Имидазопиразиновые ингибиторы syk, фармацевтическая композиция, содержащая имидазопиразиновые ингибиторы syk, и способы их применения

ИМИДАЗОПИРАЗИНОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ Syk, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ИМИДАЗОПИРАЗИНОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ Syk, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В изобретении предложены конкретные имидазопиразины и их фармацевтические композиции. Предложены способы лечения пациентов, страдающих определенными заболеваниями и расстройствами, чувствительными к подавлению активности Syk, включающие введение указанным пациентам количества по меньшей мере одного химического соединения, эффективного для ослабления признаков или симптомов заболевания или расстройства. Также предложены способы определения присутствия или отсутствия Syk-киназы в образце. Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США 61/120590, поданной 8 декабря 2008 г., предварительной заявке на патент США 61/140535, поданной 23 декабря 2008 г., и предварительной заявке на патент США 61/240983, поданной 9 сентября 2009 г., каждая из которых включена в настоящее изобретение посредством ссылки. Согласно настоящему изобретению предложены имидазопиразины, композиции и способы их получения и применения. Протеинкиназы - самое большое семейство ферментов человека - включают более 500 белков. Тирозинкиназа селезенки (Spleen Tyrosine Kinase, Syk) является представителем семейства тирозинкиназSyk и является регулятором раннего развития В-клеток, а также активации, передачи сигнала и выживания зрелых В-клеток.Syk представляет собой нерецепторную тирозинкиназу, которая играет ключевую роль в опосредуемой иммунорецепторами и интегринами передаче сигнала в различных типах клеток, включая Вклетки, макрофаги, моноциты, тучные клетки, эозинофилы, базофилы, нейтрофилы, дендритные клетки,Т-клетки, естественные клетки-киллеры, тромбоциты и остеокласты. Иммунорецепторы, описанные в настоящем изобретении, включают классические иммунорецепторы и подобные иммунорецепторам молекулы. Классические иммунорецепторы включают рецепторы антигенов В-клеток и Т-клеток, а также различные рецепторы иммуноглобулинов (Fc-рецепторы). Подобные иммунорецепторам молекулы либо родственны иммунорецепторам по структуре, либо участвуют в аналогичных путях передачи сигнала и главным образом вовлечены во врожденные иммунные функции, включая активацию нейтрофилов, распознавание естественных клеток-киллеров и активность остеокластов. Интегрины представляют собой рецепторы на поверхности клетки, которые играют ключевую роль в регуляции адгезии и активации лейкоцитов в системе как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Связывание лиганда вызывает активацию иммунорецепторов и интегринов, что приводит к активации киназ семейства Src и фосфорилированию иммунорецепторных тирозин-активируемых мотивов(ITAM), расположенных на поверхности ассоциированных с рецепторами трансмембранных адапторных белков со стороны цитоплазмы. Тирозинкиназа Syk связывается с фосфорилированными мотивами ITAM адапторных белков, вызывая активацию Syk и последующее фосфорилирование и активацию нисходящих сигнальных путей. Тирозинкиназа Syk необходима для активации В-клеток при передаче сигнала через В-клеточный рецептор (BCR). Syk активируется при связывании с фосфорилированным рецептором BCR и, таким образом, инициирует ранние события сигнального каскада, следующие за активацией BCR. Передача сигнала В-клетками через BCR может вызывать широкий спектр биологических ответов, которые, в свою очередь, зависят от стадии развития В-клеток. Величина и продолжительность сигналов BCR должны точно регулироваться. Отклонения в BCR-опосредованной передаче сигнала могут вызывать нерегулируемую активацию В-клеток и/или формирование патогенных аутоантител, приводя к развитию многочисленных аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний. У мышей, у которых отсутствует Syk,наблюдаются нарушение процессов созревания В-клеток, снижение выработки иммуноглобулинов, нарушение независимых от Т-клеток иммунных ответов и выраженное ослабление непрерывного тока кальция при стимуляции BCR. Многочисленные данные подтверждают роль В-клеток и гуморальной иммунной системы в патогенезе аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний. Терапевтические средства на основе белков (такие как ритуксан), разработанные для подавления В-клеток, представляют собой один из подходов к лечению ряда аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Аутоантитела и образующиеся иммунные комплексы на их основе, как известно, играют роль патогенов в аутоиммунном заболевании и/или воспалительном заболевании. Патогенный ответ на эти антитела зависит от передачи сигнала через Fcрецепторы, которая, в свою очередь, зависит от Syk. Благодаря участию Syk в активации В-клеток, наряду с зависимой от FcR передачей сигнала, ингибиторы Syk могут подходить для использования в качестве ингибиторов опосредуемой В-клетками патогенной активности, включая выработку аутоантител. Соответственно подавление ферментативной активности Syk в клетках предложено в качестве лечения аутоиммунного заболевания за счет действия Syk на выработку аутоантител.Syk также играет ключевую роль в опосредуемой FCRI дегрануляции тучных клеток и активации эозинофилов. Таким образом, Syk вовлечена в аллергические расстройства, включая астму. Syk связывается с фосфорилированной гамма-цепью FCRI через ее SH2-домены и необходима для дальнейшей передачи сигнала. В тучных клетках с дефицитом Syk наблюдаются нарушения процессов дегрануляции,секреции арахидоновой кислоты и цитокинов. Такие же результаты были получены при использовании фармакологических агентов, подавляющих активность Syk в тучных клетках. Обработка Syk антисмысловыми олигонуклеотидами приводит к подавлению антиген-индуцированной инфильтрации эозинофилов и нейтрофилов в моделях астмы у животных. В эозинофилах с дефицитом Syk также наблюдаются нарушения процессов активации в ответ на стимуляцию FCRI. Следовательно, низкомолекулярные ингибиторы Syk-киназы могут применяться при лечении воспалительных заболеваний аллергической природы, включая астму.Syk также экспрессируется в тучных клетках и моноцитах и, как было показано, необходима для функционирования этих клеток. Например, дефицит тирозинкиназы Syk у мышей связан с нарушением опосредованной IgE активации тучных клеток, которая характеризуется снижением уровня ФНО-альфа и высвобождением других воспалительных цитокинов. Также было показано, что ингибиторы Syk подавляют дегрануляцию тучных клеток в клеточных анализах. Кроме того, было показано, что ингибиторыSyk подавляют вызванную антигеном пассивную кожную анафилаксию, бронхостеноз и отек бронхов у крыс. Таким образом, подавление активности Syk можно применять для лечения аллергических расстройств, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний, таких как системная красная волчанка (SLE, СКВ), ревматоидный артрит, множественный васкулит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), миастения гравис, аллергический ринит, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), респираторный дистресс-синдром у взрослых (РДСВ) и астма. Кроме того, сообщалось,что Syk играет важную роль в лиганд-независимой тонической передаче сигнала через В-клеточный рецептор, который, как известно, является важным сигналом выживаемости В-клеток. Таким образом, подавление активности Syk можно применять при лечении определенных типов рака, включая Вклеточную лимфому и лейкемию. Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемым солям,где R1 означает (2-метил-2-гидроксипропокси)пиридин-6-ил, (2-метоксиэтокси)пиридинил, 2(диметиламино)этокси-3-пиридинил, гидроксиэтокси-5-пиридинил, (3-метил-3-гидроксиазетидин)пиридин-3-ил, (3-метил-3-гидроксиазетидин)пиридин-2-ил, (3-гидроксиазетидин)пиридин-2-ил, (гидрокси(диметилэтил-5-пиридинил, (4-метил-4-гидроксипиперидин)пиридин-2-ил, (3-метил-3-гидроксипиперидин)пиридин-2-ил,5-морфолинопиридин-2-ил,6-морфолинопиридин-3-ил,2-метоксиэтил)(метил)амино)пиридин-5-ил, 2-гидроксиэтил)(метил)амино)пиридин-5-ил, 2-метокси-4-пиридинил и 2-гидрокси-5-пиридинил, (2-гидроксиэтил)-1H-пиразол-4-ил, (2-гидроксипропил)-1 Н-пиразол-4-ила,(2-метоксиэтил)-1 Н-пиразол-4-ил, 1-этил-1 Н-пиразол-4-ил, 1-изопропил-1H-пиразол-4-ил, 3-циклопропил-1 Н-пиразол-5-ил и 1-этил-5-метил-1H-пиразол-3-ил,1 Н-бензо[d]имидазол-6-ил,1 Нбензо[d]имидазол-5-ил, 1 Н-индазол-6-ил, 1 Н-индазол-5-ил, 1-метил-1 Н-бензо[d]имидазол-6-ил, бензоксазол-6-ил, бензоксазол-5-ил, имидазо[1,2-а]пиридин-6-ил, 1 Н-индол-6-ил, 1 Н-индол-5-ил, бензотиазол 6-ил и бензотиазол-5-ил;R5 означает водород. Кроме того, объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний, чувствительных к подавлению активности Syk, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, выбранный из группы, состоящей из носителей, адъювантов и вспомогательных веществ. Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения человека, страдающего заболеванием, чувствительным к подавлению активности Syk, включающий введение человеку соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли. В предпочтительном варианте эффективное количество указанного соединения вводят человеку способом, выбранным из внутривенного, внутримышечного и парентерального введения. Еще более предпочтительно пероральное введение. Заболевание, чувствительное к подавлению активности Syk, может представлять собой рак, Вклеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, лейкоз ворсистых клеток, множественную миелому, хроническую миелогенную лейкемию, острую миелогенную лейкемию, хронический лейкоцитарный лейкоз и острый лейкоцитарный лейкоз, а также ревматоидный артрит, аллергический ринит, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), респираторный дистресс-синдром у взрослых (РДСВ), вызванное аллергией воспалительное заболевание, рассеянный склероз, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание, острую воспалительную реакцию, аллергическое заболевание или поликистозную болезнь почек. Другим объектом настоящего изобретения является способ определения присутствия Syk в образце,включающий приведение образца в контакт с соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью в условиях, позволяющих проводить определение активности Syk и определение уровня активности Syk в образце, и на основании полученных данных определение присутствия или отсутствия Syk в образце. Другим объектом настоящего изобретения является способ подавления активности В-клеток, включающий приведение клеток, экспрессирующих Syk, в контакт с соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью в количестве, достаточном для поддающегося обнаружению снижения активности В-клеток in vitro. Другим объектом настоящего изобретения является способ подавления гидролиза АТФ, включающий приведение клеток, экспрессирующих Syk, в контакт с соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью в количестве, достаточном для поддающегося обнаружению снижения уровня гидролиза АТФ in vitro. Другим объектом настоящего изобретения является способ подавления активности В-клеток у нуждающегося в этом человека, включающий введение человеку соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли. Другим объектом настоящего изобретения является способ подавления гидролиза АТФ у нуждающегося в этом человека, включающий введение человеку соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли. Химические соединения включают (но не ограничиваются указанными) соединения, описанные в настоящем изобретении и все их фармацевтически приемлемые формы. Следовательно, термины "химическое соединение" и "химические соединения" также включают фармацевтически приемлемые соли."Фармацевтически приемлемые соли" включают (но не ограничиваются указанными) соли, образованные с неорганическими кислотами, такие как гидрохлорат, фосфат, дифосфат, гидробромат, сульфат,сульфинат, нитрат, и подобные соли; а также соли, образованные с органической кислотой, такие как малат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, цитрат, ацетат, лактат, метансульфонат, п-толуолсульфонат,2-гидроксиэтилсульфонат, бензоат, салицилат, стеарат и алканоат, такой как ацетат, НООС-(СН 2)nСООН, где n равен 0-4, и подобные соли. Аналогично, фармацевтически приемлемые катионы включают(но не ограничиваются указанными) натрий, калий, кальций, алюминий, литий и аммоний. Кроме того, в тех случаях, когда соединения, описанные в настоящем изобретении, представляют собой соль присоединения кислоты, при этом свободное основание может быть получено путем ощелачивания раствора кислой соли. Напротив, если продукт представляет собой свободное основание, соль присоединения, в частности фармацевтически приемлемая соль присоединения, может быть получена путем растворения свободного основания в подходящем органическом растворителе и обработки раствора кислотой в соответствии со стандартными способами получения солей присоединения кислоты из основных соединений. Специалистам в данной области известны различные синтетические методы, которые могут использоваться для получения нетоксичных фармацевтически приемлемых солей присоединения. Термин "водородная связь" относится к форме связи между электроотрицательным атомом (также известным как акцептор водородной связи) и атомом водорода, связанным с другим, относительно электроотрицательным атомом (также известным как донор водородной связи). Подходящие донор и акцепторы водородной связи хорошо известны в области медицинской химии (G.С. Pimentel and A.L. McClellan, The Hydrogen Bond, Freeman, San Francisco, 1960; R. Taylor and O. Kennard, "Hydrogen Bond Geometry"Акцептор водородной связи" относится к группе, включающей кислород или азот, в частности кислород или азот, который является sp2-гибридизованным, кислород простого эфира или кислород сульфоксида или N-оксида. Термин "донор водородной связи" относится к кислороду, азоту или углероду в гетероароматическом кольце, который связан с содержащей водород группой, включающей атом азота в кольце, или гетероарильой группой, содержащей атом азота в кольце. В настоящем изобретении термины "группа", "радикал" или "фрагмент" являются синонимами и предназначены для обозначения функциональных групп или фрагментов молекул, способных присоединяться к связи или к другим фрагментам молекул. Термин "активный агент" используется для обозначения химического соединения, которое проявляет биологическую активность. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения "активный агент" представляет собой соединение, имеющее фармацевтическую полезность. Например, активный агент может представлять собой противораковое терапевтическое средство. Термин "терапевтически эффективное количество" при употреблении в отношении описанного в настоящем изобретении химического соединения означает количество, достаточное при введении паци-3 021293 енту, представляющему собой человека или не являющемуся человеком, для обеспечения терапевтического благоприятного эффекта, такого как ослабление симптомов, замедление прогрессирования заболевания или предупреждение развития заболевания, например терапевтически эффективное количество может представлять собой количество, достаточное для ослабления симптомов заболевания, чувствительного к подавлению активности Syk. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для ослабления симптомов рака, симптомов аллергического заболевания, симптомов аутоиммунного и/или воспалительного заболевания или симптомов острой воспалительной реакции. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для снижения количества выявляемых раковых клеток в организме, поддающегося определению снижения или остановки роста раковой опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для уменьшения раковой опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации у пациента, страдающего раком, могут не проявляться симптомы заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения терапевтически эффективное количество химического соединения представляет собой количество, достаточное для предотвращения значительного повышения или для значительного снижения количества выявляемых раковых клеток или маркеров рака в крови, сыворотке или тканях пациента. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество может также представлять собой количество, достаточное при введении пациенту для выявляемого замедления прогрессирования заболевания или предотвращения проявления симптомов аллергического заболевания, и/или аутоиммунного, и/или воспалительного заболевания, и/или острой воспалительной реакции у пациента, получающего указанное химическое соединение. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество может также представлять собой количество, достаточное для выявляемого снижения количества маркерного белка или типа клеток в крови или сыворотке пациента. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения терапевтически эффективное количество представляет собой количество химического соединения, описанного в настоящем изобретении, достаточное для значительного снижения активности В-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения терапевтически эффективное количество представляет собой количество химического соединения, описанного в настоящем изобретении,достаточное для значительного снижения количества В-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения терапевтически эффективное количество представляет собой количество химического соединения, описанного в настоящем изобретении, достаточное для снижения уровня антител против ацетилхолиновых рецепторов в крови пациента, страдающего миастенией гравис. Термин "подавление" относится к значительному снижению исходного уровня биологической активности или процесса. "Подавление активности Syk" относится к непосредственному или опосредованному снижению активности Syk в ответ на присутствие по меньшей мере одного описанного в настоящем изобретении химического соединения по сравнению с активностью Syk в отсутствие указанного по меньшей мере одного химического соединения. Снижение активности может происходить в результате непосредственного взаимодействия соединения с Syk или в результате взаимодействия описанного в настоящем изобретении химического соединения (соединений) с одним или более другими факторами, которые, в свою очередь, влияют на активность Syk. Например, присутствие указанного химического соединения (соединений) может снижать активность Syk путем непосредственного связывания с Syk, путем стимуляции (непосредственной или опосредованной) другого фактора для снижения активности Syk или путем снижения (непосредственно или опосредованно) количества Syk, присутствующего в клетке или организме. Подавление активности Syk также относится к поддающемуся определению подавлению активности Syk в стандартном биохимическом анализе активности Syk, таком как анализ гидролиза АТФ, описанный ниже. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение, описанное в настоящем изобретении, имеет значение IC50, меньшее или равное 1 мкмоль. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение имеет значение IC50, меньшее или равное меньше чем 100 нмоль. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение имеет значение IC50, меньшее или равное 10 нмоль. Термин "подавление активности В-клеток" относится к непосредственному или опосредованному снижению активности В-клеток в ответ на присутствие по меньшей мере одного химического соединения, описанного в настоящем изобретении, по сравнению с активностью В-клеток в отсутствии указанного по меньшей мере одного химического соединения. Снижение активности может происходить в результате непосредственного взаимодействия соединения с Syk или с одним или более другими факторами, которые, в свою очередь, влияют на активность В-клеток. Подавление активности В-клеток также относится к поддающемуся определению подавлению экспрессии CD86 в стандартом анализе, таком как анализ, описанный ниже. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение, описанное в настоящем изобретении, имеет значениеIC50, меньшее или равное 10 мкмоль. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение имеет значение IC50, меньшее или равное менее чем 1 мкмоль. Согласно некоторым ва-4 021293 риантам реализации изобретения химическое соединение имеет значение IC50, меньшее или равное 500 нмоль. Термин "активность В-клеток" также включает активацию, перераспределение, реорганизацию или кэппинг одного или более из различных мембранных рецепторов В-клеток или мембран-связанных иммуноглобулинов, например иммуноглобулинов IgM, IgG и IgD. Большинство В-клеток также имеет мембранный рецептор для Fc-фрагмента IgG в виде комплексов антиген-антитело или агрегированного IgG. В-клетки также имеют мембранные рецепторы для активированных компонентов комплемента, например C3b, C3d, C4 и CIq. Эти различные мембранные рецепторы и мембранно-связанные иммуноглобулины обладают мембранной подвижностью, и возможно их перераспределение и кэппинг, который может инициировать передачу сигнала. Активность В-клеток также относится к синтезу или продукции антител, или иммуноглобулинов. Иммуноглобулины синтезируются группами В-клеток и имеют общие структурные особенности и одинаковые структурные единицы. Пять классов иммуноглобулинов, т.е. IgG, IgA, IgM, IgD и IgE, распознаются на основе структурных отличий их тяжелых цепей, включая аминокислотную последовательность и длину полипептидной цепи. Антитела к конкретному антигену могут относиться ко всем или некоторым классам иммуноглобулинов или же могут ограничиваться единственным классом или подклассом иммуноглобулинов. Аутоантитела, или аутоиммунные антитела, также могут принадлежать к одному или нескольким классам иммуноглобулинов. Например, ревматоидные факторы (антитела к IgG) наиболее часто определяются как иммуноглобулины IgM, но могут также представлять собой IgG илиIgA. Кроме того, активность В-клеток также относится к ряду событий, приводящих к клональной экспансии В-клеток (пролиферации) из В-лимфоцитов-предшественников и дифференцировке в синтезирующие антитела плазматических клеток, которая происходит при связывании антигена и поступлении цитокиновых сигналов от других клеток."Подавление пролиферации В-клеток" относится к подавлению пролиферации аномальных Вклеток, таких как раковые В-клетки, например В-клеточной лимфомы, и/или подавлению нормальных здоровых В-клеток. Термин "подавление пролиферации В-клеток" относится к любому значительному снижению количества В-клеток либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, подавление пролиферации Вклеток in vitro представляет собой любое значительное снижение количества В-клеток in vitro в образце,подвергавшимся взаимодействию по меньшей мере с одним химическим соединением, описанным в настоящем изобретении, по сравнению с эквивалентным образцом, не подвергавшимся взаимодействию с указанным химическим соединением (соединениями). Подавление пролиферации В-клеток также относится к поддающемуся определению подавлению пролиферации В-клеток в стандартном анализе пролиферации В-клеток, основанном на включении тимидина, таком как анализ, описанный в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение имеет значение IC50, меньшее или равное 10 мкмоль. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение имеет значение IC50, меньшее или равное меньше чем 1 мкмоль. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химическое соединение имеет значение IC50, меньшее или равное 500 нмоль. Термин "аллергия" или "аллергическое заболевание" относится к приобретенной гиперчувствительности к веществу (аллергену). Аллергические заболевания включают экзему, аллергический ринит или насморк, сенную лихорадку, бронхиальную астму, аллергическую сыпь (крапивницу), пищевые аллергии и другие атопические состояния. Термин "астма" относится к расстройству дыхательной системы, характеризующемуся воспалением, сужением воздухоносных путей и повышением реактивности воздухоносных путей при взаимодействии с вдыхаемыми агентами. Астма часто, хотя и не обязательно, связана с атопическими или аллергическими симптомами. Под термином "значительный" подразумевают любое выявляемое изменение, которое является статистически достоверным в стандартном параметрическом тесте статистической достоверности, таком как критерий Стьюдента, где р 0,05."Заболевание, чувствительное к подавлению активности Syk" представляет собой заболевание, при котором подавление активности Syk обеспечивает благоприятный терапевтический эффект, такой как облегчение симптомов, снижение прогрессирования заболевания, предотвращение или задержка развития заболевания или подавление абберантной активности определенных клеточных типов (моноцитов, Вклеток и тучных клеток). Термин "проведение лечения" или "лечение" обозначает любое лечение заболевания у пациента,направленное на:a) предотвращение заболевания, то есть препятствие развитию клинических симптомов заболевания;c) замедление или сдерживание развития клинических симптомов и/илиd) облегчение заболевания, то есть обеспечение регрессии клинических симптомов. Термин "пациент" относится к животному, такому как млекопитающее, которое является или предполагается в качестве объекта для лечения, наблюдения или исследования. Способы, описанные в настоящем изобретении, могут найти применение для терапии у людей, а также применяться в ветеринарии. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения пациент представляет собой млекопитающее; согласно некоторым вариантам реализации изобретения пациент представляет собой человека; согласно некоторым вариантам реализации изобретения пациент представляет собой кошку или собаку. В настоящем изобретении предложено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемые соли,где R1 означает (2-метил-2-гидроксипропокси)пиридин-6-ил, (2-метоксиэтокси)пиридинил,2-(диметиламино)этокси-3-пиридинил,гидроксиэтокси-5-пиридинил,(3-метил-3-гидроксиазетидин)пиридин-3-ил, (3-метил-3-гидроксиазетидин)пиридин-2-ил, (3-гидроксиазетидин)пиридин-2-ил,(гидрокси(диметилэтил-5-пиридинил,(4-метил-4-гидроксипиперидин)пиридин-2-ил,(3-метил-3 гидроксипиперидин)пиридин-2-ил, 5-морфолинопиридин-2-ил, 6-морфолинопиридин-3-ил, 2-метоксиэтил)(метил)амино)пиридин-5-ил, 2-гидроксиэтил)(метил)амино)пиридин-5-ил, 2-метокси-4-пиридинил и 2-гидрокси-5-пиридинил, (2-гидроксиэтил)-1H-пиразол-4-ил, (2-гидроксипропил)-1 Н-пиразол-4-ил, (2 метоксиэтил)-1 Н-пиразол-4-ил, 1-этил-1 Н-пиразол-4-ил, 1-изопропил-1H-пиразол-4-ил, 3-циклопропил 1 Н-пиразол-5-ил и 1-этил-5-метил-1H-пиразол-3-ил, 1 Н-бензо[d]имидазол-6-ил, 1 Н-бензо[d]имидазол-5 ил, 1 Н-индазол-6-ил, 1 Н-индазол-5-ил, 1-метил-1 Н-бензо[d]имидазол-6-ил, бензоксазол-6-ил, бензоксазол-5-ил, имидазо[1,2-а]пиридин-6-ил, 1 Н-индол-6-ил, 1 Н-индол-5-ил, бензотиазол-6-ил и бензотиазол-5 ил;R5 означает водород. Согласно одному из вариантов реализации R2 означает 1 Н-индазолил-6-ил, 1-метил-1H-индазол-5 ил, 1-метил-1H-индазол-6-ил, 3,4-дигидро-2 Н-1,4-бензоксазин-3-он-6-ил, 1,3-бензоксазол-6-ил, 3-аминохинолин-6-ил и 2,3-дигидро-1 Н-индол-2-он-6-ил. Согласно еще одному варианту реализации соединение выбрано из группы, состоящей из следующих соединений: Согласно всем из вышеизложенных примеров химические соединения могут вводиться по отдельности, в виде смеси или в комбинации с другими активными агентами. Способы получения новых соединений, описанных в настоящем изобретении, будут очевидны для специалистов в данной области техники. Подходящие способы описаны, например, в приведенных ниже схемах реакций и примерах, а также в ссылках, цитированных в настоящем изобретении. Согласно этапу 1 схемы реакции 1 избыток соединения формулы 100 (например, приблизительно 3,5 экв.), где L представляет собой уходящую группу, такую как бромид, смешивали с водным раствором кислоты (например, 48% водным бромводородом) и смесь перемешивали с обратным холодильником в течение примерно 2 ч. Смесь охлаждали до температуры примерно 40C и добавляли основание (такое как твердый бикарбонат натрия). Реакционную смесь фильтровали и добавляли соединение формулы 101, где L представляет собой уходящую группу, такую как бромид, и реакционную смесь перемешивали с обратным холодильником в течение примерно 16 ч. Продукт - соединение формулы 102 - выделяли и возможно очищали. Согласно этапу 2 схемы реакции 1 смесь соединения формулы 102, где L представляет собой уходящую группу, такую как бромид, смешивали с избытком соединения формулы 103 (например, примерно 3 экв.) и избытком органического основания (например, примерно 1,7 экв.), такого как N,Nдиизопропилэтиламин. Реакционную смесь перемешивали при температуре примерно 100C в течение примерно 3 ч. Продукт - соединение формулы 104 - выделяли и, возможно, очищали. Согласно этапу 3 схемы реакции 1 смесь соединения формулы 104, где L представляет собой уходящую группу, такую как бромид, смешивали с избытком соединения формулы 105 (например, 1,1 экв.) и водным раствором основания (такого как 1 М водный раствор карбоната натрия) в инертном растворителе, таком как 1,4-диоксан. Через реакционную смесь барботировали азот и перемешивали в течение примерно 5 мин. Полученную в результате смесь обрабатывали примерно 0,1 экв. тетракис(трифенилфосфин)палладием(0) и подвергали воздействию микроволнового излучения при температуре примерно 135C в течение примерно 30 мин. Полученный в результате продукт - соединение формулы 106 - выделяли и, возможно, очищали. Таким образом, предложен способ лечения пациента, например млекопитающего, такого как человек, страдающего заболеванием, чувствительным к подавлению активности Syk, включающий введение пациенту, страдающему указанным заболеванием, эффективного количества по меньшей мере одного химического соединения, описанного в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химические соединения, описанные в настоящем изобретении, способны также подавлять другие киназы, осуществляя лечение заболевания,симптомов заболевания и патологических состояний, связанных с указанными киназами. Способы лечения также включают подавление активности Syk и/или подавление активности Вклеток путем ингибирования связывания или гидролиза АТФ Syk или посредством некоторого другого механизма in vivo у пациента, страдающего заболеванием, чувствительным к подавлению активностиSyk, путем введения эффективной концентрации по меньшей мере одного химического соединения, выбранного из описанных в настоящем изобретении соединений. Примером эффективной концентрации является концентрация, достаточная для подавления активности Syk in vitro. Эффективная концентрация может быть установлена экспериментально, например путем определения концентрации в крови химического соединения, или теоретически, посредством определения биодоступности. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения расстройство, чувствительное к подавлению активности Syk и/или активности В-клеток, представляет собой рак, аллергическое заболевание,и/или аутоиммунное, и/или воспалительное заболевание, и/или острую воспалительную реакцию. Также предложен способ лечения пациента, страдающего раком, аллергическим заболеванием,и/или аутоиммунным, и/или воспалительным заболеванием, и/или острой воспалительной реакцией, путем введения эффективного количества по меньшей мере одного химического соединения, описанного в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения состояния и заболевания, на которые можно оказывать воздействие, применяя описанные в настоящем изобретении химические соединения,включают (но не ограничиваются указанными): аллергические заболевания, включая (но не ограничиваясь указанными) экзему, аллергический ринит или насморк, сенную лихорадку, бронхиальную астму,аллергическую сыпь (крапивницу), пищевые аллергии и другие атопические заболевания; аутоиммунные и/или воспалительные заболевания, включая псориаз, болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, болезнь Шегрена, отторжение тканевого трансплантата и сверхострое отторжение трансплантированных органов, астма, системная красная волчанка (и связанный с ней гломерулонефрит), дерматомиозит,множественный склероз, склеродермия, васкулит (АНЦА-ассоциированный и другие васкулиты), аутоиммунные гемолитические и тромбоцитопенические стадии, синдром Гудпасчера (и связанный с ним гломерулонефрит и легочное кровотечение), атеросклероз, ревматоидный артрит, хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), болезнь Аддисона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, диабет, септический шок, миастения гравис и т.п. (но не ограничиваясь указанными); острые воспалительные реакции, включая (но не ограничиваясь указанными) солнечный ожог кожи, воспалительное заболевание органов таза, воспалительное заболевание кишечника, уретрит, увеит, синусит,пневмонию, энцефалит, менингит, миокардит, нефрит, остеомиелит, миозит, гепатит, гастрит, энтерит,дерматит, гингивит, аппендицит, панкреатит и холецистит; поликистозную болезнь почек и рак, включая(но не ограничиваясь указанными) В-клеточную лимфому, лимфому (включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому), лейкоз ворсистых клеток, множественную миелому, хроническую и острую миелогенную лейкемию и хронический и острый лимфоцитарный лейкоз.Syk является известным ингибитором апоптоза клеток В-клеточной лимфомы. Нарушения апоптоза принимают участие в патогенезе и проявлении лекарственной устойчивости лейкемий и лимфом человека. Таким образом, также предложен способ стимуляции или индукции апоптоза в клетках, экспрессирующих Syk, включающий приведение клетки в контакт по меньшей мере с одним химическим соединением, описанным в настоящем изобретении. Также предложены способы лечения, согласно которым по меньшей мере одно химическое соединение, описанное в настоящем изобретении, является единственным активным агентом, вводимым пациенту, и также включает способы лечения, в которых по меньшей мере одно химическое соединение, описанное в настоящем изобретении, вводится пациенту в комбинации с одним или более дополнительными активными агентами. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации изобретения способ лечения рака, аллергического заболевания, и/или аутоиммунного, и/или воспалительного заболевания, и/или острой воспалительной реакции включает введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества по меньшей мере одного химического соединения, описанного в настоящем изобретении, вместе со вторым активным агентом, который может использоваться при лечении рака, аллергического заболевания, и/или аутоиммунного, и/или воспалительного заболевания, и/или острой воспалительной реакции. Например,второй агент может представлять собой противовоспалительный агент. Лечение вторым активным агентом может проводиться до, во время или после проведения лечения по меньшей мере одним химическим соединением, описанным в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения по меньшей мере одно химическое соединение, описанное в настоящем изобретении, комбинируется с другим активным агентом в форме дозирования для однократного введения. Подходящие противоопухолевые терапевтические средства, которые могут использоваться в комбинации по меньшей мере с одним химическим соединением, описанным в настоящем изобретении, включают (но не ограничиваются указанными) химиотерапевтические агенты, например митомицин С, карбоплатин, таксол, цисплатин, паклитаксел, этопозид, доксорубицин, или комбинации, включающие по меньшей мере один из вышеуказанных химиотерапевтических агентов. Радиотерапевтические противоопухолевые агенты также могут использоваться по отдельности или в комбинации с химиотерапевтическими агентами. Химические соединения, описанные в настоящем изобретении, могут найти применение в качестве агентов, повышающих чувствительность к химиотерапевтическими агентам и, таким образом, могут использоваться в комбинации с другими химиотерапевтическими лекарственными средствами, в частности лекарственными средствами, вызывающими апоптоз. Также согласно настоящему изобретению предложен способ повышения чувствительности раковых клеток к химиотерапии, включающий введение пациенту, подвергаемому химиотерапии с помощью химиотерапевтического агента, вместе по меньшей мере с одним химическим соединением, описанным в настоящем изобретении, в количестве, достаточном для повышения чувствительности раковых клеток к химиотерапевтическому агенту. Примеры других химиотерапевтических лекарственных средств, которые могут применяться в комбинации с химическими соединениями, описанными в настоящем изобретении, включают ингибиторы топоизомеразы I (камптотецин или топотекан), ингибиторы топоизомеразы II (например, дауномицин и этопозид), алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, мелфалан и BCNU (1,3-бис-(2-хлорэтил)1-нитрозомочевина, БХНМ, агенты с направленным действием на тубулин (например, таксол и винбластин) и биологические агенты (например, антитела, такие как антитела против CD20, IDEC 8, иммунотоксины и цитокины). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения химические соединения, описанные в настоящем изобретении, применяются в комбинации с Rituxan (ритуксимабом) или другими агентами,которые действуют по принципу селективного подавления CD20+В-клеток. В пределах настоящего изобретения включены способы лечения, согласно которым по меньшей мере одно химическое соединение, описанное в настоящем изобретении, вводится в комбинации с противовоспалительным агентом. Противовоспалительные агенты включают (но не ограничиваются указанными) НПВС, ингибиторы фермента циклооксигеназы, неспецифические и специфические к СОХ-2, соединения золота, кортикостероиды, метотрексат, антагонисты рецепторов фактора некроза опухоли(ФНО), иммуносупрессоры и метотрексат. Примеры НПВС включают (но не ограничиваются указанными) ибупрофен, флурбипрофен, напроксен и напроксен натрия, диклофенак, комбинации диклофенака натрия и мизопростола, сулиндак,оксапрозин, дифлунизал, пироксикам, индометацин, этодолак, фенопрофен кальция, кетопрофен, набуметон натрия, сульфасалазин, толметин натрия и гидроксихлорохин. Примеры НПВС также включают специфические ингибиторы циклооксигеназы СОХ-2 (т.е. соединения, которые подавляют циклооксигеназу СОХ-2 со значением IC50 для СОХ-2 по меньшей мере в 50 раз меньшим, чем значение IC50 для СОХ-1), такие как целекоксиб, валдекоксиб, люмиракоксиб, эторикоксиб и/или рофекококсиб. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения противовоспалительный агент представляет собой салицилат. Салицилаты включают (но не ограничиваются указанными) ацетилсалициловую кислоту или аспирин, салицилат натрия и салицилаты холина и магния. Противовоспалительный агент может также представлять собой кортикостероид. Например, кортикостероид может быть выбран из кортизона, дексаметазона, метилпреднизолона, преднизолона, преднизолона фосфат натрия и преднизона. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения противовоспалительный терапевтический агент представляет собой соединение золота, такое как ауротиомалат натрия или ауранофин. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения противовоспалительный агент представляет собой метаболический ингибитор, такой как ингибитор дигидрофолатредуктазы, такой как ингибитор метотрексат- или дегидрооротатдегидрогеназы, например лефлуномид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения применяют комбинации, в которых по меньшей мере одно противовоспалительное соединение представляет собой моноклональное антитело к С 5 (такое как экулизумаб или пекселизумаб), антагонист ФНО, такой как энтанерцепт, или инфликсимаб,который представляет собой моноклональное антитело к ФНО-альфа. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения применяются комбинации, в которых по меньшей мере один активный агент представляет собой иммуносупрессорное соединение, такое как метотрексат, лефлуномид, циклоспорин, такролимус, азатиоприн или микофенолат мофетил. Для лечения вышеуказанных патологических состояний могут применяться дозировки, например,от 0,1 до 140 мг на 1 кг массы тела в день (от 0,5 мг до 7 г на пациента в день). Количество активного ингредиента, который может смешиваться с наполнителем для получения дозированной формы для однократного введения, будет различаться в зависимости от пациента, которому проводят лечение, и конкретного способа введения. Дозированные лекарственные формы, как правило, содержат от 1 до 500 мг активного ингредиента. Частота введения дозы может также меняться в зависимости применяемого соединения и конкретного заболевания, на которое направлено лечение. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения для лечения, например, аллергического заболевания, и/или аутоиммунного, и/или воспалительного заболевания, применяется режим дозирования 4 раза в день или меньше. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения применяется режим дозирования 1 или 2 раза в день. Необходимо понимать,однако, что специфический уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая активность определенного соединения, которое применяется, возраста пациента, массы тела, общего состояния здоровья, пола, питания, времени введения соединения, пути введения и скорости выведения, комбинации лекарственных средств и тяжести конкретного заболевания пациента, подвергающегося терапии. Меченая форма химического соединения, описанного в настоящем изобретении, может применяться как диагностический маркер для идентификации и/или получения соединений, действие которых направлено на модулирование активности киназы, как описано в настоящем изобретении. Химические соединения, описанные в настоящем изобретении, могут дополнительно использоваться для подтверждения, оптимизации и стандартизации биоанализов. Термин "меченый" означает, что соединение непосредственно или опосредованно связано с меткой,которая обеспечивает выявляемый сигнал, например, с радиоизотопом, флуоресцентной меткой, ферментом, антителами, частицами, такими как магнитные частицы, хемилюминесцентной меткой или молекулами специфического связывания и т.д. Молекулы специфического связывания включают пары, такие как биотин и стрептавидин, дигоксин и антидигоксин и т.д. В случае молекул специфического связывания комплементарный элемент, как правило, метится молекулой, которая обеспечивает возможность определения в соответствии с вышеуказанными известными способами. Метка может обеспечивать выявляемый сигнал непосредственным или опосредованным образом. Примеры Изобретение далее проиллюстрировано с помощью следующих неограничивающих примеров. В нижеприведенных примерах следующие аббревиатуры имеют указанные значения. Если аббре- 13021293 виатура не определена, она имеет общепринятое значение.(601 мг, 5,32 ммоль), 2-пропанола (319 мг, 5,32 ммоль) и трифенилфосфина (1,67 г, 6,36 ммоль) в тетрагидрофуране (25 мл) в течение 3 мин и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. После этого реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный в результате осадок очищали с помощью хроматографии (силикагель, градиент: этилацетат/гептан (1:4)этилацетат/гептан (7:3 с получением 1-изопропил-4-нитро-1 Н-пиразола (1) (1,23 г, 100%) в виде неочищенного твердого вещества грязно-белого цвета, которое использовали без дополнительной очистки: 1 Н ЯМР(300 МГц, ДМСО-d6)8,91 (s, 1 Н), 8,24 (s, 1 Н), 4,58 (m, 1 Н), 1,42 (d, J=6,6 Гц, 6 Н). Получение 1-изопропил-1 Н-пиразол-4-амина (2). Суспензию неочищенного 1-изопропил-4-нитро-1 Н-пиразола (1) (1,23 г), описанного выше, в этаноле (50 мл) обрабатывали 10% палладием на угле (400 мг, 50 мас.% воды) и перемешивали в атмосфере водорода (35 фунт на кв. дюйм (241 кПа при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого реакционную смесь фильтровали через диатомитовую землю и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением 1-изопропил-1 Н-пиразол-4-амина (2) (1,15 г) в виде неочищенного твердого вещества грязно-белого цвета, которое использовали без дополнительной очистки: 1 Н ЯМР (300 МГц,ДМСО-d6)7,02 (s, 1 Н), 6,87 (s, 1 Н), 4,26 (m, 1 Н), 3,72 (bs, 2 Н), 1,42 (d, J=6,6 Гц, 6 Н). Получение 6,8-дибромимидазо[1,2-а]пиразина (3). В четырехгорлую круглодонную колбу вместимостью 1 л, снабженную температурным датчиком,механической мешалкой и обратным холодильником, загружали 2-бром-1,1-диэтоксиэтан (68,1 г, 346 ммоль) и 48% водный бромводород (11,3 мл, 99,2 ммоль) и перемешивали реакционную смесь с обратным холодильником в течение 2 ч. Полученную в результате смесь оставляли охлаждаться до температуры 40C и добавляли твердый бикарбонат натрия (8,50 г, 101 ммоль) малыми порциями до тех пор, пока не наблюдалось прекращения газообразования. Меры предосторожности: первоначальное добавление бикарбоната натрия к теплому раствору приводило к интенсивному газообразованию (пенообразованию). Полученную в результате суспензию фильтровали в четырехгорлую крулодонную колбу вместимостью 1 л и промывали отфильтрованный осадок этанолом (200 мл). Колбу снабжали температурным датчиком, механической мешалкой и обратным холодильником. 3,5-Дибромпиразин-2-амин (50,0 г, 198 ммоль) добавляли и реакционную смесь нагревали с обратным холодильником при интенсивном перемешивании в течение 16 ч. После этого суспензию охлаждали до 0C и фильтровали. Отфильтрованный осадок промывали холодным этанолом (50 мл), сушили в вакууме и добавляли в трехгорлую круглодонную колбу на 1 л, снабженную механической мешалкой. Добавляли воду (200 мл) и после интенсивного перемешивания суспензию обрабатывали порциями твердого карбоната калия (27,4 г, 198 ммоль). Меры предосторожности: при добавлении карбоната калия наблюдалось газообразование. После перемешивания в течение 30 мин полученный в результате осадок выделяли посредством фильтрования и отфильтрованный осадок промывали водой (100 мл) с последующей промывкой этанолом (50 мл). Отфильтрованный осадок сушили при температуре 50C до постоянного веса в вакууме с получением 6,8 дибромимидазо[1,2-а]пиразина (3) (52,0 г, 94%) в виде твердого вещества светло-желтого цвета: 1 Н ЯМР(300 МГц, ДМСО-d6)9,02 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 7,90 (s, 1H). Получение 6-бром-N-(1-изопропил-1 Н-пиразол-4-ил)имидазо[1,2-а]пиразин-8-амина (4). Смесь неочищенного 1-изопропил-1H-пиразол-4-амина (2) (1,00 г) согласно приведенному выше описанию, 6,8-дибромимидазо[1,2-а]пиразина (3) (750 мг, 2,71 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (526 мг, 4,16 ммоль) в ДМФА (20 мл) перемешивали при температуре 100C в течение 3 ч. После этого реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и выливали в ледяную воду (200 мл). Полученную в результате суспензию фильтровали и отфильтрованный осадок сушили до получения постоянной массы в вакууме с получением неочищенного 6-бром-N-(1-изопропил-1H-пиразол-4-ил)имидазо[1,2 а]пиразин-8-амина (4) (1,26 г) в виде твердого вещества грязно-белого цвета, которое использовали без дополнительной очистки: 1 Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6) 10,26 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 8,08 (s, 1H), 7,90 (s,1H), 7,77 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 4,49 (m, 1H), 1,40 (d, 6H); ИЭР МС m/z 323,3 [М+Н]+. Получение 6-(1 Н-индазол-6-ил)-N-(1-изопропил-1H-пиразол-4-ил)имидазо[1,2-а]пиразин-8-амина(195 мг) согласно приведенному выше описанию и 1 Н-индазол-6-илбороновой кислоты (159 мг, 0,650 ммоль) в 1 М водном растворе карбоната натрия (1,3 мл) и 1,4-диоксана (3,5 мл) барботировали азотом при перемешивании в течение 5 мин. Затем добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (69 мг,0,060 ммоль) и полученную в результате смесь нагревали при воздействии микроволнового излучения при 135C в течение 30 мин. После этого реакционную смесь разбавляли метиленхлоридом (30 мл) и водой (20 мл) и фильтровали через диатомитовую землю. Слои фильтрата разделяли и водную фазу экстаргировали смесью метиленхлорид/метанол в отношении 9:1 (100 мл). Объединенные органические слои концентрировали при пониженном давлении и полученный в результате осадок очищали с помощью хроматографии (силикагель, градиент: метиленхлорид - 8:2 метиленхлорид/метанол), затем растирали с ацетонитрилом с получением 6-(1 Н-индазол-6-ил)-N-(1-изопропил-1H-пиразол-4-ил)имидазо[1,2 а]пиразин-8-амина (5) (85 мг, 35%) в виде твердого вещества желтого цвета: mp250C; 1 Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6)13,23 (s, 1H), 9,95 (s, 1H), 8,59 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,18 (s, 1 Н), 8,10 (s, 1 Н), 8,00 (s, 1 Н),7,97 (d, J= 1,2 Гц, 1 Н), 7,85 (d, J= 8,7 Гц, 1 Н), 7,75 (dd, J=8,7, 1,2 Гц, 1 Н), 7,62 (s, 1 Н), 4,52 (m, 1 Н), 1,47 (d,J=6,6 Гц, 6 Н); ИЭР МС m/z 359,4 [М+Н]+; ВЭЖХ, 5,37 мин, 99% (ППК). Пример 2. Следующие соединения очищали в соответствии с методиками, описанными выше. Специалистам в области органического синтеза будут очевидны необходимые модификации условий реакций или материалов для получения желаемого соединения. Данные МС согласно настоящему примеру были получены следующим образом: Условия проведения МС: МС с ионизацией электрораспылением проводили на масс-спектрометреMICROMASS LCT, снабженном источником LockSpray для точных измерений массы. Спектры получали в режиме определения положительных ионов с диапазоном масс 100-1000 Да при частоте сбора данных 1 спектр/0,9 с с интервалом между сканами, равным 0,1 с. Прибор настраивали на разрешение 5000 (спектральная ширина, FWHM). Каждый 5-й скан был сделан при стандартном положении источника Lockspray. Лейцинэнкефалин (556,2771 [М+Н]+) использовали в качестве стандарта или массы захвата.