Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение

ВЫДЕЛЕННОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ УЧАСТОК, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ПРОТЕИНТИРОЗИНКИНАЗОЙ 7 ( PTK7) ЧЕЛОВЕКА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение включает выделенные моноклональные антитела, в частности человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с PTK7 с высокой аффинностью. Также предусматриваются нуклеотидные молекулы, кодирующие антитела по изобретению,векторы экспрессии, клетки-хозяева и способы экспрессирования антител по изобретению. Также охватываются иммуноконъюгаты, биспецифические молекулы и фармацевтические композиции,содержащие антитела по изобретению. Также изобретение включает способы обнаруженияPTK7 и способы лечения различных заболеваний, включая рак и инфекционные заболевания, с применением антител против PTK7. Предпосылки создания изобретения Рецепторные тирозинкиназы (РТК, RTK) представляют собой трансмембранные передающие сигналы белки, которые передают биологические сигналы из внеклеточной среды внутрь клетки. Регуляция РТК сигналов важна для регуляции клеточного роста, дифференцировки, аксонного роста, эпителиального роста, развития, адгезии, миграции и апоптоза клеток (Prenzel et al. (2001), Endocr. Relat. Cancer. 8: 1131; Hubbard and Till (2000), Annu. Rev. Biochem. 69: 373-98). Известно, что РТК участвуют в развитии и прогрессировании некоторых форм рака. В большинстве РТК-связанных форм рака наблюдается скорее амплификация рецепторного белка, нежели мутация гена (Kobus and Fleming (2005), Biochemistry. 44: 1464-70). Протеинтирозинканаза 7 (PTK7), член семейства рецепторных протеинтирозинкиназ, впервые была выделена из нормальных человеческих меланоцитов и клонирована методом RT-ПЦР (Lee et al. (1993),Oncogene. 8: 3403-10; Park et al. (1996), J. Biochem. 119: 235-9). Отдельно клонировали ген из клеточной линии карциномы толстой кишки человека и назвали киназой карциномы толстой кишки 4 (CCK4)(Mossie et al. (1995), Oncogene. 11: 2179-84). PTK7 относится к субпопуляции РТК (RTK), в которых отсутствует детектируемая тирозинкиназная активность, но сохраняется активность сигнальной трансдукции, и полагают, что она, вероятно, функционирует как молекула клеточной адгезии. Найдено, что мРНК для PTK7 вариабельно экспрессируется в клеточных линиях карциномы толстой кишки, но е экспрессия не обнаружена во взрослых тканях толстой кишки человека (Mossie et al.,supra). Экспрессия PTK7 также наблюдалась в линиях клеток меланомы и при биопсии меланомы (Easty,et al. (1997), Int. J. Cancer. 71: 1061-5). Найдено, что альтернативная сплайсированная форма экспрессируется в клетках гепатом и клетках карциномы толстой кишки (Jung et al. (2002), Biochim Biophys Acta. 1579: 153-63). Найдено, кроме того, что PTK7 в высокой степени сверхэкспрессирует в образцах острого миелоидного лейкоза (Muller-Tidow et al. (2004), Clin. Cancer Res. 10: 1241-9). С помощью иммуногистохимии опухолеспецифическое окрашивание PTK7 наблюдали при раке молочной железы, толстой кишки, лгкого, поджелудочной железы, почки и мочевого пузыря, как описано в опубликованной заявкеPCT WO 04/17992. Поэтому необходимы агенты, распознающие PTK7, и способы применения таких агентов. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает выделенные моноклональные антитела, в частности человеческие моноклональные антитела, которые связываются с PTK7 и проявляют нужные различные свойства. Эти свойства включают высокоаффинное связывание с человеческой PTK7 и связывание с клетками опухоли Вильмса (нефробластомы). Также охватываются способы лечения различных заболеваний, опосредуемых PTK7, с применением антител и композиций по изобретению. В одном аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку (фрагменту), отличающемуся тем, что это антитело:(б) связывается с клетками линии опухоли Вильмса (ATCC Acc No. CRL-1441). Предпочтительно антитело является человеческим антителом, хотя альтернативные варианты изобретения могут представлять собой мышиное антитело, химерное антитело или "гуманизированное" антитело. В более предпочтительных вариантах изобретения антитело связывается с клетками опухоли Вильмса с ЕС 50 4,0 нМ или менее или антитело связывается с клетками опухоли Вильмса с ЕС 50 3,5 нМ или менее. В другом варианте изобретения антитело связывается с линией раковых клеток, выбранной из группы, состоящей из А-431 (ATCC Acc No. CRL-1555), Saos-2 (ATCC Acc No. HTB-85), SKOV-3(ATCC Acc No. CCL-229) и MIA PaCa-2 (ATCC Acc No. CRL-1420) клеточных линий. В другом варианте данное изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), отличающееся тем, что это антитело перекрстно конкурирует за связывание с PTK7 с эталонным антителом, причм эталонное антитело:(б) связывается с клетками линии опухоли Вильмса (ATCC Acc No. CRL-1441). В различных вариантах изобретения эталонное антитело включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 5; или эталонное антитело включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность или эталонное антитело включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 7; или эталонное антитело включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 8; или эталонное антитело включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 9; или эталонное антитело включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 10. В одном аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована из человеческого VH 3-30.3 гена, причм антитело специфически связывает PTK7. Изобретение также включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована из человеческого VH DP44 гена, причм антитело специфически связывает PTK7. Изобретение также включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована из человеческого VH 3-33 гена, причм антитело специфически связывает PTK7. Изобретение далее включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована из человеческого VK L-15 гена, причм антитело специфически связывает PTK7. Изобретение далее включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована из человеческого VK A-10 гена, причм антитело специфически связывает PTK7. Изобретение далее включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована из человеческого VK A-27 гена, причм антитело специфически связывает PTK7. Изобретение далее включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована из человеческого VK L-6 гена, причм антитело специфически связывает PTK7. Предпочтительная комбинация включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 15;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 19;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 23;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 29;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 35. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 15;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 19;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 24;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 30;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 36. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 12;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 16;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 20;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 25;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 31;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 37. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 13;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 21;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 26;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 32;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 38. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 13;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 21;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 27;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 33;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 39. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 14;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 18;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 22;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 28;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 34;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 40. Другие предпочтительные антитела по изобретению, или их антигенсвязывающие участки включают в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 5. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 6. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 7. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 8. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 9. Другая предпочтительная комбинация включает в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 10. Антитела по изобретению могут представлять собой, например, полноразмерные антитела, например IgG1 или IgG4 изотипа. Или же антитела могут представлять собой фрагменты антитела, такие какFab или Fab'2 фрагменты. Изобретение также включает биспецифическую молекулу, содержащую антитело или его антигенсвязывающий участок, связанное(ый) со вторым функциональным фрагментом, обладающим специфичностью связывания, отличную от специфичности связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего участка. Также охватываются композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий участок, или иммуноконъюгат, или биспецифическое соединение по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Нуклеотидные молекулы, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие участки, по изобретению также охватываются данным изобретением, так же как векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы экспрессии. Кроме того, изобретение включает трансгенную мышь, содержащую трансгены тяжлой и лгкой цепей человеческих иммуноглобулинов, отличающуюся тем, что эта мышь экспрессирует антитело по изобретению, а также гибридомы,полученные из такой мыши, причм гибридомы продуцируют антитело по изобретению. Ещ в одном аспекте изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося ростом опухолевых клеток, экспрессирующих PTK7, заключающийся во введении субъекту антитела или его антигенсвязывающего участка по изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения заболевания. Заболевание может представлять собой, например, рак, например, толстой кишки (включая рак тонкого кишечника), рак лгкого, рак молочной железы,рак поджелудочной железы, меланому (например, метастатическую злокачественную меланому), острый миелоидный лейкоз, рак почки, рак мочевого пузыря, рак яичника и рак предстательной железы. В предпочтительном варианте изобретение включает способ лечения рака in vivo с применением антитела против PTK7. Антитело против PTK7 может представлять собой мышиное, химерное, "гуманизированное" или человеческое антитело. Примеры других раковых заболеваний, которые можно лечить,используя способы по изобретению, включают почечный рак (например, почечно-клеточный рак), глиобластому, опухоли мозга, хронические или острые лейкозы, включая острый лимфоцитарный лейкоз(ОЛЛ, ALL), T-клеточный лейкоз взрослых (T-ОЛЛ, T-ALL), хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфомы (например, лимфома Ходжкина и неходжкинская лимфома, лимфоцитарная лимфома, первичная лимфома ЦНС, лимфома Беркитта, анапластические крупноклеточные лимфомы (ALCL), нодулярные лимфомы из малых клеток с расщепленным ядром, периферические T-клеточные лимфомы, лимфомы Леннерта, иммунобластные лимфомы, Tклеточный(ые) лейкоз/лимфомы (ATLL), центробластно-центроцитарные (cb/cc) фолликулярные лимфомы, диффузные крупноклеточные B-клеточные лимфомы, T-клеточная лимфома типа ангиоиммунобластной лимфаденопатии (AILD) и связанные с ВИЧ лимфомы полости тела), эмбриональные карциномы,недифференцированные карциномы носоглотки (например, опухоль Шминке), болезнь Кастльмана, саркому Капоши, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрома и другие B-клеточные лимфомы, назофарингеальные карциномы, рак кости, рак кожи, рак головы и шеи, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак матки, ректальный рак, анальный рак, рак желудка, рак яичек,карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища,карциному вульвы, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак околощитовидной железы, саркому мягкой ткани, рак уретры, рак пениса, солидные опухоли у детей, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному почечной лоханки, новообразование ЦНС, ангиогенез опухоли, опухоль позвоночника, глиому ствола мозга, аденому гипофиза, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, раковые заболевания, вызванные загрязнением окружающей среды,включая рак, вызванный асбестозом, например мезотелиому, и комбинации указанных раковых заболеваний. Другие признаки и преимущества данного изобретения будут ясны из нижеприведнного подробного описания и примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылочных материалов, данных в GenBank, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых по всему изобретению, однозначно вводится в данное описание в качестве ссылки. Краткое описание чертежей На фиг. 1A показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 41) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) вариабельной области тяжлой цепи человеческих моноклональных антител 3G8 и 3G8a. Определены области (границы областей) CDR1 (SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 15) и CDR3 (SEQ ID NO: 19) и указано происхождение V, D и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 1 В показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 45) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 5) вариабельной области лгкой цепи человеческого моноклонального антитела 3G8. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) и CDR3 (SEQ ID NO: 35) и указано происхождение V и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 1 С показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 46) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) вариабельной области лгкой цепи человеческого моноклонального антитела 3G8a. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 30) и CDR3 (SEQ ID NO: 36) и указано происхождение V и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 2 А показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 42) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 4D5. Определены области (показаны области) CDR1 (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 16) и На фиг. 2 В показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 47) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7) вариабельной области лгкой цепи человеческого моноклонального антитела 4D5. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 31) и CDR3 (SEQ ID NO: 37) и указано происхождение V и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 3 А показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 43) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) вариабельной области тяжлой цепи человеческих моноклональных антител 12 С 6. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) и CDR3 (SEQ ID NO: 21) и указано происхождение V, D и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 3 В показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 48) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) вариабельной области лгкой цепи человеческого моноклонального антитела 12 С 6. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 32) и CDR3 (SEQ ID NO: 38) и указано происхождение V и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 3 С показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 49) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9) вариабельной области лгкой цепи человеческого моноклонального антитела 12 С 6 а. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 33) и CDR3(SEQ ID NO: 39) и указано происхождение V и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 4 А показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 44) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 7 С 8. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) и CDR3(SEQ ID NO: 22) и указано происхождение V, D и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 4 В показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 50) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 10) вариабельной области лгкой цепи человеческого моноклонального антитела 7 С 8. Определены области CDR1 (SEQ ID NO: 28), CDR2 (SEQ ID NO: 34) и CDR3(SEQ ID NO: 40) и указано происхождение V и J сегментов зародышевой линии. На фиг. 5 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжлой цепи 3G8 (SEQ ID NO: 1) и 3G8a (SEQ ID NO: 1) с аминокислотной последовательностью(SEQ ID NO: 51) VH 3-30.3 человеческой зародышевой линии (зародышевая линия JH4b раскрывается какSEQ ID NO: 59). На фиг. 6 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области тяжлой цепи 4D5 (SEQ ID NO: 2) с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 51) VH 3-30.3 человеческой зародышевой линии (зародышевая линия JH4b раскрывается как SEQ ID NO: 60). На фиг. 7 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжлой цепи 12 С 6 (SEQ ID NO: 3) и 12 С 6 а (SEQ ID NO: 2) с аминокислотной последовательностью(SEQ ID NO: 52) VH DP44 человеческой зародышевой линии (зародышевые линии 3-7, 3-23 и JH4b раскрываются как SEQ ID NO: 61-63 соответственно). На фиг. 8 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области тяжлой цепи 7C8 (SEQ ID NO: 4) с аминокислотной последовательностью человеческой зародышевой линии VH 3-30.3 (SEQ ID NO: 53) (зародышевая линия JH6b раскрывается как SEQ ID NO: 64). На фиг. 9 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей лгкой цепи 3G8 (SEQ ID NO: 5) и 3G8a (SEQ ID NO: 6) с аминокислотной последовательностью человеческой зародышевой линии VK L15 (SEQ ID NO: 54) (зародышевая линия JK1 раскрывается какSEQ ID NO: 65). На фиг. 10 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи 4D5 (SEQ ID NO: 7) с аминокислотной последовательностью человеческой зародышевой линииV A10 (SEQ ID NO: 55) (зародышевая линия JK5 раскрывается как SEQ ID NO: 66). На фиг. 11 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи 12 С 6 (SEQ ID NO: 8) с аминокислотной последовательностью человеческой зародышевой линии VK A27 (SEQ ID NO: 56) (зародышевая линия JK2 раскрывается как SEQ ID NO: 67). На фиг. 12 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи 12 С 6 а (SEQ ID NO: 9) с аминокислотной последовательностью человеческой зародышевой линии VK L15 (SEQ ID NO: 54) (зародышевая линия JK2 раскрывается как SEQ ID NO: 68). На фиг. 13 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи 7C8 (SEQ ID NO: 10) с аминокислотной последовательностью человеческой зародышевой линии VK L6 (SEQ ID NO: 57) (зародышевая линия JK3 раскрывается как SEQ ID NO: 69). На фиг. 14 показаны результаты экспериментов по проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело 7 С 8 против человеческой PTK7 связывается с клеточной поверхностью клеток HEK3, трансфицированных с помощью полноразмерной человеческой PTK7. На фиг. 15 показаны результаты экспериментов ELISA, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против человеческой PTK7 специфически связываются с PTK7. На фиг. 16 показаны результаты экспериментов по проточной цитометрии, демонстрирующие, что антитела против человеческой PTK7 связываются с клеточной поверхностью клеток опухоли Вильмса. На фиг. 17 показаны результаты экспериментов по проточной цитометрии, демонстрирующие, что антитела против человеческой PTK7 связываются с клеточной поверхностью линии раковых клеток. На фиг. 18 показаны результаты экспериментов по проточной цитометрии, демонстрирующие, что антитела против человеческой PTK7 связываются с клеточной поверхностью дендритных клеток. На фиг. 19 показаны результаты экспериментов по проточной цитометрии, демонстрирующие, что антитела против человеческой PTK7 связываются с CD4+ и CD8+ T-лимфоцитами, но не с B-лимфоцитами. На фиг. 20 показаны результаты экспериментов по интернализации HumZap, демонстрирующие,что человеческие моноклональные антитела против человеческой PTK7 можно интернализовать в PTK7+ клетки:(А) интернализация человеческих антител 3G8, 4D5 и 7 С 8 в клетки опухоли Вильмса;(В) интернализация человеческого антитела 12 С 6 в клетки опухоли Вильмса;(С) интернализация человеческих антител 7 С 8 и 12 С 6 в опухолевые клетки А-431;(D) интернализация человеческих антител 7 С 8 и 12 С 6 в опухолевые клетки PC3. На фиг. 21 показаны результаты анализа клеточной пролиферации, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела против PTK7 убивают человеческие клеточные линии рака почки. На фиг. 22 показаны результаты анализа клеточной пролиферации, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела против PTK7 убивают линии клеток,экспрессирующих PTK7 с уровнями экспрессии от низкого до высокого. На фиг. 23 показаны результаты инвазивного анализа, демонстрирующие, что антитела противPTK7 ингибируют инвазивную подвижность клеток, экспрессирующих PTK7 на клеточной поверхности. На фиг. 24 показаны результаты in vivo исследования опухолевого ксенотрансплантата, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином антитела против PTK7 замедляют прогрессирование опухоли в клетках поджелудочной железы. На фиг. 25 показаны результаты in vivo исследования опухолевого ксенотрансплантата, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином антитела против PTK7 замедляют прогрессирование опухоли в клетках молочной железы. Подробное описание изобретения В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности к человеческим моноклональным антителам, которые связываются с PTK7. В некоторых вариантах изобретения антитела по изобретению проявляют одно или более требуемых свойств, таких как высокоаффинное связывание с PTK7 и способность ингибировать рост опухолевых клеток in vitro или invivo. В некоторых вариантах изобретения антитела по изобретению имеют особые структурные признаки, такие как CDR области, содержащие конкретные аминокислотные последовательности. Изобретение включает выделенные антитела, способы получения таких антител, иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы (соединения), содержащие такие антитела, и фармацевтические композиции, содержащие антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические соединения (молекулы) по изобретению. Изобретение относится также к способам применения антител, например, для лечения заболеваний, таких как рак. Для того чтобы было легче понять настоящее изобретение, сначала даются определения некоторых терминов. Дополнительные определения даются по всему описанию. Термины "PTK7" и "CCK4" применяются взаимозаменяемо (поочердно) и включают варианты,изоформы и гомологи человеческой PTK7. Соответственно, человеческие антитела по изобретению могут, в некоторых случаях, перекрстно реагировать с PTK7 других видов, отличных от человеческого. В некоторых вариантах изобретения антитела могут быть абсолютно специфическими к одной или более человеческих PTK7 и могут не проявлять разновидностей или других типов перекрстной реактивности с белками PTK7 нечеловеческого происхождения. Полная аминокислотная последовательность типичной человеческой PTK7 имеет в Genbank регистрационный номер NM002821 (SEQ ID NO: 58). Термин "иммунный ответ" ("иммунная реакция") относится к действию, например, лимфоцитов,антиген-презентирующих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимым макромолекулам,продуцируемым вышеуказанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент),что приводит к селективному поражению, деструкции или удалению из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случае аутоиммунного или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей."Путь сигнальной трансдукции" относится к биохимической зависимости между различными молекулами сигнальной трансдукции в системе сигнальной трансдукции, которые участвуют в передаче сигнала от одного участка клетки к другому участку клетки. Выражение "поверхностный клеточный рецептор" по данному описанию включает, например, молекулы и комплексы молекул, способных получать сигнал и передавать такой сигнал через плазматическую клеточную мембрану. Примером "поверхностного клеточного рецептора" по настоящему изобретению является рецептор PTK7. Термин "антитело" в данном описании включает целые антитела и его любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающий участок") или одиночные цепи. "Антитело" относится к гликопро-6 017812 теину, содержащему по меньшей мере две тяжлые (Н) и две лгкие (L) цепи, соединнные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий участок. Каждая тяжлая цепь состоит из вариабельной области тяжлой цепи (в данном описании изображается аббревиатурой VH) и константной области тяжлой цепи. Константная область тяжлой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая лгкая цепь состоит из вариабельной области лгкой цепи (в данном описании изображается аббревиатурой VL) и константной области лгкой цепи. Константная область лгкой цепи состоит из одного доменаCL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (гипервариабельными участками или областями) (CDR), рассеянными между более консервативными областями, называемыми каркасными (остовными, скелетными) областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трх CDR и четырх FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжлой и лгкой цепей содержат связывающий домен (домен связывания), который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные ткани иммунной системы (например, эффекторные клетки), первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Термин "антигенсвязывающий участок (фрагмент)" антитела (или просто "участок (фрагмент) антитела") по данному описанию относится к одному или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, PTK7). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающий участок" антитела, включают(i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VH, VL, CL и CH1; (ii) F(ab')2 фрагмент,двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iiii) Fab' фрагмент, который практически представляет собой Fab с участком шарнирной области (см. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) Fd фрагмент, состоящий из VH и CH1 доменов; (v) Fv фрагмент, состоящий из VL и VH доменов единичной области (плеча) антитела; (vi) dAb фрагмент (Ward et al. (1989), Nature. 341: 544-546), который состоит из VH домена;(vii) выделенную гипервариабельную область (CDR) и (viii) нанотело, вариабельную область тяжлой цепи, содержащую один вариабельный домен и два константных домена. Кроме того, хотя два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны с помощью методов рекомбинантной ДНК синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH соединяются, образуя одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988), Science. 242: 423-426 и Huston et al. (1988), Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 85: 5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающий участок (фрагмент)" антитела. Эти фрагменты антитела получают обычными методами, известными специалистам в данной области техники, и эти фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же образом, как интактные антитела. Предполагается, что "выделенное антитело" по данному описанию относится к антителу, практически свободному от других антител, обладающих другими антигенными специфичностями (например,выделенное антитело, которое специфически связывает PTK7, практически не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от PTK7). Выделенное антитело, которое специфически связывает PTK7, может, однако, проявлять перекрстную реактивность (кросс-реактивность) к другим антигенам, таким как молекулы PTK7 другого вида. Кроме того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ. Термин "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" по данному описанию относится к препарату молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела проявляет общую (единую) специфичность и аффинность связывания с конкретным эпитопом. Предполагается, что термин "человеческое антитело" по данному описанию включает антитела, содержащие различные области, в которых как каркасные, так и CDR области образованы из иммуноглобулиновых последовательностей человеческой зародышевой линии. Кроме того, если антитело содержит константную область, эта константная область также образована из иммуноглобулиновых последовательностей человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями человеческой зародышевой линии (например, мутации, вводимые случайным или сайт-специфическим мутагенезом invitro или соматической мутацией in vivo). Однако не предполагается, что термин "человеческое антитело" по данному описанию включает антитела, в которых последовательности CDR из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, "прививают" на человеческие каркасные последовательности. Термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, проявляющим единичнуюCDR области образованы из иммуноглобулиновых последовательностей человеческой зародышевой линии. В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридо-7 017812 мой, которая включает B-клетку, полученную из трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжлой цепи и трансген лгкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой. Термин "рекомбинантное человеческое антитело" по данному описанию включает все человеческие антитела, которые получаются, экспрессируются, создаются или выделяются методами рекомбинантной ДНК, такие как (а) антитела, выделенные из животных (например, мыши), трансгенных или трансхромосомных в отношении генов человеческих иммуноглобулинов или полученных из них гибридом (подробнее описанных ниже); (б) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной таким образом,чтобы экспрессировать человеческое антитело, например, из трансфектомы; (в) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки человеческих антител; и (г) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов в другие ДНК-последовательности. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные области, в которых каркасные и CDR области образованы из иммуноглобулиновых последовательностей человеческой зародышевой линии. Однако в некоторых вариантах изобретения такие рекомбинантные человеческие антитела могут подвергаться in vitro мутагенезу (или, когда используется животное, трансгенное в отношении человеческих Ig последовательностей,in vitro соматическому мутагенезу), и, таким образом, аминокислотные последовательности VH и VL областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя образованы из последовательностей и связаны с последовательностями VH и VL человеческой зародышевой линии, могут не существовать в природе в спектре антител человеческой зародышевой линии in vivo. Термин "изотип" по данному описанию относится к классу антител (например, IgM или IgG1), которые кодируются генами константной области тяжлой цепи. Выражения "антитело, узнающее (распознающее) антиген" и "антитело, специфическое к антигену" применяются в данном описании на равных правах (взаимозаменяемо) с выражением "антитело, которое специфически связывается с антигеном". Выражение "производные человеческих антител (антител человека, антител человеческого происхождения)" относится к любой модифицированной форме человеческого антитела, например конъюгату антитела и другого агента или антитела. Предполагается, что термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, в которых CDR последовательности, образованные из зародышевой линии млекопитающего другого вида, такого как мышь, встроены в ("привиты" на) человеческие каркасные последовательности. Дополнительные модификации каркасной области можно осуществить в человеческих каркасных последовательностях. Предполагается, что термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых последовательности вариабельной области образованы из одного вида, а последовательности константной области образованы из другого вида, таким как антитело, у которого последовательности вариабельной области происходят из мышиного антитела, а последовательности константной области происходят из человеческого антитела. Предполагается, что выражение "специфически связывается с человеческой PTK7" по данному описанию относится к антителу, которое связывается с человеческой PTK7 с KD 110-7 М или менее, более предпочтительно 510-8 М или менее, более предпочтительно 110-8 М или менее, более предпочтительно 510-9 М или менее. Выражение по данному описанию "практически не связывается" с белком или клеткой означает не связывается или не связывается с высокой аффинностью с белком или клеткой, а именно связывается с белком или клеткой с KD 110-6 М или более, более предпочтительно 110-5 М или более, более предпочтительно 110-3 М или менее, ещ более предпочтительно 110-2 М или более. Предполагается, что термин "Kassoc", или "Ka", по данному описанию относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин "Kdis", или "Kd", по данному описанию относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Предполагается,что термин "KD" по данному описанию относится к константе диссоциации, которую получают как отношение Kd к Ka (т.е. Kd/Ka), она выражается в виде молярной концентрации (М). Величины KD для антител можно определять общепринятыми в уровне техники методами. Предпочтительный метод определения KD антитела представляет собой поверхностный плазменный резонанс, предпочтительно с применением биосенсорной системы, такой как система Biacore. Выражение по данному описанию "высокая аффинность" для IgG антитела относится к антителу,имеющему KD в отношении целевого антигена 10-8 М или менее, более предпочтительно 10-9 М или менее или ещ более предпочтительно 10-10 М или менее. Однако "высокоаффинное" связывание (связывание с "высокой аффинностью") может меняться для других изотипов антитела. Например, "высокоаффинное" связывание для изотипа IgM относится к антителу, имеющему KD 10-7 М или менее, более предпочтительно 10-8 М или менее или ещ более предпочтительно 10-9 М или менее. Термин "субъект" по данному описанию включает человека или отличного от человека животного. Выражение "отличное от человека животное" включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как нечеловеческие приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры,земноводные, рептилии и т.д. Различные аспекты изобретения описаны более подробно в нижеприведнных подразделах. Антитела против PTK7. Антитела по изобретению характеризуются конкретными функциональными признаками или свойствами антител. Например, антитела специфически связываются с PTK7. Предпочтительно антитело по изобретению связывается с PTK7 с высокой аффинностью, например с KD 110-7 М или менее. Антитела против PTK7 по изобретению предпочтительно обладают одной или более следующих характеристик:(б) связываются с клеточной линией опухоли Вильмса (ATCC Acc No. CRL-1441). Предпочтительно антитело связывается с человеческой PTK7 с KD 510-8 М или менее, связывается с человеческой PTK7 с KD 110-8 М или менее, связывается с человеческой PTK7 с KD 510-9 М или менее или связывается с человеческой PTK7 с KD между 510-8 и 110-10 М или менее. Предпочтительно антитело связывается с клетками опухоли Вильмса с ЕС 50 4,0 нМ или менее или связывается с клетками опухоли Вильмса с ЕС 50 3,5 нМ или менее. Стандартные анализы по оценке способности антител к связыванию с PTK7 известны в уровне техники, включая, например, анализы ELISA, Вестерн-блоттинг и РИА (RIA). Кинетику связывания (например, аффинность связывания) антител также можно оценить стандартными методами анализа, известными в уровне техники, такими как анализы ELISA, Скетчарда иBiacore. Ещ один пример, антитела по настоящему изобретению могут связываться с опухолевой клеточной линией карциномы почки, например с клеточной линией опухоли Вильмса. Соответствующие анализы по оценке вышеописанных характеристик подробно описаны в примерах. Моноклональные антитела 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8. Предпочтительными антителами по изобретению являются человеческие моноклональные антитела 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. Рядовые специалисты в данной области техники знают, что антитела 3G8 и 3G8a, а также антитела 12 С 6 и 12 С 6 а имеют одинаковую последовательность тяжлой цепи, но отличные последовательности лгкой цепи. VH аминокислотные последовательности 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 показаны в SEQ ID NO: 1 (3G8b и 3G8a), 2 (4D5), 3 (12C6 и 12 С 6 а) и 4 (7C8). VL аминокислотные последовательности 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12 С 6 а и 7C8 показаны в SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 и 10 соответственно. С учтом того что каждое из этих антител может связываться с PTK7, последовательности VH и VL могут быть "смешанными и соединнными попарно (совмещающимися)", чтобы создать другие молекулы связывающих антител против PTK7 по изобретению. Связывание с PTK7 таких "смешанных и согласованных (совмещающихся, соединнных попарно)" антител можно проверять с помощью анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, анализы ELISA). Предпочтительно, когда VH и VL цепи являются смешанными и совмещающимися, a VH последовательность конкретной пары VH/VL заменена на сходную по структуре VH последовательность. Аналогично, предпочтительно VL последовательность конкретной пары VH/VL заменена на сходную по структуре VL последовательность. Соответственно, в одном аспекте изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4; и(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 и 10; причм антитело специфически связывает PTK7, предпочтительно человеческую PTK7. Предпочтительные комбинации тяжлой и лгкой цепей включают в себя:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 1; и (б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 10. В другом аспекте изобретение предусматривает антитела, которые содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжлой и лгкой цепей антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 или их комбинации. Аминокислотные последовательности CDR1 VH антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 показаны в SEQ ID NO: 11 (3G8 и 3G8a), 12 (4D5), 13 (12 С 6 и 12 С 6 а) и 14 (7 С 8). Аминокислотные последовательности CDR2 VH антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 показаны в SEQ ID NO: 15 (3G8 и 3G8a), 16 (4D5), 17 (12 С 6 и 12 С 6 а) и 18 (7 С 8). Аминокислотные последовательности CDR3 VH антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 показаны в SEQ ID NO: 19 (3G8 и 3G8a), 20 (4D5), 21 (12 С 6 и 12 С 6 а) и 22 (7 С 8). Аминокислотные последовательности CDR1 VK антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 показаны в SEQ ID NO: 23, 24,25, 26, 27 и 28 соответственно. Аминокислотные последовательности CDR2 VK антител 3G8, 3G8a, 4D5,12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 показаны в SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 и 34 соответственно. Аминокислотные последовательности CDR3 VK антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8 показаны в SEQ ID NO: 35, 36,37, 38, 39 и 40 соответственно. Области CDR изображены с применением системы Kabat (Kabat, E.A., et.al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). С учтом того что каждое из этих антител может связываться с PTK7 и специфичность связывания с антигеном обеспечивается, прежде всего, областями CDR1, CDR2 и CDR3, последовательности VHCDR1, CDR2 и CDR3 и последовательности VK CDR1, CDR2 и CDR3 могут быть "смешаны и соединены попарно (спарены)" (т.е. CDR различных антител могут быть смешаны и соединены (спарены), хотя каждое антитело должно содержать VH CDR1, CDR2 и CDR3 и VK CDR1, CDR2 и CDR3) для того, чтобы создать другие связывающие PTK7 молекулы антител против PTK7 по изобретению. Связывание PTK7 такими "смешанными и согласованными (совмещающимися, соединнными попарно)" антителами можно проверять с помощью анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, анализыELISA, Biacore). Предпочтительно, когда VH CDR последовательности являются смешанными и совмещающимися, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 конкретной последовательности VH заменена на сходную(ые) по структуре CDR последовательность(и). Аналогично, предпочтительно VK CDR последовательности являются смешанными и совмещающимися, последовательность CDR1, CDR2 и/илиCDR3 конкретной последовательности VK заменена на сходную(ые) по структуре CDR последовательность(и). Рядовому специалисту в данной области техники совершенно очевидно, что новые VH и VL последовательности можно создать, заменяя последовательности областей CDR цепей VH и/или VL сходными по структуре CDR последовательностями, раскрываемыми в данном описании для моноклональных антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8. Соответственно, в другом аспекте изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащий:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и 28;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 и 34;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 и 40; причм антитело специфически связывает PTK7, предпочтительно человеческую PTK7. В предпочтительном варианте изобретения антитело включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 15;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 19;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 23;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 29;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 35. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 15;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 19;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 24;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 30;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 36. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 12;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 16;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 20;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 25;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 31;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 37. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 13;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 21;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 26;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 32;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 38. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 13;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 21;(г) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 27;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 33;(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 39. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело включает в себя:(а) CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 14;(б) CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 18;(в) CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 22;(r) CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 28;(д) CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 34; и(е) CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 40. В уровне техники хорошо известно, что CDR3 домен, независимо от CDR1 и/или CDR2 домена(доменов), один может определять специфичность связывания антитела с узнаваемым антигеном и что при наличии общей CDR3 последовательности можно прогнозировать получение множества антител,имеющих такую же специфичность связывания. См., например, Klimka et al., British J. of Cancer. 83(2): 252-260 (2000) (где описывается продуцирование гуманизированного антитела против CD30 с применением лишь CDR3 вариабельного домена тяжлой цепи мышиного антитела против CD30 Ki-4); Beiboer etal., J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000) (где описываются рекомбинантные антитела к эпителиальному гликопротеину-2 (EGP-2), полученные только при использовании последовательности CDR3 тяжлой цепи исходного мышиного антитела МОС-31 против EGP-2); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Set U.S.A. 95: 89108915 (1998) (где описывается панель гуманизированных антител против интегрина v3, полученная с применением CDR3 вариабельного домена тяжлой и лгкой цепей мышиного антитела против интегрина v3 LM609, причм в этом наборе антител каждое антитело, за исключением CDR3 домена, имеет отличную (отдельную) последовательность и способно связываться с тем же самым эпитопом, что и исходное мышиное антитело, с аффинностью, такой же или более высокой, чем исходное мышиное антитело); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-2162 (1994) (где раскрывается, что CDR3 домен вносит(обеспечивает) наиболее значительный вклад в связывание антигена); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.Fab (SI-1, SI-40 и SI-32) против человеческой плацентарной ДНК только в тяжлую цепь Fab против столбнячного токсина, тем самым заменяется имеющийся CDR3 тяжлой цепи и демонстрируется, что один лишь домен CDR3 сообщает специфичность связывания); и Ditzel et al., J. Immunol. 157: 739-749(1996) (где описываются исследования по "прививке", в которых переноса лишь CDR3 тяжлой цепи исходного полиспецифического Fab LNA3 в тяжлую цепь моноспецифического IgG, связывающего столбнячный токсин антитела Fab p313, было достаточно для сохранения специфичности связывания исходного Fab). Каждый из этих ссылочных материалов при этом вводится ссылкой в данное описание во всей полноте. Соответственно, настоящее изобретение включает моноклональные антитела, содержащие один или более доменов CDR3 тяжлой и/или лгкой цепи антитела человека или отличного от человека животного, причм моноклональное антитело способно специфически связываться с PTK7. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает моноклональные антитела, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи антитела нечеловеческого происхождения, такого как мышиное или крысиное антитело, отличающиеся тем, что моноклональное антитело способно специфически связываться сPTK7. В некоторых вариантах изобретения такие антитела по изобретению, содержащие один или болееCDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи антитела нечеловеческого происхождения, (а) способны конкурировать за связывание с соответствующим исходным нечеловеческим антителом; (б) сохраняют функциональные характеристики соответствующего исходного нечеловеческого антитела; (в) связываются с тем же эпитопом, что и соответствующее исходное нечеловеческое антитело; и/или (г) имеют аффинность связывания, аналогичную аффинности связывания соответствующего исходного нечеловеческого антитела. В других аспектах настоящее изобретение включает моноклональные антитела, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи человеческого антитела, такого, например, как человеческое антитело, полученное от отличного от человека животного, причм человеческое антитело способно специфически связываться с PTK7. В других аспектах настоящее изобретение включает моноклональные антитела, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи первого человеческого антитела, такого, например, как человеческое антитело, полученное от отличного от человека животного, причм первое человеческое антитело способно специфически связываться с PTK7, и при этом CDR3 домен из первого человеческого антитела заменяет CDR3 домен в человеческом антителе, у которого отсутствует специфичность связывания с PTK7, с целью получить второе человеческое антитело, которое способно специфически связываться с PTK7. В некоторых вариантах изобретения такие антитела по изобретению, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи первого человеческого антитела, (а) способны конкурировать за связывание с соответствующим исходным первым человеческим антителом; (б) сохраняют функциональные характеристики соответствующего исходного первого человеческого антитела; (в) связываются с тем же эпитопом, что и соответствующее исходное первое человеческое антитело; и/или (г) имеют аффинность связывания, аналогичную аффинности связывания соответствующего исходного первого человеческого антитела. В предпочтительных вариантах изобретения первое человеческое антитело представляет собой 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8. Антитела, имеющие конкретные последовательности зародышевой линии. В некоторых вариантах изобретения антитело по изобретению содержит вариабельную область тяжлой цепи, полученную при использовании конкретного гена зародышевой линии тяжлой цепи иммуноглобулина и/или вариабельную область лгкой цепи, полученную при использовании конкретного гена зародышевой линии лгкой цепи иммуноглобулина. Например, в предпочтительном варианте изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VH 3-30.3, причм антитело специфически связывает PTK7, предпочтительно человеческую PTK7. В другом предпочтительном варианте изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VH DP44, причм антитело специфически связываетPTK7, предпочтительно человеческую PTK7. В другом предпочтительном варианте изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VH 3-33, причм антитело специфически связывает PTK7, предпочтительно человеческую PTK7. Ещ в одном предпочтительном варианте изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VKL15, причм антитело специфически связывает PTK7, предпочтительно человеческую PTK7. Ещ в одном предпочтительном варианте изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело,или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VK A10, причм антитело специфически связывает PTK7, предпочтительно человеческую PTK7. Ещ в одном предпочтительном варианте изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VK A27, причм антитело специфически связываетPTK7, предпочтительно человеческую PTK7. Ещ в одном предпочтительном варианте изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VK L6, причм антитело специфически связывает PTK7, предпочтительно человеческую PTK7. Ещ в одном предпочтительном варианте изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, отличающееся тем, что это антитело:(а) содержит вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VH 3-30.3, DP44 или 3-33 (этот ген кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51, 52 или 53 соответственно);(б) содержит вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом, или образована при использовании, человеческого гена VK L15, А 10, А 27 или L6 (этот ген кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, 55, 56 или 57 соответственно); и(в) специфически связывается с PTK7. Примерами антител, имеющих VH и VK из VH 3-30.3 и VK L15 соответственно, являются 3G8 и 3G8a. Примером антитела, имеющего VH и VK из VH 3-30.3 и VK A10 соответственно, является 4D5. Примером антитела, имеющего VH и VK из VH DP44 и VK А 27 соответственно, является 12 С 6. Примером антитела, имеющего VH и VK из VH DP44 и VK L15 соответственно, является 12 С 6. Примером антитела,имеющего VH и VK из VH 3-33 и VK L6 соответственно, является 7 С 8. По данному описанию человеческое антитело содержит вариабельные области тяжлой или лгкой цепи, которые являются "продуктом" или "образованы при использовании" конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные области антитела получены с помощью системы, которая использует гены зародышевой линии человеческого иммуноглобулина. Такие системы включают иммунизацию трансгенной мыши, несущей гены человеческого иммуноглобулина, представляющим интерес антигеном или скрининг библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов с помощью фагового дисплея с представляющим интерес антигеном. Человеческое антитело, которое является "продуктом" или"образовано при использовании" последовательности зародышевой линии человеческого иммуноглобулина, можно идентифицировать как таковое, сравнивая аминокислотную последовательность человеческого антитела с аминокислотными последовательностями зародышевой линии человеческих иммуноглобулинов и выбирая человеческую последовательность зародышевой линии иммуноглобулина, которая является наиболее близкой по последовательности (т.е. с наибольшим % идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является "продуктом" или "образовано при использовании" конкретной последовательности зародышевой линии человеческого иммуноглобулина, может иметь аминокислотные различия по сравнению с последовательностью зародышевой линии вследствие, например, природных соматических мутаций или прицельной сайт-направленной мутации. Однако выбранное человеческое антитело имеет последовательность, как правило, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, кодированной геном зародышевой линии человеческого иммуноглобулина, и содержит аминокислотные остатки, которые позволяют идентифицировать человеческое антитело как являющееся человеческим при сравнении с аминокислотными последовательностями зародышевой линии иммуноглобулинов другого вида (например, последовательностями мышиной зародышевой линии). В некоторых случаях человеческое антитело может иметь аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную аминокислотной последовательности, кодированной геном зародышевой линии иммуноглобулина. Обычно человеческое антитело, образованное при использовании конкретной последовательности человеческой зародышевой линии, выявляет не более 10 различий аминокислот от аминокислотной последовательности, кодированной геном зародышевой линии иммуноглобулина. В некоторых случаях человеческое антитело может иметь (выявлять) не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 различия в аминокислотах от аминокислотной последовательности, кодированной геном зародышевой линии иммуноглобулина. Гомологичные антитела. Ещ в одном варианте изобретения антитело по изобретению содержит вариабельные области тяжлой и лгкой цепей, включающие аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям предпочтительных антител по данному описанию, и при этом антитела сохраняют заданные (нужные) функциональные свойства антител против PTK7 по изобретению. Например, изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи и вариабельную область лгкой цепи, где:(а) вариабельная область тяжлой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4;(б) вариабельная область лгкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 и 10; и антитело проявляет одно или более из следующих свойств:(г) связывается с линией клеток опухоли Вильмса. В других вариантах изобретения VH или VL аминокислотные последовательности могут быть на 85,90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичны последовательностям, представленным выше. Антитело, содержащее VH или VL области, имеющие высокую (а именно, 80% или выше) гомологию с VH или VL облас- 13017812 тями представленных выше последовательностей, можно получать мутагенезом (например, сайтнаправленным или ПЦР-опосредованным мутагенезом) нуклеотидных молекул, кодирующих SEQ IDNO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50, с последующим тестированием кодированного изменнного антитела на сохраннную функцию (а именно, функции, представленные выше, в пп. (в) и (г с применением функциональных анализов по данному описанию. По данному описанию выраженная в процентах гомология между двумя аминокислотными последовательностями эквивалентна выраженной в процентах идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % гомологии = числоидентичных положений/общее числоположений 100), учитывающую число гэпов, и протяжнность каждого гэпа,которые следует ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнять, используя математический алгоритм, как описано в неограничивающих примерах, представленных ниже. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять с помощью алгоритма Ю. Майерса и В. Миллера (Е. Meyers and W. Miller. Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17(1988, который включн в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу весов остатков РАМ 120,штраф за длину гэпа 12 и штраф за открытие гэпа 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять, используя алгоритм Нидльмана и Вунша(Needleman and Wunsch. J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970, который включн в программу GAP в пакете программ GCG (представленном на сайте www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу РАМ 250 и средневзвешенное гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и средневзвешенное длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Помимо этого или в качестве альтернативы, белковые последовательности по настоящему изобретению можно далее использовать в качестве "запрашиваемой последовательности" для проведения поиска в общих базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск можно осуществлять, используя программу XBLAST (вариант 2.0) (Altschul, et al. (1990). J. Mol. Biol. 215: 403-10). BLAST поиск белков можно проводить, используя программу XBLAST, количественный показатель = 50, длину слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам антитела по изобретению. Для проведения выравнивания с гэпами (промежутками) с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). (См. www.ncbi.nlm.nih.gov). Антитела с консервативными модификациями. В некоторых вариантах изобретения антитело по изобретению содержит вариабельную область тяжлой цепи, включающую CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности, и вариабельную область лгкой цепи, включающую CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности, причм одна или более этих CDR последовательностей содержит заданные аминокислотные последовательности на основе предпочтительных антител по данному описанию (например, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12 С 6 а или 7C8) или их консервативные модификации, и при этом антитела сохраняют нужные функциональные свойства антител против PTK7 по изобретению. Соответственно, изобретение предусматривает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок (фрагмент), содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи,включающую CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности, и вариабельную область лгкой цепи, включающую CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности, где:(а) последовательность CDR3 вариабельной области тяжлой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей(б) последовательность CDR3 вариабельной области лгкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQID NO: 35, 36, 37, 38, 39 и 40 и их консервативных модификаций; и антитело проявляет одно или более из следующих свойств:(г) связывается с линией клеток опухоли Вильмса (ATCC Acc No. CRL-1441). В предпочтительном варианте изобретения последовательность CDR2 вариабельной области тяжлой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18 и их консервативных модификаций; а последовательность CDR2 вариабельной области лгкой цепи содержит аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 и 34 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном варианте изобретения последовательность CDR1 вариабельной области тяжлой цепи содержит аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14 и их консервативных модификаций; а последовательность CDR1 вариабельной области лгкой цепи со- 14017812 держит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и 28 и их консервативных модификаций. Предполагается, что выражение "консервативные модификации последовательностей" относится к аминокислотным модификациям, которые незначительно влияют или изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации можно вводить в антитело по изобретению стандартными методами, известными в уровне техники, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, в которых аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком с аналогичной (сходной) боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные аминокислотные боковые цепи, охарактеризованы в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например,аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), разветвлнные в бетаположении боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в CDR областях антитела по изобретению могут быть заменены на другие аминокислотные остатки семейства с такой же боковой цепью, и изменнное антитело можно проверить на сохраннную функцию (а именно, функции, представленные выше, в пп. (в) и (г с помощью функциональных анализов по данному описанию. Антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом, как антитела против PTK7 по изобретению. В другом варианте изобретение предусматривает антитела, которые связываются с тем же эпитопом на человеческой PTK7, что любые другие моноклональные антитела к PTK7 по изобретению (т.е. антитела, которые обладают способностью перекрстно конкурировать за связывание с PTK7 с любыми моноклональными антителами по изобретению). В предпочтительных вариантах изобретения эталонное антитело для исследований перекрстной конкуренции может являться моноклональным антителом 3G8(имеющим VH и VL последовательности, показанные в SEQ ID NO: 1 и 5 соответственно), или моноклональным антителом 3G8a (имеющим VH и VL последовательности, показанные в SEQ ID NO: 1 и 6 соответственно), или моноклональным антителом 4D5 (имеющим VH и VL последовательности, показанные вSEQ ID NO: 2 и 7 соответственно), или моноклональным антителом 12 С 6 (имеющим VH и VL последовательности, показанные в SEQ ID NO: 3 и 8 соответственно), или моноклональным антителом 12 С 6 а(имеющим VH и VL последовательности, показанные в SEQ ID NO: 3 и 9 соответственно), или моноклональным антителом 7 С 8 (имеющим VH и VL последовательности, показанные в SEQ ID NO: 4 и 10 соответственно). Такие перекрстно-конкурирующие (конкурентные) антитела можно идентифицировать на основании их способности перекрстно конкурировать с 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8 в стандартных анализах связывания PTK7. Например, анализ Biacore, анализы ELISA или проточную цитометрию можно использовать для демонстрации перекрстной конкуренции с антителами по настоящему изобретению. Способность испытуемого антитела ингибировать связывание, например, 3G8, 3G8a, 4D5,12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8 с человеческой PTK7 демонстрирует, что испытуемое антитело может конкурировать с 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8 за связывание с человеческой PTK7 и, следовательно, связывается с тем же самым эпитопом на человеческой PTK7, что и 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8. В предпочтительном варианте изобретения антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом на человеческой PTK7, что и 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Такие человеческие моноклональные антитела можно получать и выделять, как описано в примерах. Генно-инженерные (рекомбинантные) и модифицированные антитела. Помимо этого, антитело по изобретению можно получать, используя антитело, имеющее VH и/илиVL последовательности, раскрываемые в данном описании, в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела, причм это модифицированное антитело может иметь изменнные свойства по сравнению с исходным антителом. Антитело можно создать (сконструировать), модифицируя один или более остатков в одной или в обеих вариабельных областях (т.е. в VH и/или VL), например в одной или более CDR областей, и/или в одной или более каркасных областей. Кроме того или в качестве альтернативы, антитело можно создать, модифицируя остатки в контантной (константных) области (областях), например, с целью изменения эффекторной (эффекторных) функции (функций) антитела. Одним из способов создания вариабельной области, который можно осуществлять, является "CDR прививка". Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно за счт аминокислотных остатков, локализованных в шести гипервариабельных областях (CDR) тяжлой и лгкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности внутри CDR более различаются между отдельными антителами, чем последовательности вне CDR. Так как последовательности CDR ответственны за большинство взаимодействий антиген-антитело, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, конструируя векторы экспрессии, которые включают CDR последовательности специфического природного антитела, привитые на каркасные последовательности другого антитела с отличающимися свойствами (см., например, Riechmann, L. et al.Acad. See. U.S.A. 86: 10029-10033; патент США 5225539, выданный Winter, и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.). Соответственно, другой вариант изобретения относится к выделенному моноклональному антителу,или его антигенсвязывающему участку (фрагменту), содержащему вариабельную область тяжлой цепи,включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14, SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18 иSEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22 соответственно, и вариабельную область лгкой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и 28, SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 и 34 и SEQ ID NO: 35,36, 37, 38, 39 и 40 соответственно. Таким образом, такие антитела содержат VH и VL CDR последовательности моноклональных антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8, но ещ могут содержать различные каркасные последовательности этих антител. Такие каркасные последовательности можно получать из общих баз данных ДНК или опубликованных ссылочных материалов, которые включают последовательности гена зародышевой линии антитела. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для человеческих генов вариабельной области тяжлой и лгкой цепей можно найти в базе данных последовательности человеческой зародышевой линии "VBase" (на сайте в Интернете www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat, E.A., et al. (1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992),"The Repertoire of Human Germline VH SequencesEur. J. Immunol. 24: 827-836; содержание каждого из этих ссылочных материалов однозначно вводится в данное описание в качестве ссылки. Другой пример, последовательности ДНК зародышевой линии для человеческих генов вариабельной области тяжлой и лгкой цепей можно найти в базе данных Genbank. Например, следующие последовательности зародышевой линии тяжлой цепи, найденные у мыши HCo7HuMAb, доступны в Genbank под следующими номерами: 1-69 (NG0010109, NT024637 и ВС 070333),3-33 (NG0010109 и NT024637) и 3-7 (NG0010109 и NT024637). Другой пример, следующие последовательности зародышевой линии тяжлой цепи, найденные у мыши HCo12 HuMAb, доступны в Genbank под следующими номерами: 1-69 (NG0010109, NT024637 и ВС 070333), 5-51 (NG0010109 иNT024637), 4-34 (NG0010109 и NT024637), 3-30.3 и 3-23 (AJ406678). Белковые последовательности антител сравнивают с собранной базой данных последовательностей белков, используя один из методов поиска сходства последовательностей, называемый Gapped BLAST(Altschul et. al. (1997). Nucleic. Acids Research. 25: 3389-3402), хорошо известный специалистам в данной области техники. BLAST представляет собой эвристический алгоритм в том смысле, что статистически значимое выравнивание между последовательностью антитела и последовательностью из базы данных,по-видимому, содержит пары сегментов с максимальным сходством (HSP) выравненных слов. Пары сегментов, показатели которых нельзя улучшить расширением или уменьшением, называются попадание(hit). Коротко говоря, нуклеотидные последовательности, взятые из VBASE (http://vbase.mrccpe.cam.ас.uk/vbase1/list2.php), транслируют и область между и включая каркасную область от FR1 доFR3 сохраняют. Последовательности из базы данных имеют среднюю длину 98 оснований. Идентичные последовательности (дубликаты), которые являются точным повторением по всей длине белка, удаляются. BLAST поиск белков с применением программы blastp с характеристиками по умолчанию, стандартными параметрами, за исключением фильтра участков кода пониженной сложности, который выключен,и матрицы замен BLOSUM62, фильтрует максимальные 5 попаданий (hit), дающих совпадения последовательностей. Нуклеотидные последовательности транслируются во всех шести рамках считывания, и рамка, в которой отсутствует стоп-кодон в соответствующем (парном) сегменте последовательности из базы данных, рассматривается как возможное попадание (hit). В свою очередь, это подтверждают, используя BLAST программу tblastx, которая позволяет транслировать последовательность антитела во всех шести рамках считывания и сравнивает эти трансляции с VBASE нуклеотидными последовательностями, динамически транслируемыми во всех шести рамках считывания. Идентичности (тождества) представляют собой точные совпадения аминокислот последовательности антитела и белка из базы данных по всей длине последовательности. Позитивности (тождества + совпадающая замена ("под пару" не являются идентичными, но при аминокислотных заменах руководствуются матрицей замен BLOSUM62. Если последовательность антитела совпадает с двумя из последовательностей из базы данных с одинаковой идентичностью, решают, что попадание (hit) с наибольшими позитивами является соответствующим попаданием (hit) последовательности. Предпочтительными каркасными последовательностями для применения в антителах по изобретению являются такие последовательности, которые сходны по структуре с каркасными последовательно- 16017812 стями, используемые выбранными антителами по изобретению, сходными, например, с каркасными последовательностями VH 3-30.3 (SEQ ID NO: 51), и/или с каркасными последовательностями VH DP44L15 (SEQ ID NO: 54), и/или с каркасными последовательностями VK L6 (SEQ ID NO: 57), используемыми в предпочтительных моноклональных антителах по изобретению. CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности VH и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 цепи VK можно привить на каркасные области, в которых имеется последовательность, идентичная последовательности в гене иммуноглобулина зародышевой линии, при использовании которого получают каркасную последовательность, или CDR последовательности можно привить на каркасные области, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, найдено, что в некоторых случаях предпочтительно осуществить мутацию остатков в каркасных областях для того, чтобы сохранить или повысить антигенсвязывающую способность антитела (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.). Другим типом модификации вариабельной области является мутация аминокислотных остатков вVH и/или VK областях CDR1, CDR2 и/или CDR3, чтобы тем самым улучшить одно или более свойств связывания (например, аффинность) представляющего интерес антитела. Сайт-направленный мутагенез ПЦР-опосредованного мутагенеза можно осуществлять для введения мутации(й) и воздействия на связывание антитела или другое представляющее интерес функциональное свойство можно определять в invitro или in vivo анализах, представленных в данном описании и приведнных в примерах. Предпочтительно вводятся консервативные модификации (обсуждаемые выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции, но предпочтительно они представляют собой замены. Кроме того, обычно в CDR области меняется не более одного, двух, трх, четырх или пяти остатков. Соответственно, в другом варианте изобретение предусматривает выделенные моноклональные антитела против PTK7 или их антигенсвязывающие участки, содержащие вариабельную область тяжлой цепи, включающую:(a) VH CDR1 область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две,три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 11,12, 13 и 14;(б) VH CDR2 область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две,три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 15,16, 17 и 18;(в) VH CDR3 область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две,три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 19,20, 21 и 22;(г) VK CDR1 область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и 28, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с(д) VK CDR2 область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 и 34, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с(е) VK CDR3 область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 и 40, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению сSEQ ID NO: 35, 36, 37; 38, 39 и 40. Созданные генной инженерией (рекомбинантные) антитела по изобретению включают антитела, в которых сделаны модификации в каркасных остатках в VH и/или VK, например, с целью улучшения свойств антитела. Как правило, такие модификации в каркасной области совершают с целью понизить иммуногенность антитела. Например, один подход заключается в том, чтобы "мутировать обратно" один или более каркасных остатков в соответствующие остатки последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое претерпело соматическую мутацию, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой образовано антитело. Такие остатки можно идентифицировать, сравнивая каркасные последовательности антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой образовано антитело. Например, в случае 3G8 (и 3G8a) аминокислотный остаток 28 (в FR1) VH представляет собой изолейцин, тогда как этот остаток в соответствующей последовательности зародышевой линии VH 3-30.3 представляет собой треонин. Чтобы вернуть последовательности каркасной области в конфигурацию их зародышевой линии, соматическую мутацию можно "обратно мутировать" в последовательность зародышевой линии, например, сайт-направленным мутагенезом или ПЦР-опосредованным мутагенезом (например, остаток 28 FR1 VH 3G8 (и 3G8a) можно "обратно мутировать" из изолейцина в треонин). Другой пример, в случае 12 С 6 (и 12 С 6 а) аминокислотный остаток 44 (в FR2) VH представляет собой треонин, тогда как этот остаток в соответствующей последовательности зародышевой линии VHDP44 представляет собой глицин. Чтобы вернуть последовательности каркасной области в конфигурацию их зародышевой линии, например, остаток 44 (остаток 9 FR2) VH 12C6 (и 12 С 6 а) можно "обратно мутировать" из треонина в глицин. Предполагается, что такие антитела с "обратной мутацией" также охватываются изобретением. Другой тип каркасной модификации включает мутацию одного или более остатков в каркасной области или даже внутри одной или более CDR областей для удаления T-клеточных эпитопов, чтобы тем самым понизить потенциальную иммуногенность антитела. Этот метод также называют "деиммунизацией", подробнее он описан в опубликованной патентной заявке США 20030153043 Carr et al. Помимо или вместо модификаций внутри каркасных или CDR областей, можно сконструировать антитела по изобретению таким образом, чтобы они включали модификации внутри Fc области, обычно,чтобы изменить одно или более функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, Fc-рецепторное связывание и/или антиген(тело)зависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело по изобретению может быть химически модифицированным (например, к антителу могут быть присоединены одна или более химических частиц) или модифицированным таким образом, чтобы изменить его гликозилирование, чтобы снова изменить одно или более функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов изобретения подробнее описан ниже. Нумерация остатков в Fc области соответствует EU индексу Kabat. В одном варианте изобретения шарнирная область CH1 модифицируется таким образом, что число цистеиновых остатков в шарнирной области меняется, например увеличивается или уменьшается. Этот метод подробнее описан в патенте США 4677425 Bodmer et al. Число цистеиновых остатков в шарнирной области меняется, например, для того, чтобы упростить сборку лгкой и тяжлой цепей или повысить или понизить стабильность антитела. В другом варианте изобретения мутация в Fc шарнирной области антитела понижает биологический период полужизни антитела. Более конкретно, одна или более мутаций аминокислот вводят в область контакта (раздела) домена СН 2-СН 3 Fc-шарнирного фрагмента таким образом, чтобы ослаблялось связывание антитела с белком Staphylococcal A (SpA) по сравнению со связыванием нативногоFc-шарнирного домена SpA. Этот метод подробнее описан в патенте США 6165745 Ward et al. В другом варианте изобретения антитело модифицируют с целью повысить его биологический период полужизни. Возможны различные подходы. Например, могут быть введены одна или более следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США 6277375, выданном Ward. Или же для повышения биологического периода полужизни антитело можно изменять в CH1 или CL области таким образом, чтобы оно содержало эпитоп, связывающий salvage рецептор (рецептор-"утилизатор"),причм этот эпитоп взят из двух петель СН 2 домена Fc области IgG, как описано в патентах США 5869046 и 6121022 Presta et al. В других вариантах изобретения Fc область изменяют, заменяя по меньшей мере один аминокислотный остаток на другой аминокислотный остаток с целью изменения эффекторной(ых) функции(ий) антитела. Например, одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235,236, 237, 297, 318, 320 и 322, можно заменить на другой аминокислотный остаток таким образом, что антитело будет обладать изменнной аффинностью к эффекторному лиганду, но сохранит антигенсвязывающую способность исходного антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяется,может представлять собой Fc-рецептор или C1 компонент комплемента. Этот метод описан подробнее в патентах США 5624821 и 5648260, оба принадлежат Winter et at. В другом примере одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, можно заменить на другой аминокислотный остаток таким образом, что антитело будет проявлять изменнное связывание C1q и/или пониженную или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) или не иметь е совсем. Этот метод подробнее описан в патенте США 6194551, выданном Idusogie et al. В другом примере один или более аминокислотных остатков в положениях аминокислот 231 и 239 изменяют, чтобы при этом изменить способность антитела фиксировать комплемент. Этот метод подробнее описан в опубликованной заявке PCT WO 94/29351 Bodmer et al. Ещ в одном примере Fc область модифицируют с целью повышения способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ, ADCC) и/или с целью повышения аффинности антитела к Fc-рецептору, модифицируя одну или более аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286,289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330,- 18017812 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437,438 или 439. Этот метод подробнее описан в опубликованной заявке PCT WO 00/42072 Presta. Кроме того, сайты связывания на человеческом IgG1 с FcRI, FcRII, FcRIII и FcRn картированы и варианты с повышенным связыванием описаны (см. Shields, R.L. et al. (2001), J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). Было показано, что специфические мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcRIII. Кроме того, было показано, что следующие комбинированные мутанты повышают связываниеFcRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A. Ещ в одном варианте изобретения модифицируется гликозилирование антитела. Например, можно получать агликозилированное антитело (т.е. антитело, не имеющее гликозилирования). Гликозилирование можно изменять с целью, например, повысить аффинность антитела к антигену. Такие модификации углеводов можно осуществлять, например, изменяя один или более сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно сделать одну или более аминокислотных замен, которые вызывают элиминирование одного или более каркасных сайтов гликозилирования вариабельной области, тем самым отменяют гликозилирование по этому сайту. Такое гликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Этот метод подробнее описан в патентах США 5714350 и 6350861 Со et al. Кроме того или вместо того, можно получать антитело, которое имеет изменнный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, содержащее уменьшенное количество фукозильных остатков, или антитело, имеющее повышенное содержание GlcNac структур с биссекторными плоскостями. Показано, что такие изменнные паттерны гликозилирования повышают ADCC способность антител. Такие модификации углеводов можно выполнять, например экспрессируя антитело в клеткехозяине с изменнным механизмом гликозилирования. Клетки с изменнным механизмом гликозилирования описаны в уровне техники и их можно использовать в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению и, тем самым, для продуцирования антитела с изменнным гликозилированием. Например, в линиях клеток Ms704, Ms705 и Ms709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, FUT8 (альфа (1,6) фукозилтрансфераза), так что в углеводах антител, экспрессируемых в Ms704,Ms705 и Ms709 клеточных линиях, отсутствует фукоза. Линии клеток Ms704, Ms705 и Ms709 FUT8-/были созданы целевой дизрупцией (разрывом) гена FUT8 в CHO/DG44 клетках с применением двух векторов замен (см. опубликованную патентную заявку США 20040110704, принадлежащую Yamane etal. and Yamane-Ohnuki et al. (2004), Biotechnol Bioeng. 87: 614-22). Другой пример, в Европейском патенте ЕР 1176195, выданном Hanai et al., описывается линия клеток с разорванным FUT8 геном, который кодирует фукозилтрансферазу, так что в антителах, экспрессированных в такой линии клеток, наблюдается гипофукозилирование за счт уменьшения или элиминирования фермента, относящегося к ферменту с альфа-1,6-связью. Hanai et al. описывают также линии клеток с низкой ферментной активностью в отношении присоединения фукозы к N-ацетилглюкозамину, который связывается с Fc областью антитела,или не проявляет ферментной активности, например, в отношении линии клеток крысиной миеломыYB2/0 (АТСС CRL 1662). В опубликованной заявке PCT WO 03/035835 Presta описывает вариант СНО клеточной линии, клетки Lec13, с пониженной способностью связывать фукозу с Asn(297)-связанными углеводами, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессированных в такой клеткехозяине (см. также Shields, R.L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 272: 26733-26740). В опубликованной заявкеPCT WO 99/54342 Umana et al. описывают клеточные линии, созданные генной инженерией для экспрессии гликопротеин-модифицирующих гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII, так что у антител, экспрессированных в созданных клеточных линиях,наблюдаются повышенные биссекторные GlcNac структуры, которые вызывают повышенную ADCC антител (см. также Umana et al. (1999), Nat. Biotech. 17: 176-180). Или же остатки фукозы от антитела можно отщеплять, используя фермент фукозидазу. Например, фукозидаза альфа-L-фукозидаза удаляет фукозильные остатки из антител (Tarentino, A.L. et al. (1975), Biochem. 14: 5516-23). Другой модификацией антител по данному описанию, которая рассматривается изобретением, является пэгилирование. Антитело можно пэгилировать, например, для повышения биологического (например, в сыворотке) периода полужизни антитела. Обычно для пэгилирования антитело или его фрагмент реагирует с полиэтиленгликолем (ПЭГ, PEG), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегид ПЭГ, в условиях, в которых одна или более групп ПЭГ связывается с антителом или фрагментом антитела. Предпочтительно пэгилирование проводят с помощью реакции ацилирования или алкилирования реакционноспособной молекулы ПЭГ (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Предполагается, что термин "полиэтиленгликоль" по данному описанию охватывает любую форму ПЭГ (PEG), которая используется для дериватизации других белков, такую как моно(C1-С 10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеинимид. В некоторых вариантах изобретения пэгилируемое антитело представляет собой агликозилированное антитело. Способы пэгилирования белков известны в уровне техники и могут быть применены к антителам по изобретению. См., например, Европейский патент ЕР 0154316, выданный Nishimura et al. и ЕР 0401384, выданный Ishikawa et al. Физические свойства антител. Антитела по настоящему изобретению можно подробнее характеризовать различными физическими свойствами антител против PTK7. С учтом этих физических свойств для обнаружения и/или установления различия разных классов антител можно применять различные методы анализа. В некоторых вариантах антитела по настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельной области либо лгкой, либо тяжлой цепи. Наличие одного или более сайтов гликозилирования в вариабельной области может привести к повышенной иммуногенности антитела или изменению pK антитела вследствие изменения связывания с антигеном (Marshall et al.(1985), Nature. 316: 452-7: Mimura et al. (2000), Mol. Immunol. 37: 697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. Гликозилирование вариабельной области можно проверять, используя анализ Glycoblot, в ходе которого антитело расщепляют, получаяFab, а затем тестируют на гликозилирование, используя анализ, в котором определяют окисление периодатом и образование основания Шиффа. Или же гликозилирование вариабельной области можно определять жидкостной хроматографией на системе Dionex (Dionex-LC), в ходе которой сахариды из Fab расщепляют до моносахаридов и анализируют содержание отдельного сахарида. В некоторых примерах предпочтительно иметь антитело против PTK7, которое не содержит гликозилирования вариабельной области. Этого можно достичь либо отбором антител, которые не содержат мотив гликозилирования в вариабельной области, либо мутацией остатков в мотиве гликозилирования стандартными методами,общеизвестными в уровне техники. В предпочтительном варианте антитела по настоящему изобретению не содержат сайтов изомеризации (isomerism) аспарагина. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты может осуществляться на последовательностях N-G и D-G соответственно. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты приводит к образованию изоаспарагиновой кислоты, которая понижает стабильность антитела за счт образования изогнутой (изломанной) структуры скорее у карбоксиконца боковой цепи, нежели главной цепи. Образование изоаспарагиновой кислоты можно определять (измерять) с помощью количественного анализа с применением обращнно-фазовой ВЭЖХ для тестирования изоаспарагиновой кислоты. Каждое антитело имеет единственную изоэлектрическую точку (pI), но обычно антитела попадают в интервал рН между 6 и 9,5; pI для антитела IgG1 обычно попадает в интервал рН 7-9,5, a pI для антитела IgG4 обычно попадает в интервал рН 6-8. Антитела могут иметь pI вне этого интервала. Хотя эффекты обычно неизвестны, имеется предположение, что антитела с pI вне нормального интервала могут проявлять в условиях in vivo некоторое раскручивание и нестабильность. Изоэлектрическую точку можно определять методом капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ), который формирует градиент рН, а для повышенной точности можно использовать лазерное фокусирование (Janini et al. (2002),Electrophoresis. 23: 1605-11; Ma et al. (2001), Chromatographia. 53: S75-89; Hunt et al. (1998), J. Chromatogr.A 800: 355-67). В некоторых примерах предпочтительно иметь антитело против PTK7, имеющее значение pI, попадающее в нормальный интервал. Этого можно достичь либо отбором антител с pI в нормальном интервале, либо мутацией заряженных остатков на поверхности стандартными методами, хорошо известными в уровне техники. Каждое антитело имеет температуру плавления, которая является показателем термической стабильности (Krishnamurthy R. and Manning M.C. (2002), Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 361-71). Более высокая термическая стабильность указывает на более высокую общую стабильность in vivo. Температуру плавления антитела можно определять такими методами, как дифференциальная сканирующая калориметрия(Chen et al. (2003), Pharm. Res. 20: 1952-60; Ghirlando et al. (1999), Immunol. Lett. 68: 47-52). TM1 указывает температуру начального раскручивания антитела; TM2 указывает температуру полного раскручивания антитела. Обычно предпочтительно чтобы TM1 антитела по настоящему изобретению была выше 60 С,предпочтительно выше 65 С, ещ более предпочтительно выше 70 С. Или же термическую стабильность антитела можно определять методом кругового дихроизма (Murray et al. (2002), J. Chromatogr. Sci. 40: 343-9). В предпочтительном варианте изобретения выбирают антитела, которые не разлагаются быстро. Фрагментацию антитела против PTK7 можно измерять с помощью капиллярного электрофореза (СЕ) иMALDI-MS, хорошо изученных в уровне техники (Alexander A.J. and Hughes D.E. (1995), Anal. Chem. 67: 3626-32). В другом предпочтительном варианте изобретения выбирают антитела, которые имеют минимальные эффекты агрегации. Агрегация может привести к запуску нежелательного иммунного ответа и/или изменнных или нежелательных фармакокинетических свойств. Обычно антитела являются приемлемыми с агрегацией 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, ещ более предпочтительно 15% или менее, ещ более предпочтительно 10% или менее и ещ более предпочтительно 5% или менее. Агрегацию можно измерять несколькими методами, хорошо известными в уровне техники, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) на колонке для гель-проникающей хроматографии(SEC) и рассеяние света, для идентификации мономеров, димеров, триммеров или мультимеров. Методы создания (генной инженерией) антител. Как обсуждается выше, антитела против PTK7, имеющие VH и VK последовательности, раскрываемые в данном описании, можно использовать для создания новых антител против PTK7, модифицируяVH и/или VK последовательности или связанную(ые) с ними константую(ые) область(и). Поэтому в другом аспекте изобретения структурные признаки антитела против PTK7 по изобретению, например 3G8,3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8, используют для создания родственных по структуре антител противPTK7, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по изобретению,такое как связывание с человеческим PTK7. Например, одну или более областей CDR антител 3G8, 3G8a,4D5, 12 С 6, 12 С 6 а или 7 С 8 или их мутации можно объединять методами рекомбинантной ДНК с известными каркасными областями и/или другими CDR для создания дополнительных рекомбинантных антител против PTK7 по изобретению, обсуждаемых выше. Исходным материалом для метода генной инженерии является одна или более последовательностей VH и/или VK по данному описанию или одна или более их CDR областей. Для создания рекомбинантного (генно-инженерного) антитела нет необходимости фактически получить (т.е. экспрессировать в виде белка) антитело, имеющее одну или более VH и/или VK последовательностей по данному описанию или одну или более их CDR областей. Скорее информацию, содержащуюся в последовательности(ях), используют в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) "второго поколения", образованной(ых) из первоначальной(ых) последовательности(ей), а затем получают последовательность(и) "второго поколения" и экспрессируют в виде белка. Поэтому в другом варианте изобретение предусматривает способ получения антитела против PTK7,включающий:(a) предоставление (получение): (i) последовательности вариабельной области тяжлой цепи антитела, содержащей CDR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14, CDR2 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18, и/или(ii) последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела, содержащей CDR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и 28, CDR2 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 и 34, и/или CDR3 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 и 40;(b) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в вариабельной области тяжлой цепи антитела и/или в вариабельной области лгкой цепи антитела с целью создания по меньшей мере одной изменнной последовательности антитела;(c) экспрессию изменнной последовательности антитела в виде белка. Для получения и экспрессии последовательности изменнного антитела можно применять обычные методы молекулярной биологии. Предпочтительно антитело, кодированное последовательностью(ями) изменнного антитела, представляет собой антитело, которое сохраняет одно, некоторые или все из функциональных свойств антител против PTK7 по данному описанию, причм эти функциональные свойства включают, но без ограничения:(б) антитело связывает линию клеток опухоли Вильмса. Функциональные свойства изменнных антител можно оценивать стандартными анализами, имеющимися в уровне техники и/или представленными в данном описании, такими, которые приводятся в примерах (например, проточная цитометрия, анализы связывания). В некоторых вариантах способов получения антител с помощью генной инженерии (рекомбинантной ДНК) мутации можно вводить случайно (произвольно) или селективно по всей последовательности или на части последовательности, кодирующей антитело против PTK7, и полученные модифицированные антитела против PTK7 можно подвергать скринингу на активность связывания и/или другие функциональные свойства по данному описанию. Методы мутации описаны в уровне техники. Например, в опубликованной заявке PCT WO 02/092780 Short описывает методы создания и скрининга мутаций в антителе с помощью насыщающего мутагенеза, синтетической сборки сшиванием (лигированием) или их комбинацией. Или же в опубликованной заявке PCT WO 03/074679, принадлежащей Lazar et al., описывается применение методов компьютерного скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител. Нуклеотидные молекулы, кодирующие антитела по изобретению. Другой аспект изобретения относится к нуклеотидным молекулам, которые кодируют антитела по изобретению. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточных лизатах или в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или"практически чистой", если она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочным SDS, центрифугирование с CsCl2, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие общеизвестные методы. См. F. Ausubel, et al., ed. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеиновая кислота по изобретению может представлять собой, например, ДНК, РНК и может содержать или может не содержать интронные последовательности. В предпочтительном варианте изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получать обычными методами молекулярной биологии. В случае антител, экспрессированных в гибридомах (например, гибридомах, полученных от трансгенных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина, подробнее описанные ниже), кДНК,кодирующие лгкую и тяжлую цепи антитела, полученного при использовании гибридомы, можно получать обычными методами ПЦР-амплификации или кДНК клонирования. В случае антител, полученных при использовании библиотеки генов иммуноглобулинов (например, методом фагового дисплея),нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно получать из библиотеки. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами по изобретению являются такие нуклеиновые кислоты, которые кодируют VH и VL последовательности моноклональных антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6,12 С 6 а или 7 С 8. Последовательности ДНК, кодирующие VH последовательности моноклональных антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8, показаны в SEQ ID NO: 41 (3G8 и 3G8a), 42 (4D5), 43 (12 С 6 и 12 С 6 а) и 44 (7 С 8). Последовательности ДНК, кодирующие VL последовательности моноклональных антител 3G8, 3G8a, 4D5, 12 С 6, 12 С 6 а и 7 С 8, показаны в SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49 и 50 соответственно. Когда получены фрагменты ДНК, кодирующие сегменты VH и VL, эти фрагменты ДНК можно далее обрабатывать стандартными методами рекомбинантной ДНК, например превращать гены вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены фрагмента Fab или в ген scFv. В ходе этой обработки фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, функционально связывается с другим фрагментом ДНК,кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Предполагается,что выражение "функционально связанный" в данном контексте означает, что два фрагмента ДНК связываются таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК,остаются в рамке считывания. Выделенную ДНК, кодирующую VH область, можно превратить в полноразмерный ген тяжлой цепи функциональным связыванием ДНК, кодирующей VH, в другую ДНК, кодирующую константные области тяжлой цепи (CH1, CH2 и СН 3). Последовательности генов константных областей человеческой тяжлой цепи известны в уровне техники (см., например, Kabat, E.A., et al. (1991), Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242), а ДНК фрагменты, охватывающие эти области, можно получать стандартной ПЦРамплификацией. Константная область тяжлой цепи может быть константной областью IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно является константной областью IgG1 илиIgG4. Для гена Fab фрагмента тяжлой цепи ДНК, кодирующая VH, может быть функционально связана с другой ДНК, кодирующей только константную область тяжлой цепи CH1. Выделенную ДНК. кодирующую область VL, можно превратить в полноразмерный ген лгкой цепи(а также в ген Fab лгкой цепи) функциональным связыванием ДНК, кодирующей VL, с другой ДНК,кодирующей константную область лгкой цепи, CL. Последовательности генов, кодирующих константную область человеческой лгкой цепи, известны в уровне техники (см., например, Kabat, E.A., et al.Services, NIH Publication. No. 91-3242), а ДНК фрагменты, охватывающие эти области, можно получать стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область лгкой цепи может быть константной областью каппа или лямбда, но наиболее предпочтительно является константной областью каппа цепи. Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, функционально связываются с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так что последовательности VH и VL могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, при этом VL и VH области соединены гибким (подвижным) линкером (см., например, Bird et al. (1988), Science. 242: 423-426; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 58795883; McCafferty et al. (1990), Nature. 348: 552-554). Получение моноклональных антител по изобретению. Моноклональные антитела (mAbs) по настоящему изобретению можно получать различными методами, включая обычные методы получения моноклональных антител, например стандартные методы гибридизации соматических клеток Kohler and Milstein (1975), Nature. 256: 495. Хотя методы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, можно применять другие методы получения моноклонального антитела, например трансформацию В лимфоцитов под действием вирусов или онкогенов. Предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышиная система. Получение гибридом в мыши является общепринятой процедурой. Протоколы иммунизации и методы выделения спленоцитов иммунизированных мышей для слияния известны в уровне техники. Партнры по слиянию (например, клетки мышиной миеломы) и методы слияния также известны. Химерные или гуманизированные антитела по настоящему изобретению можно получать исходя из последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующие тяжлые и лгкие цепи иммуноглобулинов, можно получать из представляющей интерес мышиной гибридомы и стандартными методами молекулярной биологии преобразовывать таким образом, чтобы они содержали немышиные (например, человеческие) иммуноглобулиновые последовательности. Например, для создания химерного антитела мышиные вариабельные области можно связывать с человеческими константными областями, используя методы, известные в уровне техники (см., например, патент США 4816567, выданный Cabilly et al.). Для создания гуманизированного антитела мышиныеCDR области можно включить в человеческую каркасную область методами, известными в уровне техники (см., например, патент США 5225539, выданный Winter, и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.). В предпочтительном варианте антитела по изобретению представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела к PTK7 можно получать, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих фрагменты скорее человеческой, нежели мышиной иммунной системы. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, называемых в данном описании HuMAb мыши и KM мыши соответственно и в целом называемых в данном описании "мыши с человеческим Ig".HuMAb мышь (Medarex, Inc.) содержит минилокусы гена человеческого иммуноглобулина, которые кодируют переаранжированные человеческие последовательности тяжлой ( и ) и лгкойцепей иммуноглобулина, вместе с нацеленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусыицепей (см., например, Lonberg, et al. (1994), Nature. 368(6474): 856-859). Поэтому у мышей наблюдается пониженная экспрессия мышиного IgM или , и в ответ на иммунизацию введнные трансгены человеческой тяжлой и лгкой цепей претерпевают переключение класса и соматические мутации, давая высокоаффинное моноклональное человеческое антитело IgG (Lonberg, N. et al. (1994), см. выше; обзор в(1995), Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 и Harding, F. and Lonberg, N. (1995), Ann. NY. Acad. Sci. 764: 536546). Получение и применение HuMAb мышей и геномных модификаций, которые несут эти мыши, подробнее описано в Taylor, L. et al. (1992), Nucleic Acids Research. 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993),International Immunology. 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 3720-3724; Choi(1996), Nature Biotechnology. 14: 845-851, содержание всех этих ссылочных материалов вводится ссылкой в данное описание во всей полноте. См. далее патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все они выданы Lonberg and Kay; патент США 5545807, выданный Surani et al.; опубликованные заявки PCT WO 92/03918, WO 93/12227,WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962, все выданные Lonberg and Kay, и опубликованную заявку PCT WO 01/14424, выданную Korman et al. В другом варианте можно получать человеческие антитела по изобретению, используя мышь, несущую последовательности человеческих иммуноглобулинов на трансгенах и трансхромосомах, такую как мышь, несущую трансген человеческой тяжлой цепи и трансхромосому с геном человеческой лгкой цепи. Такие мыши, называемые в данном описании "KM мыши", подробно описаны в опубликованной заявке PCT WO 02/43478 Ishida et al. Далее, альтернативные системы трансгенных животных, экспрессирующие гены человеческих иммуноглобулинов, имеются в уровне техники и могут использоваться для получения антител по изобретению, специфичных к PTK7. Например, может использоваться альтернативная трансгенная система, названная Xenomouse (Abgenix, Inc.), такие мыши описаны, например, в патентах США 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, выданных Kucherlapati et al. Кроме того, альтернативные системы трансхромосомных животных, экспрессирующие гены человеческих иммуноглобулинов, имеются в уровне техники и могут использоваться для получения антител по изобретению, специфичных к PTK7. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому с геном человеческой тяжлой цепи, так и трансхромосому с геном человеческой лгкой цепи,названных "ТС мыши", такие мыши описаны Tomizuka et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 722727. Далее, в уровне техники описаны коровы, несущие трансхромосомы с генами человеческой тяжлой и лгкой цепей (Kuroiwa et al. (2002), Nature Biotechnology. 20: 889-894), и их можно использовать для получения антител по изобретению, специфичных к PTK7. Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно также получать методами фагового дисплея для скрининга библиотек генов человеческого иммуноглобулина. Такие методы фагового дисплея для выделения человеческих антител известны в уровне техники. См., например, патенты США 5223409; 5403484 и 5571698, выданные Ladner et al.; патенты США 5427908 и 5580717, выданные Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно также получать, используя мышейSCID, у которых человеческие иммунные клетки были восстановлены таким образом, что в ответ на иммунизацию вырабатывается человеческое антитело. Такие мыши описаны, например, в патентах США 5476996 и 5698767, выданных Wilson et al. Иммунизация мышей с человеческим Ig. Если для выработки человеческих антител по изобретению используют мышей с человеческим Ig,таких мышей можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом PTK7 антигена и/или рекомбинантным PTK7 или слитым белком PTK7, как описано Lonberg, N. et al. (1994), Nature. 368PCT WO 98/24884 и WO 01/14424. Предпочтительно в момент первой инфузии мышам должно быть 6-16 недель. Например, для интраперитонеальной иммунизации мышей с человеческим Ig можно использовать очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) PTK7 антигена. Методы получения полностью человеческих моноклональных антител к PTK7 подробно описаны ниже, в примере 1. Опыт, накопленный в ходе работы с различными антигенами, показал, что у трансгенных мышей ответ вырабатывается, когда их сначала иммунизируют интраперитонеально (и.п., IP) антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующими иммунизациями IP через неделю (всего вплоть до 6 иммунизаций) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Однако найдено также, что эффективными могут быть другие адъюванты, нежели адъювант Фрейнда. Кроме того, найдено, что целые клетки в отсутствие адъюванта являются высокоиммуногенными. В процессе протокола иммунизации можно проводить мониторинг иммунного ответа, используя образцы плазмы, полученные при ретроорбитальном кровоизлиянии. Скрининг плазмы можно проводить методами ELISA (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина против PTK7 можно использовать для слияния. Мышей можно иммунизировать с помощью внутривенной бустер-инъекции за 3 дня до умерщвления и извлечения селезнки. Для каждого антигена обычно иммунизируют от 6 до 24 мышей. Обычно используют как HCo7, так и HCo12 штаммы. Кроме того, как HCo7, так и HCo12 трансген можно выращивать совместно в одной мыши, несущей два различных трансгена человеческой тяжлой цепи(HCo7/HCo12). Или же или вместо этого, можно использовать штамм KM мыши, как описано в примере 1. Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по изобретению. Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по изобретению, можно выделять спленоциты и/или клетки лимфатических узлов из иммунизированных мышей и сливать их с подходящей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные в результате гибридомы можно подвергнуть скринингу на продуцирование антигенспецифических антител. Например, суспензии одиночных клеток, лимфоцитов селезнки иммунизированных мышей можно сливать с одной шестой от числа Р 3 Х 63-Ag8.653 несекретирующих клеток мышиной миеломы (АТСС, CRL 1580) с 50% ПЭГ. Клетки засевают при плотности около 2105 в плоскодонный титрационный микропланшет, а затем инкубируют в течение двух недель в селективной среде,содержащей 20% фетальной сыворотки для клонирования, 18% кондиционированной среды "653", 5% оригена (IGEN), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 5 мМ HEPES, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола,50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина и 1X HAT (Sigma; HAT добавляют через 24 ч после слияния). Примерно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой HAT заменяют на НТ. Затем отдельные лунки можно подвергать скринингу с помощью ELISA на человеческие моноклональные антитела IgM и IgG. Когда происходит интенсивный рост гибридом, за средой можно наблюдать обычно через 10-14 дней. Антитело, секретирующее гибридомы, можно пересевать, снова проводить скрининг, и в случае положительной пробы на IgG моноклональные антитела можно субклонировать по меньшей мере дважды при ограниченном разведении. Стабильные субклоны можно затем культивировать in vitro для получения малых количеств антитела в тканевой культуральной среде с целью определения характеристик. Для очистки человеческих моноклональных антител выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Перед аффинной хроматографией на протеин А-сефарозе (Pharmacia, Piscataway, N.J.) супернатанты можно отфильтровать и концентрировать. Элюированный IgG можно проверять с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы гарантировать чистоту. Буферный раствор можно заменить на PBS и концентрацию можно определить с помощью OD280, используя коэффициент экстинкции 1.43. Аликвоты моноклональных антител можно хранить при -80 С. Получение трансфектом продуцирующих моноклональные антитела по изобретению. Антитела по изобретению также можно продуцировать в трансфектоме клетки-хозяина, используя,например, комбинацию методов рекомбинантной ДНК и методов трансфекции (встраивания) генов, хорошо известную в уровне техники (например, Morrison, S. (1985), Science. 229: 1202). Например, для экспрессии антител или фрагментов антител ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные лгкие и тяжлые цепи, можно получать обычными методами молекулярной биологии (на- 24017812 пример, ПЦР-амплификацией или клонированием кДНК, используя гибридому, которая экспрессирует антитело, представляющее интерес), и ДНК можно включить в векторы экспрессии так, чтобы гены были функционально связаны с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. Предполагается, что в этом контексте выражение "функционально связаны" означает, что ген антитела лигируют в вектор таким образом, что последовательности контроля транскрипции и трансляции в векторе выполняют свою предполагаемую функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности регуляции экспрессии выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген лгкой цепи антитела и ген тяжлой цепи антитела можно вставить в отдельный вектор или, чаще, оба гена встраивают в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела встраивают в вектор экспрессии стандартными методами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции к фрагменту гена антитела и вектору или лигированием по тупым концам, если отсутствуют сайты рестрикции). Вариабельные области лгкой и тяжлой цепей антител по данному описанию можно использовать для создания полноразмерных генов антител по данному описанию любого изотипа антител, встраивая их в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжлой цепи и константные области лгкой цепи заданного изотипа, так, чтобы VH сегмент функционально связывался с CH сегментом (сегментами), a VK сегмент функционально связывался с CL сегментом внутри вектора. Кроме того или вместо того, вектор рекомбинантной экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, чтобы сигнальный пептид связывался в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из неиммуноглобулинового белка). Помимо генов цепей антитела, векторы экспрессии рекомбинантных генов по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клеткехозяине. Предполагается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы аденилирования), которые регулируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны,например, у Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,CA (1990. Специалист в данной области техники понимает, что дизайн вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина,которую следует трансформировать, уровень экспрессии нужного белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке млекопитающего-хозяина включают вирусные элементы, которые управляют высоким уровнем экспрессии белка в клетках млекопитающего, такие как промоторы и/или энхансеры цитомегаловируса (CMV), вируса симиан-40 (SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP) и вируса полиомы). Или же можно использовать невирусные регуляторные последовательности из различных источников, такие как промотор убиквитина или промотор -глобина. Далее, можно использовать регуляторные элементы, такие как SR промоторная система, которая содержит последовательности раннего промотора SV40 и длинный концевой повтор вируса человеческого T-клеточного лейкоза типа 1 (Takebe, Y. et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 466472). Помимо генов цепей антитела и регуляторных последовательностей, векторы экспрессии рекомбинантных генов по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетке-хозяине (например, ориджины репликации) и селективные маркерные гены (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017, все выданы Axel et al.). Например, обычно селективный маркерный ген придат резистентность к лекарствам, таким как G418, гигромицину или метотрексату, клетке-хозяину, в которую вектор введн. Предпочтительные селективные маркерные гены включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках-хозяевах для селекции/амплификации с метотрексатом) и ген neo (для G418 селекции). Для экспрессии лгкой и тяжлой цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующий(ие) тяжлую и лгкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина обычными методами. Предполагается, что различные формы термина "трансфекция" охватывают широкий ряд методов, применяемых обычно для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с применением DEAE-декстрана и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, более предпочтительна экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно в клетках хозяев-млекопитающих, так как такие эукариотические клетки, и в особенности клетки млекопитающих, скорее чем прокариотические, подходят для сборки и секретирования соответствующим образом сложенного и иммунологически активного антитела. Сообщалось, что экспрессия антитела в прокариотических клетках неэффективна для получения активного антитела с высоким выходом (Boss, M.A. and Wood, С.R. (1985), Immunology Today. 6: 12-13). Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (СНО клетки) (включая "дрейфующие"Biol. 759: 601-621), клетки NSO миеломы, клетки COS и клетки SP2. В частности, для применения с клетками миеломы NSO другая предпочтительная система представляет собой систему экспрессии GS гена, описанную в международных патентных заявках WO 87/04462, WO 89/01036 и в Европейском патенте ЕР 338841. Если векторы экспрессии рекомбинантной ДНК вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела можно выделить из культуральной среды стандартными методами очистки белков. Характеристика связывания антитела с антигеном. Антитела по изобретению можно проверять на связывание с PTK7, например, стандартным методом ELISA. Коротко говоря, микротитрационные планшеты покрывают очищенной PTK7 с концентрацией 0,25 мкг/мл в PBS, а затем блокируют 5% бычьим сывороточным альбумином в PBS. Разведения антитела (например, разведения плазмы иммунизированных PTK7 мышей) добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1-2 ч при 37 С. Планшеты отмывают PBS/Твин (Tween), а затем инкубируют вторичным реагентом (например, для человеческих антител специфическим поликлональным реагентомантителом козы против человеческого IgG Fc), конъюгированным со щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37 С. После отмывания планшеты проявляют pNPP-субстратом (1 мг/мл) и анализируют при OD 405-650. Предпочтительно для слияния берут мышей с наивысшими титрами. Анализ ELISA, описанный выше, можно использовать также для скрининга на гибридомы, которые проявляют позитивную реактивность в отношении PTK7 иммуногена. Гибридомы, которые с высокой авидностью связываются с PTK7, субклонируют и характеризуют более детально. Один клон каждой гибридомы, который сохраняет реактивность родительских клеток (методом ELISA), можно выбрать для создания банка клеток из 5-10 ампул, которые хранят при -140 С, и для очистки антитела. Для очистки антител против PTK7 выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Перед аффинной хроматографией на протеин-Асефарозе (Pharmacia, Piscataway, NJ) супернатанты можно профильтровать и концентрировать. Элюированный IgG можно проверять с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы гарантировать чистоту. Буферный раствор можно заменить на PBS и концентрацию можно определить с помощью OD280, используя коэффициент экстинкции 1,43. Аликвоты моноклональных антител можно хранить при -80 С. Для того чтобы проверить, действительно ли селективные моноклональные антитела против PTK7 связываются с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать, используя продажные реагенты (Pierce, Rockford, IL). Изучение конкурентного связывания с применением немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител можно проводить, используя покрытые PTK7 планшеты для ELISA, описанные выше. Связывание биотинилированного mAb можно обнаруживать с помощью комплекса стреп (strep)-авидин-щелочная фосфатаза. Для определения изотипа очищенных антител можно проводить анализ ELISA изотипов с применением реагентов, специфических к антителам конкретного изотипа. Например, для определения изотипа человеческого моноклонального антитела лунки микротитрационных планшетов можно покрывать антителом против человеческого иммуноглобулина с концентрацией 1 мкг/мл в течение ночи при 4 С. Блокируют с помощью 1% BSA, планшеты оставляют реагировать с тестируемыми моноклональными антителами или с очищенными контрольными изотипами с концентрацией 1 мкг/мл или менее при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Затем лунки оставляют для реакции с зондами реагентов, специфических либо к человеческому IgG1, либо к человеческому IgM, конъюгированных со щелочной фосфатазой. Планшеты проявляют и анализируют, как описано выше. Далее методом Вестерн-блоттинга можно проверять реактивность человеческих IgG против PTK7 в отношении антигена PTK7. Короче говоря, можно получить PTK7 и провести его электрофорез в акриламидном геле в системе додецилсульфата. После электрофореза разделнные PTK7 переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 10% фетальной телячьей сывороткой и анализируют с помощью зондов испытуемых моноклональных антител. Связывание с человеческим IgG можно детектировать, используя щелочную фосфатазу против человеческого IgG и проявляя таблетками субстратаBCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). Иммуноконъюгаты. В другом аспекте настоящее изобретение включает антитело против PTK7 или его фрагмент, конъюгированное(ый) с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин, лекарство (например, иммунодепрессант (иммуносупрессор или радиотоксин. Такие конъюгаты в данном описании называются "иммуноконъюгатами". Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, называют"иммунотоксинами." Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является пагубным для клеток (например, убивает их). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D,этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D,1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают также, например, антиметаболиты (например,метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-флуорурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин(CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманит, стрептозотоцин, митомицин С и цисдихлордиаминплатина (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Другие предпочтительные примеры терапевтических цитотоксинов, которые можно конъюгировать с антителом по изобретению, включают дуокармицины, калихеамицины, майтанзины (maytansines) и ауристатины (auristatines) и их производные. Пример конъюгата калихеамицина с антителом является продажным (Mylotarg; Wyeth-Ayerst). Примеры терапевтических цитотоксинов можно найти, например, в патентах США 6548530 и 6281354 и патентных заявках СШАUS 2003/0064984,US 2003/0073852 и US 2003/0050331. Цитотоксины можно конъюгировать с антителами, используя линкеры, известные в уровне технике. Примеры типов линкеров, которые используются для конъюгации цитотоксина с антителом, включают,но без ограничения, гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептидсодержащие линкеры. Можно выбирать линкер, который, например, чувствителен к расщеплению при низких рН в лизосомном компартменте или чувствителен Ра расщеплению протеазами, такими как протеазы, преимущественно экспрессируемые в опухолевой ткани, такие как катепсины (например, катепсины В, С, D). Более подробное обсуждение типов цитотоксинов, линкеров и методов конъюгации терапевтических агентов с антителами см. также в Saito, G. et al. (2003), Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A.et al. (2003), Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003), Cancer Cell. 3: 207-212; Allen,T.M. (2002), Nat. Rev. Cancer. 2: 750-763; Pastan, I. and Kreitman, R.J. (2002), Curr. Opin. Investig. Drugs. 3: 1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001), Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264. Антитела по настоящему изобретению можно также конъюгировать с радиоактивным изотопом с образованием цитотоксических радиофармацевтических веществ, также называемых радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые можно конъюгировать с антителами для диагностического или терапевтического применения, включают, но без ограничения, йод 131, индий 111, иттрий и лютеций 177. Способ получения радиоиммуноконъюгатов широко известен в уровне техники. Примеры иммуноконъюгатов являются продажными, включая Zevalin (IDEC Pharmaceuticals) и Bexxar (CorixaPharmaceuticals), и аналогичные методы можно применять для получения радиоиммуноконъюгатов, в которых используются антитела по изобретению. Конъюгаты антител по изобретению можно использовать для модификации данного биологического ответа, а лекарственный агент не следует рассматривать как ограничивающийся классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственный агент может представлять собой белок или полипептид, обладающий заданной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин pseudomonas или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолевых клеток или интерферон-; или модификаторы биологического ответа, например лимфокины, интерлейкин-1 ("IL-1"),интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ("GM-CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие факторы роста. Методы конъюгации такого терапевтического агента с антителами хорошо известны, см., например,Anion et al. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drags In Cancer Therapy", в MonoclonalConjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982). Биспецифические молекулы. В другом аспекте настоящее изобретение включает биспецифические молекулы, содержащие антитело против PTK7 или его фрагмент по изобретению. Антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент можно дериватизировать или связывать с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом к рецептору), для получе- 27017812 ния биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или целевыми молекулами. На самом деле антитело по изобретению может быть дериватизировано или связано более чем с одной другой функциональной молекулой с образованием полиспецифических молекул, которые связываются более чем с двумя различными сайтами связывания и/или целевыми молекулами; предполагается, что такие полиспецифические молекулы также охватываются термином "биспецифическая молекула" по данному описанию. Для создания биспецифической молекулы по изобретению антитело по изобретению можно функционально связывать (например, химической связью,генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или иным способом) с одной или более других связывающих молекул, таких как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или миметик связывания, так что образуется биспецифическая молекула. Поэтому настоящее изобретение включает биспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере одну первую специфичность связывания с PTK7 и вторую специфичность связывания второго целевого эпитопа. В конкретном варианте изобретения второй целевой эпитоп представляет собойFc-рецептор, например рецептор человеческого FcRI (CD64) или человеческого Fc (CD89). Таким образом, изобретение включает биспецифические молекулы, способные связываться как с эффекторными клетками, экспрессирующими FcR или FcR (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарными клетками (PMN, так и с клетками-мишенями, экспрессирующими PTK7. Эти биспецифические молекулы нацеливают клетки, экспрессирующие PTK7, на эффекторные клетки и запускают (инициируют) опосредованные Fc-рецептором активности эффекторных клеток, такие как фагоцитоз экспрессирующих PTK7 клеток, антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ, ADCC), высвобождение цитокина или образование супероксид-аниона. В одном варианте изобретения, в котором биспецифическая молекула является полиспецифической,молекула должна дополнительно включать третью специфичность связывания, помимо специфичности связывания с антителом против Fc и специфичности связывания с антителом против PTK7. В одном варианте изобретения третья специфичность связывания представляет собой участок антитела к фактору усиления (активации) (EF), например молекула, которая связывается с поверхностным белком, включнным в цитотоксическую активность и, тем самым, повышает иммунный ответ против целевой клетки."Участок антитела к фактору усиления" может представлять собой антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с данной молекулой, например антигеном или рецептором, и,тем самым, приводит к усилению эффекта связывания детерминант с рецептором для Fc-фрагмента или антигеном целевой клетки. "Участок против фактора усиления" может связывать рецептор дляFc-фрагмента или антиген целевой клетки или же "участок антитела против фактора усиления" может связываться с объектом, отличным от объекта, с которым связываются первая и вторая специфичности. Например, участок против фактора усиления может связывать цитотоксическую T-клетку (например,через посредство CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 или другую иммунную клетку, что приводит к повышению иммунного ответа на целевую клетку). В одном варианте изобретения биспецифические молекулы по изобретению содержат в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело или его антительный фрагмент, включая,например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv. Антитело может также представлять собой димер лгкой или тяжлой цепи или любой его минимальный фрагмент, такой как Fv, или одноцепочечную конструкцию, такую как описана Ladner et al. патент США 4946778, содержание которого однозначно вводится в данное описание в качестве ссылки. В одном варианте изобретения специфичность связывания с Fc рецептором обеспечивается моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином G (IgG). Термин "IgG рецептор" по данному описанию относится к любому из восьми генов -цепи, локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют в целом 12 трансмембранных или растворимых рецепторных изоформ, которые сгруппированы в три класса Fc рецепторов: FcRI (CD64), FcRII (CD32) и FcRIII(CD16). В одном предпочтительном варианте изобретения Fc рецептор представляет собой высокоаффинный FcRI. Человеческий FcRI представляет собой молекулу протяжнностью 72 кДа, обладающую высокой аффинностью к IgG (108-109 М-1). Получение и определение характеристик некоторых предпочтительных моноклональных антител против Fc описаны Fanger et al. в опубликованной заявке PCT WO 88/00052 и в патенте США 4954617, раскрытие которых полностью вводится в данное описание в качестве ссылки. Эти антитела связываются с эпитопом FcRI, FcRII или FcRIII по сайту, который отличен от сайта связывания Fc, и,следовательно, их связывание практически не блокируется физиологическими уровнями IgG. Антителами, специфическими к FcRI, применимыми по данному изобретению, являются mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 и mAb 197. Гибридома, продуцирующая mAb 32, имеется в Американской типовой коллекции клеточных культур, АТСС Accession No. HB9469. В других вариантах изобретения антитело к Fc рецептору представляет собой гуманизированную форму моноклонального антитела 22 (Н 22). Получение и определение характеристик моноклонального антитела Н 22 описано в Graziano, R.F. et al. (1995), J. щая антитело Н 22, депонирована в Американской типовой коллекции клеточных культур под названиемHA022CL1 и имеет регистрационный номер CRL 11177. В других вариантах изобретения специфичность связывания с Fc-рецептором обеспечивается антителом, которое связывается с рецептором для человеческого IgA, например с Fc-альфа рецептором(FcRI (CD89, связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулиномA (IgA). Предполагается, что термин "IgA рецептор (рецептор для IgA)" включает генный продукт одного -гена (FcRI), локализованного на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует некоторые полученные при альтернативном сплайсинге трансмембранные изоформы протяжнностью от 55 до 110 кДа.FcRI (CD89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяциях эффекторных клеток. FcRI имеет среднюю аффинность(5107 М-1) как к IgA1, так и к IgA2, которая повышается при экспозиции с цитокинами, такими какG-CSF или GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996), Critical Reviews in Immunology. 16: 423-440). Описаны четыре моноклональных антитела, специфических к FcRI, идентифицированные как A3, А 59, А 62 и А 77, которые связывают FcRI вне лигандсвязывающего домена IgA (Monteiro, R.C. et al. (1992), J.FcRI и FcRI являются предпочтительными запускающими рецепторами (рецепторамипереключателями) для применения в биспецифических молекулах по изобретению, так как они (1) экспрессируются главным образом на иммунных эффекторных клетках, например моноцитах, PMN, макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются с высокими уровнями (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, ADCC, фагоцитоз); (4) опосредуют повышенную антигенную презентацию антигенов, включая аутоантигены, нацеленные на них. Хотя предпочтительными являются человеческие моноклональные антитела, в биспецифических молекулах по изобретению можно использовать другие антитела, мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела. Биспецифические молекулы по настоящему изобретению можно получать конъюгацией составляющих специфичностей связывания, например анти-FcR и анти-PTK7 специфичностей связывания, методами, известными в уровне техники. Например, каждую специфичность связывания биспецифической молекулы можно получать по отдельности, а затем конъюгировать их друг с другом. Если специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно использовать различные конденсирующие или сшивающие агенты. Примеры сшивающих агентов включают белок А, карбодиимид, N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA),5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), о-фенилендималеимид (oPDM), N-сукцинимидил-3(2-пиридилтио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат (sulfo-SMCC) (см., например, Karpovsky et al. (1984), J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M.A. et al.(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 8648). Другие методы включают методы, описанные в PaulusImmunol. 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются SATA иsulfo-SMCC, оба получают от Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Если специфичности связывания представляют собой антитела, их можно конъюгировать, связывая сульфгидрильной связью С-концевые шарнирные области двух тяжлых цепей. В особенно предпочтительном варианте изобретения шарнирную область модифицируют таким образом, чтобы перед конъюгацией она содержала нечтное число сульфгидрильных связей, предпочтительно одну. Или же обе специфичности связывания можно кодировать в одном векторе и экспрессировать и собирать в одной и той же клетке-хозяине. Этот метод особенно применим в тех случаях, когда биспецифичесая молекула представляет собой слитый белок mAbmAb, mAbFab, FabF(ab')2 или лигандFab. Биспецифическая молекула по изобретению может быть одноцепочечной молекулой, содержащей одно одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечной биспецифической молекулой, содержащей две связывающие детерминанты. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения биспецифических молекул описаны,например, в патентах США 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498; 5482858. Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтвердить, например, твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), радиоиммуноанализом (RIA), FACS анализом, биоанализом (например, ингибированием роста) или Вестерн-блоттингом. Каждый из этих методов анализа позволяет обнаруживать присутствие комплексов белок-антитело, представляющих конкретный интерес, с помощью меченого реагента (например, антитела), специфического к представляющему интерес комплексу. Например, комплексы FcR-антитело можно детектировать, используя, например, связанное с ферментом антитело или фрагмент антитела, которое(ый) распознат и специфически связывается с комплексами антитело-FcR. Или же комплексы можно детектировать, используя любой из множества других иммуноанализов. Например, антитело можно метить радиоактивной меткой и использовать в радиоиммуноанализе (RIA) (см., например, Weintraub, В., Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, это пособие