Модифицированные бычьи полипептиды g-csf и их применение

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БЫЧЬИ ПОЛИПЕПТИДЫ G-CSF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Представлены модифицированные бычьи полипептиды G-CSF и их применение.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: АМБРКС, ИНК.; ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к полипептидам колониестимулирующего фактора бычьих гранулоцитов (bG-CSF), необязательно модифицированным по меньшей мере одной не кодируемой в природе аминокислотой. Уровень техники Экономические потери от инфекционных заболеваний при производстве пищевых продуктов животноводства хорошо документированы. Инфекционные заболевания снижают выгоду, повышают стоимость продукции и ухудшают качество пищевых продуктов, также как влияют на производительность,здоровье и общее состояние животного. Заболевания могут снизить производство и ухудшить качество молока, что приводит к большим экономическим потерям владельцев молочных ферм и производителей говядины, в частности, если в некоторых случаях инфекционные микробные заболевания вызывают заболеваемость и смертность новорожденных, молодых (например, ремонтного поголовья) или взрослых животных. Два таких заболевания, как мастит и респираторное заболевание крупного рогатого скота(BRD), могут оказать губительный эффект на производство мясомолочных пищевых продуктов. Мастит определяют как воспаление молочной железы. Он может поразить любое млекопитающее,например коров, овец и коз. Мастит крупного рогатого скота представляет собой инфекцию вымени жвачных животных, таких как коровы, вызываемую, главным образом, грам-положительными и грамотрицательными бактериями, и особенно у коров с интенсивной лактацией. Бактериальная инфекция приводит к воспалению молочной железы (т.е. сосков и вымени). Животные могут стать более подверженными маститу из-за нарушенной микробицидной функции нейтрофилов во время периода до и после отела. Заболевание доставляет особенно много беспокойства и является весьма важным с экономической точки зрения, так как патоген легко переносится от одного животного к другому во время процесса дойки. Он часто развивается в течение первых нескольких недель после отела и может повторяться при каждой лактации. Некоторыми из основных патогенных микроорганизмов, вызывающих мастит крупного рогатого скота, являются Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa; см. также Bovine Mastitis, издание Glenys Bloomfield, VO Publications 1987, включенное в описание путем ссылки. Указанные микроорганизмы проникают в вымя через сосковые каналы и вызывают воспаление вырабатывающих молоко тканей, вызывая образование рубцовой ткани, которая один раз образовавшись, может вызывать постоянное снижение производства молока. Инфекция может также изменять состав, количество, вид и качество молока. Вызывающие мастит патогены делятся на две категории, а именно контагиозные (заразные) и относящиеся к окружающей среде. Контагиозные бактерии, такие какStreptococcus agalactiae и Staphylococcus aureus, главным образом, заселяют такие участки тканей хозяина, как молочные железы, сосковые каналы и поврежденную кожу сосков, и передаются от одной инфицированной коровы к другой в процессе дойки. Относящиеся к окружающей среде бактерии, часто streptococci, enterococci и колиформные организмы, обычно присутствуют в среде обитания коров, в таких источниках, как коровий навоз, почва, растительные материалы, подстилка или вода, и инфицируют при случайном оппортунистическом контакте с животным. Различие между контагиозными и относящимися к окружающей среде патогенами, хотя и не исключительное, является особенно важным, так как особенности содержания молочного поголовья важны для различных групп микроорганизмов. Во всех случаях мастит крупного рогатого скота вызывает, независимо от вызывающего его микроорганизма, способ передачи заражающего патогена внутрь железы вымени через отверстие соска и сосковый канал. Обычные источники вредных микроорганизмов включают антисанитарное состояние доильных установок, доярок,других больных маститом животных, антисанитарное состояние стойл и процессы собственных выделений животных (дефекация/мочеотделение). Существуют различные формы или типы мастита крупного рогатого скота, характеризующиеся различной тяжестью и симптоматикой, включая следующие: (1) инфекция вымени: заражение полости вымени микроорганизмами, которые размножаются в железе и вызывают воспаление; (2) неклинический или субклинический мастит; форма мастита, при которой не происходит опухания железы или не наблюдается анормальности молока, хотя в молоке происходят изменения, которые можно определить специальными тестами. Такой тип мастита является наиболее часто встречающимся и вызывает наиболее крупные общие потери для большинства стад. Такой мастит часто называют "скрытым" маститом: (3) клинический мастит; это такая форма мастита, при которой наблюдаются анормальное состояние вымени и секреции молока. Легкий клинический мастит включает изменения в молоке, такие как расслаивание, образование сгустков и водянистость или необычный внешний вид. Повышение температуры и чувствительность вымени незначительны или отсутствуют, но могут присутствовать следы набухания. Тяжелый клинический мастит включает внезапное набухание инфицированной четверти вымени, которая становится горячей, твердой и чувствительной. Качество молока ухудшается, и производство молока падает. Иногда, кроме локальных проявлений в вымени, сами коровы становятся больными. Появляются признаки лихорадки, учащенный пульс, депрессия, слабость и потеря аппетита. Комбинацию таких признаков часто называют острым системным маститом, так как поражено не только вымя, но и весь организм животного; и (4) хронический мастит; такую форму мастита вызывает постоянная инфекция выме-1 019968 ни, которая существует чаще всего в неклинической форме, но иногда может переходить в активную клиническую форму. После таких "вспышек" неклиническая форма обычно периодически возвращается.(см. Generally Current Concepts of Bovine Mastitis, published by The National Mastitis Council, Inc., 2nd Ed. 1978, p. 5.) Мастит продолжает вызывать значительные экономические потери в молочной промышленности. Мастит влияет на рентабельность стада разными путями, как прямо, так и косвенно, включая (1) потери производства молока; (2) большее количество отбракованных инфицированных коров; (3) снижение ценности молока; (4) выбраковку молока после обработки антибиотиками; (5) стоимость ветеринарного лечения (антибиотики и визиты ветеринара) и (6) смертность (Bovine Mastitis, Glenys Bloomfield, supra, p. 33.) Другим общим заболеванием, поражающим скотоводство, является транспортная лихорадка (респираторное заболевание крупного рогатого скота или BRD). Некоторые называют BRD "комплексным заболеванием" по двум причинам: обычно его вызывают различные патогены, как вирусы, так и бактерии, которые взаимодействуют друг с другом, вызывая резко выраженное заболевание, и так как поведение патогенов может проявляться как последовательный процесс, оно шаг за шагом приводит к болезни животных. Бактериальные патогены представляют собой одну из наиболее изученных причин острого синдрома. Такие бактериальные патогены могут заселять респираторный тракт крупного скота после поражения вирусной инфекцией и другие факторы, такие как стресс после отнятия от вымени, стресс при транспортировке, изменение питания и изменение окружающей температуры и влажности, могут предшествовать и внести свой вклад в инфицирование. Во многих случаях эти факторы добавляются к экспонированию скота патогенам во время транспортировки животных, когда они смешиваются с животными другого происхождения в грузовиках, стойлах и аукционных сараях, что приводит к большому числу заболеваний животных, доставляемых на площадки для откорма. Были выделены и связаны с BRD некоторые виды бактерий, и некоторыми из наиболее часто встречающихся являются Mannhemia haemolytica, Pasteurella multocida и/или Histophilus somni. Haemophilussomnus представляет собой вирулентный патоген, который вызывает септицемию у скота и иногда приводит к проявлениям, которые называют "гемофилический somnus комплекс", одной из форм которого является респираторное заболевание; вирусы, такие как инфекционный бычий ринотрахеит (IBR), вирусная диарея крупного рогатого скота (BVD) и респираторный синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), также могут участвовать в инициировании BRD комплекса, часто открывая дверь вторичной бактериальной инфекции. Так как практически невозможно исключить указанные организмы из окружающей среды, к BRD комплексу следует подходить с точки зрения профилактики указанных заболеваний, предотвращая возможность контактирования с вызывающими заболевания агентами и детектируя или обрабатывая клинические случаи, насколько возможно, быстро и эффективно. Респираторные заболевания являются основной причиной потерь от заболеваний мясного поголовья. Обычно считают, что окончательной причиной гибели в большинстве случаев транспортной лихорадки является бактериальная (обычно pasteurella) пневмония. Pasteurella haemolytica, особенности типа IA, является наиболее часто встречающейся бактерией, выделенной при случаях респираторного заболевания в Северной Америке. Вакцинация против некоторых из инфекционных агентов, проводимая против транспортной лихорадки, иногда помогает, но вакцины доступны и эффективны только против нескольких из агентов, которые, как известно, участвуют в комплексе заболевания. Лечение антибиотиками было основным компонентом стратегии борьбы с маститом и BRD. В патенте США 7182948, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте, указано, что противомикробные обработки сосков вымени содержащими йод растворами, как было показано,являются эффективными против инфекций млекопитающих и вызывающих мастит бактерий (Pankey,J.W. et al., (1983) J. Dairy Sci., 66 (1), 161, 167). Указанными композициями обычно обрабатывают вымя путем его погружения или опрыскивания перед дойкой, а также после удаления доильной чашки. Для уменьшения случаев мастита созданы коммерческие растворы для сосков, содержащие различные противомикробные агенты, включая йодофоры, четвертичные соединения аммония, соединения, выделяющие хлор (например, щелочные гипохлориды), окисляющие соединения (например, перекись водорода,перациды), протонированные карбоновые кислоты (например, гептановая, октановая, нонановая, декановая, ундекановая кислоты), анионные кислоты (например, алкиларилсульфоновые кислоты), диоксид хлора (из хлорита) и бисбигуаниды, такие как хлоргексидин. Такие агенты, которые обладают различными степенями эффективности, ограничивают распространение мастита за счет уменьшения популяций патогенов на сосках. Однако существуют проблемы, связанные с использованием противомикробных агентов. Чаще всего встречаются раздражение сосков и растрескивание сосков. Для облегчения указанных проблем в такие композиции включали умягчающие добавки, такие как глицерин и ланолин. Однако даже при использовании указанных умягчительных средств кожные раздражения все еще могут возникать. В патенте США 6790867, который полностью включен в описании посредством ссылки, указывается, что подкожные инъекции композиций, включающих нестероидные противовоспалительные ле-2 019968 карственные средства (NSAID), такие как флуниксин, с фторированным хлорамфениколом или антибиотиком - производным тиамфеникола, таким как флорфеникол, можно использовать для лечения BRD. В патентной публикации заявки США 20070155799, которая полностью включена в описание посредством ссылки во всей своей полноте, раскрыты новые соединения феникола, которые можно использовать в качестве антибиотиков-пролекарств и в комбинации с NSAID или другими антибиотиками.NMC (ранее National Mastitis Council), некоммерческая организация, занимающаяся уменьшением случаев мастита и повышением качества молока, акцентирует внимание на важности правильной санации сосков, но также и на лечебной обработке для профилактики мастита. Экономический вред, причиняемый маститом, привел к многочисленным исследованиям по борьбе с ним. Сообщалось, что физические стрессы так же, как относящиеся к окружающей среде условия, вносят значительный вклад в маститные инфекции; см. патентную публикацию США 20020051789, которая включена в описании посредством ссылки. Так как было документировано, что субклинический мастит непосредственно связан с плохим состоянием сосков (Neijenhuis P., et al. (2001) J. Dairy Sci., (84) 2664 2672), был предложен ряд коммерческих растворов для омывания сосков, включающих кондиционеры (National Mastitis Council,Summary of Peer-Reviewed Publicatuins on Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published Since, 1980; January 2002). Было показано, что затверделость и шероховатость кончиков сосков имеет прямое отношение к клиническому маститу (Neijenhuis F., et al. (2001) J. Dairy Sci., (84) 2664 2672). Уменьшение растрескивания и раздражения сосков так же, как сохранение эластичности сосков, являются очень важными факторами в борьбе с инфекциями молочной железы. В качестве кондиционера для сосков также использовали глицерин в растворах для омывания сосков. Однако исследования показали,что не происходит значительного уменьшения количества вызывающих мастит бактерий, таких какStaphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae или Coliforms, если содержание глицерина повышают с 2 до 10% в 1% йодном растворе для обработки сосков (National Mastitis Council, Summary of Peer-ReviewedPublicatiobs on Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published Since, 1980; January 2002). Таким образом, хотя такие продукты, как растворы для омывания сосков, доступны, все еще существует неудовлетворенная потребность в уменьшении случаев возникновения, рецидивов и/или снижении тяжести мастита. В патенте США 5849883, который полностью включен в описание посредством ссылки, раскрыт ряд антибиотиков, которые использовали для лечения мастита, включая, без ограничения, беталактамные антибиотики, такие как пенициллин (ампициллин, клоксациллин, гетациллин, нафциллин,пенициллин G, (бензил-пенициллин), прокаинпенициллин) и цефалоспорины (цефоперазон, цефуроксим,цефалоний, цефаприн, цефоксазол, цефравцетрил); аминогликозидные антибиотики (фрамицетин, неомицин, новобиоцин, стрептомицин); антибиотики макролиды (эритромицин); тетрациклины (хлортетрациклин, окситетрациклин) и полипептидные антибиотики (полимиксин В). Лечение мастита антибиотиками обычно проводят, используя интрамаммарные вливания, или коровам в период лактации, если у них диагностирован клинический мастит, или в сухостойный период (когда корову не доят) (Bovine Mastitis, supra, p. 69). В тех случаях, когда присутствует тяжелое клиническое заболевание, антибиотики необходимо вводить парентерально, так как интрамаммарные вливания неэффективны из-за блокировки каналов. Существовавшие ранее надежды на то, что антибиотики позволят полностью победить заболевание,не реализовались. Ни один из вышеперечисленных антибиотиков не оказался полностью удовлетворительным. Кроме того, было обнаружено, что было бы весьма желательно заменить лечение антибиотиками лечением неантибиотическими химиотерапевтическими лекарственными соединениями по следующим причинам: (1) антибиотики, эффективные в медицине для людей, нельзя использовать в ветеринарии, чтобы не выработать штаммовую устойчивость бактерий, проявляющихся при заболеваниях людей;(2) антибиотики следует приберечь для таких заболеваний, для которых недоступны химиотерапевтические лекарственные соединения, так как было доказано, что штаммы бактерий вырабатывают устойчивость к антибиотикам после длительного использования таких антибиотиков; и (3) Staphylococcus aureus,один из вышеуказанных патогенов, уже выработал устойчивость к большинству антибиотиков, которые использовали при лечении мастита крупного рогатого скота. Один из таких способов лечения неантибиотическим химиотерапевтическим лекарственным соединением раскрыт в патенте США 4610993, который включен в описание посредством ссылки, в котором заявлен способ лечения животных от мастита крупного рогатого скота эффективным количеством по меньшей мере одного пиридин-N-оксиддисульфидного соединения. Другой способ тех же авторов раскрыт в патенте США 4401666, который включен в описание посредством ссылки, где заявлен способ лечения животных от мастита крупного рогатого скота эффективным количеством по меньшей мере одной соли металла пиридин-2-тион-N-оксида. Несмотря на несколько опубликованных способов, все еще остается очень важным найти рентабельные, но эффективные способы использования соединений, отличных от антибиотиков, которые смогли бы, по существу, преодолеть недостатки использованных до настоящего времени антибиотиков и при этом были бы эффективны при лечении и профилактике мастита. Другим общим заболеванием, поражающим скотопромышленность, являются транспортные лихо-3 019968 радки (респираторное заболевание крупного рогатого скота). Респираторные заболевания являются основной причиной потерь мясного скота. Термин "транспортная лихорадка" используют для описания комплекса респираторных заболеваний, наблюдаемых у животных в возрасте 6 месяцев или старше после перевозки или на площадке для откорма скота либо на пастбищах. Стрессы при отлучении от матери,кастрация, удаление рогов, голодная выдержка, чрезмерная скученность, экспонирование инфекционным агентам, изменения кормежки, транспортировка, относящиеся к окружающей среде температурные экстримы и другие причины стрессов, наряду с вирусной, бактериальной, микоплазменной и/или хламидийной инфекциями, составляют комплекс транспортной лихорадки. Перемешивание телят из различных ферм и/или в предпродажных сараях приводит к значительному экспонированию инфекционным агентам. В патенте США 6497869, который включен в описание посредством ссылки, описаны некоторые первичные инфекционные агенты, которые могут воздействовать на скот. Смешивание популяций может быть наиболее важным провоцирующим фактором, вызывающим транспортную лихорадку, нежели стресс-факторы, хотя заболевание может проходить без перемешивания и без стресс-факторов, обычно резко ухудшающих респираторное заболевание. Попытки уменьшить стрессы при отлучении от матери,при кастрации, при удалении рогов и т.д. и при приучении скота к новому корму за несколько дней или недель до перевозки иногда бывают успешными (но могут оказаться нерентабельными) для уменьшения случаев транспортной лихорадки. Вакцинация против некоторых инфекционных агентов, принимающих участие в транспортной лихорадке, иногда помогает, но вакцины доступны и эффективны только для нескольких из агентов, которые, как известно, включены в комплекс заболевания. Общепринято считать, что конечной причиной, вызывающей гибель в большинстве случаев транспортной лихорадки, является бактериальная (обычно Pasteurella) пневмония. Pasteurella haemolytica, особенно типа IA, является наиболее общей, выделенной из случаев респираторных заболеваний в Северной Америке. Попытки экспериментально воспроизвести бактериальную пневмонию у скота обычно являются безуспешными без сильного стресса и предрасполагающего повреждения респираторного тракта. Обычно принято считать, что во время стресса вирусы, микоплазмы и/или хламидии чаще всего осуществляют начальное повреждение респираторного тракта, что и провоцирует тяжелую бактериальную инфекцию и заболевание. Вспышка типичного клинического респираторного заболевания обычно начинается в течение нескольких часов или дней по прибытии скота в загон для откорма. Недавно прибывший скот весом в интервале от 180 до 225 кг обычно дает от 10 до 80% заболеваемости и от 1 до 10% смертности или более из-за заболеваний респираторного тракта. Когда проводят анализ сыворотки скота в отношении четырехкратного увеличения антител (серологическая конверсия) и респираторный тракт и его секрецию подвергают микробиологическому выделению, можно идентифицировать мириад этиологических агентов. Можно показать, что многие животные, те, которые больны, и те, которые, по-видимому, здоровы, подверглись инфицированию одним или более из агентов (заболевание респираторного тракта, вероятно,редко связано с только одним инфекционным агентом). Хотя комплекс респираторного заболевания крупного рогатого скота распознается клинически в пункте откорма после прибытия, инфекции, вызывающие клиническое заболевание, по-видимому, начинаются в торговых помещениях, где скот вначале собирают из различных ферм; см. также Bovine Respiratory Disease, Loan, R.W. Texas AM UniversityPress, 1984, что включено в описание посредством ссылки. Введение соединения, которое лечит или модулирует возникновение, возврат, длительность и/или тяжесть мастита или респираторного заболевания у скота или другие инфекции у нечеловеческих животных, включая, без ограничения, крупный рогатый скот, птицу, свиней, лошадей, собак и кошек, должно пригодиться в ветеринарии. Примеры таких инфекций включают, без ограничения, неонатальную септицемию у лошадей, пиеропневмонию у свиней и пневмонии у нечеловеческих животных. Такие соединения могут сохранять или модулировать функцию нейтрофилов в организме животных. Семейство супергенов гормона роста (GH) (Bazan, F. Immunology Today, 11: 350-354 (1991); Mott,H.R. and Campbell, I.D. Current Opinion in Structural Biology, 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. и Ihle, J.N.(1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS) представляет собой набор белков с аналогичными структурными характеристиками. Каждый член этого семейства белков включает четырехспиральный узел. Хотя до сих пор не обнаружены другие члены указанного семейства, некоторые члены указанного семейства включают следующие: гормон роста, пролактин, плацентарный лактоген, эритропоэтин (ЕРО), тромбопоэтин (ТРО), интерлейкин-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL10, IL-11, IL-12 (р 35 субъединица), IL-13, IL-15, онкостатин М, цилиарный нейротрофический фактор,ингибирующий лейкемию фактор, альфа-интерферон, бета-интерферон, гамма-интерферон, омегаинтерферон, тау-интерферон, эпсилон-интерферон, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор(G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и кардиотропин-1 (СТ-1) ("семейство супергенов GH"). Члены семейства супергенов GH обладают аналогичными вторичными и третичными структурами, несмотря на тот факт, что они вообще отличаются ограниченной идентичностью аминокислот или ДНК последовательностей. Общие структурные характеристики позволяют легко идентифицировать новые члены генного семейства. Четырехспиральный узел полипептидов описан в публикации WO 2005/074650, озаглав-4 019968 ленной "Modified Human Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses", которая полностью включена в описание посредством ссылки. Член супергенного семейства GH представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой один из факторов роста гликопротеинов, известных как колониестимулирующие факторы (CSF), так как они поддерживают пролиферацию гемопоэтических клеток-предшественников. G-CSF стимулируют пролиферацию и дифференцирование специфических клеток-предшественников костного мозга в гранулоциты. Они отличаются от других CSF своей способностью как стимулировать образование колоний нейтрофильных гранулоцитов, так и стимулировать образование колоний нейтрофилов в полутвердом агаре и индуцировать терминальное дифференцирование мышиных миеломоноцитарных лейкемических клеток in vitro. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является эффективным стимулом для пролиферации и созревания нейтрофилов in vivo (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1987; 84: 2484-2488,см. также Heidari et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2001; 81:45-57). G-CSF также способны индуцировать функциональную активацию или "прайминг" зрелых нейтрофилов in vitro (Weisbart, R.H., Gasson,С.G. и D.W. Golde. Annals of Internal Medicine, 1989; 110:297-303). Было показано, что G-CSF примируют человеческие гранулоциты и усиливают выделение супероксида, стимулируемое хемотактическим пептидом, N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином (S. Kitagawa, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,1987; 144: 1143-1146 и С.F. Nathan, Blood, 1989; 74:301-306), и активируют фагоцитоз, опосредованный человеческими нейтрофильными IgA (Weisbart, R.Н., et al., Nature, 1988; 332: 647-649). Нейтрофилы являются критическим компонентом защитного механизма хозяина против бактериальных и грибковых инфекций. G-CSF способны индуцировать увеличение абсолютного числа циркулирующих нейтрофилов и усиление функций нейтрофилов. Были описаны клонирование кДНК и экспрессия рекомбинантных человеческих G-CSF (hG-CSF),было подтверждено, что рекомбинантные hG-CSF проявляют большинство, если не все, биологические свойства природной молекулы (Souza, L. et al. Science, 232, 61-65 (1986. Анализ последовательностей кДНК и клонов геномной ДНК позволяет дедуктивно определить аминокислотную последовательность и показывает, что указанный белок состоит из 204 аминокислот в длину с сигнальной последовательностью в 30 аминокислот. Зрелый белок состоит из 174 аминокислот в длину и не содержит потенциальных сайтов N-связанного гликозилирования кроме нескольких возможных сайтов О-связанного гликозилирования. Клонирование и экспрессия кДНК, кодирующей человеческий G-CSF, были описаны двумя группами (Nagata, S. et al., Nature, 319, 415-418 (1986); Souza, L.M. et al., Science, 232, 61-65 (1986. В первой работе, посвященной G-CSF кДНК клону, высказано предположение, что зрелый белок состоит из 177 аминокислот в длину. Авторы сообщали, что они также идентифицировали клон кДНК G-CSF, которая кодирует белок, в котором отсутствует участок из трех аминокислот. Эта более короткая форма G-CSF кДНК экспрессирует ожидаемую G-CSF активность. Во втором сообщении описывается кДНК последовательность, идентичная указанной короткой форме, и нет никаких указаний на другие варианты. Так как указанные авторы подтверждают, что короткая кДНК экспрессирует G-CSF с ожидаемым профилем биологической активности, возможно, что это и есть важная форма G-CSF и что более длинная форма является или минорным вариантом сплайсинга, или результатом артефакта клонирования.Matsumoto et al., in Infection and Immunity, Vol. 55,11, p. 2715 (1987) обсуждает защитное действие человеческого G-CSF в отношении микробных инфекций у нейтропеничных мышей. Следующие патентные публикации относятся к G-CSF: WO 8703689, который включен в описание посредством ссылки, раскрывает гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфические для человеческого G-CSF, и их использование при очистке G-CSF; в WO 8702060, который включен в описание посредством ссылки, раскрыты полипептиды, подобные человеческому G-CSF, и способы их получения; в патенте США 4810643, который включен в описание посредством ссылки, раскрыты полипептиды, подобные человеческому G-CSF, кодирующие их последовательности и способы их получения; в WO 8604605 и WO 8604506, которые включены в описание посредством ссылки, описан ген, кодирующий человеческий G-CSF, и ингибиторы инфекций, содержащие человеческий G-CSF. ВыделениеG-CSF представляет собой фармацевтически активный белок, который регулирует пролиферацию,дифференциацию и функциональную активацию нейтрофильных гранулоцитов (Metcalf, et al. Blood,67:257 (1986); Yan, et al. Blood, 84(3): 795-799 (1994); Bensinger, et al. Blood, 81(11): 3158-3163 (1993);Hematology, 26:2 1-14 (1989. G-CSF очищают до гомогенности из надосадочной жидкости клеточной культуры клеточной линии карциномы мочевого пузыря человека 5637 (Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci.Souza et al., Science (1986), 232:61-65. Вследствие альтернативного сплайсинга в указанном втором интроне существуют две природные формы hG-CSF, содержащие 204 или 207 аминокислот, из которых первые 30 представляют собой сигнальный пептид (Lymphokines, IRL Press, Oxford, Washington D.C.,Editors D. Male и С. Rickwood). Было показано, что зрелый белок имеет молекулярную массу около 19 кДа и имеет 5 цистеиновых остатков, которые могут образовывать межмолекулярные или внутримолекулярные дисульфидные мостики. Исследования связывания показали, что hG-CSF связывается с нейтрофильными гранулоцитами. Слабое связывание или его отсутствие наблюдаются с эритроидами, лимфоидными эозинофильными клеточными линиями, так же, как с макрофагами. У людей эндогенный G-CSF детектируется в плазме крови (Jones et al. Bailliere's ClinicalHematology, 2:1 83-111 (1989. hG-CSF продуцируется фибробластами, макрофагами, Т-клетками, трофобластами, эндотелиальными клетками и эпителиальными клетками и представляет собой продукт экспрессии одной копии гена, включающего четыре эксона и пять интронов, расположенных на хромосоме семнадцать. Транскрипция указанного локуса продуцирует тип мРНК, которая дифференциально процессируется, что приводит к двум формам hG-CSF мРНК, причем одна версия кодирует белок из 177 аминокислот, а другая кодирует белок из 174 аминокислот (Nagata et al. EMBO J., 5: 575-581 (1986, и было обнаружено, что форма, содержащая 174 аминокислоты, обладает наибольшей специфической invivo биологической активностью. hG-CSF представляют собой виды перекрестнореакционноспособные,так что, когда человеческие G-CSF вводят другим млекопитающим, таким как мыши, собаки или обезьяны, вырабатывается устойчивый нейтрофильный лейкоцитоз (Moore, et al. PNAS-USA, 84: 7134-7138G-CSF можно получить и выделить из многих источников. Природные человеческие G-CSF (nhGCSF) можно выделить из надосадочных жидкостей культивируемых клеточных линий опухолей человека. Создание технологии рекомбинантных ДНК, см., например, патент США 4810643 (Souza), который включен в описание посредством ссылки, обеспечил получение в промышленных количествах G-CSF в гликозилированной форме как продукт экспрессии эукариотных клеток-хозяев и G-CSF в негликозилированной форме как продукт экспрессии прокариотных клеток-хозяев. Было обнаружено, что G-CSF можно использовать для лечения таких показаний, при которых увеличение количества нейтрофилов оказывает положительное действие. G-CSF может мобилизовывать стволовые клетки и клетки-предшественники из костного мозга и его используют для лечения пациентов,гранулоциты которых истощены в результате химиотерапии, или как подготовку к трансплантации костного мозга. Например, для больных раком пациентов G-CSF является хорошим средством для селективной стимуляции продуцирования нейтрофилов для компенсации гематопоэтического дефицита, возникшего в результате химиотерапии или радиационной терапии. Другие показания включают лечение различных инфекционных заболеваний и родственных состояний, таких как сепсис, которые обычно вызываются за счет метаболизма бактерий. G-CSF можно использовать отдельно или в комбинации с другими соединениями, такими как другие цитокины, для роста или размножения клеток в культуре, например для трансплантатов костного мозга.G-CSF рецептор (G-CSFR) является членом семейства рецепторов факторов роста гематопоэтических цитокинов, которое включает некоторые другие рецепторы факторов роста, такие как рецепторы интерлейкина (IL)-3, -4 и -6 рецепторы, рецепторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), рецептор эритропоэтина (ЕРО), также как рецепторы пролактина и гормона роста; см. Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 6934-6938 (1990). Члены семейства рецепторов цитокинов содержат четыре консервативных цистеиновых остатка и мотив триптофан-серин-Х-триптофан-серин,расположенный непосредственно вне трансмембранного участка. Считают, что консервативные последовательности участвуют во взаимодействиях белок-белок; см., например, Chiba et al., Biochim. Biophys.Res. Comm., 184: 485-490 (1992). Рецептор G-CSF состоит из одной пептидной цепи с молекулярной массой около 150 кДа (Nicola, Immunol. Today, 8 (1987), 134). Гликозилированный hG-CSF сравнивают с дегликозилированным hG-CSF, полученным in vitro в результате ферментативного гидролиза нейраминидазой и эндоN-ацетилгалактозаминидазой, в отношении его стабильности как функции рН и температуры (Oh-eda et al., 1990, J. Biol. Chem., 265 (20): 11432-35). Дегликозилированный hG-CSF, растворенный в концентрации 1 мкг/мо в 20 мМ фосфатном буфере, содержащем 0,2 M NaCl и 0,01% Tween 20, быстро инактивируется в интервале значений рН от около 7 до около 8 после двух дней инкубирования при 37 С. Напротив, гликозилированный hG-CSF сохраняет более 80% своей активности в тех же условиях. Кроме того, оценка термостабильности обеих форм hG-CSF, определенная в биологическом анализе и в колориметрическом анализе, показывает, что дегликозилированный hG-CSF был менее термостабилен, чем нативная форма hG-CSF. Было предпринято несколько попыток получить стабильную фармацевтически приемлемую G-CSF композицию. Одна из попыток повышения стабильности композиции G-CSF включает синтез производных белка. В патенте США 5665863 раскрыто получение рекомбинантных химерных белков, содержащих G-CSF, соединенных с альбумином, которые обладают новыми фармакокинетическими свойствами. В патентах США 5824784 и 5320840 описано химическое присоединение водорастворимых полимеров к белкам для повышения стабильности и обеспечения защиты против протеолитического разложения и, более конкретно, N-терминально модифицированные G-CSF молекулы, содержащие химически присоединенные полимеры, включая полиэтиленгликоль.(1993, были определены с помощью дифракции рентгеновских лучей и ЯМР исследований и продемонстрировали поразительный консерватизм GH структуры, несмотря на отсутствие существенной гомологичности основной последовательности. Альтернативный подход к повышению стабильности G-CSF в композиции включает изменение аминокислотной последовательности белка. В патенте США 5416195 раскрыты генетически сконструированные аналоги G-CSF, обладающие повышенной композиционной стабильностью, где цистеиновый остаток, обычно расположенный в положении 17 цепи зрелого полипептида, остаток аспарагиновой кислоты, расположенный в положении 27, и по меньшей мере один из тандемных остатков пролина, расположенных в положениях 65 и 66, все заменены сериновым остатком. В патенте США 5773581 раскрыты генетически сконструированные аналоги G-CSF, которые были ковалентно конъюгированы с водорастворимым полимером. Различные формы человеческого G-CSF, включая их получение и очистку, которые можно использовать в способе лечения или профилактики мастита, подробно раскрыты в патенте США 4810643,который включен в описание посредством ссылки. В патенте США 4810643 раскрыты и заявлены новые генные сегменты, биологически функциональные рекомбинантные плазмиды и вирусные ДНК векторы и прокариотные и эукариотные клетки-хозяева, которые содержат G-CSF ген или генетически сконструированный вариант G-CSF гена. Клетки-хозяева экспрессируют биологически активные G-CSF или генетически сконструированный вариант G-CSF. В патентах США 5849883 и WO 89/10932 раскрыты различные исследования человеческого G-CSF в крупном рогатом скоте. Указанные исследования проводились для оценки респираторных заболеваний (Pasteurella hemolytica), реакций на бактериальные заражения (Klebsiella pneumonia) или колиформного мастита (Е. coli) у скота. В патенте США 5849883, который полностью включен в описание посредством ссылки, представлен полинуклеотид и полипептидная последовательность зрелого бычьего G-CSF (bG-CSF) и раскрыты способы клонирования, выделения и очистки указанного полипептида и его аналогов. Зрелый bGCSF состоит из 174 аминокислот в длину (SEQ ID NO: 1) и на 82% гомологичен с hG-CSF. ПолипептидbG-CSF с начальным аминокислотным остатком метионином представлен как SEQ ID NO: 2. Полинуклеотидная последовательность, которая кодирует SEQ ID NO: 1, представлена как SEQ ID NO: 3. Полинуклеотидная последовательность, которая кодирует SEQ ID NO: 2, представлена как SEQ ID NO: 4. Heidari et al. описывают экспрессию, очистку и биологическую активность bG-CSF в Veterinary Immunologyand Immunopathology (2001) 81:45-57. Ковалентное присоединение гидрофильного полимера поли(этиленгликоля), сокращенно ПЭГ,представляет собой способ повышения растворимости в воде, биодоступности, увеличения времени полужизни в сыворотке, повышения времени терапевтической полужизни, модулирования иммуногенности, модулирования биологической активности или продления времени циркуляции многих биологически активных молекул, включая белки, пептиды и особенно гидрофобные молекулы. ПЭГ интенсивно используют в фармацевтических препаратах, в искусственных имплантатах и в других применениях, где важным являются биосовместимость, отсутствие токсичности и отсутствие иммуногенности. Для достижения максимума желательных свойств ПЭГ полная молекулярная масса и гидратационное состояние ПЭГ полимера или полимеров, присоединенных к биологически активной молекуле, должны быть достаточно высоки, чтобы придать выгодные характеристики, обычно связанные с присоединением PEG полимера, такие как повышенная растворимость в воде и увеличение циркуляционного времени полужизни, при этом не оказывая вредного воздействия на биоактивность исходной молекулы. Производные ПЭГ часто связаны с биологически активными молекулами через реакционноспособные химические функциональности, такие как лизиновый, цистеиновый и гистидиновый остатки, Nконец и углеводные молекулы. Белки и другие молекулы часто имеют ограниченное число реакционноспособных сайтов, доступных для присоединения полимера. Часто сайты, которые наиболее подходят для модификации через присоединение полимера, играют значительную роль в рецепторном связывании и необходимы для сохранения биологической активности молекулы. В результате беспорядочного присоединения полимерных цепей к таким реакционноспособным сайтам биологически активной молекулы часто происходит значительное ослабление или даже полная потеря биологической активности модифицированной полимером молекулы. R. Clark et al. (1996), J. Biol. Chem., 271: 21969-21977. Для создания конъюгатов, обладающих достаточной молекулярной массой полимера для придания необходимых преимуществ мишеневой молекуле, применявшийся ранее подход обычно состоял в произвольном присоединении множества полимерных ветвей к молекуле, тем самым повышая риск ослабления или даже полной потери биоактивности исходной молекулы. Реакционноспособные сайты, которые образуют локусы для присоединения производных ПЭГ к белкам, определяются структурой белков. Белки, включая ферменты, состоят из различных последова-7 019968 тельностей альфа-аминокислот, которые имеют общую структуру H2N-CHR-COOH. Альфааминомолекула (H2N-) аминокислоты присоединяется к карбоксильной молекуле (-СООН) соседней аминокислоты с образованием амидной связи, что можно представить как -(NH-CHR-CO)n-, где подстрочное "n" может принимать значения сотен или тысяч. Фрагмент, представленный как R, может содержать реакционноспособные сайты для биологической активности белка и для присоединения производных ПЭГ. Например, в случае аминокислоты лизин существует -NH2 молекула в эпсилон положении, также как в альфа положении. Эпсилон -NH2 свободен для реакции в условиях щелочных значений рН. Множество работ в области получения производных белка, содержащих ПЭГ, были направлены на создание производных ПЭГ для присоединения к эпсилон -NH2 молекуле лизиновых остатков, присутствующих в белках. "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, p. 1-17. Все указанные производные ПЭГ имеют, однако, общее ограничение, состоящее в том,что их нельзя включить селективно среди множества лизиновых остатков, расположенных на поверхности белков. Это является существенным ограничением в случае, когда лизиновый остаток важен для активности белка, существующей в сайте ферментной активности, например, или в случае, когда лизиновый остаток играет роль в опосредовании взаимодействия белка с другой биологической молекулой, как в случае сайтов рецепторного связывания. Вторая и одинаково важная сложность существующих способов ПЭГилирования белков состоит в том, что производные ПЭГ могут претерпевать нежелательные побочные реакции с другими остатками,отличающимися от желательных. Гистидин содержит реакционноспособную имино-молекулу, представленную структурно как -N(H)-, но многие химически реакционноспособные виды, которые реагируют с эпсилон -NH2, могут также реагировать с -N(H)-. Аналогично, боковая цепь аминокислоты цистеина содержит свободную сульфгидрильную группу, представленную структурно как -SH. В некоторых случаях производные ПЭГ, направленные по -NH2 группе лизина, также реагируют с цистеиновым, гистидиновым или другими остатками. Это создает сложные, гетерогенные смеси ПЭГ-производных биоактивных молекул и риск нарушения активности биоактивной молекулы, являющейся целью. Было бы желательно создать такие производные ПЭГ, которые позволили бы вводить химически функциональную группу в один сайт в белке, что обеспечило бы селективное присоединение одного или более из ПЭГ полимеров к биоактивной молекуле по специфическим сайтам на поверхности белка, которые являются одновременно хорошо известными и предсказуемыми. Кроме лизиновых остатков, значительные попытки специалистов были направлены на создание активированных ПЭГ реагентов на другие боковые цепи аминокислот, включая цистеин, гистидин и Nконец; см., например, патент США 6610281, который включен в описание посредством ссылки, и"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,p. 1-17. Цистеиновый остаток можно вводить сайт-селективно в структуры белков, используя сайтнаправленный мутагенез и другие методы, известные специалистам, и полученную свободную сульфгидрильную молекулу можно подвергнуть взаимодействию с производным ПЭГ, которое содержит тиолреакционноспособные функциональные группы. Такой подход, однако, сложен в том, что введение свободной сульфгидрильной группы может осложнить экспрессию, укладку (фолдинг) и стабильность полученного белка. Поэтому было бы желательно иметь средства для введения химически функциональной группы в биоактивные молекулы, которые обеспечили бы селективное присоединение одного или более из ПЭГ полимеров к белку, который одновременно оставался бы совместимым с (то есть не участвовал бы в нежелательных побочных реакциях с) сульфгидрилами и другими химически функциональными группами, обычно присутствующими в белках. Как видно из обзора, многие из указанных производных, которые были созданы для присоединения к боковым цепям белков, особенно -NH2 молекулы на боковой цепи аминокислоты лизина и -SH молекулы на боковой цепи цистеина, была доказана проблематичность их синтеза и применения. Некоторые образуют нестабильные связи с белком, которые подвержены гидролизу и поэтому разрушаются, или оказываются другим образом нестабильными в водной среде, такой как кровоток. Некоторые образуют более стабильные связи, но подвергаются гидролизу прежде, чем связь образуется, что означает, что реакционноспособная группа на ПЭГ производном может быть инактивирована прежде, чем белок может быть присоединен. Некоторые являются в некоторой степени токсичными и поэтому менее подходящими для применения in vivo. Некоторые реагируют слишком медленно, чтобы иметь практическое значение. Некоторые приводят к потере активности белка, присоединяясь к сайтам, ответственным за активность белка. Некоторые не являются специфическими в сайтах, к которым они должны присоединиться,что также сможет привести к утрате желательной активности и к отсутствию воспроизводимости результатов. Для преодоления проблем, связанных с модифицированием белков молекулами поли(этиленгликоля), были созданы производные ПЭГ, которые были более стабильными (например, см. патент США 6602498, который включен в описание посредством ссылки) или которые селективно реагируют с тиольными молекулами на молекулах и на поверхности (например, см. патент США 6610281, который включен в описание посредством ссылки). Существует настоятельная необходимость в ПЭГ производных, которые были бы химически инертными в физиологической среде до селективной реакции с образованием стабильных химических связей. Применение конъюгатов гидроксиалкилкрахмала и, в частности, применение гидроксиэтилкрахмала (HES), ковалентно связанного с полипептидом, было раскрыто для потенциального изменения иммуногенности полипептида и/или аллергенности. ПЭГилирование представляет собой альтернативную методику, которая обсуждалась в ряде патентных заявок, принадлежащих Fresenius Kabi A.B., включая патентные публикации США 20050063943, 20060121073, 20010100163, 20050234230, 20050238723,20060019877, 20070134197, 20070087961, а также патент США 7285661, причем все они включены в описание посредством ссылки. HES представляет собой модифицированный природный полимер, который был клинически использован в качестве агента, увеличивающего объем плазмы, и ПЭГилирование представляет собой методику присоединения лекарственного вещества к HES производным для модификации характеристик лекарственного вещества, таких как фармакокинетика или растворимость в воде. Характеристики также включают пролонгирование циркуляции белка в плазме за счет повышенной стабильности молекулы и пониженного почечного клиренса, что приводит к повышению биологической активности. Кроме того, могут быть снижены иммуногенность или аллергенность. Изменяя различные параметры, такие как молекулярная масса HES, можно создать широкий круг HES конъюгатов. Тем не менее, гидроксиэтилкрахмал имеет недостаток, общий с другими доступными в настоящее время полимерами: их полидисперсность. Полимерные конъюгаты представляют собой смесь молекул с молекулярно массовым распределением около среднего значения. Такой недостаток гомогенности приводит к низким уровням химической и биохимической характеризации и может предотвратить достижение фармацевтически активным компонентам сайта его действия (рецептора, фермента и т.д.). В таких случаях,чтобы лекарственное средство было активным, необходима его доставка в исходной неконъюгированной форме и таким образом расщепление полимера в метаболических реакциях требуется для его фармацевтической эффективности. Недавно появились сообщения о совершенно новой методике в науке о белках, которая обещает преодолеть многие из ограничений, связанных с сайт-специфическими модификациями белков. Более конкретно, новые компоненты были добавлены к механизму биосинтеза белков прокариотной Escherichiacoli (E. coli) (например, L. Wang, et al. (2001), Science, 292:498-500) и эукариотным Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (например, J. Chin et al., Science, 301: 964-7 (2003, что сделало возможным включение не кодируемой генетически аминокислоты в белки in vivo. Ряд новых аминокислот с новыми химическими, физическими или биологическими свойствами, включая метки фотосродства и фотоизомеризуемые аминокислоты, фотосшиваемые аминокислоты (см., например, Chin, J.W., et al. (2002) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 99: 11020-11024 и Chin, J.W., et al. (2002) J. Am. Chem. Soc., 124:9026-9027), кетоаминокислоты, аминокислоты, содержащие тяжелые атомы, и гликозилированные аминокислоты, были эффективно и с высокой точностью включены в белки в Е. coli и в дрожжи в ответ на амбер-кодон, TAG,используя указанную методику; см., например, J.W. Chin et al., (2002), Journal of the American ChemicalSociety, 124:9026-9027; J.W. Chin,P.G. Schultz, (2002), ChemBioChem, 3(11):1135-1137; J.W. Chin, et al.,(2002), PNAS United States of America, 99: 11020-11024 и L. Wang,P.G. Schultz, (2002), Chem. Comm.,1:1-11. Все ссылки полностью включены в описание посредством ссылки. Представленные исследования продемонстрировали, что возможно селективно и рутинно вводить химические функциональные группы,такие как кетонные группы, группы алкина и азидные молекулы, которые не встречаются в белках, которые химически инертны в отношении всех функциональных групп, присутствующих в 20 обычных, генетически кодируемых аминокислотах, и которые можно использовать для селективной и эффективной реакции с образованием стабильной ковалентной связи. Способность включать не кодируемые генетически аминокислоты в белки позволяет вводить химические функциональные группы, которые могут предоставить альтернативы природным функциональным группам, таким как эпсилон -NH2 лизина, сульфгидрил -SH цистеина, иминогруппа гистидина и т.д. Известно, что некоторые химические функциональные группы инертны в отношении функциональных групп, присутствующих в 20 обычных, кодируемых генетически аминокислотах, но реагируют точно и эффективно с образованием стабильной связи. Азидные и ацетиленовые группы, например, как известно специалистам, претерпевают реакцию [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена в присутствии каталитического количества меди; см., например, Tornoe, et al., (2002) J. Qrg. Chem., 67:3057-3064 и Rostovtsev, et al.(2002) Angew. Chem., Int. Ed, 41:2596-2599. Путем введения азидной молекулы в структуру белка, например, можно включить функциональную группу, которая химически инертна в отношении аминов,сульфгидрилов, карбоксильных кислот, гидроксильных групп, находящихся в белках, но которая также реагирует хорошо и эффективно с ацетиленовой молекулой с образованием продукта циклоприсоединения. Важно, что в отсутствие ацетиленовой молекулы азид остается химически инертным и нереакционноспособным в присутствии других боковых цепей белков и в физиологических условиях. Настоящее изобретение нацелено, среди прочего, на проблемы, связанные с активностью и продуцированием полипептидов bG-CSF, и также нацелено на получение полипептида bG-CSF с улучшенными биологическими или фармакологическими свойствами и/или повышенным терапевтическим временем полужизни. Сущность изобретения В настоящем изобретении предложены полипептиды bG-CSF, включающие одну или более не кодируемых в природе аминокислот. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает одну или более из посттрансляционных модификаций. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF связан с линкером, полимером или биологически активной молекулой. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF связан с бифункциональным полимером, бифункциональным линкером или по меньшей мере одним дополнительным полипептидомbG-CSF. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером линкером или связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах молекула поли(этиленгликоля) является бифункциональным полимером. В некоторых вариантах бифункциональный полимер связан со вторым полипептидом. В некоторых вариантах указанный второй полипептид представляет собой полипептид bG-CSF. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает по меньшей мере две аминокислоты, связанные с водорастворимым полимером, включающим молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах по меньшей мере одна аминокислота представляет собой не кодируемую в природе аминокислоту. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений в bG-CSF: перед положением 1 (то есть на N-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142,143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164,165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (то есть на карбоксильном конце белка) и любую их комбинацию (SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 2 либо соответствующие аминокислоты в другом полипептиде bG-CSF). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений bG-CSF: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134,136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любую из их комбинаций из SEQ ID NO: 1 или соответствующих аминокислот в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений в bG-CSF: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123,124, 133, 134, 141, 166 и любую из их комбинаций (SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты вSEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений bG-CSF: 3, 7, 62, 133, 166 и любую из их комбинаций изSEQ ID NO: 1 или соответствующих аминокислот в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений bGCSF: 62, 133 и их комбинаций (SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в положении 62 bG-CSF (SEQ ID NO: 1 или соответствующая аминокислота в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в положение 133 bG-CSF (SEQ IDNO: 1 или соответствующая аминокислота в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах полипептид по настоящему изобретению включает одно или более из природных аминокислотных замещений, добавлений или делеций. В некоторых вариантах одна или более из неприродных аминокислот включена в лидерную или в сигнальную последовательность, которая является N- или С-терминальной в отношении SEQ IDNO: 1, 2 или другой bG-CSF последовательности. В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения: перед положением 1 (то есть на N-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 1 11, 112, 113,114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135,136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (то есть на карбоксильном конце белка) и любую их комбинацию (SEQ ID NO: 1 или у соответствующих аминокислот вSEQ ID NO: 2 либо у соответствующих аминокислот в другом полипептиде bG-CSF). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125,133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любую их комбинацию (SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3,7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166 и любую их комбинацию (SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 62, 133, 166 и любую их комбинацию (SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 62, 133 и их комбинацию (SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 62 связана с водорастворимым полимером (SEQ ID NO: 1 или соответствующей аминокислотой в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 133 связана с водорастворимым полимером(SEQ ID NO: 1 или соответствующей аминокислотой в SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в сигнальной или лидерной последовательности N- или С-терминальной относительно SEQ ID NO: 1, 2 или другой bG-CSF последовательности связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют сродство полипептида bG-CSF к рецептору или к связываемому партнеру, включая, без ограничения, белок, полипептид, малые молекулы или нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые повышают стабильность полипептида bG-CSF по сравнению со стабильностью соответствующих полипептидов bG-CSF без замещения, добавления или делеции. Стабильность и/или растворимость можно измерить, используя ряд различных анализов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Такие анализы включают, без ограничения, SE-HPLC и RP-HPLC. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют иммуногенность полипептида bG-CSF по сравнению с иммуногенностью соответствующих полипептидов bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют время полужизни в сыворотке или время циркуляции полипептида bG-CSF по сравнению со временем полужизни в сыворотке или со временем циркуляции соответствующих bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые повышают водорастворимость полипептида bG-CSF по сравнению с водорастворимостью соответствующих полипептидов bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые повышают растворимость полипептида bG-CSF, продуцируемого в клетке-хозяине, по сравнению с растворимостью соответствующихbG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые повышают экспрессию полипептида bG-CSF в клеткехозяине или повышают синтез in vitro no сравнению с экспрессией или синтезом соответствующих bGCSF без замещения, добавления или делеции. Полипептид bG-CSF, включающий такое замещение, сохраняет агонистическую активность и сохраняет или повышает уровни экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые повышают устойчивость протеазы полипептида bG-CSF по сравнению с устойчивостью протеазы соответствующих bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют активность сигнальной трансдукции рецептора по сравнению с активностью рецептора при взаимодействии с соответствующим полипептидом bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют его связывание с другой молекулой, такой как рецептор, по сравнению со связыванием соответствующих полипептидов bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение,добавление или делецию, которые модулируют гематопоэз по сравнению с гематопоэзом соответствующих полипептидов bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептидbG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют пролиферацию нейтрофилов по сравнению с пролиферацией нейтрофилов соответствующих полипептидов bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют созревание нейтрофилов по сравнению с созреванием нейтрофилов соответствующих полипептидов bG-CSF без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF включает замещение, добавление или делецию, которые повышают совместимость полипептида bG-CSF с фармацевтическими консервантами (например, wкрезолом, фенолом, бензиловым спиртом) по сравнению с совместимостью соответствующих bG-CSF без замещения, добавления или делеции. Такое повышение совместимости должно обеспечить возможность получения законсервированных фармацевтических композиций, которые сохраняют физикохимические свойства и биологическую активность белка в процессе хранения. В некоторых вариантах одну или более из сконструированных связей создают с одной или более из неприродных аминокислот. Внутримолекулярную связь можно создать различными способами, включая,без ограничения, реакцию между двумя аминокислотами в белке в подходящих условиях (одна или обе аминокислоты могут быть неприродными аминокислотами); реакцию двух аминокислот, каждая из которых может быть кодируемой в природе или не кодируемой в природе, с линкером, полимером или другой молекулой в подходящих условиях; и т.д. В некоторых вариантах одно или более из аминокислотных замещений в полипептиде bG-CSF может осуществляться одной или более из природных или неприродных аминокислот. В некоторых вариантах аминокислотные замещения в полипептиде bG-CSF могут осуществляться природными или неприродными аминокислотами при условии, что по меньшей мере одно замещение происходит не кодируемой в природе аминокислотой. В некоторых вариантах одно или более из аминокислотных замещений в полипептиде bG-CSF происходит одной или более из природных аминокислот и, кроме того, по меньшей мере одно замещение происходит не кодируемой в природе аминокислотой. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает карбонильную группу,ацетильную группу, аминооксигруппу, группу гидразина, группу гидразида, группу семикарбазида,группу азида или группу алкина. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает карбонильную группу. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота имеет следующую структуру: где n принимает значения 0-10; R1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил; R2 представляет собой Н, алкил, арил, замещенный алкил и замещенный арил; R3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую аминоконец; и R4 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбоксиконец. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает аминооксигруппу. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает группу гидразида. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает группу гидразина. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты включает группу семикарбазида. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты включает группу азида. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота имеет следующую структуру: где n принимает значения 0-10; R1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил, замещенный арил или отсутствует; X представляет собой О, N, S или отсутствует; m принимает значения 0-10; R2 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую аминоконец; и R3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбоксиконец. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает группу алкина. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота имеет следующую структуру: где n принимает значения 0-10; R1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил; X представляет собой О, N, S или отсутствует; m принимает значения 0-10; R2 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую аминоконец; и R3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбоксиконец. В некоторых вариантах полипептид представляет собой агонист, частичный агонист, антагонист,частичный антагонист или обратный агонист полипептида bG-CSF. В некоторых вариантах агонист, частичный агонист, антагонист, частичный антагонист или обратный агонист полипептида bG-CSF включают не кодируемую в природе аминокислоту, связанную с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах агонист, частичный агонист, антагонист, частичный антагонист или обратный агонист полипептида bG-CSF включают не кодируемую в природе аминокислоту и одну или более из посттрансляционных модификаций, линкеров, полимеров или биологически активных молекул. В настоящем изобретении также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с SEQ ID NO: 3, 4 или нуклеиновыми кислотами, которые кодируют полипептиды SEQ ID NO: 1, 2. В настоящем изобретении также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с SEQ ID NO: 3, 4 или полинуклеотидами, которые гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидами, которые кодируют полипептиды, представленные как SEQ ID NO: 1, 2, где указанный полинуклеотид включает по меньшей мере один селекторный кодон. В настоящем изобретении также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который кодирует полипептиды, представленные как SEQ ID NO: 1, 2. В настоящем изобретении также предложены выделенные нук- 12019968SEQ ID NO: 1, 2 с одной или более из не кодируемых в природе аминокислот. Специалисты в данной области легко поймут, что множество различных полинуклеотидов может кодировать любой полипептид по настоящему изобретению. В некоторых вариантах селекторный кодон выбирают из группы, состоящей из янтарного кодона,охра-кодона, опал-кодона, уникального кодона, редкого кодона, пятиосновного кодона и четырехосновного кодона. В настоящем изобретении также предложены способы получения полипептида bG-CSF, связанного с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный способ включает осуществление контактирования выделенного полипептида bG-CSF, включающего не кодируемую в природе аминокислоту,с водорастворимым полимером, включающим молекулу, которая реагирует с не кодируемой в природе аминокислотой. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота, включенная в полипептид bG-CSF, является реакционноспособной в отношении водорастворимого полимера, который иначе является нереакционноспособным в отношении любой из 20 обычных аминокислот. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота, включенная в полипептид bG-CSF, является реакционноспособной в отношении линкера, полимера или биологически активной молекулы, которая иначе является нереакционноспособной в отношении любой из 20 обычных аминокислот. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF, объединенный с водорастворимым полимером, получают, осуществляя взаимодействие полипептида bG-CSF, включающего карбонилсодержащую аминокислоту, с молекулой поли(этиленгликоля), включающей аминооксигруппу, группу гидразина, группу гидразида или группу семикарбазида. В некоторых вариантах аминооксигруппа, группа гидразина, группа гидразида или группа семикарбазида связаны с молекулой поли(этиленгликоля) через амидную связь. В некоторых вариантах аминооксигруппа, группа гидразина, гидразида или семикарбазида связаны с молекулой поли(этиленгликоля)через карбаматную связь. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF, связанный с водорастворимым полимером, получают,осуществляя взаимодействие молекулы поли(этиленгликоля), включающей карбонильную группу, с полипептидом, включающим не кодируемую в природе аминокислоту, которая содержит аминооксигруппу, группу гидразина, группу гидразида или группу семикарбазида. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF, связанный с водорастворимым полимером, получают,осуществляя взаимодействие полипептида bG-CSF, включающего алкинсодержащую аминокислоту с молекулой поли(этиленгликоля), включающей азидную молекулу. В некоторых вариантах группа азида или алкина связана с молекулой поли(этиленгликоля)через амидную связь. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF, связанный с водорастворимым полимером, получают,осуществляя взаимодействие полипептида bG-CSF, включающего азидсодержащую аминокислоту с молекулой поли(этиленгликоля), включающей молекулу алкина. В некоторых вариантах группы азида или алкина связаны с молекулой поли(этиленгликоля)через амидную связь. В некоторых вариантах молекулярная масса молекулы поли(этиленгликоля) составляет величину от около 0,1 до около 100 кДа. В некоторых вариантах молекулярная масса молекулы поли(этиленгликоля) составляет величину от 0,1 до 50 кДа. В некоторых вариантах молекула поли(этиленгликоля) представляет собой разветвленный полимер. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой ветви разветвленного полимера поли(этиленгликоля) составляет величину от 1 до 100 кДа или от 1 до 50 кДа. В некоторых вариантах водорастворимый полимер, связанный с полипептидом bG-CSF, включает молекулу полиалкиленгликоля. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты,включенной в полипептид bG-CSF, включает карбонильную группу, аминооксигруппу, группу гидразида, группу гидразина, группу семикарбазида, группу азида или группу алкина. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты, включенной в полипептид bG-CSF, включает карбонильную молекулу и водорастворимый полимер включает аминоокси молекулу, молекулу гидразида,гидразина или семикарбазида. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты,включенной в полипептид bG-CSF, включает молекулу алкина и водорастворимый полимер включает азидную молекулу. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты, включенной в полипептид bG-CSF, включает азидную молекулу и водорастворимый полимер включает молекулу алкина. В настоящем изобретении также предложены композиции, включающие полипептид bG-CSF,включающий не кодируемую в природе аминокислоту и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером. В настоящем изобретении также предложены клетки, включающие полинуклеотид, кодирующий полипептид bG-CSF, включающий селекторный кодон. В некоторых вариантах указанные клетки включают ортогональную РНК синтетазу и/или ортогональную тРНК для замещения не кодируемой в природе аминокислоты в полипептид bG-CSF. В настоящем изобретении также предложены способы получения полипептида bG-CSF, включающего не кодируемую в природе аминокислоту. В некоторых вариантах указанные способы включают культивирование клеток, включающих полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующие полипептидbG-CSF, ортогональную РНК синтетазу и/или ортогональную тРНК, в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида bG-CSF; и выделение полипептида bG-CSF из клеток и/или культуральной среды. В настоящем изобретении также предложены способы увеличения терапевтического времени полужизни, времени полужизни в сыворотке или времени циркуляции полипептидов bG-CSF. В настоящем изобретении также предложены способы модулирования иммуногенности полипептидов bG-CSF. В некоторых вариантах указанные способы включают замещение не кодируемой в природе аминокислотой любой одной или более из аминокислот в природных полипептидах bG-CSF и/или связывание полипептида bG-CSF с линкером, полимером, водорастворимым полимером или биологически активной молекулой. В настоящем изобретении также предложены способы лечения нуждающегося в таком лечении пациента эффективным количеством bG-CSF молекул по настоящему изобретению. В некоторых вариантах указанные способы включают введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей полипептид bG-CSF, включающий неприродную аминокислоту и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF гликозилирован. В некоторых вариантах полипептид bG-CSF не гликозилирован. В настоящем изобретении также предложены полипептиды bG-CSF, включающие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 2, или любую другую полипептидную bG-CSF последовательность, при условии, что по меньшей мере одна аминокислота в ней замещена не кодируемой в природе аминокислотой. В настоящем изобретении также предложены полипептиды bG-CSF, включающие последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1, 2. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает карбонильную группу, аминооксигруппу, группу гидразида, группу гидразина, группу семикарбазида, группу азида или группу алкина. В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый носитель и полипептид bG-CSF, включающий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 2, или любую другую полипептидную bG-CSF последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота замещена не кодируемой в природе аминокислотой. В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый носитель и G-CSF полипептид, включающий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1,2. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает сахаридную молекулу. В некоторых вариантах водорастворимый полимер связан с полипептидом через сахаридную молекулу. В некоторых вариантах линкер, полимер или биологически активная молекула связаны с полипептидомbG-CSF через сахаридную молекулу. В настоящем изобретении также предложен полипептид bG-CSF, включающий водорастворимый полимер, связанный ковалентной связью с полипептидом bG-CSF по одной аминокислоте. В некоторых вариантах водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах аминокислота, ковалентно связанная с водорастворимым полимером, является не кодируемой в природе аминокислотой, присутствующей в полипептиде. В некоторых вариантах по настоящему изобретению полипептид bG-CSF, включающий HES, связанный ковалентной связью с полипептидом bG-CSF, связан по одной аминокислоте. В некоторых вариантах указанная единственная аминокислота, ковалентно связанная с HES, является не кодируемой в природе аминокислотой, присутствующей в полипептиде. В некоторых вариантах по настоящему изобретению полипептид bG-CSF включает множество не кодируемых в природе аминокислот, которые могут быть связаны с множеством HES и/или ПЭГ молекул. В настоящем изобретении предложен полипептид bG-CSF, включающий по меньшей мере один линкер, полимер или биологически активную молекулу, где указанные линкер, полимер или биологически активная молекула присоединены к указанному полипептиду через функциональную группу не кодируемой в природе аминокислоты, рибосомально включенной в указанный полипептид. В некоторых вариантах указанный полипептид является моноПЭГилированным. В настоящем изобретении также предложен полипептид bG-CSF, включающий линкер, полимер или биологически активную молекулу,которые присоединены к одной или более из не кодируемых в природе аминокислот, где указанные не кодируемые в природе аминокислоты рибосомально включены в полипептид в заранее выбранных сайтах. В объем настоящего изобретения включены bG-CSF лидерная или сигнальная последовательности,соединенные с кодирующим участком bG-CSF, также как гетерологичная сигнальная последовательность, соединенная с кодирующим участком bG-CSF. Выбранная гетерологичная лидерная или сигнальная последовательность должна быть последовательностью, которая распознается и процессируется, например, системой секреции клетки-хозяина для секретирования и возможного расщепления сигнальной пептидазой клетки-хозяина. Способ лечения состояния или нарушения с использованием bG-CSF по на- 14019968 стоящему изобретению подразумевает применение лечения с помощью bG-CSF, содержащего или не содержащего сигнального или лидерного пептида. В настоящем изобретении предложен способ лечения и профилактики инфекции у животных. В настоящем изобретении также предложен способ лечения и профилактики мастита и транспортной лихорадки крупного рогатого скота. В настоящем изобретении также предложен способ лечения инфекций у животных без создания штамма устойчивых бактерий. Кроме того, в настоящем изобретении предложен очищенный и выделенный полипептид, имеющий часть или всю конформацию первичной структуры и одно или более из биологических свойств природного бычьего G-CSF, и ДНК последовательности, кодирующие такие бычьи G-CSF. В другом варианте настоящего изобретения один или более из дополнительных колониестимулирующих факторов вводят инфицированному животному с G-CSF, включая, без ограничения, GM-CSF,M-CSF и мульти-CSF (IL-3). CSF вводят вместе или отдельно. В следующем варианте инфекции животных лечат путем введения G-CSF с одним или более из: интерферонов, включая, без ограничения, интерферон, IL2 и TNF, или с традиционными антибиотиками, включая, без ограничения, пенициллин,цефалоспорины и аминогликозиды. В другом варианте лечение bG-CSF используют в целях профилактики. bG-CSF можно использовать в качестве профилактической обработки для усиления защитных сил животных, которые подвержены риску заражения бактериальной, дрожжевой или грибковой инфекцией. Например, bG-CSF можно использовать в качестве профилактической обработки здоровых животных, подверженных риску заражения инфекцией, включая, без ограничения, пневмонию. Термин "здоровый" в том смысле, как здесь использован, означает животное с нормальным иммунитетом и нормальным количеством и дифференциалом лейкоцитов. Скот лечат профилактически перед транспортировкой или другими ситуациями,которые могут ослабить скот, чтобы повысить их способность побеждать инфекции. Введение bG-CSF можно осуществить в то время, когда скот обрабатывают, то есть вакцинируют, клеймят и т.д. Обработку с помощью bG-CSF можно также осуществить в период "сухостоя" и/или непосредственно перед отелом коровы, чтобы уменьшить возможность внутриматочной инфекции после отела и мастита на ранних стадиях лактации. See Kehrli et al., Am. J. Vet. Res., 50, No. 2, 207 (1989); Oliver et al., J. Dairy Sci., 71: 25842606 (1988) и Kehrli et al., J. Dairy Sci. 74:4399-4412 (1991) для описания функций бычьих нейтрофилов на протяжении периода отела. Обычно обработку антибиотиками не осуществляют непосредственно перед отелом из-за остатков, которые могут появиться в коровьем молоке, делая его непригодным для использования. В другом варианте конъюгирование полипептида bG-CSF, включающего одну или более из неприродных аминокислот, с другой молекулой, включая, без ограничения, ПЭГ, позволяет получить, по существу очищенный bG-CSF благодаря уникальной химической реакции, используемой для конъюгирования с неприродной аминокислотой. Конъюгирование bG-CSF, включающего одну или более из не кодируемых в природе аминокислот, с другой молекулой, такой как ПЭГ, можно осуществить, используя другие методики очистки, осуществляемые перед или после стадии конъюгирования, получая практически чистые bG-CSF. Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображена плазмида, используемая для экспрессии bG-CSF; на фиг. 2 представлены подробности, касающиеся клеточной линии хозяина, используемой для экспрессии bG-CSF; на фиг. 3 представлен SDS PAGE анализ экспрессии полипептидов bG-CSF по настоящему изобретению; на фиг. 4 представлен SDS PAGE анализ пиковых фракций CM FF колонки для bG-CSF перед ПЭГилированием; на фиг. 5 представлен SDS-PAGE анализ пиковых фракций SP HP колонки для ПЭГилированногоbG-CSF-T133pAF; на фиг. 6 представлен SDS-PAGE анализ b-GCSF до и после ПЭГилирования; на фиг. 7 а представлен трипсин/Glu-C гидролизат дикого типа bG-CSF (детектирование на 214 нм); на фиг. 7b представлен трипсин/Glu-C гидролизат bG-CSF T133pAF (детектирование на 214 нм); на фиг. 8 а представлен трипсин/Glu-C гидролизат дикого типа bG-CSF (детектирование на 250 нм); на фиг. 8b представлен трипсин/Glu-C гидролизат bG-CSF T133pAF (детектирование на 250 нм); на фиг. 9 а представлен Glu-C гидролизат дикого типа bG-CSF (детектирование на 214 нм); на фиг. 9b представлен Glu-C гидролизат bG-CSF T133pAF (детектирование на 214 нм); на фиг. 10a представлен Glu-C гидролизат дикого типа bG-CSF (250 нм детектирование); на фиг. 10b представлен Glu-C гидролизат bG-CSF T133pAF (250 нм детектирование); на фиг. 11 представлен SEC-ВЭЖХ анализ ПЭГилированного полипептида bG-CSF; на фиг. 12 представлен SEC-ВЭЖХ анализ полипептида bG-CSF; на фиг. 13 представлены необработанные ЕС 50 значения, полученные в M-NFS60 пролиферационном анализе 20K ПЭГилированных бычьих G-CSF T133pAF и дикого типа; на фиг. 14 представлены кратные ЕС 50 различия в M-NFS60 пролиферационном анализе 20K ПЭ- 15019968 Гилированных бычьих G-CSF T133pAF относительно дикого типа; на фиг. 15 представлены результаты эксперимента анализа бычьих нейтрофилов, окрашенныхCD11b антителом; на фиг. 16 представлены результаты введения ПЭГилированных bG-CSF в отношении ANC; фиг. 17 - линейный график, демонстрирующий абсолютное количество нейтрофилов (среднеест.откл., ошибка) у телят, обработанных или буфером для лекарственного средства, или ПЭГилированным bG-CSF после одной подкожной инъекции в дозе 40 мкг/кг; фиг. 18 - линейный график, демонстрирующий среднее дневное производство молока коровами из примера 40 мкг/кг. фиг. 19 - столбиковая диаграмма, демонстрирующая различия в количестве соматических клеток в дни 3, 5, 7 и 10 после отела между четырьмя группами коров, включая контрольную группу, группу, обработанную неПЭГилированными bG-CSF при ежедневной обработке, группу, инъецированную ПЭГилированными bG-CSF в дозе 40 мкг/кг, и группу, инъецированную ПЭГилированными bG-CSF в дозе 20 мкг/кг. Определения Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными, раскрытыми здесь методами, протоколами, клеточными линиями, конструкциями и реагентами и, как таковые, они могут варьироваться. Следует также понимать, что используемая здесь терминология приведена только для целей описания конкретных вариантов и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения,которое должно быть ограничено только прилагаемой формулой изобретения. В описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если только в контексте нет четких указаний на обратное. Так, например, ссылки на"bGCSF" "бычьи G-CSF", "bG-CSF", "бычий G-CSF полипептид" или "полипептид bG-CSF" и различные формы с дефисом или без дефиса являются ссылкой на один или более из таких белков и включают их эквиваленты, известные специалистам в данной области и т.д. Если не определено иначе, все использованные технические и научные термины имеют те же самые значения, которые обычно подразумевают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя можно использовать любые способы, устройства и материалы аналогичные или эквивалентные раскрытым здесь в практике или тестировании настоящего изобретения, далее будут раскрыты предпочтительные методы, устройства и материалы. Все упомянутые в описании публикации и патенты включены посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, конструкций и методологий, которые раскрыты в публикациях, которые можно использовать в связи с раскрытым настоящим изобретением. Обсуждаемые здесь публикации предложены исключительно для их раскрытия перед датой подачи рассматриваемого изобретения. Ничего из приведенного здесь не следует толковать, как допущение того, что авторы изобретения не полномочны датировать задним числом такое раскрытие на основании более раннего изобретения или по каким-либо другим причинам. Термин "по существу очищенный" относится к полипептиду bG-CSF, который может, по существу,или практически не содержать компонентов, которые обычно сопутствуют белку или взаимодействуют с белком, как это происходит в его природном окружении, то есть природных клеток, или клеток-хозяев в случае рекомбинантно получаемых полипептидов bG-CSF. Полипептиды bG-CSF, которые могут практически не содержать клеточного материала, включают препараты белка, содержащие менее чем около 30, менее чем около 25, менее чем около 20, менее чем около 15, менее чем около 10, менее чем около 5,менее чем около 4, менее чем около 3, менее чем около 2 или менее чем около 1% (в расчете на сухой вес) загрязняющего белка. Если полипептид bG-CSF или его вариант рекомбинантно получен с использованием клетки-хозяина, указанный белок может присутствовать в количестве около 30, около 25, около 20, около 15, около 10, около 5, около 4, около 3, около 2 или около 1% или меньше в расчете на сухой вес клетки. Если полипептид bG-CSF или его вариант рекомбинантно получен с использованием клеткихозяина, указанный белок может присутствовать в культуральной среде в концентрации около 5, около 4,около 3, около 2, около 1 г/л, около 750, около 500, около 250, около 100, около 50, около 10 или около 1 мг/л или меньше в расчете на сухой вес клетки. Так, "по существу очищенный" полипептид bG-CSF, полученный указанными способами настоящего изобретения, может иметь степень чистоты по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70%, особенно степень чистоты по меньшей мере около 75, 80, 85% и более конкретно степень чистоты по меньшей мере около 90, степень чистоты по меньшей мере около 95, степень чистоты по меньшей мере около 99% или больше, что определено соответствующими способами,такими как SDS/PAGE анализ, RP-HLPC, SEC и капиллярный электрофорез. Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" или "клетка-хозяин" относится к клетке, которая включает экзогенный полинуклеотид, независимо от использованного способа встраивания, например прямого захвата, трансдукции, f-скрещивания, или других способов, известных специалистам в данной области для создания рекомбинантной клетки-хозяина. Экзогенный полинуклеотид можно сохранять как неин- 16019968 тегрированный вектор, например плазмиду, или, альтернативно, можно интегрировать в геном хозяина. Термин "среда" или "среды" включает любую культуральную среду, раствор, твердую, полутвердую или жесткую подложку, которая может поддерживать или содержать любую клетку-хозяина, включая бактериальные клетки-хозяева, дрожжевые клетки-хозяева, клетки-хозяева насекомых, растительные клетки-хозяева, эукариотные клетки-хозяева, клетки-хозяева млекопитающих, СНО клетки, прокариотные клетки-хозяева, Е. coli или Pseudomonas клетки-хозяева, и содержание клеток. Таким образом, термин может включать среду, в которой клетка-хозяин выращивалась, например среду, в которую полипептид bG-CSF был секретирован, включая среду как до, так и после стадии пролиферации. Указанный термин может также включать буферы или реагенты, которые содержат лизаты клетки-хозяина, такие как в случае, когда полипептид bG-CSF продуцируется внутриклеточно, и клетки-хозяева подвергаются лизису или разрушению для выделения полипептида bG-CSF. Термин "восстанавливающий агент" в отношении рефолдинга белка определяют как любое соединение или материал, которые сохраняют сульфгидрильные группы в восстановленном виде и восстанавливают внутри- или межмолекулярные дисульфидные связи. Подходящие восстанавливающие агенты включают, без ограничения, дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол, дитиоэритритол, цистеин, цистеамин (2-аминоэтантиол) и восстановленный глутатион. Специалистам в данной области легко понять, что для использования в указанных способах и композициях настоящего изобретения можно использовать широкий круг восстанавливающих агентов. Термин "окисляющий агент" в отношении рефолдинга белка определяют как любое соединение или материал, которые способны удалять электрон из соединения, которое окисляют. Подходящие окисляющие агенты включают, без ограничения, окисленный глутатион, цистеин, цистамин, окисленный дитиотреитол, окисленный эритреитол и кислород. Специалистам в рассматриваемой области должно быть очевидно, что для использования в указанных способах настоящего изобретения можно использовать широкий круг окисляющих агентов. Термин "денатурирующий агент" или "денатурант" определяют как любое соединение или материал, которые вызывают обратимое разворачивание (unfolding) белка. Эффективность денатурирующего агента или денатуранта определяется как свойствами, так и концентрацией конкретного денатурирующего агента или денатуранта. Подходящие денатурирующие агенты или денатуранты могут быть хаотропными агентами (chaotropts), детергентами, органическими растворителями, смешивающимися с водой растворителями, фосфолипидами или комбинацией двух или более таких агентов. Подходящие хаотропные агенты включают, без ограничения, мочевину, гуанидин и тиоцианат натрия. Подходящие детергенты могут включать, без ограничения, сильные детергенты, такие как натрийдодецилсульфат, или полиоксиэтиленовые эфиры (например, детергенты Tween или Triton), саркозил, мягкие неионные детергенты(например, дигитонин), мягкие катионные детергенты, такие как N2,3-(Dioleyoxy)-пропил-N,N,Nтриметиламмоний, мягкие ионные детергенты (например, натрийхолат или натрийдеоксихолат) или цвиттерионные детергенты, включая, без ограничения, сульфобетаины (Zwittergent), 3-(3 холамидопропил)диметиламмонио-1-пропансульфат (CHAPS) и 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний 2-гидрокси-1-пропансульфонат (CHAPSO). Органические смешивающиеся с водой растворители, такие как ацетонитрил, низшие спирты (особенно С 2-С 4 спирты, такие как этанол или изопропанол) или низшие алкандиолы (особенно С 2-С 4 алкандиолы, такие как этиленгликоль), можно использовать в качестве денатурантов. Фосфолипиды, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут быть природными фосфолипидами, такими как фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол, или синтетическими производными или вариантами фосфолипидов, такими как дигексаноилфосфатидилхолин или дигептаноилфосфатидилхолин. Термин "рефолдинг" описывает любой процесс, реакцию или способ, которые трансформируют полипептиды, содержащие дисульфидную связь, из неправильного складчатого или не складчатого состояния в природную или правильную складчатую конформацию относительно дисульфидных связей. Термин "кофолдинг" относится специально к процессам рефолдинга, реакциям или способам, в которых используют по меньшей мере два полипептида, которые взаимодействуют друг с другом и в результате происходит трансформация развернутого полипептида или полипептида с неправильной укладкой в природный, с правильной укладкой полипептид. Термины "гранулоцитарный колониестимулирующий фактор" или "G-CSF" включают такие полипептиды и белки, которые обладают по меньшей мере одной биологической активностью G-CSF (такие как те, что раскрыты в патентах США 6716606; 6689351; 6565841; 6162426; 5811301; 5776895; 5718893; 5580755; 5536495; 5202117; 5043156; 4999291; 4810643 и 4968618 для hG-CSF, которые включены в описание посредством ссылки), также как G-CSF аналоги, G-CSF изоформы, G-CSF миметики, GCSF фрагменты, гибридные G-CSF белки, олигомеры и мультимеры гибридных белков, гомологи, варианты схем гликозилирования и мутеины, независимо от их биологической активности и, кроме того, независимо от их способа синтеза или получения, включая, без ограничения, рекомбинантные (независимо от того, получены они из кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или других форм нуклеиновой кислоты), синтетические, трансгенные и активирующие гены способы. Конкретные примеры G-CSF вклю- 17019968 чают, без ограничения, ПЭГфилграстим (NEULASTA), филграстим (NEUPOGEN), аналог G-CSF,мутант G-CSF, измененный гликозилированный G-CSF и конъюгированные с ПЭГ G-CSF аналоги. Конкретные примеры клеточных линий, модифицированных для экспрессии эндогенных человеческих GCSF, раскрыты у Devlin et al., J. Leukoc. Biol., 41:306 (1987); в патентах США 6716606; 6379661; 6004548; 5830705; 5582823; 4810643 и 6242218, которые включены в описание посредством ссылки. Термины "бычий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор", "бычьи G-CSF" или "bG-CSF" включают такие полипептиды и белки, которые обладают по меньшей мере одной биологической активностью bG-CSF, также как bG-CSF аналоги, bG-CSF изоформы, bG-CSF миметики, bG-CSF фрагменты,гибридные bG-CSF белки, олигомеры и мультимеры гибридных белков, гомологи, варианты схем гликозилирования и мутеины, независимо от их биологической активности и, кроме того, независимо от их способа синтеза или получения, включая, без ограничения, рекомбинантные (независимо от того, получены они из кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или других форм нуклеиновой кислоты), синтетические, трансгенные и активирующие гены способы. Конкретные примеры G-CSF включают, без ограничения, bG-CSF мутанты, измененные гликозилированные G-CSF и конъюгированные с ПЭГ G-CSF аналоги. Термины "бычий G-CSF (bG-CSF)" или "полипептид bG-CSF" относятся к бычьему гранулоцитарному колониестимулирующему фактору или G-CSF, как раскрыто выше, так же, как к полипептиду, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность природных bG-CSF. ПолипептидыbG-CSF включают фармацевтически приемлемые соли и пролекарства, пролекарства солей, полиморфы,гидраты, сольваты, биологически активные фрагменты, биологически активные варианты и стереоизомеры природных бычьих G-CSF, так же, как варианты агонистов, миметиков и антагонистов природных бычьих G-CSF и их гибридных полипептидов. Примеры полипептидов bG-CSF и миметиков включают те, что раскрыты в WO 89/10932, в патентах США 5849883 и 6497869, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте. Гибриды, включающие добавленные аминокислоты у аминоконца, карбоксильного конца или с обоих концов, охватывают термин "полипептид bG-CSF". Примеры гибридов включают, без ограничения, например, метионил bG-CSF, в котором метионин связан с N-концом bG-CSF (такой как полипептид в SEQ ID NO: 2), полученный в результате рекомбинантной экспрессии зрелой формы bG-CSF, гибриды для целей очистки (включая, без ограничения, полигистидин или родственные эпитопы), гибриды с пептидами, связывающими сывороточный альбумин, и гибриды с сывороточными белками, такими как сывороточный альбумин. Природная bG-CSF нуклеиновая кислота и аминокислотные последовательности для полной длины и зрелых форм известны так же, как варианты,такие как варианты отдельных аминокислот и варианты сплайсинга. Для аминокислотной последовательности зрелого bG-CSF так же, как для аминокислотной последовательности метионил bG-CSF, см. здесь SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие hGCSF мутанты и мутантные hG-CSF полипептиды, также известны. Бычий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или bG-CSF обладает различными биологическими активностями, включая, без ограничения, связывание со своим рецептором, инициирование димеризации своего рецептора, стимулирование продуцирования нейтрофилов и стимулирование клеточной пролиферации и дифференциации. Примеры некоторых из биологических активностей гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и hG-CSF раскрыты выше и в патентах США 6676947; 6579525; 6531121; 6521245; 6489293; 6368854; 6316254; 6268336; 6239109; 6165283; 5986047; 5830851; 5043156 и 577569, которые включены в описание посредством ссылки. Термины "бычий G-CSF полипептид", "полипептид bG-CSF", "бычий G-CSF" или "bG-CSF" и написанные через дефис или без дефиса, их формы включают такие полипептиды и белки, которые обладают по меньшей мере одной биологической активностью CSF, их bG-CSF аналогов, bG-CSF мутантов, измененных гликозилированных bG-CSF, конъюгированных с ПЭГ bG-CSF, bG-CSF изоформ, bG-CSF миметиков, bG-CSF фрагментов, гибридных bG-CSF белков, гибридных белков, олигомеров и мультимеров,гомологов, вариантов схем гликозилирования, вариантов сплайсинга и мутеинов, независимо от их биологической активности и, кроме того, независимо от указанного способа их синтеза или получения,включая, без ограничения, рекомбинантные (независимо от того, получены он из кДНК, геномной ДНК,синтетической DNA или других форм нуклеиновой кислоты), in vitro, in vivo, путем микроинъекций молекул нуклеиновой кислоты, синтетически, трансгенно и активированием генов, способы. Термины "бычий G-CSF полипептид", "полипептид bG-CSF", "бычьи G-CSF" или "bG-CSF" охватывают полипептидыbG-CSF, включающие одно или более из аминокислотных замещений, добавлений или делеций; см. патент США 5849883, который включен в описание посредством ссылки, для аналогов бычьего G-CSF. Описаны замещения в большом разнообразии положений аминокислот в bG-CSF. Замещения,включая, без ограничения, такие, которые модулируют фармацевтическую стабильность, повышают агонистическую активность, повышают устойчивость к протеазам, превращают полипептид в антагониста и т.д., включены в термины "полипептид bG-CSF", "бычий G-CSF полипептид", "бычий G-CSF" или "bGCSF". В следующем аспекте в настоящем изобретении предложены рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие вариантные белки, векторы экспрессии, содержащие варианты нуклеиновых кислот,- 18019968 клетки-хозяева, включающие варианты нуклеиновых кислот и/или векторы экспрессии, и способы получения вариантов белков. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения инфекции путем введения животному варианта белка обычно вместе с фармацевтическим носителем в терапевтически эффективном количестве.bG-CSF мутанты обсуждаются в патенте США 5849883, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте, и включают полипептиды, сконструированные с оптимизацией кодона для Е. coli и гибридных белков, созданных с бычьими и человеческими G-CSF последовательностями. В патенте США 5416195, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте,раскрыты hG-CSF мутанты, в которых было произведено по меньшей мере одно из следующих аминокислотных замещений (нумерация аминокислот дается в соответствии со зрелым белком; поэтому, если присутствует N-концевой метионин, ему приписывается положение -1 или 0): Cys17 природной последовательности заменен на Ser17 остаток, Asp27 природной последовательности заменен на Ser27 остаток,Leu15 природной последовательности заменен на Glu15 остаток, Lys23 природной последовательности заменен на Arg23 остаток, Gly28 природной последовательности заменен на Ala28 остаток, Lys40 природной последовательности заменен на Arg40 остаток, Pro44 природной последовательности заменен наAla44 остаток, Leu49 природной последовательности заменен на Lys49 остаток, Gly55 природной последовательности заменен на Ala55 остаток, Cys60 природной последовательности заменен на Ser60 остаток, Pro111 природной последовательности заменен на Glu111 остаток, Thr115 природной последовательности заменен на Ser115 остаток и Tyr165 природной последовательности заменен на Arg165 остаток. Многие из указанных остатков присутствуют в bG-CSF последовательности, и одно или более из указанных замещений можно обнаружить в полипептиде bG-CSF настоящего изобретения. Carter et al.Biologicals (2004), 32:37 описывают мутантные hG-CSF, у которых отсутствуют сайты гликозилирования. Аналогичные мутации можно найти в полипептидах bG-CSF настоящего изобретения. В некоторых вариантах полипептиды bG-CSF по настоящему изобретению, по существу, идентичны SEQ ID NO: 1, 2 или любой другой последовательности полипептида bG-CSF. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды bG-CSF, включая мутанты и способы экспрессии и выделения полипептидов bG-CSF, хорошо известны. Термин "полипептид bG-CSF" также включает фармацевтически приемлемые соли и пролекарства и пролекарства солей, полиморфы, гидраты, сольваты, биологически активные фрагменты, биологически активные варианты и стереоизомеры природных bG-CSF так же, как агонисты, миметики и антагонисты природных bG-CSF и гибридных полипептидов. Белки слияния, включающие добавления аминокислот у аминоконца, карбоксльного конца или у обоих концов, включены в термин "полипептид bG-CSF". Примеры слияний включают, без ограничения, например, метионин bG-CSF, в котором метионин связан с Nконцом bG-CSF, полученного в результате рекомбинантной экспрессии зрелой формы bG-CSF без лидерного или сигнального пептида или его части (метионин связан с N-концом bG-CSF в результате рекомбинантной экспрессии), белки слияния, для целей очистки (включая, без ограничения, полигистидин или родственные эпитопы), белки слияния с пептидами, связывающими сывороточный альбумин, и белки слияния с сывороточными белками, такими как сывороточный альбумин. В патенте США 5750373,который включен в описание посредством ссылки, раскрыт способ селекции новых белков, таких как гормон роста и вариантов фрагментов антител с измененными свойствами связывания в отношении их сответствующих рецепторных молекул. Указанный способ включает слияние гена, кодирующего представляющий интерес белок, с карбоксиконцевым доменом гена III белка оболочки нитчатого бактериофага M13. Химерные молекулы включают bG-CSF одну или более из других молекул. Химерная молекула может содержать специфические участки или фрагменты одной или обеих из bG-CSF и другой молекулы (молекул). Любые такие фрагменты можно получить из белков стандартными биохимическими методами или осуществляя экспрессию полинуклеотида, кодирующего фрагмент bG-CSF, или его фрагмент можно получить как белок слияния, включающий человеческий сывороточный альбумин (HSA), Fc или его часть. Такие конструкции слияния пригодны для повышения экспрессии bG-CSF или его фрагмента в эукариотной клетке-хозяине. Примеры HSA частей включают N-концевой полипептид (аминокислоты 1-369, 1-419 и участки промежуточной длины, начинающиеся с аминокислоты 1), как раскрыто в патенте США 5766883 и в публикации WO 97/24445, которые включены в описание посредством ссылки. Другие химерные полипептиды могут включать HSA белок с bG-CSF или его фрагментами, присоединенными к каждому из С-конца и N-конца HSA. Другие белки слияния можно создать путем слияния bG-CSF с a) Fc частью иммуноглобулина; b) аналогом Fc части иммуноглобулина и с) фрагментамиFc части иммуноглобулина. В различных ссылках раскрыты модификации полипептидов конъюгированием с полимером или гликозилированием. Термин "полипептид bG-CSF" включает полипептиды, конъюгированные с полимером, таким как ПЭГ, и могут включать одно или более из дополнительных производных цистеина, лизина или других остатков. Кроме того, полипептид bG-CSF может включать линкер или полимер, где аминокислота, с которой конъюгируют указанные линкер или полимер, может быть неприродной аминокислотой в соответствии с настоящим изобретением или может быть конъюгирована с кодируемой в природе аминокислотой с использованием методик, известных специалистам, таких как присоединение к ли- 19019968 зину или цистеину. Имеются сообщения о модификации полипептидов полимерами. IFN упоминается как один из примеров полипептида, принадлежащего к суперсемейству гормонов роста. В WO 00/23114 раскрыт гликозилированный и ПЭГилированный IFN. В WO 00/23472 раскрыты IFN гибридные белки. В патенте США 4904584 раскрыты полипептиды, обедненные ПЭГилированным лизином, где по меньшей мере один лизиновый остаток был удален или заменен любым другим аминокислотным остатком. В WO 99/67291 раскрыт процесс конъюгирования белка с ПЭГ, где по меньшей мере один аминокислотный остаток в белке удаляют и осуществляют контактирование полученного белка с ПЭГ в условиях, достаточных для достижения конъюгирования с белком. В WO 99/03887 раскрыты ПЭГилированные варианты полипептидов, принадлежащих к суперсемейству гормонов роста, где цистеиновый остаток был замещен остатком несущественной аминокислоты, расположенным в специфическом участке указанного полипептида. В WO 00/26354 раскрыт способ получения гликозилированного полипептидного варианта с пониженной аллергенностью, который по сравнению с соответствующим исходным полипептидом включает по меньшей мере один дополнительный сайт гликозилирования. В патенте США 5218092, который включен в описание посредством ссылки, раскрыта модификация гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) и других полипептидов для введения по меньшей мере одной дополнительной углеводной цепочки по сравнению с природным полипептидом. Термин "полипептид bG-CSF" также включает гликозилированные bG-CSF, такие как, без ограничения, полипептиды, гликозилированные по любому аминокислотному положению, N-связанная или Освязанная формы гликозилирования полипептида. Варианты, содержащие единственное нуклеотидное изменение, также рассматриваются как биологически активные варианты полипептида bG-CSF. Варианты, содержащие одно нуклеотидное изменение, также рассматриваются как биологически активные варианты bG-CSF. Кроме того, включены также варианты сплайсинга. Термин "полипептид bG-CSF" также включает bG-CSF гетеродимеры, гомодимеры, гетеромультимеры или гомомультимеры любого одного или более из bG-CSF или любого другого полипептида, белка, углевода, полимера, малой молекулы,линкера, лиганда или другой активной молекулы любого типа, связанной химически или экспрессированной как гибридный белок (см. патенты США 6261550; 6166183; 6204247; 6261550; 6017876, которые включены в описание посредством ссылки), также как аналоги полипептидов, содержащие, например, специфические делеции или другие модификации, но все еще сохраняя биологическую активность (патенты США 6261550; 6004548; 6632426, которые включены в описание посредством ссылки). Все ссылки на положения аминокислот в описанных здесь bG-CSF основаны на положениях в SEQID NO: 1, если не указано иначе (то есть если не указывается, что сравнение основано на SEQ ID NO: 2 или другой bG-CSF последовательности). Например, аминокислота в положении 1 SEQ ID NO: 1 представляет собой треонин и соответствующий треонин расположен в SEQ ID NO: 2 у положения 2. Специалистам в данной области должно быть понятно, что положения аминокислот, соответствующие положению в SEQ ID NO: 1, можно легко идентифицировать в любой другой bG-CSF молекуле, такой какSEQ ID NO: 2. Специалистам в данной области должно быть понятно, что положения аминокислот, соответствующие положению в SEQ ID NO: 1, 2 или в любой другой bG-CSF последовательности, можно легко идентифицировать в любой другой bG-CSF молекуле, такой как bG-CSF гибриды, варианты, фрагменты и т.д. Например, программу выравнивания последовательностей, такую как BLAST, можно использовать для выравнивания и определения конкретного положения в белке, которое соответствует положению в SEQ ID NO: 1, 2, или в других bG-CSF последовательностях. Замещения, делеции или добавления аминокислот, раскрытые здесь со ссылкой на SEQ ID NO: 1, 2, или другие bG-CSF последовательности относятся также к замещениям, делециям или добавлениям в соответствующие положения в bGCSF гибридах, вариантах, фрагментах и т.д., раскрытых здесь или известных специалистам, и естественно включены в настоящее изобретение. Термин "полипептид bG-CSF" или "bG-CSF" включает полипептиды bG-CSF, включающие одно или более из аминокислотных замещений, добавлений или делеций. Полипептиды bG-CSF настоящего изобретения включают модификации с одной или более из природных аминокислот вместе с одной или более из неприродных аминокислотных модификаций. Были описаны примеры замещений в широком круге положений аминокислот в природных bG-CSF полипептидах, включая, без ограничения, замещения, которые модулируют фармацевтическую стабильность, которые модулируют одну или более из биологических активностей полипептида bG-CSF, такие как те, без ограничения, что повышают агонистическую активность, повышают растворимость полипептида, уменьшают протеазную восприимчивость, превращают полипептид в антагониста и т.д. и включены в термин "полипептид bG-CSF". В некоторых вариантах bG-CSF антагонист включает не кодируемую в природе аминокислоту, связанную с водорастворимым полимером, который присутствует в участке связывания рецептора bG-CSF молекулы. В некоторых вариантах полипептиды bG-CSF далее включают добавление, замещение или делецию, которые модулируют биологическую активность полипептида bG-CSF. В некоторых вариантах полипептиды bG-CSF далее включают добавление, замещение или делецию, которые модулируют проли- 20019968 ферацию нейтрофилов, функцию и/или дифференциацию полипептида bG-CSF. Например, добавления,замещения или делеции могут модулировать одно или более из свойств или активностей bG-CSF. Например, добавления, замещения или делеции могут модулировать сродство к рецептору, модулируют время полужизни в циркуляции, модулируют терапевтическое время полужизни, модулируют стабильность полипептида, модулируют расщепление протеазами, модулируют дозу, модулируют выделение или биодоступность, облегчают очистку или улучшают или изменяют способ введения. Аналогично, полипептиды bG-CSF могут включать последовательности расщепления протеазой, реакционноспособные группы, связывающие антитело домены (включая, без ограничения, FLAG или поли-His) или другие основанные на сродстве последовательности (включая, без ограничения, FLAG, поли-His, GST и т.д.) либо связанные молекулы (включая, без ограничения, биотин), которые улучшают детектирование (включая,без ограничения, GFP), очистку или другие характеристики полипептида. Термин "полипептид bG-CSF" также включает гомодимеры, гетеродимеры, гомомультимеры и гетеромультимеры, которые связаны, включая, без ограничения, непосредственно через боковые цепи не кодируемых в природе аминокислот, с боковыми цепями или той же самой или другой не кодируемой в природе аминокислоты, с боковым цепям кодируемой в природе аминокислоты или непосредственно через линкер. Примеры линкеров включают, без ограничения, малые органические соединения, водорастворимые полимеры различной длины, такие как поли(этиленгликоль)или полидекстран, или полипептиды различной длины. Термин "не кодируемая в природе аминокислота" относится к аминокислоте, которая не является одной из 20 обычных аминокислот или пирролизином либо селеноцистеином. Другими терминами, которые можно использовать синомимично с термином "не кодируемая в природе аминокислота", являются термины "неприродная аминокислота", "ненатуральная аминокислота", "не встречающаяся в природе аминокислота" и различные их варианты с дефисом или без него. Термин "не кодируемая в природе аминокислота" также включает, без ограничения, аминокислоты, которые возникают в результате модификаций (например, пост-трансляционных модификаций) кодируемой в природе аминокислоты (включая,без ограничения, 20 обычных аминокислот или пирролизин и селеноцистеин), но сами не являются природновключенными в растущую полипептидную цепь трансляционным комплексом. Примеры таких неприродно возникших аминокислот включают, без ограничения, N-ацетилглюкозаминил-L-серин, Nацетилглюкозаминил-L-треонин и О-фосфотирозин. Термин "аминоконец модифицирующая группа" относится к любой молекуле, которую можно присоединить к аминоконцу полипептида. Аналогично, термин "карбоксиконец модифицирующая группа" относится к любой молекуле, которую можно присоединить к карбоксиконцу полипептида. Модифицирующие концы группы включают, без ограничения, различные водорастворимые полимеры, пептиды или белки, такие как сывороточный альбумин или другие молекулы, которые повышают время полужизни пептидов в сыворотке. Термины "функциональная группа", "активная молекула", "активирующая группа", "отщепляемая группа", "реакционноспособный сайт", "химически реакционноспособная группа" и "химически реакционноспособная молекула", которые используют специалисты и которые использованы здесь для обозначения различных, определяемых участков или звеньев в молекуле. Термины в некотором смысле являются синонимами в области химии и использованы здесь для указания частей молекул, которые выполняют некоторые функции или обладают некоторой активностью и являются реакционноспособными в отношении других молекул. Термины "связь" или "линкер" использованы здесь для обозначения групп или связей, которые обычно образованы в результате химических реакций и обычно являются ковалентными связями. Термин гидролитически стабильные связи означает, что связи, по существу, стабильны в воде и не реагируют с водой при используемых значениях рН, включая, без ограничения, в физиологических условиях в течение длительного промежутка времени, возможно даже, бесконечно долго. Термины гидролитически нестабильные или разлагаемые связи означают, что такие связи разлагаются в воде или в водных растворах, включая, например, кровь. Термины ферментативно нестабильные или разлагаемые связи означают,что связь может разрушиться под действием одного или более из ферментов. Как понятно специалистам,ПЭГ и родственные полимеры могут включать разлагаемые связи в полимерном скелете или в линкерной группе между полимерным скелетом и одной или более из концевых функциональных групп полимерной молекулы. Например, сложноэфирные связи, образованные в реакции ПЭГ карбоновых кислот или активированных ПЭГ карбоновых кислот со спиртовыми группами биологически активного агента, обычно гидролизуются в физиологических условиях с выделением агента. Другие гидролитически разлагаемые связи включают, без ограничения, карбонатные связи; иминные связи, образованные в результате реакции амина и альдегида; фосфатные эфирные связи, образованные при взаимодействии спирта с фосфатной группой; гидразоновые связи, которые являются продуктом реакции гидразида и альдегида; ацетальные связи, которые являются продуктом реакции альдегида и спирта; ортоэфирные связи, которые являются продуктом реакции формиата и спирта; пептидные связи, образованные группой амина, включая,без ограничения, связи у конца полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильную группу пептида; и олигонуклеотидные связи, образованные фосфорамидитной группой, включая, без ограничения, группы на конце полимера и 5' гидроксильную группу олигонуклеотида. Термины "биологически активная молекула" или "биологически активный агент" означают любое вещество, которое может влиять на любые физические или биохимические свойства биологической системы, схемы функционирования молекулы или взаимодействия, связанные с организмом, включая, без ограничения, вирусы, бактерии, бактериофаги, транспозоны, прионы, насекомых, грибы, растения, животных и людей. В частности, в том смысле, как здесь использован термин, биологически активные молекулы включают, без ограничения, любые вещества, предназначенные для диагностических целей, ухода, облегчения, лечения или профилактики заболеваний у людей или других животных или для улучшения физического или ментального состояния человека или животных. Примеры биологически активных молекул включают, без ограничения, пептиды, белки, ферменты, малые молекулы лекарственных средств, вакцины, иммуногены, твердые формы лекарственных средств, мягкие формы лекарственных средств, углеводы, неорганические атомы или молекулы, красители, липиды, нуклеозиды, радионуклиды, олигонуклеотиды, токсоиды, токсины, прокариотные и эукариотные клетки, вирусы, полисахариды,нуклеиновые кислоты и их части, полученные или произведенные из вирусов бактерий, насекомых, животных или любых других клеток или клеточных типов, липосомы, микрочастицы и мицеллы. Полипептиды bG-CSF можно добавлять в мицеллюлярные композиции. Классы биологически активных агентов,которые можно использовать для целей настоящего изобретения, включают, без ограничения, лекарства,пролекарства, радионуклиды, агенты для получения изображений, полимеры, антибиотики, фунгициды,противовирусные агенты, противовоспалительные агенты, противоопухолевые агенты, сердечнососудистые агенты, антидепрессанты, гормоны, факторы роста, стероидные агенты, микробно полученные токсины и т.п. Термин "бифункциональный полимер" относится к полимеру, включающему две дискретные функциональные группы, которые способны специфически реагировать с другими молекулами (включая, без ограничения, боковые группы аминокислот) с образованием ковалентной или нековалентной связи. Бифункциональный линкер, содержащий одну функциональную группу, реакционноспособную в отношении группы на конкретном биологически активном компоненте, и другую группу, реакционноспособную в отношении группы на втором биологическом компоненте, можно использовать для получения конъюгата, который включает первый биологически активный компонент, бифункциональный линкер и указанный второй биологически активный компонент. Известны многие процедуры и линкерные молекулы для присоединения различных соединений к пептидам, см., например, Европейскую патентную заявку 188256; патенты США 4671958, 4659839, 4414148, 4699784; 4680338 и 4569789, которые включены в описание посредством ссылки. Термин "многофункциональный полимер" относится к полимеру, включающему две или более дискретные функциональные группы, которые способны специфически реагировать с другими молекулами (включая, без ограничения, боковые группы аминокислот) с образованием ковалентных и нековалентных связей. Бифункциональный полимер или полифункциональный полимер могут быть любой нужной длины или молекулярной массы, и их можно выбрать таким образом, чтобы обеспечить конкретное необходимое пространственное положение или конформацию между одной или более из молекул, связанных с bG-CSF и его рецептором или с bG-CSF. Если группы заместителей обозначены их обычными химическими формулами, написанными слева направо, они одинаково включены в химически идентичные заместители, которые получаются при написании структуры справа налево, например структура -СН 2 О- эквивалентна структуре -ОСН 2-. Термин "заместители" включает, без ограничения, термин "неинтерферирующие заместители"."Неинтерферирующие заместители" представляют собой такие группы, которые приводят к получению стабильных соединений. Подходящие неинтерферирующие заместители или радикалы включают, без ограничения, галоген, C1-C10 алкил, C2-C10 алкенил, C2-C10 алкинил, C1-C10 алкокси, C1-C12 аралкил, C1C12 алкарил, C3-C12 циклоалкил, C3-C12 циклоалкенил, фенил, замещенный фенил, толуоил, ксиленил,бифенил, C2-C12 алкоксиалкил, C2-C12 алкоксиарил, C7-C12 арилоксиалкил, C7-C12 оксиарил, C1-C6 алкилсульфинил C1-C10 алкилсульфонил, -(СН 2)m-О-(C1-C10 алкил), где m принимает значения от 1 до 8, арил,замещенный арил, замещенный алкокси, фторалкил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, нитроалкил, -NO2, -CN, -NRC(О)-(С 1-С 10 алкил), -С(O)-(C1-C10 алкил), C2-C10 алкилтиоалкил, -С(О)О-(C1-C10 алкил), -ОН, -SO2, =S, -COOH, -NR2, карбонил, -С(О)-(C1-C10 алкил)-CF3,-С(О)-CF3, -C(O)NR2, -(C1-C10 арил)-S-(С 6-С 10 арил), -С(О)-(C1-C10 арил), -(CH2)m-O-(-(CH2)m-O-(C1-C10 алкил), где каждый m принимает значения от 1 до 8, -C(O)NR2, -C(S)NR2, -SO2NR2, -NRC(O)NR2,-NRC(S)NR2, их соли и тому подобные. Каждый R в том смысле, как здесь использован, представляет собой Н, алкил или замещенный алкил, арил или замещенный арил, аралкил или алкарил. Термин "галоген" включает фтор, хлор, йод и бром. Термин "алкил" сам по себе или как часть другого заместителя означает, если не указано иначе, неразветвленную или разветвленную цепочку или циклический углеводородный радикал или их комбинации, которые могут быть полностью насыщенными, моно- или полиненасыщенными и могут включать ди- и поливалентные радикалы, с указанным числом атомов углерода (то есть C1-C10 означает от одного до десяти атомов углерода). Примеры насыщенных углеводородных радикалов включают, без ограничения, группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил,- 22019968 циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил, гомологи и изомеры, например н-пентил, нгексил, н-гептил, н-октил и т.п. Ненасыщенная алкильная группа содержит одну или более из двойных связей или тройных связей. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают, без ограничения, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил,1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и изомеры. Термин "алкил", если нет других указаний,также включает такие производные алкила, более подробно определенные далее как "гетероалкил". Алкильные группы, которые ограничены улеводородными группами, называют "гомоалкилами". Термин "алкилен" сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал,полученный из алкана, представленный, но ими не ограниченный, структурами -СН 2 СН 2- и-СН 2 СН 2 СН 2 СН 2-, и далее включает такие группы, которые раскрыты далее как "гетероалкилены". Обычно алкильная (или алкиленовая) группа содержит от 1 до 24 атомов углерода, причем такие группы,которые содержат 10 или меньше атомов углерода, составляют предпочтительный вариант раскрытых здесь способов и композиций. Термин "низший алкил" или "низший алкилен" означает короткоцепочечную алкильную или алкиленовую группу, обычно содержащую восемь или меньше атомов углерода. Термины "алкокси", "алкиламино" и "алкилтио" (или тиоалкокси) используют в их общепринятом значении и они относятся к алкильным группам, присоединенным к остальной части молекулы через атом кислорода, аминогруппу или атом серы соответственно. Термин "гетероалкил" сам по себе или в комбинации с другим термином означает, если не указано иначе, стабильную, неразветвленную или разветвленную цепочку, или циклический углеводородный радикал, или их комбинации, состоящие из указанного числа атомов углерода и по меньшей мере одного гетероатома, выбранного из группы, состоящей из О, N, Si и S, и где атомы азота и серы могут быть необязательно окислены, и гетероатом азота может быть необязательно кватернизован. Гетероатом (гетероатомы) О, N и S и Si могут находиться в любом положении внутри гетероалкильной группы или в положении, по которому указанная алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Примеры включают, без ограничения, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 и -CH=CHN(CH3)-CH3. Вплоть до двух гетероатомов могут располагаться последовательно, как, например,-CH2-NH-OCH3 и -СН 2-O-Si(СН 3)3. Аналогично, термин "гетероалкилен" сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, полученный из гетероалкила, как представлено, но ими не ограничено, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- и -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. В гетероалкиленовых группах одинаковые или различные гетероатомы также могут занимать или один или оба конца цепочки (включая, без ограничения, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино, аминооксиалкилен и т.п.) Кроме того, для алкиленовых и гетероалкиленовых связывающих групп ориентация связывающей группы по направлению, в котором записана связывающая группа, не указывается. Например, формула-C(O)2R'- представляет собой как -C(O)2R'-, так и -R'C(O)2-. Термины "циклоалкил" и "гетероциклоалкил", сами по себе или в комбинации с другими терминами, представляют, если не указано иначе, циклический вариант "алкила" и "гетероалкила" соответственно. Таким образом, циклоалкил или гетероциклоалкил включают насыщенные, частично ненасыщенные и полностью ненасыщенные кольцевые связи. Кроме того, для гетероциклоалкила гетероатомы могут занимать положение, по которому гетероцикл присоединен к остальной части молекулы. Примеры циклоалкилов включают, без ограничения, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил,циклогептил и т.п. Примеры гетероциклоалкилов включают, без ограничения, 1-(1,2,5,6 тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил,тетрагидрофуран-2-ил,тетрагидрофуран-3-ил,тетрагидротиен-2-ил,тетрагидротиен-3-ил,1 пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п. Кроме того, термин включает бициклические и трициклические кольцевые структуры. Аналогично, термин "гетероциклоалкилен" сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, полученный из гетероциклоалкила, и термин "циклоалкилен", сам по себе или как часть другого заместителя, означает двухвалентный радикал, полученный из циклоалкила. Термин "водорастворимый полимер"относится к любому полимеру, который растворим в водных растворителях. Связь водорастворимых полимеров с полипептидами bG-CSF может привести к изменениям, включая, без ограничения, те, которые повышают или модулируют время полужизни в сыворотке или повышают или модулируют терапевтическое время полужизни по сравнению с немодифицированной формой, модулируют иммуногенность, модулируют характеристики физической ассоциации, такие как агрегация и образование мультимеров, изменяют рецепторное связывание, изменяют связывание с одним или более из связываемых партнеров и изменяют рецепторную димеризацию или мультимеризацию. Водорастворимый полимер может или не может обладать собственной биологической активностью,и его можно использовать в качестве линкера для присоединения bG-CSF к другим веществам, включая,без ограничения, один или более из полипептидов bG-CSF или одну или более из биологически активных молекул. Подходящие полимеры включают, без ограничения, полиэтиленгликоль, пропиональдегид полиэтиленгликоля, моно C1-C10 алкокси или арилокси его производные (раскрыты в патенте США 5252714, который включен в описание посредством ссылки), монометоксиполиэтиленгликоль, поливи- 23019968 нилпирролидон, поливиниловый спирт, полиаминокислоты, малеиновый ангидрид дивинилового эфира,N-(2-гидроксипропил)метакриламид, декстран, производные декстрана, включая декстрансульфат, полипропиленгликоль, сополимер полипропиленоксид/этиленоксида, полиоксиэтилинированные полиоли,гепарин, фрагменты гепарина, полисахариды, олигосахариды, гликаны, целлюлозу и производные целлюлозы, включая, без ограничения, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу, крахмал и производные крахмала, полипептиды, полиалкиленгликоль и его его производные, сополимеры полиалкиленгликоля и его производных, поливинилэтиловые эфиры и альфа-бета-поли(2-гидроксиэтил)-DL-аспартамид и т.п. или их смеси. Примеры таких водорастворимых полимеров включают, без ограничения, полиэтиленгликоль и сывороточный альбумин. В WO 03/074087 и WO 03/074088 раскрыто конъюгирование белков или малых молекул с гидроксиалкилкрахмалом (HAS). Примеры гидроксиалкилкрахмалов включают, без ограничения, гидроксиэтилкрахмал. Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и других молекул, например,могут включать ковалентную связь между концевыми альдегидными группами HAS и реакционноспособными группами других молекул. Термин "полиалкиленгликоль" или "поли(алкиленгликоль)" относится к полиэтиленгликолю (поли(этиленгликолю, полипропиленгликолю, полибутиленгликолю и их производным. Термин "полиалкиленгликоль" включает как линейные, так и разветвленные полимеры со средней молекулярной массой от 0,1 до 100 кДа. Другие примеры вариантов перечислены, например, в коммерческих каталогах поставщиков, таких как каталог Shearwater Corporation's catalog "Polyethyleneglycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001). Термин "арил" означает, если не указано иначе, полиненасыщенный, ароматический, углеводородный заместитель, который может представлять собой одно кольцо или множество колец (включая, без ограничения, от 1 до 3 колец), которые конденсированы вместе или связаны ковалентно. Термин "гетероарил" относится к арильным группам (или кольцам), которые содержат от одного до четырех гетероатомов, выбранных из N, О и S, где атомы азота и серы необязательно окислены, и атом (атомы) азота необязательно кватернизованы. Гетероарильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через гетероатом. Нелимитирующие примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4 имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4 изоксазолил, 5-изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2 пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2 бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил и 6-хинолил. Заместители у каждого из указанных выше арильных и гетероарильных кольцевых систем выбирают из группы описанных далее приемлемых заместителей. Для краткости термин "арил", когда использован в комбинации с другими терминами (включая, без ограничения, арилокси, арилтиоокси, арилалкил), включает как арильные, так и гетероарильные кольца,как определено выше. Таким образом, термин "арилалкил" означет, что включены те радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (включая, без ограничения, бензил, фенэтил, пиридилметил и т.п.), включая такие алкильные группы, в которых атом углерода (включая, без ограничения, метиленовую группу) был заменен, например, на атом кислорода (включая, без ограничения, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.п.). Каждый из вышеуказанных терминов (включая, без ограничения, "алкил", "гетероалкил", "арил" и"гетероарил") означает, что включены как замещенные, так и незамещенные формы указанных радикалов. Примеры заместителей для каждого типа радикалов представлены далее. Заместителями для алкильного и гетероалкильного радикалов (включая такие группы, которые часто называют как алкилен, алкенил, гетероалкилен, гетероалкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил и гетероциклоалкенил) могут быть один или более из членов группы, выбранные из,без ограничения: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -галоген, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R',-CO2R', CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR,-NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN и -NO2, причем количество их может меняться в интервале от нуля до (2m'+1), где m' представляет собой полное число атомов углерода в таком радикале. R', R", R"' и R, каждый независимо, обозначает водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, включая, без ограничения, арил, замещенный 1-3 галогенами, замещенный или незамещенный алкил, алкокси- или тиоалкоксигруппы или арилалкильные группы. Если соединение настоящего изобретения включает более чем одну R группу, например, каждую R группу независимо выбирают как каждую R', R", R'" и R группу, если присутствует более чем одна из указанных групп. Если R' и R" присоединены к одному и тому же атому азота, тогда взятые вместе с атомом азота они могут образовывать 5-, 6- или 7-членное кольцо. Например, -NR'R" включает, без ограничения, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. На основании вышеприведенного обсуждения заместителей специалисту в данной области должно быть понятно, что термин "алкил" включает группы, включая атомы углерода, связанные с группами другими, чем группы водорода, такими как галогеноалкил Аналогично заместителям, раскрытым для алкильного радикала, заместители для арильной и гетероарильной группы варьируются и их выбирают, без ограничения, из: галогена, -OR', =O, =NR', =N-OR',-NR'R", -SR', -галогена, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -ОС(O)NR'R", -NR"C(O)R',-NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR- С(NR'R"R'")=NR, -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R',-S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN и -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, фтор(С 1-С 4)алкокси и фтор(С 1-С 4)алкила, в количестве от нуля до числа свободных валентностей у ароматической кольцевой системы; и где R', R", R'" иR независимо выбирают из водорода, алкила, гетероалкила, арила и гетероарила. Если соединение по настоящему изобретению включает более одной R группы, например, каждую из R групп независимо выбирают как каждую R', R", R'" и R группу, если присутствует более одной из указанных групп. Термин "модулируют время полужизни в сыворотке" означает позитивное или негативное изменение во времени циркулирующей полужизни модифицированных bG-CSF по сравнению с немодифицированной формой. Время полужизни в сыворотке измеряют, отбирая образцы крови в различные моменты времени после введения bG-CSF и определяя концентрацию указанной молекулы в каждом образце молекул. Зависимость концентрации сыворотки от времени позволяет рассчитать время полужизни в сыворотке. Желательно повышение времени полужизни по меньшей мере в два раза, но и меньшие значения повышения могут оказаться полезными, например, в тех случаях, когда они позволяют определить удовлетворительный режим дозирования и избежать токсического эффекта. В некоторых вариантах повышение составляет по меньшей мере трехкратное, по меньшей мере примерно пятикратное или по меньшей мере примерно десятикратное. Термин "модулируют терапевтическое время полужизни" в том смысле, как здесь использован, означает позитивное или негативное изменение времени полужизни терапевтически эффективного количества bG-CSF по сравнению с его немодифицированной формой. Терапевтическое время полужизни определяют, измеряя фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства молекул в различные моменты времени после введения. Желательно, чтобы повышение терапевтического времени полужизни обеспечило конкретный благоприятный дозовый режим, конкретную благоприятную полную дозу или позволило избежать вредных эффектов. В некоторых вариантах повышение терапевтического времени полураспада возникает из-за повышения эффективности, увеличения или уменьшения связывания модифицированных молекул с их мишенью, усиления или уменьшения разрушений молекул ферментами,такими как протеазы, или повышения или уменьшения других параметров или механизма действия немодифицированных молекул или повышения или уменьшения рецептор-опосредованного клиренса молекул. Термин "выделенный" в применении к нуклеиновой кислоте или белку означает, что указанные нуклеиновая кислота или белок не содержат, по меньшей мере, некоторых из клеточных компонент, с которыми они ассоциированы в природном состоянии, или что указанные нуклеиновая кислота или белок были сконцентрированы до уровня, который выше, чем их концентрация при in vivo или in vitro продуцировании. Это может быть в гомогенном состоянии. Выделенные вещества могут быть или в сухом либо в полусухом виде или в растворе, включая, без ограничения, водный раствор. Они могут быть компонентами фармацевтических композиций, которые включают дополнительные фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты. Чистоту и гомогенность обычно определяют, используя аналитические химические методы, такие как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок, который является преимущественным видом в препарате, значительно очищают. В частности, выделенный ген выделяют из открытой считывающей рамки, которая фланкирует ген и кодирует белок, другой, нежели представляющий интерес ген. Термин "очищенный" означает,что нуклеиновая кислота или белок проявляются только одной полосой в электрофоретическом геле. В частности, это может означать, что указанные нуклеиновая кислота или белок имеют степень чистоты по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99% или больше. Термин "нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам, дезоксирибонуклеозидам,рибонуклеозидам или рибонуклеотидам и их полимерам или в одноцепочечной, или в двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают аналогичными свойствами связывания, что и сравниваемая нуклеиновая кислота, и их метаболизм аналогичен метаболизму природных нуклеотидов. Если конкретно не ограничено иначе, термин также относится к аналогам олигонуклеотидов, включаяPNA (пептидонуклеиновая кислота), аналогам ДНК, используемым в антисмысловой методике (фосфоротиоаты, фосфороамидаты и т.п.). Если не указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно включает ее консервативно модифицированные варианты (включая, без ограничения, замещения вырожденного кодона) и комплементарные последовательности, также как косвенно означенную последовательность. Специфически, замещения вырожденного кодона можно осуществить,создавая последовательности, в которых третье положение одного или более из выбранных (или всех) кодонов замещено смешанным основанием и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer et al., NucleicProbes, 8:91-98 (1994. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" в настоящем описании используют взаимозаменяемо,- 25019968 обозначая полимер аминокислотных остатков. То есть описание, относящееся к полипептиду, равным образом применимо к описанию белка, и наоборот. Термины, применимые к природным аминокислотным полимерам, также применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или более из аминокислотных остатков представляет собой не кодируемую в природе аминокислоту. Термин включает аминокислотные цепи любой длины, включая белки полной длины, где аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями. Термин "аминокислота" относится к природным и неприродным аминокислотам так же, как к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Кодируемые в природе аминокислоты представляют собой 20 обычных аминокислот (аланин,аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин,изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин) и пирролизин и селеноцистеин. Термин "аминокислотные аналоги" относится к соединениям, которые имеют ту же самую основную химическую структуру, что и природные аминокислоты, то есть содержат-углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и R группу, такую как,гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R группы (такие как норлейцин) или модифицированные пептидные основные цепи, но сохраняют ту же самую основную химическую структуру, что и природные аминокислоты. Ссылки на аминокислоту включают, например, природные протеогенные L-аминокислоты; D-аминокислоты, химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; природные непротеогенные аминокислоты, такие как -аланин, орнитин и т.д.; и химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, которые, как известно специалистам, являются характеристиками аминокислот. Примеры неприродных аминокислот включают, без ограничения, -метиламинокислоты(например, -метилаланин), D-аминокислоты, гистидино-подобные аминокислоты (например, 2 аминогистидин, -гидроксигистидин, гомогистидин, -фторметилгистидин и -метилгистидин), аминокислоты, содержащие дополнительный метилен в боковой цепи ("гомо" аминокислоты), и аминокислоты,в которых функциональная группа карбоновой кислоты в боковой цепи заменена группой сульфоновой кислоты (например, цистеиновой кислоты). Включение неприродных аминокислот, включая синтетические неприродные аминокислоты, замещенные аминокислоты, или одну или более из D-аминокислот в белки настоящего изобретения может оказаться выгодным в ряде различных случаев. Пептиды, содержащие D-аминокислоту и т.д., проявляют повышенную стабильность in vitro или in vivo по сравнению с эквивалентами, содержащими L-аминокислоту. Таким образом, конструирование пептидов и т.д., включающих D-аминокислоты, может быть особенно полезным в тех случаях, когда желательна или необходима повышенная внутриклеточная стабильность. Более конкретно, D-пептиды и т.д. устойчивы в отношении эндогенных пептидов и протеаз, тем самым обеспечивая повышенную биодоступность молекул, и пролонгируют время полужизни in vivo, если такие свойства желательны. Кроме того, D-пептиды и т.д. не могут быть процессированы эффективно из-за ограниченного основным комплексом гистосовместимости класса II представления Т-хелперным клеткам, поэтому, по-видимому, меньше вызывают гуморальные иммунные реакции во всем организме. Аминокислоты могут быть названы в описании или по их общеизвестным трехбуквенным символам, или по однобуквенным символам, как рекомендовано комиссией по биохимической номенклатуреIUPAC-IUB. Нуклеотиды, аналогично, могут быть названы в соответствии с их общепринятыми однобуквенными кодами. Термин "консервативно модифицированные варианты" применим как к аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, термин "консервативно модифицированные варианты" относится к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности или если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность до практически идентичной последовательности. Из-за дегенерации генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодирует аминокислота аланин. Таким образом, в каждом положении,где аланин специфицирован кодоном, указанный кодон можно изменить на любой из соответствующих кодонов, описанных без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой кислоты являются "молчащими вариантами", которые являются одними из типов консервативно модифицированных вариантов. Здесь каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид,также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалистам в данной области должно быть понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, присутствует в каждой описанной последовательности. Что касается последовательностей аминокислот, специалисту в данной области должно быть по- 26019968 нятно, что отдельные замещения, делеции или добавления к последовательностям нуклеиновой кислоты,пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или исключают одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой "консервативно модифицированный вариант", в котором указанное изменение приводит к делеции аминокислоты,добавлению аминокислоты или замещению аминокислоты химически аналогичной аминокислотой. Таблицы консервативных замещений, содержащие списки функционально аналогичных аминокислот, известны специалистам в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты, кроме того,дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели настоящего изобретения. Таблицы консервативных замещений, содержащие списки функционально аналогичных аминокислот, известны специалистам в данной области. Следующие восемь групп, каждая из которых содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замещения друг для друга: 1) Аланин (А), Глицин (G); 2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е); 3) Аспарагин (N), Глутамин (Q); 4) Аргинин (R), Лизин (K); 5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V); 6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонин (Т) и 8) Цистеин (С), Метионин (М),(см., например, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. FreemanCo.; 2nd edition (December 1993). Термины "идентичны" или процент "идентичности" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы. Последовательности "по существу,идентичны", если процент их аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые одинаковы (то есть имеют около 60% идентичности, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90 или около 95% идентичности в указанном участке), по сравнению с и выравненные для максимального соответствия в окне сравнения или в обозначенном участке, как измерено с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей (или других алгоритмов, доступных специалистам в данной области) или вручную сравнения и визуального изучения. Указанное определение также относится к комплементу тестируемой последовательности. Идентичности могут существовать на участке, который имеет по меньшей мере около 50 аминокислот или нуклеотидов в длину, или на участке, который имеет 75-100 аминокислот или нуклеотидов в длину или, если конкретно не указано, по всей последовательности полинуклеотида или полипептида. Полинуклеотид, кодирующий полипептид настоящего изобретения, включая гомологи видов, отличающихся от людей, можно получить способом, включающим стадии скринирования библиотеки в жестких условиях гибридизации с меченым зондом, содержащим полинуклеотидную последовательность настоящего изобретения или ее фрагмент, и выделяя полной длины кДНК и геномные клоны, содержащие указанную полинуклеотидную последовательность. Такие методики гибридизации хорошо известны специалистам в данной области. Для сравнения последовательностей обычно одну последовательность используют как референспоследовательность, с которой сравнивают последовательности. Когда используют алгоритм сравнения последовательностей, тестируемую последовательность и референс-последовательность вводят в компьютер, определяют координаты субпоследовательности, при необходимости, и задают параметры программы алгоритма последовательностей. Можно использовать параметры неудачной программы или можно задать альтернативные параметры. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей рассчитывают процент идентичности последовательности для тестируемой последовательности относительно референс-последовательности на основании параметров программы. Термин "окно сравнения" в том смысле, как здесь использован, включает сравнение с сегментом любого одного из числа смежных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно от около 50 до около 200, чаще от около 100 до около 150, в котором последовательность можно сравнить с референс-последовательностью того же числа смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны специалистам в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществить, используя, включая, без ограничения, алгоритм локальной гомологичностиSmith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math., 2:482c, алгоритм выравнивания гомологичности Needlemanand Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443, поиск по методу сходства Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l.Acad. Sci. USA, 85:2444, компьютерными реализациями указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA из Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science, Dr., Madison,WI) или выравнивая вручную и визуально инспектируя (см., например, Ausubel et al., Current Protocols inMolecular Biology (1995 supplement. Одним примером алгоритма, который пригоден для определения процента идентичности последо- 27019968 вательности и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые раскрыты Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410 соответственно. Программное обеспечение для осуществления BLAST анализов общедоступно через Национальный Центр (National Center Biotechnology Information), доступный на World Wide Web по адресу ncbi.nlm.nih.gov. Параметры BLAST алгоритма W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. BLASTN программа (для нуклеотидных последовательностей) использует как параметр по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) или 10, М=5, N=-4 и сравнение обоих цепей. Для аминокислотных последовательностей BLASTP программа использует как параметр по умолчанию длину слова 3, и ожидание (Е) 10, и BLOSUM62 матрицу замен (см. Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl.BLAST алгоритм обычно используют с отключенным фильтром "низкой комплексности".BLAST алгоритм также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787). Одним показателем сходства, который предоставляет BLAST алгоритм, является наименьшая сумма вероятностей(P(N, что является показателем вероятности совместимости между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, которая может случайно возникнуть. Например, нуклеиновую кислоту считают сходной с референс-последовательностью, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с референс-нуклеиновой кислотой составляет менее чем около 0,2, или менее чем около 0,01, или менее чем около 0,001. Выражение "селективно (или специфически) гибридизуется с" относится к связыванию, дублированию или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, если такая последовательность присутствует в сложной смеси (включая, без ограничения, полные клеточные или библиотеку ДНК или РНК). Выражение "жесткие условия гибридизации" относится к гибридизации последовательности ДНК,РНК, PNA или других имитаторов нуклеиновой кислоты либо их комбинаций в условиях низкой ионной силы и высокой температуры, что известно специалистам. Обычно в жестких условиях зонд гибридизуется со своей мишеневой субпоследовательностью в сложной смеси нуклеиновых кислот (включая, без ограничения, полные клеточные или библиотеки ДНК либо РНК), но не гибридизуется с другими последовательностями в сложной смеси. Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти вTijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of Nucleic Acids Analysis" (1993). Обычно жесткие условия выбирают примерно на около 5-10 С ниже температуры точки плавления (Tm) для конкретной последовательности при заданной ионной силе, рН. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, рН и концентрации ядер), при которой 50% зондов комплементарных мишени гибридизуются с последовательностью-мишенью при равновесии (если последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Tm 50% зондов находятся в равновесии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,0 М ионов натрия, обычно от около 0,01 до 1,0 М концентрации ионов натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, и температура равна по меньшей мере около 30 С для коротких зондов (включая, без ограничения, зонды от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60 С для более длинных зондов (включая, без ограничения, зонды от 50 нуклеотидов). Жесткие условия можно также создать, добавляя дестабилизирующие агенты, такие как формамид. Доля селективной или специфической гибридизации позитивного сигнала может превышать фон, по меньшей мере двукратно, оптимально в 10 раз фоновую гибридизацию. Примеры условий жесткой гибридизации могут быть следующими: 50% формамида, 5 Х SSC, и 1% SDS, инкубирование при 42 С или 5 Х SSC, 1% SDS, инкубирование при 65 С, с промывкой при 0,2 Х SSC и 0,1% SDS при 65 С. Такие промывки можно осуществлять в течение 5, 15, 30, 60, 120 или более минут. Термин "эукариот" относится к организмам, принадлежащим к филогенетическому домену Eucarya,таким как животные (включая, без ограничения, млекопитающих, насекомых, рептилий, птиц и т.д.),реснитчатые, растения (включая, без ограничения, однодольные, двудольные, водоросли и т.д.), грибы,дрожжи, жгутиковые, микроспоридии, одноклеточные организмы и т.д. Термин "неэукариот" относится к неэукариотным организмам. Например, неэукариотный организм может принадлежать к Eubacteria (включая, без ограничения, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacilus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pulida и т.д.) филогенетическому домену или Archaea (включая, без ограничения, Melhanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, таким как Haloferax volcanii и Halobacterium species NRC-I,Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix и т.д.) филогенетическому домену. Термин "субъект" относится к животному, в некоторых вариантах - к млекопитающему, и в других вариантах - к человеку, который является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Животное может быть домашним животным (например, собакой, кошкой и т.п.), фермерским животным (например,- 28019968 коровой, овцой, свиньей, лошадью и т.п.) или лабораторным животным (например, крысой, мышью,морской свинкой и т.п.). Термин "эффективное количество" относится к такому количеству вводимого полипептида, модифицированного неприродной аминокислотой, которое до некоторой степени облегчит один или более из симптомов подлежащего лечению заболевания, состояния или нарушения. Композиции, содержащие раскрытые здесь полипептиды, модифицированные неприродной аминокислотой, можно вводить для профилактики, активизации и/или терапевтического лечения. Термины "повышать" или "повышение" означают повышение или пролонгирование эффективности или длительности необходимого эффекта. Так, что касается эффекта усиления терапевтических агентов,термин "усиление" относится к способности повышать или пролонгировать, или эффективность или длительность действия других терапевтических агентов на систему. Термин "повышающе-эффективное количество" в том смысле, как здесь использован, относится к количеству, которое адекватно усилению действия другого терапевтического агента в необходимой системе. При использовании для животного эффективное количество для такого использования будет зависеть от тяжести процесса заболевания, нарушения или состояния, предшествовавшего лечения, общего состояния здоровья животного, реакции на лекарственное средство и от суждения лечащего ветеринара. Термин "модифицированное" относится к любому изменению, осуществленному для данного полипептида, такому как изменение длины полипептида, аминокислотной последовательности, химической структуры, к котрансляционной модификации или посттрансляционной модификаци полипептида. Термин "модифицированная" форма означает, что обсуждаемые полипептиды являются необязательно модифицированными, то есть обсуждаемые полипептиды могут быть как модифицированными, так и/или немодифицированными. Термин "посттрансляционно модифицированный" относится к любой модификации природной или неприродной аминокислоты, которая происходит после того, как такая аминокислота была включена в полипептидную цепь. Термин включает только в качестве примера котрансляционные in vivo модификации, котрансляционные in vitro модификации (такие как не содержащая клеток трансляционная система),посттрансляционные in vivo модификации и посттрансляционные in vitro модификации. В целях профилактики композицию, содержащую полипептид bG-CSF, вводят животному, восприимчивому или каким-либо другим образом подверженному риску конкретного заболевания, нарушения или состояния. Такое количество определяют как "профилактически эффективное количество". При таком использовании точные количества также зависят от общего состояния здоровья животного, веса и т.п. Среди специалистов в данной области общепринято определять такие профилактически эффективные количества рутинными экспериментами (например, доза, превышающая клинически определенные дозы). Термин "защищенный" относится к присутствию "защитной группы" или молекулы, которые предотвращают реакцию химически реакционноспособных функциональных групп в некоторых условиях реакций. Защитная группа будет меняться в зависимости от типа защищаемой химически реакционноспособной группы. Например, если химически реакционноспособной группой является амин или гидразид, защитную группу можно выбрать из группы тетрабутилоксикарбонила (t-Boc) и 9 фторенилметоксикарбонила (Fmoc). Если химически реакционноспособной группой является тиол, защитной группой может быть ортопиридилдисульфид. Если химически реакционноспособной группой является карбоновая кислота, такая как бутановая или пропионовая кислота либо гидроксильная группа,защитной группой может быть бензильная или алкильная группа, такая как метил, этил или трет-бутил. Другие известные специалистам защитные группы можно также использовать в раскрытых здесь способах и композициях, включая фотолабильные группы, такие как Nvoc и MeNvoc. Другие известные специалистам защитные группы можно также использовать в раскрытых здесь способах и композициях. Только в качестве примера блокирующие/защитные группы можно выбрать из Другие защитные группы раскрыты у Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rdEd., John WileySons, New York, NY, 1999, что включено в описание посредством ссылки во всей своей полноте. В терапевтических целях композицию, содержащую модифицированный неприродный аминокис- 29