Гуманизированные антитела против il-22ra человека

ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ IL-22RA ЧЕЛОВЕКА Изобретение относится к гуманизированным антителам против человеческого IL-22RA и к их применению в лечении псориаза и других иммунноопосредованных заболеваний, таких как псориатический артрит и атопический дерматит. Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к гуманизированным антителам против IL-22RA человека и к их применению в лечении псориаза и других иммуноопосредованных заболеваний, таких как псориатический артрит и атопический дерматит. Уровень техникиIL-22RA (также известный как IL22R, IL22R1, IL22RA1, CRF2-9 и Zcytor11) относится к семейству цитокиновых рецепторов II типа и является компонентом рецептора IL-20, IL-22 и IL-24. Из-за своего структурного сходства IL-20, IL-22 и IL-24, вместе с IL-19 и IL-26, были объединены с IL-10 в так называемое "семейство IL-10" (Kunz S et al. 2006). IL-10 является основным регулятором иммунного ответа,который опосредует даунрегуляцию экспрессии провоспалительных цитокинов в макрофагах, Т-клетках и других клетках иммунной системы (Moore KW et al. 2001).In vitro IL-20 и IL-24 вырабатываются не только активированными иммунными клетками, но также в подобной степени кератиноцитами. In vivo указанные цитокины предпочтительно экспрессируются в воспаленных тканях. IL-20 и IL-24 могут передавать сигнал через два комплекса рецепторов, IL-20RA/IL20RB и IL-22RA/IL-20RB (Langer JA et al. 2004). Некоторые ткани, в особенности кожа, ткани из репродуктивной и дыхательной систем, а также различные железы оказались главными мишенями указанных медиаторов (Kunz S et al. 2006).IL-22 был открыт как ген, апрегулируемый CD4+ Т-клетками при активации, и он имеет 22% идентичности аминокислотной последовательности с IL-10; поэтому первоначально его называли IL-10 подобный Т-клеточный индуцируемый фактор (IL-TIF) (Dumoutier L et al. 2000). В отличие от IL-10, который регулирует функции иммунных клеток, IL-22 контролирует реакции ткани на иммунную систему.IL-22 передает сигналы через гетеродимерный рецептор, сформированный IL-22RA и IL-10RB, который с высоким уровнем экспрессируется в различных тканях, но он не присутствует на иммуноцитах. Первоначально IL-22 связывается через его IL-22RA связывающий сайт с внеклеточным доменом IL-22RA и затем IL-10RB связывается с областью, созданной при взаимодействии IL-22 и IL-22RA, формируя комплекс цитокинового рецептора с более высокой аффинностью к IL-22 (Li J et al. 2004). Так как IL-10RB широко экспрессируется многими типами различных клеток, экспрессия IL-22RA является лимитирующим фактором, который определяет реакцию клеток на IL-22. IL-22RA значительно экспрессируется в печени, а также в коже, легких, поджелудочной железе и других периферических тканях (Wolk K et al. 2004; Aggarwal S. et al. 2001). Широкий скрининг различных линий клеток показал, что на IL-22 реагируют только те клетки, которые экспрессируют IL-22RA, что указывает на то, что нет никакого другого рецептора, который может опосредовать передачу сигнала IL-22. Растворимый рецептор, называемый IL-22-связывающим белком (IL-22BP; также известен какIL22BP, IL22RA2, IL-22R-2, CRF2X, CRF2-S1 и CRF2-10), также способен связываться с IL-22 как природный антагонист белка и, вероятно, обеспечивает системную регуляцию активности IL-22 (Kotenko SVet al. 2003). IL-22 был обнаружен в пораженных тканях пациентов с различными хроническими воспалительными заболеваниями, которые включают инфильтрацию активированных Т-клеток, такими как псориаз, псориатический артрит и атопический дерматит. IL-22 обычно описывают как провоспалительний цитокин из-за его экспрессии в участках повреждений у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями и его индукции таких провоспалительных цитокинов, как IL-6, IL-8 и TNF- (Wolk K etal. 2004; Andoh et al. 2005; Ikeuchi H et al. 2005; Nograles KE et al. 2009a.; Nograles KE et al. 2009b). Недавно Zheng с сотр. показал, что IL-22 важен при опосредовании IL-23-индуцированного воспаления кожи в модели псориаза на мышах, что указывает на его провоспалительную роль (Zheng Y et al. 2007). Учитывая биологические эффекты IL-22, включая гиперплазию кератиноцитов, индукцию хемокинов и выработку провоспалительных цитокинов в определенной ткани, использование антагонистов, которые блокируют, ингибируют, уменьшают или нейтрализуют активность IL-22, например, нарушая его связывание с рецептором, может предотвращать инфильтрацию патогенных клеток в участках воспаления. Моноклональные антитела мыши против IL-22RA человека были ранее описаны в заявке на патент РСТ WO 2006/047249, поданной 21 октября 2005 года. Впрочем, антитела мыши могут быть иммуногенными и поэтому предпочтительны гуманизированные антитела к IL-22RA человека. Гуманизированные антитела, как правило, обладают по меньшей мере тремя потенциальными преимуществами по сравнению с мышиными антителами при использовании в лечении человека: (1) так как эффекторная часть является человеческой, она может лучше взаимодействовать с другими элементами иммунной системы человека(например, более эффективно разрушать клетки-мишени посредством комплемент зависимой цитотоксичности (CDC) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC; (2) иммунная система человека не должна узнавать каркасную или константную область гуманизированного антитела как чужеродную, и поэтому выработка антител против такого введенного антитела должно быть меньше, чем против полностью чужеродного антитела мыши; и (3) вводимые антитела мыши, как сообщали, имели намного более короткий период полужизни в кровотоке человека, чем человеческие антитела. Вводимые гуманизированные антитела, по-видимому, будут иметь период полужизни наподобие природных антител человека, что позволит вводить меньшие и менее частые дозы. Таким образом, с учетом вышеизло-1 021356 женного, существует потребность в гуманизированных антителах против IL-22RA человека для лечения опосредуемого IL-22 воспаления, такого как псориаз, псориатический артрит и атопический дерматит. Сущность изобретения В первом аспекте изобретение предоставляет гуманизированное антитело, которое связывается сIL-22RA человека. Гуманизированное антитело согласно изобретению включает: а) вариабельный домен тяжелой цепи, включающий Н-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и b) вариабельный домен легкой цепи, включающий LCDR1, L-CDR2 и L-CDR3, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно, или состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, 5 и 7, соответственно. В другом аспекте изобретение предоставляет антитело, описанное в настоящей заявке, в котором: а) указанный вариабельный домен тяжелой цепи включает каркасные области H-FR1, H-FR2, H-FR3 и HFR4, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9, 10 и 11, соответственно, и b) указанный вариабельный домен легкой цепи включает каркасные области L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4,состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12, 13, 14 и 15, соответственно. В другом аспекте изобретение предоставляет антитело, описанное в настоящей заявке, в котором: а) указанный вариабельный домен тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 и b) указанный вариабельный домен легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQID NO: 17. В другом аспекте изобретение предоставляет антитело, описанное в настоящей заявке, где указанное антитело включает: а) константную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, и b) константный домен легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19. В другом аспекте изобретение предоставляет гуманизированное антитело, которое связывается сIL-22RA человека, которое включает тяжелую цепь, включающую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и легкую цепь, включающую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21. В другом аспекте изобретение предоставляет полинуклеотид, например ДНК, кодирующую тяжелую цепь гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению. Предпочтительно указанный полинуклеотид включает или состоит из SEQ ID NO: 22. В другом аспекте изобретение предоставляет полинуклеотид, например ДНК, кодирующую легкую цепь гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению. Предпочтительно указанный полинуклеотид включает или состоит из SEQ ID NO: 23. В другом аспекте изобретение предоставляет полинуклеотид, например ДНК, кодирующую тяжелую и легкую цепи гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению. В другом аспекте изобретение предоставляет вектор, а более конкретно вектор экспрессии, включающий: а) полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению, и b) полинуклеотид, кодирующий легкую цепь гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению. В другом аспекте изобретение предоставляет вектор, а более конкретно вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь и легкую цепь гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению. В другом аспекте изобретение предоставляет клетку-хозяина, предпочтительно клетку СНО, включающую, например, в результате трансфекции, вектор, и в частности, вектор экспрессии согласно изобретению. В другом аспекте изобретение предоставляет способ получения гуманизированного антитела согласно изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, предпочтительно клетки СНО согласно изобретению, и выделение гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению. В другом аспекте изобретение предоставляет гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в лечении псориаза, псориатического артрита или атопического дерматита. В другом аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция, включающая гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению, и ее применение в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в лечении псориаза, псориатического артрита или атопического дерматита. В другом аспекте изобретения предложено применение гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, включающей указанное антитело, в производстве лекарственного средства для лечения псориаза, псориатического артрита или атопического дерматита. Описание фигур На фиг. 1 представлено выравнивание иммуноглобулинового каппа вариабельного гена 4-1 (IGKV41) зародышевой линии человека и 280.46.3.4 VL мыши (280.46.3.4). На фиг. 2 представлено выравнивание иммуноглобулинового тяжелого вариабельного гена 3-66(IGHV3-66) зародышевой линии человека и 280.46.3.4 VH мыши (280.46.3.4). На фиг. 3 представлено выравнивание иммуноглобулинового каппа вариабельного гена 4-1 (IGKV41) зародышевой линии человека и первого варианта гуманизированного 280.46.3.4 VL (280.VK4-1-C). На фиг. 4 представлено выравнивание первого варианта гуманизированного 280.46.3.4 VH(280.VH3-66.1) и иммуноглобулинового тяжелого вариабельного гена 3-66 (IGHV3-66) зародышевой линии человека. На фиг. 5 показаны результаты окрашивания кумасси синим очищенных на белке А гуманизированных 280.46.3.4 антител в электрофорезном ДСН геле в неденатурирующих условиях. "Humira" (Adalimumab), коммерческое моноклональное антитело к TNF, использовали в качестве стандарта. "Маркер" представляет собой стандартные белковые маркеры молекулярного веса (MW), кДа указаны слева на фиг. "До" относится к очищенным на белке А гуманизированным 280.46.3.4 антителам, включающим 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-C, содержащим, таким образом, неспаренный цистеин в легкой цепи. "После" относится к очищенным на белке А гуманизированным 280.46.3.4 антителам, включающим 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-S. На фиг. 6 показаны результаты анализа фосфорилирования STAT3, выполненного в клетках гепатомы HepG2 человека для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного какIgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-S ( 280.VH3-66-1/VK4-1-S),с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело в 1,4 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, которое содержит свободный цистеин, со значениями IC50 257,5 пМ и 370,5 пМ, соответственно. На фиг. 7 показаны результаты анализа пролиферации, выполненного в трансфицированных рецептором IL-22 человека стабильных клетках BaF3 для сравнения активности гуманизированного антитела,экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-S ( 280.VH3-66-1/VK4-1-S), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело в 1,7 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, которое содержит свободный цистеин, со значениями IC50 340 пМ и 587 пМ, соответственно. На фиг. 8 показаны результаты анализа пролиферации, выполненного в трансфицированных мышиным рецептором IL-22 стабильных клетках BaF3 для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1S ( 280.VH3-66-1/VK4-1-S), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело в 2,1 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, которое содержит свободный цистеин, со значениями IC50 693 пМ и 1473 пМ, соответственно. На фиг. 9 представлено выравнивание иммуноглобулинового тяжелого вариабельного гена 3-66(IGHV3-66) зародышевой линии человека и варианта 4 гуманизированного 280.46.3.4 VH (280.VH3-664). На фиг. 10 показаны результаты анализа фосфорилирования STAT3, выполненного в клетках гепатомы HepG2 человека для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного какIgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-4, спаренную с 280.VK4-1-T ( 280.VH3-66-4/VK4-1-T),с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело в 1,8 раза более актвино по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениямиIC50 183,2 пМ и 333,0 пМ, соответственно. На фиг. 11 показаны результаты анализа пролиферации, выполненного в трансфицированных рецептором IL-22 человека стабильных клетках BaF3 для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-4, спаренную с 280.VK4-1T ( 280.VH3-66-4/VK4-1-T), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело в 1,75 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениями IC50 334 пМ и 587 пМ, соответственно. На фиг. 12 показаны результаты анализа пролиферации, выполненного в трансфицированных мышиным рецептором IL-22 стабильных клетках BaF3 для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-4, спаренную с 280.VK4-1T ( 280.VH3-66-4/VK4-1-T), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело в 2,1 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениями IC50 687 пМ и 1473 пМ, соответственно. На фиг. 13 приведены результаты анализа Biacore, направленного на измерение аффинности связывания с IL-22RA человека набора мутантов, где Asp 32 в H-CDR1 и Asp 96 в H-CDR3 были по отдельности мутированы в 280.VH3-66-4. Такие одиночные мутанты были спарены с гуманизированным вариабельным доменом легкой цепи 280.VK4-1-T, а затем проанализированы для измерения аффинности.D32E: мутация с заменой Asp на Glu в положении 32 в 280.VH3-66-4 для получения варианта 280.VH366-18; D32: исходный вариант 280-VH3-66-4; D32N: мутация с заменой Asp на Asn в положении 32 в 280.VH3-66-4; D96E: мутация с заменой Asp на Glu в положении 96 в 280.VH3-66-4; D96N: мутация с заменой Asp на Asn в положении 96 в 280.VH3-66-4. Результаты, представленные на данной фигуре, показывают, что мутация D32E повышала скорость ассоциации приблизительно в 2 раза и снижала скорость диссоциации приблизительно в 5 раз по сравнению с исходным немутированным D32 (280.VH3-66-4). С другой стороны, мутация D96E оказывала отрицательное воздействие, уменьшая аффинность приблизительно в 500 раз. На фиг. 14 представлены результаты дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) мутанта D32E и исходного немутированного D32, проведенной с целью исследования их термостабильности. Мутант D32E (светло-серая линия) более стабилен на 1 градус, чем исходное D32 (темно-серая линия). На фиг. 15 представлены результаты анализа фосфорилирования STAT3, выполненного в клетках гепатомы HepG2 человека для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-18, спаренную с 280.VK4-1-T ( 280.VH3-6618/VK4-1-Т), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело почти в 3 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениями IC50 132,5 пМ и 370,5 пМ, соответственно. На фиг. 16 показано выравнивание финального гуманизированного варианта VH, 280.VH3-66-46, и иммуноглобулинового тяжелого вариабельного гена 3-66 (IGHV3-66) зародышевой линии человека. На фиг. 17 показано выравнивание иммуноглобулинового каппа вариабельного гена 4-1 (IGKV4-1) зародышевой линии человека и финального гуманизированного варианта VL, 280.VK4-1-TSY. На фиг. 18 представлены результаты анализа фосфорилирования STAT3, выполненного в нормальных кератиноцитах человека для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-46, спаренную с 280.VK4-1-TSY ( 280.VH3-6646/VK4-1-TSY), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело (280.346.TSY, см. пример 7) почти в 9 раз более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениями IC50 60,95 пМ и 541,9 пМ, соответственно. На фиг. 19 представлены результаты анализа фосфорилирования STAT3, выполненного в клетках гепатомы HepG2 человека для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-46, спаренную с 280.VK4-1-TSY ( 280.VH3-6646/VK4-1-TSY), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело (280.346.TSY, см. пример 7) почти в 5 раз более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениями IC50 55,16 пМ и 266,3 пМ, соответственно. На фиг. 20 представлены результаты анализа пролиферации, выполненного в трансфицированных рецептором IL-22 человека стабильных клетках BaF3 для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-46, спаренного с 280.VK4-1-TSY ( 280.VH3-66-46/VK4-1-TSY), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело (280.34 6.TSY, см. пример 7) в 1,7 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениями IC50 317 пМ и 545 пМ, соответственно. На фиг. 21 представлены результаты анализа фосфорилирования STAT3, выполненного в клетках гепатомы НЕРА 1-6 мыши для вычисления активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgGl/каппа человека, включающего 280.VH3-66-46, спаренного с 280.VK4-1-TSY ( 280.VH3-6646/VK4-1-TSY). Человеческий IgG1 использовали в качестве отрицательного контроля ( контрольныйhIgG1). Результаты показывают, что гуманизированное антитело (280.346.TSY, см. пример 7) способно ингибировать активность мышиного IL-22 с IC50 в наномолярном диапазоне (2,1 нМ). На фиг. 22 представлены результаты анализа пролиферации, выполненного в трансфицированных мышиным рецептором IL-22 стабильных клетках BaF3 для сравнения активности гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66-46, спаренную с 280.VK4-1-TSY ( 280.VH3-66-46/VK4-1-TSY), с исходным мышиным антителом 280.46.3.4 ( 280.46.3.4). Результаты показывают, что гуманизированное антитело (280.346.TSY, см. пример 7) в 6,2 раз более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, со значениями IC50 137 пМ и 849 пМ,соответственно. На фиг. 23 представлены результаты конкурентого ELISA, выполненного с целью измерения специфичности 280.346.TSY в отношении IL-22RA человека. Микротитровальные планшеты были покрыты человеческим IL-22RA-ECD (то есть IL-22RA-внеклеточным доменом). Биотинилированное антитело 280-346-TSY добавляли в планшет в присутствии конкурентов: альфа-рецептора интерлейкина 22 человека (hIL-22RA), IL-22-связывающего белка человека (hIL-22 ВР), альфа-рецептора IL-22 мыши (mIL22RA), альфа-рецептора IL-10 а человека (hIL-10R) и альфа-рецептора человека IL-20a (hIL-20R). Связывание с hIL-22RA, нанесенным на планшеты, определяли с помощью добавления конъюгированного с пероксидазой стрептавидина. Измеренные значения IC50 для человеческого ( hIL-22RA) и мышиного (mIL-22RA) IL-22RA составили 18,25 пМ и 149,3 пМ, соответственно. 280.346.TSY не появляет перекрестной реактивности с человеческим IL-22BP ( МЛ-22 ВР), IL-10R альфа ( hIL-10R) и IL-20R альфа (VhIL-20R). На фиг. 24 представлены результаты фармакодинамической активности 280-346-TSY в отношении подкожно за 22 ч до внутривенной инъекции рекомбинантного мышиного IL-22. Контрольной средой являлся PBS, который вводили подкожно. Забор крови проводили через 6 ч после введения IL-22. Человеческий IgG1 использовали в качестве отрицательного контроля (контрольного изотипа). Сывороточный амилоид А определяли с помощью ELISA. 280-346-TSY показал эффективность в данной модели и дал значение ED50 0,5 мг/кг. Для выполнения статистического анализа использовали критерий МаннаУитни: р 0,05 в сравнении с группой контрольного изотипа; р 0,001 в сравнении с группой контрольного изотипа. На фиг. 25 представлены результаты фармакодинамической активности 280-346-TSY в модели псориаза на мышах. Определяли эффективность 280-346-TSY при IL-23-индуцированном утолщении уха. Мышам вводили 500 нг рекомбинантного человеческого IL-23a или PBS через день в течение 14 дней. Полный терапевтический охват выполняли с различными дозами 280.346.TSY, которые вводили подкожно. Контрольной средой являлся PBS, который вводили подкожно. Дексаметазон (Dexa) использовали в качестве положительного контроля. Процент ингибирования вычисляли в день 9, который соответствовал пику опухания уха. 280-346-TSY показал эффективность в данной модели и дал значение ED50 1,8 мг/кг. Подробное описание изобретения Перед подробным изложением изобретения для его понимания может быть полезным определить следующие термины. Используемый в настоящей заявке термин "антитело", а также его множественная форма "антитела", включает, помимо прочего, поликлональные антитела, афинноочищенные поликлональные антитела,моноклональные антитела, нанотела и антигенсвязывающие фрагменты, такие как F(ab')2, Fab протеолитические фрагменты и одноцепочечные фрагменты вариабельной цепи (scFv). Также включены полученные методами генной инженерии интактные антитела или фрагменты, такие как химерные антитела, Fvфрагменты, одноцепочечные антитела и т.п., а также синтетические антигенсвязывающие пептиды и полипептиды. Антитела нечеловеческого происхождения могут быть гуманизированы с помощью графтинга нечеловеческих CDR на человеческие каркасные и константные области, или путем включения полностью нечеловеческих вариабельных доменов. В некоторых случаях гуманизированные антитела могут сохранять нечеловеческие остатки в человеческих каркасных областях для улучшения параметров правильного связывания. С помощью гуманизации антител может быть увеличен биологический период полужизни и снижен потенциал к развитию нежелательных иммунных реакций при введении людям. Используемый в настоящей заявке термин "иммуноглобулин" (Ig) относится к белку, состоящему из одного или более полипептидов, по существу кодируемых генами иммуноглобулинов. Одна форма иммуноглобулина составляет основную структурную единицу антитела. Эта форма представляет собой тетрамер и состоит из двух идентичных пар иммуноглобулиновых цепей, каждая пара содержит одну легкую и одну тяжелую цепь. Легкая цепь содержит две части: вариабельный домен (VL) и константный домен (CL), который в контексте легкой цепи также можно называть константной областью. Тяжелая цепь также содержит две части: вариабельный домен (VH) и константную область (СН). В каждой паре вариабельные домены легкой и тяжелой цепи вместе отвечают за связывание с антигеном, а константные области отвечают за эффектроные функции антитела. Полноразмерные иммуноглобулиновые "легкие цепи" (приблизительно 25 кДа) кодируются геном вариабельного домена на N-конце (приблизительно 110 аминокислот) и геном каппа или лямбда константного домена (С и С, соответственно) на С-конце. Полноразмерные иммуноглобулиновые "тяжелые цепи" (приблизительно 50 кДа) также кодируются геном вариабельного домена (приблизительно 116 аминокислот) и одним из генов других константных областей (приблизительно 330 аминокислот), указанных далее. У млекопитающих существует пять типов тяжелых цепей, обозначаемых греческими буквами: , , ,и . Тип тяжелой цепи определяет изотип антитела как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно. Константная область идентична во всех антителах одного изотипа, но отличается у антител различных изотипов. Тяжелые цепи ,иимеют константную область, которая состоит из трех константных доменов Ig (CH1, CH2 и CH3), и шарнирную область для повышения гибкости; тяжелые цепиисодержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов Ig (CH1, CH2, CH3 иCH4), и шарнирную область. Вариабельный домен легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из "каркасной" области,прерываемой тремя гипервариабельными областями. Таким образом, термин "гипервариабельная область" относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "определяющей комплементарность области" или "CDR", то есть L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 в вариабельном домене легкой цепи и Н-CDR1, HCDR2 и H-CDR3 в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al. 1991) и/или аминокислотные остатки из "гипервариабельной петли" (Chothia and Lesk, 1987). Остатки "каркасной области" или "FR" являются остатками вариабельного домена, отличными от остатков гипервариабельной области, как определено в настоящем описании. Последовательности каркасных областей различных легких (то есть L-FR1, L-FR2,L-FR3 и L-FR4) или тяжелых (то есть H-FR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4) цепей относительно консервативны в пределах биологических видов. Таким образом, "человеческая каркасная область" является каркасной областью, которая, по существу, идентична (приблизительно на 85% или больше, обычно на 90-95% или больше) каркасной области природного человеческого иммуноглобулина. Каркасная область антитела,которая представляет собой объединенные каркасные области составляющих легких и тяжелых цепей,служит для размещения и выравнивания CDR. CDR прежде всего отвечают за связывание с эпитопом антигена. Соответственно, термин "гуманизированный" иммуноглобулин относится к иммуноглобулину,включающему человеческую каркасную область и одну или более CDR из нечеловеческого (обычно мышиного или крысиного) иммуноглобулина. Нечеловеческий иммуноглобулин, являющийся источником CDR, называют "донором", а человеческий иммуноглобулин, который обеспечивает каркас, называют "акцептором". Константные области не должны непременно присутствовать, но если они присутствуют, то они должны быть по существу идентичны константным областям иммуноглобулина человека,то есть являться идентичными по меньшей мере приблизительно на 85-90%, предпочтительно приблизительно на 95% или более. Таким образом, все части гуманизированного иммуноглобулина, кроме, возможно, CDR и нескольких остатков в константной области тяжелой цепи, если необходима модуляция эффекторных функций, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей природных человеческих иммуноглобулинов. "Гуманизированное антитело" является антителом, включающим гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых случаях гуманизированные антитела могут сохранять нечеловеческие остатки в человеческих каркасных областях для улучшения параметров правильного связывания, и/или в CDR могут быть введены некоторые аминокислотные мутации с целью повышения аффинности связывания и/или снижения иммуногенности, и/или повышения степени гуманизации. Термин "рекомбинантные антитела" означает антитела, у которых аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности нативного антитела. Благодаря методам генной инженерии при создании антител не требуется ограничиваться аминокислотными последовательностями,обнаруживаемыми у природных антител; антитела могут быть изменены для получения требуемых свойств. Возможные изменения многочисленны и включают от замены только одной или нескольких аминокислот до полного изменения, например, вариабельного домена или константной области. Изменения в константной области, как правило, проводят с целью улучшения, уменьшения или изменения таких свойств, как связывание комплемента (например, комплемент-зависимая цитотоксичность, CDC), взаимодействие с мембранами и другие эффекторные функции (например, антителозависимая клеточная цитотоксичность, ADCC). Изменения вариабельного домена обычно проводят для улучшения антигенсвязывающих свойств. В дополнение к антителам, иммуноглобулины могут существовать в целом ряде других форм,включая, например, одиноцепочечную или Fv, Fab и (Fab')2, а также диатела, линейные антитела, поливалентные или полиспецифичные гибридные антитела. Используемые в настоящей заявке термины "одноцепочечный Fv" "одноцепочечные антитела" "Fv" или "scFv" относятся к фрагментам антитела, которые включают вариабельные домены из тяжелой и легкой цепей, но не содержат константных областей,однако находятся в пределах одной полипептидной цепи. Как правило, одноцепочечное антитело также включает полипептидный линкер между VH и VL доменами, который позволяет ему формировать необходимую структуру, которая позволяет связываться с антигеном. В определенных вариантах осуществления одноцепочечные антитела также могут быть биспецифичными и/или гуманизированными. "Fabфрагмент" состоит из одной легкой цепи и вариабельного и CH1 доменов одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Fab молекулы не может формировать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. "Fab' фрагмент" содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит больше константной области, между CH1 и CH2 доменами, что между двумя тяжелыми цепями может быть сформирована межцепочечная дисульфидная связь с образоваием F(ab')2 молекулы. "F(ab')2" содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, содержащие такую часть константной области между CH1 и CH2 доменами, что между двумя тяжелыми цепями формируется межцепочечная дисульфидная связь. Определив некоторые важные термины, теперь можно сосредоточить внимание на конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение основано на открытии гуманизированных антител против IL-22RA человека. Применение таких антител в качестве антагонистов к IL-22RA может предотвратить воспаление и,таким образом, может быть полезным в лечении хронических воспалительных заболеваний, которые включают инфильтрацию активированных Т-клеток, таких как псориаз, псориатический артрит и атопический дерматит. Изобретение обеспечивает применение гуманизированных антител, которые узнают,связывают, модулируют и/или нейтрализуют IL-22RA. В частности, изобретение обеспечивает применение гуманизированных вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, которые узнают, связывают, модулируют и/или нейтрализуют IL-22RA. Такие гуманизированные вариабельные домены легкой и тяжелой цепи могут быть слиты, соответственно, с каппа или лямбда константным доменом и с константной областью тяжелой цепи, выбранной из любого изотипа (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM), и экспрессированы в различных клетках-хозяевах. Предпочтительно, выбранная константная область является областью IgG,-6 021356 и более предпочтительно IgG1. Гуманизированные антитела к IL-22RA, описанные в настоящей заявке,были получены при использовании, в качестве исходной точки процесса гуманизации, аминокислотной последовательности мышиных моноклональных антител против IL-22RA человека, описанных ранее в заявке на патент РСТ WO 2006/047249, поданной 21 октября 2005 года.IL-22RA является цитокиновым рецептором типа II, который был впервые описан как Zcytor11 в заявке на патент РСТ WO 99/07848, поданной 30 июля 1998 года. Аминокислотная последовательность IL22RA человека приведена в SEQ ID NO: 24. В настоящем изобретении также предложены гуманизированные антитела к IL-22RA, которые связываются с полипептидными фрагментами или пептидами, включающими эпитопсодержащую часть полипептида IL-22RA или иммуногенный эпитоп или антигенный эпитоп. Связывание антител с указанными эпитопами приводит к ингибированию, блокированию, нейтрализации и/или уменьшению трансдукции сигнала IL-22RA. Активность антител, как описано в настоящей заявке, может измеряться по их способности ингибировать или уменьшать пролиферацию с использованием различных анализов, которые измеряют пролиферацию и/или связывание с клетками, экспрессирующими рецептор IL-22RA. Особый интерес представляют изменения в IL-22-зависимых клетках. Подходящие линии клеток, которые создаются как IL22-зависимые, включают линию клеток BaF3. Активность гуманизированных антител к IL-22RA может также быть измерена в анализе пролиферации BaF3, анализе фосфорилирования STAT3 в клетках гепатомы HepG2 человека или в клетках гепатомы НЕРА 1-6 мыши, анализе Biacore или в анализе на нормальных кератиноцитах человека, описанных ниже. В варианте осуществления гуманизированное антитело изобретения включает: а) вариабельный домен тяжелой цепи, включающий H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и b) вариабельный домен легкой цепи, включающийL-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, 5 и 6,соответственно, или состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, 5 и 7, соответственно. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет антитело, описанное в настоящей заявке, в котором: а) указанный вариабельный домен тяжелой цепи включает каркасные области Н-FR1,H-FR2, H-FR3 и H-FR4, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9, 10 и 11,соответственно, и b) указанный вариабельный домен легкой цепи включает каркасные области L-FR1, LFR2, L-FR3 и L-FR4, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12, 13, 14 и 15,соответственно. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет антитело, описанное в настоящей заявке, в котором: а) указанный вариабельный домен тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и b) указанный вариабельный домен легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет антитело, описанное в настоящей заявке, в котором: а) указанный вариабельный домен тяжелой цепи слит с константной областью тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из константной области человеческого IgA, IgG, IgM, IgD, IgE или любого подкласса, предпочтительно IgG1, и b) указанный вариабельный домен легкой цепи слит с константным доменомилилегкой цепи иммуноглобулина человека, предпочтительно . В другом варианте осуществления указанная константная область тяжелой цепи включает некоторые аминокислотные мутации, которые модулируют, уменьшают или ингибируют эффекторную функцию антитела (например, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет антитело, описанное в настоящей заявке, где указанное антитело включает: а) константную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, и b) константный домен легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет гуманизированное антитело, которое связывается с IL-22RA человека, которое включает тяжелую цепь, включающую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, и легкую цепь, включающую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21. Способы получения полинуклеотидов, кодирующих антитела, описанные в настоящей заявке(включая ДНК и РНК), известны в уровне техники. Суммарная РНК может быть получена при использовании экстракции с гуанидинизотиоцианатом, с последующим выделением центрифугированием в градиенте CsCl (Chirgwin JM et al. 1979). Поли(А)+ РНК получают из суммарной РНК, используя метод Aviv и Leder (Aviv H et al. 1972). Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли(А)+ РНК, используя известные методы. В альтернативе может быть выделена геномная ДНК. Затем полинуклеотиды, кодирующие антитела IL-22RA, идентифицировуют и выделяют, например, с помощью гибридизации или ПЦР. Антитела, раскрытые в настоящей заявке, могут быть получены с помощью любой технологии, известной в уровне техники, например генной инженерии, химического синтеза, клонирования, лигирова-7 021356 ния или комбинации перечисленного. В варианте осуществления антитела настоящего изобретения получают с помощью генной инженерии, например, при экспрессии соответствующей нуклеиновой кислоты в подходящей клетке-хозяине. Полученный полипептид может быть гликозилирован или нет, или может содержать другие посттрансляционные модификации в зависимости от используемого типа клетки-хозяина. Множество книг и обзоров содержат описание клонирования и получения рекомбинантных белков с использованием векторов и прокариотических или эукариотических клеток-хозяев. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения, таким образом, является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая любое из антител или его фрагментов, описанных выше или ниже, или его комплементарную цепь или вырожденную последовательность. В данном отношении термин "молекула нуклеиновой кислоты" охватывает все различные типы нуклеиновых кислот, включая без ограничения дезоксирибонуклеиновые кислоты (например, ДНК, кДНК, гДНК, синтетическую ДНК и т.д.), рибонуклеиновые кислоты (например, РНК) и пептиднуклеиновые кислоты (ПНК). В предпочтительном варианте осуществления молекулой нуклеиновой кислоты является молекула ДНК, такая как двунитевая молекула ДНК или молекула кДНК. Термин "выделенный" означает молекулы нуклеиновой кислоты, которые были идентифицированы и отделены по меньшей мере от одной контаминирующей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой они обычно связаны в природном источнике. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты в той форме или окружении, в котором она присутствует в природе. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, таким образом, отличаются от определенной молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в природных клетках. Вырожденная последовательность определяет любую нуклеотидную последовательность, кодирующую ту же аминокислотную последовательность, что и референсная нуклеотидная последовательность, но включающую иную нуклеотидную последовательность в результате вырожденности генетического кода. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, также называемая полинуклеотидом, кодирует тяжелую цепь гуманизированного антитела изобретения, а другой полинуклеотид кодирует легкую цепь гуманизированного антитела изобретения. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь гуманизированного антитела изобретения, включает или состоит из SEQ ID NO: 22. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий легкую цепь гуманизированного антитела изобретения, включает или состоит из SEQ ID NO: 23. В предпочтительном варианте осуществления уникальный полинуклеотид кодирует и тяжелую, и легкую цепь гуманизированного антитела изобретения. Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является вектор, включающий ДНК, кодирующую любое из антител или его фрагментов, описанных выше или ниже. Вектор может быть любым клонирующим или экспрессионным вектором, интегративным или автономно реплицирующимся, функциональным в любой прокариотической или эукариотической клетке. В частности, вектор может быть плазмидой, космидой, вирусом, фагом, эписомой, искусственной хромосомой и т.п. Вектор может включать кодирующие последовательности и тяжелой, и легкой цепи, либо одну из последовательностей, кодирующих легкую и тяжелую цепи. Если вектор включает кодирующие последовательности и тяжелой, и легкой цепи, тяжелая и легкая цепи могут быть функционально связаны с промотором. Промотор для тяжелой и легкой цепи может быть одинаковым или разным. Тяжелая и легкая цепь также могут быть функционально связаны с одним промотором, в данном случае кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепи могут предпочтительно быть разделены внутренним сайтом посадки рибосомы (IRES). Подходящими промоторами для экспрессии эукариотических генов, например, являются промоторы, происходящие из вирусных генов, таких как цитомегаловирус (CMV) мыши или человека, двунаправленный промотор CMV мыши или промотор вируса саркомы Рауса (RSV), которые известны специалисту, квалифицированному в данной области. Вектор может нести регуляторные элементы, такие как промотор, терминатор, энхансер, селективный маркер, сайт начала репликации, инсулятор и т.д. Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в вектор с помощью целого ряда процедур. Как правило, ДНК встраивают в подходящий сайт(ы) эндонуклеаз рестрикции, используя методы, известные из уровня техники. При конструировании подходящих векторов,содержащих один или более таких элементов, используют стандартные методы лигирования, которые известны квалифицированному специалисту. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является рекомбинантная клеткахозяин, где указанная клетка включает молекулу/полинуклеотид нуклеиновой кислоты или вектор, как определено выше. Клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Примеры прокариотических клеток включают бактерии, такие как E.coli. Примерами эукариотических клеток являются клетки дрожжей, клетки растений, клетки млекопитающих и клетки насекомых, включая любую первичную клеточную культуру или стабильную линию клеток (например, 3 Т 3, Vera, HEK293, TN5 и т.д.). Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных белков получают из многоклеточных организмов. Примеры полезных линий клеток-хозяев на основе клеток млекопитающих включают клетки яичников китайского хомячка (СНО) и клетки COS. Наиболее предпочтительными клетками млекопитающих по изобретению являются клетки СНО. Как раскрыто выше, антитела по изобретению мо-8 021356 гут быть получены любыми методами, известными в уровне техники, например, методами генной инженерии, химического синтеза, клонирования, лигирования или их комбинаций. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения, таким образом, является способ получения антитела по изобретению, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина согласно изобретению при условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, и получение/выделение получаемого полипептида. Полученный полипептид может быть гликозилирован или нет,или может содержать другие посттрансляционные модификации в зависимости от используемого типа клетки-хозяина. Способ получения антитела настоящего изобретения может дополнительно включать этап включения антитела в фармацевтическую композицию. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения, таким образом, является фармацевтическая композиция, включающая гуманизированное антитело согласно изобретению. Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция может также включать дополнительные вспомогательные вещества, такие как буфер, стабилизатор, поверхностно-активное вещество и т.д. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут применяться в диагностике, профилактике и/или лечении (местном или системном) псориаза и других иммуноопосредованных заболеваний, таких как псориатический артрит и атопический дерматит. Термин "лечение" в рамках настоящего изобретения относится к любому благоприятному воздействию на течение заболевания, включая ослабление, сокращение, снижение или уменьшение патологического процесса после возникновения заболевания. Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить с фармацевтически приемлемым носителем. Термин "фармацевтически приемлемый" следует понимать как охватывающий любой носитель, который не оказывает нежелательного действия на эффективность биологической активности активного компонента и не токсичен для реципиента, которому его вводят. Например, в случае парентерального введения активный белок(ки) может быть приготовлен в единичной лекарственной форме для инъекции в таких средах, как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера. В другом аспекте изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В другом аспекте изобретение предоставляет способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции согласно изобретению. Предпочтительно заболевание выбрано из псориаза, псориатического артрита и атопического дерматита. В другом аспекте изобретение предоставляет гуманизированное антитело согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В другом аспекте изобретение предоставляет способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту гуманизированного антитела согласно изобретению. Предпочтительно заболевание выбрано из псориаза, псориатического артрита и атопического дерматита. В другом аспекте изобретение обеспечивает применение гуманизированного антитела согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения псориаза, псориатического артрита или атопического дерматита. В первом применении согласно изобретению фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят пульмонально. Во втором применении согласно изобретению фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят интраназально. В третьем применении согласно изобретению фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят ингаляцией. В четвертом применении согласно изобретению фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят перорально. В пятом применении согласно изобретению фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят внутривенно или внутримышечно. В предпочтительном варианте осуществления в применении согласно изобретению фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят подкожно. Фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят согласно любому из путей, описанных выше, ежедневно или через день. В случае парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения фармацевтическая композиция по изобретению может быть приготовлена в форме раствора, суспензии,эмульсии или лиофилизированного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемой парентеральной средой (например, водой, солевым раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые сохраняют изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Лекарственную форму стерилизуют стандартными методами. Активные компоненты фармацевтической композиции согласно изобретению можно вводить человеку различными способами. Пути введения могут включать внутрикожный, трансдермальный (например, в лекарственных формах с медленным высвобождением), внутримышечный, внутрибрюшинный,-9 021356 внутривенный, подкожный, перидуральный, местный, пероральный пути и введение в аэрозоле, интраназальным путем или при вдыхании. Может использоваться любой другой терапевтически эффективный путь введения, например, абсорбция через эпителиальные или эндотелиальные ткани, или генная терапия, при которой молекулу ДНК, кодирующую активное вещество, вводят пациенту (например, посредством вектора), что вызывает экспрессию и секрецию активного вещества in vivo. Кроме того, фармацевтическую композицию согласно изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных средств, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества,вспомогательные вещества, носители, разбавители и среды. Дозировка, которую вводят человеку, изменяется в зависимости от ряда факторов, включающих фармакокинетические свойства, путь введения, состояние и показатели пациента (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, размер), уровень симптомов, сопутствующую терапию, частоту лечения и требуемый эффект. Антитела по настоящему изобретению могут быть получены, приготовлены, введены или применены в других альтернативных формах, которые могут быть предпочтительными в соответствии с требуемым способом применения и/или получения. Полезные конъюгаты или комплексы также могут быть получены с целью улучшения средств в отношении эффективности доставки лекарственного средства. С данной целью антитела, описанные в настоящей заявке, могут находиться в форме активных конъюгатов или комплекса с молекулами, такими как полиэтиленгликоль и другие природные или синтетические полимеры (Harris JM et al. 2003). В этой связи настоящее изобретение рассматривает химически модифицированные антитела, в которых антитело связано с полимером. Как правило, полимер растворим в воде,чтобы конъюгат не осаждался в водной среде, такой как физиологическая среда. Кроме того, для получения конъюгата может использоваться смесь полимеров. Конъюгаты, используемые для терапии, могут включать молекулы фармацевтически приемлемых водорастворимых полимеров. Подходящие водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, биссукцинимидилкарбонат ПЭГ, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлозу или другие полимеры на углеводной основе. Подходящий ПЭГ может иметь молекулярную массу от приблизительно 600 до приблизительно 60000, включая, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат также может включать смесь таких водорастворимых полимеров. Примеры конъюгатов включают любое антитело, раскрытое выше, и полиалкилоксидную группу, присоединенную к N-концу. ПЭГ является одним из подходящих полиалкилоксидов. В качестве иллюстрации, любое антитело, раскрытое в настоящей заявке, может быть модифицировано ПЭГом в процессе, известном как "ПЭГилирование". ПЭГилирование может быть выполнено любой из реакций ПЭГилирования, известных в уровне техники (Francis GE et al. 1998). Например, ПЭГилирование может быть выполнено с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с использованием реакционноспособной молекулы полиэтиленгликоля. Предпочтительно все подобные модификации существенно не влияют на способность антитела связывать IL-22RA человека. Настоящее изобретение также включает рекомбинантные гуманизированные антитела против IL22RA человека, которые функционально эквивалентны антителам, описанным выше. Также включены модифицированные гуманизированные антитела, обеспечивающие повышенную стабильность и/или терапевтическую эффективность. Примеры модифицированных антител включают антитела с консервативными заменами аминокислотных остатков, а также с одной или более делециями или вставками аминокислот, которые существенно не ухудшают антигенсвязывающие свойства. Замены могут варьировать от изменения или модификации одного или более аминокислотных остатков до полного изменения области, при условии сохранения терапевтической полезности. Гуманизированные антитела настоящего изобретения могут быть модифицированы посттрансляционно (например, ацетилированием и фосфорилированием) или могут быть модифицированы синтетически (например, присоединением метящей группы). Следует понимать, что гуманизированные антитела,созданные с помощью настоящего способа, могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые не оказывают, по существу, никакого влияния на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Гуманизированные антитела настоящего изобретения могут включать производные, которые модифицированы, например, помимо прочего, производные включают гуманизированные антитела, которые были модифицированы, например, гликозилированием, ацетилированием, ПЭГилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связыванием с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Дополнительно производное может содержать одну или более нестандартных и/или неприродных аминокислот. Периоды полужизни in vivo гуманизированных антител настоящего изобретения могут быть увеличены посредством модификации (например, замены, делеции или присоединения) аминокислотных остатков,идентифицированных как остатки, участвующие во взаимодействии между Fc-областью и FcRnрецептором. Все ссылки, процитированные в настоящей заявке, включая журнальные статьи или рефераты,- 10021356 опубликованные или неопубликованные заявки на патенты США или иностранные заявки, выданные патенты США или иностранные патенты, или любые другие ссылки, полностью включены в настоящую заявку путем отсылки, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, содержащийся в процитированных ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, процитированных в настоящей заявке, также полностью включено в настоящее описание путем ссылки. Предыдущее раскрытие конкретных вариантов осуществления описывает общую суть изобретения,что специалисты, применяя знания в рамках уровня техники (включая содержание ссылок, процитированных в настоящей заявке), могут с легкостью изменить и/или адаптировать для другого применения указанных конкретных вариантов осуществления, без избыточного экспериментирования, не отступая от общей сути настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что подобные адаптации и модификации включены в значения диапазона эквивалентов раскрытых вариантов осуществления, основанных на описании и руководстве, представленном в настоящей заявке. Необходимо понимать, что настоящая фразеология или терминология служит в целях описания, а не ограничения. Примеры Пример 1. Выбор исходного антитела для процесса гуманизации. Моноклональные мышиные антитела против IL-22RA человека, экспрессируемые пятью гибридомами, описанными в примере 18 заявки на патент РСТ WO 2006/047249, поданной 21 октября 2005 года,сравнивали с целью выбора того антитела, которое затем использовали в качестве исходного в процессе гуманизации. Самыми важными критериями выбора являлись: высокая аффинность к человеческому IL22RA, перекрестная реактивность с мышиным IL-22RA, отсутствие перекрестной реактивности с IL22BP и отсутствие агонистической активности в отношении человеческого IL-22RA. Только одно антитело соответствовало всем вышеуказанным критериям (данные не показаны), а именно антитело, экспрессируемое гибридомой, обозначенной 280.46.3.4 (обозначение патентного депозитария АТСС РТА 6284), которое является мышиным IgG1/каппа антителом. Определенная аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой и легкой цепей(VH и VL, соответственно) данного мышиного моноклонального антитела к IL-22RA человека (в дальнейшем называемого "280.46.3.4 мыши") приведена в SEQ ID NO: 25 и 26, соответственно. Пример 2. Создание реконструированных гуманизированных вариабельных доменов 280.46.3.4. А. Выбор гомологичной человеческой зародышевой линии для последовательности каркасной области. При использовании базы данных IMGT-GENE (Giudicelli V. et al. 2005), вариабельные домены каппа легкой цепи человеческой зародышевой линии, полные последовательности которых (каркасные области и CDR) показали высокий процент идентичности по отношению к последовательностям VL 280.46.3.4 мыши, идентифицировали в результате сравнения аминокислотных последовательностей. VL 280.46.3.4 мыши была наиболее гомологична каппа вариабельному гену 4-1 (IGKV4-1) иммуноглобулина зародышевой линии человека с идентичностью 82,2%, (83 аминокислотных остатка из 101; фиг. 1). Поэтому IGKV4-1, приведенный в SEQ ID NO: 27, выбрали в качестве человеческой акцепторной каркасной последовательности для графтинга CDR. Что касается VH 280.46.3.4 мыши, при использовании базы данных IMGT-GENE, высокого процента идентичности с зародышевой линией человека не выявили. Иммуноглобулиновый тяжелый вариабельный ген 1-46 зародышевой линии человека (IGHV1-46) идентифицировали как обладающий наиболее высокой гомологией с идентичностью 60,2% (59 аминокислотных остатков из 98). Однако IGHV3-66, приведенный в SEQ ID NO: 28, эффективно выбрали в качестве человеческой акцепторной каркасной последовательности, несмотря на ее самую низкую гомологию(50,0% идентичность, 49 аминокислотных остатков из 98; фиг. 2), так как ее последовательность близка последовательности VH 280.46.3.4 мыши в различных важных каркасных положениях и, таким образом,вероятно, будет обеспечивать хорошую стабильность. В. Аминокислотные замены в каркасных областях. 8.1. Легкая цепь. Следующий этап в создании гуманизированного VL 280.46.3.4 заключался в присоединении CDR из VL 280.46.3.4 мыши к каркасным областям (FR) из человеческой зародышевой линии IGKV4-1. Иммуноглобулиновый каппа соединяющий 1 ген человеческой зародышевой линии (IGKJ1) использовали вместо J-гена мыши. В первом варианте реконструированной гуманизированной VL 280.46.3.4 (280.VK41-C), приведенном в SEQ ID NO:29, в человеческих FR изменений не сделали, то есть ни один из остатков мыши в FR, как полагали, не был структурно важен. Выравнивание IGKV4-1 и первого варианта гуманизированной VL 280.46.3.4 (280.VK4-1-C) показано на фиг. 3. 8.2. Тяжелая цепь. Следующий этап в процессе создания гуманизированной VH 280.46.3.4 заключался в присоединении CDR из VH 280.46.3.4 мыши к FR из человеческой зародышевой линии IGHV3-66. В первом варианте реконструированной гуманизированной VH 280.46.3.4 (280.VH3-66.1), приведенной в SEQ ID NO: 30,в человеческих каркасных областях сделали 12 изменений (фиг. 4). В человеческих FR 12 изменений находились в положениях 27, 28, 29, 30, 48, 49, 67, 69, 70, 71, 73 и 78 (см. нумерацию в табл. 1). Таблица 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей, приводящее к созданию гумани- 11021356 зированной VH 280.46.3.4. В первой колонке (нумерация Кэбата) приведен номер остатка согласно Кэбату (Kabat et al. 1991). FR и CDR идентифицируют каркасные области (H-FR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4) и определяющие комплементарность области (H-CDR1, H-CDR2 и Н-CDR3) вариабельного домена тяжелой цепи, при этом указанные три CDR разделят четыре FR. Во второй колонке (нумерация Чотиа) приведен номер остатка в соответствии с определением CDR по Чотиа (Al-Lazikani et al. 1997). В третьей колонке (VH 280.46.3.4 мыши) приведена аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 280.46.3.4 мыши. В четвертой колонке (IGHV3-66) приведена аминокислотная последовательность иммуноглобулинового тяжелого вариабельного гена 3-66 человеческой зародышевой линии(регистрационный номер IMGT Х 92218), используемого в качестве человеческой акцепторной каркасной области для графтинга CDR. В пятой колонке (гуманизированный 280.VH3-66-46) приведена аминокислотная последовательность финального гуманизированного варианта VH 280.46.3.4 мыши; подчеркнутые остатки указывают аминокислоты, которые отличаются от человеческой зародышевой линии IGHV3-66. Таблица 1 В положении 27, 28, 29 и 30 в H-FR1 аминокислоты, присутствующие в человеческой зародышевой линии IGHV3-66, меняли на аминокислоты, присутствующие в тех же положениях в VH 280.46.3.4 мыши. Хотя указанные положения определяются как находящиеся в пределах H-FR1 (нумерация Кэбата; табл. 1), положения 26-30 являются частью структурной петли, которая формирует H-CDR1 петлю VH. Это вероятно обусловлено тем, что аминокислоты в этих положениях непосредственно участвуют в связывании с антигеном. Фактически, положения 27-30 являются частью канонической структуры для HCDR1, как определено Чотиа (табл. 1). В положениях 48 и 49 в H-FR2, аминокислоты, присутствующие в человеческой зародышевой линии IGHV3-66 (валин и серин, соответственно), меняли на аминокислоты, присутствующие в тех же положениях в VH 280.46.3.4 мыши (изолейцин и глицин, соответственно; табл. 1). Указанные два остатка очень близки к H-CDR2 и влияют на тонкую структуру петли CDR. В положениях 67, 69, 70, 73 и 78 в H-FR3 аминокислоты, присутствующие в человеческой зародышевой линии IGHV3.66 (фенилаланин, изолейцин, серин, аспарагин и лейцин, соответственно), меняли на аминокислоты, присутствующие в тех же положениях в VH 280.46.3.4 мыши (аланин, лейцин, треонин, глутамин и аланин, соответственно; табл. 1). Указанные 5 остатков важны при упаковке VL и VH доменов и наиболее вероятно влияют на общую стабильность антитела. В положении 71 в H-FR3, аргинин, присутствующий в человеческой зародышевой линии IGHV3-66,меняли на валин, присутствующий в том же положении в VH 280.46.3.4 мыши. Положение 71 является частью канонической структуры для H-CDR2, как определено Чотиа (табл. 1). Замена аргинина на валин в данном положении с высокой вероятностью могла бы привести к нарушению расположения петли HCDR2. Пример 3. Удаление свободного цистеина в CDR1 легкой цепи. В CDR1 легкой цепи (L-CDR1) в положении 32 по Кэбату (см. нумерацию в табл. 2) неспаренный цистеин, который ассоциировался с высоким уровнем образования ковалентного агрегата в ходе экспрессии и очистки гуманизированного антитела 280.46.3.4, включающего 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-C (данные не показаны). Табл. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей, приводящее к соданию гуманизированной VL 280.46.3.4. В первой колонке (нумерация Кэбата и Чотиа) приведен номер остатка по Кэбату(Kabat et al. 1991) и Чотиа (Al-Lazikani et al. 1997). FR и CDR идентифицируют каркасные области (LFR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4) и определяющие комплементарность области (L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3) вариабельного домена легкой цепи, при этом указанные три CDR разделяют четыре FR. Во второй колонке (VL 280.46.3.4 мыши) приведена аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи 280.46.3.4 мыши. В третьей колонке (IGKV4-1) приведена аминокислотная последовательность иммуноглобулинового каппа вариабельного гена 4-1 (регистрационный номер IMGT Z00023) человеческой зародышевой линии, используемого в качестве человеческой акцепторной каркасной области для графтинга CDR. В четвертой колонке (гуманизированное 280.VK4-1-TSY) приведена аминокислотная последовательность финального оптимизированного гуманизированного варианта VL 280.46.3.4 мыши; подчеркнутые остатки указывают аминокислоты, которые отличаются от IGKV4-1 человеческой зародышевой линии. Таблица 2 С целью удаления свободного цистеина создали и сконструировали второй вариант гуманизированной легкой цепи, 280.VK4-1-S, приведенный в SEQ ID NO: 31, в котором цистеин заменили на серин, что является наиболее консервативной заменой, возможной с учетом размера и гидрофильности. После очистки на белке А профиль антитела без цистеина (то есть гуманизированного антитела 280.46.3.4, включающего 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-S), в ДСН геле (фиг. 5) выглядел лучше, чем у антитела,содержащего цистеин (то есть гуманизированного антитела 280.46.3.4, включающего 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-C). Под лучшим профилем понимается, что тяжелая и легкая цепи были более правильно связаны, чем побочные продукты в антителе без неспаренного цистеина (280.VK4-1-S; "После" на фиг. 5), по сравнению с антителом, содержащим свободный цистеин (280.VK4-1-C; "До" на фиг. 5). Активность гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающий 280.VH3-66-1, спаренную с 280.VK4-1-S, оценивали в трех различных клеточных анализах. 1) Анализ фосфорилирования STAT3 в клетках гепатомы HepG2 человека. Линию клеток гепатомыHepG2 человека получали из АТСС (Американская коллекция типовых культур) и стимулировали рекомбинантным человеческим IL-22 в 24-луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител смешивали с IL-22 при ЕС 80 и добавляли к клеткам на 20 мин. Лизаты HepG2 тестировали при использовании набора PathScan Phospho-STAT3 для сэндвич-ELISA производства Cell Signaling с целью определения значения IC50 тестируемых антител. В данном анализе HepG2 гуманизированное антитело, как установили, было в 1,4 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом,которое содержит свободный цистеин и выделено из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 257,5 пМ и 370,5 пМ, соответственно (фиг. 6). 2) Анализ пролиферации в клетках BaF3. Линию клеток BaF3 трансфицировали обеими цепями IL22 рецептора человека (IL-22RA и IL-10RB) и культивировали с рекомбинантным человеческим IL-22 в 96-луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител добавляли к клеткам и определяли воздействие на пролиферацию BaF3 по измерению включения меченного тритием тимидина. В данном анализе на трансфицированной человеческим IL-22 рецептором стабильной линии клеток BaF3 гуманизированное антитело, как установили, было в 1,7 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, которое содержит свободный цистеин и выделено из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 340 и 587 пМ, соответственно(фиг. 7). 3) Анализ пролиферации в клетках BaF3. Линию клеток BaF3 трансфицировали обеими цепями мышиного IL22 рецептора (IL-22RA и IL-10RB) и культивировали с рекомбинантным мышиным IL-22 в 96-луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител добавляли к клеткам и определяли воздействие на пролиферацию BaF3 по измерению включения меченного тритием тимидина. В данном анализе на трансфицированной мышиным IL-22 рецептором стабильной линии клеток BaF3 гуманизированное антитело, как установили, было в 2,1 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, которое содержит свободный цистеин и выделено из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 693 и 1473 пМ, соответственно(фиг. 8). В заключение необходимо отметить, что мутация с заменой свободного цистеина в L-CDR1 существенно улучшила не только биофизические свойства, но также и активность гуманизированных антител 280.46.3.4, включающих 280.VH3-66.1, спаренную с 280.VK4-1-S как в отношении человеческого, так и мышиного IL-22RA, по сравнению с исходным мышиным антителом 280.46.3.4. Пример 4. Удаление деамидированного мотива в L-CDR1 и увеличение степени гуманизации в гуманизированных VH 280.46.3.4. Антитела могут быть подвергнуты ряду реакций химической модификации и/или расщепления, например дезамидированию, изомеризации, гидролизу, перестановке дисульфидных связей, бетаэлиминированию, окислению и образованию аддуктов. Главные гидролитические механизмы расщепления могут включать дезамидирование аспарагинов, в особенности, когда сразу после них расположены глицин или серин. Замена цистеина серином в L-CDR1 привела к созданию NS мотива, который образует потенциальный сайт дезамидирования и, таким образом, должен быть удален. В попытке разрушения указанного NS мотива сконструировали ряд мутантов (данные не показаны). Обнаружили, что наилучшей полной мутацией была замена серина на треонин. Такой мутированный вариабельный домен легкой цепи (280.VK4-1-Т), приведенный в SEQ ID NO: 32, спаривали с вариантом 4 гуманизированной VH 280.46.3.4 (280.VH3-66-4; см. ниже), и оценивали на активность ингибирования в клеточных анализах. В варианте 4 гуманизированной VH 280.46.3.4 (280.VH3-66-4) остаток 70 (табл. 1) подвергали мутации с заменой на остаток человеческой зародышевой линии, присутствующий в данном положении,мутации с заменой треонина на серин. Также последние два остатка H-CDR2, глутаминовую кислоту и аланин в положении 64 и 65 (табл. 1), подвергали мутации с заменой на остатки человеческой зародышевой линии, присутствующие в указанных положениях; лизин и глицин, соответственно. В целом, вариант 4 гуманизированной VH 280.46.3.4 (280.VH3-66-4), приведенный в SEQ ID NO: 33, имеет более трех остатков человеческой зародышевой линии по сравнению с вариантом 1 (280.VH3-66-1) с двумя такими остатками, которые расположены в H-CDR2 (фиг. 9 по сравнению с фиг. 4). Активность гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека и включающего 280.VH3-66-4, спаренную с 280.VK4-1-T, оценивали в трех различных клеточных анализах, как описано выше в примере 3. 1) В анализе HepG2 гуманизированное антитело, как установили, было в 1,8 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, выделенным из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 183,2 и 333,0 пМ, соответственно (фиг. 10). 2) В анализе трансфицированной IL-22-рецептором человека стабильной линии клеток BaF3 гуманизированное антитело, как установили, было в 1,75 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, выделенным из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 334 и 587 пМ, соответственно (фиг. 11). 3) В анализе трансфицированной мышиным IL-22-рецептором стабильной линии клеток BaF3 гуманизированное антитело, как установили, было в 2,1 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, выделенным из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 687 и 1473 пМ, соответственно (фиг. 12). Пример 5. Мутация остатка 32 по Кэбату с заменой Asp на Glu в CDR1 гуманизированной VH 280.46.3.4 приводит к повышению аффинности и улучшению стабильности Антитела могут быть подвергнуты различным реакциям химической модификации и/или расщепления, например, дезамидированию, изомеризации, гидролизу, перестановке дисульфидных связей, бета-элиминированию, окислению и образованию аддуктов. Главные гидролитические механизмы расщепления могут включать изомеризацию аспарагиновой кислоты (Asp). Для устранения данной проблемы создали ряд мутантов, в которыхAsp 32 в H-CDR1 и Asp 96 в H-CDR3 были отдельно мутированы в 280.VH3-66-4. Указанные одиночные мутанты затем спаривали с гуманизированным вариабельным доменом легкой цепи 280.VK4-1-T, описанным выше, и полученные NiNTA-очищенные Fab фрагменты антитела тестировали с помощьюBiacore, измеряющего связывание с человеческим IL-22RA, представленного на фиг. 13, показывают, что мутация D32E повышала скорость ассоциации приблизительно в 2 раза и уменьшала скорость диссоциации примерно в 5 раз по сравнению с исходным немутированным D32 (280.VH3-66-4). С другой стороны, мутация D96E оказала отрицательное воздействие, уменьшив аффинность примерно в 500 раз. Мутант D32 при анализе дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) оказался более стабильным на 1 градус, чем исходное антитело D32 (фиг. 14). В целом можно сделать вывод, что мутация D32E существенно улучшает свойства последнего гуманизированного варианта 18 тяжелой цепи (280.VH3-6618). Активность гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66.18, спаренную с 280.IGKV4-1, оценивали в анализе на клетках HepG2. Результаты,представленные на фиг. 15, показывают, что гуманизированное антитело (280.VH3-66.18/VK4-1-T) почти в 3 раза более активно по сравнению с исходным мышиным антителом, выделенным из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 132,5 и 370,5 пМ,соответственно. Пример 6. Увеличение степени гуманизации.A. Тяжелая цепь. После повышения аффинности, активности и стабильности гуманизированного 280.46.3.4 по сравнению с исходным 280.46.3.4 мыши был создан ряд мутантов в попытке увеличения гуманизации финального гуманизированного варианта. Цель состояла в том, чтобы подвергнуть мутации столько остатков каркасной области, содержащихся в исходных мышиных последовательностях, сколько возможно, с их заменой обратно на соответствующие остатки IGHV3-66 человеческой зародышевой линии. В ходе данного процесса авторы изобретения смогли успешно провести обратную мутацию остатков Ala 67 иLeu 69 на остатки Phe и Ile, соответственно (табл. 1). Также было установлено, что введение изолейцина в положение 29 вместо присутствующего в IGHV3-66 человеческой зародышевой линии валина оказало положительное влияние на термическую стабильность (данные не показаны). Несмотря на то что остатокIle 29 обычно не присутствует в данном положении в IGHV3-66 человеческой зародышевой линии (Val 29), из-за его положительного влияния на стабильность без потери активности было решено ввести его в финальный гуманизированный вариант VH 46 (280.VH3-66-46), приведенный в SEQ ID NO: 16. Выравнивание последовательности финального гуманизированного варианта VH, 280.VH3-66-46, с IGHV3-66 человеческой зародышевой линии показало, что 9 каркасных остатков мыши были сохранены (фиг. 16 и табл. 1).B. Легкая цепь. В гуманизированной легкой цепи, поскольку все каркасные остатки являются человеческими, исследовали возможность гуманизации остатков CDR. Ряд мутантов с заменами в остатках CDR мыши сконструировали, подвергнув мутации отдельные остатки CDR с заменой на остатки IGKV4-1 человеческой зародышевой линии, присутствующие в эквивалентном положении. Мутанты подвергали скринингу с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии и Biacore, исследуя их на термическую стабильность и аффинность, соответственно. Установили, что Phe в положении 92 в L-CDR3 (табл. 2) можно было заменить остатком Tyr, присутствующим в данном положении в IGKV4-1 человеческой зародышевой линии с улучшением термической стабильности на 1 градус Цельсия и при этом без потери аффинности. Полученная оптимизированная гуманизированная последовательность VL, обозначеная 280.VK4-1-TSY, приведена в SEQ ID NO: 17. Ее выравнивание с IGKV4-1 человеческой зародышевой линии, показанное на фиг. 17, указывает, что 280.VK4-1-TSY обладает очень высокой идентичностью по отношению к полной последовательности IGKV4-1 зародышевой линии, включая остатки каркасных областей и CDR, поскольку указанные последовательности отличаются только по 5 положениям (фиг. 17 и табл. 2). Все указанные выше гуманизированные антитела были получены путем соединения определенного вариабельного домена тяжелой цепи с константной областью, приведенной в SEQ ID NO: 18, и определенного вариабельного домена легкой цепи с константным доменом, приведенным в SEQ ID NO: 19. Необходимо отметить, что указанные константные области использовались в качестве примера и могут быть легко заменены другими, поскольку аффинность и специфичность связывания антител зависит от вариабельных доменов. Что касается вышеуказанных Fab, они включают последовательность первого константного домена тяжелой цепи (СН 1), приведенную в SEQ ID NO: 18, и константный домен легкой цепи, приведенный в SEQ ID NO: 19. Различные гуманизированные антитела и Fab, упомянутые в примерах, были получены в клетках СНО с применением одного вектора экспрессии, который включает последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи под контролем двух различных промоторов. Пример 7. Активность гуманизированных VH 280.VH3-66-46, спаренных с VL 280.VK4-1-TSY в анализах на клетках, экспрессирующих человеческий IL-22RA. Активность гуманизированного антитела, экспрессированного как IgG1/каппа человека, включающего 280.VH3-66.46, спаренную с 280.IGKV4-1-TSY, оценивали в трех различных клеточных анализах. Термин "280.34 6.TSY" в дальнейшем используется для обозначения гуманизированного антитела противIL-22RA человека, включающего 280.VH3-66.46, спаренную с 280.IGKV4-1-TSY, независимо от константных областей тяжелой и легкой цепи. 1) Анализ фосфорилирования STAT3 в нормальных человеческих кератиноцитах. Нормальные человеческие кератиноциты получали от Biopredic International и стимулировали рекомбинантным человеческим IL-22 в 96-луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител смешивали с IL-22 при EC80 и добавляли к клеткам на 20 мин. Лизаты кератиноцитов тестировали при использовании набора PathScan Phospho-STAT3 для сэндвич-ELISA производства Cell Signaling с целью определения значения IC50 тестируемых антител. В данном анализе на нормальных человеческих кератиноцитах 280.346.TSY, как установили, было почти в 9 раз более активным по сравнению с исходным мышиным антителом, выделенным из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 60,95 и 541,9 пМ, соответственно (фиг. 18). 2) Анализ фосфорилирования STAT3 в клетках HepG2. Линию клеток гепатомы человека HepG2 получали от АТСС (Американская коллекция типовых культур) и стимулировали рекомбинантным человеческим IL-22 в 24-луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител смешивали с IL-22 при ЕС 80 и добавляли к клеткам на 20 мин. Лизаты HepG2 анализировали с помощью набора PathScan Phospho-STAT3 для сэндвич-ELISA производства Cell Signaling с целью определения значения IC50 тестируемых антител. В данном анализе HepG2, 280.346.TSY, как установили, было почти в 5 раз более активным по сравнению с исходным мышиным антителом, выделенным из гибридомы 28 0.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 55,16 и 266,3 пМ,соответственно (фиг. 19). 3) Анализ пролиферации в клетках BaF3. Линию клеток BaF3 трансфицировали обеими цепями IL22-рецептора человека (IL-22RA и IL-10RB) и культивировали с рекомбинантным человеческим IL-22 в 96-луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител добавляли к клеткам и определяли влияние на пролиферацию BaF3 по измерению включения меченного тритием тимидина. В данном анализе на трансфицированной IL-22-рецептором человека стабильной линии клеток BaF3,280.346.TSY, как установили, было в 1,7 раза активным по сравнению с исходным мышиным антителом,выделенным из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 317 и 545 пМ, соответственно (фиг. 20). Аминокислотная последовательность константных областей тяжелой и легкой цепи конкретного 280.346.TSY приведена в SEQ ID NO: 18 и 19, соответственно, а аминокислотная последовательность всей тяжелой и легкой цепи указанного конкретного 280.346.TSY приведена в SEQ ID NO: 20 и 21, соответственно. Пример 8. Активность гуманизированного 280.346.TSY в анализах на клетках, экспрессирующих мышиный IL-22RA. Активность 280.346.TSY оценивали в двух различных клеточных анализах. 1) Анализ фосфорилирования STAT3 в клетках HEPA1-6. Линию клеток гепатомы НЕРА 1-6 получали из DSMZ (Коллекция микроорганизмов и клеточных культур Германии) и стимулировали рекомбинантным мышиным IL-22 в 96-луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител смешивали с IL-22 при ЕС 80 и добавляли к клеткам на 20 мин. Человеческий IgG1 использовали в качестве контроля. Лизаты НЕРА 1-6 анализировали с использованием набора PathScan Phospho-STAT3 для сэндвич-ELISA производства Cell Signaling с целью определения значения IC50 тестируемых антител. В данном анализе на клетках НЕРА 1-6, 280.346.TSY, как установили, ингибировал активность мышиногоIL-22 с IC50 в наномолярном диапазоне (2,1 нМ; фиг. 21). 2) Анализ пролиферации в клетках BaF3. Линию клеток BaF3 трансфицировали обеими мышиными цепями IL-22-рецептора (IL-22RA и IL-10RB) и культивировали с рекомбинантным мышиным IL-22 в 96 луночных планшетах. Последовательные разведения нейтрализующих антител добавляли к клеткам и определяли влияние на пролиферацию BaF3 по измерению включения меченного тритием тимидина. В данном анализе на трансфицированных мышиным IL-22-рецептором стабильных линиях клеток BaF3,280.346.TSY, как установили, было в 6,2 раз более активным по сравнению с исходным мышиным антителом, выделенным из гибридомы 280.46.3.4 (обозначение в патентном депозитарии АТСС РТА-6284), со значениями IC50 137 и 849 пМ, соответственно (фиг. 22). Пример 9. Селективность связывания 280.346.TSY по отношению к IL-22RA-подобным белкам в конкурентном ELISA. Специфичность и аффинность связывания 280.346.TSY определяли, используя конкурентный ELISA. Микротитровальные планшеты покрывали человеческим IL-22RA-ECD (то есть IL-22RAвнеклеточный домен). Биотинилированное антитело 280-346-TSY добавляли в планшет в присутствии конкурентов: человеческого альфа-рецептора интерлейкина 22 (hIL-22RA), связывающего человеческийIL-10 (hI-10R) и человеческого альфа-рецептора IL-20 (hIL-20R). Связывание с hIL-22RA, нанесенным на планшеты, определяли путем добавления стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой. Измеренные значения IC50 для рекомбинантного человеческого и мышиного IL-22RA составили 18,25 пМ и 149,3 пМ, соответственно (фиг. 23). Моноклональное антитело не проявляло перекрестной реактивности с рекомбинантными человеческими IL-22BP, IL-10R и IL-20R. Пример 10. Перекрестная реактивность 280-346-TSY против ортологов IL-22RA согласно оценке при измерении Kd с помощью KinExA и Biacore. Значение Kd 280-346-TSY оценивали, используя приборы Biacore и KinExA. Внеклеточные доменыIL-22RA (ECD) последовательностей человеческих и гомологичных генов, обнаруженных у различных видов (крыса, мышь, собака, макак-резус, яванский макак и игрунка), были получены в клетках НЕК-293 и очищены на NiNTA с использованием 6-His метки. Антитело 280-346-TSY обладает субнаномолярной аффинностью в отношении протестированного человеческого IL-22RA и IL-22RA всех трех видов обезьян. Оно обладает наномолярной аффинностью к мышиному IL-22RA, которая приблизительно в 100 раз ниже, чем к человеческому, и микромолярной аффинностью к крысиному IL-22RA (табл. 3). Таблица 3. Измерение Kd аффинности моноклонального антитела 280-346-TSY в отношении человече- 20021356 Пример 11. Эффективность 280-346-TSY в отношении IL-22-индуцированного сывороточного амилоида А у мышей. Фармакодинамическую активность 280-346-TSY определяли в отношении IL-22-индуцированного сывороточного амилоида А у самцов мышей Balb/c. Различные дозы 280.346.TSY вводили подкожно за 22 ч до внутривенной инъекции рекомбинантного мышиного IL-22. Контрольной средой являлся PBS,который вводили подкожно в количестве 10 мл/кг. Мышам давали 100 мкг/кг IL-22 в ретроорбитальное сплетение под анастезией изофлураном. Забор крови производили через 6 ч после инъекции IL-22 посредством пункции сердца под анастезией изофлураном. Человеческий IgG1 использовали в качестве отрицательного контроля (контрольный изотип). Сывороточный амилоид А определяли с помощью ELISA (Biosource). 280-346-TSY дало значение ED50 0,5 мг/кг. Для выполнения статистического анализа использовали критерий Манна-Уитни: р 0,05 в сравнении с группой контрольного изотипа; р 0,001 в сравнении с группой контрольного изотипа (фиг. 24). Пример 12. Эффективность 280-346-TSY при IL-23-индуцированном воспалении уха у мышей. Фармакодинамическую активность 280-346-TSY определяли в модели псориаза на мышах. Исследовали эффективность 280-346-TSY при опухании уха, индуцированного IL-23 у самок мышей C57BL/6. Мышам вводили 500 нг рекомбинантного человеческого IL-23 или PBS в общем объеме 20 мкл через день в течение 14 дней, как описано Zheng Y et al. (Nature 2007). Различные дозы 280.346.TSY вводили подкожно через день, причем первую дозу вводили перед первым введением рекомбинантного IL-23. Контрольной средой являлся PBS, который вводили подкожно в количестве 10 мл/кг. Дексаметазон(Dexa) использовали в качестве положительного контроля. Процент ингибирования вычисляли в день 9,что соответствовало пику опухания уха. 280-346-TSY дало значение ED50 1,8 мг/кг (фиг. 25).