Человеческое моноклональное антитело против cd20 и его применение

ЧЕЛОВЕЧЕСКОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ CD20 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В изобретении охватываются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим CD20 и ингибируют его, родственные композиции и молекулы на основе антител. Человеческие антитела можно продуцировать при использовании трансфектомы или в организме отличного от человека трансгенного животного, например в трансгенной мыши, способной продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител при использовании V-DJ рекомбинации и переключения изотипа. Также охватываются фармацевтические композиции,содержащие человеческие антитела, отличные от человека трансгенные животные и гибридомы,которые продуцируют человеческие антитела и диагностические методы для применения человеческих антител. Телинг Джесика, Руулс Зигрид (NL),Гленни Мартин (GB), Ван Де Винкель Ян Г.Й., Паррен Пауль (NL), Петерсен Йорген (DK), Бодсгорд Оле Д.М.Ск. Предпосылки создания изобретения Молекула CD20 (также называемая антигеном ограниченной дифференцировки человеческих Влимфоцитов, или Вр 35) является гидрофобным трансмембранным белком с молекулярным весом около 35 кДа, расположенным на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 и Einfield et al (1988) EMBO J. 7(3):711-717). (Белок) CD20 обнаружен на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется в процессе раннего развития пре-В-клеток и остается до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует как в нормальных В-клетках, так и в злокачественных В-клетках. В частности, CD20 экспрессируется более чем в 90% В-клеток неходжкинской лимфомы (NHL) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433), но не обнаруживается в гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135(2)973-979). Карбоксиконцевая область белка CD20 из 85 аминокислот расположена в цитоплазме. Протяженность этого участка находится в противоречии с протяженностью этих участков других специфических в отношении В-клетки поверхностных структур, таких как тяжелые цепи IgM, IgD и IgG или - или -цепи антигенов гистосовместимости антигенов класса II, которые имеют сравнительно короткие внутрицитоплазматические участки из 3, 3, 28, 15 16 аминокислот соответственно (Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). Из последних 61 концевых аминокислот 21 являются кислотными остатками и только 2 основными, это указывает на то, что эта область имеет сильный отрицательный заряд ( в GenBank NP 690605). Полагают, что CD20 может быть вовлечен в регуляцию ранней стадии(й) в процессах активации и дифференцировки В-клеток (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 16:881-887) и может функционировать как кальциевый канал (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D:195). Несмотря на неопределенность относительно действительной функции CD20 в стимулировании пролиферации и/или дифференцировки В-клеток, он представляет важную мишень для антителоопосредованной терапии и для киллинга В-клеток, участвующих в раковых заболеваниях и аутоиммунных нарушениях. В частности, экспрессия CD20 на опухолевых клетках, например NHL, делает его важной мишенью антитело-опосредованной терапии для специфически нацеленных терапевтических агентов против CD20-позитивных неопластических клеток. Однако, хотя полученные до настоящего времени результаты четко характеризуют CD20 как мишень для иммунотерапии, они также показывают, что доступные в настоящее время мышиные и химерные антитела не являются идеальными химическими агентами. Следовательно, существует необходимость в усовершенствованных терапевтических антителах против CD20, эффективных для предупреждения и/или лечения ряда заболеваний, включающих клетки,экспрессирующие CD20. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает усовершенствованные антитела-лекарственные вещества для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими CD20,включая заболевания, связанные с опухолями, и иммунные заболевания, в том числе и аутоиммунные заболевания. Антитела, охватываемые изобретением, усовершенствованы (улучшены) в том смысле, что они являются полностью человеческими и, таким образом, являются менее иммуногенными в организме пациентов. Как показано на примерах в данном описании, человеческие антитела по изобретению опосредуют киллинг В-клеток, экспрессирующих CD20, с помощью различных механизмов. В одном варианте изобретения человеческие антитела по изобретению индуцируют комплемент-зависимую цитотоксичность(CDC), например, по меньшей мере примерно в 20% случаев CDC-опосредованного лизиса, предпочтительно примерно в 30% случаев CDC-опосредованного лизиса и более предпочтительно примерно в 4050% случаев CDC-опосредованного лизиса, в клетках, таких как клетки хронического В-лимфоцитарного лейкоза (B-CLL, В-ХЛЛ). В другом варианте человеческие антитела по изобретению индуцируют апоптоз клеток, экспрессирующих CD20. В другом варианте человеческие антитела по изобретению индуцируют гомотопическую адгезию клеток, экспрессирующих CD20. Кроме того, человеческие антитела по изобретению могут индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) клеток, экспрессирующих CD20 в присутствии человеческих эффекторных клеток (например, моноцитов, мононуклеаров, NK клеток и PMN). Кроме того, человеческие антитела по изобретению могут индуцировать фагоцитоз клеток, экспрессирующих CD20 в присутствии макрофагов. Человеческие моноклональные антитела по изобретению могут работать по одному или более этих механизмов. Примеры клеток, которые могут лизироваться антителами по данному изобретению, включают, но без ограничения, В-клетки, экспрессирующие CD20, такие как опухолегенные В-клетки и В-клетки, участвующие в иммунных заболеваниях. В конкретном варианте по изобретению человеческие антитела применяются для опосредования киллинга В-лимфоцитов при лечении лимфомы, В-клеточной неходжкинской лимфомы. Человеческие антитела по изобретению включают IgG1 (например, IgG,), IgG3 (например, IgG3,) и IgG4 (например, IgG,) антитела. Однако другие изотипы антител также охватываются изобретением,-1 021644 включая IgG2, IgM, IgA1, IgA2, секреторный IgA, IgD и IgE. Антитела могут являться целыми антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, включая, например, Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечные Fv фрагменты или биспецифические антитела. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты включают химерные (слитые) белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие (i) полипептид связывающего домена (такой как вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи),(ii) CH2 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с полипептидом шарнирной области, и (iii) CH3 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с СН 2 константной областью. Такие химерные белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. Конкретные человеческие антитела по настоящему изобретению включают антитела, названные 11 В 8, 2F2 и 7D8, кодируемые нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человеческого происхождения и легкой цепичеловеческого происхождения, содержащими нуклеотидные последовательности в их вариабельных областях, представленных в SEQ ID NO: 1, 5 или 9 и SEQ ID NO: 3, 7 или 11 соответственно,и их модификации консервативной последовательности. В другом варианте изобретения человеческие антитела характеризуются тем, что они включают вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и легкой цепичеловеческого происхождения, содержащие аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 2, 6 или 10 и SEQ ID NO: 4, 8 или 12 соответственно, и модификации их консервативных последовательностей. Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела характеризуются тем, что они содержат вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и легкой цепичеловеческого происхождения, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны аминокислотным последовательностям, представленным SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 соответственно; SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 соответственно или SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12 соответственно. Другие конкретные человеческие антитела по изобретению включают антитела, которые содержатCDR домен, имеющий CDR1 область тяжелой и легкой цепей человеческого происхождения, CDR2 область тяжелой и легкой цепей человеческого происхождения и CDR3 область тяжелой и легкой цепей человеческого происхождения, где:(a) CDR1, CDR2 и CDR3 области тяжелой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностейCDR1, CDR2 и CDR3, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (SEQ ID NO: 13-15, 19-21 и 25-27), и модификаций их консервативных последовательностей, и(b) CDR1, CDR2 и CDR3 области легкой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностейCDR1, CDR2 и CDR3, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (SEQ ID NO: 16-18, 22-24 и 28-30), и модификаций их консервативных последовательностей. Также настоящее изобретение включает антитела, которые диссоциируют из CD20 с равновесной константой диссоциации (KD) около 1-10 нМ или ниже. Такие антитела также включают антитела, которые не реагируют перекрестно с родственными антигенами клеточной поверхности и, таким образом, не ингибируют их функцию. В другом варианте изобретения человеческие антитела против CD20 по настоящему изобретению можно охарактеризовать одним или более следующих свойств:b) аффинность связывания с CD20 (KD) около 10 нМ или ниже, предпочтительно около 5 нМ или ниже и более предпочтительно около 1-3 нМ или ниже по определению с помощью эксперимента по связыванию, представленному в примере 5 (фиг. 9) по данному описанию;c) константа скорости диссоциации (kd) их ассоциата с CD20 равна около 10-4 с-1 или менее, предпочтительно около 10-5 с-1 или менее и более предпочтительно около 10-6 с-1 по определению с помощью эксперимента по связыванию, представленному в примере 5 (фиг. 9) по данному описанию;d) способность опосредовать высокий уровень CDC либо на CD55/59 негативных, либо на CD55/59 позитивных клетках;f) способность ингибировать рост клеток, экспрессирующих CD20;g) способность индуцировать апоптоз клеток, экспрессирующих CD20;h) способность индуцировать гомотопическую адгезию клеток, экспрессирующих CD20;j) способность пролонгировать выживание субъекта, имеющего опухолевые клетки, экспрессирующие CD20;l) способность истощать клетки, экспрессирующие низкие уровни CD20 (CD20low клетки). Человеческие антитела против CD20 по настоящему изобретению могут быть дериватизированными, связанными с или коэкспрессирующимися с другими специфичностями связывания. В особом варианте изобретение включает биспецифичную или полиспецифичную молекулу, содержащую по меньшей мере одну первую специфичность связывания CD20 (например, человеческое антитело против CD20 или его миметик) и вторую специфичность связывания человеческой эффекторной клетки, такую как специфичность связывания Fc-рецептора (например, человеческого Fc рецептора, такого как FcRI, или человеческого Fc рецептора) или Т-клеточного рецептора, например CD3. Следовательно, настоящее изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, которые связываются как с человеческим CD20, так и с Fc-рецептором, например CD3. ПримерамиFc-рецепторов являются, например, рецептор человеческого IgG, например Fc-гамма рецептор (FcR),такой как FcRI (CD64), FcRII (CD32) и FcRIII (CD16). Также могут быть нацеленными другие Fcрецепторы, такие как рецепторы человеческого IgA (например, FcRI). Fc-рецептор предпочтительно локализован на поверхности эффекторной клетки, например моноцита, макрофага или активированного мононуклеара. В предпочтительном варианте изобретения биспецифичные и моноспецифичные молекулы связываются с Fc-рецептором по сайту, отличному от сайта связывания рецептора Fc иммуноглобулина (например, IgG или IgA). Следовательно, связывание биспецифичных и полиспецифичных молекул не блокируется физиологическими уровнями иммуноглобулинов. Еще в одном аспекте человеческие антитела против CD20 по изобретению являются дериватизированными, связанными или коэкспрессирующимися с другой функциональной молекулой, например пептидом или белком (например, Fab' фрагментом). Например, антитело по изобретению может быть функционально связано (например, химической связью, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или другим способом) с одним или более других молекулярных объектов, таких как другое антитело (например, с образованием биспецифичного или полиспецифичного антитела), цитотоксин, клеточный лиганд или антиген (например, с образованием иммуноконъюгата, такого как иммунотоксин). Антитело по данному изобретению может быть связано с другими терапевтическими частицами, например, радиоизотопом, низкомолекулярным (малая молекула) противораковым лекарственным веществом, противовоспалительным агентом или иммуносупрессором. Соответственно настоящее изобретение охватывает большой ряд конъюгатов антитела, биспецифичных или полиспецифичных молекул и химерных (слитых, гибридных) белков, причем все они связываются с клетками, экспрессирующими CD20, и всех их можно использовать для нацеливания других молекул на такие клетки. Еще в одном аспекте изобретение включает композиции, например фармацевтические и диагностические композиции/наборы, содержащие фармацевтически приемлемый носитель, приготовленный с одним человеческим моноклональным антителом или с комбинацией человеческих моноклональных антител. В особом варианте изобретения композиция включает комбинацию антител, которые связываются с различными эпитопами или которые обладают различными функциональными характеристиками, таких как индуцирующие CDC и индуцирующие апоптоз. Человеческие антитела, иммуноконъюгаты, биспецифичные и полиспецифичные молекулы и композиции по настоящему изобретению можно использовать в различных методах для ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD20, и/или киллинга клеток, экспрессирующих CD20, путем контактирования клеток с эффективным количеством антитела,иммуноконъюгата,биспецифичной/полиспецифичной молекулы или композиции, так что рост клетки ингибируется и/или клетка гибнет. В одном варианте изобретения способ включает киллинг клетки, экспрессирующей CD20, в присутствии эффекторных клеток, например, с помощью CDC, апоптоза, ADCC, фагоцитоза или комбинацией двух или более из этих механизмов. Предпочтительно клетки лизируют или ингибируют, не убивая или не ингибируя активность клеток, которые не экспрессируют CD20, но которые могут, например, экспрессировать родственный по структуре антиген клеточной поверхности (т.е. без кросс-реактивности с родственными, но функционально отличными антигенами клеточной поверхности). Клетки, экспрессирующие CD20, которые можно ингибировать или убить, используя человеческие антитела по изобретению, включают, например, опухолегенные В-клетки. Следовательно, человеческие антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предупреждения различных заболеваний, включающих клетки, экспрессирующие CD20, путем введения антител пациентам, страдающим такими заболеваниями. Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, облегчать) или предупреждать, включают, но без ограничения, опухолегенные заболевания и иммунные заболевания, например аутоиммунные заболевания. Примеры опухолегенных заболеваний, которые можно лечить и/или предупреждать, включают В-клеточную лимфому, напримерNHL, в том числе В-лимфобластный лейкоз/лимфому из клеток-предшественников и опухоли из зрелых В-клеток, такие как В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)/малая лимфоцитарная лимфома (SLL), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмацитарная лимфома, лимфома из клеток мантийной зоны (MCL), фолликулярная лимфома (FL), включая FL низкой, средней и высокой степени злокачественности, кожная лимфома из клеток фолликулярных центров, В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны (MALT тип, узловой тип, селезеночный тип), волосатоклеточный лейкоз,диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома, лимфома Беркита, плазмацитома, миелома из плазматических клеток, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство, макроглобулинемия Вальденстрема и анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL). Примеры иммунных расстройств,в которых участвуют В-клетки, экспрессирующие CD20, которые можно лечить и/или предупредить,включают псориаз, псориатический артрит, дерматит, системную склеродерму и склероз, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, менингит, энцефалит, увеит, гломерулонефрит, экзему, астму, атеросклероз, недостаточность адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Сегрена, ювенильный диабет, болезнь Рейтера,болезнь Бехчета, иммунный комплексный нефрит, IgA нефропатию, IgM полинейропатии, иммунные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическую анемию, тяжелую псевдопаралитическую миастению, волчаночный нефрит, системную красную волчанку, ревматоидный артрит (RA), атопический дерматит, пузырчатку, болезнь Грейвза, тиреоидит Хашимото, гранулематоз Вегенера, синдром Оменна, хроническую почечную недостаточность, острый инфекционный мононуклеоз, ВИЧ и заболевания, ассоциированные в вирусом герпеса. Дополнительными примерами являются тяжелый острый респираторный дистресс-синдром и хореоретинит. Другими дополнительными примерами являются заболевания и нарушения, вызванные инфицированием В-клеток вирусом, таким как вирус ЭпштейнБарра (EBV). В особом варианте изобретения субъекта, которому вводят антитело, дополнительно лечат химиотерапевтическим агентом, облучением или агентом, который модулирует, т.е. повышает или ингибирует,экспрессию или активность Fc-рецептора, Fc рецептора или Fc рецептора, таким как цитокин. Типичные цитокины для введения в процессе лечения включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон- (IFN-) и фактор некроза опухолевых клеток (TNF). Типичные терапевтические агенты включают,среди прочих, противоопухолевые агенты, такие как доксорубицин, цисплатин, блеомицин, кармустин,хлорамбуцил и циклофосфамид. Еще в одном аспекте настоящее изобретение охватывает способ обнаружения in vitro или in vivo присутствия в образце или индивидуально CD20, например, для диагностирования связанных с CD20 заболеваний предпочтительно на ранней стадии. Это также может быть полезно для мониторинга заболевания и эффекта лечения и для определения и корректировки дозы вводимого антитела. In vivo метод можно осуществлять, используя методику визуализации, такую как PET (позитронно эмиссионная томография) или SPECT (единичная фотонно-эмиссионная компьютерная томография). В одном варианте изобретения визуализацию осуществляют путем контактирования тестируемого образца, необязательно наряду с контрольным образцом, с человеческим моноклональным антителом по изобретению в условиях, которые делают возможным образование комплекса антитела и CD20. Затем детектируют образование комплекса (например, с помощью FACS анализа или вестерн-блоттинга). Если наряду с тестируемым образцом используют контрольный образец, комплекс обнаруживают в обоих образцах, и любая статистически значимая разница между образцами в образовании комплексов является показателем присутствия в тестируемом образце CD20. Еще в одном аспекте изобретение охватывает трансгенное отличное от человека животное, такое как трансгенная мышь, которое экспрессирует человеческие моноклональные антитела, которые связываются с CD20. В особом варианте изобретения трансгенное, не являющееся человеком животное представляет собой трансгенную мышь, имеющую геном, содержащий трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения и трансген с легкой цепью человеческого происхождения, кодирующие все антитело по изобретению или его фрагмент. Трансгенное отличное от человека животное можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом CD20 антигена и/или клеток, экспрессирующих CD20. Предпочтительно трансгенное отличное от человека животное, например трансгенная мышь, способно продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к CD20 (например, IgG, IgA и/или IgM) при использовании V-D-J рекомбинации и переключении изотипа. Переключение изотипа может осуществляться с помощью классического или неклассического переключения изотипа. Соответственно еще в одном аспекте изобретение охватывает выделенные В-клетки трансгенного отличного от человека животного, описанного выше, например трансгенной мыши, которая экспрессирует человеческие антитела против CD20. Выделенные В-клетки могут затем быть иммортализованы путем слияния с иммортализованной клеткой для создания источника (например, гибридомы) человеческих антител против CD20. Такие гибридомы (т.е. те, которые продуцируют человеческие антитела против CD20) также входят в объем настоящего изобретения. Как показано в примерах по данному описанию, человеческие антитела по изобретению можно получать непосредственно при использовании гибридом, которые экспрессируют антитело, или можно клонировать и рекомбинантно экспрессировать в клетке-хозяине (например, в СНО клетке, NS/0 клетке или лимфоците). Другими примерами клеток-хозяев являются микроорганизмы, такие как Е. coli и гри-4 021644 бы, такие как дрожжи. Или же, их можно получать методами рекомбинантной ДНК в трансгенном отличном от человека животном или растении. Соответственно в другом аспекте настоящее изобретение охватывает методы получения моноклональных антител, которые связываются с человеческим CD20. В одном варианте изобретения метод включает иммунизацию трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, описанной ранее (например, имеющей геном, содержащий трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения и трансген с легкой цепью человеческого происхождения,кодирующие все антитело против CD20 или его фрагмент), очищенным или обогащенным препаратом человеческого CD20 антигена и/или клеток, экспрессирующих человеческий CD20. Затем получают Вклетки (например, В-клетки селезенки) животного и сливают с клетками миеломы для образования бессмертных гибридомных клеток, которые секретируют человеческие моноклональные антитела противCD20. Еще в одном аспекте изобретение включает нуклеотидные молекулы, кодирующие человеческие антитела против CD20 (например, их вариабельные области), а также рекомбинантные векторы экспрессии, которые включают нуклеиновые кислоты по изобретению, и клетки-хозяева, трансфецированные при использовании таких векторов. Методы получения антител с помощью культивирования этих клеток-хозяев также охватываются данным изобретением. Конкретные нуклеиновые кислоты по изобретению содержат нуклеотидные последовательности, показанные SEQ ID NO: 1, 5 или 9 и SEQ ID NO: 3, 7 или 11, кодирующих тяжелую и легкую цепи соответственно человеческих антител 2F2, 7D8 и 11 В 8 против CD20. Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведенного подробного описания и формулы изобретения. Краткое описание фигур На фиг. 1 показан вектор pCON 1f/вариабельная (область)-тяжелая (цепь), используемый для рекомбинантного продуцирования человеческих моноклональных антител 2F2 и 11 В 8. На фиг. 2 показан вектор pCON 1f/вариабельная (область)-тяжелая (цепь), используемый для рекомбинантного продуцирования 2F2 и 11 В 8. На фиг. 3 показан двугенный вектор клонирования (pCON 1f/k2A2), используемый для рекомбинантного продуцирования 2F2 и 11 В 8. На фиг. 4 изображен график сравнения определенного методом проточной цитометрии связывания человеческих антител 2F2, 7D8 и 11 В 8 с клетками NS/0, трансфецированными при использовании Raji,Daudi и CD20, и родительскими NS/0 клетками. На фиг. 5 А и 5 В показано определенное методом проточной цитометрии связывание 2F2 с РВМС у трех доноров-людей. На фиг. 6 изображен график, на котором сравниваются аффинности связывания меченного 125I 2F2 и меченного 125I 11B8 с клетками Ramos-EHRB. На фиг. 7 А и 7 В показано связывание меченного 125I 2F2 и меченного 125I 11B8 по сравнению с меченным 125I ритуксимабом (химерное антитело против CD20, IDEC) и меченным 125I В 1 (термин В 1 соответствует немеченой форме Bexxar, которое представляет собой меченное 131I мышиное антитело против человеческого CD20, Coulter) с клетками Ramos-EHRB (А) и клетками Daudi (В). На фиг. 8 показан график сравнения скорости диссоциации меченного 125I 11 В 8 Т, меченного 125I 2F2, меченного 125I ритуксимаба (RIT) и меченного 125I B1. На фиг. 9 показаны скорости диссоциации F(ab')2 фрагментов 2F2, 11 В 8 Т и ритуксимаба в клеткахRamos-EHRB. На фиг. 10 А и 10 В показана CDC (комплементзависимая цитотоксичность), индуцированная 2F2,11 В 8 Т, ритуксимабом и изотипом контрольного антитела (HuMad-KLH), клеток Daudi (А) и клеток SUDHL-4 (В) в различных временных точках (функциональная "off-rate"), определяемая методом проточной цитометрии. На фиг. 11 А-Е показана кинетика CDC, индуцированной 2F2 и ритуксимабом в различных клеточных линиях, определяемая с применением проточной цитометрии. На фиг. 12A-D показана кинетика CDC, индуцированной 2F2 и ритуксимабом в различных клеточных линиях, как функция концентрации комплемента (нормальной человеческой сыворотки (NHS при двух различных концентрациях антитела, определяемая с применением проточной цитометрии. На фиг. 13A-D показана зависимая от концентрации индукция CDC, индуцированной 2F2 и ритуксимабом в различных клеточных линиях, определяемая с применением проточной цитометрии. На фиг. 14 А и 14B показана зависимая от концентрации индукция CDC, вызываемая 2F2, 2F2T,11 В 8 Т, В 1 и ритуксимабом в клетках Daudi (А) и Raji (В), определяемая с применением проточной цитометрии. На фиг. 15 А и 15 В показаны графики сравнения CDC (клеточной цитотоксичности) клеток Daudi(клеток, экспрессирующих низкие уровни CD55/59), вызываемой человеческими моноклональными антителами 2F2, 7D8 и 11 В 8 Т и ритуксимабом; график (А) показывает лизис неотмытых клеток в процентах, а график (В) показывает лизис клеток, отмытых перед прибавлением сыворотки, в процентах. На фиг. 16 А и 16 В показаны графики сравнения CDC клеток Raji (клеток, экспрессирующих высокие уровни CD55/59), вызываемой человеческими моноклональными антителами 2F2, 7D8, 11 В 8 Т, В 1 и ритуксимабом; график (А) показывает лизис (в процентах) клеток, не блокированных антителами противCD55 и против CD59, а график (В) показывает лизис клеток, блокированных антителами против CD55 и против CD59, в процентах. На фиг. 17 А-С показана роль CD55 и CD59 в CDC, индуцированной 2F2 и ритуксимабом в клеткахRaji. На фиг. (А) показан процент клеток, лизированных при добавлении антитела против CD55; на фиг.(В) показан процент клеток, лизированных при добавлении антитела против CD59, а график (С) показывает процент клеток, лизированных при добавлении как антитела против CD55, так и антитела противCD59. На фиг. 18A-D показано связывание фактора комплемента C1q при использовании 2F2 и ритуксимаба в различных клеточных линиях, определяемая проточной цитометрией. На фиг. 19A-D показано отложение фрагмента фактора комплемента С 4 с с помощью 2F2 и ритуксимаба в различных клеточных линиях, определяемая проточной цитометрией. На фиг. 20 показан лизис клеток ARH-77 с помощью 2F2, ритуксимаба и 11 В 8 Т в присутствииPMN, MNC, плазмы или цельной крови. На фиг. 21 показан лизис клеток В-CLL с помощью 2F2, ритуксимаба и 11 В 8 Т в присутствии PMN,MNC, плазмы или цельной крови. На фиг. 22 показан лизис клеток HCL (волосатоклеточной лейкемии) с помощью 2F2, ритуксимаба и 11 В 8 Т в присутствии PMN, MNC, плазмы или цельной крови. На фиг. 23 показан лизис клеток В-ALL с помощью 2F2, ритуксимаба и 11 В 8 Т в присутствии PMN,MNC, плазмы или цельной крови. На фиг. 24 показан лизис клеток фолликулярной лимфомы с помощью 2F2, ритуксимаба и 11 В 8 Т в присутствии PMN, MNC, плазмы или цельной крови. На фиг. 25 показан лизис клеток лимфомы из клеток мантийной зоны с помощью 2F2, ритуксимаба и 11 В 8 Т в присутствии PMN, MNC, плазмы или цельной крови. На фиг. 26 показан зависимый от концентрации лизис клеток ARH-77 с помощью 2F2 и ритуксимаба в присутствии цельной крови. На фиг. 27 показан опосредованный MNC лизис клеток ARH-77 с помощью 2F2, 11 В 8 Т и ритуксимаба. На фиг. 28 показан опосредованный MNC лизис Raji клеток с помощью 2F2, 11 В 8 Т и ритуксимаба. На фиг. 29 А-С даны графики, показывающие образование кластеров CD20 в липидных рафтах("липидных плотах") при инкубации с 2F2, 7D8 или 11 В 8 Т, построенные с помощью FRET анализа и анализа нерастворимости с Тритоном-X. На фиг. 30 показано образование кластеров CD20 в липидных рафтах ("липидных плотах") при инкубации с 2F2, ритуксимабом или 11 В 8 Т, построенные с помощью FRET анализа. На фиг. 31 показано соотношение CD20, остающегося в нерастворимой фракции рафта (плота) после обработки Тритоном-Х-100 (ТХ) и инкубации с 2F2, ритуксимабом и 11 В 8 Т. На фиг. 32 показано распределение CD20 между "рафтовой" и "нерафтовой" мембранными фракциями при стимулировании клеток Daudi 2F2, ритуксимабом и 11 В 8 Т. На фиг. 33 А-G показан апоптоз клеток Daudi с помощью 2F2, 7D8 и 11 В 8 Т, определяемый проточной цитометрией. На фиг. 34 показана индукция апоптоза клеток Raji с помощью 2F2, 11 В 8 Т, ритуксимаба или В 1,определяемая проточной цитометрией. На фиг. 35 А показана индукция апоптоза клеток Daudi с помощью 2F2, 11 В 8 Т, ритуксимаба или В 1,определяемая проточной цитометрией. На фиг. 35 В показан апоптоз клеток Daudi на ранней и поздней стадии с помощью 2F2, 11 В 8 Т, ритуксимаба или В 1, определяемый проточной цитометрией. На фиг. 36 А-Е показана гомотипическая адгезия клеток Ramos-EHRB при использовании 2F2, 7D8 и 11 В 8 Т, определяемая с помощью оптической спектроскопии. На фиг. 37 показана гомотипическая адгезия клеток Daudi при использовании 2F2, ритуксимаба и В 1, определяемая с помощью оптической спектроскопии. На фиг. 38 дан график, показывающий процент выживания мышей SCID, которым инъецированы клетки Daudi и которые обработаны 2F2 или 7D8. На фиг. 39 дан график, показывающий процент выживания мышей SCID, которым инъецированы клетки Tanoue и которые обработаны 2F2, ритуксимабом или В 1. На фиг. 40 показан процент выживания мышей SCID, которым инъецированы клетки Daudi и которые обработаны различными концентрациями 2F2 или ритуксимаба. На фиг. 41 показан процент выживания мышей SCID, которым инъецированы клетки Daudi и которые обработаны 11 В 8 Т или В 1. На фиг. 42 дана биолюминесцентная визуализация опухолевых клеток у мышей SCID в день 39 лена красным цветом (темные участки на изображении мышей) (интенсивность света 50 фотонов за 5 мин) как перекрывание черного и белого на изображении мышей. На фиг. 43 показана массы опухоли у каждой мыши, количественно определяемая интегрированием световых сигналов от поверхности тела в день 25, 32, 39 и 46 после введения, в день 8, 10 мкг В 1, ритуксимаба, 11 В 8 Т. 2F2T или huIgG. На фиг. 44 А-С показан проточно-цитометрический анализ клеток CD20 в периферической крови обезьян Cynomolgus после внутривенного введения различных доз - 41.25 мг/кг (А), 46.25 мг/кг (В) или 412.50 мг/кг (С) - 2F2 или ритуксимаба. На фиг. 45 А-С показан проточно-цитометрический анализ клеток CD21+ в периферической крови обезьян Cynomolgus после внутривенного введения различных доз - 41.25 мг/кг (А), 46.25 мг/кг (В) или 412.50 мг/кг (С) - 2F2 или ритуксимаба. На фиг. 46 А-С показан проточно-цитометрический анализ клеток CD20+ в лимфатических узлах обезьян Cynomolgus после внутривенного введения различных доз - 41.25 мг/кг (А), 46.25 мг/кг (В) или 412.50 мг/кг (С) - 2F2 или ритуксимаба. На фиг. 47 А-С показан проточно-цитометрический анализ CD20lowCD23+CB40high экспрессирующих клеток в периферической крови обезьян Cynomolgus после внутривенного введения различных доз 41.25 мг/кг (А), 46.25 мг/кг (В) или 412.50 мг/кг (С) - 2F2 или ритуксимаба. На фиг. 48 А-Е показано связывание ритуксимаба (A), 2F2 (В), 11 В 8 Т (С), В 1 (D) или изотипа контрольного антитела (Е) с клетками СНО, экспрессирующими дикого типа (WT) CD20, мутантный CD20(АхР) или как WT CD20, так и мутантный CD20 (АхР), определяемое проточной цитометрией. На фиг. 49A-F показан процент связывания 2F2, 11 В 8 Т, В 1 или ритуксимаба с мутантным P172S vsWT CD20 (А), процент связывания 2F2, 11 В 8 Т, B1, CAT (CAT 12.6 Е 12, мышиное моноклональное IgG2A антитело против CD20, Diatec.Com.), изотипа контрольного антитела (KLH) или ритуксимаба с мутантным CD20 (АхР) vs WT CD20 (В), процент связывания 2F2, 11 В 8 Т, В 1 или ритуксимаба с мутантным(Е) и процент связывания 2F2T, CAT или ритуксимаба с мутантным N163D vs WT CD20(F). На фиг. 50 показано связывание 2F2T, 7D8 и изотипа контрольного антитела по определению методом ELISA с тремя антиидиотипическими антителами, анти-2F2 sab 1.1, анти-2F2 sab 1.2 и анти-2F2 sab 1.3, специфичными к 2F2. На фиг. 51 показано связывание 11 В 8 Т по определению методом ELISA с тремя антиидиотипическими антителами, анти-11 В 8 Т sab 2.2, анти-11 В 8 Т sab 2.3, анти-11 В 8 Т sab 2.4, анти-11 В 8 Т sab 2.5, анти 11 В 8 Т sab 2.6,специфичное к 11 В 8 Т, но не связывание с антиидиотипическими антителами против 2F2. На фиг. 52 А-С показано зависящее от дозы связывание 2F2T по определению методом ELISA с тремя антиидиотипическими антителами, анти-2F2 sab 1.1 (А), анти-2F2 sab 1.2(В) и анти-2F2 sab 1.3 (С),специфичными к 2F2. На фиг. 53 показаны аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) V области тяжелой цепи и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) V области легкойцепи человеческого моноклонального антитела 2F2 с обозначенными CDR областями. На фиг. 54 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) V области тяжелой цепи и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 3) V области легкойцепи человеческого моноклонального антитела 2F2. На фиг. 55 показаны аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) V области тяжелой цепи и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8) V области легкойцепи человеческого моноклонального антитела 7D8 с обозначенными CDR областями. На фиг. 56 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:5) V области тяжелой цепи и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:7) V области легкойцепи человеческого моноклонального антитела 7D8. На фиг. 57 показаны аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 10) V области тяжелой цепи и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 12) V области легкойцепи человеческого моноклонального антитела 11 В 8 с обозначенными CDR областями. На фиг. 58 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:9) V области тяжелой цепи и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 11) V области легкойцепи человеческого моноклонального антитела 11 В 8. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение охватывает усовершенствованную "антительную" терапию для лечения и диагностирования нарушений, включающих клетки, экспрессирующие CD20. Терапия по изобретению применяет выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом в CD20. Выделенные человеческие моноклональные антитела, охватываемые настоящим изобретением, включают антитела IgA, IgG4, IgE, IgM и IgD. В одном варианте изобретения антитело является IgG1 антителом, более конкретно, IgG1, илиIgG1, изотипа. В другом варианте изобретения антитело является IgG3 антителом, более конкретно,IgG3, или IgG3, изотипа. Еще в одном варианте изобретения антитело является IgG4 антителом, более конкретно, IgG4, или IgG4, изотипа. Еще в одном варианте изобретения антитело является IgA1 илиIgA2 антителом. Еще в одном варианте изобретения антитело является IgM антителом. В одном варианте изобретения человеческие антитела продуцируются в отличном от человека трансгенном животном, например в трансгенной мыши, способном продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к CD20 при использовании V-D-J рекомбинации или переключения изотипа. Соответственно аспекты по изобретению включают не только антитела, фрагменты антител и их фармацевтические композиции, но также отличных от человека трансгенных животных, В-клетки,трансфектомы клеток-хозяев и гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела. Такое трансгенное животное может также быть трансгенным кроликом для продуцирования поликлональных антител, таких как поликлональные антитела, описанные в патентной заявке США 2003/0017534. Соответственно изобретение также охватывает человеческие поликлональные антитела, которые специфически связываются с CD20. В одном варианте изобретение относится к поликлональным антителам, которые связываются с эпитопом на CD20 (i), который не содержит или которому не требуется аминокислотный остаток пролин в положении 172; (ii) который не содержит или которому не требуются аминокислотные остатки аланин в положении 170 или пролин в положении 172; (iii) который содержит или которому требуются аминокислотные остатки аспарагин в положении 163 и аспарагин в положении 166; (iv) который не содержит или которому не требуется аминокислотный остаток пролин в положении 172, но который содержит или которому требуются аминокислотные остатки аспарагин в положении 163 и аспарагин в положении 166; или (v) который не содержит или которому не требуются аминокислотные остатки аланин в положении 170 или пролин в положении 172, но который содержит или которому требуются аминокислотные остатки аспарагин в положении 163 и аспарагин в положении 166. В другом варианте изобретение относится к человеческим поликлональным антителам, которые имеют одну или более из следующих характеристик: (i) связываются с мутантным P172S CD20 (пролин в положении 172 заменяется на серин), по меньшей мере, с такой же аффинностью, как и с человеческимCD20; (ii) связываются с мутантным АхР (аланин в положении 170 заменен на серин и пролин в положении 172 заменен на серин), по меньшей мере, с такой же аффинностью, как и с человеческим CD20; (iii) показывают пониженное на 50% или более связывание с мутантным N166D (аспарагин в положении 166 заменен на аспарагиновую кислоту) по сравнению с человеческим CD20 при концентрации антитела 10 мкг/мл; и/или (iv) показывают пониженное на 50% или более связывание с мутантным N163D (аспарагин в положении 163 заменен на аспарагиновую кислоту) по сравнению с человеческим CD20 при концентрации антитела 10 мкг/мл. Еще в одном варианте изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые связываются с эпитопом в малой первой внеклеточной петле человеческого CD20. Еще в одном варианте изобретение охватывает также человеческие моноклональные антитела, которые связываются с прерывистым эпитопом на CD20. Еще в одном варианте изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые связывают прерывистый эпитоп на CD20, который содержит участок первой малой внеклеточной петли и участок второй внеклеточной петли. Еще в одном варианте изобретение относится к человеческим поликлональным антителам, которые связываются с прерывистым эпитопом на CD20, содержащим остатки AGIYAP малой первой внеклеточной петли и остатки MESLNFIRAHTPYI второй внеклеточной петли. Изобретение охватывает способы применения антител по изобретению для обнаружения клетки,экспрессирующей CD20. Также охватываются способы применения антител по изобретению для блокирования или ингибирования индуцированных CD20 активностей, например пролиферативной активности и/или активности дифференцировки, и эти методы применимы для лечения нарушений, ассоциированных с CD20, таких как опухолегенные заболевания (например, В-клеточная лимфома) и аутоиммунные заболевания (например, RA (ревматоидный артрит, РА), болезнь Крона и грануломатоз Вегенера). Для того чтобы лучше понять настоящее изобретение, сначала дается определение некоторых терминов. Дополнительные определения вводятся в ходе подробного описания. Термины "CD20" и "антиген CD20" применяются поочередно в данном описании и включают любые варианты, изоформы и гомологи человеческого CD20, которые естественно экспрессируются клетками или экспрессируются в клетках, трансфецированных геном CD20. Связывание антитела по изобретению с антигеном CD20 опосредует киллинг клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевых клеток) путем инактивации CD20. Киллинг клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или более следующих механизмов: комплементзависимая цитотоксичность (CDC) клеток, экспрессирующих CD20; апоптоз клеток, экспрессирующих CD20; вызванный эффекторными клетками фагоцитоз клеток, экспрессирующих CD20; или вызванная эффекторными клетками антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC, АЗКЦ) клеток, экспрессирующих CD20. Признанные в технике синонимы CD20 включают В-лимфоцитарный антиген CD20, антиген В 1 на поверхности В-лимфоцитов, Leu-16, Вр 35, ВМ 5 и LF5. Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "ингибирует рост" (например, по отношению к клетке) включает любое измеряемое уменьшение роста клеток при контакте с антителом против CD20 по сравнению с ростом тех же самых клеток, не контактирующих с антителом противCD20, например ингибирование роста клеточной культуры по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40,50, 69, 70, 80, 90, 99 или 100%. Такое уменьшение роста клеток может происходить по различным механизмам, например, таким как фагоцитоз эффекторными клетками, ADCC, CDC и/или апоптоз. Термин "рафт", "плот" относится к обогащенным сфинголипидами и холестерином мембранным микродоменам, локализованным на внешней поверхности плазменной мембраны клетки. Способность некоторых белков ассоциироваться с такими доменами может влиять на функцию белка. Например,транслокация молекул CD20 в липидные рафты после связывания человеческими антителами по настоящему изобретению дает в плазменных мембранах комплексы антиген CD20-антитело высокой плотности. Такая высокая плотность комплексов CD20-антитело может способствовать эффективной активации системе комплемента в процессе CDC. Термин "антитело" по данному описанию включает целые антитела и любой его антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающий участок") или его одиночную цепь. "Антитело" относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи и две легких (L) цепи, связанных дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий фрагмент. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в данном описании VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в данном описании VL) и константной области легкой цепи. Области VH и VL можно далее подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежающимися (с вкраплениями) более консервативными областями, называемыми остовными (каркасными, скелетными, FR) областями. Каждая VH и VL область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2,CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен,который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Термин "антигенсвязывающий участок (область, фрагмент)" антитела (или просто "область (участок, фрагмент) антитела" по данному описанию относится к одному или более фрагментов антитела,которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, CD20). Показано,что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающий участок" антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из VH, VL, CL и CH1 доменов; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, состоящий из VH и CH1 доменов; (iv) фрагмент Fv, состоящий из VH и VL доменов единственного плеча молекулы антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al.,(1989) Nature 341:544-546), который состоит из VH домена; (vi) выделенную вариабельную область (CDR) и (vii) комбинацию из двух или более изолированных CDR, которые, необязательно, могут быть соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VH и VL, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением методов рекомбинантной ДНК с помощью синтетического линкера, который позволяет им находиться в виде единой белковой цепи, в которой VH и VL области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела охватываются термином "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Другим примером являются слитые белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие (i) полипептид связывающего домена, который сливается с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ii) CH2 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина,слитую с полипептидом шарнирной области, и (iii) CH3 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с СН 2 константной областью. Полипептид связывающего домена может быть вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи. Такие химерные белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. Эти фрагменты антитела получены общепринятыми методами, известными специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же способом, как и интактные антитела. Термин "эпитоп" означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных группирующихся на поверхности молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и, как правило, имеют специфические признаки трехмерной структуры, а также специфический заряд. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачиваются в присутствии денатурирующих агентов. Термин "прерывистый эпитоп" по данному описанию означает конформационный эпитоп на белковом антигене, который образуется по меньшей мере из двух отдельных областей в первичной последовательности белка. Предполагается, что термин "биспецифическая молекула" включает любой агент, например белок,пептид или комплекс белка или пептида, который имеет две различные специфичности связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности и(b) Fc-рецептором на поверхности эффекторной клетки. Предполагается, что термин "полиспецифическая молекула" или "гетероспецифическая молекула" включает любой агент, например белок, пептид или комплекс белка или пептида, который имеет более двух различных специфичностей связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности, (b)Fc-рецептором на поверхности эффекторной клетки и (с) по меньшей мере одним другим компонентом. Соответственно изобретение включает, но без ограничения, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и другие полиспецифические молекулы, которые направлены на антигены клеточной поверхности, такие как CD20, и на другие мишени, такие как Fc-рецепторы на эффекторных клетках. Термин "биспецифическое антитело" также включает "diabodies" ("диатела"). "Диатела"("diabodies") представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых VH и VL домены экспрессируются на одиночной полипептидной цепи, но, так как используется линкер, слишком короткий для того, чтобы было возможно спаривание двух доменов на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайтаStructure 2: 1121-1123). Термин "производные человеческого антитела" относится к любой модифицированной форме антитела, например к конъюгату антитела и другому агенту или антителу. Выражение "происходит из", "из", "образовано из" конкретной последовательности зародышевой линии применяется в данном описании, если антитело получают из системы, использующей последовательности человеческих иммуноглобулинов, например, иммунизацией трансгенной мыши, несущей гены человеческих иммуноглобулинов, или скринингом библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов,причем аминокислотная последовательность выбранного человеческого антитела по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, человеческое антитело, образованное из конкретной последовательности человеческой зародышевой линии, демонстрирует не более 10 различий аминокислот, более предпочтительно не более 5 или еще более предпочтительно не более 4, 3, 2 или 1 различия аминокислот от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Применяемый в данном описании термин "гетероантитела" относится к двум или более антителам,их производным или антигенсвязывающим областям, связанным вместе, из которых по меньшей мере два имеют различные специфичности. Эти различные специфичности включают специфичность связывания с Fc-рецептором на эффекторной клетке и специфичность связывания с антигеном или эпитопом на клетке-мишени, например опухолевой клетке. Предполагается, что термин "человеческое антитело" по данному описанию включает антитела,имеющие вариабельные и константные области последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями геном человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, вводимые случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Однако термин "человеческое антитело" по данному описанию не предполагает включать антитела, в которых последовательности CDR из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, могут быть введены ("трансплантированы") в человеческие остовные последовательности. Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" по данному описанию относятся к препарату молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единую (общую) специфичность и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Следовательно, термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, проявляющим единую (общую) специфичность, которые имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку,полученную от трансгенного или "трансхромосомного" отличного от человека животного, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитый с иммортализованной клеткой. Термин "рекомбинантное человеческое антитело" по данному описанию включает все человеческие антитела, которые получаются, экспрессируются, создаются или выделяются методами рекомбинантной ДНК, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), трангенного или "трансхромосомного" по генам человеческих иммуноглобулинов или полученных из них гибридом (описанных ниже в разделе 1), (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные при использовании комбинаторной библиотеки, содержащей рекомбинантные человеческие антитела, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов в последовательности других ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в некоторых вариантах изобретения такие рекомбинантные человеческие антитела могут претерпевать in vitro мутагенез (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям человеческого Ig, in vivo соматический мутагенез), и тем самым аминокислотные последовательности VH и VL областей рекомбинантных антител секвенируют таким образом, что несмотря на то, что они образованы из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и являются родственными им, они не могут существовать в природе в составе человеческого антитела зародышевой линии in vivo. Термин "трансфектома" по данному описанию включает рекомбинантную эукариотную клеткухозяина, экспрессирующую антитело, такую как клетки СНО, клетки NS/0, клетки HEK293, растительные клетки или клетки грибов, включая клетки дрожжей. Применяемый в данном описании термин "гетерологическое антитело" определяют в связи с трансгенным, отличным от человеческого, организмом, продуцирующим такое антитело. Этот термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодирующую нуклеотидную последовательность, соответствующие последовательностям антитела, обнаруживаемого в организме, не являющемся организмом трансгенного отличного от человека животного, и, как правило, вида, иного,нежели вид в трансгенном отличном от человека животном. Применяемый в данном описании термин "гетерогибридное антитело" относится к антителу, имеющему легкую и тяжелую цепи, происходящие из различных организмов. Например, антитело, имеющее тяжелую цепь, ассоциированную с мышиной легкой цепью, является гетерогибридным антителом. Примеры гетерогибридных антител включают химерные и гуманизированные антитела, обсуждавшиеся выше. Предполагается, что термин "выделенное антитело" по данному описанию относится к антителу,практически не содержащему других антител, имеющих отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с CD20, практически не содержит антител, которые специфически связываются с антигенами, иными, нежели CD20). Выделенное антитело,которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого CD20, может,однако, иметь кросс-реактивность в отношении других родственных антигенов, например других видов(например, гомологи CD20 вида). Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном варианте изобретения комбинация"выделенных" моноклональных антител, имеющих различные специфичности, объединены в определенную композицию. Применяемый в данном описании термин "специфическое связывание" относится к антителу, связывающемуся с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью, соответствующей KD, примерно, 110-7 М или меньше, и связывается с заданным антигеном с аффинностью, соответствующей KD, которая по меньшей мере на два порядка (по абсолютной величине) ниже, чем его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеин), иным, нежели заданный антиген или близкородственный антиген. Выражения "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное в отношении антигена" применяются в данном описании взаимозаменяемо, поочередно с выражением "антитело, которое связывается специфически с антигеном". Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "kd" (с-1) относится к константе скорости диссоциации взаимодействия "конкретное антитело-антиген". Указанную величину также называют величиной koff. Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "ka" (М-1 с-1) относится к константе скорости ассоциации взаимодействия "конкретное антитело-антиген". Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "KD" (М) относится к константе равновесной диссоциации взаимодействия "конкретное антитело-антиген". Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "KA" (М-1) относится к константе равновесной ассоциации взаимодействия "конкретное антитело-антиген" и эту величину получают делением ka на kd. Предполагается, что применяемый в данном описании термин "изотип" относится к классу антител(например, IgM или IgG1), которые кодируются генами константных областей тяжелой цепи. Применяемое в данном описании выражение "переключение изотипа" относится к явлению, когда класс, или изотип, антитела меняется с одного Ig класса на один из других Ig классов. Применяемое в данном описании выражение "непереключенный изотип" относятся к изотипическому классу тяжелой цепи, которая продуцируется, когда не происходит переключения изотипа; СН ген, кодирующий непереключенный изотип, как правило, представляет собой первый ген непосредственно по ходу транскрипции от функционально реаранжированный VDJ ген. Переключение изотипа классифицируют как классическое или неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит с помощью событий рекомбинации, которые включают по меньшей мере одну область последовательности-переключателя в трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, гомологичной рекомбинацией между человеческойи человеческой(ассоциированная делеция). Альтернативные неклассические механизмы переключения, среди прочего,такие как интертрансгенная и/или интерхромосомная рекомбинации, могут происходить и осуществлять переключение изотипа. Применяемый в данном описании термин " последовательность-переключатель" относится к последовательностям ДНК, ответственным за рекомбинацию с переключением. Последовательность "донора переключения", как правило,область переключения, располагается 5' (т.е. upstream, против хода транскрипции) от области конструкции, удаляемой в ходе рекомбинации с переключением. Область "акцептора переключения" находится между удаляемой (делетируемой) конструкцией и константной областью замены (например, ,и т.д.). Так как отсутствует специфичный сайт, в котором всегда происходит рекомбинация, последовательность конечного гена, как правило, нельзя предсказать исходя из конструкции. Применяемый в данном описании термин "тип гликозилирования, гликозилирующий паттерн" определяется как тип (паттерн) углеводных единиц (элементов), ковалентно связанный с белком, более конкретно с иммуноглобулиновым белком (белком антитела). Тип гликозилирования гетерологического антитела можно охарактеризовать как практически аналогичный типам гликозилирования, встречающимся в природе на антителах, продуцированных видом отличного от человека трангенного животного,когда специалист в данной области техники поймет, что тип гликозилирования гетерологического антитела более похож на тип гликозилирования вида отличного от человека животного, чем на вид, из которого образованы СН гены трансгена. Термин "природный" по данному описанию, применяемый к объекту, относится к тем случаям, когда объект может встречаться в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которую можно выделить из источника в природе и которая не модифицирована преднамеренно человеком в лаборатории, является природной. Термин "реаранжированный", "перегруппированный" по данному описанию относится к конфигурации тяжелой цепи или легкой цепи локуса иммуноглобулина, в котором V сегмент позиционирован как непосредственно прилегающий к D-J или J сегменту в конформации, кодирующей в основном полный VH и VL домен соответственно. Перегруппированный (реаранжированный) локус гена иммуноглобулина (антитела) можно идентифицировать, сравнивая с ДНК зародышевой линии; перегруппированный локус содержит по меньшей мере один рекомбинированный гептамерный/нонамерный элемент гомологии. Термин "неаранжированный" ("неперегруппированный") или "конфигурация зародышевой линии" по данному описанию по отношению к V сегменту относится к конфигурации, в которой V сегмент не рекомбинируется таким образом, чтобы непосредственно прилегать к сегменту D или J. Предполагается, что термин "нуклеотидная молекула", "молекула нуклеиновой кислоты" по данному описанию включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Нуклеотидная молекула может быть однонитевой (одноцепочечной) или двухнитевой (двухцепочечной), но предпочтительно двухнитевой ДНК. Предполагается, что термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" по данному описанию по отношению к нуклеиновым кислотам (нуклеотидам), кодирующим полные антитела или участки антител(например, VH, VL, CDR3), которые связываются с CD20, относится к нуклеотидной молекуле, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие интактное антитело или фрагмент антитела, не содержат других нуклеотидных последовательностей, кодирующих полное антитело или фрагменты (участки) антитела, которые связывают антигены, иные, нежели CD20, каковые другие последовательности могут в природе фланкировать нуклеиновую кислоту в человеческой геномной ДНК. В одном варианте изобретения человеческое антитело против CD20 включает нуклеотидную или аминокислотную последовательность 2F2, 7D8 или 11 В 8, а также вариабельные области тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL), имеющие последовательности, показанные на SEQ ID NO: 1, 5 или 9 и SEQ ID NO: 3, 7 или 11 соответственно. Как описывается в данном описании и заявляется в формуле в данном описании, последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1-30, включают "модификации консервативных последовательностей", т.е. модификации нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, которые не оказывают значительного влияния на или не изменяют в значительной степени характеристики связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие модификации консервативных последовательностей включают нуклеотидные и амино- 12021644 кислотные замены, добавления или делеции. Модификации можно вводить в SEQ ID NO: 1-30 стандартными методами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, в которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток с аналогичной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющие аналогичные боковые цепи, определены (охарактеризованы, установлены) в технике. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например,лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин,серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, остаток заменимой аминокислоты в человеческом антителе против CD-20 предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из семейства с такими же боковыми цепями. Настоящее изобретение также охватывает "производные" аминокислотных последовательностей,представленных SEQ ID NO: 1-30, и модификации их консервативных последовательностей, в которых один или более аминокислотный остаток дериватизирован, например, ацилированием или гликозилированием, что не оказывает значительного влияния или не изменяет значительно характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотные последовательности. Кроме того, настоящее изобретение включает антитела, в которых сделаны изменения в Fc области,чтобы изменить функциональные или фармакокинетические свойства антител. Такие изменения могут привести к уменьшению или увеличению Clq связывания и CDC или FcR связывания и ADCC. Можно,например, сделать замены в одном или более аминокислотных остатков в положениях 234, 235, 236, 237,297, 318, 320 и 322 константной области тяжелой цепи, тем самым вызывая изменение эффекторной функции, в то же время сохраняя способность связываться с антигеном, по сравнению с немодифицированным антителом, ср. патенты США 5624821 и 5648260.In vivo период полужизни антител можно также увеличить, модифицируя эпитоп рецептора"мусорщика" константного домена Ig или Ig-подобного константного домена так, чтобы молекула не содержала интактного СН 2 домена или интактной Ig Fc области, ср. патенты США 6121022 и 6194551. Кроме того, in vivo период полужизни можно увеличить, осуществляя мутации в Fc области, например,заменой треонина на лейцин в положении 252, заменой треонина на серин в положении 254 или заменой треонина на фенилаланин в положении 256, ср. патент США 6277375. Помимо этого, тип гликозилирования антител можно модифицировать для того, чтобы изменить эффекторную функцию антител. Например, можно экспрессировать антитела в трансфектоме, которая не добавляет элемент (единицу) фукозы, обычно соединенный с Asn в положении 297 области Fc, чтобы повысить аффинность области Fc к FcRIII, что, в свою очередь, приведет к повышенной АЗКЦ (ADCC) антител в присутствии клеток NK, ср. Shield et al. (2002), JBC, 277:26733. Кроме того, для модификацииCDC можно модифицировать галактозилирование. Или же, в другом варианте изобретения можно вводить мутации произвольно по всей или по участку последовательности, кодирующей антитело против CD-20, например, с помощью мутагенеза насыщения, и полученные в результате модифицированные антитела против CD-20 можно подвергнуть скринингу на активность связывания. Соответственно антитела, кодированные (вариабельные области тяжелой и легкой цепи) нуклеотидными последовательностями по данному описанию и/или содержащие (вариабельные области тяжелой и легкой цепи) аминокислотные последовательности по данному описанию (т.е. SEQ ID NO: 1-30),включают практически аналогичные антитела, кодированные аналогичными последовательностями или содержащие аналогичные последовательности, "консервативно модифицированные". Дополнительное обсуждение того, как эти практически аналогичные антитела можно получить исходя из частичных (например, вариабельных областей тяжелой и легкой цепи) последовательностей по данному описанию,таких как SEQ ID NO: 1-30, дано ниже. В случае нуклеиновых кислот термин "практическая гомология" указывает, что две нуклеиновые кислоты или их указанные последовательности при оптимальном наложении и сравнении явяются идентичными при наличии соответствующих инсерций или делеций нуклеотидов по меньшей мере примерно в 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере примерно в 90-95% нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере примерно в 98-99.5% нуклеотидов. Или же, практическая гомология существует, когда сегменты гибридизуются в селективных условиях гибридизации с комплементом цепи. По отношению к нуклеотидной и аминокислотной последовательностям термин "гомология" указывает на степень идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями при оптимальном наложении и сравнении с соответствующими инсерциями или делециями. Или же, практическая гомология существует тогда, когда ДНК сегменты гибридизуются в селективных условиях гибридизации с комплементом цепи. Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (например, % гомологии= идентичных положений/общее число положений 100), принимается во внимание число гэпов и протяженность каждого гэпа, которые требуется ввести для оптимального совмещения (наложения) двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно выполнять, используя математический алгоритм, описанный в неограничивающих примерах, приведенных ниже. Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить, используяweight" 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с помощью алгоритма Е. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci.,4:11-17 (1988, который встроен в программу ALIGN (вариант 2.0), используя РАМ 120 таблицу масс остатков, штрафную функцию длины гэпа 12 и штрафную функцию гэпа 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970, который встроен в программу GAP в программном обеспечении GCG (доступной по адресу в Интернете http://www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу РАМ 250 и массу гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и "length weight" 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Далее, нуклеотидные и аминокислотные последовательности по данному изобретению можно использовать в качестве "последовательности по запросу" для осуществления поиска в доступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск можно осуществлять, например, используя программы NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:403-10. Поиск нуклеотидов BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST, показатель (степень)=100, длина кода=12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Поиск BLAST белков можно осуществлять с помощью программы XBLAST, степень=50, длина кода=3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам по изобретению. Для проведения совмещения последовательностей с гэпами с целью сравнения можно использовать программу Gapped BLAST, описанную Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. При использовании программ BLAST и GappedBLAST можно использовать параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) по умолчанию; см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в клеточном лизате или в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "представленной практически чистой", когда она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/SDS, CsCl бэндинг (дифференциальное окрашивание хромосом), колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие общеизвестные в технике методы; см. F. Ausubel, etal., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley biterscience, New York (1987). Составы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, хотя часто имеющие нативную последовательность (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.) любой кДНК, геномной или их смесей, можно сделать мутантными стандартными методами с целью получения последовательностей генов. В случае кодирующих последовательностей эти мутации, если нужно, могут влиять на аминокислотную последовательность. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, практически гомологичные нативным V, D, J, константным переключениям и другим таким последовательностям по данному описанию или образованные из этих последовательностей (где "образованный" ("derived") указывает на то, что последовательность идентична другой последовательности или получена модификацией другой последовательности). Нуклеиновая кислота "функционально связана", если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Что касается транскрипции регуляторных последовательностей, функционально связанный означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются соседними и, если необходимо соединить две области,кодирующие белок, соседними и в рамке считывания. Что касается последовательностейпереключателей, "функционально связанный" указывает, что последовательности способны осуществлять рекомбинацию переключения. Предполагается, что термин "вектор" по данному описанию относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать (переносить) другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является "плазмида", термин, относящийся к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные ДНК сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные ДНК сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегри- 14021644 рованы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и тем самым реплицированы вместе с геномом-хозяином. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании называются "векторами рекомбинантной экспрессии" (или просто "векторами экспрессии"). В целом векторы экспрессии, применяемые в методах рекомбинантной ДНК, часто находятся в виде плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут применяться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее общеупотребительной формой вектора. Предполагается, однако, что изобретение включает такие другие формы векторов экспрессии(экспрессирующих векторов), как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы,аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют аналогичные (эквивалентные) функции. Предполагается, что термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") по данному описанию относится к клетке, в которую вводят рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что такие термины, как предполагается, относятся не только к клетке конкретного субъекта,но к потомству такой клетки. Так как в последующих поколениях могут встречаться некоторые модификации вследствие либо мутации, либо влияния окружающей среды, на самом деле такое потомство может не быть идентичным родительской клетке, но, тем не менее, охватывается термином "клетка-хозяин" по данному изобретению. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как клетки СНО, клетки NS/0 и лимфоциты. Термин "субъект" по данному описанию включает человека или отличное от человека животное. Термин "отличное от человека ("нечеловеческое") животное" включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овца, собака, корова,куры, земноводные, пресмыкающиеся и т.д. Выражение "трансгенное отличное от человека животное" относится к отличному от человека животному, имеющему геном, содержащий один или более трансгенов или трансхромосом с тяжелой и/или легкой цепью человеческого происхождения (интегрированных или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного) и способный экспрессировать полностью человеческие антитела. Например,трансгенная мышь может иметь трансген с легкой цепью человеческого происхождения и либо трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения, либо трансхромосому с тяжелой цепью человеческого происхождения, так что мышь, будучи иммунизирована CD20 антигеном и/или клетками, экспрессирующими CD20, продуцирует человеческие антитела против CD20. Трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных, например, HuMAb мышей, таких как мыши Нсо 7 или Нсо 12, или трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения можно сохранять вне хромосомы, как в случае трансхромосомных (например, KM) мышей, описанных в Международной заявке WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к CD20 (например,IgG, IgA и/или IgE), если претерпевают V-D-V рекомбинацию и переключение изотипа. Различные аспекты изобретения более подробно описаны в подразделах, приведенных ниже.I. Получение человеческих антител к CD20. Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно получать многими методами,включая обычную методологию моноклональных антител, например стандартный метод гибридизации соматических клеток Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975). Хотя методы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе для получения моноклонального антитела можно применять другие методы, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов или методы фагового дисплея, используя библиотеки генов человеческих антител. Предпочтительной животной системой для получения гибридом, которые секретируют человеческие моноклональные антитела, является мышиная система. Получение гибридом в мыши является общепризнанным методом. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния (гибридизации) известны в технике. Гибридообразующие клетки-партнеры, например клетки мышиной миеломы, и методики гибридизации также известны. В предпочтительном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела против CD20 можно получать, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих фрагменты (части) скорее иммунной системы человека, нежели системы мыши. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, обозначенных в данном описании "мыши HuMab" и "мыши KM" соответственно,и в данном описании имеют общее название "трансгенные мыши". Мышь HuMAb содержит "минилокусы" гена человеческого иммуноглобулина, которые кодируют неперегруппированные последовательности тяжелой ( и ) и легкойцепи человеческого иммуноглобулина, вместе с нацеленными мутациями, которые инактивируют локусы эндогенных - и -цепей(Lonberg, N. et al (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Соответственно мыши проявляют пониженную экспрессию мышиного IgM илии в ответ на иммунизацию, введенные трансгены с тяжелой и легкой цепью человеческого происхождения претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с обра- 15021644 зованием человеческих моноклональных антител IgG, (Lonberg, N. et al. (1994), см. выше; обзор в Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, и Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546). Получение мышей HuMAb подробно описано в Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:62876295; Chen, J. et al (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:29122920, Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar,D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Помимо этого, см. патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; все выданы Lonberg and Kay, а также патент США 5545807, выданный Surani et al.; международные заявки WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 b WO 01/09187. Мышь KM содержит трансхромосому с тяжелой цепью человеческого происхождения и слегкой цепью человеческого происхождения трансгена. Эндогенные гены с мышиной тяжелой и легкой цепью также диссоциированы в мышах KM, так что иммунизацация мышей ведет скорее к продуцированию человеческих иммуноглобулинов, нежели мышиных иммуноглобулинов. Конструкция KM мышей и их применение для индуцирования человеческих иммуноглобулинов подробно описаны в Международной заявке WO 02/43478. Иммунизация. Для получения полностью человеческих моноклональных антител к CD20 трансгенных или трансхромосомных мышей, содержащих гены человеческих иммуноглобулинов (например, мышей НСо 12,НСо 7 или KM), можно иммунизировать препаратом, обогащенным CD20 антигеном, и/или клетками,экспрессирующими CD20, описанными, например, в Lonberg et al. (1994), см. выше; Fishwild et al (1996),см. выше, и в Международной патентной заявке WO 98/24884. Или же, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующими человеческий CD20. Предпочтительно для первой инфузии берут мышей в возрасте 6-16 недель. Например, обогащенный препарат (5-50 мкг) антигена CD20 можно использовать для иммунизации мышей HuMAb интраперитонеально. В событии, когда иммунизация с использованием очищенного и обогащенного антигена CD20 не приводит к антителам, для индуцирования иммунного ответа мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими CD20, например клеточной линией. Кумулятивный опыт с различными антигенами показал, что трансгенные мыши HuMAb лучше всего отвечают (реагируют), когда их сначала иммунизируют интраперитонеально (IP) или подкожно (SC) клетками, экспрессирующими CD20, в полном адъюванте Фрейнда с последующими IP иммунизациями через неделю (каждые две недели) (всего вплоть до 10) клетками, экспрессирующими CD20, в PBS. Мониторинг иммунного ответа можно проводить в течение курса иммунизации по протоколу с образцами плазмы, полученными при ретроорбитальном кровотечении. Скрининг плазмы можно проводить с помощью анализа FACS (описанного ниже), а мышей с удовлетворительными титрами человеческого иммуноглобулина против CD20 можно использовать для слияний (гибридизации). Мышам можно внутривенно вводить бустер-инъекцию клеток, экспрессирующих CD20, за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки. Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела против CD20. Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к человеческому CD20, спленоциты и клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей можно выделить и гибридизовать с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы можно затем подвергнуть скринингу на продуцирование антиген-специфических антител. Например, единую суспензию лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей можно гибридизовать с SP2/O Ag8.653 несекретирующими клетками мышиной миеломы (АТСС,CRL 1580) с 50% PEG (вес./об.). Клетки можно засевать с примерной плотностью 110 на лунку в титрационный микропланшет с плоским профилем дна лунки с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей, помимо обычных реагентов, 10% фетальной (телячьей) сыворотки для клонирования, 5-10% фактора начала клонирования гибридомы (IGEN) и 1X HAT (Sigma). Примерно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой HAT замещают на НТ. Затем индивидуальные клетки можно подвергнуть скринингу методом ELISA на антитела, содержащие легкую цепьчеловеческого происхождения, и анализом FACS с применением клеток, экспрессирующих CD20, наCD20 специфичность. Обычно, когда происходит интенсивный рост гибридом, среду можно наблюдать через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитело, можно снова культивировать, снова подвергнуть скринингу и, если они позитивны в отношении человеческого IgG, моноклональные антитела против CD20 можно субклонировать по меньшей мере дважды при ограниченном разведении. Стабильные субклоны можно затем культивировать in vitro для получения антитела в тканевой культуральной среде для характеристики. Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела с CD20. Человеческие антитела по изобретению также можно получать в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, комбинацию методов рекомбинантной ДНК и методов трансфекции гена, хорошо известных в технике (Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Например, в одном варианте изобретения ген(-ы), представляющий(-ие) интерес, например ген человеческих антител, может быть лигированы в экспрессирующий вектор, такой как плазмида экспрессии в клетках эукариот, такую, как используемая системой экспрессии GS генов, описанной в Международных заявках WO 87/04462, WO 89/01036 и Европейском патенте ЕР 338841, или другими системами экспрессии, хорошо известными в технике. Очищенную плазмиду с генами клонированных антител можно вводить в эукариотные клетки-хозяева, такие как клетки СНО, клетки NS/0 или клетки HEK293, или же другие эукариотные клетки, такие как растительные клетки, клетки грибов или дрожжей. Способ, используемый для введения этих генов, может быть методом, описанным в технике, таким как электропорация, липофектин, липофектамин или другие методы. После введения этих генов антител в клеткихозяева клетки, экспрессирующие антитело, могут быть идентифицированы и селектированы. Эти клетки представляют собой трансфектомы, которые можно амплифицировать до их уровня экспрессии и сделать способными продуцировать антитела. Рекомбинантные антитела можно выделить и очистить от этих культуральных супернатантов и/или клеток. Дополнительные рекомбинантные методы продуцирования человеческих моноклональных антител к CD20. Или же, гены клонированных антител можно экспрессировать в других системах экспрессии, включая клетки прокариот, такие как клетки микроорганизмов, таких как Е. coli, для получения одноцепочечных Fv антител, водоросли и клетки насекомых. Помимо этого, антитела могут продуцироваться в трансгенных животных, отличных от человека, например в молоке овец и кроликов или в яйцах кур, или в трансгенных растениях; см., например, Verma, В. et al. (1998). Antibody engineering: Comparison bacterial,yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Meth. 216:165-181; Pollock, et al (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J. Immunol. Meth. 231:147-157 и Fischer,B., et al. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol. Chem. 380:825-839. Применение частичных последовательностей антител для экспрессии интактных антител. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно за счет аминокислотных остатков, которые расположены на шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелой и легкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR являются более разнообразными в индивидуальных антителах, нежели последовательности вне CDR. Так как последовательности CDR ответственны за большинство взаимодействий антиген-антитело,возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые подражают свойствам специфичных природных антител, за счет конструкции экспрессирующих векторов, включающих последовательностиCDR специфичного природного антитела, "пересаженные" в остовные последовательности из отличного(другого) антитела с отличными (другими) свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525 и Queen, С. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 86:10029-10033). Такие остовные последовательности можно получить из доступных баз данных ДНК,которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Эти последовательности генов антител зародышевой линии отличаются от последовательностей зрелых генов, кодирующих антитела, так как они не включают полностью собранных вариабельных генов, которые образуются соединением V(D)J в процессе созревания В-клетки. Последовательности гена зародышевой линии также будут отличаться от последовательностей вторичного антитела спектра с высокой аффинностью у индивидуума одинаково по всей вариабельной области. Например, соматические мутации являются относительно нечастыми на аминоконцевой части остовной области 1 и на карбоксиконцевой части остовной области 4. Кроме того, многие соматические мутации незначительно изменяют свойства связывания антитела. По этой причине нет необходимости получать полную последовательность ДНК, кодирующей конкретное антитело, чтобы воссоздать интактное рекомбинантное антитело, обладающее свойствами связывания,аналогичными свойствам связывания оригинального (первоначального) антитела (см. WO 99/45962). Как правило, для этой цели достаточно частичной последовательности тяжелой и легкой цепи, охватывающей CDR области. Частичную последовательность используют для определения, какие вариабельные и соединительные генные сегменты зародышевой линии вносят вклад в вариабельные гены рекомбинированного антитела. Последовательность зародышевой линии используют затем для заполнения недостающих частей вариабельных доменов. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепей отщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в свойства конечного антитела. Для добавления недостающих последовательностей клонированные последовательности кДНК можно соединять с синтетическими олигонуклеотидами лигированием или ПЦР-амплификацией. Или же, полные вариабельные домены можно синтезировать в виде набора коротких, перекрывающихся олигонуклеотидов и объединять с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать клон полностью синтетической вариабельной области. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как элиминирование или включение конкретных сайтов рестрикции или оптимизация конкретных кодонов. Нуклеотидные последовательности и транскрипты легких цепей из гибридом используют для дизайна перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов при создании синтетических V последовательностей со способностью кодировать аминокислоты, идентичной природньм последовательностям. Синтетические последовательности тяжелой и -цепей могут отличаться от природных последовательностей по трем направлениям: ряды повторяющихся нуклеотидных оснований прерываются, чтобы упростить синтез олигонуклеотидов и ПЦР-амплификацию; сайты инициации оптимальной трансляции вводятся согласно правилам Козака (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870) и сайты HindIII создают в 3'-5' (upstream) направлении от сайтов инициации трансляции. Для вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие последовательности цепей разбиваются на 30-50 нуклеотидов примерно посередине (в средней точке) некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды можно собрать в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 олигонуклеотидов. Затем пулы используют в качестве матриц для получения продуктов ПЦРамплификации из 150-400 олигонуклеотидов. Как правило, единый набор олигонуклеотидов вариабельной области можно разбить на два пула, которые амплифицируют раздельно, чтобы получить два перекрывающихся ПЦР-продукта. Затем эти перекрывающиеся продукты соединяют ПЦР-амплификацией с образованием полной вариабельной области. Также может быть желательным ввести перекрывающийся фрагмент константной области тяжелой или легкой цепи (включающий сайт BbsI легкой цепиили сайтAgeI тяжелой цепи гамма) в ПЦР-амплификацию, чтобы получить фрагменты, которые можно легко клонировать в экспрессирующие векторные конструкции. Реконструированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей затем соединяют с клонированными промотором, лидерной последовательностью, последовательностями сайта инициации трансляции, константной области, 3' нетранслируемой области, сайта полиаденилирования и сайта терминации транскрипции с образованием экспрессирующих векторных конструкций. Конструкции экспрессии тяжелой и легкой цепей можно объединить в единый вектор, котрансфецировать, последовательно трансфецировать или по отдельности трансфецировать в клетки-хозяева, а затем слить (гибридизовать) с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи. Плазмиды для применения в конструкции экспрессирующего вектора для человеческого IgG, описаны ниже. Плазмиды конструированы таким образом, чтобы ПЦР-амплифицированные последовательности кДНК V тяжелой и Vлегкой цепей можно было использовать для реконструкции минигенов полной тяжелой и легкой цепей. Эти плазмиды можно использовать для экспрессии полностью человеческих или химерных IgG1, или IgG4, антител. Аналогичные плазмиды можно конструировать для экспрессии других изотипов легкой цепи или для экспрессии антител, содержащих легкие цепи . Так, в другом аспекте изобретения структурные особенности (признаки) человеческих антител против CD20 по изобретению, например 11 В 8, 2F2 или 7D8, используются для создания родственных по структуре человеческих антител против CD20, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по изобретению, такое как связывание с CD20. Более конкретно, одну или болееCDR областей 2F2, 7D8 или 11 В 8 можно объединять рекомбинантно с известными остовными областями человеческого происхождения и CDR для создания дополнительных полученных методом рекомбинантной ДНК антител против CD20 по изобретению. Соответственно в другом варианте изобретение включает способ получения антитела против CD20,заключающийся в получении антитела, содержащего (1) остовные области тяжелой цепи человеческого происхождения и CDR тяжелой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна изCDR тяжелой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в SEQ ID NO: 13-15, 19-21 или 25-27); и (2) остовные области легкой цепи человеческого происхождения и CDR легкой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна из CDR легкой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в SEQ ID NO. 16-18, 22-24 или 28-30); где антитело сохраняет способность связываться с CD20. Способность антитела связываться с CD20 можно определить с применением стандартных анализов связывания, таких, которые представлены в примерах (например, FACS анализ). Так как в технике хорошо известно, что домены CDR3 тяжелой и легкой цепей играют особенно важную роль в специфичности/аффинности связывания антитела с антигеном, рекомбинантные антитела по изобретению, полученные, как представлено выше, предпочтительно содержат области CDR3 тяжелой и легкой цепей 2F2, 7D8 или 11 В 8. Антитела далее могут содержать области CDR2 2F2, 7D8 или 11 В 8. Кроме того, антитела могут содержать области CDR1 2F2, 7D8 или 11 В 8. Соответственно изобретение далее содержит антитела против CD20: (1) остовные области тяжелой цепи человеческого происхождения и область CDR1 тяжелой цепи человеческого происхождения, область CDR2 тяжелой цепи человеческого происхождения и область CDR3 тяжелой цепи человеческого происхождения, в которых область CDR3 тяжелой цепи человеческого происхождения представляет собой CDR3 2F2, 7D8 или 11 В 8, показанные на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в SEQ ID NO: 15, 21 или 27); и (2) остовные области легкой цепи человеческого происхождения и область CDR1 легкой цепи человеческого происхождения, область CDR2 легкой цепи человеческого происхождения и областьCDR3 легкой цепи человеческого происхождения, в которых область CDR3 легкой цепи человеческого происхождения представляет собой CDR3 2F2, 7D8 или 11 В 8, показанные на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в SEQ ID NO. 18, 24 или 30); где антитело связывается с CD20. Антитело может дополнительно содержать CDR2 тяжелой и/или легкой цепи 2F2, 7D8 или 11 В 8. Кроме того, антитела могут содержать области CDR1 тяжелой и/или легкой цепи 2F2, 7D8 или 11 В 8. Предпочтительно CDR1, 2 и 3 антител, полученных методом рекомбинантной ДНК, описанные выше, содержат точно такую(-е) же аминокислоту(-ы), которые содержат 2F2, 7D8 или 11 В 8 по данному описанию. Однако рядовой специалист в данной области понимает, что возможно некоторое отклонение от точных CDR последовательностей 2F2, 7D8 или 11 В 8 при все еще сохраняющейся способности антитела эффективно связывать CD20 (например, консервативные замены). Соответственно в другом варианте изобретения антитело, полученное методом рекомбинантной ДНК, может состоять из одной или более областей CDR, которая, например, на 90, 95, 98 или 99.5% идентична одной или более областей CDR 2F2, 7D8 или 11 В 8. Помимо простого связывания CD20 антитела, полученные методом рекомбинантной ДНК, такие как описанные выше, можно выбирать из-за сохранения ими других функциональных свойств антител по изобретению, таких как:(1) низкая скорость диссоциации ассоциата с CD20;(2) высокая аффинность связывания с CD20;(3) связывание с уникальным эпитопом на CD20;(4) опосредование высокого уровня CDC либо на CD55/59 негативных, либо на CD55/59 позитивных клетках;(8) индуцирование гомотипической адгезии клеток, экспрессирующих CD20;(10) опосредование ADCC CD20 мишеней при смешении с соответствующими эффекторными клетками;(12) способность истощать клетки, экспрессирующие низкие уровни CD20 (CD20low клетки). Характеристика связывания моноклинальных антител с CD20. Для очистки человеческих антител против CD20 выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых колбах-центрифугах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно отфильтровать и упарить перед аффинной хроматографией с протеин А-сефарозой (для антител изотипа IgG1)(Pharmacia, Piscataway, NJ) или с сефарозой, покрытой антителом против человеческого IgG, или Gсефарозой в случае антител изотипа IgG3. Для гарантии чистоты элюированный IgG можно проверять с помощью гель-электрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор можно заменить на PBS и концентрацию можно определять по OD280, используя коэффициент 1.43. Моноклональные антитела можно аликвотировать и хранить при -80 С. Для того чтобы определить, связываются ли человеческие моноклональные антитела против CD20 с уникальными эпитопами, можно использовать сайт-направленный или полисайт-направленный мутагенез. Для определения изотипа очищенных антител можно осуществлять изотипический ELISA. Лунки микротитрационных планшетов можно покрывать пленкой из 10 мкг/мл антитела против человеческогоIg в течение ночи при 4 С. После блокирования с помощью 5% BSA в лунки планшетов добавляют 10 мкг/мл моноклональных антител или контрольных очищенных изотипов при комнатной температуре на 2 ч. Затем содержимое лунок может реагировать либо с человеческими IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, либо с зондами конъюгированной человеческий IgM-специфической щелочной фосфатазы. После промывания планшеты обрабатывают субстратом pNPP (1 мг/мл) и анализируют при OD 405-650. Чтобы продемонстрировать присутствие антител против CD20 в сыворотках иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими CD20, можно применять проточную цитометрию. Коротко говоря, клеточные линии, экспрессирующие CD20 (выращенные в стандартных условиях культивирования), смешивают с моноклональными антителами в различных концентрациях в PBS, содержащем 0.1 BSA и 0.02% азида натрия, и инкубируют при 4 С в течение 30 мин. После отмывания клетки реагируют с меченным флуоресцеином антителом против человеческого IgG в тех же условиях, что и первичное окрашивание антитела. Образцы можно анализировать проточной цитометрией на приборе FACS, используя светорассеяние и боковое рассеяние на одиночных живущих клетках. Альтернативный анализ с применением флуоресцентной микроскопии можно исполь- 19021644 зовать как дополнение к или вместо проточной цитометрии. Клетки можно окрашивать точно так, как описано выше, и исследовать методом флуоресцентной микроскопии. Этот метод делает возможной визуализацию отдельных клеток, но может иметь пониженную чувствительность, зависящую от плотности антигена. Человеческие IgG против CD20 можно дополнительно тестировать на реактивность в отношенииCD20 вестерн-блоттингом. Коротко говоря, можно приготовить клеточные экстракты клеток, экспрессирующих CD20, и подвергнуть их электрофорезу на додецилсульфат (SDS)-полиакриламидном геле. После электрофореза разделенные антигены можно перенести на нитроцеллюлозные мембраны, блокировать 20% мышиной сывороткой и гибридизовать с зондом испытуемых моноклональных антител. Связывание человеческого IgG можно обнаружить, применяя конъюгат щелочной фосфатазы против IgG и обрабатывая таблетками субстрата BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Фагоцитарная активность человеческих мооноклональных антител к CD20 и их активность в отношении киллинга клеток. Помимо специфического связывания с CD20, человеческие моноклональные антитела против CD20 можно тестировать на их способность опосредовать фагоцитоз и киллинг клеток, экспрессирующихCD20. Тестирование активности моноклонального антитела in vitro обеспечит начальный скрининг перед тестированием in vivo моделей. Коротко говоря, полиморфноядерные клетки (PMN), NK клетки, моноциты или другие эффекторные клетки здоровых доноров можно очистить центрифугированием по плотности в среде Ficoll Hypaque с последующим лизисом примеси эритроцитов. Отмытые PMN можно суспендировать в среде RPMI, дополненной 10% термоинактивированной фетальной телячьей сывороткой, и смешать с мечеными 51Cr клетками, экспрессирующими CD20, при различных соотношениях эффекторных клеток к опухолевым клеткам (-эффекторные клетки: опухолевые клетки). Затем можно добавлять очищенные IgG против CD20 в различных концентрациях. В качестве негативного контроля можно использовать нерелевантные человеческие IgG. Анализ можно проводить в течение 4-20 ч при 37 С в зависимости от типа используемых эффекторных клеток. Образцы можно анализировать на цитолиз, измеряя выделение 51Cr в культуральный супернатант. Моноклональные антитела против CD20 можно также тестировать в комбинации друг с другом для определения, повышается ли цитолиз в присутствии нескольких моноклональных антител. Человеческие моноклональные антитела, которые связываются с CD20, также можно испытывать на in vivo моделях (например, на мышах) для определения их эффективности в регулировании роста опухолевых клеток, экспрессирующих CD20. Эти антитела можно выбирать, например, на основе нижеприведенных критериев, которые не претендуют на эксклюзивность: 1) связывание с живыми клетками, экспрессирующими CD20; 2) низкая скорость диссоциации ассоциата с CD20; 3) высокая аффинность связывания с CD20; 4) связывание с уникальным эпитопом на CD20, и/или связывание в специфической ориентации сCD20, и/или связывание со специфической формой CD20; 5) опсонизация клеток, экспрессирующих CD20; 6) опосредование ингибирования клеток, фагоцитоза и/или киллинга клеток, экспрессирующихCD20, в присутствии человеческих эффекторных клеток; 7) способность индуцировать CDC либо на CD55/59 негативных, либо на CD55/59 позитивных клетках; 8) способность индуцировать гомотопическую адгезию; 9) способность индуцировать транслокацию в липидные рафты ("липидные плоты") при связывании с CD20; 10) способность индуцировать (стимулировать) апоптоз; 11) способность индуцировать ADCC на клетках, экспрессирующих CD20; 12) способность истощать клетки, экспрессирующие CD20; и/или 13) способность истощать клетки, экспрессирующие низкие уровни CD20 (CD20low клетки). Предпочтительные человеческие моноклональные антитела по изобретению отвечают одному или более этих критериев. Человеческие моноклональные антитела против CD20 можно тестировать на их способность опосредовать CDC различными известными методами. Например, сыворотку для комплемента можно получать из крови здоровых субъектов, ее можно центрифугировать и собирать. Для определения CDC активности различных mAb можно использовать различные методы. Например, можно определять высвобождение 51Cr или можно оценивать повышенную проницаемость мембран методом исключения окрашиванием йодидом пропидия (PI). Коротко говоря, клетки-мишени можно отмывать и снова суспендировать в RPMI-1% BSA при плотности 1106/мл. К клеткам можно добавлять различные концентрацииmAb и их оставляют связываться на 10-15 мин при комнатной температуре. Затем можно добавить сыворотку до конечной концентрации 20 об.% и клетки инкубируют при 37 С в течение 45 мин. Все клетки каждого образца можно прибавить к раствору PI в пробирке с FACS. Затем смесь можно сразу же оценивать проточной цитометрией на проточном цитометре FACScalibur и анализировать с помощью про- 20021644 граммы CellQuest pro (BD Biosciences, Mountain view, CA). Для испытания способности инициировать апоптоз человеческие моноклональные антитела противCD20 можно, например, инкубировать с CD20 позитивными опухолевыми клетками, например Daudi,при 37 С примерно в течение 20 ч. Клетки можно собрать, отмыть Annexin-V-FITC буфером для связывания (BD biosciences) и пометить с помощью Annexin-V-FITC (BD biosciences) в течение 15 мин в темноте при 4 С. Все клетки каждого образца можно прибавить к раствору PI (10 мкг/мл в PBS) в пробирке сFACS и сразу же оценивать проточной цитометрией (как указано выше). В конкретном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела используются в комбинации, например, в виде фармацевтической композиции, содержащей два или более моноклональных антител против CD20. Например, человеческие моноклональные антитела, имеющие различные, но комплементарные активности, можно объединять в единое лекарственное средство для достижения заданного терапевтического или диагностического эффекта. В предпочтительном варианте композиция включает человеческое моноклональное антитело против CD20, которое опосредует CDC, объединенное с другим человеческим моноклональным антителом, которое стимулирует апоптоз. В другом варианте изобретения композиция включает человеческое моноклональное антитело против CD20, которое опосредует высокоэффективный киллинг клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток, объединенное с другим человеческим моноклональным антителом против CD20, которое ингибирует рост клеток, экспрессирующих CD.II. Получение трансгенных отличных от человека животных, которые генерируют человеческие моноклональные антитела против CD20. Еще в одном аспекте изобретение включает трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных, таких как трансгенные или трансхромосомные мыши, которые способны экспрессировать человеческие антитела, специфично связывающиеся с CD20. В особом варианте изобретение включает трансгенную или трансхромосомную мышь, имеющую геном, содержащий трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения, так, что при иммунизации клетками, экспрессирующими CD20,мышь продуцирует человеческие моноклональные антитела против CD20. Трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных, например HuMAb, мышей, как подробно описано и показано на примерах в данном описании. Или же, трансген тяжелой цепи человеческого происхождения можно сохранять вне хромосомы, как в случае трансхромосомных мышей (например, KM), описанных в Международной заявке WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные животные способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител против CD20 (например, IgG, IgA и/или IgF), претерпевая V-D-V/V-J рекомбинацию и переключение изотипа. Дизайн трансгенного или трансхромосомного отличного от человека животного, которое отвечает на стимуляцию чужеродным антигеном с помощью спектра гетерологических антител, требует, чтобы трансгены гетерологических иммуноглобулинов в организме трансгенного животного корректно функционировали на всем пути развития В-клетки. Это включает, например, переключение изотипа гетерологического трансгена тяжелой цепи. Соответственно трансгены строят таким образом, чтобы можно было индуцировать переключение изотипа и один или более следующих признаков генов антитела: (1) высокий уровень экспрессии и ее специфичность в отношении типа клеток, (2) функциональная реаранжировка гена, (3) активация исключения аллеля и ответ на него, (4) экспрессия достаточного первичного спектра, (5) сигнальная трансдукция, (6) соматическая гипермутация и (7) доминирование локуса трансгена, кодирующего антитело, в процессе иммунного ответа. Необязательно должны присутствовать все вышеуказанные критерии. Например, в тех вариантах изобретения, в которых эндогенные локусы генов иммуноглобулинов трансгенного животного функционально разрушены, для трансгена нет необходимости в активации аллельного исключения. Кроме того, в тех вариантах изобретения, в которых трансген содержит функционально реаранжированный ген тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, необязательным является второй критерий функциональной реаранжировки гена, по меньшей мере, для того трансгена, который уже является реаранжированным. Сведения общего характера о молекулярной иммунологии см. в Fundamental Immunology. 2nd edition(1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y. В других вариантах изобретения трансгенные или трансхромосомные отличные от человека животные, используемые для получения человеческих моноклональных антител по изобретению, содержат реаранжированные, нереаранжированные или комбинацию реаранжированных и нереаранжированных гетерологических трансгенов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина в зародышевой линии трансгенного животного. Каждый из трансгенов тяжелой цепи содержит по меньшей мере один CH ген. Кроме того, трансген тяжелой цепи может содержать функциональные последовательности-переключатели изотипа, которые способны поддерживать переключение изотипа многих кодирующих CH генов гетерологического трансгена в В-клетках трансгенного животного. Такими последовательностямипереключателями могут быть такие последовательности, которые встречаются в природе в локусе зародышевой линии иммуноглобулина вида, который служит в качестве источника CH генов трансгена, или такие последовательности переключатели могут быть образованы из последовательностей, которые встречаются в виде, применяемом для получения трансгенной конструкции (трансгенное животное). На- 21021644 пример, трансгенная конструкция человеческого происхождения, которая применяется для получения трансгенной мыши, может давать большую частоту события переключения изотипа, если она вводит последовательности-переключатели, аналогичные последовательностям-переключателям, которые встречаются в природе в локусе мышиной тяжелой цепи, так как, предположительно, мышиные последовательности-переключатели оптимизированы таким образом, чтобы функционировать с системой фермента рекомбиназы, тогда как последовательности-переключатели человеческого происхождения не оптимизированы. Последовательности-переключатели можно выделить и клонировать обычными методами клонирования или их можно синтезировать de novo из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, относящихся к последовательностям области переключения (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl.Immunol. 1:631-642 (1989. В случае каждого из вышеприведенных трансгенных животных функционально реаранжированные гетерологические трансгены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина обнаружены в значительной части В-клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%). Трансгены, используемые для получения трансгенных отличных от человека животных по изобретению, включают трансген тяжелой цепи, содержащий ДНК, кодирующую по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один D сегмент, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Трансген легкой цепи иммуноглобулина содержит ДНК, кодирующую по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Сегменты гена, "кодирующие" (вернее, соответствующие) сегменты (сегментам) генов легкой и тяжелой цепей, являются гетерологическими для трансгенного животного в том отношении, что они образованы из или соотносятся с ДНК, соответствующей сегментам генов тяжелой и легкой цепи, вида, не состоящего из трансгенного отличного от человека животного. В одном аспекте изобретения трансген построен таким образом, что отдельные сегменты гена являются неаранжированными, т.е. трансген не аранжирован так, чтобы кодировать функциональную легкую или тяжелую цепь иммуноглобулина. Такие неаранжированные трансгены содействуют рекомбинации V, D и J сегментов гена (функциональная реаранжировка) и предпочтительно содействуют включению всего или части D сегмента гена в полученную в результате реаранжированную тяжелую цепь иммуноглобулина в трансгенном животном при экспозиции с антигеном CD20. В альтернативном варианте изобретения трансгены содержат неаранжированный "минилокус". Такие трансгены, как правило, содержат значительную часть С, D и J сегментов, а также "субпопуляцию" сегментов V генов. В таких трансгенных конструкциях различные регуляторные последовательности,например промоторы, энхансеры, области-переключатели класса, последовательности доноров и акцепторов сплайсинга для процессирования РНК, сигналы рекомбинации и т.п., содержат соответствующие последовательности гетерологической ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть включены в трансген того же самого или родственного вида отличного от человека животного, используемого в изобретении. Например, сегменты гена человеческого иммуноглобулина можно соединять в трансгене с энхансерной последовательностью иммуноглобулина грызунов для использования в трансгенной мыши. Или же, синтетические регуляторные последовательности могут быть включены в трансген, в котором такие синтетические регуляторные последовательности не являются гомологичными функциональной последовательности ДНК, о которой известно, что она встречается в природе в геномах млекопитающих. Синтетические регуляторные последовательности строят по правилам согласованности (консенсуса), так, например, регуляторные последовательности, которые обусловливают разрешенную последовательность акцепторного сайта сплайсинга или промоторный/энхансерный мотив. Например,минилокус содержит часть локуса генома иммуноглобулина, имеющего по меньшей мере одну внутреннюю делецию (т.е. не на конце участка) заменимого участка ДНК (например, интрон или его часть) по сравнению с природным Ig локусом зародышевой линии. Предпочтительные трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, продуцируют значительный спектр иммуноглобулинов, практически в идеале похожий на спектр иммуноглобулинов человека после поправки на объем. Спектр в идеале приближается к спектру человека после поправки на объем обычно при разнообразии по меньшей мере около 10%, предпочтительно 25-50% или более. В целом получается по меньшей мере тысяча различных иммуноглобулинов (в идеале IgG), предпочтительно 104-106 или более в зависимости от числа различных V, J и D областей, введенных в геном мыши и управляемых дополнительным разнообразием, вызванным реаранжировками V-(D)-J сегментов гена, случайных добавлений в соединяющие области. Как правило, иммуноглобулины проявляют аффинность (KD) к предварительно выбранным антигенам ниже 10-7 М, такую как аффинность более низкая чем 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже. Трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, описанные выше, могут быть иммунизированы, например, клетками, экспрессирующими CD20. Или же, трансгенные животные могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческиеCD20. Животные, которые затем продуцируют В-клетки, которые претерпевают переключение класса путем рекомбинациипереключения (цис-переключение) и экспрессируют иммуноглобулины, реактивные в отношении CD20. Иммуноглобулины могут представлять собой человеческие антитела (также называемые "антитела с последовательностями человеческого происхождения), в которых полипептиды тяжелой и легкой цепей кодируются последовательностями трансгена человеческого происхождения, которые могут включать последовательности, образованные при использовании соматической мутации и рекомбинаторных (рекомбинированных) соединений V области, а также последовательности, кодируемые генами зародышевой линии; эти человеческие антитела можно считать практически идентичными полипептидной последовательности, кодируемой сегментами VL и JL или VH, DH и JH генов человеческого происхождения, даже несмотря на то, что в результате соматической мутации и различия V-J и V-D-J рекомбинированных соединяющих частей могут присутствовать другие последовательности незародышевой линии. Вариабельные области каждой цепи антитела, как правило, по меньшей мере на 80% аналогичны сегментам V,J и в случае тяжелых цепей D генов зародышевой цепи человеческого происхождения; часто по меньшей мере на 85% аналогичны последовательностям зародышевой линии в трансгене; часто на 90 и 95% аналогичны последовательностям зародышевой линии в трансгене. Однако, так как последовательности нечеловеческой зародышевой линии вводятся соматической мутацией и VJ и VDJ соединением, антитела с последовательностью человеческого происхождения часто будут иметь некоторые последовательности вариабельной области, которые не кодируются сегментами V, D или J гена человеческого происхождения, обнаруженными в трансгене(ах) человеческого происхождения в зародышевой линии мышей. Как правило, последовательности не-человеческого происхождения (или отдельные положения нуклеотидов) являются кластером в или около CDR, или в областях, где соматические мутации известны кластеру. Другой аспект изобретения включает В-клетки трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных по данному описанию. В-клетки можно использовать для получения гибридом, экспрессирующих человеческие моноклональные антитела, которые связываются с высокой аффинностью(например, константа равновесной диссоциации (KD) ниже 10-7 М) с человеческими CD20. Так, в одном варианте изобретение включает гибридому, которая продуцирует человеческое антитело, имеющее аффинность (KD) ниже 10-7 М, такую как аффинность более низкая чем 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже, если ее определять, анализируя клетки, экспрессирующие CD20, по методу Скэтчарда, используя меченное радиоактивной меткой моноклональное антитело, или определяя полумаксимальную концентрацию связывания, используя FACS анализ. Моноклональные антитела по данному описанию содержат легкую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом VL человеческого происхождения и генным сегментом JL человеческого происхождения, и 2) константной области легкой цепи, кодируемой генным сегментом CL человеческого происхождения, и тяжелую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом VH человеческого происхождения,областью D и генным сегментом JH человеческого происхождения, и 2) константной области тяжелой цепи, кодируемой генным сегментом CL человеческого происхождения. Создание человеческих моноклональных антител с высокой аффинностью против CD20 можно упростить с помощью метода расширения спектра сегментов вариабельной области гена человеческого происхождения в трансгенном отличном от человека животном, имеющем геном, содержащий интегрированный трансген человеческого иммуноглобулина, причем указанный метод включает введение в геном трансгена V гена, содержащий генные сегменты V области, которые отсутствуют в указанном интегрированном трансгене человеческого иммуноглобулина. Часто трансген V области представляет собой искусственную хромосому дрожжей, содержащую часть набора генных сегментов VH и VL (VK) человеческого происхождения, которые могут встречаться в геноме человека или могут быть раздельно вырезаны при сплайсинге вместе методами рекомбинантной ДНК, которые могут включать нестандартные (выпадающие) V-генные сегменты. Часто по меньшей мере пять или более функциональных Vгенных сегментов содержится на YAC (искусственных хромосомах дрожжей, и.х.д.). В этом варианте возможно получить трансгенное животное методом расширения V спектра, при этом животное экспрессирует цепь иммуноглобулина, содержащую последовательность вариабельного домена, кодируемую сегментом V-генной области, присутствующим в трангене V области, и С области, кодируемой трансгеном человеческого Ig. С помощью метода расширения V спектра можно получать трансгенные животные, имеющие по меньшей мере 5 различных V генов; а также можно получить животных, содержащих по меньшей мере около 24 V генов. Некоторые V-генные сегменты могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т.п.); эти сегменты, если требуется, можно сохранять или можно селективно делетировать (удалять) методами рекомбинантной ДНК, доступными специалистам в данной области техники. Когда методом рекомбинантной ДНК мышиная последовательность зародышевой линии создана таким образом, чтобы содержать функциональную YAC, имеющую расширенный спектр V сегментов,практически отсутствующих в трансгене человеческого Ig, содержащем J и С генные сегменты, признак можно размножить и "развести" в других генетических средах, включая среды, в которых функциональ- 23021644 ные YAC, имеющие расширенный спектр V сегментов, введены в зародышевую линию отличного от человека животного, имеющую трансген другого человеческого Ig. Многие функциональные YAC, имеющие расширенный спектр V сегментов, можно ввести в зародышевую линию для работы с трансгеном человеческого Ig (или многими трансгенами человеческих Ig). Хотя такие трансгены в данном описании называются YAC трансгенами, такие трансгены, будучи интегрированы в геном, могут практически утратить последовательности дрожжей, такие как последовательности, требуемые для автономной репликации в дрожжах; такие последовательности могут, необязательно, быть удалены методом рекомбинантной ДНК (например, рестрикцией при гидролизе и гель-электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или другим подходящим методом) после репликации в дрожжах, они более не нужны (например,перед введением в мышиную клетку ES или мышиный фагоцит). Методы распространения признака экспрессии иммуноглобулина с последовательностями человеческого происхождения включают разведение трансгенного животного, имеющего трансген(-ы) человеческого Ig, и, необязательно, также имеющего функциональную YAC с расширенным спектром V сегментов. Как VH, так и VL генные сегменты могут присутствовать на YAC. Трансгенное животное можно разводить в любой (генной) среде, нужной практику, включая среды, содержащие другие трансгены человеческого происхождения, включающие трансгены человеческих Ig и/или трансгены, кодирующие другие белки человеческих лимфоцитов. Изобретение также включает высокоаффинный иммуноглобулин с последовательностью человеческого происхождения, продуцируемый трансгенной мышью, имеющей трансген с YAC, содержащей расширенный спектр V области. Хотя вышесказанное описывает предпочтительный вариант трансгенного животного по изобретению, рассматриваются другие варианты изобретения, которые делятся на три класса:I) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью;II) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью;III) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью. Порядок предпочтительности этих классов (категорий) трансгенного животного следующий:IIIIII, где гены с эндогенной легкой цепью (или, по меньшей мере, K ген) нокаутированы с помощью гомологичной рекомбинации (или другим методом), и IIIIII, где гены с эндогенной легкой цепью не нокаутированы и должны быть доминирующими при использовании аллельного исключения.III. Биспецифические/полиспецифические молекулы, связывающиеся с CD20. Еще в одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела к CD20 могут быть дериватизированы или связаны с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, с Fab' фрагментом) с образованием биспецифической или полиспецифической молекулы,которая связывается со многими сайтами связывания или эпитопами-мишенями. Например, антитело по изобретению может быть функционально связано (например, химической связью, генетического слияния(гибридизации), нековалентной ассоциацией или иным способом) с одной или более связующих молекул, таких как другое антитело, пептид или связующий миметик. Соответственно настоящее изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере одну специфичность связывания с CD20 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом-мишенью. В особом варианте изобретения вторым нацеленным эпитопом(эпитопом-мишенью) является Fc-рецептор, человеческий FcRI (CD64) рецептор или человеческий Fc рецептор (CD89), или Т-клеточный рецептор, например CD3. Следовательно, изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, способные связываться с эффекторными клетками, экспрессирующими как FcR, FcR, так и FcsR (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарами (PMN и с клетками-мишенями, экспрессирующими CD20. Эти биспецифические и полиспецифические молекулы нацеливают клетки, экспрессирующие CD20, на эффекторную клетку и, подобно человеческим моноклональным антителам по изобретению, включают активности эффекторных клеток,опосредованные Fc-рецептором, такие как фагоцитоз клеток, экспрессирующих CD20, антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), высвобождение цитокинов или образование аниона супероксида. Далее, биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению могут включать третью специфичность связывания, помимо анти-Fc специфичности связывания и анти-CD20 специфичности связывания. В одном варианте изобретения третья специфичность связывания представляет собой участок (часть) фактора противоусиления (anti-enhancement) (EF), например молекула, которая связывается с поверхностным белком, включена в цитотоксическую активность и тем самым повышает иммунный ответ на клетку-мишень. Участком (частью) фактора противоусиления (anti-enhancement) (EF) может быть антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с данной молекулой, например антиген или рецептор, и тем самым приводит к усилению влияния детерминант связывания на Fc-рецептор или антиген клетки-мишени. "Участок фактора противоусиления" может связываться с объектом, отличным от объекта, с которым связываются первая и вторая специфичности. Например,- 24021644 участок связывания может связывать цитотоксическую Т-клетку (например, через CD2, CD3, CD8, CD28,CD4, CD40, ICAM-1 или другая иммунная клетка, которая приводит к повышенному иммунному ответу против клетки-мишени). В одном варианте изобретения биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению содержат в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело, включая Fab, Fab',F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv. Антитело также может димером легкой или тяжелой цепи или его минимальным фрагментом, таким как Fv, или одноцепочечной конструкцией, описанной Ladner et al. в патенте США 4946778. Антитело может также быть химерным белком связывающего домена иммуноглобулина, описанного в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. В одном варианте изобретения биспецифические и моноспецифические молекулы по изобретению содержат специфичность связывания с FcR или FcR на поверхности эффекторной клетки, а вторая специфичность связывания с антигеном клетки-мишени, например CD20. В одном варианте изобретения специфичность связывания с Fc-рецептором обеспечивается человеческим моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином G (IgG). Применяемый в данном описании термин "IgG рецептор" относится к любому из восьми генов -цепи, локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют всего двенадцать изоформ мембранных или растворимых рецепторов, которые группируются в три класса Fc рецепторов: FcRI (CD64),FcRII (CP32) и FcRIII (CD 16). В одном предпочтительном варианте изобретения Fc представляет собой человеческий высокоаффинный FcRI. Продуцирование и характеристика этих предпочтительных моноклональных антител описаныFanger et al. в Международной заявке WO 88/00052 и в патенте США 4954617. Эти антитела связываются с эпитопом FcRI, FcRII и FcRIII в сайте, который отличен от сайта связывания Fc рецептора, и, таким образом, их связывание практически не блокируется физиологическими уровнями IgG. Специфическими антителами против FcRI, применимыми по данному изобретению, являются mAb 22, mAb 32, mAb 44,mAb 62 и mAb 197. В других вариантах изобретения анти-Fc рецепторное антитело представляет собой гуманизированную форму моноклонального антитела 22 (Н 22). Продуцирование и характеристика антитела Н 22 описано в Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 и в Международной заявке WO 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая Н 22 антитело, депонирована в Американской коллекции типовых клеточных культур 4 ноября 1992 г. под названием HA022CL1 и имеет No. CRL 11177. В других предпочтительных вариантах изобретения специфичность связывания с Fc-рецептором обеспечивается антителом, которое связывается с рецептором человеческого IgA, например с Fc- рецептором (FcRI (CD89, связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином A (IgA). Предполагается, что термин "IgA рецептор" включает генный продукт -гена(FcRI), локализованный на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько альтернативно вырезанных при сплайсинге трансмембранных изоформ от 55 до 110 кДа. FcRI (CD89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяции не-эффекторных клеток. FcRI имеет аффинность среды как в отношении IgA1, так и в отношении IgA2, которая повышается при экспозиции с цитокинами, такими как G-CSF или GM-CSF(Morton, Н.С. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Четыре FcRI-специфических моноклональных антитела, идентифицированные как A3, А 59, А 62 и А 77, связывают FcRI вне лигандсвязывающего домена IgA, описаны Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764.FcRI и FcRI являются предпочтительными триггерными рецепторами для применения по изобретению, так как они (1) экспрессируются первично на иммунных эффекторных клетках; (2) экспрессируются с высокими уровнями (например, 5000-1000000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, ADCC, фагоцитоза); (4) опосредуют повышенную антигенную презентацию антигенов, включая аутоантигены, нацеленные на них. В другом варианте изобретения биспецифическая молекула составлена двумя моноклональными антителами по изобретению, которые имеют комплементарные функциональные активности, так что одно антитело преимущественно работает, индуцируя CDC, а другое антитело преимущественно работает, индуцируя апоптоз, например, 2F2 в комбинации с 11 В 8. В других вариантах изобретения биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению дополнительно содержат активность связывания, которая распознает антиген клетки-мишени, например связывается с антигеном клетки-мишени, например, с CD20. В предпочтительном варианте изобретения специфичность связывания обеспечивается с помощью человеческого моноклонального антитела по данному изобретению. Выражение "специфическое антитело эффекторной клетки" по данному описанию относится к антителу или функциональному фрагменту антитела, которые связываются с эффекторными клетками. Предпочтительные антитела для применения в качестве предмета изобретения связываются с эффекторными клетками по сайту, который не связан эндогенным иммуноглобулином. Применяемый в данном описании термин "эффекторная клетка" относится к иммунной клетке, ко- 25021644 торая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в противоположность когнитивной фазе и фазе активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоциты (например, В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Тклетки (CTL), киллерные клетки, природные клетки-киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфонуклеары, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы и выполняют иммунные функции. В предпочтительных вариантах изобретения эффекторная клетка способна индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), например нейтрофил, способный индуцировать ADCC. Например, моноциты,макрофаги, которые экспрессируют FcR, участвуют в (включены) в специфическом киллинге клетокмишеней и презентации антигенов другим компонентам иммунной системы или в связывании с клетками, которые содержат (презентируют) антигены. В других вариантах изобретения эффекторная клетка может фагоцитировать нацеленный антиген, клетку-мишень или микроорганизм. Экспрессия конкретного FcR на эффекторной клетке может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Найдено, например, что экспрессия FcRI позитивно регулируется интерфероном гамма (IFN-). Эта повышенная экспрессия повышает цитотоксическую активность FcRI-несущих клеток против мишеней. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень. Термин "клетка-мишень" должен означать любую нежелательную клетку субъекта (например, человека или животного), которая может быть целью композиции (например, моноклонального антитела,биспецифической или полиспецифической молекулы) по изобретению. В предпочтительных вариантах изобретения клетка-мишень представляет собой клетку, экспрессирующую или сверхэкспрессирующуюCD20. Клетки, экспрессирующие CD20, как правило, включают В-клетки и В-клеточные опухоли. Хотя предпочтительными являются человеческие моноклональные антитела, в биспецифических и моноспецифических молекулах по данному изобретению могут использоваться другие антитела, а именно мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела. Такие мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получать известными в технике методами. Биспецифические и полиспецифические молекулы по настоящему изобретению можно получать химическими методами (см., например, D.M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), методами "полидома" (см. патент США 4474893, выданный Reading) или методами рекомбинантной ДНК. В частности, биспецифические и моноспецифические молекулы по данному изобретению можно получать конъюгацией компонентов специфичностей связывания, например специфичностей связывания против FcR и CD20, применяя методы, известные в технике и описанные в примерах в данном описании. Например, каждую специфичность связывания биспецифической и полиспецифической молекулы можно получать отдельно, а затем конъюгировать друг с другом. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно использовать множество линкеров и сшивающих агентов. Примеры сшивающих агентов включают протеин А, карбодиимид, N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), о-фенилендималеинимид (oPDM), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидинил 4-(N-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky et al.(1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие методы включают методы, описанные Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science(1985) 229:81-83) и Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются SATA и сульфо-SMCC, оба выпускаются Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Если специфичности связывания представляют собой антитела, их можно конъюгировать с помощью связывания сульфгидрильных групп С-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. В особенно предпочтительном варианте изобретения шарнирная область модифицирована таким образом,чтобы пред конъюгацией содержать нечетное число сульфгидрильных остатков, предпочтительно один. Или же, обе специфичности связывания можно кодировать в одном и том же векторе и экспрессировать в той же самой клетке-хозяине. Этот метод особенно применим в тех случаях, когда биспецифическая и полиспецифическая молекула представляет собой mAbmAb, mAbFab, FabF(ab')2 или лигандFab химерный белок. Биспецифическая и полиспецифическая молекула по изобретению, например бисецифическая молекула, может быть одноцепочечной молекулой, такой как одноцепочечное биспецифическое антитело, одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая две детерминанты связывания. Биспецифические и полиспецифические молекулы могут также представлять собой одноцепочечные молекулы или, по меньшей мере, могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения би- и полиспецифических молекул описаны, например, в патентах США 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858. Связывание биспецифических и полиспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтвердить твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), радиоиммуноанализом (RIA),анализом FACS, биоанализом (например, ингибированием роста) или вестерн-блоттингом. Каждый из этих анализов, как правило, обнаруживает присутствие комплексов белок-антитело, представляющих особый интерес, с помощью меченого реагента (например, антитела), специфического в отношении представляющего интерес комплекса. Например, комплексы FcR-антитело можно обнаружить, используя, например, антитело, связанное с ферментом, или фрагмент антитела, который распознает и специфически связывается с комплексами антитело-FcR. Или же, комплексы можно обнаруживать, используя любой из множества других иммуноанализов. Например, антитело можно метить радиоактивной меткой и использовать в радиоиммуноанализе (RIA) (см., например, Weintraub, В., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). Радиоактивный изотоп можно обнаружить такими способами, как применение счетчика -излучения или сцинтилляционного счетчика, или ауторадиографии.IV. Иммуноконъюгаты. В другом аспекте настоящее изобретение включает человеческое моноклональное антитело против(например, иммуносупрессором) или радиоизотопом. Такие конъюгаты называются в данном описании"иммуноконъюгатами". Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, называются "иммунотоксинами". Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредным для клеток (например, убивает клетки). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидинD, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, доксорубицин,даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Подходящие терапевтические агенты для образования иммуноконъюгатов по изобретению включают, но без ограничения, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флюдарабин, 5-флуорурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин,thioepa, хлорамбуцил, мельфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан,дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платина (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики(АМС и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). В предпочтительном варианте изобретения терапевтический агент представляет собой цитотоксический агент или радиотоксический агент. В другом варианте изобретения терапевтическим агентом является иммуносупрессор. Еще в одном варианте изобретения терапевтическим агентом является GM-CSF. В предпочтительном варианте изобретения терапевтическим агентом является доксорубицин, цисплатин, блеомицин, сульфат, кармустин,хлорамбуцил, циклофосфамид или рицин А. Антитела по данному изобретению также могут быть конъюгированы с радиоизотопом, например,таким как йод-131, иттрий-111, для получения цитотоксических радиофармацевтических средств для лечения нарушения, связанного с CD20, такого как рак. Конъюгаты антител по изобретению можно использовать для модификации данного биологического ответа, а долю лекарственного вещества не следует конструировать как ограничивающуюся классическими химическими терапевтическими агентами. Например, доля (элемент, частица, фрагмент) лекарственного вещества может представлять собой белок или полипептид, обладающий заданной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонад или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолевых клеток или интерферон-; или модификаторы биологического ответа, например, такие как лимфокины, интерлейкин 1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранолоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ("GF-CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие факторы роста. Методы конъюгирования такого терапевтического фрагмента с антителами хорошо известны, см.,например, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drags In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985), Hellstrom etPress 1985) и Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58(1982). Еще в одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению присоединены к линкеру-хелатору, например тиуксетану, который способствует конъюгации антитела с радиоизотопом.V. Фармацевтические композиции. В другом аспекте настоящее изобретение включает композицию, например фармацевтическую композицию, содержащую одно или комбинацию человеческих моноклональных антител по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции можно готовить с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с другими известными адъювантами и эксципиентами обычными методами, такими как методы, описанные в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. В одном варианте изобретения композиции включают комбинацию нескольких (например, двух или более) выделенных человеческих антител по изобретению,которые действуют по различным механизмам, например одно антитело, которое действует, преимущественно индуцируя CDC, в комбинации с другим антителом, которое действует, преимущественно индуцируя апоптоз. Фармацевтические композиции по изобретению можно также применять в комбинированной терапии, т.е. комбинировать с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию по настоящему изобретению по меньшей мере с одним противовоспалительным агентом и по меньшей мере с одним иммунодепрессантом. В одном варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более противовоспалительных агентов, таких как стероидные лекарственные средства или НСПВС (нестероидные противовоспалительные средства). Предпочтительные агенты включают, например, аспирин и другие салицилаты, Сох-2 ингибиторы, такие как рофекоксиб (Vioxx) и целекоксиб (Celebrex), НСПВС, такие как ибупрофен (Motrin, Advil), фенопрофен (налфон), напрофен(напросин), сулиндак (клинорил), диклофенак (вольтарен), пироксикам (фелден), кетопрофен (орудис),дифлунизал (долобид), набуметон (релафен), этодолак (лодин), оксапрозин (дайпро) и индометацин (индоцин). В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают одно или более модифицирующих заболевание противоревматических лекарственных средств (DMARD), таких как метотрексат(ревматрекс), гидроксихлорокин (плакенил,), сульфасалазин (асульфидин), ингибиторы синтеза пиримидина, например лефлуномид (Арава), блокаторы IL-1 рецептора, например анакинра (кинерет), и блокаторы TNF-, например этанерсепт (энбрел), инфликсимаб (ремикад) и адалимумаб. В другом варианте изобретения такие агенты включают один или более иммунодепрессантов, таких как циклоспорин (сандиммун, неорал) и азатиоприн (имирал). В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин (адриамицин), цисплатин (платинол), блеомицин (бленоксан), кармустин (глиадел), циклофосфамид (цитоксан, процитокс, неосар) и хлорамбуцил (леукеран). В одном варианте человеческие антитела по данному изобретению могут вводиться в комбинации с хлорамбуцилом и преднизолоном; циклофосфамидом; винкристином; доксорубицином и преднизоном; флударабином и антрациклином или в комбинации с другими обычными схемами полилекарственной терапии для NHL, такими, которые описаны, например, в Non-Hodgkin's Lymphomas: Making sense ofDiagnosis, Treatment, and Options, Lorraine Johnston, 1999, O'Reilly and Associates, Inc. Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела можно вводить в сочетании с лучевой терапией и/или с аутотрансплантацией периферических стволовых клеток или костного мозга. Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела можно вводить в комбинации с одним или более антител, выбранных из антител против CD25, антител против CD19, антител против CD21,антител против CD22, антител против CD37, антител против CD38, антител против IL6R, антител противIL8, антител против IL15, антител против IL15K, антител против CD4, антител против CD11a (например,эфализумаб), антител против альфа-4/бета-1 интегрина (VLA4) (например, натализумаб), и CTLA4-Ig. В особом варианте изобретения человеческие моноклональные антитела вводят в комбинации с антителом против CD25 для лечения буллезного пемфигоида, например, у больных гомологичной болезнью. В другом особом варианте изобретения человеческие моноклональные антитела вводят в комбинации с одним или более антител, выбранных из антител против CD19, антител против CD21, антител против CD22, антител против CD37 и антител против CD38 для лечения злокачественных опухолей. Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела вводят в комбинации с одним или более антител, выбранных из антител против IL6R, антител против IL8, антител против IL15, антител противIL15R, антител против CD4, антител против CD11a (например, эфализумаб), антител против альфа 4/бета-1 интегрина (VLA4) (например, натализумаб), и CTLA4-Ig для лечения воспалительных заболеваний. Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела можно вводить в комбинации с антителом против С-C3b(i) для повышения активации комплемента. Применяемое в данном описании выражение "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой из перечисленных ниже и все перечисленные ниже физиологически совместимые растворители,дисперсионные среды, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и снижающие всасывание агенты и т.п. Предпочтительно носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного,подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъек- 28021644 ции или вливания (инфузии. В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело,биспецифическая и полиспецифическая молекула могут быть покрыты оболочкой, чтобы защитить соединение от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Выражение "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая сохраняет заданную биологическую активность исходного соединения и не имеет никакого нежелательного токсикологического действия (см., например, Berge, S.M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, образованные присоединением нетоксических неорганических кислот, таких как хлористо-водородная, азотная фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфорная и т.п., а также нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, ароматические сульфокислоты и т.п. Соли присоединения основания включают соли, образованные присоединением оснований щелочных и щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также нетоксических органических аминов, таких как N,N'-диметилэтилендиамин, Nметилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п. Композицию по данному изобретению можно вводить различными методами, известными в технике. Как понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения меняется в зависимости от желаемого результата. Активные соединения можно приготовить с носителями, которые предохраняют соединение от быстрого высвобождения, как в препарате пролонгированного действия (с регулируемым выделением), включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена-винилацетата, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Методы приготовления таких препаратов хорошо известны специалистам в данной области техники; см., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed.,Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Для введения соединения по изобретению определенными методами может быть необходимо покрыть соединение оболочкой из материала, предупреждающего инактивирование, или вводить соединение одновременно с этим материалом. Например, соединение можно вводить субъекту в подходящем носителе, например в липосомах, или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический солевой раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсииCGF вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в технике. Рассматривается применение в фармацевтических композициях по изобретению любых обычных сред или агентов, за исключением тех, которые несовместимы с активным компонентом. В композиции могут вводиться активные добавки. Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильны и устойчивы в условиях производства и хранения. Композицию можно готовить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для высоких концентраций лекарственного вещества. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол(например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Может сохраняться соответствующая текучесть, например, с помощью покрытия, такого как лецитин,путем сохранения требуемого гранулометрического состава в случае дисперсии и с помощью поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиолы, такие как маннит, сорбит, или хлористый натрий. Пролонгированное всасывание инъецированных композиций можно вызвать, включая в композицию агент, который замедляет всасывание, например, солей-моностеаратов и желатина. Стерильные растворы для инъекций можно приготовить, вводя в случае необходимости активное соединение в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним из ингредиентов или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизационной микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают, вводя активное соединение в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие нужные ингредиенты, выбранные из вышеперечисленных. В случае применения стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными методами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация (сушка в замороженном состоянии), которые дают порошок активного ингредиента плюс любого нужного ингредиента из их раствора, предварительно очищенного стерилизационной микрофильтрацией. Схемы приема доз корректируют таким образом, чтобы обеспечить оптимальную нужную реакцию(например, терапевтическую реакцию). Например, можно вводить единичный болюс, можно вводить несколько раздельных доз во времени или дозу можно пропорционально снизить или повысить в соответствии с ситуациями, неожиданно возникающими при лечении. Особенно предпочтительными являют- 29