Моноклональное антитело против миостатина и его применение

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ МИОСТАТИНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Идентифицированы антимиостатиновые антитела, которые отличаются высокой афинностью и могут быть химерными, гуманизированными или полностью человеческими антителами,иммуноконъюгатами антител или их антигенсвязывающими фрагментами. Антитела в соответствии с данным изобретением полезны для увеличения мышечной массы, увеличения плотности костной массы или для лечения различных расстройств у млекопитающих и у птиц.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) 015903 Область изобретения Изобретение относится к области медицины, в частности к области моноклональных антимиостатиновых антител. Более конкретно, изобретение относится к высокоаффинным химерным, гуманизированным или человеческим антимиостатиновым антителам и применению антител для лечения,профилактики или диагностирования различных расстройств или состояний у млекопитающих или птиц. Предпосылки создания изобретения Члены суперсемейства белков трансформирующего фактора роста бета (TGF-) вовлечены в развитие эмбрионов и гомеостаз зрелых тканей. Члены суперсемейства TGF- имеют общую структуру, включая пептидную сигнальную последовательность, необходимую для секреции белкового и аминоконца фрагмента, который расщеплен протеолитически приблизительно на 105-140 аминокислот карбоксиконца большего исходного белка с получением зрелого белка. Зрелый белок характеризуется наличием высококонсервативных цистеиновых остатков, в то время как активная форма зрелого белка представляет собой связанный дисульфидными мостиками гомодимер протеолитически-расщепленного пропротеина (Gray, A., and Maston, A., Science, 247:1328, 1990). Миостатин, также известный под названием фактора дифференциации роста-8 (GDF-8), является членом суперсемейства белков TGF-. Структура миостатина подобна структуре других членов семейства TGF-. Она содержит гидрофобный аминоконец, который действует как секреторный сигнал, и консервативный RSRR домен, важный для протеолитической обработки. Расщепление белка приводит к образованию пептида, с которым связана латентность аминоконца, и зрелого сигнального пептида со стороны карбоксиконца, который создает биологически активный гомодимер. Миостатин в значительной степени экспрессируется в развивающейся и зрелой скелетной мышце и функционирует как негативный регулятор скелетной мышцы. Избыточная экспрессия миостатина в организме взрослой мыши приводит к мышечному истощению (Zimmers, et al., Science, 296:1486-1488, 2002), в то время как мыши, нокаутированные по миостатину, наоборот, характеризуются гипертрофией и гиперплазией скелетной мышцы,что приводит к увеличению мышечной массы, в два или в три раза большему, чем у их однопометных мышей дикого типа, и к уменьшению накопления жира (McPherron, et al. Nature, 387:83-90, 1997). Сообщалось о человеке, у которого нокаутирование по миостатину привело к мутации, что, в свою очередь,привело к мышечной гипертрофии (Scheulke, et al., New Eng. J. Med. 350:2682, 2004). В настоящее время количество средств для лечения мышечного истощения, а также расстройств или состояний, которые могут быть улучшены посредством увеличения мышечной массы и/или мышечной силы, включая, например, мышечную дистрофию, хрупкость, атрофию бездействия и кахексию, а также расстройства, связанные с мышечным истощением, например болезнь почек, сердечная недостаточность или сердечное заболевание и заболевание печени, ограничено. Из-за функции миостатина как негативного регулятора роста скелетных мышц последние являются желаемой мишенью для терапевтического или профилактического воздействия при таких расстройствах или состояниях либо для мониторинга развития таких расстройств или состояний. Кроме роли, которую миостатин непосредственно играет в регуляции скелетных мышц, миостатин может быть также вовлечен в другие физиологические процессы, включая преадипоцитозную дифференциацию адипоцитов (Kim et al. BBRC, 281:902-906,2001), и косвенно в глюкозный гомеостаз (McPherron, A and Lee S-J. JCI 109:595, 2002) и ингибировании образования костной массы (Hamrick, M. Mol. Cell Evol. Biol. 272 388-91, 2003; Hamrick et al. Calcif Tissue Int. 71:63, 2002). Поэтому миостатин-специфические антагонисты, например миостатинспецифические антитела, могут также быть полезными для лечения, профилактики или контроля расстройств или состояний, таких как расстройства или состояния, которые можно улучшить путем увеличения костной плотности (например, остеопороза), диабет II типа, метаболический синдром, ожирение и остеоартрит. Миостатин является высококонсервативным во всех видах; аминокислотная последовательность всех зрелых форм миостатина у человека, мыши, крысы, курицы, индюка и коровы идентична на 100%(см. фиг. 2 и 3). Мутации миостатина, которые встречаются в природе у крупного рогатого скота, связаны с двойным мышечным фенотипом (McPherron, et al. PNAS, 94:12457-61, 1997). Поскольку миостатин является высококонсервативным по последовательности и по функции во всех видах, то не только антимиостатиновое антитело обеспечивает перспективное средство повышения мышечной массы или лечения или профилактики расстройств или состояний, перечисленных выше, у людей, а также у других млекопитающих, включая, например, домашних животных (например, собак и кошек), спортивных животных (например, лошадей), животных, которые служат источником пищи (например, коров, свиней и овец), и у птиц (например, кур, индюков, уток и другой пернатой дичи и домашней птицы). Фактор дифференциации роста-11, который также называется GDF-11 или BMP-11, является членом суперсемейства белков TGF- и наиболее гомологичен миостатину. Аминокислотные последовательности зрелых форм человеческого миостатина и GDF-11 идентичны приблизительно на 90%; однако,GDF-11 экспрессируется в более широком диапазоне тканей, чем GDF-8, включая зубную пульпу, мозг,сердце, почки и легкие, а также мышечную и адипозную ткань (Nakashima, et al. Mech. of Development 80:185, 1999). Мыши, нокаутированные по GDF-11, умирают в течение 24 ч после рождения, имея мно-1 015903 жественные аномалии. В частности, мыши обнаруживают наличие лишних пар ребер, отсутствие почек,и у них проявляются дефекты в желудке, селезенке и поджелудочной железе (McPherron et al., NatureGenetics 22:260, 1999; Esquela and Lee, Dev. Biol. 257:356, 2003; Harmon et al., Devpt. 131:6163, 2004). Недавно было обнаружено, что человеческий GDF-11 управляет темпоральными окнами, на протяжении которых мощные предшественники сохраняют способность продуцировать различимое нейтральное потомство (Kim, J. et al. Science 308:1927-1930, 2005). Существует терапевтическая необходимость в антимиостатиновом антителе, которое предпочтительно связывает миостатин среди остальных белков суперсемейства TGF-, особенно GDF-11. Кроме того, существует потребность в миостатин-специфических антителах, связывающих миостатин с высокой аффинностью, особенно с более высокой аффинностью (то есть с большей аффинностью, что продемонстрировано, например, более низким значением KD), чем антитела, которые связывают GDF-11, и,таким образом, дают возможность минимизировать уровень дозировок, получаемых пациентами, что,таким образом, может привести к более частому приему дозировок, содержащих такие антитела, чем дозировок, содержащих антитела, которые связывают миостатин с более низкой аффинностью (то есть с более высоким значением KD). Антитело, обладающее более высокой аффинностью, также является желательным, так как его применение может способствовать большей гибкости в отношении пути введения антитела пациенту, поскольку внутривенный путь введения лекарственного средства является менее желательным, чем, например, подкожный. Также существует потребность в миостатин-специфических антителах, с низкими или иными благоприятными значениями IC50 в анализе биологической активности миостатина, для создания терапевтического антимиостатинового антитела с минимально эффективной терапевтической дозой. Также желательно обеспечить антитела, специфические в отношении миостатина, где любой иммунный ответ на действие антитела у пациента, который получает антитело, сведен к минимуму. Данное изобретение удовлетворяет этим потребностям и обеспечивает преимущества, связанные с ним. Краткое описание изобретения Антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой химерные, гуманизированные или полностью человеческие антимиостатиновые моноклональные антитела и их антигенсвязывающие части, которые являются антагонистами или нейтрализуют по меньшей мере одну биологическую активность in vitro или in vivo или свойство, связанное с миостатином или его частью. Предпочтительно, антитела в соответствии с данным изобретением не связывают пептид, состоящий из аминокислот 40-64 (включительно), 43-57 или 45-59 зрелого миостатина, предпочтительно человеческого миостатина, на уровнях, которые значительно превышают фоновые. В одном варианте осуществления значение антитела в соответствии с данным изобретением имеютIC50 меньше или равное приблизительно 40, 30, 25, 20 или 10 нМ, более предпочтительно меньше или равное приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе миостатин/SBE репортер in vitro (см. пример 5). Предпочтительно, антитела в соответствии с данным изобретением имеют IC50 в анализе миостатин/SBE репортер in vitro по меньшей мере на 20 или 50% ниже, более предпочтительно в два раза, три раза или четыре раза ниже, чем IC50 антитела в анализе GDF-11/SBE репортер in vitro (как описано в примере 5,приведенном в данном описании). В одном варианте осуществления антитела в соответствии с данным изобретением характеризуются сильной аффинностью связывания (KD) миостатина, т.е. менее чем приблизительно 4,210-9 М или 4,0109 М, предпочтительно менее чем приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно менее чем приблизительно 8l0-11M, 710-11M, 510-12 М или 1,410-12 М. Альтернативно, антитела в соответствии с данным изобретением характеризуются KD для миостатина, значение которого не превышает приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно не превышает приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 2-10 М и более предпочтительно не превышает приблизительно 810-11 М,710-11 М, 510-2 М или 1, 410-12 М. В другом варианте осуществления антимиостатиновые антитела в соответствии с данным изобретением характеризуются предпочтительным связыванием миостатина по сравнению с GDF-11 по меньшей мере на 20, 30, или 40%. Предпочтительно антитела в соответствии с данным изобретением, которые предпочтительно связывают миостатин, а не GDF-11, дополнительно характеризуются значением KD миостатина, которое составляет менее чем приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно менее чем приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно менее чем приблизительно 510-12 М или 1,410-12 М. В другом варианте осуществления антитела в соответствии с данным изобретением, которые предпочтительно связывают миостатин, а не GDF-11, дополнительно характеризуются значением IC50, меньшим или равным приблизительно 40, 20 или 10 нМ, более предпочтительно меньшим или равным приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе in vitro миостатин/SBE репортер. В другом варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением содержит полипептид вариабельной области легкой цепи ("LCVR") с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:74-102, 140, 141 и 142 (фиг. 9). В другом-2 015903 варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи ("HCVR") с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:103-138 (фиг. 10). В другом варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением содержит (i) полипептид LCVR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:74-102, 140, 141 и 142, и (ii) полипептид HCVR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:103-138. В преимущественном варианте осуществления антитело в соответствии с данным изобретением содержит полипептид LCVR, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO, как показано в табл. 1,приведенной ниже, дополнительно содержит полипептид HCVR, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO полипептида HCVR, которая соответствует конкретному LCVR, приведенному в табл. 1 ниже. Например, антитело в соответствии с данным изобретением, содержащее полипептидLCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:88, предпочтительно дополнительно содержит полипептид HCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:103 или 119. Таблица 1 В другом варианте осуществления моноклинальное антитело в соответствии с данным изобретением является антителом, которое может конкурировать за связывание человеческого миостатина с конкурирующим антителом, как показано в анализе, известном в данной области (например, в конкурентном анализе ELISA), где конкурирующее антитело содержит два полипептида, последовательности которых выбирают из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO:98 и 138 и (ii) SEQ ID NO:74 и 103. В одном варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобрете-3 015903 нием имеет вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит области CDR со следующими аминокислотными последовательностями:CDRH1 (SEQ ID NO: 42), CDRH2 (SEQ ID NO:71) и CDRH3 (SEQ ID NO:72) (см. фиг. 7); и/или где вариабельная область легкой цепи содержит области CDR со следующими аминокислотными последовательностями: CDRL1 (SEQ ID NO:12), CDRL2 (SEQ ID NO:154) и CDRL3 (SEQ ID NO:37) (см. фиг. 6). Предпочтительно CDR тяжелой цепи антитела в соответствии с данным изобретением находятся вместе в одном антителе, как в антителе, приведенном на фиг. 7, и CDR легкой цепи антитела в соответствии с данным изобретением находятся вместе в одном антителе, как в антителе, приведенном на фиг. 6. Антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, выбранная из человеческих (или по существу человеческого происхождения) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM и IgD, предпочтительно IgG1 или IgG4. Антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением может дополнительно содержать константную область человеческой каппа или лямбда цепи. Если антитело предназначено для терапевтических или профилактический целей для человека, то константная область имеет по существу или полностью человеческое происхождение. Если антитело предназначено для терапевтических или профилактических целей для животного, которое не является человеком, или для яйца животного, которое не является человеком, константная область, предпочтительно, по существу имеет происхождение от животного, в котором антитело предназначено для использования в терапевтических целях (см., например, Clarkson,C. et al., Mol. Imm. 30:1195-1204, 1993; заявку США номер 2002/01651350; и номер доступа в GenbankX69797, U03778, X16701, X07174, AB016711). В данном описании рассмотрены различные формы антител. Например, антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением может содержать или состоит из интактного антитела (т.е. полноразмерного, имеющего интактную Fc область), по существу, интактного антитела, его антигенсвязывающей части (например, Fab, Fab', F(ab')2) или одноцепочечного Fv фрагмента. Следует понимать,что все подобные формы антител охватываются данным изобретением и по всему объему термином "антитело". Дополнительно антитело в соответствии с данным изобретением может быть помечено детектируемой меткой, иммобилизовано на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологическим соединением, например ферментом или молекулой полиэтиленгликоля. Дополнительно антитела в соответствии с данным изобретением описаны, как имеющие моноклональное происхождение, даже если они могут отличаться характером гликозилирования. В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением. Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной фармацевтической композиции антимиостатиновое моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением является активным ингредиентом. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит гомогенную или, по существу, гомогенную популяцию антимиостатиновых антител в соответствии с данным изобретением. Композиция для использования в терапевтических целях является стерильной и может быть лиофилизованной, необязательно снабженной соответствующим разбавителем. Изобретение обеспечивает способ ингибирования по меньшей мере одной биологической активности миостатина у животного, предпочтительно у видов млекопитающих и птиц, предпочтительно у человека, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества, профилактически эффективного количества или миостатин-нейтрализующего или миостатин-ингибирующего количества антимиостатинового антитела в соответствии с данным изобретением, указанным видам млекопитающих или птиц. Изобретение дополнительно обеспечивает способ увеличения мышечной массы или лечения или профилактики заболевания или расстройства, которые можно облегчить путем нейтрализации биоактивности миостатина, включающий введение пациенту (например, человеку), нуждающемуся в таком лечении или такой профилактике, терапевтически или профилактически эффективного количества моноклинального антитела в соответствии с данным изобретением. В изобретении описано антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением для использования в производстве лекарственного средства для введения млекопитающему, предпочтительно человеку, для лечения, например, хрупкости, кахексии, саркопении, связанной с возрастом, мышечного истощения или слабости, миопатии, мышечной дистрофии, остеопороза, ожирения, хронического обструктивного заболевания легких, почечной недостаточности или заболевания почек, печеночной недостаточности или заболевания печени, сердечной недостаточности или сердечного заболевания, метаболического синдрома и диабета второго типа у млекопитающего, предпочтительно у человека, нуждающегося в этом, путем введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного или профилактически эффективного количества антимиостатинового антитела в соответствии с данным изобретением. Изобретение включает изделие, состоящее из упаковочного материала и антитела в соответствии с данным изобретением, которое содержится внутри указанного упаковочного материала, где упаковочный материал содержит упаковочный вкладыш, в котором указано, что антитело нейтрализует активность миостатина или снижает уровень миостатина, содержащегося в системе.-4 015903 Изобретение дополнительно обеспечивает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело в соответствии с данным изобретением; вектор (или векторы), содержащие данную нуклеиновую кислоту, необязательно функционально связанную с контрольными последовательностями, которые распознаются клеткой-хозяином, трансформированной вектором; клетку-хозяин, содержащую данный вектор; способ продуцирования антитела в соответствии с данным изобретением, включающий культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы экспрессировать нуклеиновую кислоту, и, необязательно,выделение антитела из культуральной среды клетки-хозяина. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана аминокислотная последовательность человеческого промиостатина, сигнальная последовательность которого подчеркнута, и часть белка на карбоксиконце, которая составляет мономер зрелой формы миостатина, показанная жирным шрифтом. На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность мономерного человеческого зрелого миостатина. Активный человеческий миостатин является гомодимером данного полипептида, связанным дисульфидными мостиками. Данная последовательность идентична последовательности зрелого миостатина у мыши, крысы, курицы, индюка, собаки, лошади и свиньи. На фиг. 3 показано выравнивание аминокислотной последовательности зрелого миостатина различных видов млекопитающих и птиц. На фиг. 4 показано выравнивание аминокислотной последовательности зрелой формы человеческого миостатина и человеческого GDF-11. На фиг. 5 показана аминокислотная последовательность HCVR LCVR YN41 антитела, иллюстративного родительского антитела для антитела в соответствии с данным изобретением. На фигуре дополнительно показана нуклеотидная иллюстративная последовательность, кодирующая HCVR и LCVRYN41 антитела. На фиг. 6 показана аминокислотная последовательность CDR LCVR различных антител в соответствии с данным изобретением. На фиг. 7 показана аминокислотная последовательность CDR HCVR различных антител в соответствии с данным изобретением. На фиг. 8 показана аминокислотная последовательность константной области легкой цепи каппа,которая может быть функционально связана с LCVR антитела в соответствии с данным изобретением при генерации полноразмерной легкой цепи антитела в соответствии с данным изобретением и аминокислотная последовательность домена IgG4 константной области, которая может быть функционально связана с HCVR антитела в соответствии с данным изобретением при генерации полноразмерной тяжелой цепи антитела в соответствии с данным изобретением. На фигуре дополнительно показана иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая константная область каппа легкой цепи, и иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая домен IgG4 тяжелой цепи. На фиг. 9 показано выравнивание аминокислотной последовательности LCVR различных антител в соответствии с данным изобретением. CDR домены подчеркнуты в первой последовательности антитела. На фиг. 10 показано выравнивание аминокислотной последовательности HCVR различных антител в соответствии с данным изобретением. CDR домены подчеркнуты в первой последовательности антитела. Подробное описание изобретения Изобретение представляет химерные, гуманизированные или полностью человеческие антимиостатиновые моноклональные антитела или их антигенсвязывающие части, способные нейтрализовать или быть антагонистами по меньшей мере одной активности миостатина in vitro и/или in vivo, которые дополнительно характеризуются тем, что демонстрируют IC50, менее чем приблизительно 40, 20 или 10 нМ, более предпочтительно, меньше или равное приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе in vitro миостатин/SBE репортер и/или, предпочтительно, демонстрируют сильную связывающую аффинность с миостатином. Антитела в соответствии с данным изобретением дополнительно характеризуются тем, что они предпочтительно связывают миостатин по сравнению с ближайшим аналогом миостатина, GDF-11,по меньшей мере на 20%. Определения Как используется в данном описании, термин "зрелый миостатин" (см. SEQ ID NO:2 для человека,мыши, крысы, курицы, индюка, лошади и свиньи) относится к мономерной или димерной форме белка,который получается в результате протеолитического расщепления при Arg 266 пропротеиновой формы миостатина из 375 аминокислот. Как используется в данном описании, термин "миостатин" относится к зрелому миостатину. Как используется в данном описании, термин "промиостатин" или "пропротеиновая форма миостатина", при использовании в связи с человеческим белком, относится к белку, который содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, в мономерной или димерной форме. Полноразмерное антитело в том виде, в котором оно встречается в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, которая состоит из четырех пептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей (приблизительно, 50-70 кДа при полной длине) и двух легких (L) цепей (приблизительно, 25 кДа при полной длине), взаимосвязанных дисульфидными мостиками. Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, которые, в основном, отвечают-5 015903 за распознавание антигенов. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область,главным образом, отвечающую за функцию эффектора. Легкие цепи классифицируют как каппа и лямбда, они характеризуются конкретной константной областью, как известно в данной области. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA1 и IgA2. Каждый тип тяжелых цепей характеризуется конкретной константной областью, известной в данной области. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов антител хорошо известны в данной области. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области Nконцевой тяжелой цепи (в данном описании называемая "HCVR") и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов (CH1, CH2 и CH3) для IgG, IgD IgA; и 4 доменов (CH1, CH2, CH3 и CH4) для IgM и IgE. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данном описании называемая "LCVR") и константной области тяжелой цепи, CL. ОбластиHCVR и LCVR могут быть дополнительно разделены на области гипервариабельности, называемые гипервариабельными участками (CDR), перемежающимися с более консервативными областями, которые называются каркасными областями (FR). Каждая HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR,расположенных в следующем порядке от амино-конца к карбокси-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,CDR3, FR4. В данном описании 3 CDR тяжелые цепи названы "CDRH1, CDRH2 и CDRH3", и 3 CDR легкой цепи названы "CDRL1, CDRL2 и CDRL3." CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. CDR3 обычно является наибольшим источником молекулярных различий в пределах антителосвязывающего сайта. Присвоение аминокислот каждому домену в соответствии с хорошо известными соглашениями [например, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) или Chothia numbering scheme as described in Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948, 1997, см. также интернет-сайтhttp:www.rubic.rdg.ac.uk/andrew/bioinf.org/abs]. На функциональные возможности антитела связывать конкретный антиген в сильной степени влияют шесть CDR. Термин "антитело" в связи с антимиостатиновым антителом в соответствии с данным изобретением(либо упрощенно, "моноклональное антитело в соответствии с изобретением"), как используется в данном описании, относится к моноклональному антителу. "Моноклональное антитело", как используется в данном описании, относится к химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иное. Предпочтительное моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением существует в гомогенной или по существу гомогенной популяции. Моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены с использованием, например,гибридомных методик, хорошо известных в данной области, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных в данной области. Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из уникальной копии или клона, включая, например, любой эукариотный, прокариотный или фаговый клон, а не к способу его получения. "Моноклональное антитело" может быть интактным антителом (содержащим полную или полноразмерную Fc область), по существу, интактным антителом или частью или фрагментом антитела, содержащим антигенсвязывающую часть, например, Fab фрагмент, Fab' фрагмент или F(ab')2 фрагмент химерного, гуманизированного или человеческого антитела. Вариабельные области каждой из пар легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Таким образом, интактное IgG антитело имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два сайта связывания являются одинаковыми. Как используется в данном описании, "антигенсвязывающая часть" или "антигенсвязывающая область", или "антигенсвязывающий фрагмент" в данном описании относятся взаимозаменяемо к такой части молекулы антитела в пределах вариабельной области, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу его специфичность и аффинность в отношении к антигену. Эта часть антитела включает каркасные аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительно CDR антигенсвязывающие области антитела в соответствии с данным изобретением будут иметь мышиное происхождение или по существу мышиное происхождение, и определенные аминокислотные остатки будут изменены для повышения конкретной активности (см., например, фиг. 6 и 7). Предпочтительно, каркасные области антитела в соответствии с данным изобретением имеют человеческое происхождение или по существу человеческое происхождение (по меньшей мере 95, 97 или 99% человеческого происхождения; см., например, фиг. 9 и 10). В других вариантах осуществления антигенсвязывающая область или CDR антигенсвязывающие области могут быть получены из других видов, не являющихся человеком, включая, но, не ограничиваясь приведенным, кроликов, крыс или хомяков. В других вариантах осуществления антигенсвязывающая область может иметь полностью человеческое происхождение или, по существу, человеческое происхождение, определенные аминокислотные остатки будут изменены для повышения конкретной активности, например, аффинности или специфичности (см., например, аминокислотные положения-6 015903 на фиг. 6 и 7, которые приведены жирным шрифтом и подчеркнуты). Кроме того, "моноклональное антитело", как используется в данном описании, может быть одноцепочечным Fv фрагментом, который может быть получен путем присоединения ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, с линкерной последовательностью. (См., Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal. Antibodies,vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315, 1994). Следует понимать, что независимо от того, указаны ли фрагменты или части, термин "антитело", как используется в данном описании, включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы. До тех пор, пока белок сохраняет способность специфического или предпочтительного связывания своей намеченной мишени,(т.е. эпитопа или антигена), он включен в термин "антитело"."Популяция моноклональных антител" относится к гомогенной или по существу гомогенной популяции антител (т.е. по меньшей мере приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 97 или 98%, или более предпочтительно по меньшей мере 99% антител в популяции будут конкурировать в анализе ELISA за тот же самый антиген или эпитоп). Антитела, которые могут быть, а могут не быть гликолизированными, и все будут входить в объем изобретения. Моноклональные антитела могут быть гомогенными, если они имеют идентичные аминокислотные последовательности, хотя их посттрансляционные модификации могут отличаться, например характер гликозилирования."Вариант" антимиостатинового антитела относится в данном описании к молекуле, аминокислотная последовательность которой отличается от аминокислотной последовательности "родительского" антимиостатинового антитела путем добавления, делеции и/или замещения одного или более аминокислотных остатков в последовательности родительского антитела. В преимущественном варианте осуществления данный вариант содержит одно или более аминокислотных замещений в одном или более CDR областях родительского антитела. Например, вариант может содержать по меньшей мере одно (например, приблизительно от одного, до приблизительно десяти, и, предпочтительно, приблизительно от двух до приблизительно пяти) замещений в одном или более CDR областях родительского антитела. Идентичность или гомологичность относительно вариантной последовательности определена в данном описании как процент аминокислотных остатков в вариантной последовательности, идентичный остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Никакие N-концевые,С-концевые или внутренние продолжения, делеции или инсерции в последовательности антитела не должны интерпретироваться как влияющие на идентичность или гомологичность последовательности. Вариант сохраняет способность связывать миостатин и, предпочтительно, обладает свойствами, превосходящими аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариант может обладать более сильной аффинностью связывания, меньшим IC50 в анализе SBE/репортер или повышенной способностью ингибировать биоактивность миостатина. Вариантное антитело, которое представляет особый интерес, в данном описании представляет собой антитело, проявляющее по меньшей мере приблизительно 5-кратное, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10-кратное и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20, 30 или 50-кратное увеличение биологической активности по сравнению с родительским антителом."Родительское" антитело в данном описании означает антитело, кодированное аминокислотной последовательностью, которая используется для получения варианта. Родительское антитело может иметь мышиную каркасную, но, предпочтительно, имеет человеческую каркасную область. Родительское антитело может быть мышиным (см., например, фигуры, приведенные в данном описании), химерным, гуманизированным или человеческим антителом. Термин "специфически связывает", как используется в данном описании, относится к ситуации, в которой один участник пары специфического связывания не связывает в значительной степени молекулы, отличные от его партнера (партнеров) по специфическому связыванию, в соответствии с измерениями, проведенными по методикам, известным в данной области, например, конкурентных анализовELISA, BIACORE или KINEXA. Термин также применим, если, например, антигенсвязывающий домен антитела в соответствии с данным изобретением является специфическим для конкретного эпитопа, носителя ряда антигенов, в таком случае специфическое антитело, имеющее антигенсвязывающий домен,будет способно к специфическому связыванию различных антигенов, носителей эпитопа. Соответственно, моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением специфически связывает GDF-8, а не GDF-11. Термин "предпочтительно связывает", как используется в данном описании, относится к ситуации,в которой антитело связывает специфический антиген по меньшей мере приблизительно на 20% больше,чем оно связывает иной антиген, в соответствии с измерениями, проведенными по методикам, известным в данной области, например, конкурентного анализа ELISA или KD измерений при помощи анализовBIACORE или KINEXA. Соответственно, моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением предпочтительно связывает GDF-8, а не GDF-11. Аналогично, антитело может предпочтительно связывать один эпитоп в пределах антигена, но не другой эпитоп в пределах того же самого антигена. Термин "эпитоп" относится к той части молекулы, которая способна быть распознанной и связан-7 015903 ной с антителом в одном или более антигенсвязывающих областях антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных группировок молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими зарядовыми характеристиками. Под "ингибирующим эпитопом" и/или "нейтрализующим эпитопом" подразумевается эпитоп, который в контексте интактной молекулы (в данном случае, миостатин) и при связывании антителом, специфическим по отношению к эпитопу, приводит к утрате или уменьшению биологической активности молекулы или организма, который содержит молекулу, in vivo или in vitro описании, дополнительно относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно, млекопитающего, например, мыши или человека. Термин"антигенный эпитоп", как используется в данном описании, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, определенная любым способом, хорошо известным в данной области, например, при помощи традиционного иммунного анализа. Антигенные эпитопы необязательно должны быть иммуногенными, но могут также быть иммуногенными. "Иммуногенный эпитоп",как используется в данном описании, определяется как часть полипептида, который вызывает отклик антитела у животного, как устанавливается любым способом, известным в данной области. (См., например, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983. Выражения "биологическое свойство" или "биоактивность", "активность" или "биологическая активность" по отношению к антителу в соответствии с данным изобретением используются в данном описании как взаимозаменяемые и включают, но не ограничиваются приведенными, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность, способность нейтрализовать или быть антагонистом активности миостатинаin vivo или in vitro, IC50 в анализе миостатин/SBE репортер или другом анализе активности in vitro, invivo стабильность антитела и иммуногенные свойства антитела. Остальные идентифицируемые биологические свойства антитела включают, например, перекрестную реактивность (т.е., как правило, с нечеловеческими гомологами пептида-мишени или с остальными белками или мишенями) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться или измеряться или оцениваться с использованием методик, признанных в уровне техники, включая, но, не ограничиваясь приведенным, анализом ELISA, конкурентный анализ ELISA, анализ поверхностного плазмонного резонанса, анализы нейтрализации in vitro и in vivo без ограничений, рецепторного связывания, продуцирования и/или секреции цитокина или фактора роста, развития аномального полюса Xenopus, сигнальной трансдукции и иммуногистохимии срезов тканей,полученных из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник, в зависимости от потребностей. Термин "активность миостатина", как используется в данном описании, относится к одной или более физиологических рост-стимулирующих или морфогенетичеких активностей, связанных с активным миостатиновым белком. Например, активный миостатин является отрицательным регулятором скелетной мышечной массы. Активный миостатин может также регулировать продуцирование мышечноспецифических ферментов (например, креатинкиназы), стимулировать пролиферацию миобластов и регулировать дифференциацию преадипоцитов в адипоциты. Термин "ингибировать" или "нейтрализовать", как используется в данном описании, по отношению к активности антитела в соответствии с данным изобретением, означает способность в значительной степени противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, уничтожать, прекращать, уменьшать или обращать, например, развитие или тяжесть того, что ингибируют,включая, но, не ограничиваясь вышеприведенным, биологическую активность или свойство, заболевание или состояние. Ингибирование или нейтрализация составляют предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или выше. Термин "выделенный", при использовании по отношению к нуклеиновой кислоте или белку (например, антителу), относится к нуклеиново-кислотной последовательности или белку, которые идентифицируют и отделяют по меньшей мере от одного загрязняющего вещества, с которым он обычно связан в природном источнике. Предпочтительно "выделенное антитело" является антителом, которое в значительной степени свободно от других антител, обладающих отличной антигенной специфичностью (например, фармацевтические композиции в соответствии с данным изобретением содержат выделенное антитело, которое специфически связывает миостатин и, по существу, свободно от антител, которые специфически связывают антигены, отличные от миостатина). Термины "Кабат-нумерация" и "Кабат-маркировка" используются в данном описании как взаимозаменяемые. Данные термины, признанные в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем остальные аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела (Rabat, et al., Ann. NYDepartment of Health and Human Services, NIH Publication91-3242 (1991. Полинуклеотид является "функционально связанным", если он имеет функциональные связи с другим полинуклеотидом. Например, промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности. Пептид "функционально свя-8 015903 зан" с другим пептидом, если полинуклеотиды, кодирующие их, связаны функционально, предпочтительно, если они находятся в той же самой открытой рамке считывания. Термины "индивидуум", "субъект" и "пациент" в данном описании используются как взаимозаменяемые и относятся к животному, предпочтительно млекопитающему (включая непримата или примата) или виды птиц, включая, но, не ограничиваясь приведенным, мышей, обезьян, людей, млекопитающихсельскохозяйственных животных (например, коров, свиней, овец), млекопитающих-спортивных животных (например, лошадей) и млекопитающих-комнатных животных (например, собак и кошек); предпочтительно термин относится к людям. Термин также относится к видам птиц, включая, но, не ограничиваясь приведенным, кур и индюков. В определенном варианте осуществления субъект, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, дополнительно характеризуется заболеванием или расстройством или состоянием, которые могут быть улучшены путем уменьшения уровня или уменьшения биоактивности миостатина. В другом варианте осуществления субъект, предпочтительно млекопитающее,предпочтительно человек, дополнительно характеризуется наличием риска развития расстройства, заболевания или состояния, которые могут быть улучшены путем уменьшения уровня или уменьшения биоактивности миостатина. Термин "вектор" включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана, включая, но, не ограничиваясь приведенным, плазмиды и вирусные векторы. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, в то время как остальные векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицированы наряду с геномом-хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании называются "векторами рекомбинантной экспрессии" (или, упрощенно, "векторами экспрессии"), и проиллюстрированные векторы хорошо известны в данной области. Как используется в данном описании, выражения "клетка", "клетка-хозяин", "линия клеток" и "клеточная культура" используются как взаимозаменяемые и включают индивидуальную клетку или клеточную культуру, которые являются реципиентом любого выделенного полинуклеотида в соответствии с данным изобретением или любого рекомбинантного вектора (любых рекомбинантных векторов), которые содержат последовательность, кодирующую HCVR, LCVR или моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением. Клетки-хозяева включают потомство индивидуальной клетки-хозяина, и потомство необязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или полному ДНК комплементу) оригинальной родительской клетке, из-за природных, случайных или преднамеренных мутаций и/или изменений. Клетка-хозяин включает клетки, трансформированные, трансдуцированные или инфицированные in vivo или in vitro одним или более рекомбинантными векторами, или моноклональное антитело, которое экспрессирует полинуклеотид в соответствии с данным изобретением, или его легкую или тяжелую цепь. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор в соответствии с данным изобретением (как стабильно включенный в хромосом-хозяин, так и не включенный), также может называться "рекомбинантной клеткой-хозяином". Предпочтительными клетками-хозяевами для использования в изобретении являются клетки CHO (например, ATCC CRL-9096), клетки NS0, клетки SP2/0 и клетки COS (ATCC, например, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2). Дополнительные клетки-хозяева для использования в изобретении включают растительные клетки, дрожжевые клетки, другие клетки млекопитающих и прокариотные клетки. Характеристика антител Данное изобретение относится к выделенным, моноклональным антителам, которые специфически связывают миостатин с высокой аффинностью. Антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой, предпочтительно, химерные, гуманизированные или человеческие антитела или их антигенсвязывающие части. Дополнительно антитела в соответствии с данным изобретением нейтрализуют или являются антагонистами биологической активности миостатина in vivo или in vitro. Специфическое связывание антимиостатиновых моноклональных антител в соответствии с данным изобретением с миостатином дает возможность использовать антитела в соответствии с данным изобретением в терапевтических и профилактических целях для состояний, заболеваний или расстройств, связанных с миостатином, т.е. состояний, заболеваний или расстройств, которые могут быть улучшены путем снижения уровней миостатина или путем противодействия или ингибирования биологической активности миостатина. В преимущественном варианте осуществления изобретение обеспечивает антимиостатиновое моноклональное антитело, которое связывает миостатин или его часть, где значение аффинности связывания (KD) миостатина составляет менее чем приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно менее чем приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно менее чем приблизительно 810-11M, 710-11M, 510-12 М или 1,410-12 М. Альтернативно, антитела в соответствии с данным изобретением характеризуются значением KD для миостатина, которое не превышает приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно не превышает приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно не превышает приблизительно 810-11M, 710-11M, 510-12 М или 1,410-12 М. Аффинность антител может быть определена, как описано в примерах, приведенных ниже в-9 015903 данном описании. Предпочтительно такие антитела в соответствии с данным изобретением, которые характеризуются сильной аффинностью связывания, как описано в данном описании, также имеют значения IC50 менее чем 40, 30, 25, 20 или 10 нМ, более предпочтительно меньше или равные приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе in vitro миостатин/SBE репортер. Даже более предпочтительно, антитело, которое характеризуется сильной аффинностью связывания, как описано в данном описании, имеет IC50 в анализе in vitro миостатин/SBE репортер по меньшей мере на 20% ниже, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно в два раза, три раза или четыре раза ниже, чем IC50 антитела в анализе in vitro GDF-11/SBE репортер (как описано в примере 5 данного описания). Предпочтительно такие антитела в соответствии с данным изобретением, которые характеризуются сильной аффинностью связывания, как описано в данном описании, дополнительно отличаются тем, что они по меньшей мере на 20% преимущественно реагируют с GDF-8, а не с GDF-11, в соответствии с измерениями, проведенными по методикам, известным в данной области, например конкурентного анализа ELISA или анализов BIACORE или KINEXA, демонстрируя по меньшей мере на 20% более высокую аффинность (т.е. более низкое KD) антитела по отношению к GDF-8, чем GDF-11. Предпочтительно такие антитела в соответствии с данным изобретением, которые характеризуются более сильной аффинностью связывания, как описано в данном описании, дополнительно отличаются тем, что они не связывают пептид, состоящий из аминокислот 40-64 (включительно), 43-57 или 45-59 зрелого миостатина, предпочтительно человеческого миостатина. В другом преимущественном варианте осуществления изобретение обеспечивает антимиостатиновое моноклональное антитело, которое имеет IC50 меньше или равное приблизительно 40, 30,25, 20 или 10 нМ, более предпочтительно меньше или равное приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе in vitro миостатин/SBE репортер. Даже более предпочтительно значение IC50 антимиостатинового моноклонального антитела в анализе in vitro миостатин/SBE репортер по меньшей мере приблизительно в два раза, три раза или четыре раза ниже, чем значение IC50 антитела в анализе in vitro GDF-11/SBE репортер (как описано в примере 5, приведенном в данном описании). Антитела в соответствии с данным изобретением, имеющие IC50, как описано выше, могут дополнительно характеризоваться значением KD для миостатина, менее приблизительно 4,210-9M или 4,010-9 М, предпочтительно менее приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно менее приблизительно 810-11M, 7l0-11M, 51012M или 1,410-12 М; альтернативно, KD для миостатина не превышает приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М,предпочтительно не превышает приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и, более предпочтительно,не превышает приблизительно 810-11M, 710-11M, 510-12 М или 1,410-12 М, где значение KD для миостатина по меньшей мере приблизительно на 20% ниже, чем значение, которое имеет антитело для GDF-11. Антитела в соответствии с данным изобретением, имеющие IC50, как описано выше, могут дополнительно отличаться предпочтительным связыванием миостатина по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно в два раза, три раза или четыре раза выше, по сравнению с их возможностью связывать GDF-11 с использованием способа, известного в данной области, например, анализа ELISA или конкурентного анализа ELISA, или значение KD измеренное, например, при помощи анализаBIACORE или KINEXA. Антитела в соответствии с данным изобретением, имеющие IC50, как описано выше, могут дополнительно отличаться тем, что не связывают пептид, состоящий из аминокислот 40-64(включительно), 43-57 или 45-59 зрелого миостатина, предпочтительно человеческого миостатина, на уровнях, значительно превышающих фоновый (например, в анализе ELISA). Предпочтительно миостатиновые и GDF-11 полипептиды, проанализированные на предпочтительное связывание антитела в соответствии с данным изобретением, оба представляют собой гомодимерные формы зрелого белка, предпочтительно полученного от млекопитающих или птиц, даже более предпочтительно человеческого происхождения. Однако миостатиновые и GDF-11 полипептиды, проанализированные на предпочтительное связывание антитела в соответствии с данным изобретением, могут представлять собой мономерную форму зрелой формы белка или пропротеина. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомного способа, хорошо известного в данной области (см., например, Kohler et al., Nature, 256:495, 1975) или могут быть получены при помощи рекомбинантных ДНК способов (например, как в патенте США 4816567). Обычно,гибридому можно получить путем слияния подходящих иммортализованных линий клеток (например,миеломной линии клеток, таких как SP2/0) с клетками, продуцирующими антитела иммунизированного животного. Клетки, продуцирующие антитела, предпочтительно клетки селезенки или лимфатических узлов, получают от животных, иммунизированных антигеном, который рассматривается. Слитые клетки(гибридомы) могут быть выделены с использованием селективных условий культивирования и клонированы путем серийных разведений. Культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки,оценивают на предмет продуцирования моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, редуцированных гибридомными клетками, оценивают путем иммунного осаждения или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (RIA) или ELISA. Клетки, которые продуцируют антитела с желаемыми связующими- 10015903 свойствами, могут быть отобраны при помощи подходящего скринингового анализа. Способы такого выделения и скрининга хорошо известны в данной области. Могут быть использованы другие подходящие способы продуцирования или выделения антитела в соответствии с данным изобретением, включая, например, способы, в которых выбирают рекомбинантное антитело (например, одноцепочечный Fv или Fab) из библиотеки, или способы, которые зависят от иммунизации трансгенных животных (например, мышей), способных продуцировать набор человеческих антител (см., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993; Jakobovits et al.,Nature, 362:255-258, 1993; Lonberg et al., патент США 5545806; Surani et al., патент США 5545807). Одноцепочечные антитела и химерные, гуманизированные или приматизированные (CDRимплантированные) антитела, а также химерные или CDR-имплантированные одноцепочечные антитела,и подобные им антитела, состоят из частей, полученных из различных источников, также охватываются данным изобретением и термином "антитело". Различные части данных антител могут быть соединены вместе химически при помощи традиционных методик, синтетически, или могут быть получены как родственный белок, с использованием методов генной инженерии. Например, нуклеиновые кислоты, которые кодируют химерную или гуманизированную цепь, могут быть экспрессированы для продуцирования родственного белка. См. например, патент США 4816567; Европейский патент 0125023 B1; патент США 4816397; Европейский патент 0120694 B1; WO 86/01533; Европейский патент 0194276 B1; патент США 5225539; Европейский патент 0239400 B1 и патенты США 5585089 и 5698762. См. также, Newman, R. et al. BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, относительно приматизированного антитела и Ladner et al., патент США 4946778 и Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988, относительно одноцепочечных антител. Дополнительно могут быть также получены функциональные части антител, включая антигенсвязывающую часть химерных, гуманизированных или человеческих, или одноцепочечных антител. Функциональные части у вышеуказанных антител, сохраняют по меньшей мере одну антигенсвязывающую функцию и/или биологическую функцию или биоактивность полноразмерного антитела,из которого они получены. Преимущественные функциональные части сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего полноразмерного антитела (например, способность связывать зрелую форму миостатина млекопитающего). Особенно предпочтительные функциональные части или фрагменты сохраняют способность к ингибированию одной или более функций или биологических активностей, характерных для зрелого миостатина млекопитающих, таких как активность связывания, сигнальная активность и/или стимулирование клеточного отклика. Например, в одном варианте осуществления функциональная часть или фрагмент могут ингибировать взаимодействие зрелого миостатина с одним или более его лигандами и/или могут ингибировать один или более рецептор-опосредованных функций. Части или фрагменты антител, способные связывать зрелый миостатин включают, но, не ограничиваясь приведенным, фрагменты Fv, Fab, Fab' и F(ab')2 и охватываются изобретением. Такие фрагменты могут быть получены путем ферментного расщепления или при помощи рекомбинантных методик. Например, расщепление папином или пепсином может привести к образованию Fab или F(ab')2 фрагментов,соответственно. Наименьшим антигенсвязывающим фрагментом является Fv, состоящий из HCVR иLCVR доменов. Фрагмент Fab состоит из HCVR-CH1 и LCVR-CL доменов, ковалентно связанных дисульфидным мостиком между константными областями. Для преодоления тенденции нековалентно связанных доменов HCVR и LCVR в Fv диссоциировать при совместной экспрессии в клетке-хозяине может быть сконструирован так называемый одноцепочечный (sc) Fv фрагмент (scFv), в котором присутствуют гибкие и соразмерно длинные полипептидные связи C-конца HCVR с N-концом LCVR или C-концаLCVR с N-концом HCVR. Наиболее часто используемым линкером является 15-остаток (Gly4Ser)3 пептида, но в данной области также известны другие линкеры. Антитела также могут быть получены в различных усеченных формах, с использованием генов антител, в которых один или более стоп-кодонов введены над природным стоп-сайтом. Например, может быть разработан химерный ген, кодирующий F(ab')2 часть тяжелой цепи, для включения ДНК последовательностей, кодирующих домен CH1 и шарнирную область тяжелой цепи. Было доказано, что отбор фрагментов антител из библиотек при помощи технологий обогащения,таких как фаговый дисплей (Matthews D.J. and Wells J.A. Science. 260:1113-1, 1993), рибосомный дисплей(Hanes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:14130-5, 1998), бактериальный дисплей (Samuelson P., et al.,Journal of Biotechnology. 96:129-54, 2002) или дрожжевой дисплей (Kieke M.C., et al., Protein Engineering,10:1303-10, 1997) представляют собой успешные альтернативы классической гибридомной технологии(последние обзоры: Little M. et al., Immunology Today, 21:364-70, 2000;). Вариантные антитела Мышиное моноклональное антитело или человеческое антитело (полученное, например, у трансгенных мышей) полученное против миостатина или против белка, содержащего иммуногенный эпитоп в соответствии с данным изобретением, является родительским антителом. Мышиное родительское антитело может быть дополнительно изменено для создания химерной или гуманизированной формы антитела с использованием способов, хорошо известных в данной области. Такие химерные или гуманизиро- 11015903 ванные антитела могут служить родительскими антителами для дополнительных вариаций или мутагенеза. Родительские антитела в соответствии с данным изобретением могут быть дополнительно мутированы, например, в пределах CDR домена (доменов) (см., например, фиг. 6 и 7) для создания вариантного антитела с оптимизированными свойствами, которые рассматриваются, например, как аффинность связывания, IC50, специфичность и т.д. Предпочтительным является вариантное антитело с аминокислотным замещением, у которого удален по меньшей мере один аминокислотный остаток молекулы родительского антитела и на место которого вставлен другой остаток. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают CDR области, но FR изменения также охватываются. Предпочтительными являются аминокислотные замещения. Если такие замещения приводят к изменению биологической активности антитела, то могут быть включены более существенные изменения, т.е. неконсервативные аминокислотные изменения, и продукт подвергнут скринингу. Удобным способом получения заместительных вариантов является созревание аффинности с использованием фагового дисплея. Кратко, несколько сайтов CDR области мутируют для создания всех возможных аминокислотных замещений в каждом сайте. Варианты антител, которые создаются таким образом, проявляются в моновалентном виде из филаментных фаговых частиц как слияния с генным продуктом III из M13, упакованного в каждой частице. Варианты фагового дисплея затем подвергают скринингу на предмет их биологической активности (например, связующей активности, специфичности,IC50), как описано в данном описании. Для идентификации сайтов CDR областей, потенциальных для модификации, могут быть произведены аланиновые сканирования мутагенов для идентификации остатков CDR областей, которые вносят значительный вклад в связывание антигенов. Альтернативно или дополнительно, полезным может быть анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для идентификации мест контакта антитела и миостатина. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами для замещения в соответствии в методиками, разработанными в данном изобретении или известных в данной области. Альтернативно или дополнительно, может быть проведен неспецифический мутагенез одной или более CDR последовательностей в одном или более положениях остатков, когда CDR функционально связан с вариабельной областью или когда CDR не связана с другой последовательностью вариабельной области, и затем измененный CDR возвращают в вариабельную область с использованием рекомбинантной ДНК технологии. После того как получены такие вариантные антитела, набор вариантов подвергают скринингу, как описано в данном описании, и антитела с лучшими свойствами в одном или более релевантных анализов могут быть отобраны для дальнейшей разработки. Любые цистеиновые остатки, не задействованные в поддержании надлежащей конформации антимиостатинового антитела в соответствии с данным изобретением, могут быть замещены, в основном,серином, для улучшения стабильности молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного связывания. Наоборот, к антителу может быть добавлена цистеиновая связь (цистеиновые связи) для улучшения его стабильности (в особенности, если антителом является фрагмент антитела, такой какFv фрагмент). Другой тип аминокислотного варианта антитела изменяет оригинальный характер гликозилирования антитела. Под изменением подразумевается делеция одной или более углеводных групп, обнаруженных в антителе, и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в родительском антителе. Гликозилирование антител является, конкретно, или N-связанным, или O-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями распознавания ферментного присоединения углеводной группы к аспарагиновой боковой цепи. Поэтому присутствие любой из таких трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Oсвязанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиламиновой кислоте, наиболее часто - серину или треонину, хотя также может быть использован 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Добавление сайтов гликозилирования к антителу легко сопровождается замещением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит одну или более из вышеуказанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение может также произведено путем добавления или замещения, одного или более сериновых или треониновых остатков последовательности оригинального антитела (для O-связанных сайтов гликозилирования). Последовательность Предпочтительное моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением содержитSEQ ID NO:74-102, 140, 141 и 142 (фиг. 9) и/или HCVR, содержащий пептид с последовательностью,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:103-138 (фиг. 10). В преимущественном варианте осуществления антитело в соответствии с данным изобретением, содержащее полипептид LCVR, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO, как показано в табл. 1 данного описания, до- 12015903 полнительно содержит HCVR полипептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ IDNO полипептида HCVR, соответствующего конкретному LCVR в табл. 1. Специалисту в данной области будет очевидно, что антитела в соответствии с данным изобретением не ограничиваются конкретными последовательностями HCVR и LCVR, как указано на фиг. 9 и 10, но также включают варианты данных последовательностей, которые сохраняют способность к связыванию антигена и остальные функциональные свойства антитела в соответствии с данным изобретением. Такие варианты могут быть получены из предоставленных последовательностей с использованием методик, известных в данной области,как описано в данном описании. Дополнительно, моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением является антителом, которое конкурентно ингибировано связывающим зрелым человеческим миостатином (или его частью) конкурирующим моноклональным антителом, содержащим два полипептида с последовательностями, выбранными из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO:98 и 138 и (ii) SEQ ID NO:74 и 103. Такое конкурирующее ингибирование между антителами может быть измерено при помощи анализов, хорошо известных специалисту в данной области, например, конкурентного анализа ELISA. Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением, которое конкурирует с конкурирующим антителом, определенным выше, дополнительно отличается предпочтительным связываниемGDF-8, по сравнению с GDF-11, по меньшей мере на 20, 30 или 40%, в соответствии с измерениями, проведенными при помощи методик, известных в данной области, например конкурентным анализом ELISA или анализом BIACORE или KINEXA, демонстрируя по меньшей мере на 20, 30 или 40% более высокую аффинность (т.е. более низкое значение KD) антитела к GDF-8, чем к GDF-11. Предпочтительное антитело в соответствии с данным изобретением, которое конкурирует с конкурирующим антителом, определенным выше, дополнительно отличается тем, что оно имеет значение KD для миостатина менее приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно менее приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно менее приблизительно 810-11 М, 710-11 М, 510-12 М или 1,410-12 М; или альтернативно, отличается значением KD для миостатина, которое не превышает приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно не превышает приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно не превышает приблизительно 810-11M, 710-11M, 510-12 М или 1,410-12 М и/или дополнительно отличается тем, что имеет значение IC50 меньше или равное приблизительно 40, 20 или 10 нМ, более предпочтительно меньше или равное приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе in vitro миостатин/SBE репортер. Даже более предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением, которое конкурирует с конкурирующим антителом, определенным выше, дополнительно отличается тем, что значение IC50 в анализе in vitro миостатин/SBE репортер является меньшим или равным приблизительно 40, 30, 25, 20 или 10 нМ, более предпочтительно меньшим или равным приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе invitro миостатин/SBE репортер. Даже более предпочтительно значение IC50 антимиостатинового моноклонального антитела в анализе in vitro миостатин/SBE репортер, по меньшей мере приблизительно в два, три или четыре раза ниже, чем значение IC50 антитела в анализе in vitro GDF-11/SBE репортер (как описано в примере 5 данного описания). Даже более предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением, которое конкурирует с конкурирующим антителом, определенным выше, дополнительно характеризуется тем, что оно не связывает пептид, состоящий из аминокислот 40-64 (включительно), 4357 или 45-59 зрелого миостатина, предпочтительно человеческого миостатина. В одном варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением имеет вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR области со следующими аминокислотными последовательностями:CDRH1 (SEQ ID NO:42), CDRH2 (SEQ ID NO:71) и CDRH3 (SEQ ID NO:72) (см. фиг. 7); и/или где вариабельная область легкой цепи содержит CDR области со следующими аминокислотными последовательностями: CDRL1 (SEQ ID NO:12), CDRL2 (SEQ ID NO:154) и CDRL3 (SEQ ID NO:37). Предпочтительно CDR тяжелой цепи антитела в соответствии с данным изобретением являются такими, как показано на фиг. 7, CDR легкой цепи антитела в соответствии с данным изобретением являются такими, как показано на фиг. 6. Дополнительно предполагается, что антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением содержит HCVR, содержащую CDRH1, содержащий последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO:38-41, и/или CDRH2, содержащий последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO:43-70 и 73, и/или CDRH3, содержащей последовательность SEQ ID NO:72. В другом варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением содержит LCVR, содержащий CDRL1, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:9-11, и/или CDRL2, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:13-23, и/или CDRL3, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:24-36. В преимущественном варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением содержит CDRH1, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:38-42, и/или CDRH2, содержащий последовательность, вы- 13015903 бранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:43-70 и 73, и/или CDRH3, содержащий последовательность SEQ ID NO:72 и дополнительно содержащий LCVR, содержащий CDRL1, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:9-11, и/или CDRL2, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:13-23, и/или CDRL3, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:24-36. Структурой, содержащей CDR в соответствии с данным изобретением, обычно будет последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или его значительная часть, в которой расположена CDR в месте, соответствующем CDR HCVR и LCVR, которые встречаются в природе (Kabat et al, Sequences ofProteins of Immunological Interest, US Dept of HHS, 1991). Три CDR области для каждой цепи, легкой и тяжелой, обеспечиваются в каркасной области как заменимые последовательности, представленные следующей формулой: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелой цепи или легкой цепи сочетают для образования полного каркаса при расположении в качестве заменимой последовательности с CDR в указанном порядке. Предпочтительно каркасные области антитела в соответствии с данным изобретением имеют человеческое, гуманизированное или, по существу, человеческое происхождение. В гуманизированном антителе, предназначенном для терапевтического использования у людей,каркасная область имеет предпочтительно целиком или, по существу, человеческое происхождение (т.е. по меньшей мере 90, 92, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческого происхождения). Предпочтительно каркасная область легкой цепи гуманизированного, человеческого или химерного антитела в соответствии с данным изобретением является такой, как показано на фиг. 9, и состоит из FR1 с SEQ ID NO:143, FR2 сSEQ ID NO:144, FR3 с SEQ ID NO:145 и FR4 с SEQ ID NO:146 или 147. Предпочтительно каркасная область тяжелой цепи гуманизированного, человеческого или химерного антитела в соответствии с данным изобретением является такой, как показано на фиг. 10, и состоит из FR1 с SEQ ID NO:148 или 149, FR2 сSEQ ID NO:150 или 151, FR3 с SEQ ID NO:152 или 153, и FR4 с SEQ ID NO:139. Например, антитело 374/C1E4 содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую FR1 с SEQ ID NO:143, CDR1 с SEQFR4 с SEQ ID NO:146. Антитело 3-74/C1E4 дополнительно содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую FR1 с SEQ ID NO:149, CDR1 с SEQ ID NO:40, FR2 с SEQ ID NO:151, CDR2 с SEQ IDNO:60, FR3 с SEQ ID NO:153, CDR3 с SEQ ID NO:72 и FR4 с SEQ ID NO:139. В антителе, предназначенном для использования на животном, не являющемся человеком, последовательность каркасной области может, по существу, происходить из человеческого генома (предпочтительно, используемого на животном, не являющемся человеком, на стадии эмбриона или новорожденного) или из генома животного, в котором он должен использоваться в терапевтических целях. В одном варианте осуществления антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением, в котором вся или часть вариабельной области ограничены конкретной последовательностью, как показано на примере SEQ ID NO в данном описании, дополнительно характеризуется тем, что оно является химерным, гуманизированным или полностью человеческим антителом или его антигенсвязывающей частью, которая противодействует или нейтрализует по меньшей мере одну активность миостатина in vivo или in vitro. Антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением, в котором вся или часть вариабельной области ограничены конкретной последовательностью, как показано на примере SEQ ID NO в данном описании, дополнительно характеризуется тем, что оно предпочтительно, связывает GDF-8, по сравнению с GDF-11 по меньшей мере на 20, 30 или 40%, в соответствии с измерениями, проведенными по методикам, известным в данной области, например, при помощи анализаELISA или анализов BIACORE или KINEXA, проявляя по меньшей мере на 20, 30 или 40% большую аффинность (т.е. более низкое значение KD) антитела к GDF-8, чем к GDF-11. Предпочтительное антитело в соответствии с данным изобретением, в котором вся или часть вариабельной области ограничены конкретной последовательностью, как показано на примере SEQ ID NO в данном описании, дополнительно характеризуется тем, что значение KD для миостатина меньше приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно меньше приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно меньше приблизительно 810-11 М, 710-11 М, 510-12 М или 1,410-12 М; или альтернативно характеризуется значением KD для миостатина, которое не превышает приблизительно 4,210-9 М или 4,010-9 М, предпочтительно не превышает приблизительно 4,610-10 М, 4,010-10 М или 210-10 М и более предпочтительно, не превышает приблизительно 810-11 М, 710-11 М, 510-12 М или 1,410-12 М и/или дополнительно характеризуется тем, что имеет значение IC50 меньше или равное приблизительно 40 нМ, 20 нМ или 10 нМ, более предпочтительно меньше или равное приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализеin vitro миостатин/SBE репортер. Даже более предпочтительно, антитело в соответствии с данным изобретением, в котором вся или часть вариабельной области ограничены конкретной последовательностью, как показано на примере SEQID NO в данном описании, дополнительно характеризуется тем, что значение IC50 в анализе in vitro миостатин/SBE репортер меньше или равно приблизительно 40, 30, 25, 20 или 10 нМ, более предпочтительно меньше или равно приблизительно 5, 4, 3, 2 или 1 нМ в анализе in vitro миостатин/SBE репортер. Даже- 14015903 более предпочтительно IC50 антимиостатинового моноклонального антитела в анализе in vitro миостатин/SBE репортер по меньшей мере приблизительно в два раза, три раза или четыре раза ниже, чем значение IC50 антитела в анализе in vitro GDF-11/SBE репортер (как описано в примере 5 данного описания). Даже более предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением, в котором вся или часть вариабельной области ограничены конкретной последовательностью, как показано на примере SEQ IDNO в данном описании, дополнительно характеризуется тем, что оно не связывает пептид, состоящий из аминокислот 40-64 (включительно), 43-57 или 45-59 зрелого миостатина, предпочтительно человеческого миостатина. Экспрессия антител Настоящее изобретение также направлено на линии клеток, которые экспрессируют антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением, или его часть. Создание и выделение клеточных линий, продуцирующих моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением,может быть выполнено с использованием стандартных методик, известных в данной области. Предпочтительные клеточные линии включают COS, CHO, SP2/0, NS0 и дрожжи (имеющиеся в наличии в таких общественных депозитариях, как ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA). Для экспрессии антитела в соответствии с данным изобретением могут быть использованы разнообразные хозяйственные системы экспрессии, включая прокариотные (бактериальные) и эукариотные системы экспрессии (такие как дрожжи, бакуловирус, растительные клетки, клетки млекопитающих и другие клетки животных, трансгенные животные и гибридомные клетки), а также системы экспрессии фагового дисплея. Примером подходящего бактериального вектора экспрессии является pUC119, и подходящим эукариотным вектором экспрессии является модифицированный pcDNA3.1 вектор с ослабленной системой отбора DHFR. Остальные системы экспрессии антител также известны в данной области и описаны в данном описании. Антитело в соответствии с данным изобретением может быть получено способом рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяин трансформируют, трансдуцируют, инфицируют и т.д., с одним или более рекомбинантными векторами экспрессии, носителями ДНК фрагментов, кодируя легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы такие легкие и/или тяжелые цепи экспрессировались в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепь могут быть экспрессированы независимо от различных промоторов, с которым они функционально связаны в одном векторе или, альтернативно, тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться независимо от различных промоторов, с которыми они функционально связаны в двух векторах - один из них экспрессирует тяжелую цепь, и второй - легкую. Необязательно, тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться в различных клетках-хозяевах. Предпочтительно рекомбинантные антитела выделяются в среде, в которой культивируют клеткихозяева, из которых могут быть выделены или очищены антитела. Стандартные рекомбинантные ДНК методологии используют для получения генов легкой и тяжелой цепи антитела, включения этих генов в векторы рекомбинантной экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева. Такие стандартные рекомбинантные ДНК технологии описаны, например, в Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, et al (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989. Выделенная ДНК, кодирующая HCVR область, может быть конвертирована в ген полноразмерной тяжелой цепи, путем функционального связывания HCVR-кодирующей ДНК с другой ДНК молекулой,кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов константной области человеческой тяжелой цепи известны в данной области. См., например, Kabat, et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication91-3242 (1991). ДНК фрагменты, которые охватывают эти области, могут быть получены, например, путем стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может быть константной областью любого типа (например, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD), класса (например, IgG1,IgG2, IgG3 и IgG4) или подкласса, и все аллотипные его варианты описаны у Kabat (выше). Альтернативно, антигенсвязывающая часть может быть Fab фрагментом, Fab' фрагментом, F(ab')2 фрагментом, Fd или одноцепочечным Fv фрагментом (scFv). Для гена тяжелой цепи Fab фрагмента, ДНК, кодирующаяHCVR, может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константная область тяжелой цепи CH1. ДНК, кодирующая LCVR область, может быть превращена в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген Fab легкой цепи) путем функционального связывания ДНК, кодирующей LCVR, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области человеческой легкой цепи известны в данной области. См., например, Kabat, выше.DNA фрагменты, охватывающие эти области, могут быть получены при помощи стандартной ПЦРамплификации. Константная область легкой цепи может быть константной областью каппа или лямбда. Для создания scFv гена, фрагменты ДНК, кодирующие HCVR- и LCVR, функционально связаны с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, таким образом, чтобы последовательности HCVR и LCVR могли экспрессировать- 15015903 ся как заменимый одноцепочечный белок, где LCVR и HCVR области соединены гибким линкером. См.,Bird, et al., Science 242:423-6, 1988; Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83, 1988; McCafferty,et al., Nature 348:552-4, 1990. Для экспрессии антитела в соответствии с данным изобретением, ДНК, кодирующую частичную или полноразмерную легкую и/или тяжелую цепь, полученную, как описано выше, вводят в ген экспрессии таким образом, чтобы ген был функционально связан с транскрипционными и трансляционными контрольными последовательностями. Были отобраны вектор экспрессии и контрольные последовательности экспрессии, совместимые с используемой клеткой-хозяином экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть введены в индивидуальные векторы или, более конкретно, оба гена вводят в тот же самый вектор экспрессии. Гены антитела вводят в вектор экспрессии стандартными способами. Дополнительно, вектор рекомбинантной экспрессии может кодировать сигнальный пептид,который способствует секреции легкой и/или тяжелой цепи антимиостатинового моноклонального антитела из клетки-хозяина. Ген легкой и/или тяжелой цепи антимиостатинового моноклонального антитела может быть клонирован в вектор таким образом, чтобы сигнальный пептид был функционально связан в каркасе с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом. Кроме гена (генов) тяжелой и/или легкой цепи антитела, вектор рекомбинантной экспрессии в соответствии с данным изобретением имеет регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена (генов) цепи антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" предназначен для включения промоторов, энхансеров и других элементов контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), при необходимости, которые контролируют транскрипцию либо трансляцию гена (генов) цепи антигена. Конструкция вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которая подлежит трансформации, уровень экспрессии желаемого белка. Предпочтительные регуляторные последовательности для клеток-хозяев млекопитающих включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белков в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьяны 40 (SV40), аденовируса, (например, основного позднего промотора аденовируса (AdMLP и вируса полиомы. Кроме генов тяжелой и/или легкой цепей антитела и регуляторных последовательностей, векторы рекомбинантной экспрессии в соответствии с данным изобретением могут включать дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клеткехозяине (например, начала репликации) и один или более выбираемых маркерных генов. Выбираемые маркерные гены способствуют отбору клеток-хозяев, в которые был введен вектор. Например, конкретно выбираемые маркерные гены придают резистентность лекарственным средствам, таким как G418, гидромицин или метотрексат, в клетке-хозяине, в которую был введен вектор. Преимущественные выбираемые маркерные гены включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в DHFR-минус клетке-хозяине с отбором/амплификацией метотрексата), ген neo (для отбора G418) и глутамин синтетазу (GS) в GS-негативной клеточной линии (такой, как NS0) для отбора/амплификации. Для экспрессии легкой и/или тяжелой цепей вектор (векторы) экспрессии, кодирующий (кодирующие) тяжелые и/или легкие цепи, вводят в клетку-хозяин при помощи стандартных технологий, например электропорации, осаждения фосфатом кальция, DEAE-декстран трансфекции, трансдукции, инфекции и т.п. Хотя теоретически возможна экспрессия антитела в соответствии с данным изобретением как в прокариотных, так и в эукариотных клетках-хозяевах, предпочтительными являются эукариотные клетки, и наиболее предпочтительными являются клетки-хозяева млекопитающих, т.к. такие клетки, наиболее вероятно, собирают и выделяют надлежащим образом свернутое и иммунологически активное антитело. Преимущественные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантного антитела в соответствии с данным изобретением включают клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO)(включая клетки DHFR-CHO, описанные Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980,используемые с селективным DHFR маркером, например, как описано у Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982, миеломными клетками NS0, клетками COS и клетками SP2/0. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для того, чтобы способствовать экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно секреции антитела в культуральной среде, где выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из клеток-хозяев и/или культуральной среды при помощи стандартных методов очистки. Клетки-хозяева также могут быть использованы для продуцирования частей или фрагментов интактных антител, например, Fab фрагментов молекул scFv с применением традиционных технологий. Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что вариации вышеуказанной методики не выходят за объем данного изобретения. Например, может быть желательной трансфекция клетки-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела в соответствии с данным изобретением. Также для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих легкую или тяжелую цепь,или обе цепи, которые не являются необходимыми для связывания миостатина, могут также быть ис- 16015903 пользованы рекомбинантные ДНК технологии. Молекулы, которые экспрессируются такими усеченными молекулами ДНК, также включены в антитела в соответствии с данным изобретением. В преимущественной системе рекомбинантной экспрессии антитела в соответствии с данным изобретением, вектор рекомбинантной экспрессии, кодирующий как легкую цепь антитела, так и тяжелую цепь антитела, введен в клетки DHFR-CHO путем, например, трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В векторе рекомбинантной экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функционально связан с регуляторными элементами энхансера/промотора (например, полученными изSV40, CMV, аденовируса и т.п., таких как регуляторный элемент CMV энхансера/AdMLP промотора или регуляторный элемент SV40 энхансера/AdMLP промотора) для запуска высоких уровней генной транскрипции. Вектор рекомбинантной экспрессии также содержит ген DHFR, обеспечивающий отбор клетокCHO, которые были трансфицированы с вектором с использованием метотрексатного отбора/амплификации. Отобранные трансформатные клетки-хозяева культивируют для того, чтобы обеспечить экспрессию легкой и тяжелой цепей антитела, и интактное антитело выделяют из культуральной среды. Для получения вектора рекомбинантной экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и восстановления антитела из культуральной среды используют стандартные методы молекулярной биологии. Антитела или их антигенсвязывающие части в соответствии с данным изобретением могут быть экспрессированы у животного (например, мыши), которое является трансгенным для человеческих генов иммуноглобулина (см., например, Taylor, et al., NucleicAcids Res. 20:6287-95, 1992). После экспрессии интактные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи, или иные формы иммуноглобулина в соответствии с данным изобретением могут быть очищены согласно стандартным методикам, известным в данной области, включая осаждение сульфатом аммония, ионообменную колоночную хроматографию, аффинную колоночную хроматографию, колоночную хроматографию с обращенной фазой, колоночную хроматографию гидрофобного взаимодействия, гель-электрофорез и т.п. По существу чистые иммуноглобулины, имеющие по меньшей мере приблизительно 90, 92, 94 или 96% гомогенность, являются предпочтительными, и 98-99% или большая гомогенность является наиболее предпочтительной для фармацевтических целей. После очистки, частичной или до желаемой степени гомогенности, пептиды могут быть затем использованы в терапевтических либо профилактических целях, как описано в данном описании. Химерное антитело Как используется в данном описании, термин "химерное антитело" включает моновалентные, двухвалентные или поливалентные иммуноглобулины. Моновалентное химерное антитело представляет собой димер, образованный химерной тяжелой цепью, связанной посредством дисульфидных мостиков с химерной легкой цепью. Двухвалентное химерное антитело представляет собой тетрамер, образованный двумя димерами легкая цепь-тяжелая цепь, связанными посредством по меньшей мере одного дисульфидного мостика. Химерная тяжелая цепь антитела содержит антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепи нечеловеческого антитела, специфического для миостатина, который функционально связан по меньшей мере с частью человеческой или, по существу, человеческой (или видов, которые отличаются от тех, из которых была получена антигенсвязывающая область) константной областью тяжелой цепи, такой как CH1 или CH2, или предпочтительно с константной областью полноразмерной тяжелой цепи. Химерная легкая цепь антитела для применения на людях содержит антигенсвязывающую область, полученную из полностью или, по существу, легкой цепи нечеловеческого антитела, специфического для миостатина, функционально связанного по меньшей мере с частью человеческой или, по существу, человеческой (или видов, которые отличаются от тех, из которых была получена антигенсвязывающая область) константной областью легкой цепи (CL) или предпочтительно с константной областью полноразмерной легкой цепи. Антитела, фрагменты или производные, содержащие химерные тяжелые цепи и химерные легкие цепи с одинаковой или различной специфичностью связывания вариабельной области,могут также быть получены путем соответствующего связывания отдельных полипептидных цепей, в соответствии со стадиями известного способа. Для данного подхода носители, которые экспрессируют химерные тяжелые цепи, культивируют отдельно из носителей, которые экспрессируют химерные легкие цепи, и иммуноглобулиновые цепи восстанавливают отдельно, и затем связывают. Альтернативно, носители могут быть культивированы совместно, и цепи могут быть связаны самопроизвольно в культуральной среде с последующим восстановлением собранного иммуноглобулина или фрагмента. Способы получения химерных антител известны в данной области (см., например, патенты США 6284471; 5807715; 4816567 и 4816397). Гуманизированные антитела Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением, предназначенное для использования в терапевтических целях, будет иметь последовательность каркасной и константной области (до такой степени, до которой она соответствует антителу), полученную от млекопитающего, в котором оно будет использовано как терапевтическое антитело, таким образом, чтобы снизить вероятность того, что млекопитающее сможет запретить иммунный ответ на лечебное антитело. Гуманизированные антитела- 17015903 представляют особый интерес, поскольку их считают ценными для применения в терапевтических целях и избежания отклика у человека на антимышиное антитело, который часто наблюдается для антител грызунов. Дополнительно в гуманизированных антителах часть эффектора является человеческой, таким образом, он может лучше взаимодействовать с остальными частями иммунной системы человека (например, разрушать клетки-мишени более эффективно при помощи комплементзависимой цитотоксичности или антителозависимой клеточной цитотоксичности). Также введенные путем инъекции гуманизированные антитела могут иметь период полужизни больший, чем у человеческих антител, которые встречаются в природе, например, мышиные антитела, таким образом, давая возможность более частого введения меньших доз. Термин "гуманизированное антитело", как используется в данном описании, относится к антителу, которое содержит части антител различного происхождения, где по меньшей мере одна часть имеет человеческое происхождение. Например, гуманизированное антитело может содержать части, полученные из антитела нечеловеческого происхождения с необходимой специфичностью, такого как мышиное антитело, из антитела человеческого происхождения, соединенных вместе химически при помощи традиционных методик (например, синтетических) или полученных как смежные полипептиды с использованием методов генной инженерии. Предпочтительно "гуманизированное антитело" имеет CDR, которые происходят из нечеловеческого антитела (предпочтительно, мышиного моноклонального антитела), в то время как каркасная и константная область, в той степени, в которой они присутствуют (или их значительная или существенная часть, т.е. по меньшей мере приблизительно 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%), кодированы информацией последовательности нуклеиновой кислоты, которая встречается в области иммуноглобулина человеческой зародышевой линии (см., например, the International ImMunoGeneTics Database) или в рекомбинированных или мутированных их формах, вне зависимости от того, были ли продуцированы указанные антитела в человеческой клетке. CDR гуманизированного антитела могут быть оптимизированы из CDR негуманизированного антитела, из которого они получены, для получения желаемых свойств, например специфичности, аффинности и емкости. Оптимизированные CDR могут содержать аминокислотные замещения, добавления и/или делеции, по сравнению с родительскими CDR. Например, аминокислотные положения CDR, которые подчеркнуты и выделены жирным шрифтом на фиг. 6 и 7, представляют собой положения, которые были оптимизированы из родительских CDR, как показано на фиг. 5. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител включают интактное антитело, по существу интактное антитело, часть антитела, содержащую антигенсвязывающий сайт, или часть антитела, содержащую Fab фрагмент, Fab' фрагмент, F(ab')2 или одноцепочечный Fv фрагмент. Гуманизированные антитела предпочтительно содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентом антителе, ни в импортированном CDR, ни в каркасных последовательностях. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по меньшей мере, по существу,все из одного и, конкретно, из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все аминокислоты в CDR областях соответствуют аминокислотам нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все аминокислоты в FR областях являются аминокислотами консенсусной цепи человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), конкретно, человеческого иммуноглобулина. [Jones et al., Nature, 321:522525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).] Гуманизированные антитела могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro с использованием способов, известных в данной области (либо при использовании животного, трансгенного для человеческих Ig последовательностей, соматического мутагенеза in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности каркасной области HCVR и LCVR участков гуманизированных рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, будучи полученными из последовательностей, которые относятся к последовательностям HCVR и LCVR человеческих зародышевых линий, не могут существовать в природе в наборе антител человеческих зародышевых линий in vivo. Описано, что такие аминокислотные последовательности каркасных областей HCVR и LCVR гуманизированных рекомбинантных антител являются по меньшей мере на 90, 92, 94, 95, 96, 98% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичными последовательностям человеческих зародышевых линий. Предпочтительно такие каркасные остатки родительского антитела (например, мышиного антитела или, как правило, антитела, из которого получено гуманизированное антитело), которое поддерживает или влияет на структуру сайта связывания, будут оставлены. Такие остатки могут быть идентифицированы, например, при помощи рентгеновской кристаллографии родительского антитела или Fab фрагмента,таким образом, идентифицируя трехмерную структуру антигенсвязывающего сайта. Гуманизированное антитело в соответствии с данным изобретением может содержать или быть получено из каркаса легкой цепи человеческой зародышевой линии. В конкретных вариантах осуществления последовательность легкой цепи человеческой зародышевой линии выбирают из человеческих VK последовательностей, включая, но не ограничиваясь приведенным, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19,A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20,- 18015903L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4 и O8. В конкретных вариантах осуществления такой каркас легкой цепи человеческой зародышевой линии выбирают из V1-11, V1-13,V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14,V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 иV5-6. См. PCT WO 2005/005604, где приведено описание различных последовательностей зародышевых линий. В других вариантах осуществления гуманизированное антитело в соответствии с данным изобретением может содержать или быть получено из каркаса тяжелой цепи человеческой зародышевой линии. В конкретных вариантах осуществления данный каркас тяжелой цепи человеческой зародышевой линии выбирают из VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5,VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38,VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28,VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 и VH7-81. См. PCT WO 2005/005604,где приведено описание различных последовательностей зародышевых линий. В конкретных вариантах осуществления вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи содержит каркасную область или по меньшей мере часть каркасной области (например, содержащую 2 или 3 субобласти, такие как FR2 и FR3). В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 являются полностью человеческими. В других вариантах осуществления по меньшей мере FRH1, FRH2, FRH3 или FRH4 являются полностью человеческими. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 являются последовательностями зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии) или содержат человеческие консенсусные последовательности для конкретного каркаса. В других вариантах осуществления по меньшей мере FRH1, FRH2, FRH3 или FRH4 является последовательностью зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии) или содержит человеческие консенсусные последовательности для конкретного каркаса. В преимущественных вариантах осуществления каркасная область является человечески каркасной областью. Обычно гуманизированные антитела могут быть продуцированы путем получения нуклеиновокислотных последовательностей, кодирующих HCVR и LCVR антитела, например мышиного антитела или антитела, полученного путем гибридомы, которая связывает эпитоп миостатина в соответствии с данным изобретением, идентифицируя CDR в указанных HCVR и LCVR (нечеловеческих), и имплантируя такие CDR-кодирующие нуклеиново-кислотные последовательности в выбранные человеческие нуклеиново-кислотные последовательности, кодирующие каркас. Необязательно, CDR области могут быть оптимизированы путем рандомизированного мутагенеза или мутагенеза в конкретных положениях, для замещения одной или более аминокислот в CDR другой аминокислотой до имплантирования CDR области в каркасную область. Альтернативно, CDR область может быть оптимизирована после инсерции в человеческую каркасную область с использованием способов, известных специалисту в данной области. Предпочтительно человеческие каркасные аминокислотные последовательности выбирают таким образом, чтобы полученное в результате антитело, вероятно, было подходящим для введения людям in vivo. Это можно определить, например, основываясь на предыдущем использовании антител, которые содержат такую человеческую каркасную последовательность. Предпочтительно человеческая каркасная последовательность сама по себе не будет, по существу, иммуногенной. Альтернативно, аминокислотные последовательности каркасов антитела, предназначенного для гуманизации, могут быть сравнимы с последовательностями известных человеческих каркасных последовательностей, предназначенных для CDR-имплантирования и отобранных на основании содержащихся в них последовательностей, в значительной степени подобных последовательностям родительского антитела, например, мышиного антитела, которое связывает миостатин. Были выделены многочисленные человеческие каркасные последовательности, и о последовательностях которых сообщалось в данной области. Это повышает вероятность того, что полученное в результате CDR-имплантированное гуманизированное антитело, содержащее CDR родительского (например, мышиного) или оптимизированныеCDR родительского антитела, имплантированного в отобранные человеческие каркасы (и, возможно также, человеческую константную область) в существенной степени сохранят антигенсвязывающую структуру и, таким образом, сохранят аффинность связывания родительского антитела. Для сохранения значительной степени антигенсвязывающей аффинности отобранные человеческие каркасные области будут предпочтительно такими, которые, как ожидается, будут подходить для введения in vivo, т.е. неиммуногенными. В любом из способов получают ДНК последовательности, кодирующие HCVR и LCVR области предпочтительного мышиного антимиостатинового антитела. Способы клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулины, хорошо известны в данной области. Такие способы могут, например, включать амплификацию иммуноглобулинкодирующих последовательностей,предназначенных для клонирования с использованием соответствующих праймеров путем полимеразной цепной реакции (ПЦР). О праймерах, подходящих для амплификации нуклеиново-кислотных последовательностей иммуноглобулина, в особенности последовательностей мышиных HCVR и LCVR, сообща- 19015903 лось в литературе. После того как такие последовательности, кодирующие иммуноглобулин, клонируют,они будут секвенированы способами, известными в данной области. После имплантирования CDR-кодирующих последовательностей в отобранные человеческие каркасные кодирующие последовательности, полученные ДНК последовательности, кодирующие "гуманизированные" вариабельные тяжелые и вариабельные легкие последовательности, затем экспрессируются с получением гуманизированного Fv или гуманизированного антитела, которое связывает миостатин. Гуманизированные HCVR и LCVR могут экспрессироваться как часть целой молекулы антимиостатинового антитела, т.е. как химерный белок с человеческими последовательностями константного домена, чьи кодирующие ДНК последовательности были получены из коммерчески доступной библиотеки или были получены с использованием, например, одного из описанных выше способов получения ДНК последовательностей или способов, известных в данной области. Однако HCVR и LCVR последовательности могут также экспрессироваться при отсутствии константных последовательностей для получения гуманизированного антимиостатинового Fv. Тем не менее, слияние человеческих константных последовательностей в вариабельной области является потенциально желательным, т.к. получаемое в результате гуманизированное антимиостатиновое антитело может обладать функциями человеческого эффектора. Способы синтеза ДНК, кодирующей белок известной последовательности, хорошо известны в данной области. С использованием таких способов, синтезируют ДНК последовательности, кодирующие гуманизированные HCVR и LCVR последовательности субъекта (с константными областями и без них),и затем экспрессируют в векторную систему, подходящую для экспрессии рекомбинантных антител. Это может быть проведено в любой векторной системе, что обеспечивает гуманизированные HCVR и LCVR последовательности для субъекта, предназначенные для экспрессии в качестве химерного белка в человеческих константных доменных последовательностях и для ассоциации с получением функциональных(связывающих антиген) антител или фрагментов антител. Человеческие последовательности константного домена хорошо известны в данной области, и о них сообщалось в литературе. Преимущественные человеческие константные последовательности легкой цепи включают каппа и лямбда константные последовательности легкой цепи. Преимущественные человеческие константные последовательности тяжелой цепи включают человеческий IgG1, человеческийIgG2, человеческий IgG3, человеческий IgG4 и их мутированные версии, что обеспечивает измененную функцию эффектора, например, увеличенный период полужизни in vivo, уменьшенное связывание рецептора Fc, измененный профиль диамидирования и т.п. Если таковые имеются, человеческие каркасные области предпочтительно получены из вариабельной области человеческого антитела, имеющего последовательность, подобную последовательности аналогичной или эквивалентной области донора антигенсвязывающего рецептора (т.е. родительского антитела). Другие источники каркасных областей частей человеческого происхождения гуманизированного антитела включают человеческие вариабельные консенсусные последовательности (см., например, Kettleborough, C. A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al., WO 94/04679. Например, последовательность антитела либо вариабельной области, которую используют для получения нечеловеческой части, может быть сравнима с человеческими последовательностями, как описано у Rabat et al. Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). В особенно преимущественном варианте осуществления каркасные области цепи гуманизированного антитела получены из человеческого вариабельной области, имеющего по меньшей мере приблизительно 60% общей идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70% общей идентичности последовательности и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85% общей идентичности последовательности с вариабельным участком донора, не являющегося человеком. Человеческая часть может быть также получена из человеческого антитела, имеющего по меньшей мере приблизительно 65% идентичности последовательности, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70% идентичности последовательности с конкретной частью (например, FR), которую используют, по сравнению с эквивалентной частью (например, FR) донора, не являющегося человеком. Ссылками, в которых приведены способы, которые могут быть использованы при гуманизации мышиного антитела, являются, например, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991; патент США 5693761; патент США 4816397; патент США 5225539; компьютерные программы ABMOD и ENCAD, как описано у Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595-620, 1983; гуманизация может быть в значительной степени проведена в соответствии со способом, описанным Winter и соавторами [Jones et al., Nature,321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988)]. Человеческие антитела В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены человеческие антитела. Последние могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.,222:581 (1991). Известны также способы Cole et al. и Boerner et al. получения человеческих моноклональных антител. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) и Boerneret al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Аналогично, человеческие антитела могут быть проведены путем введения локусов человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например мыши, в которых эндогенные иммуноглобулиновые гены были частично или полностью инактивированы. После иммунизации, например, антигеном, содержащим иммуногенный эпитоп в соответствии с данным изобретением,получают полный набор продуцентов человеческого антитела, который близко совпадает с тем, который во всех отношениях наблюдается у людей, включая набор и расположение генов, и набор антител. Данный подход описан, например, в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5589369; 5591669; 5625126; 5633425; 5661016, и в следующих научных публикациях: Marks et al., BioTechnology 10:779-783,1992; Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., NatureRev. Immunol. 13:65-93 (1995) и Jobkobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993. Гены человеческого иммуноглобулина, введенные в мышь, создают, таким образом, трансгенных мышей, способных реагировать на антигены, антитела которых имеют человеческие последовательности,и которые также описаны у Bruggemann et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989). Известны несколько стратегий для создания млекопитающих, продуцирующих человеческие антитела. В частности, существует "минилокусный" подход, в котором экзогенный Ig локус имитирован посредством включения частей (отдельных генов) из Ig локуса (см., например, патенты США 5545807, 5545806,5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650 и 5814318, 5612205, 5721367, 5789215), YAC введения больших и, по существу, зародышевых фрагментов Ig локусов [См. Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)], и введения целых или, по существу, целых локусов посредством использования микроклеточного слияния (см. Европейскую патентную заявкуEP 0843961 A1). Для получения антимиостатинового антитела в соответствии с данным изобретением может быть использована любая трансгенная мышь, способная реагировать на иммунизацию антителами, имеющими человеческие последовательности, с использованием способов, доступных специалисту в данной области, например, когда такую мышь иммунизируют полипептидом, содержащим иммуногенный эпитоп в соответствии с данным изобретением. Применение Антитела настоящего изобретения являются полезными для применения в терапевтических, профилактических и исследовательских целях, как описано в данном описании. Антитело в соответствии с данным изобретением может быть использовано для диагностики расстройства или заболевания, связанных с экспрессией человеческого миостатина. Аналогично, антитело в соответствии с данным изобретением может быть использовано в анализе для контроля уровней миостатина у субъекта, который получает лечение состояния, связанного с миостатином. Исследовательское применение включает способы, в которых используют антитело в соответствии с данным изобретением и метку для детекции миостатина в пробе, например, в жидкости человеческого организма или в клетке или в клеточном экстракте. Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть использованы с модификацией или без, и помечены путем ковалентного или нековалентного присоединения группы, которую можно детектировать. Группой, которую можно детектировать, может быть любая группа, способная продуцировать, прямо или косвенно, детектируемый сигнал. Например, детектируемой группой может быть радиоизотоп, такой как, например, 3H, 14C, 32P, 35S или 125I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или пероксидаза хрена. Может быть использован любой способ, известный в данной области для отдельного коньюгирования антитела к группе, которая может быть детектирована, включая способы, описанные у Hunter, et al., Nature 144:945, 1962; David, et al., Biochemistry 13:1014, 1974; Pain, etal., J. Immunol. Meth. 40:219, 1981; и Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30:407, 1982. Ряд традиционных протоколов для измерения миостатина, включая, например, ELISA, RIA и FACS,известны в данной области и обеспечивают основание для диагностики измененных или анормальных уровней экспрессии миостатина. Нормальные или стандартные значения экспрессии устанавливают при помощи любой методики, известной в данной области, например путем комбинирования пробы, содержащей полипептид миостатина, например, с антителами в условиях, подходящих для образования комплекса антиген:антитело. Антитело прямо или косвенно метят веществом, которое можно детектировать,для того, чтобы способствовать детекции связанного или несвязанного антитела. Подходящие вещества,которые могут быть детектированы, включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих простетических комплексов групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин,флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол; и примеры радиоактивных веществ включают 125I, 131I, 35S или 3H. (См., например, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press,Inc. (1987. Количество стандартных образованных комплексов подсчитывают различными способами,- 21015903 такими как, например, фотометрические способы. Количества полипептида миостатина, который экспрессируется в пробах, затем сравнивают со стандартными значениями. Для удобства антитело в соответствии с данным изобретением может быть обеспечено в наборе,упакованной комбинации реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями по выполнению диагностического анализа. Если антитело помечено ферментом, то набор будет включать субстраты и кофакторы, необходимые для фермента (например, субстратный прекурсор, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут быть включены другие вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизисный буфер) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут быть изменены в широком диапазоне для обеспечения концентраций в растворе реагентов, которые, по существу, оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реагенты могут быть обеспечены как сухие порошки, обычно лиофилизированные,включая эксципиенты, которые при растворении обеспечивают раствор реагентов, имеющий соответствующую концентрацию. Терапевтическое применение антител Миостатин играет роль в развитии мышц и ряде связанных с этим расстройств или заболеваний. У взрослых мРНК миостатина главным образом детектируется в скелетных мышцах, хотя более низкие концентрации также находят в адипозных тканях и сердечных тканях (Sharma, M., et al, J. Cell Physiol. 180:1, 1999). Мыши, нокаутированные по миостатину, имели в два-три раза большую мышечную массу,чем их однопометные особи дикого типа. Увеличенная мышечная масса является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон (McPherron, A., et al. Nature 387:83-90, 1997 и Zhu, X. et al., FEBS Letters 474:71). Кроме того, мыши, нокаутированные по миостатину, набирают меньше жира, чем особи дикого типа, но в остальном выглядят нормальными и здоровыми. Также было недавно показано, что миостатин является важным регулятором адипогенеза (Rebbapragada, A., et al., Mol. and Cell. Bio. 23:7230-7242,2003). Кроме того, недавно исследовали структуру и содержимое костей мышей, имеющих дефицит миостатина (Hamrick M.W., et al., J. Orthopaedic Research 21:1025, 2003; Hamrick, M.W., et al., Calcif Tissue Int 71:63, 2002. Поэтому фармацевтическая композиция, содержащая антимиостатиновое антитело в соответствии с данным изобретением, может быть использована для повышения мышечной массы, повышения плотности костей, уменьшения мышечного истощения или может быть полезна для лечения или профилактики состояний, где наличие миостатина вызывает или вносит вклад в нежелательные патологические эффекты, или где уменьшение уровней миостатина имеет терапевтическую пользу у млекопитающих, предпочтительно у людей, включая, но не ограничиваясь приведенным, мышечное истощение, мышечное поражение, хирургию, восстановление пораженных мышц, хрупкости, саркопении, связанной с возрастом,атрофию от бездействия, остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, ожирение, подавление накопления жира в организме, ожирение, мышечную дистрофию любого типа, миопатию критического состояния, алкогольную миопатию, кахексию (например, связанную с раком или индуцированную ВИЧ,или возникшую в результате хронического обструктивного заболевания легких, хронического заболевания легких, восстановления после сепсиса, почечной недостаточности, печеночной недостаточности,сердечной недостаточности или сердечного заболевания), метаболический синдром, послеожоговое мышечное истощение и диабет второго типа. Атрофия от бездействия может быть вызвана множеством причин или эпизодов, включая любое расстройство или заболевание, или состояние, которые приводят к пролонгированной неподвижности или бездействию, или постельный режим, включая, но, не ограничиваясь приведенным, трансплантацию цельных органов, замену суставов, инсульт, повреждения спинного мозга, восстановление после тяжелых ожогов, стационарный хронический гемодиализ, восстановление после сепсиса и воздействие невесомости. Поскольку миостатин имеет высококонсервативную последовательность и функцию во всех видах, то антитела в соответствии с данным изобретением для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей или профилактики состояний у млекопитающих, не являющихся человеком, или птиц [например, домашних животных (например, собак и кошек), животных для занятий спортом (например, лошадей), животных-источников пищи (например, коров, свиней и овец), птиц (например, кур, индюков, остальную пернатую дичь или домашнюю птицу)], где наличие миостатина приводит или вносит вклад в патологические эффекты, или где снижение уровней миостатина имеет терапевтическую пользу. Применение антимиостатинового моноклонального антитела в соответствии с данным изобретением для лечения или профилактики по меньшей мере одного из вышеуказанных расстройств, в которых активность миостатина является вредной, или которые могут быть улучшены путем снижения уровней биоактивного миостатина, описано в данном описании. Дополнительно описано применение антимиостатинового моноклонального антитела в соответствии с данным изобретением для использования в изготовлении лекарственного средства для лечения по меньшей мере одного из вышеуказанных расстройств. Как используется в данном описании, термин "лечение" и т.п., относится к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в терминах полной или частичной профилактики заболевания или их симптомов, и/или может быть профилакти- 22015903 ческим в терминах частичного или полного лечения заболевания, и/или неблагоприятных эффектов, которые относятся к заболеванию. "Лечение", как используется в данном описании, включает введение соединения в соответствии с данным изобретением для лечения или состояния у млекопитающих, особенно у людей, включая:(a) профилактику заболевания у субъекта, который может быть расположен к заболеванию, но у него оно еще не было продиагностировано;(c) облегчения болезни, т.е. вызова регрессии заболевания или расстройства, или симптомов, облегчающих заболевание или его осложнения. Режимы дозировок могут быть установлены таким образом,чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (например, терапевтический или профилактический ответ). Например, может быть введен один болюс, могут быть введены несколько разделенных доз в течение времени, или доза может быть пропорционально снижена или повышена, в соответствии с терапевтической ситуацией. Фармацевтическая композиция Антитело в соответствии с данным изобретением может быть включено в фармацевтическую композицию, пригодную для введения субъекту. Соединения в соответствии с данным изобретением могут быть введены отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентами, в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному режиму введения, и фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или эксципиенты, такие как агенты дисперсии, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, агенты солюбилизации, изотонические агенты, стабилизаторы и т.п. использованы должным образом. Указанные композиции разработаны в соответствии с традиционными методами, приведенными, например, в Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19thEdition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, где предоставлен набор способов получения композиций, как правило, известных специалистам. Фармацевтическая композиция, содержащая антимиостатиновое моноклональное антитело в соответствии с данным изобретением, может быть введена субъекту, имеющему риск развития или имеющему патологии, как описано в данном описании, с использованием стандартных методов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев. Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением предпочтительно является"терапевтически эффективным количеством" или "профилактически эффективным количеством" антитела в соответствии с данным изобретением. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периода времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраста, пола и массы субъекта, и способности антитела или части антитела вызывать желаемую реакцию субъекта. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезный эффект антитела преобладает над токсическим или вредным эффектом. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени,необходимых для достижения желательного профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу используют для субъектов до или на ранней стадии заболевания, то профилактически эффективное количество может быть меньшим, чем терапевтически эффективное количество. Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой по меньшей мере минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза, активного агента, необходимая для обеспечения терапевтической пользы субъекту. С другой стороны, терапевтически эффективное количество антитела в соответствии с данным изобретением представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно у людей, увеличивает мышечную массу, повышает плотность костной массы или лечит состояния, где наличие миостатина приводит к или делает вклад в нежелательный патологический эффект или снижение уровней миостатина, что приводит к полезному терапевтическому эффекту у млекопитающих, предпочтительно у людей, включая, но не ограничиваясь приведенным, мышечное истощение, мышечное поражение, хирургию хрупкости, саркопению, связанную с возрастом,атрофию от бездействия, остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, ожирение, подавление накопления жира в организме, ожирение, мышечную дистрофию любого типа, миопатию критического состояния, алкогольную миопатию, кахексию (например, связанную с раком или индуцированную ВИЧ,или возникшую в результате хронического обструктивного заболевания легких, хронического заболевания легких, восстановления после сепсиса, почечной недостаточности, печеночной недостаточности,сердечной недостаточности или сердечного заболевания), метаболический синдром, послеожоговое мышечное истощение и диабет второго типа. Атрофия от бездействия может быть вызвана множеством причин или эпизодов, включая любое расстройство или заболевание, или состояние, которые приводят к пролонгированной неподвижности или бездействию, или постельный режим, включая, но не ограничиваясь приведенным, трансплантацию цельных органов, замену суставов, инсульт, повреждения спинного- 23015903 мозга, восстановление после тяжелых ожогов, стационарный хронический гемодиализ, восстановление после сепсиса и воздействие невесомости. Путь введения антитела в соответствии с данным изобретением может быть пероральным, парентеральным, путем ингаляции или местным. Предпочтительно, антитела в соответствии с данным изобретением могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Термин парентеральный, как используется в данном описании, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Преимущественным является введение путем внутривенной или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие основы для таких инъекций непосредственно известны в данной области. Фармацевтическая композиция, как правило, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в контейнере, который обеспечивается, включая, например, герметично закрытый флакон или шприц. Поэтому фармацевтические композиции могут быть стерильно отфильтрованными после получения состава, либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Конкретная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем в 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу (например, 1-100 мг/мл или более) концентрации антител. Доза может варьироваться в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого из объектов зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраста, конкретного соединения, предназначенного для введения, возраста, времени и пути введения, общего состояния здоровья и других лекарственных средств, которые вводят одновременно. Конкретная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001-1000 мкг; однако возможны дозы, находящиеся ниже или выше проиллюстрированного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Режим дозировок ежедневного парентерального введения может составлять приблизительно от 0,1 до приблизительно 100 мкг/кг от общей массы тела, предпочтительно приблизительно от 0,3 до приблизительно 10 мг/кг и более предпочтительно приблизительно от 1 до 1 мг/кг, даже более предпочтительно приблизительно от 0,5 до 10 мкг/кг массы тела в день. Прогресс можно контролировать путем периодического оценивания. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до достижения желаемого подавления симптомов болезни. Однако полезными могут быть остальные режимы дозировок, которые не исключены из данного изобретения. Желаемая дозировка может быть введена путем одноболюсного введения, множественных болюсных введений или путем непрерывного инфузионного введения антитела, в зависимости от образца фармакокинетического распада, которого хочет достигнуть практикующий специалист. Такие предположительные количества антитела в значительной степени зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима является получаемый результат. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, которое лечат,конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место введения антитела, конкретный вид антитела, способы введения, режим введения и остальные факторы, известные практикующим специалистам-медикам. Терапевтические агенты в соответствии с данным изобретением могут быть заморожены либо лиофилизированы и восстановлены непосредственно перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизирование и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антитела. Дозировки могут быть установлены для компенсации. Обычно преимущественными являются значения pH от 6 до 8. Готовые изделия В другом варианте осуществления в соответствии с данным изобретением обеспечивается готовое изделие, содержащее материалы, полезные для лечения или профилактики расстройств или состояний,описанных выше. Готовое изделие содержит контейнер и метку. Подходящие контейнеры включают,например, флаконы, пузырьки, шприцы и аналитические пробирки. Контейнеры могут быть сделаны из ряда материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию в соответствии с данным изобретением, которая является эффективной для профилактики или лечения расстройства или состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом для внутривенного раствора или пузырьком, имеющим пробку, проницаемую для гиподермальной иглы для инъекций). Активный агент в композиции является антимиостатиновым антителом в соответствии с данным изобретением. Метка на контейнере или присоединенная к нему указывает, что композицию применяют для лечения выбранного заболевания. Готовое изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом раствор, раствор Рингера и раствор декстрана. Он может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы,шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению. Следующие примеры приведены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения области данного изобретения.A. Планшеты, покрытые миостатином и GDF-11. Мышиные/человеческие химерные антимиостатиновые Fab в соответствии с данным изобретением анализировали при помощи анализа ELISA, в котором измеряли связывание Fab и зрелого миостатина(димерной формы), покрытой при различных концентрациях в 96-луночном планшете. Также анализировали связывание Fab с GDF-11. Каждую лунку обоих 96-луночных планшетов покрывали 50 мкл рекомбинантного человеческого миостатина (RD системы, не содержащие носитель, сначала ресуспендированные в 4 мМ HCl, и затем покрытые при 1 мкг/мл в карбонатном буфере, pH 9,6) или 50 мкл, рекомбинантный человеческий GDF11 (Peprotech, Inc., Cat. 120-11, свободный от носителя, сначала ресуспендированный в 4 мМ HCl, и затем покрытый при 1 мкг/мл в карбонатном буфере, pH 9,6). Планшеты инкубировали при 4C в течение ночи. Лунки подвергали аспирации и дважды промывали PBST (забуференный фосфатом раствор+0,1%Tween-20). Планшеты блокировали 200 мкл блокирующего буфера на лунку (1% бычий сывороточный альбумин в PBST в течение 1 ч).Fab из периплазматических экстрактов для анализа разводили в PBST методом серийных разведений. Пятьдесят микролитров каждого раствора Fab добавляли к линиям планшетов, покрытых GDF-8 иGDF-11. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки затем трижды промывали PBST. Вторичное антитело, конъюгированное щелочной фосфатазой, (50 мкл козьего антимышиного каппа AP (Southern Biotech), разбавленного 1:1000 в PBST) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывали PBST. Пятьдесят микролитров хромогенного субстрата(AMP/PMP) добавляли в каждую лунку и давали развиваться при комнатной температуре. Поглощение лунок измеряли при оптической плотности 560 нм. Для каждого Fab получали кривую титрования и отмечали относительную оптическую плотность в средней точке репортерной Fab кривой. Полученные данные демонстрируют, что все проанализированные Fab связывают связанный с планшетом человеческий зрелый миостатин, с перекрестной реактивностью по отношению к GDF11.B. Fab захватный ELISA. 96-Луночный планшет покрывали 50 мкл козьего античеловеческого каппа антитела при 2 мкг на мл карбонатного буфера. Планшеты инкубировали при 4C в течение ночи. Лунки подвергали аспирации и дважды промывали PBST (забуференный фосфатом раствор+0,1% Tween-20). Планшеты блокировали 200 мкл блокирующего буфера на лунку (1% бычий сывороточный альбумин+PBST в течение 1 ч).Fab из периплазматических экстрактов для анализа захватывали в колонки на планшетах в течение 2 ч при 37C, разводили в PBST методом серийных разведений. После 3-кратного промывания PBST, 50 мкл двукратных серийных разведений биотилинированного миостатина (от 100 нМ до 780 пМ) добавляли в каждую колонку захваченного Fab и инкубировали в течение 1 ч при 37C. Затем планшет промывали PBST и инкубировали PBST при 37C в течение 1-3 ч. Нейтравидин, конъюгированный со щелочной фосфатазой (Pierce, разбавленный 1:1000 в PBST) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре. Затем промывали лунки 3 раза PBST. 50 мкл хромогенного субстрата (АМР/РМР) добавляли в каждую лунку и давали развиваться при комнатной температуре. Поглощение лунок считывали при оптической плотности 560 нм. Регистрировали относительную оптическую плотность по сравнению с максимальной оптической плотностью репортерного Fab. Все Fab, проанализированные в соответствии с данным изобретением, связывают растворимый человеческий зрелый миостатин. Пример 2. Анализ нейтрализации миостатина Эктодермальные эксплантаты удаляли на 8-9 стадиях бластулы эмбрионов Xenopus при помощи стандартных методик и культивировали в 0,5MBS (1X MBS: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl2, 1 мМ MgSO4, 5 мМ HEPES, 2,5 мМ NaHCO3, 1:1000 мас.% гентамицина, 0,1% альбумина бычьей сыворотки) с добавлением фактора роста (GDF8 или GDF11) плюс или указанного в течение 18 ч при 18C, за это время контрольные эмбрионы достигли ранней нейрулы стадии (стадия 15-16). Эксплантаты фотографировали и длину каждого эксплантата измеряли с использованием алгоритма визуального анализа, разработанного для подсчета характеристик форм/размера для животных объектов. Эксплантаты не обрабатывали ни фактором роста, ни Fab (контрольными), введенных в шары эпидермиса. Миостатин и GDF-11 стимулируют мезобласты в таких эктодермальных эксплантатах, что приводит к элонгации эксплантатов и формированию гантелеобразных структур. Антитела или Fab, при анализе на нейтрализующую активность, добавляли к культуральной среде, содержащей миостатин для всей длины культурального периода, и оценивали на их способность ингибировать движения элонгации, индуцированные фактором роста. Миостатин добавляли к эксплантатам при 25 нг/мл. Антитела или Fab для анализа добавляли при 20- 25015903 мкг/мл. Fab, генерированный для иррелевантного антигена, использовали в качестве контроля. Коммерчески доступные моноклональные антимышиные GDF8 антитела могут быть проанализированы в качестве контроля, причем данное антитело продуцируются у коз, иммунизированных очищенным мышинымGDF8, и как продемонстрировано производителем, оно нейтрализует элонгацию аномальных полюсовXenopus, вызванную 25 нг/мл мышиного GDF8 при концентрациях приблизительно 10-20 мкг/мл (RDSystems Cat. MAB788). Для обработки изображений использовали ImagePro (v4.5.1.22, от Media Cybernetics). Для автоматизации обработки изображений записывали макрос. Макрос обрабатывал изображение и записывал длину в битах. Могут быть использованы альтернативные способы измерения, известные в данной области. Антитела в соответствии с данным изобретением включены для нейтрализации активности GDF8 в анализе аномальных полюсов. Пример 3. Измерение аффинности Fab Аффинность (KD) и коэффициенты kon и koff антимиостатиновых Fab в соответствии с данным изобретением измеряли с использованием прибора BIAcore 2000, содержащего сенсорный чип CM4.BIAcore использует оптические свойства поверхностного плазмонного резонанса для детекции изменений концентраций белковых молекул, которые взаимодействуют в декстрановой биосенсорной матрице. За исключением случаев, когда указано иное, все реагенты и материалы приобретены у BIAcore AB(Upsala, Sweden). Все измерения проводили при 25C. Пробы, содержащие Fab, растворяли в буфереHBS-EP (150 мМ хлорида натрия, 3 мМ EDTA, 0,05% (мас./об.) поверхностно-активного вещества P-20 и 10 нМ HEPES, pH 7,4). Миостатин или GDF-11 (RD Systems) иммобилизировали в проточных лунках чипа CM4, с использованием химии связывания аминов. Проточные лунки (1-4) активировали 1:1 смесью 0,1 М N-гидроксисукцинимида и 0,1 М 3-(N,N-диметиламино)пропил-N-этилкарбодиимида при скорости потока 20 мкл/мин. Миостатин или GDF-11 (2,5 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, pH 4,5) вручную впрыскивали в отдельные проточные лунки при скорости потока 10 мкл/мин. Плотность поверхности контролировали, пока каждая проточная лунка не достигла плотности поверхности - 150 единиц реакции(RU). Поверхности блокировали 50 мкл инъекцией 1 М этаноламин-HCl, pH 8,5 (10 мкл/мин). Для обеспечения полного удаления любого нековалентно связанного миостатина или GDF-11, дважды впрыскивали 15 мкл 10 мМ глицина, pH 1,5. Для кинетических экспериментов использовали промывные буферы,содержащие 10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,005% P20. Сбор данных о кинетическом связывании проводили при максимальной скорости потока (100 мкл/мин). Каждый аналитический цикл состоял из (i) 250 мкл инъекции Fab (диапазон концентраций составлял 50 нМ-0,4 нМ при двукратных разведениях) во все 4 проточные лунки, с проточной лункой 1 в качестве контроля, (ii) 20-минутной диссоциации (буферным потоком), (iii) регенерации поверхностиGDF-8 или GDF-11 при помощи двух 15 мкл инъекций 10 мМ глицина, pH 1,5, (iv) 15 мкл слепой (контрольной) инъекции промывного буфера, и (v) 2-минутного периода стабилизации перед началом следующего цикла. Мониторинг сигнала проводили в виде: проточная лунка 2 минус проточная лунка 1,проточная лунка 3 минус проточная лунка 1 и проточная лунка 4 минус проточная лунка 1. Пробы и буферную контрольную пробу вводили путем инъекций дважды в произвольном порядке. Данные обрабатывали при помощи программного обеспечения SCRUBBER (Center for Biomolecular Interaction Analysis,Univ. of Utah). Скорости ассоциации и диссоциации для каждого цикла определяли путем подгонки биосенсорных данных с использованием модели простой ассоциации при помощи ClampXP (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. of Utah) для выборки констант скорости kon и koff; константу равновесного связывания Kd рассчитывали с использованием уравнения Kd=koff/ kon Fabs 41-1 и 412-6, при измерении в вышеуказанном анализе, имели значения аффинностей для GDF-8, которые составляли 4,16 нМ (4,1610-9 М) и 0,46 нМ (4, 610-10 М) соответственно, и значения аффинности для GDF-11 составляли 8,96 и 0,81 нМ соответственно; относительная специфичность для обеих Fab была приблизительно в 2 раза выше для GDF-8, чем для GDF-11 (табл. 2). Таблица 2 Пример 4. Измерение аффинности Mab Измерения аффинности связывания для полноразмерного моноклонального антитела в соответствии с данным изобретением проводили при помощи анализа Sapidyne KINEXA. NHS-активированные скоротечные сефарозные подложки (GE Healthcare) предварительно покрывали антителом в соответствии с данным изобретением (50 мкг антимиостатинового антитела на 1 мл подложек) и блокировали 10 мг/мл альбумина бычьей сыворотки в 1 М Tris-HCl, pH 8,0. Затем 2, 4, 40 пМ антитела в соответствии с данным изобретением (например, 3-74/C1E4) инкубировали с различными концентрациями (например,2,4 пМ-10 нМ, серийных разбавлений) миостатина в промывном буфере (PBS, 0,005% (об./об.) Tween-20- 26015903 и 1 мг/мл яичного альбумина) в течение 10 ч при комнатной температуре. Для определения несвязанного антитела, находящегося в равновесном состоянии, каждую пробу пропускали через подложки, покрытые миостатином. Количество антитела, связанного с подложкой, затем количественно определяли пропусканием раствора козьего античеловеческого Fc антитела, меченного флуоресцеином (Cy5) (Jackson Immuno Research), разведенного 1:4000 в промывном буфере, через подложки. Измеренный сигнал флуоресценции пропорционален концентрации несвязанного антитела при равновесии. Каждую концентрацию миостатина измеряли дважды. Равновесную константу диссоциации (KD) получали по методу нелинейной регрессии конкурентных кривых с использованием односайтной гомогенной модели связывания множественной кривой (программное обеспечение KINEXA). Константу скорости ассоциации (kon) для связывания GDF-8 также определяли с использованием анализа Sapidyne KINEXA. Два pM антитела смешивали с 20 пМ GDF-8 с использованием таких же условий, как описано выше. В разное время пробы подвергали зондированию для выявления несвязанного антитела в условиях, описанных выше для равновесного связывания, а затем результирующую временную зависимость подгоняли с использованием программного обеспечения KINEXA для определения константы скорости (kon). Константу скорости диссоциации (koff) рассчитывали с использованием уравнения koff=KDkon. Полноразмерное моноклональное антитело 3-74/C1E4 (функционально связанное с IgG4 Fc областью) измеряли с использованием описанного анализа, полученные результаты приведены ниже в табл. 3. Таблица 3 Пример 5. Анализ миостатин/SBE репортер В данном репортерном анализе плазмида, кодирующая ген репортера, т.е. ген люциферазы, ниже связывающего элемента SMAD ("SBE"), более конкретно, (CAGA)12, экспрессировала белок люциферазы, если такая молекула, как миостатин, GDF-11, или другой член суперсемейства TGF-, связывает свой собственный рецептор, усиливая, таким образом, сигналы SMAD, что приводит к образованию фосфорилированного комплекса SMAD, способного связывать SBE. Ранее сообщалось, что последовательностьCAGA является TGF- реактивной последовательностью в промоторе TGF- индуцированного гена PAI1 (Denner et al., EMBO J., 17:3091-3100, 1998). Количество активного миостатина, подверженного воздействию клеток, прямо пропорционально количеству полученного люциферазного фермента, которое прямо пропорционально количеству полученного и измеряемого света. Наличие ингибитора (например, антитела, которое связывает миостатин) уменьшает количество миостатина, способного активировать SBE,что, в конечном счете, приводит к уменьшению образования света. Данный анализ также описан в Международной публикации номер WO 2004/037861, которая включена в данную заявку. Следует учитывать, что анализ миостатин/SBE репортер не должен быть ограничен точными условиями, описанными в данном описании, могут быть использованы другие виды клеток, например, клетки 293 НЕК (ATCC) или клетки рабзомиосаркомы A204 (см., например, Whittemore, et al. BBRC, 200:965-71,2003); могут быть использованы другие виды репортеров, например, CAT, -gal, GFP, и другие условия выращивания клеток и условия анализа, включая использование различных количеств миостатина в реакции. Специалист в данной области легко сможет определить, находится ли анализ в пределах объема анализа миостатин/SBE репортер, и воспользоваться вектором, содержащим элемент SBE над репортерным геном, введенным в клетку-хозяина, где используемый элемент SBE, ответственный за SMAD, полученный в результате ответа на связывание миостатином рецептора миостатина. R.S. Thies, et al.,Growth Factors, 18:251-259, 2001, описывает аналогичный анализ, в то время как Wittemore, L. et al.,BBRC, 300:965-971, 2003 описывает ответ элемента SBE на SMAD, полученный в результате ответа на связывание миостатином рецептора миостатина. В данном анализе клетки 293 Е (Edge Biosystems) в колбе T-75 выращивали в средах DMEM/F12(1:1) (Gibco 10565-042) и 10% FBS. Клетки трансфицировали смесью 100 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen 11668-019), 5 мл OptiMEM I (Gibco 51985-034) и 30 мкг ДНК SB-люциферазы в течение 4 ч при 37C. Затем трансфекционную смесь удаляли и добавляли полные среды в течение 1 ч при 37C. Клетки затем трипсинизировали и ресуспендировали в полных средах при 2106 клеток/мл и 50 мкл высевали в каждую лунку 96-луночные планшеты Biocoat (BD 35-6461) и инкубировали в течение 1 ч при 37C. После завершения инкубации, среды заменяли 100 мкл каждого Fab для анализа, который серийно разводили 1:2 и предварительно инкубировали в течение 1 ч при 37C с 1:1 раствором 40 нг/мл миостатина(RD Systems 788-G8) или GDF-11 (RD Systems) в полных средах. Планшету выдерживали в течение ночи при 37C, 5% CO2 и на следующий день 100 мкл 1:1 смеси буфера Glo Lysis Buffer и реагента Bright-Glo Luciferase (Promega) добавляли в каждую лунку и смешивали при помощи пипетки. Из полученной смеси 150 мкл переносили в белый 9-луночный планшет и люминесценцию измеряли при помощи люминометра. Затем составляли график люминесценция- 27015903 концентрация Fab, и рассчитывали IC50 для каждого Fab для миостатина и GDF-11. Пример 6. Фармакокинетика. Фармакокинетику (РК) антитела в соответствии с данным изобретением можно оценить на мышахC57B6/SCID при дозе 1 мг/кг после одного внутривенного (IV) или интраперитонеального (IP) введения. Животные, которые получают смесь немеченного и 125I-меченного антитела при дозе, описанной выше, и концентрации сыворотки, определяли на основании 125I радиоактивности в сыворотке и специфической активности введенной дозы. Составляли график: введенная IV или IP концентрация сыворотки антитела от времени. Пример 7. In vivo влияние на мышечную массу и прочность. Для того чтобы определить, блокирует ли антитело в соответствии с данным изобретением активность миостатина in vivo, антитело в соответствии с данным изобретением может быть проанализировано на взрослых мышах SCID. SCID мыши страдали от тяжелого комбинированного иммунодефицита и,поэтому, не давали иммунологической реакции после инъекции антитела в соответствии с данным изобретением. Мышечную массу использовали в качестве индикатора активности миостатина у мышей, которые получали лечение антитела в соответствии с данным изобретением. Самок мышей SCID/CB17 (Taconic Biotechnology) взвешивали и распределяли в группы по десять особей. Антитело в соответствии с данным изобретением (41C1E4) в забуференном фосфатном растворе вводили путем подкожной инъекции мышам в различных дозах (10, 5 и 2 мг/кг) в дни 0 и 7. В контрольной группе, IgG при 10 мг/кг вводили путем инъекции подкожно мышам в дни 0 и 7. На 14 день мышечную массу и прочность передних конечностей измеряли при помощи теста на силу сжатия (например,модель 1027 csx, Columbus Instruments). Животных умерщвляли и мышечную массу оценивали при помощи ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Также измеряли влажную массу икроножных и четырехглавых мышц, а также массу тела. Результаты, значения и стандартные ошибки для различных параметров приведены в табл. 5 ниже. Данные трансформировали при помощи метода трансформации Box Сох для нормализации. Резко выделяющиеся значения для каждого из параметров идентифицировали при помощи статистических значений с использованием программного обеспечения JMP 5.1 (SAS, Inc.) и исключали из набора данных. Статистическую значимость определяли при помощи ANOVA и критерия Стюдента. Значения р меньше 0,05 рассматривали как значимые. Антитело анализировали при 5 мг/кг и 10 мг/кг, что приводило к статистически значимым результатам по сравнению с контрольной IgG группой для всех проанализированных параметров. Антитело анализировали при 2 мг/кг, что приводило к статистически значимым результатам по сравнению с контрольной IgG группой для параметров ЯМР мышц, влажной массы четырехглавых мышц и влажной массы икроножных мышц. Таблица 5