Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение

В данном изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела, которые специфично связываются с CXCR4 с высоким сродством, конкретно человеческие моноклональные антитела. Также предлагаются молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела в соответствии с данным изобретением, векторы экспрессии, клетки-хозяева и способы экспрессии антител в соответствии с данным изобретением. Также предлагаются иммуноконъюгаты, молекулы с двойной специфичностью и фармацевтические композиции, содержащие антитела в соответствии с данным изобретением. В данном изобретении также предлагаются способы обнаружения CXCR4,а также способы лечения различных видов рака, воспалительных расстройств и ВИЧ-инфекции с применением анти-CXCR4 антитела в соответствии с данным изобретением. Предпосылки создания изобретения Хемокины - это семейство приблизительно из 50 белков небольшого размера, которые модулируют направленную миграцию клеток и ангиогенез, а также играют существенную роль в микроокружении опухоли (Vicari, A.P. and Caux, С. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13:143-154). В зависимости от их структуры хемокины классифицированы как хемокины С-С (содержащие мотив цистеин-цистеин) или хемокины С-Х-С (содержащие мотив цистеин-Х-цистеин). Таким образом, рецепторы, которые связываются с такими хемокинами, классифицированы как члены семейства CCR или семейства CXCR соответственно. Один из членов семейства CXCR - это CXCR4, рецептор, связанный с семью трансмембранными G-протеинами, который в основном экспрессируется на лимфоцитах и который активизирует хемотаксис. CXCR4 связывается с хемокином CXCL12 (SDF-1).CXCR4 играет роль в эмбриогенезе, гомеостазе и воспалении. Исследования на мышах с искусственно вызванным дефицитом CXCR4 или SDF-1 показывают вовлечение пути CXCR4/SDF-1 в васкуляризацию органов, а также в иммунные и гемопоэтические системы (Tachibana, K. et al. (1998) Nature 393:591-594). Кроме того, показано, что CXCR4 функционирует как корецептор для Т-лимфотропных штаммов ВИЧ-1 (Feng, Y. et al. (1996) Science 272:872-877). Также показано, что CXCR4 экспрессируется на широком спектре видов раковых клеток. Дополнительно показано, что путь CXCR4/SDF-1 вовлечен в стимуляцию метастатического процесса во многих видах новообразований (Murphy, P.M. (2001) N. Engl.J. Med. 345:833-835). Например, показано, что CXCR4 и SDF-1 опосредуют специфический для органа метастаз, создавая хемотаксический градиент между участком первичной опухоли и участком метастазаet al. (2003) Cancer Res. 63:3005-3008). Сущность изобретения В данном изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела, в частности человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим CXCR4 и которые демонстрируют многочисленные желательные свойства. Такие свойства включают способность связываться с природным человеческим CXCR4, экспрессированным на поверхности клетки, способность ингибировать связывание SDF-1 с человеческим CXCR4, способность ингибировать индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4, способность ингибировать индуцированную SDF-1 миграцию клеток, экспрессирующих CXCR4, способность ингибировать образование капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HuVEC), способность индуцировать апоптоз в клетках,экспрессирующих CXCR4, способность ингибировать пролиферацию опухолевых клеток in vitro, способность ингибировать пролиферацию опухолевых клеток in vivo, способность ингибировать метастазыCXCR4+ опухолевых клеток и/или способность увеличивать продолжительность жизни субъекта сCXCR4+ опухолью. В одном аспекте данное изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, где антитело связывается с природным человеческим CXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки. В одном варианте антитело также ингибирует связывание SDF-1 с человеческим CXCR4, предпочтительно с EC50 для ингибирования 50 нМ или меньше, или 30 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше, или 10 нМ или меньше, или 5 нМ или меньше, или 3 нМ или меньше (например, ЕС 50 для ингибирования 28,60 нМ или меньше, или 12,51 нМ или меньше,или 2,256 нМ или меньше). В другом варианте антитело связывается с природным человеческим CXCR4,экспрессирующимся на поверхности клетки, но не ингибирует связывания SDF-1 с человеческимCXCR4. В других вариантах антитело также ингибирует индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий CXCR4, предпочтительно с ЕС 50 для ингибирования 3 нМ или меньше, или 2 нМ или меньше, или 1 нМ или меньше, или 0,9 нМ или меньше, или 0,8 нМ или меньше,или 0,7 нМ или меньше, или 0,6 нМ или меньше, или 0,5 нМ или меньше, или 0,4 нМ или меньше (например, 0,9046 нМ или меньше, 0,5684 или меньше, или 0,3219 нМ или меньше). В других вариантах антитело также ингибирует индуцированную SDF-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческийCXCR4, предпочтительно с ЕС 50 для ингибирования 50 нМ или меньше, или 30 нМ или меньше, или 20 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше (например, 18,99 нМ или меньше, или 12,44 или меньше). В других вариантах антитело также ингибирует образование HuVEC капиллярных трубочек, индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих CXCR4, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток in vitro, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток или индуцирует апоптоз опухолевых клеток in vivo, ингибирует метастаз CXCR4+ опухолевых клеток и/или увеличивает продолжительность жизни субъекта с CXCR4+ опухолью. Предпочтительно антитело связывается с человеческим CXCR4 с высоким сродством, например сKD 110-7 М или меньше или с KD 510-8 М или меньше. Предпочтительно антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой антитела полной длины (т.е. содержащие вариабельный и константный участки). Кроме того, антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно обладают конфигурацией против человеческого CXCR-4 полной длины, экспрессированного в его природной конформации на клетке-хозяине или в искусственной мембране. В предпочтительном аспекте данное изобретение относится к выделенному человеческому моно-1 018836 клональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, где антитело:(a) связывается с природным человеческим CXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки;(e) ингибирует образование капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека. Даже более предпочтительно антитело также индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих человеческий CXCR4, и/или ингибирует рост CXCR4+ опухолевых клеток и/или индуцирует апоптоз опухолевых клеток in vivo. В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, где антитело перекрестно конкурирует за связывание с CXCR4 с антителом сравнения, где антитело сравнения включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 25, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29; или(b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 30; или(c) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 31; или(d) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого VH 3-48, где антитело специфично связывается с человеческим CXCR4. В других вариантах данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого VK L15, где антитело специфично связывается с человеческим CXCR4. В других вариантах данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческогоVH 3-48, и вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого VK L15, где антитело специфично связывается с человеческим CXCR4. В другом аспекте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который включает последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и вариабельный участок легкой цепи, который включает последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где(a) последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 9-12 и их консервативных модификаций;(b) последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 21-24 и их консервативных модификаций; и(c) антитело связывается с природным человеческим CXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки. В предпочтительных вариантах данное антитело также обладает одной или больше из следующих характеристик: ингибирует связывание SDF-1 с CXCR4, ингибирует индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4, ингибирует индуцированную SDF-1 миграцию клеток, экспрессирующих CXCR-4; ингибирует образование HuVEC капиллярных трубочек; индуцирует апоптоз в клетках, экспрессирующих CXCR4 (in vitro и/или in vivo), ингибирует рост CXCR4+ опухолевых клетокin vitro и/или in vivo и/или ингибирует метастазы CXCR4+ опухолевых клеток. Предпочтительно последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислотSEQ ID NO: 5-8 и их консервативных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 17-20 и их консервативных модификаций. Предпочтительно последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR1 включает последовательность аминокислот,выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 1-4 и их консерва-2 018836 тивных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 1;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 5;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 9;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 13;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 17; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 21. Другая предпочтительная комбинация включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 2;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 6;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 10;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 14;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 18; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 22. Другая предпочтительная комбинация включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 3;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 7;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 11;(d) вариабельный участок легкой цени CDR1, содержащий SEQ ID NO: 15;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 19; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 23. Другая предпочтительная комбинация включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 4;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 8;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 12;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 16;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 20; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 24. Другие предпочтительные антитела в соответствии с данным изобретением или их части, связывающиеся с антигеном, включают: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25-28 и 41-44; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-32 и 45-48; где антитело специфично связывается с CXCR4. Предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 25 или 41; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 29 или 45. Другая предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 26 или 42; и (b) вариабельный участок легкой цепи,содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 30 или 46. Другая предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 27 или 43; и (b) вариабельный участок легкой цепи,содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 31 или 47. Другая предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28 или 44; и (b) вариабельный участок легкой цепи,содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 32 или 48. В другом аспекте данного изобретения предлагаются антитела или их части, связывающиеся с антигеном, которые конкурируют за связывание с CXCR4 с любым из вышеупомянутых антител. Антитела в соответствии с данным изобретением могут представлять собой, например, антитела полной длины, например изотипа IgG1 или IgG4. Альтернативно, антитела могут представлять собой фрагменты антитела, например фрагменты Fab, Fab' или Fab'2, или одноцепочечные антитела. В данном изобретении также предлагается иммуноконъюгат, содержащий антитело в соответствии с данным изобретением, или его часть, связывающуюся с антигеном, присоединенное к терапевтическому агенту, например цитотоксину или радиоактивному изотопу. В данном изобретении также предлагается молекула с двойной специфичностью, содержащая антитело или его часть, которая связывается с антигеном, в соответствии с данным изобретением, присоединенное к второму функциональному фрагменту, обладающему другой специфичностью связывания, чем указанное антитело или его часть, которая связывается с антигеном. Также предлагаются композиции, содержащие антитело, или его часть, которая связывается с антигеном, или иммуноконъюгат, или молекулу с двойной специфичностью в соответствии с данным изобре-3 018836 тением и фармацевтически приемлемый носитель. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или их части, связывающиеся с антигеном, в соответствии с данным изобретением, также включены в данное изобретение, а также векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы экспрессии. Способы получения анти-CXCR4 антител с использованием клеток-хозяев, содержащих такие векторы экспрессии, также предлагаются и могут включать стадии (i) экспрессии антитела в клетке-хозяине и (ii) выделения антитела из клетки-хозяина. Другой аспект данного изобретения относится к способам модулирования активности CXCR4 в клетке, где клетки контактируют с антителом или его частью, которая связывается с антигеном, в соответствии с данным изобретением. Контакт клеток может обеспечиваться in vitro путем культивирования клеток с антителом, или контакт клеток может обеспечиваться in vivo путем введения антитела субъекту. В предпочтительном варианте клетки представляют собой опухолевые клетки, экспрессирующиеCXCR4, и способ приводит к ингибированию роста опухолевых клеток и/или ингибированию метастаза опухолевых клеток. В другом варианте клетки представляют собой Т-клетки, экспрессирующие CXCR4,и способ приводит к ингибированию входа ВИЧ в клетки. В другом варианте клетки представляют собой лимфоциты при воспалительном расстройстве, и способы приводят к ингибированию воспаления. В другом варианте клетки принимают участие в васкуляризации, и способ приводит к модуляции ангиогенеза. В другом аспекте данное изобретение относится к способу стимуляции мобилизации стволовых клеток CD34+ из костного мозга в периферическую кровь субъекта, где способ включает введение субъекту антитела или его части, связывающейся с антигеном, в соответствии с данным изобретением, таким образом, что стимулируется мобилизация стволовых клеток CD34+ из костного мозга в периферическую кровь. Способ может дополнительно включать сбор стволовых клеток CD34+ из периферической крови,например, для использования с целью аутологичной трансплантации стволовых клеток. Другие особенности и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего детального описания и примеров, которые не должны интерпретироваться как ограничивающие. Содержимое всех ссылок, инвентарные номера Genbank, содержание патентов и опубликованных патентных заявок,процитированных в данной заявке, явно включено в данное описание путем ссылки. Краткое описание фигур На фиг. 1 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 33) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 25) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела F7. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 5) и CDR3 (SEQ ID NO: 9) обведены, и указано происхождение V, D и J зародышевой линии. На фиг. 1 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 37) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 29) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антителаF7. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) и CDR3 (SEQ ID NO: 21) обведены, и указано происхождение V и J зародышевой линии. На фиг. 2 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 34) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 26) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела F9. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 6) и CDR3 (SEQ ID NO: 10) обведены, и указано происхождение V, D и J зародышевой линии. На фиг. 2 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 38) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 30) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антителаF9. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) и CDR3 (SEQ ID NO: 22) обведены, и указано происхождение V и J зародышевой линии. На фиг. 3 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 35) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 27) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела D1. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) и CDR3 (SEQ ID NO: 11) обведены, и указано происхождение V, D и J зародышевой линии. На фиг. 3 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 39) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 31) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антителаD1. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 19) и CDR3 (SEQ ID NO: 23) обведены, и указано происхождение V и J зародышевой линии. На фиг. 4 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 36) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 28) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела Е 2. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 8) и CDR3 (SEQ ID NO: 12) обведены, и указано происхождение V, D и J зародышевой линии. На фиг. 4 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 40) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 32) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела Е 2. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 20) и CDR3 (SEQ ID NO: 24) обведены, и указано происхождение V и J зародышевой линии. На фиг. 5 А показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи F7 (SEQ ID NO: 25) и F7GL (SEQ ID NO: 41) с человеческой последовательностью амино-4 018836 кислот VH 3-48 зародышевой линии (SEQ ID NO: 49) (зародышевая линия JH6b раскрыта как SEQ ID NO: 52). На фиг. 5 В показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи F7 (SEQ ID NO: 29) и F7GL (SEQ ID NO: 45) с человеческой последовательностью аминокислотVK L15 зародышевой линии (SEQ ID NO: 50) (зародышевая линия JK1 раскрыта как SEQ ID NO: 53). На фиг. 6 А показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи F9 (SEQ ID NO: 26) и F9GL (SEQ ID NO: 42) с человеческой последовательностью аминокислот VH 3-48 зародышевой линии (SEQ ID NO: 49) (зародышевая линия JH6b раскрыта как SEQ ID NO: 52). На фиг. 6 В показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи F9 (SEQ ID NO: 30) и F9GL (SEQ ID NO: 46) с человеческой последовательностью аминокислотVK L15 зародышевой линии (SEQ ID NO: 50) (зародышевая линия JK1 раскрыта как SEQ ID NO: 53). На фиг. 7 А показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи D1 (SEQ ID NO: 27) и D1GL (SEQ ID NO: 43) с человеческой последовательностью аминокислот VH 3-48 зародышевой линии (SEQ ID NO: 49) (зародышевая линия JH6b раскрыта как SEQ ID NO: 52). На фиг. 7 В показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи D1 (SEQ ID NO: 31) и D1GL (SEQ ID NO: 47) с человеческой последовательностью аминокислот VK L15 зародышевой линии (SEQ ID NO: 50) (зародышевая линия JK1 раскрыта как SEQ ID NO: 53). На фиг. 8 А показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи Е 2 (SEQ ID NO: 28) и E2GL (SEQ ID NO: 44) с человеческой последовательностью аминокислот VH 3-48 зародышевой линии (SEQ ID NO: 49) (зародышевая линия JH6b раскрыта как SEQ ID NO: 52). На фиг. 8 В показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи Е 2 (SEQ ID NO: 32) и E2GL (SEQ ID NO: 48) с человеческой последовательностью аминокислот VK L15 зародышевой линии (SEQ ID NO: 50) (зародышевая линия JK1 раскрыта как SEQ ID NO: 53). На фиг. 9 представлен график, показывающий связывание человеческих анти-CXCR4 антител F7,F9, D1 и Е 2 с клетками СЕМ, которые экспрессируют природный человеческий CXCR4 на поверхности клетки. На фиг. 10 представлен график, показывающий конкуренцию за связывание с клетками СЕМ междуFITC-меченным анти-CXCR4 антителом F9 и панелью не меченных человеческих анти-CXCR4 антител. На фиг. 11 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-CXCR4 антителами F7, F9 и D1 связывания меченного 125ISDF-1 с клетками СЕМ. На фиг. 12 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-CXCR4 антителами F7, F9 и D1 индуцированного SDF-1 притока кальция в клетки СЕМ. На фиг. 13 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-CXCR4 антителами F7 и F9 индуцированной SDF-1 миграции клеток СЕМ. На фиг. 14 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-CXCR4 антителами F7, F9 и Е 2 пролиферации опухолевых клеток Ramos in vitro. На фиг. 15 А-С представлены графики, показывающие ингибирование человеческими анти-CXCR4 антителами F7 и F9 пролиферации опухолевых клеток Ramos in vivo на модели подкожной опухоли. На фиг. 15 А показана кривая роста среднего объема опухоли. На фиг. 15 В показана кривая роста медианного объема опухоли. На фиг. 15 С показан медианный % изменения массы тела. На фиг. 16 показан график % выживания мышей, леченных человеческим анти-CXCR4 антителомF9 на модели системного введения опухолевых клеток Ramos. Подробное описание данного изобретения Данное изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, особенно человеческим моноклональным антителам, которые специфично связываются с природным человеческим CXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки. В некоторых вариантах антитела в соответствии с данным изобретением происходят от конкретных последовательностей тяжелой и легкой цепей зародышевой линии и/или включают конкретные структурные признаки, например участки CDR, содержащие конкретные последовательности аминокислот. В данном изобретении предлагаются выделенные антитела, способы создания таких антител, иммуноконъюгаты и молекулы с двойной специфичностью, содержащие такие антитела, и фармацевтические композиции, содержащие антитела, иммуноконъюгаты или молекулы с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением. Данное изобретение также относится к способам применения антител, например, для обнаружения CXCR4, а также модулирования активностиCXCR4 при заболеваниях или расстройствах, связанных с экспрессией CXCR4 или вовлечением путиCXCR4/SDF-1, например раковые заболевания, метастаз опухоли, ВИЧ-инфекция, воспаление и ангиогенез. Соответственно, в данном изобретении также предлагаются способы применения анти-CXCR4 антител в соответствии с данным изобретением для лечения ракового заболевания, например для лечения такого ракового заболевания, как рак молочной железы, яичника, предстательной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, щитовидной железы, меланома, рак назофарингеальной области, почечно-клеточный рак, лимфома, нейробластома, глиобластома, рабдомиосаркома, рак ободочной и прямой кишки, рак почек, остеосаркома, острая лимфобластная лейкемия или острая миелоидная лейкемия. Кроме того, в данном изобретении предлагаются способы применения анти-CXCR4 антител в соответствии с данным изобретением для ингибирования метастаза опухоли. Для лучшего понимания настоящего изобретения сначала даются определения некоторых терминов. Дополнительные определения приведены в подробном описании. Термин "CXCR4" включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфичные в отношении CXCR4, могут в определенных случаях перекрестно реагировать сCXCR4 других видов, кроме человека. В других вариантах антитела, специфичные в отношении человеческого CXCR4, могут быть полностью специфичными для человеческого CXCR4 и могут не демонстрировать перекрестной реактивности с другими родами или видами. Термин "человеческий CXCR4" обозначает человеческую последовательность CXCR4, например полная последовательность аминокислот человеческого CXCR4 с инвентарным номером Genbank P61073 (SEQ Ш NO: 51). CXCR4 также известен в данной области как, например, LESTR, Fusin или CD184. Человеческая последовательность CXCR4 может отличаться от человеческого CXCR4 с последовательностью SEQ ID NO: 51 и содержать, например, консервативные мутации или мутации в неконсервативных участках, и CXCR4 обладает в существенной мере такой же биологической функцией, как человеческий CXCR4 с последовательностью SEQID NO: 51. Например, биологическая функция человеческого CXCR4 состоит в наличии эпитопа во внеклеточном домене CXCR4, который специфично связывается с антителом в соответствии с данным изобретением, или биологическая функция человеческого CXCR4 представляет собой связывание с хемокином или вовлечение в метастатический процесс. Конкретная последовательность человеческого CXCR4 в общем как минимум на 90% идентична последовательности аминокислот человеческого CXCR4 с последовательностью SEQ ID NO: 51 и содержит остатки аминокислот, которые идентифицируют последовательность аминокислот как человеческую при сравнении с последовательностями аминокислот CXCR4 других видов (например, мыши). В некоторых случаях последовательность аминокислот человеческого CXCR4 может быть как минимум на 95% или даже как минимум на 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности аминокислот CXCR4 с последовательностью SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах последовательность человеческого CXCR4 демонстрирует не более 10 отличий аминокислот от CXCR4 с последовательностью SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах человеческий CXCR4 может демонстрировать не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 отличия аминокислот от CXCR4 с последовательностью SEQ ID NO: 51. Процент идентичности может быть определен, как описано в данном описании. Термин "SDF-1" обозначает фактор 1 из стромальных клеток, который является лигандом дляCXCR4. Термин "SDF-1" включает различные изоформы SDF-1, например SDF-1 и SDF-1. Инвентарный номер Genbank последовательности аминокислот человеческого SDF-1 NP954637. Инвентарный номер Genbank последовательности аминокислот человеческого SDF-1 NP000600. Человеческий SDF1 также описан в патенте США 5756084. SDF-1 также известен как CXCL12. Последовательность аминокислот человеческого SDF-1 может отличаться от SDF-1 NP954637 или NP000600, как описано в данном описании для CXCR4. Термин "иммунная реакция" обозначает действие, например, лимфоцитов, антигенпредставляющих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцированных вышеупомянутыми клетками или печенью (в том числе антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к избирательному повреждению, уничтожению или элиминации из человеческого организма вторгшихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток, или, в случаях аутоиммунных явлений или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей."Путь преобразования сигнала" обозначает биохимические взаимоотношения между различными молекулами преобразования сигнала, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. В данном описании фраза "рецептор на поверхности клетки" включает, например,молекулы и комплексы молекул, способные к получению сигнала и передаче такого сигнала через плазматическую мембрану клетки. Пример "рецептора на поверхности клетки" в соответствии с данным изобретением представляет собой рецептор CXCR4. Термин "антитело" в данном описании включает антитела целиком и их антигенсвязывающие (связывающиеся с антигеном) фрагменты (т.е. "антигенсвязывающая часть") или их одинарные цепи. "Антитело" обозначает гликопротеин, содержащий как минимум две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи,связанные между собой дисульфидными связями, или его часть, которая связывается с антигеном. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (в данном описании сокращенно обозначается VH) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (в данном описании сокращенно обозначается VL) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, CL. Участки VH и VL могут быть дополнительно подразделены на(CDR), перемежающимися более консервативными участками, которые называются каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами гостя, в том числе различными клетками иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент"часть антитела") в данном описании обозначает один или больше фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, CXCR4). Показано, что функция связывания антитела с антигеном может выполняться фрагментами антитела с полной длиной. Примеры связывающихся фрагментов, которые охватываются термином "антигенсвязывающая часть" (часть, связывающаяся с антигеном) антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab,связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fab', который, по существу,представляет собой Fab с частью шарнирной области (см. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed.,3.sup.rd ed. 1993); (iv) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (V) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL И VH одного плеча антитела, (vi) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; (vii) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR); и (viii) нанотело (nanobody), вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий одинарный вариабельный домен и два константных домена. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов, синтетическим линкером, который позволяет получить их как одноцепочечный белок, в котором участки VL и VH спарены для образования одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv [scFv]; см., например, Bird et al.(1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающая часть" (часть, связывающаяся с антигеном) антитела. Такие фрагменты антител получают, используя обычные техники, известные специалисту в данной области, и проводят скрининг фрагментов на предмет пригодности таким же способом, как и для интактных антител."Выделенное антитело" в данном описании обозначает антитело, которое в существенной мере свободно от других антител, обладающих другой специфичностью по отношению к антигенам (например,выделенное антитело, которое специфично связывается с CXCR4, в существенной мере свободно от антител, которые специфично связываются с другими антигенами, кроме CXCR4). Выделенное антитело,которое специфично связывается с CXCR4, может, однако, обладать перекрестной реактивностью по отношению к другим антигенам, таким как молекулы CXCR4 других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть в существенной мере свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ. Термин "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" в данном описании обозначает препарат молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единую специфичность связывания и сродство к конкретному эпитопу. Термин "человеческое антитело" в данном описании предназначен включать антитела, содержащие вариабельные участки, в которых как каркасные участки, так и участки CDR происходят от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Кроме того, если антитело содержит константный участок, константный участок также происходит от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Человеческие антитела в соответствии с данным изобретением могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo). Однако термин "человеческое антитело" в данном описании не предназначен включать антитела, в которых последовательности CDR происходят из зародышевой линии другого вида млекопитающих, таких как мышь, пересажены на человеческие каркасные последовательности. Термин "человеческое моноклональное антитело" обозначает антитела, демонстрирующие единую специфичность связывания, которые содержат вариабельные участки, где как каркасные участки, так и участки CDR происходят от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. В одном варианте человеческие моноклональные антитела продуцированы гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, не относящегося к роду Homo sapiens, например трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи, слитые с бессмертной клеткой. Термин "рекомбинантное человеческое антитело" в данном описании включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными средствами, например (а) антитела, выделенные у животного (например, мыши), трансгенного или трансхромосомаль-7 018836 ного для генов человеческого иммуноглобулина, или из гибридомы, полученной из такого животного(описана ниже), (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сращивание последовательностей человеческого гена иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные участки, в которых каркасные участки и участки CDR происходят от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. В некоторых вариантах, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro(или при использовании трансгенного животного для последовательностей человеческого Ig соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, последовательности аминокислот участков VH и VL рекомбинантных антител представляет собой последовательности, которые, хотя происходят из и родственны последовательностям человеческих VH И VL зародышевой линии, могут не существовать в природе в пределах репертуара антител зародышевой линии человека in vivo. В данном описании "изотип" обозначает класс (например, IgM или IgG1) антитела, который кодируется генами константного участка тяжелой цепи. Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфическое в отношении антигена" в данном описании используются равнозначно с термином "антитело, которое специфично связывается с антигеном". Термин "производные человеческого антитела" обозначает любую модифицированную форму человеческого антитела, например конъюгат антитела и другого агента или антитела. Термин "гуманизированное антитело" предназначен для обозначения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии или другого вида млекопитающих, например мыши, пересажены на последовательности человеческого каркаса. Дополнительные модификации каркасного участка могут быть осуществлены в пределах человеческих каркасных последовательностей. Термин "химерное антитело" предназначен для обозначения антител, в которых последовательности вариабельного участка происходят из одного вида, и последовательности константного участка происходят из другого вида, например антитело, в котором последовательности вариабельного участка происходят от антитела мыши и последовательности константного участка происходят от человеческого антитела. В данном описании антитело, которое "специфично связывается с человеческим CXCR4", предназначено для обозначения антитела, которое связывается с человеческим CXCR4 (и, возможно, CXCR4 одного или больше видов, не относящихся к Homo sapiens), но не связывается в существенной мере с белками, которые не являются CXCR4. В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением специфично связывается с человеческим CXCR4 с последовательностью SEQ ID NO: 51 или его вариантом. Предпочтительно антитело связывается с человеческим CXCR4 с KD 110-7 М или меньше, более предпочтительно 510-8 М или меньше, более предпочтительно 310-8 М или меньше, более предпочтительно 110-8 М или меньше, даже более предпочтительно 510-9 М или меньше. Термин "не связывается в существенной мере" с белком или клетками в данном описании означает"не связывается или не связывается с высоким сродством с белком или клетками, т.е. связывается с белком или клетками с KD 110-6 М или больше, более предпочтительно 110-5 М или больше, более предпочтительно 110-4 М или больше, более предпочтительно 110-3 М или больше, даже более предпочтительно 110-2 М или больше. Термин "Kassoc" или "Ka" в данном описании предназначен для обозначения скорости ассоциации конкретного взаимодействия "антиген-антитело", тогда как термин "Kdis" или "Kd" в данном описании предназначен для обозначения скорости диссоциации конкретного взаимодействия "антиген-антитело". Термин "KD" в данном описании предназначен для обозначения константы диссоциации, которая получена из отношения Kd к Ka (т.е., Kd/Ka) и выражена как молярная концентрация (М). Значения KD для антител могут быть определены с использованием способов, хорошо известных в данной области. Предпочтительный способ определения KD антитела состоит в использовании резонанса поверхностного плазмона предпочтительно с применением системы биодатчика, например системы Biacore. В данном описании термина "высокое сродство" для антитела IgG обозначает антитело с KD для целевого антигена 110-7 М или меньше, более предпочтительно 510-8 М или меньше, даже более предпочтительно 110-8 М или меньше, даже более предпочтительно 510-9 М или меньше и даже более предпочтительно 110-9 М или меньше. Однако связывание с "высоким сродством" может варьировать для других изотипов антитела. Например, связывание с "высоким сродством" для изотипа IgM обозначает антитело с KD 10-6 М или меньше, более предпочтительно 10-7 М или меньше, даже более предпочтительно 10-8 М или меньше. В данном описании термин "субъект" включает любого человека или животное, не относящееся кHomo sapiens. Термин "животное, не относящееся к Homo sapiens" включает всех позвоночных животных, например млекопитающие и не млекопитающие, таких как не относящиеся к Homo sapiens прима-8 018836 ты, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.п. Различные аспекты данного изобретения описаны более подробно в следующих подразделах. Анти-CXCR4 антитела. Антитела в соответствии с данным изобретением характеризуются конкретными функциональными признаками или свойствами антител. Например, антитела связываются с природным человеческимCXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки. Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением связывается с CXCR4 с высоким сродством, например с KD 110-7 М или меньше. Анти-CXCR4 антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно демонстрируют одну или больше из следующих характеристик:(a) связывание с природным человеческим CXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки;(e) ингибирование образования капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека;(h) ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro;(i) ингибирование пролиферации опухолевых клеток и/или индуцирование апоптоза опухолевых клеток in vivo;(k) увеличение продолжительности жизни субъекта с опухолью CXCR4+. В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим CXCR4 на поверхности клетки, но не ингибирует связывания SDF-1 к CXCR4 и не ингибирует индуцированного SDF-1 притока кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4, и не ингибирует индуцированной SDF-1 миграции клеток, экспрессирующих CXCR4. В других вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим CXCR4 на поверхности клетки и ингибирует связывание SDF-1 с CXCR4 и ингибирует индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4, но не ингибирует индуцированной SDF-1 миграции клеток, экспрессирующих CXCR4. В других вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим CXCR4 на поверхности клетки и ингибирует связывание SDF-1 с CXCR4 и ингибирует индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4, и ингибирует индуцированную SDF-1 миграцию клеток, экспрессирующих CXCR4. В других вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим CXCR4 на поверхности клетки, ингибирует связывание SDF-1 с CXCR4, ингибирует индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4, ингибирует индуцированную SDF-1 миграцию клеток, экспрессирующих CXCR4, и ингибирует образование HuVEC капиллярных трубочек. Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением связывается с человеческимCXCR4 с KD 510-8 М или меньше, связывается с человеческим CXCR4 с KD 210-8 М или меньше, связывается с человеческим CXCR4 с KD 510-9 М или меньше, связывается с человеческим CXCR4 с KD 410-9 М или меньше, связывается с человеческим CXCR4 с KD 310-9 М или меньше или связывается с человеческим CXCR4 с KD 210-9 М или меньше. Предпочтительно антитело ингибирует связывание SDF-1 с человеческим CXCR4 с ЕС 50 для ингибирования 50 нМ или меньше, более предпочтительно 30 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше, или 10 нМ или меньше, или 5 нМ или меньше, или 3 нМ или меньше (например, ЕС 50 для ингибирования составляет 28,60 нМ или меньше, или 12,51 нМ или меньше, или 2,256 нМ или меньше). Предпочтительно антитело в соответствии с данньм изобретением ингибирует индуцированныйSDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий CXCR4 с ЕС 50 для ингибирования 3 нМ или меньше, более предпочтительно 2 нМ или меньше, или 1 нМ или меньше, или 0,9 нМ или меньше,или 0,8 нМ или меньше, или 0,7 нМ или меньше, или 0,6 нМ или меньше, или 0,5 нМ или меньше, или 0,4 нМ или меньше (например, 0,9046 нМ или меньше, 0,5684 или меньше, или 0,3219 нМ или меньше). Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением ингибирует индуцированнуюSDF-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий CXCR4, с ЕС 50 для ингибирования 50 нМ или меньше, более предпочтительно 30 нМ или меньше, или 20 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше (например, 18,99 нМ или меньше, или 12,44 или меньше). Стандартные анализы для оценки способности связывания антител с природным человеческимCXCR4, экспрессированным на поверхности клетки, известны в данной области, в том числе, например,анализ методов проточной цитометрии с использованием линии клетки, которая природным образом экспрессирует природный CXCR4, или которая была трансфицирована для экспрессии природногоCXCR4. Подходящие анализы подробно описаны в примерах. Предпочтительная линия клеток, которая экспрессирует природный CXCR4, представляет собой линию Т-клеток СЕМ. Подходящие анализы для оценки ингибирования связывания SDF-1, ингибирования индуцированного SDF-1 притока кальция, ингибирования индуцированной SDF-1 миграции клеток, ингибирования образования HuVEC капиллярных трубочек, индукции апоптоза в клетках, экспрессирующих CXCR4 in vitro и/или in vivo, ингибирование роста CXCR4+ опухолевых клеток in vitro и/или in vivo, и/или ингибирование метастазов CXCR4+ опухолевых клеток также подробно описаны в примерах. Сродство связывания антител также может быть определено стандартными способами, например, такими как анализ Скэтчарда (Scatchard). Моноклональные антитела F7, F9, D1 и Е 2. Предпочтительные антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой человеческие моноклональные антитела F7, F9, D1 и Е 2, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. Последовательности аминокислот VH F7, F9, D1 и Е 2 показаны в SEQ ID NO: 25,26, 27 и 28 соответственно. Последовательности аминокислот VL F7, F9, D1 и Е 2 показаны в SEQ ID NO: 29, 30, 31 и 32 соответственно. Дополнительно были созданы альтернативные формы F7, F9, D1 и Е 2, в которых некоторые остатки каркаса были заменены на остаток зародышевой линии, и здесь и в дальнейшем называются F7GL, F9GL, D1GL и E2GL. Последовательности аминокислот VH F7GL, F9GL, D1GL иF7GL, F9GL, D1GL и E2GL показаны в SEQ ID NO: 45, 46, 47 и 48 соответственно. При условии, что каждое из этих антител может связываться с CXCR4, последовательности VH и VL могут "комбинироваться и выравниваться (mixed and matched)", чтобы создать другие анти-CXCR4 молекулы со свойством связывания в соответствии с данным изобретением. Связывание с CXCR4 таких"комбинированных и выровненных" антител может быть проверено с использованием анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, проточной цитометрией с клетками СЕМ). Предпочтительно, если цепи VH и VL комбинируют и выравнивают, последовательность VH конкретной пары VH/VL заменяют на структурно подобную последовательность VH. Подобным образом, последовательность VL из конкретной пары VH/VL предпочтительно заменяют на структурно подобную последовательность VL. Соответственно, в одном аспекте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело, или его часть, связывающаяся с антигеном, содержащее:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25-28 и 41-44; и(b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-32 и 45-48; где антитело специфично связывается с CXCR4, предпочтительно человеческим CXCR4. Предпочтительные комбинации тяжелой и легкой цепи включают:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 25 или 41, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID(b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 26 или 42, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID(c) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 27 или 43, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID(d) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 28 или 44, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ IDNO: 32 или 48. В другом аспекте данного изобретения предлагаются антитела, которые включают участки CDR1,CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи F7, F9, D1 или Е 2, или их комбинации. Последовательности аминокислот участков CDR1 VH F7, F9, D1 и Е 2 показаны в SEQ ID NO: 1-4 соответственно. Последовательности аминокислот участков CDR2 VH F7, F9, D1 и Е 2 показаны в SEQ ID NO: 5-8 соответственно. Последовательности аминокислот участков CDR3 VH F7, F9, D1 и Е 2 показаны в SEQ ID NO: 9-12 соответственно. Последовательности аминокислот участков CDR1 VK F7, F9, D1 и Е 2 показаны в SEQ ID NO: 13-16 соответственно. Последовательности аминокислот участков CDR2 VK F7, F9, D1 и Е 2 показаны вSEQ ID NO: 17-20 соответственно. Последовательности аминокислот участков CDR3 VK F7, F9, D1 и Е 2 показаны в SEQ ID NO: 21-24 соответственно. Участки CDR выделены (обведены) с использованием системы (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). При условии, что каждое из этих антител может связываться с CXCR4 и что специфичность связывания антигена обеспечивается в основном участками CDR1, CDR2 и CDR3, последовательности участков CDR1, CDR2 и CDR3 VH и последовательности участков CDR1, CDR2 и CDR3 VK могут "комбинироваться и выравниваться" (т.е. участки CDR от различных антител могут комбинироваться и выравниваться, хотя каждое антитело должно содержать участки CDR1, CDR2 и CDR3 VH и участки CDR1, CDR2 и CDR3 VK), чтобы создать другие анти-CXCR4 молекулы, обладающие свойством связывания в соответствии с данным изобретением. Связывание с CXCR4 таких "комбинированных и выровненных" анти- 10018836 тел может быть проверено с использованием анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, ELISA, анализ Biacore ). Предпочтительно если последовательности участков CDR VH комбинируют и выравнивают, последовательность(и) участков CDR1, CDR2 и/или CDR3 конкретной последовательности VH заменяют структурно подобной последовательностью(ями) участков CDR. Также, если последовательности участков CDR VK комбинируют и выравнивают, последовательности участковCDR1, CDR2 и/или CDR3 конкретной последовательности VK предпочтительно заменяют структурно подобной последовательностью(ями) участков CDR. Для среднего специалиста в данной области будет очевидно, что новые последовательности VH и VL могут быть созданы путем замены одной или больше последовательностей участков CDR VH и/или VL структурно подобными последовательностями из последовательностей участков CDR, раскрытых в данном описании для моноклональных антител F7, F9,D1 и Е 2. Соответственно, в другом аспекте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, связывающаяся с антигеном, содержащая:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-8;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-12;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-16;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-20; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-24; где антитело специфично связывается с CXCR4, предпочтительно человеческим CXCR4. В предпочтительном варианте антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 1;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 5;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 9;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 13;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 17; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 21. В другом предпочтительном варианте, антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 2;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 6;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 10;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 14;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 18; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 22. В другом предпочтительном варианте, антитело включает:(а) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 3;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 7;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 11;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 15;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 19; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 23. В другом предпочтительном варианте, антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 4;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 8;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 12;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий SEQ ID NO: 16;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий SEQ ID NO: 20; и(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 24. Из уровня техники хорошо известно, что домен CDR3, независимо от домена(ов) CDR1 и/илиCDR2, отдельно может определить специфичность связывания антитела с родственным антигеном и что может быть создано множество антител, которые прогнозируемо обладают одинаковой специфичностью связывания, основанной на общей последовательности CDR3. См., например, Klimka et al., British J. ofCancer 83(2):252-260 (2000) (описывает выработку гуманизированного анти-CD30 антитела с использованием только CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи мышиного анти-CD30 антитела Ki-4); Beiboeret al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (описывает рекомбинантные антитела против эпителиального гликопротеина-2 [EGP-2] с использованием только последовательности тяжелой цепи CDR3 материнского(описывает панель гуманизированных антител v3 против интегрина с использованием вариабельного домена CDR3 тяжелой и легкой цепи мышиного антитела v3 против интегрина LM609, где каждое антитело-член содержит другую последовательность за пределами домена CDR3 и способно связываться с тем же эпитопом, что и материнское мышиное антитело со сродством, таким же высоким или выше,чем у материнского мышиного антитела); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (раскрывает, что домен CDR3 обеспечивает наиболее значительный вклад в связывание с антигеном); Barbas etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (описывает пересадку последовательностей CDR3 тяжелой цепи трех Fab (SI-1, SI-40 и SI-32) против человеческой плацентарной ДНК на тяжелую цепьFab столбнячного анатоксина, таким образом заменяя существующий CDR3 тяжелой цепи и демонстрируя, что домен CDR3 сам по себе обеспечивает специфичность связывания); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (описывает исследования по пересадке, где перенос только CDR3 тяжелой цепи материнского полиспецифического Fab LNA3 на тяжелую цепь моноспецифического IgG антитела Fab p313,связывающегося со столбнячным анатоксином, был достаточен для сохранения специфичности связывания материнского Fab); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) (описывает пептидомиметики, основанные на CDR3 моноклонального анти-HER2 антитела); Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995) (описывает синтетический полипептид длиной 12 аминокислот, соответствующий домену CDR3 антитела против фосфатидилсерина); Bourgeois et al., J. Virol. 72:807-10 (1998) (показывает,что одинарный пептид, полученный из домена CDR3 тяжелой цепи антитела против респираторного синцитиального вируса (RSV), был способен нейтрализовать вирус in vitro); Levi et al., Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993) (описывает пептид, основанный на домене CDR3 тяжелой цепи мышиного анти-ВИЧ антитела); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) (описывает возможность связывания с scFv в результате пересадки участка CDR3 тяжелой цепи антитела, связывающегося с ZДНК) и Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000) (описание того, что разнообразия в CDR3 тяжелой цепи достаточно, чтобы позволить идентичным в других отношениях молекулам IgM различать разнообразные полуантигены и белковые антигены). См. также патенты США 6951646; 6914128; 6090382; 6818216; 6156313; 6827925; 5833943; 5762905 и 5760185, где описаны патентованные антитела, определенные одинарным доменом CDR. Каждая из этих ссылок, таким образом, включена путем ссылки во всей ее полноте. Соответственно, настоящее изобретение предлагает моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи из антитела, полученного от человека или животного, не относящегося к Homo sapiens, где моноклональное антитело способно специфично связываться сCXCR4. В пределах определенных аспектов в данном изобретении предлагаются моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи из нечеловеческого антитела, например антитела мыши или крысы, где моноклональное антитело способно специфично связываться с CXCR4. В пределах некоторых вариантов такие антитела по изобретению, содержащие один или больше доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи из нечеловеческого антитела (а), способны к конкуренции за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом; и/или (d) обладают сродством связывания, подобным соответствующему материнскому нечеловеческому антителу. В пределах других аспектов настоящее изобретение предлагает моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи из человеческого антитела, такого как человеческое антитело, полученное от животного, не относящегося к Homo sapiens, где человеческое антитело способно специфично связываться с CXCR4. В пределах других аспектов, настоящее изобретение предлагает моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, такого как человеческое антитело, полученное от животного, не относящегося к Homo sapiens, где первое человеческое антитело способно специфично связываться с CXCR4 и где домен CDR3 из первого человеческого антитела заменяет домен CDR3 в человеческом антителе, не способном специфично связываться с CXCR4, чтобы генерировать второе человеческое антитело, которое способно специфично связываться с CXCR4. В пределах некоторых вариантов,такие антитела по изобретению, содержащие один или больше доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, (а) способны конкурировать за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом; и/или (d) обладают сродством связывания, сходным с соответствующим материнским первым человеческим антителом. Антитела, содержащие конкретные последовательности зародышевой линии. В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением включает вариабельный участок тяжелой цепи из тяжелой цепи конкретного гена иммуноглобулина зародышевой линии и/или вариабельный участок легкой цепи из легкой цепи конкретного гена иммуноглобулина зародышевой линии. Например, в предпочтительном варианте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого VH 3-48, где антитело специфично связывается с CXCR4. В другом предпочтительном варианте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческогоVK L15, где антитело специфично связывается с CXCR4. В другом предпочтительном варианте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, где антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого VH 3-48, и включает вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого VK L15, где антитело специфично связывается с CXCR4, предпочтительно человеческим CXCR4. Такие антитела также могут обладать одной или больше функциональных характеристик, подробно описанных выше, например связывание с природнымCXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки, ингибирование связывания SDF-1 к CXCR4, ингибирование индуцированного SDF-1 притока кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4, ингибирование индуцированной SDF-1 миграции клеток, экспрессирующих CXCR4, ингибирование образования HuVEC капиллярных трубочек, индуцирование апоптоза в клетках, экспрессирующих CXCR4 in vitro и/илиin vivo, ингибирование роста CXCR4+ опухолевых клеток in vitro и/или in vivo, и/или ингибирование метастазов CXCR4+ опухолевых клеток. Примеры антител, содержащих VH и VK VH 3-48 и VK L15 соответственно, представляет собой антитела F7, F9, D1 и Е 2. В данном описании человеческое антитело включает вариабельные участки тяжелой или легкой цепи, которые являются "продуктом" или "происходят от" конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные участки антитела получены из системы, где используются человеческие гены иммуноглобулина зародышевой линии. Такие системы включают иммунизацию трансгенной мыши, несущей человеческие гены иммуноглобулина, целевым антигеном или скрининг библиотеки человеческого гена иммуноглобулина, показанной на фаге, с целевым антигеном. Человеческое антитело, которое является "продуктом" или "происходит из" человеческой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, может быть идентифицировано как таковое сравнением последовательности аминокислот человеческого антитела с последовательностями аминокислот иммуноглобулинов зародышевой линии человека и выбором человеческой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, последовательность которой наиболее близка (т.е. самый высокий % идентичности) к последовательности человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является "продуктом" или "происходит от" конкретной человеческой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, может включать отличия аминокислот по сравнению с последовательностью зародышевой линии за счет, например, природных соматических мутаций или умышленного введения сайт-специфической мутации. Однако последовательность аминокислот выбранного человеческого антитела обычно как минимум на 90% идентична последовательности аминокислот, кодируемой человеческим геном иммуноглобулина зародышевой линии, и содержит остатки аминокислот, которые идентифицируют человеческое антитело как человеческое при сравнении с последовательностями аминокислот иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, мышиные последовательности зародышевой линии). В определенных случаях последовательность аминокислот человеческого антитела может быть как минимум на 95% или даже как минимум на 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности аминокислот, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Обычно человеческое антитело, происходящее из конкретной человеческой последовательности зародышевой линии, демонстрирует не более 10 отличий аминокислот от последовательности аминокислот, кодируемой человеческим геном иммуноглобулина зародышевой линии. В определенных случаях человеческое антитело может демонстрировать не более 5 или даже не более 4, 3,2 или 1 отличий аминокислот от последовательности аминокислот, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Гомологичные антитела. В другом варианте антитело в соответствии с данным изобретением включает вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, содержащие последовательности аминокислот, гомологичные последовательностям аминокислот предпочтительных антител, описанных в данном описании, где антитела сохраняют желательные функциональные свойства анти-CXCR4 антител в соответствии с данным изобретением. Например, в данном изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть,которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, где:(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, которая как минимум на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из(b) вариабельный участок легкой цепи включает последовательность аминокислот, которая как минимум на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ клетки. Дополнительно или альтернативно, антитело может обладать одним или больше следующих функциональных свойств: (i) связываться с человеческим CXCR4 с KD 110-7 М или меньше; (ii) ингибировать связывание SDF-1 с CXCR4; (iii) ингибировать индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4; (iv) ингибировать индуцированную SDF-1 миграцию клеток, экспрессирующихin vitro и/или in vivo и/или (viii) ингибировать метастазы CXCR4+ опухолевых клеток. В различных вариантах антитело может быть, например, человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом. В других вариантах последовательности аминокислот VH и/или VL могут быть на 85, 90, 95, 96, 97,98 или 99% гомологичными последовательностям, описанным выше. Антитело, содержащее участки VH и VL с высокой степенью гомологии (т.е. 80% или выше) к участкам VH и VL последовательностей, описанных выше, может быть получено мутагенезом (например, сайт-специфическим или ПЦРопосредованным мутагенезом) молекул нуклеиновых кислот, кодирующих SEQ ID NO: 25-32 или 41-48,с последующей проверкой кодируемого измененного антитела на предмет сохранения функции (т.е. описанных выше функций), с использованием функциональных анализов, описанных в данном описании. В данном описании процент гомологии между двумя последовательностями аминокислот эквивалентен проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных для последовательностей положений (т.е. % гомологии = количество идентичных положений/общее количество положений 100), принимая во внимание количество промежутков и длину каждого промежутка, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с использованием математического алгоритма, как описано в не ограничивающих примерах ниже. Процент идентичности между двумя последовательностями аминокислот может быть определен с использованием алгоритма Е. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988, который встроен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы массы остатков РАМ 120, штрафа длины промежутка 12 и штрафа промежутка 4. Кроме того, процент идентичности между двумя последовательностями аминокислот может быть определен с использованием алгоритма Needleman и Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970, который встроен в программу GAP в пакете программ GCG (доступен по адресу http://www.gcg.com) с использованием матрицы Blossum 62 или матрицы РАМ 250, веса промежутка 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4, и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Дополнительно или альтернативно, белковые последовательности в соответствии с данным изобретением могут, кроме того, применяться в качестве "поисковой последовательности", чтобы выполнять поиск в общедоступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск может быть проведен с использованием программы XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиск белков BLAST может быть проведен с помощью программыXBLAST, баллы = 50, длина слова = 3, чтобы получить последовательности аминокислот, гомологичные по отношению к молекулам антител в соответствии с данным изобретением. Чтобы получить выравнивания с промежутками для целей сравнения, можно использовать BLAST Gapped, как описано в Altschulet al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. При применении программ BLAST и BLAST Gapped подходят параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См.www.ncbi.nlm.nih.gov. Антитела с консервативными модификациями. В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательности доменов CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательности доменов CDR1, CDR2 и CDR3, где одна или больше таких последовательностей CDR включает указанные последовательности аминокислот на основе предпочтительных антител, описанных в данном описании (например, F7, F9, D1 или Е 2), или их консервативных модификаций, и где антитела сохраняют желательные функциональные свойства антиCXCR4 антител в соответствии с данным изобретением. Специалисту в данной области будет понятно,что может быть осуществлена определенная консервативная модификация последовательности, которая не исключает связывания с антигеном. См., например, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8 (описание мутационного анализа в домене CDR3 тяжелой цепи антител, специфичных в отношении Salmonella); de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41 (описание исследования мутаций в анти-UA1 антителах);Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870 (показывает, что мутации в середине HCDR3 приводили к потере или снижению сродства); Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12 (описание того, как изменение одной аминокислоты в участке CDR3 привело к потере связывающей активности); Kelley and(2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43 (описание аминокислотных мутантов HCDR3). Соответственно, в данном изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательности доменовCDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательности доменов(a) последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 9-12 и их консервативных модификаций;(b) последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 21-44 и их консервативных модификаций; и(c) антитело связывается с природным человеческим CXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки. Дополнительно или альтернативно, антитело может обладать одним или больше из следующих функциональных свойств: (i) связывается с человеческим CXCR4 с KD 110-7 М или меньше; (ii) ингибирует связывание SDF-1 с CXCR4; (iii) ингибирует индуцированный SDF-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие CXCR4; (iv) ингибирует индуцированную SDF-1 миграцию клеток, экспрессирующихCXCR4; (v) ингибирует образование HuVEC капиллярных трубочек; (vi) индуцирует апоптоз в клетках,экспрессирующих CXCR4 in vitro и/или in vivo; (vii) ингибирует рост CXCR4+ опухолевых клеток in vitro и/или in vivo; и/или (viii) ингибирует метастазы CXCR4+ опухолевых клеток. В предпочтительном варианте последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 5-8 и их консервативных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 17-20 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном варианте последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 1-4 и их консервативных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 13-16 и их консервативных модификаций. В различных вариантах антитело может быть, например, человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом. В данном описании термин "консервативные модификации последовательности" предназначен для обозначения модификаций аминокислот, которые не оказывают существенного воздействия и не изменяют в значительной степени характеристик связывания антитела, содержащего последовательность аминокислот. Такие консервативные модификации включают замены, добавление и делеции аминокислот. Модификации могут быть введены в антитело в соответствии с данным изобретением стандартными методами, известными из уровня техники, например сайт-специфический мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот представляют собой такие, при которых остаток аминокислоты заменяют на остаток аминокислоты, содержащий подобную боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, содержащих подобные боковые цепи, определены в уровне техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин,гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота),полярными незаряженньми боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин,тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин,валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан,гистидин). Таким образом, один или больше остатков аминокислот в пределах участков CDR антитела в соответствии с данным изобретением могут быть заменены на другие остатки аминокислот из того же семейства боковых цепей, и измененное антитело может быть проверено на предмет сохранения функции (т.е. функций, описанных выше), с использованием функциональных анализов, описанных в данном описании. Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и анти-CXCR4 антитела. В другом варианте данного изобретения предлагаются антитела, которые связываются с таким же эпитопом на человеческом CXCR4, как и любое из моноклональных анти-CXCR4 антител в соответствии с данным изобретением (т.е. антитела, которые обладают способностью перекрестно конкурировать за связывание с CXCR4 с любым из моноклональных антител в соответствии с данным изобретением). В предпочтительных вариантах антитело сравнения для изучения перекрестной конкуренции может быть моноклональным антителом F7 (содержащим последовательности VH и VL, как показано в SEQ ID NO: 25 и 29 соответственно), или моноклональным антителом F9 (содержащим последовательности VH И VL, как показано в SEQ ID NO: 26 и 30 соответственно), или моноклональным антителом D1 (содержащим последовательности VH И VL, как показано в SEQ ID NO: 27 и 31 соответственно), или моноклональным антителом Е 2 (содержащим последовательности VH И VL, как показано в SEQ ID NO: 28 и 32 соответственно). Такие перекрестно-конкурирующие антитела могут быть идентифицированы на основе их способности перекрестно конкурировать с F7, F9, D1 или Е 2 в стандартных анализах связывания с CXCR4. Например, проточная цитометрия с клетками СЕМ может быть использована для демонстрации перекрестной конкуренции с антителами в соответствии с данным изобретением, где антитело сравнения несет метку FITC и оценивается способность исследуемого антитела ингибировать связывание FITCмеченного антитела сравнения с клетками СЕМ. Способность исследуемого антитела ингибировать связывание, например, F7, F9, D1 или Е 2, с человеческим CXCR4 демонстрирует, что исследуемое антитело может конкурировать с F7, F9, D1 или Е 2 за связывание с человеческим CXCR4 и, таким образом, связывается с таким же эпитопом на человеческом CXCR4, как F7, F9, D1 или Е 2. В предпочтительном варианте антитело, которое связывается с таким же эпитопом на CXCR4, как и F7, F9, D1 или Е 2, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Такие человеческие моноклональные антитела могут быть получены и выделены, как описано в примерах. Сконструированные и модифицированные антитела. Антитело в соответствии с данным изобретением дополнительно может быть получено с использованием антитела, содержащего одну или больше последовательностей VH и/или VL, раскрытых в данном описании, как исходного материала для конструирования модифицированного антитела, причем модифицированное антитело может обладать измененными свойствами по сравнению с исходным антителом. Антитело может быть сконструировано путем модификации одного или больше остатков в пределах одного или обоих вариабельные участков (т.е. VH и/или VL), например в пределах одного или больше участков CDR и/или в пределах один или больше каркасных доменов. Дополнительно или альтернативно,антитело может быть сконструировано путем модификации остатков в пределах константного участка(ов), например, для изменения эффекторной функции(й) антитела. В некоторых вариантах, пересадка CDR может применяться для конструирования вариабельных участков антител. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами в основном посредством остатков аминокислот, которые расположены в шести определяющих комплементарность участках (участки CDR) тяжелой и легкой цепи. Для этого последовательности аминокислот в пределах участков CDR в большей степени различаются между индивидуальными антителами, чем последовательности за пределами участков CDR. Поскольку последовательности CDR ответственны за большинство взаимодействий "антителоантиген", можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфичных природных антител, конструируя векторы экспрессии, которые включают последовательности CDR специфичных природных антител, пересаженный на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986)Nature 321:522-525; Queen, С. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; патент США 5225539, выданный Winter, в также патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданныеQueen et al.). Соответственно, другой вариант в соответствии с данным изобретением относится к выделенному моноклональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, содержащему вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательности доменов CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 5-8 иSEQ ID NO: 9-12 соответственно, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательности доменов CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие последовательность аминокислот, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 13-16, SEQ ID NO: 17-20 и SEQ ID NO: 21-24 соответственно. Таким образом,такие антитела содержат последовательности CDR VH И VL моноклональных антител F7, F9, D1 или Е 2,могут также содержать различные каркасные последовательности этих антител. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые включают генные последовательности антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для человеческих генов вариабельных участков тяжелой и легкой цепи могут быть найдены в базе данных последовательностей зародышевой линии человека "VBase" (доступна в Интернет по адресу в www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat, E.A., etin their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из которых явно включено в данное описание путем ссылки. В качестве другого примера последовательности ДНК зародышевой линии для человеческих генов вариабельных участков тяжелой и легкой цепи могут быть найдены в базе данныхGenbank. Например, доступны следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, найденные у мышей НСо 7 HuMAb, со следующими инвентарными номерами Genbank: 1-69 (NG0010109,NT024637 и ВС 070333), 3-33 (NG0010109 и NT024637) и 3-7 (NG0010109 и NT024637). Как другой пример доступны следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, найденные у мы- 16018836 шей НСо 12 HuMAb, с инвентарными номерами Genbank: 1-69 (NG0010109, NT024637 и ВС 070333), 551 (NG0010109 и NT024637), 4-34 (NG0010109 и NT024637), 3-30.3 (CAJ556644) и 3-23 (AJ406678). Еще одним источником человеческих последовательностей тяжелой и легкой цепи зародышевой линии является база данных генов человеческого иммуноглобулина, доступная от IMGT (http://imgt.cines.fr). Белковые последовательности антител сравнивают с компилированной базой данных белковых последовательностей с использованием одного из методов поиска сходства последовательностей под названием BLAST Gapped (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), который хорошо известен специалистам в данной области. BLAST представляет собой эвристический алгоритм, где статистически значимое выравнивание между последовательностью антитела и последовательностью базы данных, вероятно, содержит сегментные пары с высоким баллом (HSP) выровненных слов. Сегментные пары, баллы для которых не могут быть улучшены удлинением или упорядочением, называются хитом(hit). Если коротко, транслируют нуклеотидные последовательности VBASE происхождения(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php), и участок между (включительно) FR1-FR3 каркасного участка сохраняется. Средняя длина последовательностей баз данных составляет 98 остатков. Двойные последовательности, которые точно соответствуют друг другу по всей длине белка, исключают. ПоискBLAST для белков с использованием программы blastp и стандартных параметров по умолчанию, кроме фильтра низкой сложности, который выключен, и матрицы замены BLOSUM62, фильтры для 5 последовательностей, дающих хиты, дает пары. Нуклеотидные последовательности транслируют во всех шесть каркасов, и каркасы без стоп-кодонов в сегменте соответствия последовательности базы данных рассматривают как потенциальный хит. Это, в свою очередь, подтверждается с использованием программыBLAST tblastx, которая транслирует последовательность антитела во все шесть каркасов и сравнивает такие трансляции с нуклеотидными последовательностями VBASE, динамически транслированными во все шесть каркасов. Поиск в других базах данных последовательностей зародышевой линии человека,например, доступная от IMGT (http://imgt.cines.fr), может быть проведен так же, как изложено выше дляVBASE. Идентичность представляет собой точное соответствие аминокислот между последовательностью антитела и базой данных белков для полной длины последовательности. Позитив (идентичность + соответствие замены) не идентичен, но замены аминокислот проводятся матрицей замены BLOSUM62. Если последовательность антитела соответствует двум последовательностям из базы данных с одинаковой идентичностью, хит с большинством позитивов был бы принят как хит соответствия последовательностей. Предпочтительными каркасными последовательностями для использования в антителах в соответствии с данным изобретением являются такие, которые структурно подобны каркасным последовательностям, используемым в выбранных антителах в соответствии с данным изобретением, например подобны каркасным последовательностям VH 3-48 (SEQ ID NO: 49) и/или каркасной последовательности VKL15 (SEQ ID NO: 50), используемой в предпочтительных моноклональных антителах в соответствии с данным изобретением. Последовательности доменов CDR1, CDR2 и CDR3 VH и последовательности доменов CDR1, CDR2 и CDR3 VK могут быть пересажены на каркасные участки, последовательность которых идентична найденной в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого получена каркасная последовательность, или последовательности CDR могут быть пересажены на каркасные участки, которые содержат одну или больше мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в некоторых случаях выгодно осуществлять мутации остатков в рамках каркасных участков для поддержания или усиления способности антитела к связыванию с антигеном(см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.). Другой вид модификации вариабельного участка состоит в мутации остатков аминокислот в пределах участков CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH и/или VK, чтобы таким образом улучшить одно или больше свойств (например, сродство) связывания целевого антитела. Сайт-специфический мутагенез или ПЦРопосредованный мутагенез может осуществляться с целью введения мутации(й), и влияние на связывание антитела или другое целевое функциональное свойство может быть оценено в анализах in vitro или invivo, как описано в данном описании и предложено в примерах. Предпочтительно вводят консервативные модификации (как обсуждалось выше). Мутации могут представлять собой замены, добавление или делеции аминокислот, но предпочтительными являются замены. Кроме того, обычно изменяют не более чем один, два, три, четыре или пять остатков в пределах участка CDR. Соответственно, в другом варианте данного изобретения предлагаются выделенные моноклональные анти-CXCR4 антитела или их части, связывающиеся с антигеном, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий: (а) участок CDR1 VH, содержащий последовательность аминокислот,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с SEQID NO: 1-4; (b) участок CDR2 VH, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 5-8, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 5-8; (с) участок CDR3 12, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 9-12; (d) участок CDR1 VK, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-16, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 13-16; (е) участок CDR2 VK, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-20, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 17-20; и (f) участок CDR3 VK, содержащий последовательность аминокислот,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-24, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с SEQID NO: 21-24. Сконструированные антитела в соответствии с данным изобретением включают такие, в которых осуществлены модификации остатков каркаса в пределах VH и/или VK, например, для улучшения свойств антитела. Обычно такие модификации каркаса осуществляют с целью уменьшения иммуногенности антитела. Например, один из подходов состоит в "обратной мутации" одного или больше остатков каркаса в последовательности соответственной зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое содержит соматическую мутацию, может содержать остатки каркаса, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которых антитело получено. Такие остатки могут быть идентифицированы сравнением каркасной последовательности антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых антитело получено. Например, для участка VH F7 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 1, 6 и 25. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: Q1E, Q6E и A25S. Предпочтительная модифицированная форма участка VH F7 представляет собой VH F7GL (последовательность аминокислот, которая показана на фиг. 5 А и в SEQ ID NO: 41), которая содержит следующие замены в каркасе: Q1E иQ6E. Кроме того, для участка VK F7 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 1, 3 и 84. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: A1D, R3Q и V84A. Предпочтительная модифицированная форма участка VK F7 представляет собой VK F7GL (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 5 В и в SEQ ID NO: 45), которая содержит следующие замены в каркасе: A1D иR3Q. Кроме того, для участка VH F9 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 1, 6 и 25. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: Q1E, Q6E и A25S. Предпочтительная модифицированная форма участка F9 VH представляет собой VH F9GL (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 6 А и в SEQ ID NO: 42), которая содержит следующие замены в каркасе: Q1E иQ6E. Кроме того, для участка VK F9 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 1, 3, 4 и 60. Одно, два, три или все четыре из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух, трех или всех четырех из следующих замен: E1D, V3Q, L4M и P60S. Предпочтительная модифицированная форма участка VK F9 представляет собой VK F9GL (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 6 В и в SEQ ID NO: 46), которая содержит следующие замены в каркасе: E1D, V3Q и L4M. Кроме того, для участка VH D1 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 6, 25 и 76. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: Q6E, A25S и R76K. Предпочтительная модифицированная форма участка VH D1 представляет собой VH D1GL (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 7 А и в SEQ ID NO: 43), которая содержит следующую замену в каркасе:Q6E. Кроме того, для участка VK D1 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 1, 3, 4, 45 и 46. Одно, два, три,четыре или все пять из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух, трех, четырех или всех пяти из следующих замен:V1D, W3Q, V4M, Е 45K и L46S. Предпочтительная модифицированная форма участка VK D1 представляет собой VK D1GL (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 7 В и в SEQ ID NO: 47),которая содержит следующие замены в каркасе: V1D, W3Q и V4M. Кроме того, для участка VH E2 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 6 и 25. Одно или оба из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной или обеих из следующих замен: Q6E и A25S. Предпочтительная модифицированная форма участка VH E2 представляет собой VH E2GL (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 8 А и в SEQ ID NO: 44), которая содержит следующую замену в каркасе: Q6E. Кроме того, для участка VK E2 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации Kabat) отличаются от зародышевой линии: 1, 3 и 4. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностям зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: E1D, V3Q и L4M. Предпочтительная модифицированная форма участка VK E2 представляет собой VK E2GL (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 8 В и в SEQ ID NO: 48), которая содержит следующие замены в каркасе: E1D,V3Q и L4M. Другой вид модификации каркаса включает мутацию в одном или больше остатков в рамках каркасного участка или даже в пределах одного или больше участков CDR, чтобы исключить эпитопы Тклеток и, таким образом, уменьшить, сократить потенциальную иммуногенность антитела. Данный подход также называется "деиммунизация (deimmunization)" и подробно описан Carr et al. в патентной публикации США 20030153043. Дополнительно или альтернативно модификациям, осуществленным в каркасных участках или участках CDR, антитела в соответствии с данным изобретением могут быть сконструированы таким образом, чтобы включать модификации в пределах участка Fc, обычно с целью изменения одного или больше функциональных свойств антитела, например периода полувыведения из сыворотки, фиксации комплемента, связывания с рецептором Fc и/или антигензависимой клеточной цитотоксичности. Кроме того,антитело в соответствии с данным изобретением может быть модифицировано химически (например,один или больше химических фрагментов могут быть присоединены к антителу), или оно может быть модифицировано таким образом, чтобы изменить его гликозилирование, снова изменить одно или больше функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов подробнее описан ниже. Нумерация остатков в участке Fc представляет собой нумерацию индекса ЕС по Kabat. В одном варианте шарнирная область СН 1 модифицирована таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области изменено, например увеличено или уменьшено. Данный подход описан подробнее Bodmer et al. в патенте США 5677425. Количество остатков цистеина в шарнирной области СН 1 изменяют, например, с целью облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела. В другом варианте в шарнирную область Fc антитела введены мутации с целью уменьшения периода полувыведения антитела из биологических систем. Более конкретно одна или больше мутаций аминокислот введены в участок домена СН 2-СН 3 на границе фрагмента Fc-шарнир таким образом, что снижается способность антитела связываться с протеином А стафилококков (SpA) относительно связывания природного домена Fc-шарнир со SpA. Данный подход описан более подробно Ward et al. в патенте США 6165745. В другом варианте антитело модифицируют с целью увеличения его периода полувыведения из биологических систем. Возможны различные подходы. Например, могут быть введены одна или больше из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США 6277375, выданном Ward. Альтернативно, для увеличения периода полувыведения из биологических систем, антитело может быть изменено в пределах участка СН 1 или CL, чтобы включить эпитоп связывания с "рецептором спасения"(salvage receptor), взятый из двух петель домена СН 2 участка Fc IgG, как описано Presta et al. в патентах США 5869046 и 6121022. В других вариантах участок Fc изменяют, заменяя как минимум один остаток аминокислоты на другой остаток аминокислоты, чтобы изменить эффекторную функцию(и) антитела. Например, одна или больше аминокислот, выбранных из остатков аминокислот 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, может быть заменена на другой остаток аминокислоты таким образом, что изменится сродство антитела к эффекторному лиганду, но сохранится способность связывания с антигеном материнского антитела. Эффекторный лиганд, сродство к которому изменено, может представлять собой, например, рецептор Fc или компонент С 1 комплемента. Данный подход описан более подробно в патентах США 5624821 и 5648260, оба выданы Winter et al. В другом примере одна или больше аминокислот, выбранных из остатков аминокислот 329, 331 и 322, может быть заменена другим остатком аминокислоты таким образом, что изменяется связывание антитела с Clq и/или уменьшается или устраняется комплементзависимая цитотоксичность (CDC). Данный подход подробнее описан Idusogie et al. в патенте США 6194551. В другом примере изменяют один или больше остатков аминокислот в пределах положений аминокислот 231 и 239, чтобы таким образом изменить способность антитела к связыванию комплемента. Данный подход подробнее описан Bodmer et al. в публикации РСТ WO 94/29351. Еще в одном примере участок Fc модифицируют с целью повышения способности антитела опо- 19018836 средовывать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или увеличения сродства антитела к рецептору Fc путем модификации одной или больше аминокислот в следующих положениях: 238,239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290,292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333,334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Данный подход подробнее описан Presta в публикации РСТ WO 00/42072. Более того, была построена карта сайтов связывания на человеческом IgG1 для FcRI, FcRII, FcRIII и FcRn, и описаны варианты с улучшенным связыванием (см. Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Было показано, что конкретные мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcRIII. Кроме того, описаны следующие комбинационные мутанты для улучшения связывания с FcRIII: T256A/S298A,S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A. В другом варианте модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено негликозилированное антитело (т.е. антитело без гликозилирования). Гликозилирование может быть изменено, например, для увеличения сродства антитела к антигену. Такие модификации углеводорода могут быть осуществлены, например, изменением одного или больше сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, могут быть осуществлены одна или больше замен аминокислот, что приводит к устранению одного или больше сайтов гликозилирования в вариабельном участке каркаса, таким образом, исключая гликозилирование на данном сайте. Такое отсутствие гликозилирования может увеличивать сродство антитела к антигену. Такой подход подробнее описан Со et al. в патентах США 5714350 и 6350861. Дополнительно или альтернативно, может быть получено антитело с измененным типом гликозилирования, например гипофукозилированное антитело, содержащее уменьшенные количества фукозильных остатков, или антитело, содержащее увеличенное количество разделенных пополам структурGlcNac. Продемонстрировано, что такой измененный характер гликозилирования увеличивает способность антител к ADCC. Такие модификации углеводородов могут быть осуществлены, например, экспрессией антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в уровне техники и могут использоваться в качестве клетокхозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела в соответствии с данным изобретением, чтобы таким образом получить антитело с измененным гликозилированием. Например, в линиях клетокMs704, Ms705 и Ms709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, FUT8 1,6)фукозилтрансферазы), таким образом, что в антителах, экспрессированных в линиях клеток Ms704, Ms705 и Ms709, отсутствует фукоза в углеводородных цепях. Линии клеток Ms704, Ms705 и Ms709 FUT8-/- были созданы целенаправленным разрушением гена FUT8 в клетках CHO/DG44, с использованием двух векторов замены (см. патентную публикацию США 20040110704 Yamane et al. и Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). В качестве другого примера Hanai et al. в ЕР 1176195 описывают линию клеток с функционально разрушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, таким образом, что антитела,экспрессированные в такой линии клеток, демонстрируют гипофукозилирование с уменьшением или устранением -1,6-связи для соответствующего фермента. Hanai et al. также описывают линии клеток с низкой ферментной активностью для добавления фукозы к N-ацетилглюкозамину, который связывается с участком Fc антитела, или которые не обладают ферментной активностью, например линия клеток миеломы крыс YB2/0 (АТСС CRL 1662). Presta в публикации РСТ WO 03/035835 описывает вариант линии клеток СНО, клетки Lec13, со сниженной способностью к присоединению фукозы к связанным сAsn(297) углеводородам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессирующихся в такой клетке-хозяине (см. также Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Антитела с измененным профилем гликозилирования также могут быть продуцированы в куриных яйцах, как описано в патентной заявке СШАPCT/US 06/05853. Альтернативно, антитела с модифицированным профилем гликозилирования могут быть продуцированы в клетках растений, например Lemna. Способы продуцирования антител в системе растения раскрыты в патентной заявке США, соответствующей регистрационному номеру поверенных AlstonBird LLP040989/314911, поданной 11 августа 2006 г.Umana et al. в публикации РСТ WO 99/54342 описывают линии клеток, сконструированные для экспрессии гликопротеин-модифицирующих гликозилтрансфераз (например, (1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза III [GnTIII]) таким образом, что антитела, экспрессированные в сконструированных клеточных линиях, демонстрируют увеличенное содержание разделенных пополам структур GlcNac, что приводит к увеличенной активности ADCC антител (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Альтернативно, остатки фукозы в антителе могут быть отщеплены с применения фермента фукозидазы. Например, фукозидаза -L-фукозидаза удаляет фукозильные остатки из антител (Tarentino, A.L. et al.(1975) Biochem. 14:5516-23). Другая модификация антител в данном описании, которая предусматривается данным изобретением, - пегилирование. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения периода полувыведения антитела из биологических систем (например, сыворотки). Для пегилирования антитела обычно проводят реакцию антитела или его фрагмента с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспо- 20018836 собный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, в которых одна или больше групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно пегилирование осуществляют посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ(или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В данном описании термин"полиэтиленгликоль" предназначен включать любую из форм ПЭГ, которые применяются для дериватизации других белков, например моно(С 1-С 10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль малеинимид. В некоторых вариантах антитело для пегилирования представляет собой агликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны из уровня техники и могут быть применены к антителам в соответствии с данным изобретением. См., например, ЕР 0154316 (Nishimura etal.) и ЕР 0401384 (Ishikawa et al.). Фрагменты антитела и миметики антитела. Данное изобретение не ограничивается традиционными антителами и может практиковаться посредством применения фрагментов антитела и миметиков антитела. Как подробно описано ниже, на сегодняшний день создан и широко известен из уровня техники широкий спектр технологий фрагментов антитела и миметиков антитела. Хотя в целом ряде таких технологий, например доменные антитела, нанотела (nanobodies) и юнитела (unibodies), используют фрагменты или другие модификации традиционной структуры антител, существуют также альтернативные технологии, например аффитела (Affibodies),DARPin, антикалины (Anticalins), авимеры и версатела (Versabodies), где используются обеспечивающие связывание структуры, которые, хотя и имитируют традиционное связывание антител, созданы и функционируют посредством других механизмов. Доменные антитела (dAb) представляют собой наименьшие функциональные единицы связывания антител, соответствующие вариабельным участкам тяжелой (VH) или легкой (VL) цепей человеческих антител. Молекулярный вес доменных антител составляет приблизительно 13 кДа. Domantis разработаны серии больших и чрезвычайно функциональных библиотек полностью человеческих dAb VH И VL (более 10 млрд. различных последовательностей в каждой библиотеке), и использует эти библиотеки, чтобы выбрать dAb, специфичных в отношении терапевтических мишеней. В противоположность многим обычным антителам доменные антитела хорошо экспрессируются в системах бактериальных, дрожжевых клеток и клеток млекопитающих. Более подробное описание доменных антител и способов их продуцирования может быть найдено в патентах США 6291158; 6582915; 6593081; 6172197; 6696245; публикации США, серийный 2004/0110941; европейской патентной заявке 1433846 и европейских патентах 03686840616640; WO 05/035572, WO 04/101790, WO 04/081026, WO 04/058821, WO 04/003019 и WO 03/002609, каждый из которых включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Нанотела представляют собой полученные из антитела терапевтические белки, которые обладают уникальными структурными и функциональными свойствами природных антител с тяжелой цепью. Такие антитела с тяжелой цепью содержат одинарный вариабельный домен (VHH) и два константных домена (СН 2 и СН 3). Важно, что клонированный и выделенный домен VHH представляет собой полипептид с отличной стабильностью, сохраняющий полностью способность связывания с антигеном исходного антитела с тяжелой цепью. Нанотела демонстрируют высокую степень гомологии с доменами VH человеческих антител и могут быть дополнительно гуманизированы без какого-либо снижения активности. Важно, что нанотела обладают низким иммуногенным потенциалом, что подтверждено в исследованиях на приматах ведущих соединений нанотел. Нанотела сочетают преимущества обычных антител с важными признаками низкомолекулярных лекарственных средств. Подобно обычным антителам, нанотела показывают высокую специфичность в отношении мишени, высокое сродство в отношении мишени и низкую собственную токсичность. Однако, подобно низкомолекулярным лекарственным средствам, они могут ингибировать ферменты и легко получают доступ к расщелинам рецептора. Кроме того, нанотела чрезвычайно стабильны, могут вводиться другими способами, помимо инъекции (см., например, WO 04/041867, которая включена в данное описание путем ссылки во всей ее полноте), а также их легко производить. Другие преимущества нанотел включают распознавание необычных или скрытых эпитопов как результат их небольшого размера,связывание во впадинах или на активных сайтах белковых мишеней с высоким сродством и селективностью за счет их уникальной 3-мерной структуры, гибкости формата лекарственного средства, адаптация периода полувыведения, а также легкость и быстрота разработки лекарственных средств. Нанотела кодируются одинарными генами и эффективно продуцируются практически во всех прокариотных и эукариотных хозяевах, например Е. coli (см., например, патент США 6765087, который включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте), плесневых грибах (например, Aspergillus или Trichoderma) и дрожжах (например, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula или Pichid) (см., например, патент США 6838254, который включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте). Производственный процесс поддается масштабированию, с производством многих килограммов нанотел. Поскольку нанотела демонстрируют превосходящую стабильность по сравнению с обычными антителами, они могут быть введены в готовый к употреблению раствор с длительным сроком хранения. Способ Nanoclone (см., например, WO 06/079372, которая включена в данное описание путем ссылки во всей ее полноте) представляет собой частный способ генерации нанотел против целевой мишени,- 21018836 основанный на автоматизированной высокопродуктивной селекции В-клеток, и может использоваться в контексте данного изобретения. Юнитела представляют собой другую технологию фрагментов антитела, однако данная технология базируется на удалении шарнирной области из IgG4 антител. Делеция шарнирной области приводит к образованию молекулы, которая, по существу, вдвое меньше традиционных IgG4 антител и содержит одновалентный участок связывания вместо двухвалентного участка связывания IgG4 антител. Также хорошо известно, что IgG4 антитела инертны и поэтому не взаимодействуют с иммунной системой, что может быть предпочтительным при лечении заболеваний, где иммунная реакция нежелательна, и данное преимущество передается юнителам. Например, юнитела могут функционировать таким образом, чтобы ингибировать или "глушить", но не убивать клетки, с которыми они связываются. Дополнительно связывание юнитела с раковыми клетками не стимулирует их пролиферацию. Кроме того, поскольку размер юнител составляет половину размера традиционных IgG4 антител, они могут показывать лучшее распределение в больших солидных опухолях с потенциально лучшей эффективностью. Юнитела выводятся из организма со скоростью, подобной цельным IgG4 антителам, и могут связываться с целевыми антигенами со сродством, подобным сродству цельных антител. Более подробное описание юнител можно найти в патентной заявке WO 2007/059782, которая включена в данное описание путем ссылки во всей ее полноте. Молекулы аффител представляют новый класс аффинных белков, основанных на домене белка длиной 58 остатков аминокислот, происходящем от одного из IgG-связывающихся доменов стафилококкового протеина А. Данный домен в виде связки трех спиралей используется в качестве платформы для конструирования комбинаторных библиотек фагемид, из которых могут быть выбраны варианты аффител, направленных на целевые молекулы, с использованием технологии показа фага (Nord K., Gunneriusson Е., Ringdahl J., Stahl S., Uhlen M., Nygren P.A., Binding proteins selected from combinatorial libraries ofJ. Biochem. 2002;269:2647-55.). Простая прочная структура молекул аффител в комбинации с их низкой молекулярной массой (6 кДа) делает их подходящими для широкого спектра применения, например в качестве реактивов (Ronmark J., Hansson M., Nguyen T., et al., Construction and characterization of affibodyFc chimeras produced in Escherichia coli, J. Immunol. Methods 2002; 261:199-211) для обнаружения и ингибирования взаимодействия рецептора (Sandstorm K., Xu Z., Forsberg G., Nygren P.A., Inhibition of theCD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003; 16:691-7). Более подробное описание аффител и способов их продуцирования можно найти в патенте США 5831012, который включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Меченные аффитела также могут быть пригодными для приложений, связанных с обработкой изображений с целью определения встречаемости изоформ.DARPin (Designed Ankyrin Repeat Proteins) представляет собой один из примеров миметического антитела DRP (Designed Repeat Protein), который разработан, чтобы использовать способности связывания полипептидов, которые не являются антителами. Повторяющиеся белки, такие как анкирин или богатые лейцином повторяющиеся белки, представляют собой встречающиеся повсюду молекулы со свойствами связывания, которые, в отличие от антител, встречаются в клетках и вне клеток. Особенностью их уникальной модульной архитектуры является повторение структурных единиц (повторы), которые складываются в связку, чтобы сформировать удлиненные повторные домены, демонстрирующие вариабельные и модульные поверхности связывания с мишенью. На основе такой модульной структуры могут быть сгенерированы комбинаторные библиотеки полипептидов с чрезвычайно разнообразной специфичностью связывания. Данная стратегия включает консенсусный дизайн самосовместимых повторов, демонстрирующих вариабельные внешние остатки, и их случайную сборку в повторяющиеся домены.DARPin могут быть продуцированы в бактериальных системах экспрессии с очень высокими выходами, и они принадлежат к наиболее устойчивым из известных белков. Были отобраны DARPin с высокой специфичностью и высоким сродством к широкому спектру целевых белков, в том числе человеческим рецепторам, цитокинам, киназам, человеческим протеазам, вирусам и белкам мембран. Могут быть получены DARPin, демонстрирующие значения сродства в интервале одного знака от наномолярного до пикомолярного.DARPin применяются в широком спектре областей, в том числе ELISA, сэндвичевый ELISA, анализ методом проточной цитометрии (FACS), иммуногистохимия (IHC), применение с микрочипами, аффинная очистка или Вестерн-блоттинг. Также оказалось, что DARPin чрезвычайно активны во внутриклеточном отсеке, например, как внутриклеточные маркерные белки, слитые с белком зеленой флуоресценции (GFP). Кроме того, DARPin применяли для ингибирования вход вирусов с IC50 в интервале пМ.DARPin идеальны не только для блокирования взаимодействия "белок-белок", но и для ингибирования ферментов. Протеазы, киназы и носители успешно ингибировались, чаще всего в аллостерическом режиме ингибирования. Очень быстрое и специфичное обогащение на опухоли и крайне благоприятное соотношение содержания в опухоли к содержанию в крови делают DARPin подходящими для диагно- 22018836 стики in vivo или терапевтических подходов. Дополнительная информация относительно DARPin и других технологий DRP может быть найдена в публикации патентной заявки США 2004/0132028 и публикации международной патентной заявкиWO 02/20565, обе из которых, таким образом, включены путем ссылки во всей их полноте. Антикалины (Anticalins) представляют собой дополнительную технологию миметиков антител, однако, в данном случае специфичность связывания происходит от липокалинов, семейства низкомолекулярных белков, которые природным образом обильно экспрессируются в тканях человека и жидкостях биологического происхождения. Липокалины in vivo принимают участие в широком спектре функций,связанных с физиологическим транспортом и хранением химически чувствительных или нерастворимых соединений. Липокалины содержат прочную внутреннюю структуру, включающую высококонсервативную 6-складчатую конформацию белка, которая поддерживает четыре петли на одном конце белка. Эти петли формируют вход в карман связывания и конформационные различия в данной части молекулы,ответственные за вариации в специфичности связывания между индивидуальными липокалинами. Хотя общая структура гипервариабельных петель, поддерживаемых консервативным -листовым каркасом, напоминает иммуноглобулины, липокалины значительно отличаются от антител размером,будучи составлены из одинарной цепи полипептида длиной 160-180 аминокислот, которая немного больше, чем одинарный домен иммуноглобулина. Липокалины клонировали и их петли подвергали конструированию с целью создания антикалинов. Сгенерированы библиотеки структурно различных антикалинов, и показ антикалина позволяет селекцию и скрининг функции связывания, с последующей экспрессией и продуцированием растворимого белка для дальнейшего анализа в прокариотных или эукариотных системах. Исследования успешно продемонстрировали, что могут быть созданы антикалины, которые являются специфичными фактически по отношению к любому белку-мишени человека, который может быть выделен, и могут быть получены значения сродства связывания в наномолярном интервале или выше. Антикалины также могут быть форматированы как белки с двойными мишенями, так называемые дуокалины. Дуокалин связывается с двумя отдельными терапевтическими мишенями в один легкопродуцированный мономерный белок с использованием стандартных производственных процессов, при сохранении целевой специфичности и сродства, независимо от структурной ориентации его двух доменов связывания. Модуляция множественных мишеней через единую молекулу особенно предпочтительна при заболеваниях, с доказанным участие более чем одного этиологического фактора. Кроме того, би- или поливалентные форматы связывания, такие как дуокалины, обладают значительным потенциалом с точки зрения нацеливания на молекулы поверхности клетки при заболевании, опосредованном агонистическими эффектами на пути преобразования сигнала или индуцированием усиленных эффектов интернализации посредством связывания и объединения в кластеры рецепторов на поверхности клетки. Кроме того, высокая внутренняя стабильность дуокалинов сравнима с мономерными антикалинами, что обеспечивает гибкость лекарственных форм и потенциал доставки для дуокалинов. Дополнительная информация относительно антикалинов может быть найдена в патенте США 7250297 и публикации международной патентной заявки WO 99/16873, обе из которых, таким образом,включены путем ссылки во всей их полноте. Другая технология миметиков антител, пригодная в контексте данного изобретения, представляет собой авимеры. Авимеры развились из большого семейства человеческих внеклеточных доменов рецепторов путем перестановки экзонов in vitro и показа фага, с генерацией многодоменных белков, обладающих свойствами связывания и ингибирования. Показано, что связывание множественных независимых доменов связывания создает авидность и приводит к улучшению сродства и специфичности по сравнению с обычными белками, связывающимися с одинарным эпитопом. Другие потенциальные преимущества включают простое и эффективное продуцирование полиспецифических (в отношении многих мишеней) молекул в Escherichia coli, улучшенную термостабильность и устойчивость к действию протеаз. Получены авимеры с суб-наномолярными значениями сродства в отношении разнообразных мишеней. Дополнительная информация относительно авимеров может быть найдена в публикациях патентных заявок США 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844,2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, все из которых,таким образом, включены ссылки во всей их полноте. Версатела (Versabodies) представляет собой другую технологию миметиков антитела, которая может применяться в контексте данного изобретения. Версатела представляет собой низкомолекулярные белки размером 3-5 кДа, содержащие 15% остатков цистеина, которые формируют платформу с высокой плотностью дисульфидных связей, заменяющую гидрофобное ядро, которое содержат типичные белки. Замена большого количества гидрофобных аминокислот, составляющих гидрофобное ядро, небольшим количеством дисульфидных связей приводит к образованию белка меньшего размера, с большими гидрофильными свойствами (меньшая степень агрегации и неспецифического связывания), более устойчивых к действию протеаз и нагревания, с меньшей плотностью эпитопов Т-клеток, поскольку остатки, которые в наибольшей степени способствуют представлению МНС, гидрофобны. Известно, что все четыре из этих свойств влияют на иммуногенность, и ожидают, что вместе они приведут к значительному снижению иммуногенности. Идея версател возникла из природных инъекционных биофармацевтических средств, вырабатываемых пиявками, змеями, пауками, скорпионами, улитками и анемонами, которые неожиданно продемонстрировали низкую иммуногенность. Начиная с выбранных семейств природных белков, с помощью дизайна и скрининга размер, гидрофобность, протеолитическая обработка антигена и плотность эпитопов были минимизированы до уровней намного ниже среднего для природных инъекционных белков. С учетом структуры версател, эти миметики антител обеспечивают многосторонний формат, который включает поливалентность, полиспецифичность, разнообразие механизмов регулирования периода полувыведения, модули, направленные на ткани, и отсутствие участка Fc антитела. Кроме того, версатела продуцируются в Е. coli с высоким выходом, и благодаря своей гидрофильности и небольшому размеру, версатела хорошо растворимы и могут быть введены в препараты в высоких концентрациях. Версатела являются исключительно устойчивыми к нагреванию (их можно кипятить) и обеспечивают длительный срок хранения. Дополнительная информация относительно версател может быть найдена в публикации патентной заявки США 2007/0191272, которая, таким образом, включена путем ссылки во всей ее полноте. Подробное описание технологий фрагментов антител и миметиков антитела, описанных выше, не является исчерпывающим перечнем всех технологий, которые могут применяться в контексте данного описания. Например, не ограничиваясь ими, разнообразные дополнительные технологии, включая альтернативные технологии на базе полипептидов, например, слияние определяющих комплементарность участков, как обрисовано в Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), которая, таким образом,включена путем ссылки во всей ее полноте, а также технологии на основе нуклеиновых кислот, например технологии аптамера (aptamer) РНК, описанные в патентах США 5789157, 5864026, 5712375,5763566, 6013443, 6376474, 6613526, 6114120, 6261774 и 6387620, все из которых, таким образом, включены путем ссылки, могут применяться в контексте данного изобретения. Физические свойства антител. Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть дополнительно охарактеризованы различными физическими свойствами анти-CXCR4 антител. Различные анализы могут применяться для обнаружения и/или дифференциации различных классов антител на основе таких физических свойств. В некоторых вариантах антитела в соответствии с данным изобретением могут содержать один или больше сайтов гликозилирования в вариабельном участке легкой или тяжелой цепи. Присутствие одного или больше сайтов гликозилирования в вариабельном участке может приводить к повышению иммуногенности антитела или изменению pK антитела за счет измененного связывания с антигеном (Marshall et(1985), Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol. Immunol. 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. Гликозилирование вариабельного участка может быть исследовано с использованием анализа Glycoblot, в котором антитело расщепляется с образованием Fab, с последующими анализами гликозилирования, с применением испытания, в котором измеряют окисление перйодатом и образование основания Шиффа. Альтернативно, гликозилирование вариабельного участка может быть исследовано с использованием световой хроматографии Dionex(DIONEX-LC), где сахариды отщепляются от Fab с образованием моносахаридов и анализом индивидуального содержания сахаридов. В некоторых случаях, предпочтительным будет анти-CXCR4 антитело, в котором отсутствует гликозилирование вариабельного участка. Это может быть достигнуто селекцией антител, не содержащих мотива гликозилирования в вариабельном участке, или мутацией остатков в пределах мотива гликозилирования с использованием стандартных методов, хорошо известных из уровня техники. В предпочтительном варианте антитела в соответствии с данным изобретением не содержат изомерии сайтов аспарагина. Дезамидирование или влияние изоаспарагиновой кислоты могут происходить на последовательностях N-G или D-G соответственно. Дезамидирование или влияние изоаспарагиновой кислоты приводят к образованию изоаспарагиновой кислоты, которая уменьшает стабильность антитела,создавая перекрученную структуру от боковой цепи карбоксиконца скорее, чем от основной цепи. Образование изоаспарагиновой кислоты может быть измерено с использованием количественного анализа изоформ, в котором используют обращенно-фазовую ВЭЖХ для проверки на изоаспарагиновую кислоту. Каждому антителу будет присуща уникальная изоэлектрическая точка (pI), но в общем антитела будут находиться в интервал рН от 6 до 9,5. pI для антитела IgG1 обычно находится в пределах интервала рН 7-9,5, и pI для антитела IgG4 обычно находится в пределах интервала рН 6-8. Антитела могут демонстрировать pI за пределами данного интервала. Хотя такой эффект в общем не доказан, существует гипотеза, что антитела с pI за пределами нормального интервала могут демонстрировать некоторое разворачивание и нестабильность в условиях in vivo. Изоэлектрическая точка может быть определена с использованием анализа методом капиллярного изоэлектрического фокусирования, в котором создается градиент рН и может применяться лазер, фокусирующийся для увеличения точности (Janini et al. (2002)Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001), Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al. (1998), J. Chromatogr A 800:355-67). В некоторых случаях предпочтительным будет анти-CXCR4 антитело со значением pI в рамках нормального интервала. Это может быть достигнуто селекцией антитела с pI в нормальном интервале или мутацией заряженных поверхностных остатков с использованием стандартных методов, хорошо известных из уровня техники. Температура плавления каждого антитела будет указывать на его термическую стабильность(Krishnamurthy R. and Manning M.C. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71). Более высокая термическая стабильность указывает на более высокую общую стабильность антитела in vivo. Температура плавления антитела может быть измерена с использованием таких методов, как дифференциальная сканирующая калориметрия (Chen et al. (2003) Pharm. Res. 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol. Lett. 68:47-52).TM1 показывает температуру начального разворачивания антитела. ТМ 2 показывает температуру полного разворачивания антитела. В общем, TM1 антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно превышает 60 С, предпочтительно превышает 65 С, даже более предпочтительно превышает 70 С. Альтернативно, термическая стабильность антитела может быть измерена с использованием дугового дихроизма (Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9). В предпочтительном варианте выбраны антитела, которые не подвергаются быстрому разложению. Фрагментация анти-CXCR4 антитела может быть измерена с использованием капиллярного электрофореза (СЕ) и MALDI-MC, как хорошо известно из уровня техники (Alexander A.J. and Hughes D.E. (1995)Anal. Chem. 67:3626-32). В другом предпочтительном варианте выбраны антитела, которые подвергаются минимальной агрегации. Агрегация может приводить к запуску нежелательной иммунной реакции и/или измененных или неблагоприятных фармакокинетических свойств. В целом, приемлемы антитела с агрегацией 25% или меньше, предпочтительно 20% или меньше, даже более предпочтительно 15% или меньше, даже более предпочтительно 10% или меньше и даже более предпочтительно 5% или меньше. Агрегация может быть измерена несколькими методами, хорошо известными из уровня техники, в том числе высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на эксклюзионной колонке (СЕК), с рассеиванием света для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров. Способы конструирования антител. Как обсуждалось выше, анти-CXCR4 антитела, содержащие последовательности VH и VK, раскрытые в данном описании, могут использоваться для создания новых анти-CXCR4 антител путем модификации последовательностей VH и/или VK, или присоединенного к ним константного участка(ков). Таким образом, в другом аспекте данного изобретения, используются структурные признаки анти-CXCR4 антитела в соответствии с данным изобретением, например F7, F9, D1 или Е 2, для создания структурно родственных анти-CXCR4 антител, которые сохраняют как минимум одно функциональное свойство антител в соответствии с данным изобретением, например, связывание с человеческим CXCR4. Например,один или больше участков CDR F7, F9, D1 или Е 2, или его мутации, могут быть объединены рекомбинантными методами с известными каркасными областями и/или другими участками CDR для создания дополнительных, рекомбинантно сконструированных анти-CXCR4 антител в соответствии с данным изобретением, как обсуждалось выше. Другие виды модификаций включают описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для способа конструирования служат одна или больше последовательностей VH и/или VK, предложенных в данном описании, или один или больше их участков CDR. Для создания сконструированного антитела нет необходимости фактически получать антитело (т.е. экспрессировать как белок), содержащее один или больше последовательностей VH и/или VK, предложенных в данном описании, или один или больше их участков CDR. Скорее, информация, содержащаяся в последовательности(ях), используется в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) "второго поколения", происходящих от оригинальной последовательности(ей), после чего получают последовательность(и) "второго поколения" и экспрессируют как белок. Соответственно, в другом варианте данного изобретения предлагается способ получения антиCXCR4 антитела, включающий:(a) обеспечение: (i) последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4, последовательность(ii) последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-16, последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-20, и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-24;(b) изменение как минимум одного остатка аминокислоты в пределах последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела и/или последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела для создания как минимум одной измененной последовательности антитела; и(c) экспрессия измененной последовательности антитела как белка. Стандартные методы молекулярной биологии могут применяться для получения и экспрессии измененной последовательности антитела. Предпочтительно антитело, кодируемое измененной последовательностью(ями) антитела, является таким, которое сохраняет один, некоторые или все функциональные свойства анти-CXCR4 антител, описанных в данном описании, где функциональные свойства включают, не ограничиваясь ими:(i) связывание с природным человеческим CXCR4, экспрессирующимся на поверхности клетки;(viii) ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro;(ix) ингибирование пролиферации опухолевых клеток и/или индуцирование апоптоза опухолевых клеток in vivo;(xi) увеличение продолжительности жизни субъекта с CXCR4+ опухолью. Функциональные свойства измененных антител могут быть оценены с использованием стандартных анализов, доступных из уровня техники и/или описанных в данном описании, таких как описанные в примерах (например, проточная цитометрия, анализы связывания, функциональные анализы). В некоторых вариантах способов конструирования антител в соответствии с данным изобретением мутации могут быть введены случайным образом или избирательно вдоль всей длины или части последовательности, кодирующей анти-CXCR4 антитело, и может быть проведен скрининг полученных модифицированных анти-CXCR4 антител на предмет активности связывания и/или других функциональных свойств, как описано в данном описании. Способы введения мутаций описаны в уровне техники. Например, Short в публикации РСТ WO 02/092780 описывает способы создания и скрининга мутаций антител с использованием мутагенеза насыщения, сборки синтетического лигирования или их комбинации. Альтернативно, в публикации РСТ WO 03/074679 Lazar et al. описывают способы применения вычислительных методов скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела в соответствии с данным изобретением. Другой аспект данного изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела в соответствии с данным изобретением. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в лизате клеток, или в частично очищенный или в существенной мере чистой форме. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "в существенной мере чистой", если она очищена от других компонентов клетки или других загрязняющих веществ, например, других нуклеиновых кислот или белков клетки, стандартными методами, в том числе, обработкой щелочью/натрия додецилсульфатом, бэндингом CsCI, колоночной хроматографией, электрофорезом на агарозном геле и другими способами, хорошо известными из уровня техники. See, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением может представлять собой, например, ДНК или РНК, и может содержать или не содержать интронных последовательностей. В предпочтительном варианте нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. Нуклеиновые кислоты в соответствии с данным изобретением могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Для антител, экспрессированных гибридомами (например, гибридомы, полученные от трансгенных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина, как подробнее описано ниже), молекулы кДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела, продуцированного гибридомой, могут быть получены стандартными техниками ПЦР амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулина (например, с использованием методов показа фага), нуклеиновая кислота, кодирующая такие антитела, может быть выделена из библиотеки генов. Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением представляют собой молекулы, кодирующие последовательности VH и VL моноклональных антител F7, F9, D1 и Е 2. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности VH F7, F9, D1 и Е 2, показаны в SEQ IDNO: 33-36, соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности VL F7, F9, D1 и Е 2, показаны в SEQ ID NO: 37-40, соответственно. Как только получены фрагменты ДНК, кодирующие сегменты VH и VL, с такими фрагментами ДНК можно производить дополнительные манипуляции стандартными методами рекомбинации ДНК, например, чтобы превратить гены вариабельных участков в гены цепи антитела с полной длиной, в гены Fab фрагмента или в ген scFv. В ходе таких манипуляций, фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, например, константный участок антитела или гибкий линкер. Термин "функционально связанный" в контексте данного изобретения означает, что два фрагмента ДНК соединяются таким образом, что последовательности аминокислот,- 26018836 кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания. Выделенная ДНК, кодирующая участок VH, может быть превращена в ген тяжелой цепи с полной длиной, путем функционального связывания ДНК, кодирующей VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (СН 1, СН 2 и СН 3). Последовательности генов константных участков тяжелой цепи человека известны из уровня техники (см., например, Kabat, E.A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие такие участки, могут быть получены стандартной ПЦР амплификацией. Константный участок тяжелой цепи может представлять собой константный участок IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но, наиболее предпочтительно, представляет собой константный участок IgG1 или IgG4. Для гена тяжелой цепи фрагмента Fab кодирующая VH ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок тяжелой цепи СН 1. Выделенная ДНК, кодирующая участок VL, может быть превращена в ген легкой цепи с полной длиной (а также ген легкой цепи Fab), путем функционального связывания кодирующей VL ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи, CL. Последовательности генов константных участков легкой цепи человека известны из уровня техники (см., например, Kabat, E.A., et al.Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие такие участки, могут быть получены стандартной ПЦР амплификацией. В предпочтительных вариантах константный участок легкой цепи может представлять собой константный участок каппа или лямбда. Чтобы создать ген scFv, кодирующие VH и VL фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим последовательность аминокислот(Gly4-Ser)3, таким образом, что последовательности VH и VL могут экспрессироваться как непрерывный одноцепочечный белок, с участками VL и VH, соединенными гибким линкером (см., например, Bird et al.(1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,(1990) Nature 348:552-554). Продуцирование моноклональных антител в соответствии с данным изобретением. Моноклональные антитела (mAb) в соответствии с данным изобретением могут быть продуцированы разнообразными способами, в том числе традиционной для моноклональных антител методологией,например, стандартная техника гибридизации соматических клеток Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Хотя методики гибридизации соматических клеток предпочтительны, в принципе, могут применяться другие способы продуцирования моноклонального антитела, например, вирусная или антигенная трансформация В-лимфоцитов. Предпочтительной животной системой получения гибридом являются мыши. Продуцирование гибридомы мышью представляет собой лучше всего изученную методику. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны из уровня техники. Партнеры для слияния (например, клетки миеломы мышей) и методики слияния также известны. Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены на основе последовательности нечеловеческого моноклонального антитела, полученного, как изложено выше. ДНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, может быть получена из нечеловеческой целевой гибридомы и сконструирована таким образом, чтобы включать последовательности не мышиного (например, человеческого) иммуноглобулина с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Например, для создания химерное антитело, мышиные вариабельные участки могут быть соединены с человеческими константными участками с помощью способов, известных из уровня техники (см., например, патент США 4816567, выданный Cabilly et al.). Для создания гуманизированного антитела мышиные участки CDR могут быть вставлены в человеческий каркас с использованием способов, известных из уровня техники (см., например, патент США 5,225,539, выданныйWinter, и патенты США 5530101; 5585,89; 5,693,762 и 6,180,370, выданные Queen et al.). В предпочтительном варианте антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела, направленные против CXCR4, могут быть сгенерированы скорее с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, чем обычных мышей. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, которые в данном описании носят название HuMAbMouseи KM Mouse , соответственно, и здесь и в дальнейшем совокупно обозначаются как "мыши с человеческим Ig".HuMAb Mouse(Medarex , Inc.) содержит мини-локусы гена человеческого иммуноглобулина,которые кодируют не перестроенные последовательности тяжелой ( и ) и легкойцепей иммуноглобулина человека, вместе с целенаправленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы цепии(см., например, Lonberg, et al. (1994) Nature 168(6474): 856-859). Соответственно, у мышей наблюдается сниженная экспрессия мышиного IgM или , и в ответ на иммунизацию, введенные трансгены тяжелой и легкой цепи человека подвергаются переключению класса и соматической мутации для генерации человеческих моноклональных антител IgGK с высоким сродством (Lonberg, N. et al. (1994),выше; обзор в Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. andHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, и Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Получение и использование HuMAb Mouse , а также модификации генома, которые несут такие мыши, дополнительно описаны в Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen,J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:37203724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al.(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; and Fishwild,D. et al. (1996) Nature Biotechnology. 14: 845-851, содержание всех из которого, таким образом, конкретно включено путем ссылки во всей их полноте. См. также патенты США 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 и 5,770,429; все выданы Lonberg и Kay; патент США 5,545,807, выданный Surani et al.; публикации РСТ WO 92/03918, WO 93/12227,WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962, все Lonberg и Kay; и публикацию РСТ WO 01/14424, Korman et al. В другом варианте человеческие антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены с использованием мыши, которая несет последовательности иммуноглобулина человека на трансгенах и трансхромосомах, например, мышь, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Такая мышь здесь и в дальнейшем носит название "KM mouse " и подробно описана Ishida et al. в публикации РСТ WO 02/43478. Кроме того, альтернативные трансгенные животные системы, экспрессирующие человеческие гены иммуноглобулина, доступны из уровня техники и могут использоваться для получения анти-CXCR4 антител в соответствии с данным изобретением. Например, можно использовать альтернативную трансгеную систему, которая носит название Xenomouse (Abgenix, Inc.); такие мыши описаны, например, в патентах США 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, выданных Kucherlapati et al. Кроме того, альтернативные трансхромосомные животные системы, экспрессирующие человеческие гены иммуноглобулина, доступны из уровня техники и могут применяться для получения и антиCXCR4 антител в соответствии с данным изобретением. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так и трансхромосому человеческой легкой цепи,которые носят название "мыши ТС"; такие мыши описаны в Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. США 97:722-727. Кроме того, коровы, несущие трансхромосомы человеческих тяжелой и легкой цепей,(например, Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 и заявка РСТ WO 2002/092812) описаны в уровне техники и могут быть использованы для получения анти-CXCR4 антител в соответствии с данным изобретением. Человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением могут также быть получены с использованием способов показа фага для скрининга библиотек человеческих генов иммуноглобулина. Такие способы показа фага для выделения человеческих антител описаны в уровне техники. См., например, патенты США 5223409; 5403484 и 5571698, выданные Ladner et al.; патенты США 542908 и 5580717, выданные Dower et al.; патенты США 5969108 и 6172197, выданныеMcCafferty et al.; и патенты США 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, выданные Griffiths et al. Человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением также могут быть получены с использованием мышей SCID, которым человеческие иммунные клетки пересажены таким образом, что реакция в виде человеческих антител может быть получена в результате иммунизации. Такие мыши описаны, например, в патентах США 5476996 и 5698767, выданных Wilson et al. В особенно предпочтительном варианте человеческие анти-CXCR4 антитела получают с использованием комбинации техник мыши с человеческим Ig и показа фага, как описано Buechler et al. в патенте США 6794132. Более конкретно способ сначала включает стимулирование реакции в виде анти-CXCR4 антител у мыши с человеческим Ig (например, мышь HuMab или мышь KM, как описано выше), путем иммунизации мыши антигеном CXCR4, с последующим выделением нуклеиновых кислот, кодирующих цепи человеческого антитела, из лимфатических клеток мыши, и введением полученных нуклеиновых кислот в вектор для показа (например, фаг), чтобы обеспечить библиотеку пакетов для показа. Таким образом, каждый член библиотеки содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую цепь человеческого антитела, и каждая цепь антитела показана в пакетах для показа. Далее осуществляют скрининг библиотеки с антигеном CXCR4 для выделения членов библиотеки, которые специфично связываются сCXCR4. Вставки нуклеиновых кислот отобранных членов библиотеки далее выделяют и секвенируют стандартными способами для определения вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепи отобранных молекул, которые связываются с CXCR4. Вариабельные участки могут быть превращены в цепи антитела с полной длиной стандартными методами рекомбинации ДНК, такими как клонирование вариабельных участков в вектор экспрессии, который несет константные участки человеческой тяжелой и легкой цепи, таким образом, что участок VH функционально связан с участком СН, и участок VL функционально связан с участком CL. Дальнейшее описание получения человеческих анти-CXCR4 антител с использованием данной комбинированной трансгенной системы мыши/показа фага см. в примере 1. Иммунизация мышей с человеческим Ig. Если мышей с человеческим Ig используют для получения человеческих антител в соответствии с данным изобретением, такие мыши могут быть иммунизированы очищенным или обогащенным препаратом антигена CXCR4 и/или рекомбинантного CXCR4, или клеток, экспрессирующих CXCR4, или слитого белка CXCR4, как описано Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al.(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; а также в публикациях РСТ WO 98/24884 и WO 01/14424. Предпочтительно возраст мышей на момент первой инфузии составляет 6-16 недель. Например, очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена CXCR4 может применяться для внутрибрюшинной иммунизации мышей с человеческим Ig. Наиболее предпочтительно иммуногенное средство, используемое для получения антител в соответствии с данным изобретением, включает человеческий CXCR4 в его природной конформации в пределах мембраны, не ограничивающие примеры которого включают клетки, трансфицированные таким образом, чтобы экспрессировать CXCR4 на поверхности клетки, клетки,которые природным образом экспрессируют CXCR4 (например, клетки СЕМ), и искусственные мембраны (например, липосомы), в которые инкорпорирован CXCR4, например магнитные протеолипосомы(MPL), в которые инкорпорирован CXCR4 (описаны далее в примере 1). Подробные методики генерирования полностью человеческих моноклональных антител противCXCR4 описаны в примере 1 ниже. Совокупный опыт в отношении различных антигенов показал, что трансгенные мыши реагируют при начальной внутрибрюшинной иммунизации (в/б) антигеном в полном адъюванте Фрейнда, с последующей в/б иммунизацией каждую вторую неделю (до общего срока 6 недель) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Однако, обнаружено, что эффективны также другие адъюванты, кроме адъюванта Фрейнда. Кроме того, обнаружено, что цельные клетки в отсутствие адъюванта обладают высокой степенью иммуногенности. Иммунная реакция может контролироваться в ходе протокола иммунизации с помощью образцов плазмы, полученных ретроорбитальным забором крови. Может быть осуществлен скрининг плазмы методом ELISA (как описано ниже), и мыши с достаточным титром человеческого анти-CXCR4 иммуноглобулина могут использоваться для слияния. Реакцию у мышей можно усиливать внутривенным введением антигена за 3 дня перед забоем и извлечением селезенки. Ожидается, что может возникнуть необходимость в проведении 2-3 слияний для каждой иммунизации. От 6 до 24 мышей обычно иммунизируют для каждого антигена. Обычно используют породы НСо 7 и НСо 12. Кроме того, как НСо 7, так и НСо 12 трансгены могут быть воспроизведены вместе в одной мыши, несущей два различных трансгена человеческий тяжелой цепи (НСо 7/НСо 12). Альтернативно или дополнительно, можно использовать породу Mouse KM, как описано в примере 1. Генерация гибридом, вырабатывающих человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением. Для генерации гибридом, вырабатывающих человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением, спленоциты и/или клетки лимфатического узла иммунизированных мышей могут быть выделены и слиты с подходящей бессмертной линией клеток, например линия клеток миеломы мыши. Для полученных гибридом может быть осуществлен скрининг на предмет выработки специфических в отношении антигена антител. Например, суспензии единичных клеток селезеночных лимфоцитов от иммунизированных мышей могут быть слиты с 1/6 количества несекретирующих клеток миеломы мыши P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) с 50 % ПЭГ. Альтернативно, суспензия единичных клеток селезеночных лимфоцитов от иммунизированных мышей может быть слита с применением способа электрослияния на основе электрического поля, с использованием большой камеры для слияния клеток электропоратора CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). Клетками покрывают планшет для микротитрования с плоским дном (плотность приблизительно 2105), с последующей инкубацией на протяжении двух недель в селективной среде, содержащей 20% эмбриональной сыворотки клона, 18% кондиционированной среды "653", 5% оригена (origen, IGEN), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ натрия пирувата,5 мМ HEPES, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицины и 1X гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT, Sigma; HAT добавляют через 24 ч после слияния). По прохождении приблизительно двух недель клетки можно культивировать в среде, где HAT заменен на гипоксантин-тимидин (НТ). Далее может быть проведен скрининг методом ELISA для отдельных лунок на предмет человеческих моноклональных антител IgM и IgG. Как только происходит экстенсивный рост гибридомы, за средой можно вести наблюдение как обычно, по прохождении 10-14 дней. Секретирующими антитело гибридомами могут быть повторно покрыты планшеты, с повторным скринингом, и если результаты для человеческого IgG по-прежнему положительные, моноклональные антитела могут быть субклонированы как минимум дважды путем ограничивающего разведения. Стабильные субклоны далее могут быть культивированы in vitro для генерации небольших количеств антитела в среде для культивирования тканей с целью характеристики. Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы можно выращивать в роллерных колбах объемом 2 л для очистки моноклональных антител. Супернатант можно фильтровать и концентрировать перед аффинной хроматографией протеин А-сефарозой (Pharmacia, Piscataway, N.J.).