десяти аминокислот в длину;c) стимуляцию указанных CD8+ клеток указанной клеточной линией нпАПК в течение шести-семи дней;e) смешивание моноцитов периферической крови, собранных у указанного субъекта, примерно сf) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови, истощенных по CD8+, гаммаизлучением в 5000 рад;g) выделение прилипших моноцитов периферической крови;h) введение в указанные прилипшие моноциты периферической крови примерно 10 мкг/мл указанного эпитопа;i) объединение указанных CD8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять CD8+ клеток к одному моноциту периферической крови;j) стимуляцию указанной объединенной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение примерно шести-семи дней;k) стимуляцию указанной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;l) тестирование суспензии CD8+ клеток на подходящую ЦТЛ активность, чистоту, стерильность и содержание эндотоксина иm) прививание CD8+ суспензии указанному субъекту. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения меланомы у субъекта, включающему:a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул, ассоциированных с меланомой,предпочтительно примерно десять пептидов одновременно, причем каждый пептид составляет примерно от восьми до десяти аминокислот в длину;c) стимуляцию указанных CD8+ клеток указанной нпАПК клеточной линии в течение примерно шести-семи дней;e) смешивание моноцитов периферической крови, собранных у указанного пациента, примерно с 20 мкг/мл каждого из указанных пептидов, которые указанная нпАПК может презентировать;f) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови, истощенных по CD8+, гаммаизлучением в дозе примерно 5000 рад;g) выделение прилипших моноцитов периферической крови;h) введение в указанные прилипшие моноциты периферической крови примерно 10 мкг/мл указанного эпитопа;i) объединение указанных CD8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять CD8+ клеток к одному моноциту периферической крови;j) стимуляцию указанной объединенной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение шести-семи дней;k) стимуляцию указанной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови с использованием ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;l) тестирование суспензии CD8+ клеток на соответствующую ЦТЛ активность, чистоту, стерильность и содержание эндотоксина иm) прививание CD8+ суспензии указанному субъекту. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения меланомы при том, что нпАПК презентирует следующие пептиды: тирозиназа 369-377, тирозиназа 207-216, gp100209-217,gp100154-162, MART-127-35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, С-лектин 8-16, Рес 6020-29 и Рес 6025-33. Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания или болезненного состояния, которые приводят к развитию недостаточности или неадекватности иммунной реакции, что в норме связано с HLA молекулами класса I, при котором в результате указанного лечения удаляются инфицированные или трансформированные клетки, что достигается под действием ЦТЛ. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания или болезненного состояния; которые проводят к развитию недостаточности или неадекватности иммунной реакции, что в норме связано с HLA молекулами класса I, при котором инфицированные или трансформированные клетки, которые, как было показано, подвергаются удалению под действием ЦТЛ, обрабатывают способом, включающим:a) получение неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии (нпАПК), которая способна презентировать примерно до пятнадцати различных пептидных молекул, ассоциированных с указанным заболеванием или болезненным состоянием, предпочтительно примерно десять разных пептидных молекул одновременно, причем каждый пептид составляет примерно от шести до двенадцати аминокислот в длину, предпочтительно примерно от восьми до десяти аминокислот в длину и присутствует в диапазоне концентраций примерно от 10 нМ до 100 мкМ;b) сбор CD8+ клеток у указанного субъекта или подходящего донора;c) стимуляцию указанных CD8+ клеток указанной нпАПК клеточной линией;e) смешивание несуспендированных моноцитов периферической крови или, альтернативно, моноцитов периферической крови, истощенных по CD8+, собранных у указанного субъекта или подходящего донора, примерно с 10-50 мкг/мл пептида;f) облучение указанной суспензии моноцитов периферической крови достаточной дозой гаммаизлучения, необходимой для стерилизации компонентов суспензии, за исключением желательных моноцитов периферической крови, такой, как доза в диапазоне от примерно 3000 до примерно 7000 рад, предпочтительно примерно 5000 рад;g) выделение прилипших моноцитов периферической крови;h) введение в указанные прилипшие моноциты периферической крови примерно 10 нг/мл-10 мкг/мл каждого из указанных пептидов;i) объединение указанных CD8+ клеток с указанными прилипшими моноцитами периферической крови в соотношении примерно десять CD8+ клеток к одному моноциту периферической крови;j) необязательную стимуляцию указанной объединенной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови в течение примерно шести-семи дней;k) необязательную стимуляцию указанной суспензии CD8+ клеток и моноцитов периферической крови и использование ИЛ-2 и ИЛ-7 в среде;l) необязательное тестирование суспензии CD8+ клеток на подходящую ЦТЛ активность, и необязательное тестирование на ЦТЛ чистоту, стерильность и содержание эндотоксина; иm) прививание CD8+ суспензии указанному субъекту. Настоящее изобретение также относится к неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии(нпАПК), полученной из клеток Drosophila melanogaster, трансфицированных ДНК, кодирующей человеческие HLA-антигены класса I, связывающие и совместно стимулирующие молекулы для их экспрессии,причем указанная нпАПК способна к презентации до пятнадцати различных пептидных молекул, предпочтительно десяти пептидных молекул. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к нпАПК, которая презентирует пептиды, ассоциированные с различными желательными функциями, которые повышают эффективность лечения субъекта. Так, например, в дополнение к пептидам, ассоциированным с заболевание или болезненным состоянием, которое предстоит лечить, нпАПК может презентировать пептиды, ассоциированные с дополнительными молекулами, такими как антигены, связанные с функцией лимфоцитов (LFA-1,LFA-2 и LFA-3), фактор межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), Т-клеточные совместно стимулирующие факторы (CD2, CD28, В 7), которые повышают межклеточную адгезию или передают дополнительные сигналы клеточной активации. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к нпАПК, которая презентирует пептиды, ассоциированные с несколькими типами рака. Так, например, пептиды, ассоциированные с полипептидом, связанным с раком молочной железы, таким как HER-2/neu, или полученные из него, могут быть презентированы с пептидами, ассоциированными с полипептидом, связанным с меланомой, таким как MART-1 или MAGE, или полученными из него. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу производства неприродной антигенпрезентирующей клетки (нпАПК), способной презентировать до десяти разных пептидных молекул одновременно, включающему стадии:a) получение клеточной линии насекомых из яиц Drosophila melanogaster; альтернативно получение клеточной линии насекомых для экспрессии молекул МНС человека класса I и совместно стимулирующих молекул адгезии;b) выращивание указанных клеток насекомых в среде, подходящей для роста клеток насекомых,предпочтительно на среде Шнейдера для дрозофил (Schneider Drosophila Medium);c) создание плазмиды pRmHa-3 на основе вектора экспрессии pRmHa-1, где указанная плазмидаpRmHa-3 включает промотор металлотионеина, консенсусные последовательности реакции на металл и ген алкогольдегидрогеназы, несущий сигнал полиаденилирования, выделенный из DrosophilaA2.1, В 7.1, В 7.2, ICAM-1, -2-микроглобулин и LFA-3, где А 2.1 может быть замещен любой последовательностью ДНК класса I человека;e) трансфекцию указанных клеток насекомых плазмидой phshneo и указанной плазмидой pRmHa-3,содержащей комплементарную ДНК, иf) создание нпАПК путем контактирования указанных клеток насекомых с CuSO4 для индукции экспрессии трансфицированных генов в указанных клетках насекомых. Клетки насекомых согласно настоящему изобретению выращивают в среде, подходящей для культивирования клеток насекомых, которая будет ниже называться "среда для выращивания насекомых". Такая среда для выращивания насекомых коммерчески доступна от множества производителей и вклю-4 013944 чает такие, как среда Шнейдера для культивирования дрозофил (Schneider Drosophila Medium), среда Грейса для культивирования насекомых (Grace's Insect Media) и среда ТС-100 для культивирования насекомых (ТС-100 Insect Media). Альтернативно, среды для выращивания насекомых могут быть приготовлены любым специалистом в данной области. В типичном случае среды включают компоненты, необходимые для стимулирования и поддержания роста клеток насекомых, такие как неорганические соли (например, хлорид кальция, сульфат магния, хлорид калия, фосфат калия, бикарбонат натрия, хлорид натрия и фосфат натрия), аминокислоты, различные углеводы и иные химические компоненты (Imogene Schneider, Exp. Zool. (1964) 156(1): pg. 91). Альтернативно, среды могут также включать витамины, минералы и другие компоненты, которые способствуют росту клеток насекомых. Ниже приведен перечень сокращений и определений, используемых в настоящем описании. Сокращения Ниже приводится перечень сокращений, используемых в настоящем описании для обозначения различных пептидных эпитопов. Индивидуальные аминокислотные остатки идентифицируются в соответствии с однобуквенным кодом, который хорошо известен и используется специалистами в данной области. Сокращения, используемые для обозначение пептидных эпитопов. В контексте настоящего описания термин "тирозиназа 369-377" или "тирозиназа 369-377" относится к аминокислотной последовательности YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1). Указанное определение также включает пептид с последовательностью YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 2), который образуется в результате посттрансляционного процесса, модифицирующего аминокислотный остаток "N" в последовательности YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1) на "D", что дает аминокислотную последовательность YMDGTMSQV(SEQ ID NO: 2) (Skipper et al., J. Exp. Med. (1996) 183:527-534). Используемый также в настоящем описании термин "тирозиназа 207-216" или "тирозиназа 207-216" относится к аминокислотной последовательности FLPWHRLFLL (SEQ ID NO: 3). Используемый также в настоящем описании термин "gp100 209-217" или "gp100209-217" относится к аминокислотной последовательности ITDQVPFSV (SEQ ID NO: 4). Используемый также в настоящем описании термин "gp100 154-162" или "gp100154-162 относится к аминокислотной последовательности KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 5). В контексте настоящего описания термин "MART-1 27-35" или "MART-127-35" относится к аминокислотной последовательности AAGIGILTV (SEQ ID NO: 6). В контексте настоящего описания термин "HER-2/neu 789-797" или "HER-2/neu789-797 относится к аминокислотной последовательности CLTSTVQLV (SEQ ID NO: 7). В контексте настоящего описания термин "HER-2/neu 369-377" или "HER-2/neu369-377 относится к аминокислотной последовательности KIFGSLAFL (SEQ ID NO: 8). В контексте настоящего описания термин "С-лектин 8-16" или "С-лектин 8-16" относится к аминокислотной последовательности KMASRSMRL (SEQ ID NO: 9). В контексте настоящего описания термин "Рес 60 20-29" или "Рес 6020-29" относится к аминокислотной последовательности ALALAALLVV (SEQ ID NO: 10). В контексте настоящего описания термин "Рес 60 25-33" или "Рес 6025-33" относится к аминокислотной последовательности ALLVVDREV (SEQ ID NO: 11). В контексте настоящего описания термин "CD8 пептид 59-70" или "CD8 пептид 59-70" относится к аминокислотной последовательности AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO: 12). Термины и определения В контексте настоящего описания термин "адоптивная иммунотерапия" относится к введению донорных или аутологичных Т-лимфоцитов для лечения заболевания или болезненного состояния, которые возникают в результате недостаточности или неадекватности иммунного ответа, который в норме ассоциирован с молекулами HLA класса I. Адоптивная иммунотерапия представляет собой подходящее лечение для любого заболевания или болезненного состояния, при котором устранение инфицированных или трансформированных клеток достигается под действием ЦТЛ. Рассматриваемые заболевания или болезненные состояния включают, например, не ограничиваясь приведенным списком, рак и/или опухоли, такие как меланома, рак предстательной железы, молочной железы, колоректальный, желудка, горла и шеи, поджелудочной железы, шейки матки, яичников, костей, лейкоз, а также рак легкого; вирусные инфекции, такие как гепатит В, гепатит С, вирус иммунодефицита человека; бактериальные инфекции,такие как туберкулез, лепра и листериоз; и паразитические инфекции, такие как малярия. В контексте настоящего описания термин "В 7.1" относится к совместно стимулирующей молекуле,ассоциированной с антигенпрезентирующими клетками. В контексте настоящего описания термин "BCNU" относится к кармустину, также известному как 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина. В контексте настоящего описания термин "BSE" относится к спонгиформному энцефалиту быка. В контексте настоящего описания термин "CD" относится к кластерам дифференциации Тлимфоцитов (в исходном варианте), В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и гранулоцитов, объединенным на основании антигенных эпитопов и функций. В контексте настоящего описания термин "DTIC" относится к дакарбазину 5-(3,3-диметил-1 триазено)имидазол-4-карбоксамиду. В контексте настоящего описания термин "ex vivo" или "терапия ex vivo" относится к способу терапии, при которой биологический материал, обычно клетки, получают от пациента или соответствующего альтернативного источника, такого как подходящий донор, и модифицируется таким образом, что полу-6 013944 чаемые модифицированные клетки могут использоваться для лечения патологического состояния, которое может быть улучшено в ходе длительного или постоянного сохранения терапевтического воздействия модифицированных клеток. Лечение включает повторное введение модифицированного биологического материала пациенту, полученного либо от пациента, либо из альтернативного источника. Польза терапии ex vivo состоит в реализации полезного потенциала лечения пациента без необходимости подвергать указанного пациента нежелательному побочному эффекту лечения. Так, например, цитокины зачастую вводят пациентам, больным раком или вирусными инфекциями, для стимуляции распространения ЦТЛ у пациента. Однако цитокины часто вызывают развитие гриппоподобных симптомов у пациентов. В рамках процедуры ex vivo цитокины используют для стимуляции распространения ЦТЛ за пределами организма пациентов, и пациент лишь в незначительной степени подвергается воздействию побочных эффектов цитокинов. Альтернативно, в соответствующих ситуациях или состояниях, когда это приемлемо и когда рассматриваемый субъект может получить при этом пользу, такого субъекта подвергают лечению одновременно низкими малыми дозами -интерферона, -интерферона и/или ИЛ-2. Ожидаемый эффект интерферонов состоит в возможной сенсибилизации раковых клеток к лизису антигенспецифичными ЦТЛ, а эффект ИЛ-2 имеет отношение к возможному повышению персистенции антигенспецифических ЦТЛ. В контексте настоящего описания термин "HEPES" относится к буферу на основе N-2 гидроксиэтилпиперазин-N'2-этансульфоновой кислоты. В контексте настоящего описания термин "HLA-A2.1" относится к молекулам HLA класса I, обнаруженным примерно у 45% представителей белой расы. В контексте настоящего описания термин "MART-1" или "меланомный антиген, распознаваемый Тклетками-1" относится к антигену, ассоциированному с меланомой. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты, как и различные характеристики данного антигена,описаны в патенте США 5994523, опубликованном 30 ноября 1999 г. и озаглавленном "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods", в патенте США 5874560, опубликованном 23 февраля 1999 г. и озаглавленном "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods", и в патенте США 5844075, опубликованном 1 декабря 1998 г. и озаглавленном "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods". В частности, в патенте США 5994523 раскрывается полноразмерная последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность MART-1, показанные на фиг. 1 как последовательность SEQ ID NO: 1 и последовательность SEQID NO: 2 соответственно. Указанная фиг. 1 включена в настоящее описание в качестве ссылки. В контексте настоящего описания термин "MAGE" относится к антигену, ассоциированному с меланомой. Аминокислотная последовательность и последовательность нуклеиновой кислоты, а также характеристики данного антигена описаны в патенте США 6140050, опубликованном 31 октября 2000 г. и озаглавленном "Methods for Determining Breast Cancer and Melanoma by Assaying for a Plurality of Antigen Associated Therewith", в патенте США 5759783, опубликованном 2 июня 1998 г. и озаглавленномLymphocytes in Humans Using Synthetic Peptide Epitopes". В контексте настоящего описания термин "МРС-10" относится к концентратору магнитных частиц. В контексте настоящего описания термин "NK клетки" относится к естественным киллерным клеткам. В контексте настоящего описания термин "OKT3" относится к ORTHOCLONE OKT3, muromonabCD3, моноклональному антителу против CD3. В контексте настоящего описания термин "ТАР-1,2" относится к переносчику, ассоциированному с процессингом антигеном-1,2. В контексте настоящего описания термин "Th клетки" относится к хелперным Т-клеткам, CD4+. В контексте настоящего описания термин "тирозиназа" относится к белку, ассоциированному с меланомой (Brichard et al., J. Exp. Med. (1993), 178:489-495; Robbins et al., Cancer Res. (1994), 54: 3124-3126). В патенте США 5843648, опубликованном 1 декабря 1998 г. и озаглавленном "Р 15 and TyrosinaseMelanoma Antigen and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods", раскрываются антигенные пептиды и ассоциированные с ними полинуклеиновые кислоты, родственные тирозиназе, приведенные на фиг. 7, планы A-D, и указанный выше рисунок также включен в настоящее описание в качестве иллюстративного материала. В патенте США 5487974, опубликованном 30 января 1996 г. и озаглавленном"Method for Detecting Complexes Containing Human Leukocyte Antigen A2 (HLA-A2) Molecules and a Tyrosinase Derived Peptide on Abnormal Cells", в примере 9, табл. 3 описан дополнительный пептид, ассоциированный с тирозиназой и меланомой, и указанные пример и таблица включены в настоящее описание в качестве ссылки. В контексте настоящего описания термин "gp100" относится к меланомному антигену, распознаваемому опухолеинфильтрующими лимфоцитами (ОИЛ). ОИЛ, распознающий gp100, ассоциирован с отторжением опухоли in vivo (Bakker et al., J. Exp. Med. (1994) 179: 1005-1009; Kawakami et al., J. Immunol. (1995) 154: 3961-3968). Антигенные пептиды, родственные gp100, раскрыты в патенте СШАgp100 последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность, приведенные на фиг. 4 и 5 соответственно. Описаны также антигенные пептиды, полученные из аминокислотных последовательностей, включая те последовательности, которые идентифицированы как SEQ ID NO: 27, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40 и 41. Все указанные выше результаты, показанные как фиг. 4 и 5, и пептиды, идентифицированные под соответствующими номерами SEQ ID NO, включены в настоящее описание в качестве ссылки. В контексте настоящего описания термин "меланома" относится, не ограничиваясь приведенным списком, к меланомам, метастазирующим меланомам, меланомам, полученным из меланоцитов либо из родственным меланоцитам невусных клеток, меланосаркомам, меланокарциномам, меланоэпителиомам,in situ поверхностно распространяющейся меланоме, узелковой меланоме, меланоме, протекающей по типу злокачественного лентиго, акральной лентигинозной меланоме, инвазивной меланоме или семейному атипичному пигментному невусу и меланомному синдрому (FAM-M). Такие меланомы у млекопитающих могут быть вызваны хромосомными аномалиями, дегенеративными нарушениями роста и развития, митогенными средствами, ультрафиолетовым облучением (UV), вирусными инфекциями, несоответствующей экспрессией гена в тканях, изменением экспрессии гена и презентации на клетке или канцерогенными агентами. Указанные выше меланомы могут быть диагностированы, оценены или подвергнуты лечению с использованием способов, описанных в настоящем изобретении. В контексте настоящего описания термин "С-лектин" относится к пептиду с последовательностью,которая, как было обнаружено, ассоциирована с раком яичников. В контексте настоящего описания термин "главный комплекс гистосовместимости" или "МНС" представляет собой родовое обозначение, относящееся к системе гистосовместимости антигенов, описанной у разных видов и включающей систему общих антигенов лейкоцитов человека (HLA). В контексте настоящего описания термины "эпитоп", "пептидный эпитоп", "антигенный пептид" и"иммунногенный пептид" относятся к пептиду, полученному из антигена, способного вызывать клеточную иммунную реакцию у млекопитающего. Такие пептиды могут также реагировать с антителами животных, иммунизированных пептидами. Указанные пептиды могут составлять от пяти до двадцати аминокислот в длину, предпочтительно восемь-пятнадцать аминокислот в длину и наиболее предпочтительно примерно девять-десять аминокислот в длину. В контексте настоящего описания термин "Рес 60" относится к пептиду с последовательностью, которая, как было показано, ассоциирована с раком яичника и молочной железы. В контексте настоящего описания термин "аналог" включает любой полипептид, имеющий последовательность аминокислотных остатков, по существу, идентичную последовательностям согласно настоящему изобретению, показанным в настоящем описании, но в которых по одному или большему числу остатков произведено консервативное замещение функционально близким остатком и которые демонстрируют те соответствующие настоящему изобретению функциональные особенности, которые описаны в данном изобретении. Примеры консервативных замещений включают замещения неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим остатком, замещение одного полярного (гидрофильного) остатка другим остатком, такого, например, остатка, как остаток, расположенный между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, между глицином и серином, замещение одного основного остатка, такого как лизин, аргинин или гистидин другим остатком, или замещение одного кислого остатка, такого как аспарагеновая кислота или глутаминовая кислота или др. В контексте настоящего описания термин "консервативное замещение" включает также использование химического производного остатка вместо недериватизированного остатка. В контексте настоящего описания термин "химическое производное" относится к полипептиду по настоящему изобретению, который содержит один или более производных входящих в него остатков,полученных путем химической реакции функциональной боковой группы. Примеры таких производных молекул включают, например, те молекулы, в которых свободные аминогруппы были дериватизированы с образованием гидрохлоридов амина, п-толуолсульфоновых групп, карбобензоксигрупп, тбутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватизированы с образованием солей, метиловых и этиловых эфиров или других типов сложных эфиров или гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы с образованием О-ацильных или О-алкильных производных. Имидазольный азот в гистидине может быть дериватизирован с образованием N-им-бензилгистидина. Настоящее описание включает также в качестве химических производных такие белки или пептиды, которые содержат одно или более производных природных аминокислот из числа двадцати стандартных аминокислот. Так, например, 4 гидроксипролин может быть замещен пролином; 5-гидроксилизин может быть замещен лизином; 3 метилгистидин может быть замещен гистидином; гомосерин может быть замещен серином и орнитин-8 013944 может быть замещен лизином. Белки или полипептиды согласно настоящему изобретению также включают любой полипептид, содержащий одну или более вставок и/или делеций или несущий остатки, родственные последовательности полипептида, последовательность которого кодируется соответствующей нуклеиновой последовательностью согласно настоящему изобретению, при условии, что поддерживается необходимая активность. В контексте настоящего описания термин "HER-2/neu" относится к онкогену, который экспрессирует или сверхэкспрессирует один или более связанных с мембраной рецептор-подобных онкогенных белков. В число тех видов рака, которые, как было показано, ассоциированы с экспрессией или сверхэкспрессией HER-2/neu, входят некоторые виды рака молочной железы, желудка, яичников, толстого кишечника и слюнной железы. Онкоген HER-2/neu является членом тирозинпротеинкиназного семейства онкогенов и характеризуется высокой степенью гомологии с рецептором эпидермального фактора роста(EGFR). Было показано, что HER-2/neu играет определенную роль в росте и/или дифференциации клеток. Оказалось, что HER-2/neu индуцирует злокачественность посредством количественных механизмов,которые связаны с повышением или дерегуляцией экспрессии, по существу, нормального генного продукта. В патенте США 6075122, опубликованном 13 июня 2000 г. и озаглавленном "Immune Reactivityto HER-2/neu Protein for Diagnosis and Treatment of Malignancies in Which the HER-2/neu Oncogene is Associated", раскрываются пептиды, которые демонстрируют Т-клеточный ответ по типу CD8+ (колонка 12,строка 31 - колонка 13, строка 7), идентифицированные номерами SEQ ID, и указанная работа включена в настоящее описание в качестве ссылки.HER-2/neu (р 185) представляет собой белковый продукт онкогена HER-2/neu. Ген HER-2/neu амплифицируется и белок HER-2/neu сверхэкспрессируется при многих видах рака, включая рак молочной железы, яичников, толстого кишечника, легкого и предстательной железы. HER-2/neu связан со злокачественной трансформацией. Он обнаружен в 50-60% карцином протоков in situ и в 20-40% всех видов рака молочной железы, а также значительной части аденокарцином, возникающих в яичниках, предстательной железе, толстом кишечнике и легком. HER-2/neu тесно связан не только со злокачественным фенотипом, но также с агрессивностью злокачественного роста и обнаруживается в одной четверти всех инвазивных видов рака молочной железы. Сверхэкспрессия HER-2/neu коррелирует с плохим прогнозом, как в случае рака молочной железы, так и в случае рака яичников. HER-2/neu представляет собой трансмембранный белок с относительной молекулярной массой 185 кДа, который составляет примерно 1255 аминокислот в длину. Он имеет домен внеклеточного связывания (ДВС) размером примерно 645 аминокислот при наличии 40% гомологии с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), высоко гидрофобным трансмембранным якорным доменом (ТМД), и цитоплазматический домен (ЦД) на карбоксильном конце размером примерно 580 аминокислот при наличии 80% гомологии с EGRF. Проводимые исследования с включением в них онкогенов позволили идентифицировать по меньшей мере сорок онкогенов, действующих в злокачественных клетках и ответственных за трансформацию или связанных с трансформацией. Онкогены были классифицированы по различным группам на основании предполагаемой функции или локализации их генных продуктов (таких как белки, экспрессируемые онкогеном). Считается, что онкогены являются необходимыми также для некоторых аспектов нормальной физиологии клеток. Рак продолжает оставаться основной проблемой здравоохранения, несмотря на значительный прогресс, сделанный в области его лечения. Стандартные режимы лечения, такие как химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое вмешательство и объединение указанных трех форм, зачастую не способны привести к длительному излечиванию. Во многих случаях раковый больной подвергается лечению, которое часто по истечении некоторого периода времени дает рецидивы болезненного состояния и дополнительным усложнением проблемы является тяжесть таких методов лечения для пациента. В случае меланомы при использовании традиционной химиотерапии не удается достичь излечивания метастазирующей меланомы. При использовании комбинированной химиотерапии по Дартмоуту (Dartmouth) (DTIC, цисплатина, BCNU и тамоксифен) отмечается ответная реакция у 35-50%, но длительность выживания остается лишь от шести до десяти месяцев. В случае активной химиотерапии "дозой высокой интенсивности" отмечается высокий уровень ремиссии, а в случае трансплантации аутологичного костного мозга - истощение гемапоэза. И тем не менее, средняя длительность выживания сохраняется короткой, примерно четыре месяца. Розенберг (Rosenberg) и сотрудники попытались использовать инфузию активированных лимфоцитов в качестве варианта лечения различных видов рака. Вначале используют лимфокинактивированные клетки-киллеры (ЛАК-клетки) и затем опухолеинфильтрующие лимфоциты (ОИЛ), активированные exvivo ИЛ-2, но при этом не было получено четких доказательств достигаемой эффективности. Фактически, контролируемые клинические испытания не выявили преимуществ использования ex vivo активированных клеток в сравнении с прямым введением ИЛ-2 пациенту. Таким образом, эффект терапии ЛАКклетками и ОИЛ был незначительным, а побочные эффекты в типичном случае были столь тяжелыми,что во многих испытаниях пришлось прекратить лечение преждевременно. Исследования на моделях опухоли мышей показали, что адоптивная иммунотерапия путем иммунизации Т-клетками in vivo, специфичными к опухолевому(ым) антигену(ам), очень эффективна и характе-9 013944 ризуется минимальной токсичностью. Основным препятствием в применении указанной стратегии для лечения опухолей человека является идентификация иммуногенных антигенов, которые придают опухолевым клеткам подверженность к разрушению, опосредованную цитотоксическими Т-лимфоцитами(ЦТЛ). Выделение опухолереактивных Т-клеток от пациентов с меланомой позволило идентифицировать некоторые опухолевые антигены (эпитопы), против которых нацеливаются ЦТЛ. Они включают тирозиназу (Brichard et al., J. Exp. Med. (1993), 178:489-495; Robbins et al., Cancer Res. (1994), 54: 3124-3126),MART/1 Melan A (Kawakami et al., J. Exp Med. (1994) 180: 347-352), gp100 (Bakker et al., J. Exp. Med.Med. (1994), 179:921-930). Из приведенного перечня тирозиназа и MART-1 почти повсеместно экспрессируются при меланомах и таким образом могут стать логическим выбором для проведения адоптивной иммунотерапии. В последние годы у небольшого процента пациентов с меланомой, подвергавшихся иммунологическому лечению, отмечается значительное улучшение выживания, порядка нескольких лет. Такие достижения связаны с активной специфической иммунотерапией с использованием "раковых вакцин", а также неспецифических усилителей иммунной системы, таких как цитокины, например ИЛ-2, -интерферон и-интерферон. Однако благоприятный эффект цитокинов снижается за счет побочных эффектов, которые сопровождают их использование, таких как тошнота и лихорадочное состояние. Цитолитические Т-клетки (CD8+) представляют собой основную линию защиты против вирусных инфекций. CD8+ лимфоциты специфически распознают и уничтожают клетки-хозяев, которые инфицированы вирусом. Теоретически в этом может заключаться возможность стимулировать иммунную систему для борьбы с другими видами заболеваний, включая рак. Однако доступно лишь несколько in vitro/exvivo процедур для специфической активации ЦТЛ. Идентификация указанных выше ключевых меланомных антигенов и наличие способа специфической активации ЦТЛ in vitro, который будет описан далее,позволяют рассмотреть концепцию адоптивной иммунотерапии метастазирующей меланомы. Все "наивные" Т-клетки требуют двух сигналов для активации и проявления иммунного ответа. В случае CD8+ лимфоцитов (ЦТЛ) первый сигнал, который определяет специфичность, включает презентацию CD8+ клетки иммуногенного пептидного фрагмента (эпитопа) антигена, связанного с комплексом МНС класса I (HLA), представленным на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Указанный комплекс специфически распознается рецептором Т-клеточного антигена (ТКР), который передает сигнал внутри клетки. Связывание с Т-клеточным рецептором необходимо, но недостаточно для индуцирования активации Т-клеток и обычно не ведет к клеточной пролиферации или секреции цитокина. Для полной активации требуется второй костимулирующий(е) сигнал(ы), и такие сигналы служат для дальнейшего усиления активирующего каскада. В число действующих на антигенпрезентирующих клетках костимулирующих молекул входят В 7 и молекулы клеточной адгезии (интегрины), такие как ICAM-1, которые способствуют протеканию указанного процесса за счет связывания с CD28 или LFA-1, соответственно, на Тклетке. Когда CD8+ взаимодействуют с антигенпрезентирующей клеткой, несущей иммуногенный пептид (эпитоп), связанный с молекулой МНС класса I при наличии взаимодействия с костимулирующей молекулой, CD8+ также становится полностью активированной цитолитической Т-клеткой. Опосредованное лимфоцитами уничтожение клеток включает последовательность биологических явлений, начинающихся со связывания ЦТЛ CD8+ с несущей антиген (опухолевой) клеткой в ходе процесса распознавания, описанного выше для случая Т-клеточной активации. Описанное выше взаимодействие между CD8+ клетками и антигенпрезентирующими клетками или(опухолевыми) клетками-мишенями проиллюстрировано на фиг. 1. Взаимодействие начинается со связывания антигена, находящегося в ассоциированном состоянии с молекулой МНС класса I на АПК или клетке-мишени, к рецептору Т-клеточного антигена (ТКР). Вспомогательные молекулы, такие как антигены функции лимфоцитов (LFA-1, LFA-2 и LFA-3), молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), а также совместно стимулирующие Т-клеточные факторы (CD2, CD28, В 7) повышают межклеточную адгезию или переносят дополнительные сигналы активации клетки. После межклеточного взаимодействия ЦТЛ уничтожает клетку-мишень за счет действия растворимых цитолитических медиаторов (перфорин и гранзимы, хранящиеся в цитоплазматических гранулах Тклетки) и молекулы на поверхности ЦТЛ (Fas-лиганд). После цитолиточеского воздействия клеткимишени погибают вследствие некроза (перфорация мембраны и разрушения органелл) или апоптоза(конденсация хроматина, фрагментация ДНК и образование пузырьков на мембране). Механизмы опосредованного лимфоцитами цитолиза графически представлены на фиг. 2. На плане А фиг. 2 видно, что после связывания с клеткой-мишенью цитоплазматические гранулы в ЦТЛ быстро переориентируются в направлении клетки-мишени для высвобождения гранул, содержащих перфорин и гранзимы, в межклеточное пространство. Указанные протеолитические ферменты образуют поры в плазматической мембране клетки-мишени, что постепенно приводит к некрозу клетки. На плане В видно,что после связывания с клеткой-мишенью уровень экспрессии Fas-лиганда на ЦТЛ повышается. Взаимодействие Fas-лиганда и Fas-рецептора в клетке-мишени ведет к апоптозу. В индукцию апоптоза включа- 10013944 ются протеазы, такие как СРР 32 и другие близкие ИЛ-1b-конвертирующему ферменту (ICE). Можно использовать природные антигенпрезентирующие клетки, например дендритные клетки, макрофаги, аутологичные опухолевые клетки, для активации CD8+ in vitro. Однако эффективность активации при таком подходе низка. Это связано с тем, что молекулы АПК класса I содержат многие другие типы пептидных эпитопов, кроме опухолевых эпитопов. Большинство пептидов происходит из нормальных безвредных клеточных белков, что приводит к разбавлению числа активных нативных АПК, которые должны бы фактически быть эффективными против опухоли (Allison et al., Curr. Op. Immunol. (1995) 7:682-686). Более прямой и эффективный подход к решению данной проблемы связан со специфической активацией CD8+ клеток с использованием только тех эпитопов, которые релевантны для борьбы с конкретным заболеванием (таким как рак), или опухолеспецифических антигенов (таких как антигены, специфичные для меланомы). В данном случае создается искусственная антигенпрезентирующая клетка путем экспрессии молекулы МНС класса I в клетках Drosophila melanogaster (фруктовая мушка). ПосколькуDrosophila не имеет иммунной системы, переносчики ТАР-1,2 пептида, нагружающие пептидные эпитопы молекул класса I, отсутствуют. В результате молекулы класса I появляются на поверхности клетокDrosophila как пустые сосуды. При инкубировании таких трансфицированных клеток Drosophila с экзогенными пептидами, которые связываются с молекулами класса I, такими как раковые или опухолеспецифичные эпитопы, включающими, без ограничения, специфичные к меланоме эпитопы, возможно заполнить каждую молекулу класса I указанным пептидом. Высокая плотность экспрессии молекул классаI, содержащих единичный пептид в указанных АПК Drosophila, позволяет генерировать in vitro цитотоксические Т-клетки CD8+, которые полностью специфичны к антигенному пептиду. Способы и процедуры получения клеток Drosophila описаны в патенте США 5529921, опубликованном 25 июня 1996 г. и озаглавленном "In Vitro Activation of Cytotoxic T-Cells Using Insect Cells Expressing Human Class I MHCof Assembling Empty Complexes and Methods of Making Said Cell Lines". В частности, в патенте США 5529921, в разделе от колонки 26, строка 56 до колонки 28, строка 22, описываются разные методы отделения и/или обогащения культур клеток предшественников. Указанная особенность дополнительно устраняет необходимость стимуляции иммунной системы invivo высокими дозами различных цитокинов. При этом результат лечения достигается раньше, чем побочные эффекты, вызываемые цитокином. Альтернативно, в соответствующих ситуациях или при условиях, когда это приемлемо и когда субъект может получить пользу, указанный субъект может быть подвергнут лечению одновременно дозами -интерферона, -интерферона и/или ИЛ-2 на низком уровне. Устранение необходимости стимуляции in vivo цитокинами дает улучшение качества лечения пациента. Методы лечения, которые включают введение пациенту цитокинов, зачастую приводят к развитию у пациентов гриппоподобных симптомов, таких как тошнота, рвота и лихорадочное состояние. Указанные побочные реакции обычно не является жизнеугрожающими, хотя у пациентов, которые уже находились в ослабленном состоянии, развивается особенно тяжелая реакция, что может привести к ситуации, опасной для жизни. Другой аспект связан с неблагоприятным воздействием таких побочных реакций на восприятие и приемлемость метода лечения, который оказывал бы в ином случае полезное воздействие. Устранение необходимости стимуляции in vivo цитокинами приводит к такому варианту метода лечения, который улучшает комфортность для пациента и предлагает клиницисту эффективный способ лечения, который более подходит пациенту. Применимость данного способа адоптивной иммунотерапии опухоли была продемонстрирована на мышах с использованием клеток Drosophila, трансфицированных АПК и CD8+ клетками из 2 С линии Тклеточного рецептора (ТКР) трансгенных мышей. В данной системе очищенные CD8+ из 2 С клеток являются высоко реакционноспособными in vitro на пептиды, презентируемые МНС класса I в (Ld)трансфицированных клетках Drosophila, также несущими костимулирующие молекулы В 7-1 и ICAM-1. Трансфицированные клетки Drosophila используют в качестве зонда для определения минимальных потребностей с целью стимуляции не примированными CD8+ Т-клетками (Cai et al., P.N.A.S. USA (1996) 93:14736-14741). Альтернативно, в том случае, когда неотделенные клетки селезенки мышей используют в качестве клеток-респондеров вместо очищенных 2 С клеток, потребность в костимулирующих молекулах отпадает. В данном случае CD8+ в популяции клеток селезенки получают "стимул" костимуляции от активированных В-клеток. Использование данного факта позволило показать, что клетки Drosophila,(Ld)-трансфицированные МНС класса I, способны индуцировать нормальные клетки селезенки мышейDBA/2 для ответа на сингенные опухолеспецифичные пептиды мастоцитомы Р 815 in vitro в отсутствие добавляемых лимфокинов. Инъекция указанных ЦТЛ в мышей линии DBA/2, имеющих мастоцитому Р 815, ведет к быстрой регрессии опухоли (Sun et al. Immunity (1996) 4:555-564). Методика состоит в том, что нормальные клетки селезенки мышей DBA/2 культивируют in vitro с клетками Drosophila, (Ld)-трансфицированными МНС класса I, содержащим пептид PIA.35-43, опухолеспецифичный эпитоп клеточной линии мастоцитомы Р 815, полученной из DBA/2. Как видно из фиг. 3,- 11013944 план А, лимфоциты, собранные из пятидневной культуры, демонстрируют мощную цитотоксическую Тлимфоцитарную (ЦТЛ) активность (ЦТЛ) в отношении опухолевых клеток Р 815 in vitro, но не способны лизировать Р 1024, мутантную клеточную линию Р 815, которая не экспрессирует PIA.35-43. Когда указанные ЦТЛ инъецируют мышам DBA/2, которым за три дня до этого были инокулированы клетки Р 815,опухоли растут беспрепятственно в течение первой недели, но уничтожаются впоследствии в течение следующей недели, как показано на фиг. 3, план В. Специфичность была продемонстрирована по отсутствию какого-либо воздействия на рост р 815, когда ЦТЛ были иммунизированы in vitro против нерелевантного антигена, такого как нуклепротеиновый пептид вируса, как показано на фиг. 3, план В. В целом, следует отметить, что главный комплекс гистосовместимости класса I из (Ld)-трансфицированных клеток Drosophila индуцирует in vitro ответ нормальных клеток селезенки мышей линии DBA/2 на сингенные опухолеспецифичные пептиды мастоцитомы Р 815 в отсутствие добавленных лимфокинов. Инъекции указанных ЦТЛ мышам линии DBA/2, несущих мастоцитому Р 815, ведут к быстрой регрессии опухоли (Wolfel et al., J. Exp.Med. (1993) 178; 489-495). Испытание на людях in vitro Человеческие ЦТЛ от здоровых субъектов были иммунизированы in vitro против тирозиназы. После первичной стимуляции только клетками Drosophila четко выявляется специфический лизис клеток JY,содержащих тирозиназу, при всех значениях соотношений ЦТЛ эффектора к JY мишени. Специфичные к тирозиназе ЦТЛ от здоровых субъектов были индуцированы с использованием полного протокола стимуляции/повторной стимуляции и исследованы на способность уничтожать клетки в клеточной линии меланомы Malme 3M. При наличии одного или двух возможных исключений, специфическая активность ЦТЛ против Malme 3M индуцируется у всех доноров в различной степени. В большей части реакционная способность в отношении контрольных опухолевых клеток Malme 3 была минимальна. Клетки от пациента с меланомой были также иммунизированы in vitro против тирозиназного эпитопа для генерирования ЦТЛ со сходной активностью и специфичностью относительно ЦТЛ, полученных от здоровых добровольцев. Использование in vitro любых натуральных или искусственных систем антигенпрезентирующих клеток (АПК) для генерирования цитотоксических Т-лимфоцитов ограничено той антигенной специфичностью, которую указанные системы могут генерировать. Приведенные ниже системы АПК были использованы для генерирования антигенспецифичных ЦТЛ к единственному для них эпитопу: 1) дендритные клетки (ДК) человека, подвергшиеся пульсовой обработке определенными пептидами; 2) мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), которые были подведены к лимфобластам и подвергнуты пульсовой обработке пептидами; 3) лимфобластоидные клеточные линии (ЛКЛ), в которых естественные пептиды подвергнуты кислотной обработке и нагружены интересующими пептидами; 4) полученные генно-инженерными методами клетки Drosophila,с тем чтобы экспрессировать пустые молекулы класса I, и клетки 3 Т 3 мышей, трансфицированные молекулами класса I человека и костимулирующими молекулами (J.B. Latouche and M.Sadelain, Nature Biotech(2000) 18:405-409). Дендритные клетки (ДК) считаются основной системой антигенпрезентирующих клеток у человека в связи с их широким применением для презентации первичных антигенных клеток. Собственные или чужеродные белки подвергаются процессингу внутри ДК. Полученные пептидные эпитопы презентируются молекулами HLA и транспортируются на поверхность ДК. Однако было показано, что ДК не будут соответствующим образом генерировать in vitro ЦТЛ, направленные против четырех различных пептидов. Такой эффект может быть достигнут с помощью ЦТЛ, имеющих активность, соответствующую каждому из четырех пептидов. Кроме того, было также показано, что фенотип ДК в момент пульсовой обработки пептидом, зрелым или незрелым, не влияет на получаемый результат. Альтернативно, стимуляция клетки Drosophila обычно приводит к появлению ЦТЛ, направленных против десяти разных типов пептидов. И при этом образуются ЦТЛ, которые обладают активностью против каждого из десяти пептидов. По методу стандартной стимуляции была оценена способность клеток Drosophila и ДК демонстрировать реакции ЦТЛ вначале к одному пептидному эпитопу и, при последующем проведении стандартной процедуры стимуляции, к каждому. Проводят сравнение ДК и трансфицированных клеток Drosophila. Незрелые ДК получают при культивировании в течение одной недели аутологичных моноцитов в присутствии ИЛ-4 и GM-CSF. Зрелые ДК получают из незрелых ДК при добавлении TNF к культуральной среде за 24 ч до сбора клеток. ДК (незрелые и зрелые) собирают, проводят пульсовую обработку пептидом, смешивают с CD8 клетками с последующим проведением процедуры стимуляции CD8 клеток и пульсовой обработки пептидами клеток Drosophila. Как показано на фиг. 7, в случае оценки с использованием тирозиназного пептидного эпитопа 689, клетки Drosophila в основном являются лучшими стимуляторами, чем ДК. Кроме того, ДК, проявляющие либо незрелый, либо зрелый фенотип (фиг. 8), были не столь эффективны, как клетки Drosophila, в плане проявления специфичных для ЦТЛ реакций в случае использования определенных пептидов для пульсовой обработки АПК. Это представляется особенно удивительным в связи с известной доминирующей ролью, которую играют ДК в иммунной системе. Было проведено сравнительное исследование с одним донором, как показано на фиг. 9. Достигается специ- 12013944 фическое уничтожение четырех различных пептидов при использовании клеток плодовых мушек в качестве стимуляторов, в то время как незрелые ДК приводили лишь к незначительному специфическому уничтожению, а зрелые ДК приводили к специфическому уничтожению только одного из четырех пептидов, использованных для стимуляции. Получение цитотоксических лимфоцитовCD8+ клетки, выделенные из лейкаферезных образцов путем позитивной селекции с антителами кCD8, стимулируют против четырех различных пептидов, ассоциированными с меланомой, презентируемых клетками Drosophila, которые экспрессируют антигенные молекулы человека класса I (HLA-A2.1),В 7.1, ICAM-1, LFA-3 и В 7.2. CD8+ клетки повторно стимулируют в течение двух курсов аутологичными моноцитами, несущими пептидный эпитоп, в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-7. ЦТЛ неспецифически размножают с использованием OKT3 и ИЛ-2. Активность ЦТЛ измеряют относительно клеток Malme 3M, а чистоту CD8+ Т-клеток оценивают методом проточной цитометрии. Процесс получения и используемые процедуры основаны на принципах правильной лабораторной практики (Good Laboratory Practices) и практики правильного производства (Good Manufacturing Practices). Принципы правильной лабораторной практики (Good Laboratory Practices) и правильной практики производства (Good Manufacturing Practices) представляют собой стандарты лабораторной и производственной деятельности, которые установлены Управлением США по контролю за продуктами и лекарствами и известны специалистам в данной области. ЦТЛ оценивают с точки зрения их идентичности, жизнеспособности, ЦТЛ активности, стерильности и содержания эндотоксина. Перечень пептидных эпитопов, пригодных для использования в способах настоящего изобретения для лечения рака молочной железы и яичников, приведен в табл. 1. Для специалистов в данной области вполне очевидно, что кроме перечисленных в табл. 1, для использования в способах настоящего изобретения с целью лечения рака молочной железы и яичников будет пригодно также множество других пептидных эпитопов, при условии, что такие пептиды представляют собой Т-клеточные эпитопы. Таблица 1 Идентифицированные ограниченные по HLA-A2.1 эпитопы ассоциированных с опухолью антигенов в качестве мишени при лечении рака молочной железы и яичников Приведенные ниже примеры даны для иллюстрации настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают изобретение содержанием приведенных примеров. Пример 1. Получение антигенпрезентирующих клеток Drosophila. Клеточную линию Schneider S2 получают из яиц Drosophila melanogaster (Oregon-R) по опубликованным методикам и депонируют в Американской коллекции типовых культур (American Type CultureCollection) (CRL 10974. S2 клетки растят на коммерческой среде Шнейдера для дрозофил с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка. Плазмидный вектор pRmHa-3 для экспрессии МНС класса I и костимулирующих белков в S2 клетках получают из вектора экспрессии pRmHa-1, сконструированного по методике, описанной в литературе. Он содержит промотор металлотионеина, консенсусные последовательности реакции на металл и ген алкогольдегидрогеназы, несущий сигнал полиаденилирования, выделенный из Drosophila melanogaster. Комплементарные ДНК для трансфекции получают следующим образом.HLA-A2.1 и -2 микроглобулин: методом ПЦР с обратной транскрипцией из K562 клеток с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности. В 7.1: методом ПЦР с обратной транскрипцией из K562 клеток с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности.ICAM-1: методом ПЦР с обратной транскрипцией из K562 клеток с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности. В 7.2: методом ПЦР с обратной транскрипцией из HL-60 клеток (АТСС CCL-240) с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности.LFA-3: методом ПЦР с обратной транскрипцией из HL-60 клеток (АТСС CCL-240) с использованием праймеров, полученных из опубликованной последовательности. Комплементарные ДНК вставляют по отдельности в вектор pRmHa-3. S2 клетки трансфицируют смесью плазмидных ДНК, кодирующих HLA-A2.1, В 7.1 и ICAM-1, и плазмиды phshneo с использованием метода осаждения фосфатом кальция. Стабильно трансфицированные клетки отбирают путем культивирования на среде Шнейдера, содержащей генетицин. За 24 ч до использования индуцируют экспрессию трансфицированных генов путем добавления CuSO4. Уровень экспрессии оценивают методом проточной цитометрии с использованием антител против HLA-A2.1, В 7.1 и ICAM-1. Для эффективной активации in vitro CD8+ лимфоцитов необходима экспрессия HLA более чем в 30% клеток.CD8+ клетки человека выделяют из лейкаферезных образцов путем позитивной селекции с использованием процедуры выделения от Dynabeads (Dynal). Моноклональное антитело мыши против CD8 человека (50 мкг/мл в человеческом гамма-глобулине [Gammagard]) добавляют к промытым клеткам в ФБР Дульбекко, содержащем 1% сывороточного альбумина человека (Baxter-Hyland) и 0,2% цитрата натрия. После инкубирования при 4 С в течение 45 мин при осторожном перемешивании клетки промывают и ресуспендируют в том же буфере, содержащем магнитные шарики Dynal (Dynabeads), на которые наслоен овечий антимышиный IgG с соотношением количества шариков и клеток, равным 1:1. Клетки и шарики помещают в стерильную пробирку и осторожно перемешивают при 4 С в течение 45 мин. В конце указанного периода времени клетки, связанные с антителами, удаляют магнитным методом с использованием сепаратора МРС-1 по инструкции производителя (Dynal). Диссоциация комплекса клеткаCD8 - шарик достигается путем инкубирования при 37 С в течение 45 мин в присутствии CD8 пептида 59-70 (AAEGLDTQRFSG; SEQ ID NO: 12). Свободные шарики удаляют магнитным методом, подсчитывают количество CD8 клеток и проводят анализ методом проточной цитометрии с целью оценки их чистоты. Восстановление CD8+ клеток обычно превышает 80%. В табл. 2 приведены данные по составу клеток в четырнадцати отдельных препаратах CD8+ из нормальных препаратов человеческих МКПК путем позитивной селекции с антителом к CD8. Таблица 2 Очистка CD8+ клеток путем позитивной селекции при проведении анализа методом проточной цитометрии Иммунизация in vitro очищенных человеческих клеток CD8+ Первичная стимуляция Трансфицированные S2 клетки Drosophila инкубируют в среде Шнейдера (106 клеток/мл), с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка и CuSO4, при 27 С в течение 24 ч. Клетки собирают, промывают и ресуспендируют в среде для насекомых X-press (BioWhittaker), содержащей 100 мкг/мл человеческой тирозиназы 369-377. После инкубации при 27 С в течение 3 ч S2 клетки смешивают с CD8+ клетками в соотношении 1:10 в среде RPMI (Gibco) с добавкой 10% аутологичной сыворотки. Клеточную смесь инкубируют в течение четырех дней при 37 С, в течение которых клетки Drosophila отмирают. На пятый день добавляют ИЛ-2 (20 Ед./мл) и ИЛ-7 (30 Ед./мл) для селективного размножения популяции ЦТЛ, специфичных к тирозиназе. Повторная стимуляция Замороженные аутологичные МКПК, истощенные по CD8, полученные во время лейкафереза, оттаивают, промывают и ресуспендируют в количестве 106 клеток/мл в RPMI среде, содержащей 10% аутологичной сыворотки (в качестве источника -2-микроглобулина) и 20 мкг/мл тирозиназы 369-377. После-облучения (5000 рад) клетки инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Не прилипшие клетки удаляют промыванием ФБР Дульбекко. К прилипшим моноцитам добавляют тирозиназный эпитоп путем инкубирования в течение 90 мин в Hepes-RPMI буфере, содержащем 10% аутологичной сыворотки и 10 мкг/мл тирозиназы 369-377. Удаляют супернатант и суспензию Drosophila-активированные CD8+ клеткиCD8+ клеток к 1 прилипшему моноциту. После трех-четырех дней культивирования при 37 С добавляют ИЛ-2 (20 Ед./мл) и ИЛ-7 (30 Ед./мл) и меняют среду для селективного размножения популяции ЦТЛ,специфичных к тирозиназе. Неспецифическое размножение Эффекторные клетки неспецифически размножают путем культивирования их в среде RPMI с добавкой аутологичной сыворотки, моноклонального антитела к CD3 (OKT3), ИЛ-2 и -облученных аутологичных МКПК. Тестирование на активность и чистоту Тестирование ЦТЛ Клетки Malme 3M используют в качестве клеток-мишеней в тесте высвобождения 51Cr. 5106 кле- 15013944 ток Malme 3M в RPMI среде, содержащей 4% фетальной сыворотки теленка, 1% буфера Hepes и 0,25% гентамицина, метят при 37 С в течение 1 ч с использованием 1 mCi 51Cr. Клетки промывают четыре раза и разбавляют до концентрации 105 клеток/мл в среде RPMI с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка (HyClone). Объединяют на 96-луночных микротитрационных планшетах 100 мкл эффекторных ЦТЛ и 100 мкл несущих пептид 51Cr-меченых клеток-мишеней Malme 3 М в соотношениях 100:1, 20:1 и 4:1 (эффектор: клетка-мишень). Добавляют клетки K562 в соотношении 20:1 (K562: Malme 3M) для снижения фонового лизиса естественных киллерных клеток. Неспецифичный лизис оценивают с использованием неопухолевой клеточной линии фибробластов HLA-A2.1 - Malme 3M. Включают в двойном повторе контрольные варианты для оценки спонтанного высвобождения и максимального высвобождения 51Cr. После инкубации при 37 С в течение 6 ч планшеты центрифугируют и подсчитывают уровень радиоактивности супернатантов для определения высвобождения 51Cr. Процент специфического лизиса вычисляется с использованием следующего уравнения: Проточная цитометрияCD8+ клетки до и после инкубации in vitro анализируют с целью определения количества маркеров клеточной поверхности с использованием флуоресцентных моноклональных антител и FACS-анализа. Результаты типичной процедуры активации с использованием клеток от здорового донора приведены в табл. 3. Таблица 3 Анализ методом проточной цитометрии активированных in vitro CD8+ клеток Препараты ЦТЛ анализируют помимо теста на активность и чистоту, на стерильность и содержание эндотоксина. Реагенты АТСС: Американская коллекция типовых культур. Пример 2. Испытание с инфузиями цитотоксических Т-клеток против меланомы. Цель испытания Данный пример описывает эффективность инфузий цитотоксических Т-клеток при лечении меланомы на основе оценки следующих факторов: 1) безопасность и толерантность повторно инфузируемых аутологичных ЦТЛ, полученных после иммунизации in vitro; 2) кинетика инфузированных ЦТЛ в системе кровообращения при оценке методом ограниченного разведения; 3) распределение ЦТЛ по организму при оценке по методу радиосцинтографии; 4) клеточный состав отобранных для биопсии узелков, определяемый иммуногистологически (ЦТЛ,ТН, NK, В-клетки), и 5) регрессия измеряемых поражений и длительность реакции, отслеживаемые в течение двух месяцев. Группы пациентов Для включения пациентов в указанный режим лечения требовалось наличие гистологически подтвержденной нерезектабельной злокачественной меланомы, которую можно измерить или оценить каким-либо другим способом, и наличие гаплотипа HLA-A2. Оценка до лечения включала радиологическое исследование мозга методами ЯМР-томографии или КТ-сканирования, КТ-сканирования грудной клетки и брюшной полости и физического обследования, в особенности кожи и лимфатических узлов. Общее число пациентов, подвергшихся данному курсу лечения, составило пятнадцать человек (девять мужчин и шесть женщин). Возраст варьировал от 33 до 75 лет и в среднем составлял 58 лет. Средняя продолжительность метастазирующего заболевания составляла 1,5 года. Кожный предварительный тест для выявления наличия состояния анергии проводился у 14/15 пациентов, при этом у 5/14 получен негативный результат в тесте на все семь общих оцениваемых антигенов. Пациентов подвергли скринингу на анализаторе клеток по интенсивности флуоресценции с использованием HLA-А 2-специфичного моноклонального антитела (ВВ 7.2) на наличие гаплотипа HLA-A2. Субтипирование проводили методом ПЦР анализа. Все пациенты, за исключением одного, представляли собой гаплотип HLA-A0201, за исключением пациента 08, который представлял собой гаплотип HLA-A0205.- 17013944 Лечение полученными ex vivo аутологичными ЦТЛ Пятнадцать пациентов подвергают лечению в рамках данного клинического протокола. Всем пациентам проводят по меньшей мере одну инфузию аутологичных ЦТЛ. Данные по количеству циклов и дозе вводимых каждому пациенту клеток суммированы в табл. 1. Количество клеток, полученных in vitro, зависит от присущих пациенту факторов, таких как количество МКПК, выделенных по методике афереза, и количество CD8+ клеток, имеющихся в каждом препарате МКПК. Поскольку все генерированные in vitro клетки подвергаются повторной инфузии донору,вводимые каждому пациенту дозы обязательно варьируют. С целью нормализации доз от пациента к пациенту для каждой дозы подсчитывается балл "мощности". Указанное значение получают при умножении общего числа клеток на литическую активность, полученную на клетках-мишенях, несущих пептид. Дозы введенных инфузией Т-клеток варьируют от минимального числа 4107 (пациент 08) до максимального числа 3,2109 (пациент 13). Пациентов допускают на второй, третий или четвертый циклы лечения с учетом их клинического состояния в конце каждого цикла. Количество МКПК, получаемых из аферезных образцов, снижается у пациентов, подвергшихся дополнительным циклам, особенно если начало последующего цикла следует достаточно близко за окончанием предыдущего. Это объясняют персистирующей лимфопенией, определяемой введением во время предшествующего цикла IFN-2b. Общее число выделенных нативных CD8+ клеток зависит от их процента в каждом из препаратов МКПК. Процент CD8+ Т-клеток варьирует от 8 до 31% в группах пациентов. Полученный фактор экспансии также вносит свой вклад в окончательное количество клеток и варьирует от 0,1 до 6,0 раз. Процедура получения ЦТЛ ex vivo приведена в описании и в примере 1 выше. Позитивная регуляция антигенов класса I и антигенов, ассоциированных с меланомой,введением IFN-2b С целью усиления способности антигенспецифичных ЦТЛ лизировать клетки меланомы in vivo вводят низкие дозы IFN-2b в течение пяти последовательных дней перед инфузией ЦТЛ и три раза в неделю еще в течение четырех недель. Одним из способов оценки реакции in vivo на цитокин является иммуногистохимический анализ биопсийных образцов, полученных в серии временных точек, на положительное окрашивание специфичными антителами. Серию биопсийных образцов получают от одного пациента с множественными поражениями кожи (пациент 04) для оценки класса I и экспрессии антигена. Исследование биопсийных образцов показывает, что класс I и экспрессия MART-1 являются слабо положительными до начала любого лечения (биопсия А). После пятидневного подкожного введения 10 МЕ/м 2 отмечается резкое увеличение обоих маркеров (биопсия В). На тирозиназу и gp100 иммуногистохимическое окрашивание дает результаты от отрицательного до слабо положительного, соответственно, в образцах до лечения (биопсия А). После введения начальной дозы -интерферона в течение пяти дней и 13 дополнительных дней лечения экспрессия указанных поздних антигенов повышается, что отмечается по окраске образцов ткани (биопсия С). Антигенная специфичность ЦТЛ, полученных ex vivo ЦТЛ, полученные от всех пациентов, оценивают на день высвобождения против клеток-мишеней Т 2, несущих пептид, клеточной линии меланомы с HLA-A2 (Malme 3 М) и аутологичной линии меланомы, если биопсийный материал возможно установить в виде клеточной линии. Каждую подготовленную дозу клеток оценивают на цитолитическую активность. Для определения специфичности ЦТЛ реакции,полученной для каждого пациента, используют Т 2 клетки, который несут пептид, презентируя либо каждый пептид в отдельности, либо все четыре пептида одновременно. Способность лизировать эндогенно экспрессирующие, ассоциированные с меланомой и несущие антиген клетки оценивают с использованием маркированной по HLA-A2 линии или аутологичной опухолевой линии. В дополнение к цитолитической активности, антигенную специфичность оценивают по установленному методу обнаружения внутриклеточной продукции гамма-интерферона на основании ответа на специфический пептидный стимул. ЦТЛ, генерируемые в конце протокола ex vivo, оценивают по данному методу. Отмечают процент клеток, специфичных для каждого из пептидов. Общее число специфичных клеток в каждой культуре CD8 от пациента 13 подсчитывают путем сложения значения каждого из факторов, определяющих пептидную специфичность, обнаруженную в популяции Т-клеток. Увеличение общего числа специфичных клеток может быть обнаружено в каждом из последовательных циклов лечения. Обнаружение CD8 и CD4 клеток, инфильтрующих биопсийные образцы опухоли после ЦТЛ терапии Биопсийные образцы, отбираемые от всех пациентов до, во время и после лечения, должны быть идеальными. Однако экспериментальные условия позволили отобрать биопсийные образцы только у ограниченного числа пациентов. Опухолевая ткань была получена от пяти из пятнадцати пациентов, включенных в исследование. У двух пациентов (пациенты 08 и 13) биопсийные образцы были доступны на пятую и шестую недели соответственно после проведения Т-клеточной терапии. Обследование тканевых образцов выявило наличие инфильтрующих CD8 и CD4 клеток. Один из опухолевых образцов был взят из кожного поражения в участке кожи затылочной области, которая увеличилась в размере ко времени повторного обследования, через четыре недели после второй инфузии Т-клеток. Биопсия выявила некроз ткани, которая подверглась усиленной инфильтрации лимфоцитами. Другой биопсийный образец был- 18013944 взят из головки бедренной кости, удаленной в ходе заместительной хирургии бедра. Кожные поражения у пациента 08 были очень положительными (4+) как на общий класс I, так и на специфический HLA-A2 маркер. Тест на тирозиназу и gp 100 был слабо положительным (1+ и 2+, соответственно), тогда как тест на MART-1 в том же образце был отрицательным. Участки отбора биопсийных образцов у пациента 13 были также некротизированы, с более гетерогенным окрашиванием; отмечались четкие популяции опухолевых клеток, не экспрессирующих HLA-A2.1 молекулы и одна или более МАА. Однако интактные тканевые области демонстрируют выраженный показатель класса I (4+) и наличие всех ассоциированных с меланомой антигенов. Оказалось, что лимфоцитарная инфильтрация в последнем образце сосредоточена вокруг опухолевых узелков, а не проникает вглубь. Однако наибольший процент клеток, непосредственно ассоциированных с опухолями, составляют CD8 клетки. Отсутствие у обоих пациентов биопсийных образцов, отобранных до лечения, не позволило получить подтверждения сходства типов инфильтрующих клеток в образцах тканей, имевших место до лечения. КТ сканограммы после проведения Т-клеточной терапии подтверждают объективный характер реакции КТ сканограммы представляют собой часть критериев, используемых при скрининге до лечения и при оценке результатов после лечения. Пациент 10 получал однократную инфузию 8108 ЦТЛ (7/27/99) через пять недель после проведения сканирования перед лечением (6/23/99). При повторении КТсканирования грудной клетки через месяц после инфузии (8/27/99) отмечается резкое уменьшение размеров поражения легкого. Аналогично, пациент 14 подвергался КТ-сканированию грудной клетки, в качестве составной части процесса подбора пациентов в испытание (9/10/99), за три недели и полнедели перед проведением первой инфузии с использованием 6,6108 клеток (10/5/99). Последующий мониторинг с использованием КТ-сканирования (1/7/99), через месяц после второй инфузии с использованием 11,5108 клеток выявил резкое сокращение трех отдельных поражений. Пациент 13 также продемонстрировал объективную реакцию, измеряемую по параметрам КТ-сканирования до и после лечения. Паратрахеальная аденопатия изменялась от 7,8 см 2 (до исследования) до 4,4 см 2 после цикла I и исчезала после цикла II. Наличие анергического состояния не предотвращает способности генерировать ЦТЛ или не препятствует развитию клинической реакции Большинство пациентов, проходивших лечение по данной методике, подвергались предварительному медицинскому вмешательству. Проводят кожный тест перед лечением для определения того, коррелирует ли анергическая реакция на группу семи общих антигенов с неспособностью генерировать exvivo ЦТЛ или является препятствием для развития клинической реакции. Способность генерировать ЦТЛ ex vivo не коррелирует с результатами кожного теста, проведенного у пациентов перед лечением. Следует отметить, что у пациентов 03 и 04 (оба смешанных респондера) сделали повторные кожные тесты перед началом второго цикла, результаты которых остались анергическими. Пример 3. Генерирование HER-2/neu-специфичных ЦТЛ, способных лизировать раковые клетки молочной железы и яичников. Авторов интересовала возможность использования разработанной ими технологии генерирования ЦТЛ в случае других типов опухоли, и следовало определить, могут ли все формы рака служить мишенями для лечения по такому методу. HER-2/neu представляет собой протоонкоген, имеющий гомологию с EGFR, который амплифицируется и подвергается сверхэкспрессии в очень многих видах рака человека,в особенности аденокарцином молочной железы, яичников и толстого кишечника. Он зачастую ассоциируется с агрессивной формой заболевания и может быть индикатором плохого прогноза. Он был исследован в нескольких клинических испытаниях в качестве возможной мишени для лечения указанных видов рака. В начале 90-х гг. ограниченные по HLA-A2.1 пептидные эпитопы HER-2/neu были идентифицированы либо путем компьютерного определения связывания пептида, либо путем картирования ЦТЛ, выделенных из асцитов пациентов с раком яичника (табл. 3 а). Все пептиды были синтезированы, им был присвоен идентификационный номер (PRI) и далее они были исследованы на способность генерировать ЦТЛ ex vivo с использованием того же метода, который авторы разработали для оценки ассоциированных с меланомой Т-клеточных пептидных эпитопов. CD8 клетки были выделены от нормальных доноров для определения их способности генерировать ЦТЛ exvivo с клетками Drosophila, несущими известные пептидные эпитопы ЦТЛ. Пептиды 826, 835, 861 и 863 характеризовались наивысшей частотой генерирования ЦТЛ (табл. 4). Таблица 4 Частота генерирования HER-2/neu ЦТЛ у нормальных доноров Поскольку трансфицированные клетки Drosophila обладают уникальной способностью презентировать до десяти различных пептидных эпитопов (фиг. 10), авторы на основании частоты генерирования exvivo ЦТЛ к указанным пептидам отобрали четыре HER-2 пептида 826, 835, 861 и 863. Четыре различныхHER-2 пептида демонстрируют от слабой до умеренной способности связываться с HLA-A2.1 молекулой, презентированной на поверхности трансфицированных клеток Drosophila. Авторы решили включить А 2 связывающие соединения, обладающие слабой способностью, поскольку опыт работы с ассоциированными с меланомой пептидами дает основание полагать, что слабые связывающие соединения класса I в основном способны генерировать мощные ЦТЛ, которые распознают опухолевые клетки, если в действительности они репрезентируют нативные эпитопы Т-клеток. Большинство белков, ассоциированных с опухолями, которые авторы использовали в качестве мишеней, являются собственными антигенами и в качестве таковых, как можно ожидать, обладают высокой афинностью к молекуле класса I, что отмечается в случае вирусных пептидов. Связывающие соединения со способностью от низкой до умеренной обычно генерируют ЦТЛ, которые очень эффективно лизируют опухолевые клетки. Это было показано с пептидом MART-1, который является связывающим соединением с низкой аффинностью на клетках Drosophila (фиг. 3), презентируя эпитоп, который обычно генерирует мощные ЦТЛ, способные лизировать клетки-мишени, несущие пептид (Т 2) или, что важнее, меланомные клетки (Malme 3M) (фиг. 12).HER-2/neu является представителем семейства EGF-R и функционирует как рецептор фактора роста. Белок HER-2 экспрессируется во время эмбрионального развития у человека. У взрослых указанный белок слабо выявляется в эпителиальных клетках многих нормальных тканей. В нормальных клетках генHER-2 представлен в виде единственной копии. Амплификация гена и/или сверхэкспрессия ассоциированного белка идентифицируется в случае многих видов рака человека, включая рак молочной железы,яичников, матки, желудка и аденокарциному легкого. Различия в последовательностях между HER-2 и- 20013944 рецептором EGF-R показаны в табл. 5. Были исследованы три из четырех пептидов HER-2, из которых два белка несут три или более аминокислотных изменения. Уже одного изменения аминокислоты достаточно для того, чтобы оба белка различались. Таблица 5 Сравнение HER-2/neu и EGF-R Определив, что ЦТЛ генерируется после проведения четырехнедельного протокола стимуляции exvivo, авторы оценили наличие пептидспецифичных клеток с использованием для этого тетрамерных молекул HLA-A2.1, полученных с помощью иммунизированных пептидов. Как показано на фиг. 13, способность генерировать пептидспецифичные ЦТЛ зависит от донора. На плане А (донор 261) показан донор, демонстрирующий мощную реакцию ЦТЛ на пептид 835 (37,55%). На плане В (донор 262) пептидспецифичные ЦТЛ могут быть обнаружены с использованием тетрамерных молекул как 835, так и 861(3,6% и 15,1%, соответственно). Такие результаты подтверждают полезность применения множества пептидов для гарантированного получения пептидспецифичных ЦТЛ в конце протокола стимулирования. Указанная процедура ex vivo позволяет получать относительно легко ЦТЛ со множественной специфичностью. Реакция против пептида и против опухоли После завершения полной процедуры ex vivo полученные ЦТЛ оценивают на их антигенную специфичность. Для генерирования ЦТЛ на день 0 в клетки Drosophila вносят сочетание четырех пептидовHER-2. В конце четырехнедельного протокола стимуляции ex vivo всю культуру CD8 оценивают на антигенную специфичность. В качестве клеток-мишеней используют Т 2 клетки, несущие каждый из иммунизирующих пептидов. На фиг. 14 показана типичная реакция. Полная культура демонстрирует специфичность к каждому из четырех HER-2 пептидов. Противоопухолевый ответ оценивают с использованием клеточной линии опухоли яичника (АТСС; НТВ-77). В том случае, когда клеточная линия-мишень не ограничена HLA-А 2.1, авторы трансфицируют клеточную линию с получением системы +/- тестирования. Когда HLA-A2.1 трансфицируют в линию НТВ-77, отмечается усиленное уничтожение CD8 эффекторными клетками (фиг. 15, планы A-D). Оценивают HER-2-специфичные эффекторы, репрезентирующие индивидуальные пептиды, для подтверждения презентации каждого из пептидных эпитопов в данной клеточной линии опухоли. Клеточную линию аденокарциномы молочной железы (АТСС; НТВ-131), трансфицированнуюHLA-A2.1, также оценивают на способность лизировать опухоль с использованием HER-2-специфичных пептидных эффекторов. ЦТЛ, специфичные к пептиду 861, могут лизировать указанную клеточную линию опухоли при трансфекции вместе с HLA-A2.1 (фиг. 16). Лечение с использованием -интерферона, требуемого для лизиса опухолевой клетки Клеточная линия НТВ-77/А 2.1 для проявления пептидспецифичного лизиса требует предварительной обработки -интерфероном. Клетки обрабатывают 500 Ед/мл -интерферона (удельная активность 25 нг/мл) за 24 ч до проведения теста на высвобождение 51Cr. На фиг. 17 показано, что добавление интерферона приводит к усилению лизиса HLA-A2.1-трансфицированной клеточной линии. Для определения эффекта указанной дозы -интерферона на поверхностную экспрессию HLA-А 2.1 и HER-2 проводят FACS-анализ для определения уровня молекул по истечении 24 и 48 ч после индукции. На фиг. 18,планы A и В, показаны результаты FACS-анализа. На плане А видно отсутствие повышение уровня молекул HER-2 на поверхности НТВ-77 клеток по истечении 24 и 48 ч после индукции -интерфероном. ВHLA-A2.1-трансфицированных клетках ни HER-2, ни HLA-A2.1 не приводят к повышению уровня поверхностной экспрессии после проведения обработки по аналогичной процедуре. Отмечается лишь повышение уровня экспрессии ТАР-1, а также HLA-DM и HLA-DR, катепсина S и D и каспазы 5, когда уровни мРНК оценивают по микротесту ДНК-чипа (фиг. 19). Получаемые при этом результаты должны- 21013944 объяснить, почему имеется усиление гибели НТВ-77/А 2.1 клеток в присутствии -интерферона. Позитивная регуляция данной молекулы проводит к более эффективному процессингу молекулы HER-2, создавая лучшие условия для презентации интересующих пептидов. Пептиды Синтетические пептиды получают по стандартной технологии Fmoc-химии с использованием пептидного синтезатора (Gilson Company, INC.). Все пептиды очищают до уровня 95% чистоты методом ВЭЖХ с обращением фазы на С-8 колонке. Чистоту и идентичность устанавливают на ионизационном масс-спектрометре с электронапылением. Ассоциированные с меланомой пептиды включают пептид 819,специфичный для MART-1 (AAGIGILTV SEQ ID NO: 6), 817 и 853, которые оба являются gp100 пептидами (ITDQVPFSV SEQ ID NO: 4 и KTWGQYWQV SEQ ID NO: 5 соответственно), пептиды, специфичные к тирозиназе, включают 689 и 792, при этом 792 представляет пост-трансляционный модифицированный вариант (YMDGTMSQV SEQ ID NO: 2) нативной последовательности (YMNGTMSQV SEQ IDSEQ ID NO: 8) представляют последовательности HER-2/neu из внутриклеточного и внеклеточного доменов соответственно белка р 185. Рес 6020 (ALALAALLVV SEQ ID NO: 10) и Рес 6025 (ALLVVDREV SEQID NO: 11) содержат перекрывающиеся последовательности, представляющие мукоидный белок, обнаруженный в опухолевых линиях яичников. С-лектин также является белком, обнаруженным в опухолевых клеточных линиях яичников, а пептид, получаемый на основе его последовательности (С-лектин 8),имеет вид KMASRSMRL SEQ ID NO: 9. Тест на цитотоксичность in vitro Проводят стандартный анализ на высвобождение 51Cr с целью определения способности эффекторной клетки ЦТЛ распознавать ассоциированные с меланомой пептидные эпитопы на Т 2 клетках. Собирают 3106 Т 2 клеток, растущих в RPMI +10% ФБР (среда). Добавляют 0,1 mCi 51Cr и инкубируют при 37 С в водяной бане. Меченые клетки добавляют к 10 мл 4% промытой среды (RPMI + 4% ФБР) и осадок, промытый еще два раза и ресуспендированный в среде до конечной концентрации 0,2106/мл, используют для определения спонтанной радиоактивности против лизированных детергентом клеток. Клетки подвергают пульсовой обработке соответствующим(ими) пептидом(ами) в дозе 20 мкг/мл в течение 30 мин. Добавляют по 50 мкл к каждой ячейке 96-луночного планшета, содержащей CD8 эффекторные клетки в количестве 10, 2, 0,4 и 0,08106/мл, и далее инкубируют при 37 С в течение 6 ч, откручивают и отбирают супернатант. Проточная цитометрия и окрашивание тетрамером Клетки метят моноклональными антителами, конъюгированными с флюоресцеин-изотиоцианатом или ПЭ путем инкубирования при 4 С в течение 30 мин в FACS буфере (1% БСА, 0,02% NaN3 в ФБР) и затем промывают тем же буфером. Клетки фиксируют в 0,5% формальдегиде до подсчета на проточном цитрометре для флуоресцентного анализа клеток на FACSscan (Becton Dickinson) с использованием программного обеспечивания CellQuest. Неспецифическое окрашивание измеряют с помощью того же вторичного антитела, что применялось для мечения очищенных первичных антител или для изотипного контроля, когда первичные антитела подвергались мечению непосредственно. Окрашивание тетрамерами проводят с использованием HLAA2.1-специфичных тетрамерных молекул HIVgag (Beckman Coulter), содержащих последовательностьSLYVTVATL SEQ ID NO: 43 в качестве отрицательного контроля. HER-2-специфичные тетрамеры получают с использованием пептидных последовательностей CLTSTVQLV (826, SEQ ID NO: 7),KIFGSLAFL (835, SEQ ID NO: 8) или VMAGVGFSPYV (861, SEQ ID NO: 16). ПЭ-меченые тетрамерные комплексы HLA-А 2.1-пептида используют в сочетании с моноклональными антителами, меченными изотицианат-флуоресцеином (FITC-меченые), против человеческого CD8a (BD PharmMagin) для окрашивания эпитоп-специфичных CD8+ Т-клеток, в соответствии с описанием в инструкции-вкладыше. Образцы анализируют на двухцветном проточном цитрометре на приборе Beckton Disckenson FACScan, иCD8+ Т-клетки осматривают с точки зрения их окрашивания тетрамерными HLA-A2.1-пептидными комплексами. Пример 4. Генерирование дополнительных ЦТЛ, специфичных к молочной железе и яичникам, с использованием процедуры стимуляции ex vivo. Авторы продемонстрировали способность генерировать ЦТЛ реакции ко всем известным ограниченным по HLA-A2.1 пептидным эпитопам нескольких опухолевых антигенов при опухолях разного происхождения. При этом первые исследования были сконцентрированы на меланоме, где авторы смогли показать объективные клинические реакции у пациентов, подвергавшихся лечению ЦТЛ, специфичными для четырех различных пептидных эпитопов, которые специфичны для белков MART-1, gp100 и тирозиназы, ассоциированных с меланомой [Richards et al., Amer. Soc. Clin. Oncol., San Francisco, California (2001, May)]. Для усиления способности повышать образование ЦТЛ к другим опухолевым антигенам, представленным в случае многих других видов рака, авторы выбрали опубликованные и новые последовательности для опухолевых антигенов, которые являются общими для нескольких различных видов рака. Они- 22013944 включают AES, MUC-1, CEA, FBP, С-лектин, NY-ESO-1, Рес 60, СА-125, MAGE-3, теломеразу и G250. В табл. 7 описаны указанные антигены, частота их экспрессии и виды рака, которые экспрессируют их. Данные по частоте реакции на рассматриваемые пептиды при использовании описанной процедуры стимуляции ex vivo указаны в табл. 6. Таблица 6 Частота реакции на пептидные эпитопы для молочной железы и яичников у нормальных доноров
МПК / Метки
МПК: C12N 5/02, A61K 48/00, C12N 5/00, A61P 43/00
Метки: линии, антигенпрезентирующей, применение, клеточной, получения, опухолей, способ, неприродной, лечения
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-13944-sposob-polucheniya-neprirodnojj-antigenprezentiruyushhejj-kletochnojj-linii-i-primenenie-linii-dlya-lecheniya-opuholejj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей</a>
Усеченный нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, днк, кодирующая указанный фактор, вектор, содержащий указанную днк, способ получения фактора, фармацевтическая композиция и способ лечения
Номер патента: 1204
Опубликовано: 25.12.2000
Автор: Ху Шоу-Фен Сильвия
МПК: A61P 25/00, A61K 38/00, C07K 14/00...
Метки: вектор, лечения, днк, глиальной, композиция, усеченный, линии, фармацевтическая, фактора, получения, нейротрофический, фактор, способ, содержащий, указанную, кодирующая, клеточной, указанный
Формула / Реферат:
1. Усечённый нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF), имеющий следующую аминокислотную последовательность X-[Cys41-Cys133]-Y, причем [Cys41-Cys133] представляет собой аминокислотную последовательность от Cys41 до Cys133 в соответствии с фиг. 1 (SEQ ID NO:2); Y представляет собой концевую карбоксильную группу Cys133 или карбоксиконцевой участок аминокислотного остатка Ilе134; а Х представляет собой метионилированную или...
Гуманизированное антитело против рецептора лимфотоксина -β (варианты), композиция, способ лечения или снижения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у человека, выделенная нуклеиноваякислота (варианты), клетка клеточной линии (варианты)
Номер патента: 6945
Опубликовано: 30.06.2006
Авторы: Сальдана Хосе У., Лайн Пол, Гарбер Эллен
МПК: A61K 39/395, C07K 16/28, A61P 35/00...
Метки: клеточной, человека, развития, антитело, риска, против, лимфотоксина, линии, тяжести, клетка, рецептора, композиция, варианты, способ, снижения, последствий, выделенная, нуклеиноваякислота, beta, гуманизированное, лечения, неоплазии
Формула / Реферат:
1. Гуманизированное антитело против рецептора лимфотоксина-b (LT-b -R) или его антиген-связывающий фрагмент, у которых гипервариабельные участки легкой цепи определены остатками аминокислот 24-34, 50-56 и 89-97 последовательности SEQ ID NO:1, а гипервариабельные участки тяжелой цепи определены остатками аминокислот 31-35, 50-66 и 99-109 последовательности SEQ ID NO:2, при этом антитело содержит в легкой цепи по меньшей мере один...
применение антитела против полипептида april для получения лекарственного препарата для лечения опухолей
Номер патента: 5411
Опубликовано: 24.02.2005
Автор: Чопп Юрг
МПК: C07K 14/525, A61P 35/00, A61K 38/00...
Метки: получения, препарата, опухолей, антитела, april, против, полипептида, лечения, применение, лекарственного
Формула / Реферат:
1. Применение антитела, специфично связывающегося с полипептидом индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL) SEQ ID NO: 2 или его растворимым фрагментом и препятствующего связыванию полипептида лиганда APRIL и полипептида рецептора APRIL, для получения лекарственного препарата для лечения, подавления или изменения роста опухолевой клетки, лечения злокачественной опухоли или лечения гиперплазии. 2. Применение по п.1, где указанная опухолевая...
Линия клеток растения сахарной свеклы и растение сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновому гербициду, семена указанного растения, способы получения указанной клеточной линии и гибридных растенийсвеклы, устойчивых к данному гербициду, и применение указанного гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с указанными растениями сахарной свеклы
Номер патента: 3296
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Пеннер Доналд, Райт Терри Р.
Метки: указанного, имидазолиноновому, борьбы, растение, сорняками, применение, устойчивых, данному, гербициду, растущими, линии, семена, полях, свеклы, растенийсвеклы, сахарной, клеточной, указанной, гибридных, устойчивые, клеток, растения, указанными, растениями, способы, линия, гербицида, получения
Формула / Реферат:
1. Линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновому гербициду, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данному гербициду. 2. Линия клеток по п.1, которая получена из чувствительных клеток...
Линия клеток растения сахарной свеклы и растение сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, семена указанного растения, способы получения указанной клеточной линии и гибридных растений свеклы, устойчивых к данным гербицидам, и применение имидазолинонового гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с указанными растениями сахарной свеклы
Номер патента: 3297
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Пеннер Доналд, Райт Терри Р.
Метки: указанной, линия, семена, растение, растениями, клеток, сахарной, растений, устойчивые, данным, сорняками, линии, способы, свеклы, растения, гербицидам, гибридных, имидазолинонового, борьбы, гербицида, растущими, применение, указанными, имидазолиноновым, указанного, клеточной, полях, устойчивых, сульфонилмочевинным, получения
Формула / Реферат:
1. Линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 562 цитозин замещен на тимин и в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данным гербицидам. 2....
Следующий патент: Способ получения обогащенного глюкозамином растительного сырья из различных видов растений
Случайный патент: Путевая машина с крытым помещением для грузов