Лечение микробных инфекций

mediated by Staphylococcus aureus clumping factor B", Изобретение относится к улучшенным вакцинам против микробных антигенов, фармацевтическим композициям,иммуногенным композициям и антителам и их применению для лечения микробных инфекций, в частности инфекций бактериального происхождения, включая стафилококковое происхождение. В идеале изобретение относится к рекомбинантным стафилококковым MSCRAMM или MSCRAMM-подобным белкам либо их фрагментам с уменьшенным связыванием с их лигандом хозяина для применения в терапии.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЕ ПРОВОСТ, ФЕЛЛОУС ЭНД СКОЛАРС ОФ ДЕ КОЛЛЕДЖ ОФ ДЕ ХОУЛИ ЭНД АНДИВАЙДИД ТРИНИТИ ОФ КУИН ЭЛИЗАБЕТ, НЕАР ДУБЛИН (IE) Введение Настоящее изобретение относится к улучшенным вакцинам против микробных антигенов, фармацевтическим композициям, иммуногенным композициям и антителам и их применению в лечении микробных инфекций, в частности инфекций бактериального происхождения, включая стафилококковое происхождение. Множественная лекарственная устойчивость (MDR) представляет собой растущую проблему среди грамположительных бактерий, в частности, в больницах. Широкое применение антибиотиков и других агентов для лечения бактериальных инфекций привело к быстрому развитию бактерий, устойчивых к данным агентам, и многие бактерии имеют множественную лекарственную устойчивость. Таким образом, в настоящее время существует необходимость в обеспечении улучшенных способов лечения для решения проблем, связанных с такими устойчивыми к лекарствам инфекциями. Стафилококки представляют собой грамположительные бактерии сферической формы, обычно организованные в виде виноградоподобных нерегулярных кластеров. Некоторые из них являются членами нормальной флоры кожи и слизистых мембран человека, другие вызывают нагноение, формирование абсцесса, различные пиогенные инфекции и даже фатальный сепсис. Патогенные стафилококки часто вызывают гемолиз крови, коагуляцию плазмы и производят различные внеклеточные ферменты и токсины. Род Staphylococcus имеет по меньшей мере 30 видов. К трем основным видам, имеющим клиническое значение, относятся Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus saprophyticus.Staphylococcus aureus является положительным в отношении коагулазы, что отличает его от других видов. S. aureus является основным патогеном для людей. Почти каждый человек в течение жизни имеет какой-либо тип инфекции, вызываемой S. aureus, варьирующий по тяжести от пищевого отравления или незначительных кожных инфекций до тяжелых, угрожающих жизни инфекций. Отрицательные в отношении коагулазы стафилококки представляют собой нормальную человеческую флору, которая иногда вызывает инфекцию, часто ассоциированную с имплантированными устройствами, особенно у очень молодых, пожилых пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом. Приблизительно 75% инфекций, вызванных отрицательными в отношении коагулазы стафилококками, ассоциированы S. epidermidis. Инфекции, вызванные Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis и другими видами, менее распространены. S. saprophyticus является относительно частой причиной инфекций мочевых путей у молодых женщин. Стафилококки продуцируют каталазу, которая отличает их от стрептококков. S. lugdunensis также имеет клиническое значение и присутствует приблизительно в 5-10% случаев инфекционного эндокардита. Колонизация S. aureus суставного хряща, в котором коллаген является основным компонентом,внутри суставной щели, по-видимому, является важным фактором, способствующим развитию септического артрита. Гематогенно-приобретенный бактериальный артрит остается серьезной медицинской проблемой. Это быстро прогрессирующее и чрезвычайно разрушительное для суставов заболевание трудно лечить. Как правило, менее 50% инфицированных пациентов не могут восстановиться без серьезных повреждений суставов. S. aureus является преобладающим патогеном, выделенным из взрослых пациентов с гематогенным и вторичным остеомиелитом. У госпитализированных пациентов бактерии Staphylococcus, такие как S. aureus, являются основной причиной инфекции. Первично локализованные инфекции ран или постоянных медицинских устройств могут привести к более серьезным инвазивным инфекциям, таким как сепсис, остеомиелит, мастит и эндокардит. В случае инфекций, ассоциированных с медицинскими устройствами, пластмассовые и металлические поверхности покрываются плазмой хозяина и матриксными белками, такими как фибриноген и фибронектин, вскоре после имплантации. Эта способность S. aureus и других стафилококковых бактерий прикрепляться к этим белкам является существенной для начала инфекции. Сосудистые трансплантаты,внутривенные катетеры, искусственные клапаны сердца и устройства сердечной помощи являются тромбогенными и склонны к бактериальной колонизации. Из стафилококковых бактерий S. aureus является обычно самым разрушительным возбудителем таких инфекций. Значительный рост изолятов S. aureus, которые демонстрируют устойчивость к большинству доступных в настоящее время антибиотиков для лечения инфекций, наблюдался в больницах по всему миру. Разработка пенициллина для борьбы с S. aureus явилась значительным прогрессом в контроле и лечении инфекций. К сожалению, быстро появились пенициллин-устойчивые микроорганизмы и потребность в новых антибиотиках стала первостепенной. С появлением каждого нового антибиотика S. aureus был способен противодействовать ему с помощью -лактамаз, измененных пенициллинсвязывающих белков и мутантных белков клеточных мембран, позволяющих бактерии выживать. Таким образом, метициллин-устойчивый S. aureus (MRSA) и организмы с множественной лекарственной устойчивостью появились и создали основной плацдарм в больницах и домах престарелых по всему миру (Chambers, H.F.,Clin. Microbiol. Rev., 1:173, 1988 и Mulligan, M.E., et al., Am J. Med., 94:313, 1993). Сегодня почти половина стафилококковых штаммов, вызывающих внутрибольничные инфекции, устойчивы ко всем антибиотикам, за исключением ванкомицина, и это, по-видимому, лишь вопрос времени, когда ванкомицин также станет неэффективным. Таким образом, сохраняется очень сильная и быстро растущая потребность в терапевтических средствах для лечения инфекций, вызванных стафилококками, такими как S. aureus, которые эффективны в отношении штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам. В случае грамположительных патогенов, таких как стафилококки, стрептококки и энтерококки,белки, названные адгезинами, опосредуют такие инфекции, например, путем стимулирования колонизации, прикрепления к сгусткам крови и травмированным тканям. Эти специфические микробные поверхностные адгезины называются MSCRAMMs (микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные матриксные молекулы) (Patti, J. et al., Ann Rev. Microbiol., 48:585-617, 1994; Patti, J. and Hook,M., Cur. Opin Cell Biol., 6:752-758, 1994). MSCRAMMs специфически распознают и связываются с компонентами внеклеточного матрикса (ЕСМ), такими как фибронектин, фибриноген, коллаген и эластин. Эти MSCRAMMs находятся во многих грамположительных патогенах, и их аминокислотные последовательности являются родственными, они имеют сходную модульную конструкцию и общую организацию связывающих доменов.MSCRAMMs на поверхности бактериальной клетки и лиганды в ткани хозяина взаимодействуют по типу замка и ключа, что приводит к прикреплению бактерий к хозяину. Адгезия часто требуется для выживания бактерий и помогает бактериям обойти защитные механизмы хозяина и испытания на антибиотики. После того как бактерии успешно прикрепились и заселили ткани хозяина, их физиология резко меняется и они секретируют повреждающие компоненты, такие как токсины и ферменты. Более того,прикрепленные бактерии часто продуцируют биопленку и быстро становятся устойчивыми к убивающему эффекту большинства антибиотиков. Бактерия может экспрессировать MSCRAMMs, которые распознают различные матриксные белки. Лигандсвязывающие сайты в MSCRAMMs, по-видимому, определяются относительно короткими непрерывными участками аминокислотных последовательностей (мотивами). Поскольку похожий мотив можно найти в нескольких различных видах бактерий, возможно, что посредством этих функциональных мотивов осуществляется межвидовой перенос (Patti and Hook, Cur. Opin Cell Biol., 6:752-758, 1994). Кроме того, единичный MSCRAMM может иногда связываться с несколькими ЕСМ лигандами.MSCRAMMs могут опосредовать инфекцию путем связывания с белками, включающими фибриноген (Fg) и/или фибронектин (Fn) и т.д. Фибриноген и фибронектин представляют собой белки, обнаруженные в плазме крови, и играют ключевые роли в гемостазе и коагуляции. Фибриноген состоит из шести полипептидных цепей: двух А, двух В и двух -цепей. С-концевая часть -цепи является биологически важной и взаимодействует с тромбоцитарным интегрином во время прикрепления тромбоцитов и агрегации. Именно эта область, которая также является мишенью дляStaphylococcus aureus имеет несколько поверхностных экспрессирующихся белков, которые стимулируют активацию и агрегацию тромбоцитов. Белки MSCRAMM из Staphylococcus aureus включают, но не ограничиваются этим, следующие: фибриногенсвязывающий белок фактора агглютинации A (ClfA); фибриногенсвязывающий белок фактора агглютинации В (ClfB); фибронектин-фибриногенсвязывающий белок A (FnBPA); фибронектин-фибриногенсвязывающий белок В (FnBPB) иS. aureus поверхностные белки SasA, SasG, SasK и т.д. В таблице ниже приведен перечень различных поверхностных белков, заякоренных в клеточной мембране Staphylococcus aureus.c консенсусный мотив, распознаваемый сортазой и находящийся в Сконцевом сигнале сортировки на клеточной стенке;d сортаза, для которой поверхностный белок клеточной стенки является субстратом;TNFR, рецептор фактора некроза опухоли;f также связывается с белками слущенных эпителиальных клеток. Стимулирует устойчивость к бактерицидным липидам и лактоферрину;g также связывается со слущенными эпителиальными клетками носовой полости. Участвуют в образовании биопленок. Другие стафилококковые бактерии продуцируют поверхностные экспрессируемые белки(MSCRAMMs), которые похожи на факторы агглютинации или связывающие белки, перечисленные выше. Они включают, но не ограничиваются этим:Fbl из Staphylococcus lugdunensis представляет собой фибриногенсвязывающий белок. Fbl является членом Sdr-семейства: группы стафилококковых поверхностных белков, содержащих характерную область серин-аспартатных повторов. Фибриногенсвязывающий домен Fbl был картирован до 313 аминокислот и показал 62%-ную идентичность с соответствующей областью фактора агглютинации A (ClfA) из Staphylococcus aureus. Другие лигандсвязывающие белки/адгезины включают белки Isd (железорегулируемые поверхностные детерминанты), которые, хотя все они сами по себе не являются MSCRAMMs (например, IsdB иIsdH), способствуют адгезии бактерий к компонентам внеклеточного матрикса и названы в данном изобретении "MSCRAMM-подобными белками". Известно, что IsdA стимулирует адгезию к клеткам плоского эпителия и обладает слабым сродством к фибриногену и фибронектину, так что формально может быть определен как MSCRAMM. Фактор агглютинации A (ClfA) был идентифицирован как первый адгезии S. aureus, связывающий-цепь фибриногена. Затем были идентифицированы фибронектин-фибриногенсвязывающий белок AClfA и FnBP имеют структурные признаки, которые являются общими для всех белков, заякоренных в клеточной стенке, экспрессирующихся в грамположительных бактериях, включая ClfB. Фактор агглютинации A (ClfA), например, представляет собой белок, расположенный на поверхности Staphylococcus aureus. ClfA является важным фактором вирулентности S. aureus. Он вносит вклад в патогенез септического артрита и эндокардита. ClfA представляет собой образец семейства поверхностно-ассоциированных белков со сходной структурной/модульной организацией, включая, но не ограничиваясь этим, ClfB, SdrD, SdrE и т.д.ClfA содержит N-концевой домен А (фибриногенсвязывающую область) длиной 520 аминокислот,который включает три отдельно свернутых субдомена N1, N2 и N3. За доменом А следует серинаспартатная дипептидная повторяющаяся область и область, соединяющая клеточную стенку и мембра-3 019516 ну, которая содержит LPDTG-мотив для стимулируемого сортазой заякоривания в клеточной стенке.ClfA присутствует практически во всех штаммах S. aureus (Peacock S.J., Moore C.E., Justice A., KantzanouM., Story L., Mackie K., O'Neill G., Day N.P.J. (2002) Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus. Infect Immun., 70:4987-4996). Он связывается с С-концом -цепи фибриногена и таким образом способен индуцировать агглютинацию бактерий в растворе фибриногенаCharacterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor (ClfA) and fibrinogen,Eur J. Biochem. 247:416-424 и McDevitt D., Francois P., Vaudaux P., Foster T.J. (1994) Molecular characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus, Mol. Microbiol., 11:237-248). Трехмерный структурный анализ ClfA и родственных фибриногенсвязывающих белков SdrG и ClfB показал, что лигандсвязывающий домен А во всех этих родственных белках состоит из трех субдоменовN1, N2 и N3, с остатками 221-559, соответствующими участкам N2-N3, представляющим собой наименьшее укорочение, которое сохраняет способность связываться с фибриногеном. Обнаружили, что аминокислотные остатки 532-538 соответствуют области фиксирующего пептида из ClfA. Каждый субдомен содержит девять -цепей, которые образуют новую IgG-подобную укладку. Пептидсвязывающий сайт -цепь фибриногена в этих белках находится в гидрофобной бороздке на границе между N2 и N3. Обнаружили, что существует значительное структурное сходство между трехмерной структурой этих белков, которое обусловлено одной или более чем одной родственной аминокислотной последовательностью, сходной модульной конструкцией и общей организацией связывающего домена.SdrC, SdrD, SdrE, FnBPA-A (все семь изоформ) и FnBPB-B (все семь изоформ) имеют сходную модульную организацию и, используя, таким образом, PHYRE молекулярное моделирование можно ожидать, что эти белки будут иметь одинаковую трехмерную структуру.IsdA и IsdB не имеют такого же типа структуры, как белки Clf или Sdr. Они имеют новый мотив,названный NEAT, который вовлечен в связывание лиганда. Однако NEAT-мотив сходен с трехмерной структурой Clf или Sdr в том, что он состоит из "сэндвича" бета-цепей (бета-сэндвич-укладка, которая состоит из двух пятицепочечных антипараллельных бета-слоев) и является членом Ig-суперсемейства(Pilpa et al. "Solution Structure of the NEAT (NEAr Transported) Domain from IsdH/HarA: the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus", J. Mol. Biol. (2006) 10 360:435-447). Была установлена трехмерная структура NEAT-мотива IsdH и предсказаны остатки в петле 1b-2. Экспрессия ClfA на S. aureus препятствует фагоцитозу как макрофагами, так и нейтрофиламиimpedes macrophage phagocytosis, Microb Infect., 6:188-195 и Higgins J., Loughman A., van Kessel K.P.M.,van Strijp J.A.G., Foster T.J. (2006) Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes, FEMS Microbiol. Lett, 258:290-296). В нейтрофилах это связано как с фибриноген-зависимым механизмом, так и с фибриноген-независимым механизмом. Напротив, тромбоциты активируются бактериями, экспрессирующими ClfA, посредством его взаимодействия с GPIIb/IIIa,приводящего к агрегации. Это наиболее эффективно осуществляется, когда фибриноген присутствует, но существует также фибриноген-независимый путь активации тромбоцитов (Loughman A., Fitzgerald J.R.,Brennan M.P., Higgins J., Downer R., Cox D., Foster T.J. (2005) Roles of fibrinogen, immunoglobulin andClfA является фактором вирулентности для индукции септического артрита у мышей (Josefsson E.,Hartford О., O'Brien L., Patti J.M., Foster T. (2001) Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant, J. Infect. Dis, 184:1572-1580). Кроме того, элиминация ClfA вместе с другим фибриногенсвязывающим белком ClfB защищала против системного воспаления на ранних стадиях инфекции (Palmqvist N., Foster T., Fitzgerald R., Josefsson E.,Tarkowski A. (2005) Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles inClfA и ClfB имеют идентичную структурную (трехмерную) организацию и приблизительно 27%ную аминокислотную идентичность. FnBPA имеет приблизительно 25%-ную аминокислотную идентичность с ClfA. В настоящее время нет одобренных и коммерчески доступных вакцин на основе MSCRAMM. Veronate, донор-селективный противостафилококковый человеческий иммуноглобулиновый внутривенный(IGIV) препарат, направленный на ClfA и SdrG, плохо проявил себя в III фазе клинических испытаний и был снят с испытаний. В настоящее время его переоценивают для того, чтобы определить, является ли он эффективным для лечения стафилококковых инфекций.WO 2005/116064 относится к FnBPA, который является многофункциональным связывающим белком S. aureus. N-концевой домен А FnBPA напоминает ClfA и, как было показано, связывается с фибриногеном. Однако С-концевые BCD домены FnBPA связываются с фибронектином, следовательно, FnBPA является бифункциональным MSCRAMM.WO 2005/116064 основана на открытии, что в присутствии трансглутаминазы ковалентные связи образуются между бактериальным адгезином FnBPA и белком фибронектином хозяина, делая ассоциацию значительно более сильной и, по существу, необратимой. Фибриноген является основным компонентом (примерно 3 мг/мл) в крови, где он выступает в качестве конечной мишени каскада коагуляции. Фибронектин присутствует в меньшем количестве, примерно 0,3 мг/мл или одна молекула Fn на каждые 10-15 молекул фибриногена. Считают, что фибриноген и фибронектин не связываются в крови, где они циркулируют независимо. Важно отметить, что WO 2005/116064 конкретно относится к ковалентному сшиванию, катализируемому фактором XIIIa. В WO 2005/116064 выделено множество мутантных рекомбинантных FnBPA, в которых были изменены остатки с положительно заряженными боковыми цепями (т.е. субстраты для трансглутаминазы). Более того, WO 2005/116064 относится к мутантам, в которых изменены только связывающие свойства ковалентного фибронектина, а не фибриногена. Кроме того, в данном изобретении экспериментально не показано, уменьшается ли связывание мутантного белка с лигандом, и не представлено никаких данных, подтверждающих иммуногенность. Таким образом, в связи с распространенностью множественной лекарственной устойчивости у грамположительных бактерий и отсутствием успешных способов лечения и вакцин против таких бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, любая альтернативная терапия, которая может справляться с подобными бактериальными инфекциями без применения антибиотиков, будет иметь важное значение. Более того, любые улучшения эффективности известных способов лечения или вакцин будут иметь особое значение, особенно в клинических условиях. Таким образом, настоящее изобретение направлено на обеспечение альтернативной и улучшенной терапии для такого лечения таких бактериальных инфекций. Краткое изложение сущности изобретения В соответствии с первым основным аспектом изобретения предложен рекомбинантный стафилококковый MSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок или его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина для применения в терапии. В соответствии с предпочтительным воплощением предложен рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок MSCRAMM или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области без способности связывать фибриноген, для применения в терапии. В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума и/или лечения пациента, имеющего микробную инфекцию, включающий введение указанному индивидууму рекомбинантного стафилококкового MSCRAMM или MSCRAMMподобного белка или его фрагмента, или вакцины, содержащей рекомбинантный стафилококковыйMSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок или его фрагмент, с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина. В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая рекомбинантный стафилококковый белок MSCRAMM или его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина. В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения предложены антитела, полученные против рекомбинантного стафилококкового MSCRAMM или MSCRAMM-подобного белка или его фрагмента, с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина предпочтительно в виде гипериммунной сыворотки. В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения предложена иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый MSCRAMM или MSCRAMMподобный белок или его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина и фармацевтически приемлемым адъювантом. Подробное описание Следует понимать, что в данном описании термины "адгезии", "MSCRAMM" и "белки, заякоренные в клеточной стенке" являются взаимозаменяемыми и охватывают все происходящие из микробов лигандсвязывающие белки. В идеале эти белки связывают фибриноген, гем или гемоглобин, гаптоглобингемоглобин, гемин, коллаген и другие подобные лиганды. Предполагается, что термин "MSCRAMMподобные" белки охватывает белки или адгезины, которые имеют родственные аминокислотные последовательности, сходную модульную конструкцию и/или общую/сходную организацию связывающего домена с такими белками MSCRAMM, как белки Isd. В идеале MSCRAMM-подобные белки имеют сходную организацию/модульную конструкцию связывающего домена. Кроме того, MSCRAMMподобные белки могут иметь по меньшей мере 50%, предпочтительно 60%, предпочтительно 75%, более предпочтительно 85%, еще более предпочтительно 95%, а еще лучше 99% или более идентичности с белками MSCRAMM. Следует также понимать, что любой процент идентичности или гомологии, упомянутый в описании, определяют с использованием имеющихся традиционных способов относительно целой/всей длины последовательности. Термин "микроорганизм", "микроб", "микробный" или тому подобный включает, но не ограничивается организмами, включающими бактерии, грибы, вирусы, дрожжи и/или плесень. Термин "иммунологически эффективное количество" относится к таким количествам, которые способны вызывать В-клеточный и/или Т-клеточный ответ. В соответствии с первым основным аспектом изобретения предложен рекомбинантный стафилококковый MSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть лигандсвязывающей области с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина, для применения в терапии. Такой рекомбинантный белок может быть использован в лечении микробных инфекций, таких как лечение сепсиса, септического артрита и/или эндокардита или других сходных заболеваний либо болезненных состояний. Такие микробные инфекции, в идеале, могут быть вызваны стафилококками или другими сходными микроорганизмами. В соответствии с одним конкретным воплощением этого аспекта изобретения рекомбинантныйMSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок или его фрагмент имеет уменьшенную способность или отсутствие способности нековалентно связываться с его лигандом хозяина. Таким образом, следует понимать, что рекомбинантный стафилококковый MSCRAMM илиMSCRAMM-подобный белок или его фрагмент может иметь уменьшенное связывание с его лигандом хозяина или связывание с лигандом хозяина может быть предотвращено. В соответствии с изобретением предполагают, что нековалентное связывание, которое происходит во время связывания, посредством "стыковки, захвата и фиксации" (Dock, Lock and Latching (DLL,MSCRAMM или MSCRAMM-подобного белка с его лигандом, может быть уменьшено или предотвращено. Установлено, что первая стадия в связывании MSCRAMM с его лигандом включает нековалентное взаимодействие через DLL-модель. Это первичные нековалентные взаимодействия MSCRAMM с лигандом. Конечные стадии связывания MSCRAMM с лигандом включают ковалентные взаимодействия. В этом конкретном воплощении рекомбинантный MSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок либо его фрагмент имеют уменьшенную способность или отсутствие способности нековалентно связываться с его лигандом хозяина вследствие изменения "стыковки, захвата и фиксации". Могут быть изменены одна или более стадий "стыковки, захвата или фиксации". Модель DLL была выявлена из трехмерной структуры SdrG в комплексе с его лигандом. В настоящее время было показано, что ClfA действует с незначительным изменением DLL-механизма (Ganech etthe design of anti-staphylococcal therapeutics", PloS Pathog, 4(11); e1000226). DLL-модель относится именно к нековалентным взаимодействиям, вовлеченным в связывание лиганда. DLL-модель предложена для всех других белков сходного структурного типа (будь то аминокислотное сходство/гомология или гомология структурной организации), включая, но не ограничиваясь этим, MSCRAMM или MSCRAMMподобные белки. В отношении MSCRAMMs ClfA/ClfB, в частности, было обнаружено, что минимальный лигандсвязывающий домен содержит субобласти N1-N3 области А, а именно субобласти N2 и N3, которые содержат вариант Dev-IgG Ig укладки. Вариант Dev-IgG Ig укладки представляет собой новый вариант иммуноглобулинового мотива, также названный DE-вариантом. Предполагают, что гидрофобный карман, образованный между двумя Dev-IgG доменами ClfA/B, представляет собой лигандсвязывающий сайт для-цепи фибриногена. По сути, лиганд связывается с гидрофобной бороздкой, разделяющей N2 и N3. А именно, во время связывания лиганда развернутый пептидный компонент лиганда встраивается в бороздку, расположенную между субдоменами N2 и N3. Фиксирующий пептид на С-конце субдомена N3 претерпевает конформационное изменение и встраивается между двумя -цепями в субдомене N2, таким образом фиксируя лиганд на месте. Действительно, мутагенная замена остатков Tyr256, Pro336, Tyr338 иAGDV411 -цепи фибриногена, приводит к образованию белков с отсутствующим или заметно уменьшенным сродством к фибриногену. Более подробная информация о данном конкретном воплощении предложена ниже. Хотя эти идеи относятся к факторам агглютинации, в частности к ClfA, они в равной степени применимы к другим MSCRAMM и/или MSCRAMM-подобным белкам, которые имеют сходную модульную организацию связывающего домена и связывают лиганды аналогичным образом. Таким образом, для получения рекомбинантных стафилококковых MSCRAMM или MSCRAMMподобных белков или их фрагментов с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина, полноразмерный белок, лигандсвязывающий домен, минимальный лигандсвязывающий домен или его фрагмент могут быть изменены для уменьшения или предотвращения связывания с его лигандом хозяина. В идеале, для ClfA/ClfB и других сходных MSCRAMM или MSCRAMM-подобных белков субобласти N2 и N3 области А, которые в идеале содержат вариант Dev-IgG Ig укладки, могут быть изменены для предотвращения или уменьшения связывания с его лигандом хозяина. Такое изменение предназначено для предотвращения связывания лиганда с гидрофобной бороздкой, разделяющей минимальные лигандсвязывающие домены, необходимые для DLL. Такие изменения в лигандсвязывающем домене могут происходить на аминокислотном уровне путем замены или делеции аминокислоты с использованием либо полноразмерного белка, лигандсвязывающего домена, минимального лигандсвязывающего домена, либо его фрагмента. Следует понимать,что белки или их фрагменты с достаточно высокой гомологией с лигандсвязывающим белком также могут быть использованы. Высокая гомология, как определено в данном изобретении, имеет место, когда по меньшей мере 50%, предпочтительно 60%, предпочтительно 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95-99%, наиболее предпочтительно 99% или более нуклеотидов совпадают по всей длине последовательности ДНК, или при использовании в отношении аминокислотных последовательностей, когда указанные аминокислотные последовательности не идентичны,но производят белок, имеющий ту же функцию и активность. Следует понимать, что эти комментарии по поводу высокой гомологии также могут относиться к трехмерной структуре белка, то есть к модульной организации связывающего домена. Следует понимать, что может быть использован полный лигандсвязывающий белок, лигандсвязывающий домен, минимальный лигандсвязывающий домен или его фрагмент. Применение укороченных белков лигандсвязывающего белка, таких как лигандсвязывающий домен, минимальный лигандсвязывающий домен, или применение их фрагментов является предпочтительным для облегчения изготовления и преодоления других проблем, таких как нежелательное расщепление белка. Например, фиксирующий пептид, присутствующий в минимальном лигандсвязывающем домене,может быть делетирован/удален или изменен. Например, фиксирующий пептид в ClfA соответствует аминокислотам 532-538 области А и в ClfB - аминокислотам 530-540 области А (Walsh et al.(2004) JBC 279(49): 50691-50699). Эти остатки могут быть изменены, заменены или удалены/делетированы для предотвращения связывания лиганда с MSCRAMM через DLL. Таким образом, DLL "фиксирование"MSCRAMM с его лигандом предотвращается. Это "фиксирование" осуществляется посредством нековалентного взаимодействия. В одном воплощении фиксирующий пептид полностью удален вместе с остальными С-концевыми аминокислотными остатками области А. Согласно другому воплощению удалена только фиксирующая пептидная область. В соответствии с еще одним воплощением фиксирующая пептидная область подвергается аминокислотной замене, приводящей к уменьшению или предотвращению связывания/фиксирования. Эти комментарии применимы ко всем MSCRAMM или MSCRAMMподобным белкам, которые связывают лиганды посредством DLL или похожих моделей. Изменяя MSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок таким путем, можно создать лигандсвязывающий белок, неспособный связываться со своим лигандом, который стимулирует больший иммунный ответ при иммунизации, чем белок дикого типа. Предпочтительно это уменьшает системное воспаление,снижая тем самым микробную вирулентность. Следовательно, этот измененный лигандсвязывающийMSCRAMM или MSRAMM-подобный белок, который лишен способности связываться со своим лигандом, может быть предпочтительно использован для лечения микробных инфекций. Таким образом, эти данные представляют новое и ценное терапевтическое средство для вакцинации/иммунизации против бактериальных инфекций, которое обеспечивает лучшие результаты по сравнению с терапевтическим средством для вакцинации/иммунизации, происходящим из белка дикого типа. В соответствии с одним воплощением изобретения лиганд представляет собой гем, гемоглобин или фибриноген. Могут рассматриваться и другие лиганды, такие как гаптоглобин-гемоглобин, гемоглобин,гемин, коллаген и т.д. В соответствии с другим воплощением изобретения рекомбинантный белок MSCRAMM выбран из фибриногенсвязывающего белка или SdrD, SdrE, SdrG и/или SdrF. Фибриногенсвязывающие белки были описаны выше и включают, но не ограничиваются этим,ClfA, ClfB, FnBPA, FnBPB, Fbl, IsdA и т.д. Было показано, что SdrG/F связывает коллаген. ДругиеMSCRAMMs включают SasA, SasG, SasK и SdrH. Рекомбинантный MSCRAMM-подобный белок может быть выбран из IsdA, IsdB и/или IsdH. На основании данных о фибриногенсвязывающем MSCRAMM ClfA могут быть получены аналогичные не-лигандсвязывающие мутанты, например, в NEAT (NEAr Transporter) мотиве белков Isd, включая IsdH и IsdB. Как описано выше, IsdA и IsdB не имеют такого же типа структуры, как белки Clf илиSdr. Однако NEAT-мотив в Isd непосредственно вовлечен в связывание лиганда (гаптоглобингемоглобин, гемоглобин, гемин), таким образом изменения в NEAT-мотиве будут препятствовать взаимодействию хозяин-лиганд таким же образом, как изменение DLL- или DLL-подобного взаимодействия хозяин-лиганд для Clf или Sdr. Многие NEAT доменсодержащие белки, включая IsdA в Staphylococcusaureus, вовлечены в связывание с гемом. Предполагают, что гемсвязывающее свойство IsdA содержится в NEAT-домене. Кристаллические структуры ано-IsdA NEAT-домена и в комплексе с гемом продемонстрировали подобную клатриновому адаптеру бета-сэндвич-укладку с большим гидрофобным гемсвязывающим карманом. IsdB имеет два NEAT-мотива, и IsdA имеет один NEAT-мотив. Не-7 019516 лигандсвязывающие мутанты белков Isd могут быть выделены путем изменения остатков, предназначенных для связывания с лигандом, например, путем изменения остатков между бета-цепями и/или гидрофобным карманом. Кроме того, NEAT-мотив может быть изменен для воздействия на нековалентные взаимодействия хозяин-лиганд. В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума и/или лечения пациента, имеющего микробную инфекцию,включающий введение указанному индивидууму рекомбинантного стафилококкового MSCRAMM илиMSCRAMM-подобного белка или его фрагмента либо вакцины, содержащей рекомбинантный стафилококковый MSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок либо его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина. В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложена вакцина,содержащая рекомбинантный стафилококковый MSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок либо его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина. В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложены антитела против рекомбинантного стафилококкового MSCRAMM или MSCRAMM-подобного белка или его фрагмента с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина предпочтительно в форме гипериммунной сыворотки. В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложена иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый MSCRAMM илиMSCRAMM-подобный белок или его фрагмент, с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина. В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения предложен рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области и лишенный способности связывать фибриноген, для применения в терапии. Следует понимать, что рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент может быть использован для лечения микробных инфекций, предпочтительно стафилококковых инфекций, например, для лечения сепсиса, септического артрита и/или эндокардита или других похожих заболеваний или болезненных состояний. Фибриногенсвязывающая область белка изменена таким образом, что больше не связывается с фибриногеном. Как отмечалось выше, изменение может произойти на нуклеотидном или аминокислотном уровне. Следует понимать, что могут быть использованы также белки или их фрагменты с достаточно высокой гомологией с фибриногенсвязывающим белком. Высокая гомология, как определено в данном изобретении, имеет место, когда по меньшей мере 50%, предпочтительно 60%, предпочтительно 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95%, наиболее предпочтительно 95-99%, особенно предпочтительно 99% нуклеотидов совпадают по всей длине последовательности ДНК, или при использовании в отношении аминокислотных последовательностей, когда указанные аминокислотные последовательности не идентичны, но производят белок, имеющий ту же функцию и активность. Следует понимать, что эти комментарии о высокой гомологии также могут относиться к трехмерной структуре белка. Следует понимать, что может быть использован полный фибриногенсвязывающий белок, фибриногенсвязывающая область, минимальная фибриногенсвязывающая область или ее фрагмент. Применение укороченных белков или их фрагментов является предпочтительным для облегчения изготовления и преодоления других проблем, таких как нежелательное расщепление белка. Это описано ниже. Такие фрагменты, в идеале, должны содержать по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области MSCRAMM. Преимущества применения укороченного белка или его фрагмента, содержащего,например, только один или более субдоменов лиганд-фибриногенсвязывающей области, относится к способности очищать белок с высокими выходами без деградации. Фибриногенсвязывающая область белка ClfA, иначе называемая областью А, содержит 3 субобласти, N1, N2 и N3. Таким образом, иммуногенный фрагмент может содержать субобласти N1, N2 и/или N3 области A ClfA или ее фрагмент. Таким образом, например, в отношении ClfA фрагмент может содержать один или более субдоменов области А,N1, N2 или N3. В идеале, могут быть использованы N2 и N3, поскольку такое укорочение, вероятно,меньше подвергается протеолизу (сообщалось, что сайт для расщепления протеазами находится междуN1 и N2 в ClfA и ClfB) и может экспрессироваться на более высоких уровнях в Е. coli. N2 и N3 представляют собой минимальную фибриногенсвязывающую область белков Clf. Следует понимать, что хотя последующее обсуждение относится к фибриногенсвязывающему белку ClfA, эти комментарии в равной степени применимы к другим MSCRAMM, MSCRAMM-подобным белкам и, в частности, другим фибриногенсвязывающим белкам, которые структурно сходны на уровне либо аминокислотной, либо белковой структуры с ClfA, например, таким как ClfB, Fbl и SdrF/G (которые также связывают коллаген). Кроме того, эти идеи применимы к FnBPA и FnBPB. Таким образом, хотя следующие комментарии относятся к фибриногенсвязывающим белкам, они в равной степени применимы к другим MSCRAMM или MSCRAMM-подобным белкам, которые связываются с лигандами, отличными от фибриногена. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что измененный фибриногенсвязывающий белок,укорочение или его фрагмент, лишенный способности связываться с фибриногеном, стимулирует больший иммунный ответ при иммунизации, чем белок дикого типа, который связывается с фибриногеном обычным способом. Предпочтительно этот измененный фибриногенсвязывающий белок не вызывает системного воспаления при экспрессии в S. aureus и, таким образом, микробная вирулентность уменьшается. Следовательно, этот измененный белок, который лишен способности связываться с фибриногеном,может быть предпочтительно использован для лечения микробных инфекций. Авторы изобретения также обнаружили, вопреки ожиданиям, что защитный эффект измененного фибриногенсвязывающего белка выше, чем у белка дикого типа. Авторы изобретения обнаружили, что фармацевтическая композиция или вакцина, содержащая такой измененный рекомбинантный белок, является более эффективной, чем фармацевтическая композиция или вакцина, содержащая тот же рекомбинантный белок в неизмененной (дикого типа) форме, такой как ClfA, ClfB, SdrG и т.д. Таким образом, эти данные представляют новое и полезное терапевтическое средство для вакцинации/иммунизации против бактериальных инфекций, которое обеспечивает лучшие результаты по сравнению с белком дикого типа, также используемым в качестве терапевтического средства для вакцинации/иммунизации. Следует понимать, что измененный белок, будь то MSCRAMM или MSCRAMM-подобный белок,фибриноген или другой лигандсвязывающий белок, может быть использован для получения антител,включая моноклональные, поликлональные, химерные, гуманизированные антитела или их фрагменты,для применения в лечении таких микробных инфекций. Затем могут быть предложены композиции, которые включают такие антитела, например, как гипериммунная сыворотка, и эти композиции могут быть использованы в лечении пациентов, инфицированных стафилококковыми инфекциями. Таким образом, белки или их активные фрагменты могут быть использованы для ингибирования связывания стафилококков с внеклеточным матриксом (ЕСМ) и для предупреждения/лечения стафилококковых инфекций у пациента. Кроме того, белки или их активные фрагменты и антитела к белкам полезны в лечении инфекций,вызванных стафилококками, для разработки вакцин для активной и пассивной вакцинации и при введении в виде фармацевтической композиции для раны или медицинского устройства, как белки, так и антитела полезны в качестве блокирующих агентов для предупреждения микробных инфекций. Например,эти белки или их фрагменты могут быть использованы в активных вакцинах, а антитела к этим белкам в пассивных вакцинах. Эти вакцины и продукты, описанные в данном изобретении, представляют значительное улучшение по сравнению с предшествующим уровнем техники, в котором сообщается об обычном примененииMSCRAMMs для обеспечения иммунизации, но не сообщается о неожиданных и улучшенных вакцинах или продуктах, описанных в данном изобретении. Получение белков, ДНК и антител хорошо известно в данной области техники и не будет подробно описываться в данном изобретении. Обычные способы идеально подходят для получения этих молекул. Изобретение также будет понятно для охвата конструкций нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновокислотную и аминокислотную последовательность, представляющую интерес, рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих такие конструкции нуклеиновых кислот для экспрессии интересующего белка, и иммуногенных композиций. Для введения белковая композиция может быть диспергирована в стерильном изотоническом солевом растворе или другом фармацевтически приемлемом адъюванте. Следует понимать, что вакцина может быть ДНК- или белковой вакциной. Иммунизация может иметь место при введении ДНК, белка или антител. Кроме того, может быть введен ослабленный живой организм, который включает и экспрессирует ДНК. Количество ДНК, белка или антител, которые могут быть введены, будет зависеть от некоторых смягчающих факторов, включая зависимость от силы промотора, экспрессии белка и иммуногенности экспрессируемого гена. Они могут быть изменены для каждого нового применения для получения желаемого иммунологически эффективного количества. В соответствии с другим воплощением данного изобретения предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума и/или лечения пациента, имеющего микробную инфекцию, включающий введение индивидууму рекомбинантного стафилококкового фибриногенсвязывающего белка или его фрагмента, содержащего, по меньшей мере, фибриногенсвязывающую область, без способности связываться с фибриногеном. В соответствии с другим предпочтительным воплощением данного изобретения предложена вакцина, содержащая рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент,содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области, без способности связываться с фибриногеном. В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением данного изобретения предложено антитело против рекомбинантного стафилококкового фибриногенсвязывающего белка или его фрагмента,содержащего по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области, без способности связываться с фибриногеном, предпочтительно в форме гипериммунной сыворотки. В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением данного изобретения предложена иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области, без способности связываться с фибриногеном, и фармацевтически приемлемый адъювант. В идеале рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент происходит из S. aureus, S. epidermidis и/или S. lugdunensis. В этих воплощениях фибриногенсвязывающий белок может быть выбран из Fbl, SdrF и/или SdrG(которые также являются коллагенсвязывающими). Альтернативно, фибриногенсвязывающий белок может быть выбран из фибриногенсвязывающего белка фактора агглютинации A (ClfA), фибриногенсвязывающего белка фактора агглютинации В (ClfB), фибронектин-фибриногенсвязывающего белка A(FnBPA), фибронектин-фибриногенсвязывающего белка В (FnBPB). IsdA стимулирует адгезию, имеет слабую аффинность к фибриногену и фибронектину, поэтому может быть в принципе определен как фибриногенсвязывающий MSCRAMM. Следует понимать, что нуклеотидные и аминокислотные замены или делеции в фибриногенсвязывающей области таких фибриногенсвязывающих белков дают в результате рекомбинантный белок без способности связываться с фибриногеном. Было выявлено, что связывание ClfA с фибриногеном осуществляется посредством механизма"стыковки, захвата и фиксации" (dock, lock and latching (DLL, аналогичного механизму для SdrG. Модель DLL была описана выше. Область A ClfA отвечает за белок-лигандное взаимодействие. Как показано на фиг. 11, модульная структура нескольких фибриногенсвязывающих MSCRAMM сходна и все они содержат область А, похожую на ClfA. Пептидсвязывающий сайт -цепи фибриногена расположен в гидрофобной бороздке на границе между N2 и N3 ClfA. Таким образом, замены или делеции, упомянутые выше, направлены на изменение взаимодействия между белком MSCRAMM и лигандом и предотвращение нековалентного связыванияClfA с фибриногеном. В соответствии с одним конкретным воплощением настоящего изобретения рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок представляет собой мутант ClfA, дефектный в отношении связывания с фибриногеном. В этом воплощении фибриногенсвязывающая область A ClfA изменена любыми способами (такими как мутации с заменой или делецией) с тем, чтобы она больше не связывалась с фибриногеном. В идеале, фибриногенсвязывающий белок представляет ClfA, однако ClfA имеет трехмерное структурное сходство со многими другими фибриногенсвязывающими белками. Таким образом, следует понимать, что эти комментарии, относящиеся к ClfA, в равной степени применимы к другим MSCRAMM фибриногенсвязывающим белкам, включая ClfB, FnBPA, FnBPB, Fbl, SdrG/F, IsdA и т.д. Все эти белки имеют похожие трехмерные структуры, поэтому сходные изменения/мутации в фибриногенсвязывающей области могут быть сделаны с получением тех же результатов.ClfA представляет собой белок из 993 аминокислот, содержащий фибриногенсвязывающий домен из 520 аминокислот (из аминокислот с 40 по 559). Этот фибриногенсвязывающий домен представляет собой N-концевой А домен, содержащий субобласти N1, N2 и N3. В изобретении может быть использована полная фибриногеновая область, охватывающая N1-N3, от аминокислоты 40 до аминокислоты 559. Альтернативно, может быть использовано укорочение N1-143-области, например 221-559 (минимальная фибриногенсвязывающая область), 221-531 (минимальная фибриногеновая область без фиксирующего пептида и последующих остатков) и т.д. В идеале, могут быть использованы субобласти N2 и N3, минимальная фибриногенсвязывающая область, которые соответствуют аминокислотным остаткам 221-559. Альтернативно, может быть использован фрагмент этих субобластей. Было установлено, что аминокислотные остатки от 221 до 559, охватывающие области N2 и N3ClfA, играют важную роль в связывании с фибриногеном и представляют собой минимальную фибриногенсвязывающую область. Авторы изобретения также неожиданно обнаружили, что мутация аминокислотных остатков в этой области дает в результате экспрессируемый белок, который может распознаваться иммунной защитной системой хозяина, но лишен связывания с фибриногеном и поэтому уменьшает ассоциированную вирулентность. Эта область (фибриногенсвязывающий домен из 339 аминокислот)ClfA имеет определенную трехмерную структуру, так называемый DE-вариант IgG укладки, и представляет собой минимальное Fg-связывающее укорочение, которое в случае изменения (посредством замены или делеции и т.д.) может обеспечить улучшенную терапию. Изменение, приводящее к потере фибриногенсвязывающей активности, может происходить путем замены, добавления либо вставки или делеции либо на нуклеотидном, либо на аминокислотном уровне. В идеале, замена отрицательно влияет на трехмерную структуру (например, так называемого DEварианта IgG укладки) белка или фрагмента, поэтому он больше не может связываться с фибриногеном. В идеале, нуклеотидная или аминокислотная замена уменьшает нековалентное взаимодействие с фибриногеном предпочтительно посредством предотвращения связывания лиганда с гидрофобным карманом, разделяющим N2 и N3 области А фибриногенсвязывающего белка. Альтернативно, область фик- 10019516 сирующего пептида, соответствующая аминокислотам 532-538, может быть изменена посредством замены или делеции для предотвращения связывания лиганда. Дополнительно могут быть использованы укорочение/фрагмент, лишенные области фиксирующего пептида и возможно оставшейся части С-концевых белковых остатков, то есть лишенные аминокислотных остатков 532-559. В соответствии с одним конкретным воплощением этого аспекта изобретения мутант ClfA, дефектный в отношении связывания с фибриногеном, может быть сконструирован посредством замены аминокислот Р 336 на серин и/или Y338 на аспартат соответственно. Выбор остатков был основан на рентгеноструктурном анализе ClfA и наблюдении, что индивидуальные изменения в пролине или тирозине уменьшали связывающую способность. Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что этот мутантный белок ClfA (rClfAP336S Y338A) стимулирует иммунный ответ и может быть использован для создания значительно более эффективной вакцинной или антительной терапии. Эта замена может иметь место в полноразмерном фибриногенсвязывающем белке, фибриногенсвязывающей области, минимальной фибриногенсвязывающей области или его фрагменте. В соответствии с другим конкретным воплощением этого аспекта изобретения мутант ClfA, дефектный в отношении связывания с фибриногеном, может быть сконструирован посредством замены аминокислот Р 336 на аспартат и/или Y338 на серин соответственно. Как и в предыдущем воплощении, этот мутантный белок ClfA (rClfAP 336 А Y338S) также может быть использован для создания значительно более эффективной вакцинной или антительной терапии. Альтернативно, изменение может быть в форме делеции, включая фибриногенсвязывающую область без последовательности фиксирующего пептида (аминокислоты 532-538), с получением рекомбинантного фибриногенсвязывающего белка без способности нековалентно связываться с фибриногеном. В этом воплощении используют аминокислотные остатки 221-531 области A ClfA, которая лишена фиксирующего пептида и последующих С-концевых остатков. Альтернативно, может быть рассмотрена аминокислотная замена в аминокислотах 532-538 фиксирующего пептида, которая препятствует DLL фибриногена. Следует понимать, что все белки семейства Clf-Sdr связывают лиганды согласно DLL-модели. Посредством моделирования трехмерной структуры можно предсказать фиксирующий пептид и сделать укорочение с его отсутствием либо в полноразмерном (N1-N3), либо в минимальном лигандсвязывающем укорочении N2-N3 или его фрагменте. Авторы изобретения обнаружили, что эти белки rClfA с заменами (либо мутанты с делециями, либо замены или укорочения) снижали вирулентность и облегчали исход заболевания и неожиданно индуцировали менее системное воспаление, чем белок дикого типа. Таким образом, иммунизация этих мутантных белков, как ожидается, основана на тестировании белков, увеличении уровня антител, которые распознают как мутантный белок, так и белок дикого типа,и обеспечивают больший иммунный ответ, чем в случае белка дикого типа. Таким образом, ClfA, который был изменен так, что он больше не может связываться с фибриногеном, является полезным терапевтическим кандидатом для активной или пассивной иммунизации. Следовательно, сам измененный белок ClfA может быть использован в качестве вакцины, или могут быть использованы антитела, полученные к этому измененному белку ClfA. Как указано выше, вакцина может быть ДНК- или белковой вакциной. Следующие последовательности, представленные в таблице ниже, могут быть использованы в соответствии с изобретением. 1 Дополнительные N остатки (N-концевой участок (6His метка и дополнительные остатки) содержат 6 остатков His споследующими Gly и Ser. Дополнительные С-концевые остатки включают Lys с последующим Leu (другие дополнительные N- и С-концевые остатки могут быть использованы в зависимости от используемого праймера или необходимых N/C-концевых маркеров). 2 Дополнительные N остатки (6His метка и дополнительные остатки) включают 6 остатков His с последующими Gly и Ser. Дополнительные С-концевые остатки включают Arg с последующим Ser (другие дополнительные N-и Сконцевые остатки могут быть использованы в зависимости от используемого праймера или необходимых N/C-концевых маркеров). 3 Без фиксирующего пептида, соответствующего а.к. остаткам 532-538 и оставшихся С-концевых остатков области А, то есть лишенные аминокислотных остатков 532-559. В идеале рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-3, где Р 336 и/или Y338 заменены серином и/или аланином, или его фрагмент. Альтерантивно, фрагмент рекомбинантного стафилококкового фибриногенсвязывающего белка содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 14. SEQ IDNO: 4 и 5 соответствуют только N1, N2, N3 домена A ClfA, rClfA P336S Y338A и rClfA Р 336 А Y338 S соответственно, как указано в таблице выше. Предполагают также, основываясь на заменах в фиксирующем пептиде, которые были сделаны вSdrG, что замены в фиксирующем пептиде, которые являются дефектными в отношении конформационного изменения или комплементации бета-цепи, также будут дефектными в отношении связывания с лигандом. Таким образом, в идеале, замены приходятся на аминокислотные остатки 532-538, которые соответствуют фиксирующему пептиду и влияют на способность пептида подвергаться конформационному изменению или связываться с лигандом, или на то и другое. Альтернативно, изменение может включать удаление аминокислотных остатков 532-538 (дельта фиксирующий пептид) вообще с получением аналогичных результатов. Кроме того, С-концевой укороченный мутант, лишенный аминокислотных остатков 532-559 (включая остатки фиксирующего пептида), также будет влиять на связывание с лигандом. Однако также предполагается, что другие аминокислотные остатки могут быть заменены иначе, чем конкретно указано выше. Например, Glu 526, Val 527, Tyr 256 и Lys 389 могут быть заменены для изменения фибриногенсвязывающих свойств белка или его фрагмента. Таким образом, может рассматриваться любая замена, которая уменьшает связывающую способность. В идеале, такие замены или делеции влияют на гидрофобный карман и ассоциированный механизм связывания лиганда в гидрофобной бороздке, такие как гомологи Val527 в ClfA и N526 в ClfB. В ClfB Q235 и N526 были изучены для того,чтобы показать, как уменьшается связывание. Похожее исследование было сделано с FnBPA, где N304 иF306, как было показано, являются важными для связывания Fg. Таким образом, мутации в этих аминокислотных остатках будут влиять на связывание лиганда. Следует понимать, что эти комментарии в равной степени применимы к другим фибриногенсвязывающим белкам, таким как ClfB, SdrG, FnBPA, FnBPB. Таким образом, лечение (вакцина, антитело или фармацевтическая композиция и т.д.) может включать полную фибриногенсвязывающую область или ее фрагмент. В описании термины "содержат, содержит, содержать в себе и включающие" или любой его вариант и термины "включать, включает, включенный и включительно" или любой его вариант считаются полностью взаимозаменяемыми и они все должны иметь как можно более широкую интерпретацию. Изобретение не ограничивается воплощением, описанным выше в данном изобретении, но может варьировать как в конструкции, так и в деталях в пределах формулы изобретения. Настоящее изобретение теперь будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие графические материалы и примеры. На фиг. 1-15 показаны результаты примера 1. На фиг. 1 показана тяжесть артрита (А), измеряемая в виде артритного индекса, и потеря массы (Б) мышей, инокулированных штаммом S. aureus Newman и нулевыми мутантами clfAPYI, clfAPYII и clfA. Инокулировали 3,2106-6,0106 КОЕ штаммов S. aureus. Данные представлены в виде медиан (прямоугольники или средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов(усы). Объединены данные из трех экспериментов. NNewman = 27-30, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10 и NclfA = 16- 12019516 20. На фиг. 2 показан бактериальный рост в почках у мышей на 7-8 сутки после инокуляции 3,21066,0106 КОЕ штамма S. aureus Newman и нулевыми мутантами clfAPYI, clfAPYII и clfA. Данные представлены как КОЕ на пару почек. Если рост не был обнаружен, то количество определяли по наибольшему возможному количеству в соответствии с используемым разведением. Объединены данные из трех экспериментов. NNewman = 26, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10 и NclfA = 15. На фиг. 3 показано выживание мышей после инокуляции 5,2, 5,1 или 3,3107 КОЕ штамма S. aureusNewman, мутанта clfAPYI или нулевого мутанта clfA соответственно. N = 10 в группе в начале эксперимента. На фиг. 4 показано выживание мышей после инокуляции 9,4, 7,9, 10,7 или 9,8106 КОЕ штамма S.aureus LS-1 и нулевых мутантов clfAPYI, clfAPYII или clfA соответственно. N = 15 в группе в начале эксперимента. На фиг. 5 показано выживание мышей, иммунизированных БСА, рекомбинантным ClfA или рекомбинантным ClfAPY (то есть доменом А рекомбинантного белка ClfAPYI) и инокулированных 2,3107 КОЕ S. aureus Newman. N = 15 в группе в начале эксперимента. На фиг. 6 показана частота артритных мышей, инокулированных 3,2106-6,0106 КОЕ штамма S.aureus Newman дикого типа и нулевых мутантов clfAPYI, clfAPYII и clfA. Объединены данные из трех экспериментов. NNewman = 27-30, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10 и NclfA = 16-20. На фиг. 7 показана тяжесть артрита, измеренная в виде артритного индекса у мышей, инокулированных 5,2, 5,1 или 3,3107 КОЕ штамма S. aureus Newman дикого типа, мутанта clfAPYI или нулевого мутанта clfA соответственно. Данные представлены в виде медиан (прямоугольники), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). NNewman = 0-10, NclfAPYI = 9-10 И NclfA = 0-10. На фиг. 8 показана потеря массы у мышей, инокулированных 5,2, 5,1 или 3,3107 КОЕ штамма S.aureus Newman дикого типа, мутанта clfAPYI или нулевого мутанта clfA соответственно. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапозонов (усы). NNewman = 0-10, NclfAPYI = 9-10 И NclfA - 0-10. На фиг. 9 показана тяжесть артрита, измеренная в виде артритного индекса у мышей, иммунизированных БСА, рекомбинантным ClfA или рекомбинантным ClfAPY (то есть доменом А рекомбинантного белка ClfAPYI) и инокулированного 4,0106 КОЕ S. aureus Newman. Данные представлены в виде медиан(прямоугольники), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). NБСА = 14,NclfAPY = 14 и NclfA = 15 в группе в начале эксперимента. На фиг. 10 представлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность домена А белка ClfA дикого типа (rClfA), только доменов N123, с выделенными остатками, которые изменены в следующих примерах (Р 336 и Y338) с получением rClfAPYI/II (SEQ ID NO: 3). Это тот домен А рекомбинантного белка, который использовали при вакцинации в следующих примерах. На фиг. 11 показано иллюстративное представление структуры белков FnBPA, ClfB, ClfA и SdrG. Область А представляет собой фибриногенсвязывающую область, S представляет собой сигнальную последовательность, W представляет собой домен, расположенный в клеточной стенке, М представляет собой мембранный якорь, включающий LPXTG мотив, + представляет положительно заряженные остатки и R представляет собой повторяющуюся область. В ClfA область А содержит N123 (не показано).BCD-область FnBPA (и более короткая CD-область FnBPB - не показано) связывает фибронектин. На фиг. 12 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный ClfAPY40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным ClfA40-559 (rClfA) или рекомбинантным ClfAPY40-559 (rClfAPY), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 2,3107 КОЕ/мышь штамма S. aureusNewman дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). NБСА = 13-15, NrClfA = 15 иNrClfAPY = 15. На фиг. 13 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный ClfA40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантнымClfA40-559 (rClfA) или рекомбинантным ClfAPY40-559 (rClfAPY), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 2,3107 КОЕ/мышь штамма S. aureus Newman дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). N = 13-15, NrClfA = 15 и NrClfAPY = 15. На фиг. 14 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный ClfAPY40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным ClfA40-559 (rClfA) или рекомбинантным ClfAPY40-559 (rClfAPY), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 4,0106 КОЕ/мышь штамма S. aureusNewman дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). NБСА = 14-15, NrClfA = 15 и На фиг. 15 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный ClfA40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантнымClfA40-559 (rClfA) или рекомбинантным ClfAPY40-559 (rClfAPY), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 4,0106 КОЕ/мышь штамма S. aureus Newman дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средних линий), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). NБСА = 14-15, NrClfA = 15 и NrClfAPY = 15. На фиг. 16 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный ClfAPY221-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным ClfA221-559 (rClfA221-559) или рекомбинантным ClfAPY221-559 (rClfAPY221-559), через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). NБСА =15, NrClfA221-559 = 14-15 иNrClfAPY221-559 = 14-15. На фиг. 17 примера 2 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный ClfA221559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным ClfA221-559 (rClfA221-559) или рекомбинантным ClfAPY221-559 (rClfAPY221-559), через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Данные представлены в виде медиан (средние линии),интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапозонов (усы). NБСА =15, NrClfA221-559 = 14-15 и NrClfAPY221-559 = 14-15. На фиг. 18 примера 3 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный ClfA221531 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантным ClfAPY221-531 (rClfAPY221531), через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). NrClfA221-531 = 14-15. Примеры Пример 1. Укорочения области A rClfA, содержащие N1, N2 и N3 (аминокислоты 40-559). Материалы и методы. Полная информация о числовых ссылках в скобках, указанных в примерах, приведена в конце данного раздела. Мыши. Мышей NMRI получали из Scanbur BK (Sollentuna, Швеция) и содержали в виварии Отделения Ревматологии Университета г. Гтеборга, Швеции. Этическая комиссия Гтеборга по вопросам экспериментов над животными одобрила данные эксперименты. Их размещали по 10 животных в каждой клетке с 12-часовым циклом света-темноты и кормили стандартной лабораторной пищей и водой без ограничения. В начале экспериментов возраст животных составлял от 6 до 16 недель. Бактериальные штаммы. Для инфицирования животных использовали штаммы S. aureus дикого типа Newman (14) и LS-1(clfAPYII) конструировали на основе штамма Newman и трансдуцировали в штамм LS-1 (см. ниже). Также использовали делеционные мутанты Newman clfA2Tn917 мутант DU5876 (3) и LS-1 clfA2Tn917 мутант (J.R. Fitzgerald et al., не опубликовано). Бактерии выращивали на чашках с кровяным агаром в течение 48 ч, собирали и хранили замороженными при температуре -20 С в PBS, содержащем 5%(мас./об.) БСА (Sigma Chemicals) и 10% (об./об.) диметилсульфоксида. Перед инъекцией животным бактериальные суспензии оттаивали, промывали в PBS и доводили до соответствующих концентраций клеток. Количество жизнеспособных бактерий измеряли в связи с каждым контрольным заражением посредством культивирования на чашках с кровяным агаром и подсчета колоний. Конструирование мутаций clfAPYI и clfAPYII в S. aureus Newman и LS-1. В этом эксперименте использовали укорочение области А полноразмерного ClfA, содержащее N1,N2 и N3 и соответствующее аминокислотам 40-559. В следующем описании и фигурах:ClfA также может называться как rClfA 40-559 (SEQ ID NO: 3);ClfA P336SY338A также может называться как clfAPYI, rclfAPY или rclfAPYI (т.е. clfAPYI 40-559)ClfA P336AY338S также может называться как clfAPYII, rclfAPYII (т.е. clfAPYII 40-559) (SEQ ID NO: 5); 1,02 т.п.н. PstI-BamHI фрагмент pCF77 PY (Loughman et al., 2005), содержащий мутации P336S иY336A в clfA, клонировали в pBluescriptll SK-(Stratagene). Эту плазмиду линеаризовали с помощью HindIII и лигировали в HindIII-разрезанную pTSermC (J. Higgins, не опубликовано) с получением плазмидыpARM, которая является температурочувствительным шаттл-вектором Е.coli-S. aureus, содержащим замены P336S и Y338A. Для того чтобы уменьшить риск непреднамеренного создания функционального или иммунореактивного эпитопа путем замены Р 336 и Y338, авторы изобретения создали второй мутант, в котором порядок замен был обратным, получив Р 336 А и Y338S. Чтобы получить это, создали плазмиду pJH2, аналогичнуюpARM, но содержащую замены Р 336 А и Y338S. ПЦР с перекрывающимися праймерами использовали с теми же фланкирующими праймерами, используемыми для получения pCF77 PY (6), и другой парой пе- 14019516(мутации выделены жирным шрифтом и подчеркнуты), с получением pCF77 PYII. 1,02 т.п.н. PstIHindIII фрагмент этой плазмиды использовали, как описано выше, с получением pJH2, температурочувствительного шаттл-вектора Е.coli-S. aureus, содержащего замены Р 336 А и Y338S. Обе плазмиды pARM и pJH2 переносили в RN4220 (15) посредством электропорации и затем трансдуцировали с использованием фага 85 (16) в S. aureus Newman (14) и LS-1 (11). В этих штаммах плазмиды индуцировали для встраивания в хромосому и затем вырезали, оставляя мутации в хромосоме части трансформантов, создавая Newman clfAPYI, Newman clfAPYII, LS-1 clfAPYI и LS-1 clfAPYII. Трансформанты скринировали в отношении потери плазмиды и потери фибриногенсвязывающей активности. Целостность гена clfA проверяли с помощью саузерн-гибридизации с использованием пробы clfA (данные не показаны). Экспрессия иммунореактивного белка (ClfAPY) проверяли с помощью вестерниммуноблоттинга с использованием поликлональной кроличьей антисыворотки против области A ClfA(данные не показаны). Мутации проверяли с помощью ПЦР между KpnI-BamHI фрагментами из геномной ДНК и коммерческим секвенированием продуктов. Около 700 оснований гена clfA штамма LS-1,которые были секвенированы, были идентичны соответствующим основаниям в гене Newman clfA штамма Newman. Получение рекомбинантных ClfA и ClfAPY.pCF40, как описано ранее (17), с дополнительной стадией очистки через анионообменную колонку. Плазмиду pCF77 PY (6) использовали в качестве матрицы для клонирования доменов N123 clfAPYI вpQE30 с получением pCF40PY. Используя эту плазмиду, также получали рекомбинантный ClfAPY с помощью аффинной хроматографии на никеле и анионобменной хроматографии, как было описано дляrClfA. Элюаты диализовали против двух смен PBS до концентрирования и лиофилизации. Эксперименты в отношении септического артрита и сепсиса. В экспериментах 1-3 всех мышей (n=10 в группе) инфицировали штаммом Newman для индукции артрита. В экспериментах 4 и 5 мышей инфицировали штаммом Newman и LS-1 соответственно для индукции сепсиса (n=10 в группе). Эксперимент 1. Мыши инфицировали внутривенной инъекцией 3,5106 КОЕ/мышь штамма S. aureus Newman или 4,3106 КОЕ/мышь мутанта Newman clfAPYI, оба в 200 мкл PBS. За клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 7 суток. Мышей умерщвляли на 8-е сутки, оценивали рост бактерий в почках и измеряли уровни IL-6 и общего IgG в сыворотке. Синовит и деструкцию костей исследовали гистологически на суставах передних и задних лап. Эксперимент 2. Мышей инфицировали 5,0106 КОЕ, 6,0106 КОЕ или 4,3106 КОЕ штамма S. aureus Newman, мутанта clfAPYI или Newman clfAErmR (нулевого мутанта clfA) соответственно. За клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 7 суток. Мышей умерщвляли на 7-е сутки, оценивали рост бактерий в почках и измеряли уровни IL-6 и общего IgG в сыворотке. Синовит и деструкцию костей исследовали гистологически на суставах передних и задних лап. Эксперимент 3. Мышей инфицировали 4,7106 КОЕ, 3,2106 КОЕ, 3,9106 КОЕ или 4,8106 КОЕ штамма S. aureus Newman, мутанта clfAPYI, мутанта Newman clfAPYII или нулевого мутанта NewmanclfA соответственно. За клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 7 суток. Мышей умерщвляли на 7-е сутки и оценивали рост бактерий в почках. Результаты экспериментов 1-3 были сходными, поэтому данные объединяли и представляли вместе. В эксперименте 4 мышам инъецировали внутривенно 5,2107 КОЕ, 5,1107 КОЕ или 3,3107 КОЕ штамма S. aureus Newman, мутанта clfAPYI или нулевого мутанта clfA соответственно. За гибелью, изменением массы и клиническим артритом следили вплоть до 10 суток. В эксперименте 5 мышей инфицировали 9,4106 КОЕ, 7,9106 КОЕ, 10,7106 КОЕ или 9,8106 КОЕ штамма S. aureus LS-1, мутанта LS-1 clfAPYI, мутанта LS-1 clfAPYII или нулевого мутанта LS-1 clfA соответственно. За гибелью, клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 16 суток. Внутрисуставная инъекция бактерий. В один коленный сустав на мышь инъецировали 2,4104 КОЕ, 2,4104 КОЕ или 3,4104 КОЕ штамма Newman дикого типа, мутанта clfAPYI или нокаутного мутанта clfA соответственно в 20 мкл PBS. N = 10 в группе. Мышей умерщвляли через 3 суток и коленные суставы собирали для гистопатологического исследования. Вакцинация ClfA дикого типа и мутантным рекомбинантным ClfA. Очищенный rClfA40-559, rClfAPY40-559 (т.е. rClfAPYI) или БСА растворяли в физиологическом растворе и эмульгировали 1:1 в полном адъюванте Фрейнда (Difco Laboratories). 200 мкл эмульсии, содержащей 30 мкг (= 0,53 нмоль) белка, вводили подкожно (п/к) в 0-е сутки. Первую бустерную иммунизацию 30 мкг белка в физиологическом растворе в неполном адъюванте Фрейнда осуществляли на 11-е сутки. Вторую бустерую иммунизацию осуществляли на 21-е сутки. На 30-е сутки у мышей собирали кровь и сыворотку замораживали для последующего анализа антительных ответов. На 31-е сутки 14-15 мышей в группе инфицировали посредством внутривенной инъекции 4,0106 КОЕ/мышь для индукции септического артрита или 2,3107 КОЕ/мышь для индукции сепсиса. За клиническим артритом, изменением массы и гибелью следили в течение 11 и 15 суток соответственно. Рост бактерий в почках оценивали в эксперименте в отношении септического артрита. Клиническая оценка инфицированных мышей. Клиническую оценку осуществляли слепым методом. Каждую конечность тщательно осматривали. Осмотр давал оценку в баллах от 0 до 3 (0 - отсутствие набухания и покраснения; 1 - незначительное набухание и/или покраснение; 2 - умеренное набухание и/или покраснение; 3 - значительное набухание и/или покраснение). Артритный индекс определяли путем сложения баллов по всем четырем конечностям животного. Общее состояние каждой мыши также оценивали путем определения признаков системного воспаления, т.е. уменьшения массы, пониженной активности и взъерошенной шерсти. В случаях тяжелой системной инфекции, когда мышь оценивали как слишком больную, чтобы она смогла пережить еще 24 ч, ее умерщвляли посредством цервикальной дислокации и считали умершей из-за сепсиса. Гистологический анализ. Гистологический анализ суставов осуществляли, используя модификацию (8) ранее описанного метода (18). Бактериологический анализ инфицированных почек. Почки иссекали в асептических условиях, помещали на лед, гомогенизировали, серийно разбавляли в PBS и помещали на чашки с кровяным агаром. Через 24 ч инкубации при 37 С определяли число КОЕ на пару почек. Измерение сывороточного IqG. Уровни общего IgG в сыворотке определяли методом радиальной иммунодиффузии (19). Антимышиный IgG козы и мышиный IgG стандарт были приобретены в Southern Biotech, Birmingham, AL. Специфические антитела - ELISA. Образцы сыворотки от иммунизированных мышей получали через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Специфический антительный ответ из сыворотки против rClfA и rClfAPY измеряли с помощью ELISA. Микропланшеты (96-луночные; Nunc) покрывали 5 мкг/мл рекомбинантного белка в PBS. Блокирующий агент, образцы сыворотки, биотинилированные антитела и ExtrAvidin-пероксидазу разбавляли в PBS. Анализ проводили в соответствии с предыдущим описанием (8). Все образцы сыворотки разбавляли 1:20000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм. Во втором эксперименте, чтобы получить более точный уровень специфических антительных ответов в различных группах иммунизации, ответы определяли при нескольких разведениях сыворотки. Таким образом, все образцы сыворотки разбавляли 1:5000, 1:20000, 1:80000 и 1:320000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм. Анализ IL-6.IL-6 в сыворотке определяли ранее описанным методом (20). Статистический анализ. Статистический анализ осуществляли с использованием критерия Манна-Уитни U. Р 0,05 считали значимым. Данные представлены в виде медиан, интерквартильных размахов и 80% центральных диапазонов, если не указано иное. Результаты. Замена двух аминокислот, необходимых для связывания ClfA с фибриногеном, снижает развитие септического артрита и сепсиса. Две аминокислоты (Р 336 и Y338), которые, как известно, необходимы для связывания ClfA с фибриногеном, изменяли посредством аллельного обмена для создания мутантов штаммов Newman и LS1,которые экспрессировали не-фибриногенсвязывающий белок ClfA на клеточной поверхности. Уровень экспрессии и целостность белка измеряли с помощью вестерн-блоттинга, который выявил, что наблюдалась хорошая экспрессия мутантных белков на бактериальной поверхности и что экспрессируемый белок имел правильный размер. Исследовали способность Newman дикого типа и Newman clfA P336S Y336A (clfAPYI) вызывать септический артрит. Септический артрит индуцировали внутривенной инокуляцией 3,5106-5,0106 колониеобразующих единиц (КОЕ) и 3,2106-6,0106 КОЕ Newman дикого типа и мутанта clfAPYl соответственно. Развитие артрита исследовали в клинических условиях в течение 7 суток. Мутант clfAPYI индуцировал значительно менее тяжелый артрит, чем штамм дикого типа в течение всего экспериментального периода (Р 0,001, фиг. 1 А). Частота артрита была ниже для Newman clfAPYI для большинства временных точек (фиг. 6). Неожиданно оказалось, что новая аминокислотная композиция в молекуле ClfAPYI подходит для взаимодействия с антибактериальной защитой хозяина. Для проверки этой возможности сделали новую конструкцию, где различные аминокислоты были заменены на Р 336 и Y338 (clfA Р 336 А Y338S: clfAPYII). У мышей, которым инокулировали 3,9106 КОЕ Newman clfAPYII, развился артрит в такой же низкой степени, что и после мутанта clfAPYI (фиг. 1 А) и с одинаковой частотой (фиг. 6). Этот результат убедительно указывает на то, что потеря связывания с фибриногеном отвечает за уменьшенный уровень артрита. Возможно, что ClfA вовлечен в развитие артрита с помощью механизмов, которые не включают связывание фибриногена. Для того чтобы проверить это, делеционный мутант ClfA, лишенный белкаClfA, сравнили с мутантами, экспрессирующими модифицированный белок ClfA, не связывающий фибриноген. Однако у мышей, которых инфицировали 4,3106-4,8106 КОЕ нулевого мутанта clfA, развивался артрит, сходный с артритом, индуцированным у мышей, инфицированных мутантами clfAPYI иclfAPYII (фиг. 1 А). Частота артрита также не различалась (фиг. 6). Инфицированные суставы исследовали также гистологически. Синовит у мышей, инфицированныхNewman clfAPYI, был значительно мягче, чем у мышей, инфицированных штаммом дикого типа, как в 1,так и во 2 эксперименте (Р = 0,02 и 0,001 соответственно). Разрушение кости - основная причина последствий у человека с септическим артритом - почти отсутствовала в Newman clfAPYI-инфицированных образцах (эксперимент 2, Р = 0,001). Синовит и деструкция кости, индуцированные нулевым мутантомNewman clfA, также были менее выраженными по сравнению с мышами, инфицированными Newman дикого типа (Р = 0,003 и 0,006 соответственно), но несколько более тяжелыми, чем в группе NewmanclfAPYI, хотя и не очень значительно. Затем анализировали метаболические последствия clfA мутаций для инфекционного процесса. Мыши, инфицированные штаммом Newman дикого типа, теряли вплоть до примерно 30% массы своего тела в течение экспериментального периода. Мыши, которых инфицировали мутантами Newman clfAPYI и Newman clfAPYII, дефектными в отношении связывания с фибриногеном, почти не теряли массу (Р 0,0001 по сравнению с диким типом). Напротив, нулевой мутант Newman clfA оказывал промежуточный эффект на потерю массы, воздействуя значительно меньше, чем штамм дикого типа, но значительно больше, чем мутантные штаммы clfAPYI и clfAPYII (P0,02 в большинстве случаев, фиг. 1 Б). Уровни IL-6 в сыворотке, являющиеся показателем системного воспалительного ответа, анализировали на 7-8-е сутки инфекции. Характер экспрессии IL-6 был сходен с изменениями массы. Newman дикого типа индуцировал высокие уровни сывороточного IL-6 (4,8 (2,8, 5,7) нг/мл), мутант NewmanclfAPYI индуцировал значительно более низкий уровень IL-6 (0,2 (0,07, 2,4) нг/мл, Р 0,0001), тогда как нулевой мутант Newman clfA давал в результате промежуточный ответ (2,5 (1,3, 3,2) нг/мл) со значительным отличием как для группы дикого типа, так и для группы мутанта clfAPYI (P = 0,009 и Р= 0,008 соответственно) (медиана, интерквартильный размах). Рост бактерий в почках был значительно выше у мышей, инфицированных штаммом Newman дикого типа по сравнению и с мутантами Newman clfAPY, и с нулевым мутантом Newman clfA (Р 0,0001, Р= 0,011 и Р = 0,005 соответственно, фиг. 2). Мыши, инфицированные нулевым мутантом Newman clf А,имели значительно больший бактериальный рост в почках, чем мыши, инфицированные NewmanclfAPYI (P = 0,0005, фиг. 2). Общий IgG в сыворотке измеряли у мышей на 7-8-е сутки инфекции. Наблюдали значительно меньшее увеличение уровней IgG как в группе, инфицированной Newman clfAPYI, так и в группе, инфицированной нулевым мутантом Newman clfA, по сравнению с мышами, инфицированными штаммом дикого типа (3,1 (1,2, 4,9); 2,3 (1,0, 2,6) и 6,4 (5,0, 11,0) соответственно (медиана, интерквартильный размах); Р 0,0003). Между двумя мутантными группами не было значительных различий. Смертность составила 17% у мышей, инфицированных Newman дикого типа, 0% в группах мутантов Newman clfAPYI и clfAPII и 30% в группе нулевого мутанта Newman clfA. Существовали значительные различия в смертности между группами дикого типа и clfAPYI и между группами clfAPYI и нулевого мутанта clfA (Р 0,05 и Р 0,01 соответственно). Оказалось, что прямые и косвенные признаки системного воспаления ниже у мышей, инфицированных S. aureus, экспрессирующим ClfA, который является дефектным в отношении связывания фибриногена. Неожиданно, штамм, который полностью лишен экспрессии ClfA, больше индуцировал системное воспаление, чем штамм, экспрессирующий мутант ClfAPY. Сепсис индуцировали у мышей путем увеличения дозы инокуляции S. aureus. Мышей инфицировали 5,2107 КОЕ Newman дикого типа, 5,1107 КОЕ мутанта Newman clfAPYI и 3,3107 КОЕ нулевого мутанта Newman clfA. В течение 5 суток все мыши, инфицированные диким типом, погибли, и только одна мышь из десяти с мутантом clfAPYI погибла через 10 суток после инфицирования (Р 0,0001, фиг. 3). Мыши, инфицированные нулевым мутантом clfA, также прожили значительно меньше времени, чем мыши, инфицированные мутантом clfAPYI (P0,0001, фиг. 3). В этом эксперименте у мышей, зараженных нулевым мутантом clfA, артрит развивался в значительно большей степени, чем в группе мутантаClfAPYI, хотя в то же время они потеряли значительно большую массу (фиг. 7 и 8). Таким образом, по аналогии с показателями системного воспаления в экспериментах в отношении септического артрита выживание мышей продлевается, если молекула ClfA экспрессируется, до тех пор, пока она лишена фибриногенсвязывающих свойств. Инъекция бактерий в суставы. Для того чтобы проверить, зависит ли воспалительная реакция в суставах от связывания с фибриногеном, Newman дикого типа, Newman clfAPYI или нулевой мутант Newman clfA инъецировали непосредственно в коленный сустав мышей, минуя, таким образом, системные отсеки. Синовит, включая полиморфноядерную инфильтрацию суставной полости, и разрушение кости исследовали с помощью гистологии через 3 суток. Мыши получали 2,4104 КОЕ дикого типа, 2,4104 КОЕ нулевого мутанта clfA или 3,4104 КОЕ мутанта clfAPYI в одно колено. Гистологический индекс при синовите и полиморфноядерной инфильтрации в суставной полости составлял 0,25 (0, 3,0) для коленей, инфицированных диким типом, 2,38 (0,25, 3,0) для нулевого мутанта clfA и 0,25 (0, 0,25) для мутанта clfAPYI (медиана, интерквартильный размах). Гистологический индекс для разрушения кости составлял 0 (0, 1,0) для дикого типа, 1,0 (0, 1,0) для нулевого мутанта clfA и 0 (0, 0) для мутанта clfAPYI (медиана, интерквартильный размах; Р = 0,01 между мутантом clfAPYI и нулевым мутантом clfA). Поскольку мутант clfAPYI индуцировал очень незначительный синовит и разрушение кости, несмотря на то что мышам давали на 42% больше этого штамма, чем других штаммов, пришли к выводу, что ClfA-стимулированное связывание с фибриногеном необходимо для максимального воспалительного ответа внутри сустава. Кроме того, отсутствие экспрессии ClfA увеличивало воспаление по сравнению с мутантом ClfA, дефектным в отношении связывания с фибриногеном. Мутация PY в штамме LS-1. Для того чтобы определить, влияет ли способность ClfA связываться с фибриногеном на вирулентность других штаммов S. aureus, clfAPYI, clfAPYII и нулевые мутации clfA подвергали трансдукции в штамм S. aureus LS-1, экспрессирующий TSST-1. Мышей заражали 9,4106 КОЕ LS-1 дикого типа,7,9106 КОЕ LS-1 clfAPYI, 10,7106 КОЕ LS-1 clfAPYII или 9,4106 КОЕ нулевого мутанта LS-1 clfA. Сепсис исследовали по частоте выживания. Через 16 суток только 40% мышей, зараженных штаммом дикого типа, были живы, тогда как 90% мышей, зараженных мутантом clfAPYI и нулевым мутантомclfA, и 80% мышей, инфицированных мутантом clfAPYII, были живы (фиг. 4). Мутанты clfAPYI и нулевой мутант clfA LS-1 были значительно менее вирулентными (Р = 0,014, Р = 0,05 и Р= 0,03 соответственно). Иммунизация рекомбинантными белками ClfA. Эффект вакцинации рекомбинантным белком дикого типа ClfA доменом А (rClfA) и мутантным белком ClfAPYI (rClfAPY) исследовали, как на модели септического артрита, так и на модели сепсиса. Мышей сенсибилизировали и затем дважды иммунизировали контрольным белком БСА, rClfA илиrClfAPY и затем инфицировали 4,0106 КОЕ штамма S. aureus Newman для индукции септического артрита или 2,3107 КОЕ штамма Newman для индукции сепсиса. Иммунизация с помощью rClfAPY (т.е. домен А рекомбинантного белка ClfAPYI) значительно защищала против смерти из-за сепсиса по сравнению с контрольными мышами (Р = 0,01, фиг. 5), тогда как иммунизация rClfA не давала значительной защиты. За сутки до бактериальной инфекции наблюдали значительно более высокий специфический антительный ответ в сыворотке как против rClfAPY, так и против rClfA у мышей, иммунизировнныхrClfA (A405 = 0,13 (0,07, 0,17) и 0,15 (0,10, 0,24), Р 0,0001 в обоих сравнениях (медиана, интерквартильный размах. Контрольные иммунизированные животные имели только фоновые уровни (А 405 нм = 0 и 0,01 (0, 0,01) (медиана, интерквартильный размах. Иммунизированные мыши, которые подлежали инфицированию более низкой дозой бактерий для индукции артрита, имели сходные антительные ответы на rClfA и rClfAPY, как и мыши, у которых индуцировали сепсис (данные не показаны). Иммунизация как rClfA, так и rClfAPY защищала против развития артрита, хотя защита не была значительной (фиг. 9). В течение 5-9 суток после ифицирования потеря массы значительно снижалась у rClfAPY- и rClfAиммунизированных мышей по сравнению с контрольными мышами (данные не показаны). Наблюдали тенденцию к уменьшенному росту бактерий в почках мышей, иммунизированныхrClfAPY или rClfA, на 11-е сутки после инфицирования (БСА: 38 (3, 436); rClfAPY: 7 (2, 17); rClfA: 10 (7,54)107 КОЕ/пара почек). Чтобы получить более точную оценку специфических антительных ответов в различных группах иммунизации, ответы определяли при нескольких разведениях сыворотки (второй эксперимент). Данные показывают, что, весьма вероятно, существуют более высокие титры специфических антител в сыворотках rClfAPY-иммунизированных мышей к антигенам как rClfAPY, так и rClfA дикого типа у мышей, которые подлежали инфицированию как септической, так и артритной бактериальной дозой соответственно, чем в сыворотках мышей, иммунизированных rClfA дикого типа, поскольку антительные ответы,измеренные по поглощению, были значительно выше у мышей, иммунизированных rClfAPY, в каждом разведении сыворотки во всех сравнениях (от Р 0,0001 до Р = 0,008, фиг. 12-15). Иммунизация БСА вызывала только фоновый антительный ответ. Заключение. Результаты убедительно указывают на то, что взаимодействие ClfA - фибриноген является критичным для бактериальной вирулентности и исхода заболевания. Способность ClfA связываться с фибрино- 18019516 геном ассоциирована с увеличенной вирулентностью с точки зрения способности вызывать смерть от сепсиса. В обоих протестированных стафилококковых штаммах мутант clfAPY индуцировал реже смерть от сепсиса, чем дикий тип. Тяжесть артрита также значительно уменьшалась у мышей, инфицированных мутантом clfAPY, не связывающим фибриноген. Вероятным механизмом для стимуляции вирулентности за счет взаимодействия фибриногена и бактериальной клеточной поверхности является ингибирование нейтрофильного фагоцитоза (5). Нейтрофилы являются ключевыми для иммунной защиты хозяина на ранней стадии инфекции S. aureus (13). Без нейтрофилов бактериальный рост сильно увеличивается в крови и почках и частота артрита и смертности возрастает. Фибриноген-опосредованное ингибирование нейтрофильного фагоцитоза ClfA можно объяснить, по меньшей мере, частично более выраженной вирулентностью S. aureus дикого типа по сравнению с мутантами clfAPY. Связывание фибриногена с ClfA может уменьшить опсонофагоцитоз нейтрофилами за счет уменьшения отложения опсонинов или доступа к опсонинам нейтрофильных рецепторов. Альтернативно, связанный фибриноген может блокировать взаимодействие неизвестного защитного фактора хозяина с S. aureus. Другое мнение заключается в том, что взаимодействие фибриноген -ClfA стимулирует переход бактерий из кровеносного сосуда в ткань или стимулирует колонизацию тканей. Неожиданно, данные авторов изобретения также демонстрируют, что нулевой мутант ClfA был более вирулентным, чем мутантные штаммы clfAPY. Возможно, белок ClfA имеет другие функции in vivo,чем взаимодействие с фибриногеном. Это взаимодействие явно не выгодно для хозяина, как показано в данном исследовании. Другие функции ClfA в настоящее время не отображены так хорошо, но не зависимая от фибриногена агрегация тромбоцитов, вызванная ClfA, может привести к захвату большого количества S. aureus в кровотоке с последующей элиминацией комплексов бактерий с тромбоцитами через ретикулоэндотелиальную систему. Такая опосредованная агрегацией тромбоцитов элиминация стафилококков часто встречаются в случае штаммов дикого типа и мутанта clfAPY, но не в случае нокаутного штамма clfA. Если в штамме дикого типа взаимодействие с фибриногеном будет превалировать над другими событиями, то такая элиминация бактерий в случае мутантов clfAPY может быть очень полезна для хозяина. Нокаутный мутант clfA защищал против септической смерти в такой же степени, что и clfAPY мутация в штамме S. aureus LS-1, но защищала меньше, если вообще защищала, в случае штамма Newman. Общее влияние экспрессии ClfA на бактериальную вирулентность может различаться между разными штаммами S. aureus в зависимости от уровня экспрессии и присутствия других вирулентных факторов. Вопрос о том, демонстрирует ли мутант clfAPY равную или меньшую вирулентность, находясь в суставной полости, имеет определенное значение, подразумевающее, что при воспалении в синовиальной жидкости фибриноген и фибрин находятся в избыточном количестве. Данные авторов изобретения позволяют предположить, что мутант clfAPY является менее разрушительным для хряща и кости. Защитный эффект мутанта с рекомбинантным доменом A P336Y338 ClfA, не связывающим фибриноген больше, чем для rClfA дикого типа. Иммунизация с помощью ClfAPY, весьма вероятно, индуцировала лучший иммунный ответ, поскольку более высокие специфические антительные ответы индуцировались против как иммуногена, так и белка ClfA дикого типа. Более важно, что она индуцировала больший защитный иммунный ответ против септической смерти, чем ClfA дикого типа. В заключение, результаты авторов изобретения показывают, что rClfAPY является лучшим кандидатом на роль вакцины, чем рекомбинантный ClfA дикого типа. Авторы изобретения предполагают, что связывание фибриногена с белком ClfA дикого типа во время фазы иммунизации уменьшает презентацию антигена из-за сокрытия важных эпитопов на молекуле ClfA и поэтому ухудшает продукцию специфических антител. Пример 2. Укорочение области A rClfA, содержащее N2 и N3 (rClf A 221-559). Материалы и методы. В этом примере использовали протоколы, изложенные в примере 1:rClfAPY221-559 и БСА. В начале экспериментов было 15 мышей-самок NMRI в группе в возрасте 8 недель. В этом примере конструкции, используемые для иммунизации, представляли собой ClfA дикого типа/нативное укорочение N2N3, ClfA N2N3 укорочение с мутацией PY, как описано в примере 1. БСА использовали в качестве контроля. Вакцинация ClfA дикого типа и мутантным рекомбинатным ClfA. Мышей иммунизировали с помощью rClfA 221-559, rClfAPY 221-559 или БСА в соответствии с протоколом в примере 1. Очищенные rCifA221-559, rClfAPY221-559 (т.е. субдомены N2 и N3 рекомбинантного белка AClfAPYI) или БСА растворяли в PBS и эмульгировали 1:1 в полном адъюванте Фрейнда. 200 мкл эмульсии, содержащей 30 мкг (= 0,79 нмоль) белка, инъецировали п/к в 0-е сутки. Первую бустерную иммунизацию 30 мкг белка в физиологическом растворе в неполном адъюванте Фрейнда осуществляли на 12-е сутки. Вторую бустерную иммунизацию осуществляли на 22-е сутки. На 31-е сутки у мышей брали кровь и сыворотку замораживали для последующего анализа антительных ответов. Специфические антитела - ELISA. Образцы сыворотки от иммунизированных мышей получали через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Специфический антительный ответ в сыворотке против rClfA221-559 и rClfAPY221-559 измеряли с помощью ELISA. Микропланшеты (96-луночные; Nunc) покрывали 5 мкг/мл рекомбинантного белка в PBS. Блокирующий агент, образцы сыворотки, биотинилированные антитела и ExtrAvidinпероксидазу разбавляли в PBS. Анализ проводили в соответствии с предыдущим описанием (8). Все образцы сыворотки разбавляли 1:5000, 1:20000, 1:80000 и 1:320000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм. Результаты. Специфический антительный ответ. Антительный ответ измеряли по поглощению в ELISA-анализе, как в примере 1, с четырьмя разными разведениями сыворотки. Полученные данные были очень похожи на данные в примере 1. Обнаружили, что иммунизация с помощью rClfAPY221-559, весьма вероятно, приводит к более высоким титрам специфических антител к обоим нативным rClfA221-559 и rClfAPY221-559 по сравнению с иммунизацией нативным rClfA221-599, поскольку наблюдались значительно более высокие антительные ответы, измеренные по поглощению, у мышей, иммунизированных rClfAPY221-559, при каждом разведении сыворотки, во всех сравнениях, кроме одного (Р = 0,001 - 0,025, см. фиг. 16 и 17). Иммунизация БСА индуцирует только фоновые уровни антительного ответа. Заключение. Авторы изобретения обнаружили, что иммунизация белком rClfAPY221-559 приводит к значительно более высоким антительным ответам как к иммуногену, так и к белку ClfA дикого типа, чем иммунизация природным белком. На основании этих данных авторы изобретения заключили, что PY-иммунизация, независимо от того, содержит ли PY белок аминокислоты 40-550, как в примере 1, или аминокислоты 221-559, как в примере 2, индуцирует лучший иммунный ответ, чем иммунизация нативным ClfA соответствующего размера. Пример 3. Укорочение области A ClfA (/дельта укорочение без фиксирующего пептида). Материалы и методы. В данном примере использовали протоколы, изложенные в примере 1, в которых используют следующую конструкцию: rClfA 221-531 (т.е. укорочение области A rClfA, содержащее аминокислоты 220559 N2 и N3, но без аминокислот 532-538 фиксирующего пептида и последующих пролин-богатых остатков). В начале эксперимента было 15 самок мышей NMRI в группе в возрасте 8 недель. В этом примере для иммунизации использовали указанную выше конструкцию. Мышей иммунизировали указанным выше укорочением в соответствии с протоколом из примера 1. Вакцинация ClfA дикого типа и мутантным рекомбинантным ClfA. Очищенный rClfA221-531 растворяли в PBS и эмульгировали 1:1 в полном адъюванте Фрейнда. 200 мкл эмульсии, содержащей 0,79 нмоль белка, было инъецировано п/к на сутки 0. Первую бустерную иммунизацию с помощью 0,79 нмоль белка в физиологическом растворе в неполном адъюванте Фрейнда осуществляли на 12-е сутки. Вторую бустерную иммунизацию осуществляли на 22-е сутки. На 31-е сутки у мышей брали кровь и сыворотку замораживали для последующего анализа антительных ответов. Специфические антитела - ELISA. Образцы сыворотки от иммунизированных мышей получали через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Уровни специфических антител в сыворотке измеряли с помощью ELISA. Микропланшеты (96-луночные; Nunc) покрывали белком rClfA221-531 в концентрации 4,6 мкг/мл, эквимолярной 5 мкл/мл rClfA221-559 и rClfAPY221-559, из примеров 1 и 2. Блокирующий агент, образцы сыворотки,биотинилированные антитела и ExtrAvidin-пероксидазу разбавляли в PBS. Анализ проводили в соответствии с предыдущим описанием (8). Все образцы сыворотки разбавляли 1:5000. 1:20000, 1:80000 и 1:320000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм. Результаты. Антительный ответ измеряли по поглощению в ELISA-анализе, как в примере 1. Обнаружили, что иммунизация с помощью rClfA221-531 дает иммунный ответ, измеренный как специфический антительный ответ (фиг. 18). Заключение. Авторы изобретения обнаружили, что rClfA221-531 работает как иммуноген, поскольку данный антиген индуцирует специфический антительный ответ. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA), содержащий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 или последовательность с 85%, предпочтительно 95% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 1, или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере,аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А) по меньшей мере с одной заменой, вставкой, делецией или добавлением аминокислотного остатка в аминокислотных остаткахAla254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 и/или Val527 с получением рекомбинантного фибриногенсвязывающего белка с уменьшенной способностью или отсутствием способности нековалентно связываться с фибриногеном, который стимулирует больший иммунный ответ, чем белок ClfA дикого типа, для использования в лечении или профилактике микробных инфекций, предпочтительно вызванных стафилококками. 2. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по п.1, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 10 и 13 или последовательности с 85%, предпочтительно 95% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 3, 6, 9,10 или 13. 3. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по п.1 или 2, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотных остатках Ala254, Tyr256,Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 и/или Val527. 4. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по любому из пп.1-3, где нековалентное связывание, которое имеет место при "стыковке, захвате и фиксации" (dock,lock and latching) фактора агглютинации A (ClfA) с фибриногеном, уменьшено или предотвращено. 5. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по любому из пп.1-4, где замена аминокислотного остатка уменьшает нековалентное взаимодействие с фибриногеном посредством предотвращения или уменьшения связывания лиганда с гидрофобным карманом, разделяющим субобласти N2 и N3 области А фибриногенсвязывающего белка. 6. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по любому из пп.1-5, содержащий фибриногенсвязывающую область без аминокислотных остатков фиксирующего пептида. 7. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по любому из пп.1-6, где аминокислотные остатки Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 и/илиVal527 заменены либо на Ala, либо на Ser. 8. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по любому из пп.1-7, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1 и 3-14 или последовательности с 85%, предпочтительно 95% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 1 и 314, где остаток Р 336 и/или Y338 в SEQ ID NO: 1, 3, 6, 9, 10 и 13 заменен(ы) на серин и/или аланин. 9. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по п.7 или 8, имеющий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1 или 3, где остаток Р 336 и/или Y338 заменен(ы) на серин и/или аланин с получением rClfAP336S Y338A или rClfAP336 A Y338S,или ее фрагмент. 10. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по любому из пп.1-9, содержащий фибриногенсвязывающий белок, фибриногенсвязывающую область, минимальную фибриногенсвязывающую область и/или ее фрагмент. 11. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент по любому из пп.1-10, содержащий субобласти N123, охватывающие аминокислотные остатки 40-559 фибриногенсвязывающей области (область А); и/или субобласти N23, охватывающие аминокислотные остатки 221-559 фибриногенсвязывающей области ClfA (область А). 12. Применение рекомбинантного стафилококкового фактора агглютинации A (ClfA) или его фрагмента, содержащего, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11 в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики микробной инфекции, предпочтительно вызванной стафилококками. 13. Конструкция нуклеиновой кислоты, экспрессирующая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11. 14. Экспрессирующий вектор, экспрессирующий рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11. 15. Клетка-хозяин, экспрессирующая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A(ClfA) или его фрагмент, содержащий по меньшей мере аминокислотные остатки 221-531 фибриноген- 22019516 связывающей области (область А), по любому из пп.1-11. 16. Вакцина, содержащая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11. 17. Иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации A (ClfA) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый адъювант.