Соединения, пригодные для лечения дегенеративных и воспалительных заболеваний

СОЕДИНЕНИЯ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Настоящее изобретение относится к соединение формулы VIa Мене Кристель Жанн Мари, Блан Хавьер (BE) Медведев В.Н. (RU) или его фармацевтически приемлемой соли. Это соединение можно получать в виде фармацевтической композиции и можно использовать для предотвращения и лечения различных состояний у млекопитающих, включая людей, где состояния включают в качестве неограничивающего примера заболевания, включающие деградацию хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацию суставов, например остеоартрит; и/или состояния, включающие воспаление или иммунные ответы, такие как болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз,заболевания, связанные с респираторной аллергией (например, астма, ринит), юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительные заболевания кишечника, болезненные состояния,обусловленные эндотоксином (например, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующим, например, хронической сердечной недостаточности), заболевания, включающие нарушение ремоделирования хрящевой ткани(например, заболеваний, включающих анаболическую стимуляцию хондроцитов), врожденные мальформации хрящевой ткани, заболевания, связанные с повышенной секрецией IL6 и отторжением трансплантата (например, отторжение органного трансплантата), и пролиферативные заболевания. Область изобретения Настоящее изобретение относится к соединениям, которые являются ингибиторами JAK, семейства тирозинкиназ, которые включены в модуляцию деградации хрящевой ткани, дегенерацию суставов и к заболеваниям, включающим подобную деградацию и/или воспаление. Настоящее изобретение также относится к способам получения этих соединений, фармацевтических композиций, содержащих эти соединения, способам предупреждения и/или лечения заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани,костной ткани и/или деградацию суставов, состояний, включающих воспаление или иммунные ответы,болезненных состояний, обусловленных эндотоксином, заболеваний, включающих нарушение ремоделирования хрящевой ткани (например, заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов), врожденных мальформаций хрящевой ткани, заболеваний, ассоциированных с повышенной секрецией IL6, пролиферативных заболеваний и отторжений при трансплантации (например, отторжение органного трансплантата); и/или способам предупреждения и/или лечения заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани, деградацию и/или воспаление суставов посредством введения соединения по изобретению. Янус-киназы (JAK) представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, которые осуществляют передачу цитокинового сигнала с мембранных рецепторов к факторам транскрипции STAT. Описано четыре члена семейства JAK: это JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. При связывании цитокина с его рецептором члены семейства JAK ауто- и/или трансфосфорилируют друг друга с последующим фосфорилированиемSTAT, которые затем перемещаются в ядро для регулирования транскрипции. Внутриклеточную передачу сигнала JAK-STAT используют интерфероны, большинство интерлейкинов, а также ряд цитокинов и эндокринных фактров, таких как ЕРО, ТРО, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF, PRL Vainchenker W. et al.(2008). Комбинация генетических моделей и исследование низкомолекулярного ингибитора JAK выявили терапевтические возможности некоторых JAK. Исследования генетики человека и мыши подтверждают возможность использования JAK3 в качестве мишени для подавления иммунного ответа (О'Shea J. et al.(2004. Ингибиторы JAK3 успешно подвергали клиническим исследованиям, первоначально по поводу отторжения органного трансплантата, но позднее также по поводу других иммуновоспалительных показаний, таких как ревматоидный артрит (RA), псориаз и болезнь Крона (http://clinicaltrials.gov/).TYK2 является потенциальной мишенью при иммуновоспалительных заболеваниях, подтверждаемой исследованиями генетики человека и нокаутных мышей (Levy D. and Loomis С. (2007.JAK1 являются новой мишенью в области иммуновоспалительных заболеваний. Для передачи запускаемого цитокинами провоспалительного сигнала JAK1 образует гетеродимер с другими JAK. Таким образом, ингибирование JAK1 и/или других JAK, как ожидают, будет иметь терапевтическое преимущество для ряда воспалительных состояний, а также для других заболеваний, обусловленных JAKопосредованной передачей сигнала. Предпосылки изобретения Хрящевая ткань представляет собой ткань, лишенную сосудов, в которой главный клеточный компонент представлен хондроцитами. Хондроциты в нормальном суставном хряще занимают приблизительно 5% объема ткани, в то время как внеклеточный матрикс заполняет оставшиеся 95% ткани. Хондроциты секретируют компоненты матрикса, в основном протеогликаны и коллагены, которые, в свою очередь, обеспечивают хондроцитам условия, подходящие для их выживаемости при механической нагрузке. В хрящевой ткани коллаген типа II вместе с белком - коллагеном типа IX образуют твердые фибриллоподобные структуры, которые обеспечивают хрящевую ткань большой механической прочностью. Протеогликаны могут абсорбировать воду и являются ответственными за эластичные и амортизирующие свойства хрящевой ткани. Одним из функциональных значений хрящевой ткани в суставе является обеспечение правильного соединения костей друг с другом. Утрата суставного хряща, таким образом, влечет за собой трение костей друг о друга, что приводит к боли и потере подвижности. Деградация хрящевой ткани может иметь различные причины. При воспалительных артритах, таких как, например, ревматоидный артрит, деградация хрящевой ткани обусловлена секрецией воспаленными тканями (воспаленной синовиальной оболочкой, например) протеаз (например, коллагеназ). Деградация хрящевой ткани может также являться результатом повреждения хрящевой ткани, результатом травмы или хирургического вмешательства, или повышенной нагрузки или изнашивания. Способность хрящевой ткани к регенерации после подобных повреждений ограничена. Хондроциты в поврежденной хрящевой ткани часто проявляют сниженную синтезирующую активность хрящевой ткани (анаболическую) и/или повышенную деградирующую активность хрящевой ткани (катаболическую). Дегенерация хрящевой ткани является отличительным признаком различных заболеваний, среди которых ревматоидный артрит и остеоартрит являются наиболее значимыми. Ревматоидный артрит (RA) представляет собой хроническое суставное дегенеративное заболевание, характеризующееся воспалением и деструкцией суставных структур. Если заболевание не контролируется, это приводит к существенной потере трудоспособности и боли вследствие потери функциональных свойств суставов и даже к преждевременной смерти. Целью терапии RA, таким образом, является не только замедление течения заболевания, но и достижение ремиссии, с целью прекращения суставной деструкции. Кроме того, тяжесть исхода заболевания, высокая распространенность RA (во всем мире поражено 0,8% взрослого населения) означает высокие социально-экономические последствия (для обзора по RA заявители ссылаются на Smolen и Steiner (20 03); Lee и Weinblatt (20 01); Choy и Panayi (2001); О'Dell (2004) и Firestein(2003. Остеоартрит (также обозначаемый как ОА или артрит изнашивания) представляет собой наиболее общую форму артрита и характеризуется утратой суставного хряща, что часто связано с гипертрофией кости и болью. Заболевание в основном поражает руки и суставы, несущие весовую нагрузку, такие как коленные, тазобедренные суставы и суставы позвоночника. Этот процесс истончает хрящевую ткань. Если вследствие истончения исчезла площадь поверхности, остеоартрит достигает степени I; если исчезла площадь поверхности тангенциальной зоны, остеоартрит достигает степени II. Существуют дополнительные степени дегенерации и деструкции, при которых затронуты глубокие и кальцинированные слои хрящевой ткани, граничащие с субхондральной костью. Для более подробного обзора по остеоартриту заявители ссылаются на Wieland et al., 2005. Клинические проявления развития остеоартритного состояния представляют собой увеличенный размер сустава, боль, крепитацию и функциональную нетрудоспособность сустава, что приводит к боли и сниженной подвижности суставов. При дальнейшем развитии заболевания появляется боль в состоянии покоя. Если состояние остается без коррекции и/или лечения, сустав разрушается, что приводит к потере трудоспособности. Затем требуется реконструктивное хирургическое вмешательство с общим протезированием. Терапевтические способы для коррекции участков поражения суставного хряща, возникающих в течение развития остеоартрита, разработаны, но до настоящего времени ни один из них не способен опосредовать регенерацию суставного хряща in situ и in vivo. Остеоартрит трудно поддается лечению. В настоящее время нет доступного средства, и лечение направлено на облегчение боли и предотвращение перехода сустава из пораженного состояния в деформированное. Общепринятые виды лечения включают применение нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID). Хотя пищевые добавки, такие как хондроитин и глюкозамина сульфат рекомендованы как безопасные и эффективные варианты для лечения остеоартрита, недавнее клиническое испытание показало, что оба варианта лечения не снижали боль, связанную с остеоартритом (Clegget al., 2006). В совокупности, нет доступного лекарственного средства против остеоартрита, которое изменяет течение заболевания. В тяжелых случаях может быть необходима замена сустава. Это особенно актуально для тазобедренных и коленных суставов. Если сустав сильно болит и не может быть заменен, его можно зафиксировать в заданном положении. Эта процедура снимает боль, но приводит к необратимой потере функции сустава, создавая затруднение при ходьбе и сгибании. Другим возможным лечением является трансплантация культивированных аутологичных хондроцитов. В данном случае хрящевой клеточный материал берут у пациента, отправляют в лабораторию, где клеточный материал наращивают. Материал затем имплантируют в поврежденные ткани для покрытия тканевых дефектов. Другое лечение включает внутрисуставную инстилляцию Hylan G-F 20 (например, Synvisc, Hyalgan, Artz), средства, которое временно улучшает реологию синовиальной жидкости, что создает почти немедленное ощущение свободы движения и выраженное уменьшение боли. Другие описанные способы включают применение сухожильного, надкостничного, фасциального,мышечного или перихондрального трансплантатов; имплантацию фибрина или культивированных хондроцитов; имплантацию искусственных матриксов, таких как коллаген, углеродная нить; введение электромагнитных полей. Все они показали минимальные и недостаточное действия, приводящие к образованию ткани низкого качества, которая не может ни выдержать нагрузку массой, ни обеспечить восстановление суставной функции с нормальной подвижностью. Стимулирование анаболических процессов, блокирование катаболических процессов или комбинация этих двух процессов может приводить к стабилизации хрящевой ткани, и возможно, даже к аннулированию повреждения, и таким образом, предотвращению дальнейшего прогрессирования заболевания. Различные инициирующие факторы могут вызывать анаболическую стимуляцию хондроцитов. Инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I) представляет собой преобладающий анаболический фактор роста в синовиальной жидкости и стимулирует синтез как протеогликанов, так и коллагена. Также показано, что члены семейства морфогенетического белка кости (BMP), в частности ВМР 2, ВМР 4, ВМР 6 и ВМР 7, и члены семейства трансформирующего фактора роста- человека (TGF-) могут индуцировать анаболическую стимуляцию хондроцитов (Chubinskaya and Kuettner, 2003). Недавно установлено соединение,которое индуцирует анаболическую стимуляцию хондроцитов (US 6500854; ЕР 1391211). Однако большинство этих соединений проявляют тяжелые побочные эффекты, и, таким образом, существует существенная необходимость в соединениях, которые стимулируют дифференциацию хондроцитов без этих побочных эффектов.Vandeghinste et al. (WO 2005/124342) описали JAK1 как мишень, ингибирование которой может иметь терапевтическую значимость при лечении некоторых заболеваний, включая ОА. JAK1 относится к Янус-киназам (JAK), семейству цитоплазматических тирозинкиназ, вовлеченных во внутриклеточную передачу сигнала, опосредованную цитокиновым рецептором. Семейство JAK состоит из 4 членов:JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. JAK участвуют во взаимодействии с цитокиновыми рецепторами, при связывании цитокинов, с последующей гетеродимеризацией цитокинового рецептора и общей рецепторной субъединицы (общая цепь гамма-с, gp130). JAK затем активируются посредством ауто- и/или трансфосфорилирования посредством других JAK, что приводит к фосфорилированию рецептора и вовлечению и фосфорилированию членов семейства сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции (STAT). Фосфорилированные STAT димеризуются и перемещаются в ядро, где они связываются с энхансерными областями генов, чувствительных к цитокинам. Нокаут гена JAK1 у мышей показал, что JAK1 принимает важное и не избыточное участие в период развития: мыши JAK1-/- умерли в пределах 24 ч после рождения, и наблюдают значительное нарушение развития лимфоцитов. Кроме того, JAK1 -/- клетки не реагировали или меньше реагировали на цитокины, которые используют II класс цитокиновых рецепторов,цитокиновые рецепторы, которые используют субъединицу гамма-с для передачи сигнала, и семейство цитокиновых рецепторов, которые используют субъединицу gp130 для передачи сигнала (Rodig et al.,1998). Различные группы включают передачу сигнала JAK-STAT в биологию хондроцитов. Li et al. (2001) показали, что онкостатин М индуцирует экспрессию генов ММР и TIMP3 в первичных хондроцитах посредством активации путей передачи сигнала JAK/STAT и МАРК. Osaki et al. (2003) показали, что опосредованное интерфероном-гамма ингибирование коллагена II в хондроцитах включает передачу сигналаJAK-STAT. IL1-бета индуцирует катаболизм хрящевой ткани посредством снижения экспрессии компонентов матрикса и посредством индуцирования экспрессии коллагеназ и индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2), которая опосредует продукцию оксида азота (NO). Otero et al., (2005) показали, что лептин и ILl-бета синергично индуцировали продукцию NO или экспрессию NOS2 мРНК в хондроцитах, и что это останавливали посредством ингибитора JAK. Legendre et al. (2003) показали, что в артикулярных хондроцитах быка IL6/IL6 рецептор индуцировал негативную регуляцию специфичных для матрикса хрящевой ткани генов коллагена II, аггрекановой структуры и связывающего белка, и что это было опосредовано передачей сигнала JAK/STAT. Таким образом, эти данные наблюдения предполагают участие киназы JAK в гомеостазе хрящевой ткани и терапевтический потенциал для ингибиторов киназы JAK. Члены семейства JAK вовлечены в дополнительные состояния, включающие миелопролиферативные нарушения (О'Sullivan et al., 2007, Mol. Immunol. 44(10): 2497-506), в которых обнаружены мутации вJAK2. Это показывает, что ингибиторы JAK, в частности, JAK2 можно также использовать при лечении миелопролиферативных нарушений. Дополнительно, семейство JAK, в частности JAK1, JAK2 и JAK3,связаны со злокачественными опухолями, в частности лейкемиями, например острым миелолейкозом(Mullighan et al., 2009) или солидными опухолями, например лейомиосаркомой матки (Constantinescu etal., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131), раком предстательной железы (Tam et al., 2007,British Journal of Cancer, 97, 378-383). Эти результаты показывают, что ингибиторы JAK, в частностиJAK1 и/или JAK2, могут также быть полезны при лечении злокачественных опухолей (лейкемии и солидные опухоли, например лейомиосаркома матки, рак предстательной железы). Кроме того, болезнь Кастлемена, множественная миелома, мезангиально-пролиферативный гломерулонефрит, псориаз и саркома Капоши развиваются, вероятно, вследствие повышенной секреции цитокина IL-6, биологические эффекты которого опосредованы внутриклеточной передачей сигнала JAKSTAT (Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3): S233S242). Этот результат показывает, что ингибитор JAK может также найти применение при лечении указанных заболеваний. Установлена связь с аутоиммунными заболеваниями для JAK3 и Tyk2. Мутации в JAK3, а также в вышерасположенных компонентах передачи сигнала, рецепторной цепи гамма-с и рецептора IL7 обусловливают, в совокупности, 70% случаев тяжелого комбинированного иммунодефицита человека('OShea et al., 2004). Отмечено, что JAK1 взаимодействует с JAK3 в передаче сигналов с рецепторной цепи гамма-с. Полиморфизмы Тук 2 обнаружены при системной красной волчанке (SLE) (О'Sullivan et al.,2007, Mol. Immunol. 44(10): 2497-506). Таким образом, нацеливание на семейство JAK может предоставить терапевтические возможности в области иммуновоспаления. Существующие способы лечения не являются достаточными, и, таким образом, остается необходимость в определении дополнительных соединений, которые можно использовать при лечении заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацию суставов, например остеоартрита; и/или состояний, включающих воспаление или иммунные ответы, такие как болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, заболеваний, связанных с респираторной аллергией (например, астма,-3 018080 ринит), юношеского идиопатического артрита, колита, воспалительных заболеваний кишечника, болезненных состояний, обусловленных эндотоксином (например, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующие, например, хронической сердечной недостаточности), заболеваний, включающих нарушение ремоделирования хрящевой ткани (например,заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов), врожденных мальформаций хрящевой ткани, заболеваний, ассоциированных с повышенной секрецией IL6, пролиферативных заболеваний и отторжения при трансплантации (например, отторжение органного трансплантата). ИнгибиторыJAK могут также найти применение при лечении пролиферативных заболеваний. В частности, ингибиторы JAK нашли применение при лечении злокачественных опухолей, главным образом, лейкемий и солидных опухолей (например, лейомиосаркома матки, рак предстательной железы). Настоящее изобретение, таким образом, предоставляет соединения, способы их получения и фармацевтические композиции,включающие соединение по изобретению вместе с подходящим фармацевтическим носителем. Настоящее изобретение также относится к использованию соединения по изобретению в препарате лекарственного средства для лечения дегенеративных заболеваний суставов. Сущность изобретения Настоящее изобретение основано на открытии того, что ингибиторы JAK пригодны для лечения заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацию суставов, например, остеоартрита; и/или состояний, включающих воспаление или иммунные ответы, такие как болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, заболеваний, связанных с респираторной аллергией (например,астма, ринит), юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительных заболеваний кишечника, болезненных состояний, обусловленных эндотоксином (например, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующим, например, хронической сердечной недостаточности), заболеваний, включающих нарушение ремоделирования хрящевой ткани (например, заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов), врожденных мальформаций хрящевой ткани, заболеваний, ассоциированных с повышенной секрецией IL6, и отторжения при трансплантации (например, отторжение органного трансплантата). Ингибиторы JAK могут также найти применение в лечении пролиферативных заболеваний. В частности, ингибиторы JAK находят применение при лечении злокачественных опухолей, в частности, лейкемий и солидных опухолей (например,лейомиосаркомы матки, рака предстательной железы). Настоящее изобретение также относится к способам получения этих соединений, фармацевтических композиций, содержащих эти соединения и способам лечения заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани, деградацию и/или воспаление суставов посредством введения соединения по изобретению. Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предлагается соединение формулы VIa: или его фармацевтически приемлемая соль. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения, предотвращения или профилактики заболеваний, выбранных из группы, включающей пролиферативные заболевания, заболевания, связанные с деградацией хрящевой ткани, костной ткани, и/или деградацией суставов; и/или состояний, включающих воспаление или иммунные ответы,включающая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество указанного выше соединения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание, связанное с деградацией хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацией суставов, представляет собой остеоартрит; и состояния, включающие воспаление или иммунные ответы, представляют собой болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, астму, ринит, юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительные заболевания кишечника, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином,способствующим хронической сердечной недостаточности, заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов, врожденные мальформации хрящевой ткани, заболевания, ассоциированные с повышенной секрецией IL6, и отторжение при трансплантации органного трансплантата. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению указанного выше соединения для лечения, предотвращения или профилактики заболеваний, выбранных из группы, включающей пролиферативные заболевания, заболевания, связанные с деградацией хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацией суставов; и/или состояний, включающих воспаление или иммунные ответы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание, связанное с деградацией хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацией суставов, представляет собой остеоартрит; и состояния, включающие воспаление или иммунные ответы, представляют собой болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, астму, ринит, юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительные заболевания кишечника, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином,способствующим хронической сердечной недостаточности, заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов, врожденные мальформации хрящевой ткани, заболевания, ассоциированные с повышенной секрецией IL6, и отторжение при трансплантации органного трансплантата. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению указанного выше соединения для получения лекарственного средства для лечения, предотвращения или профилактики заболеваний, выбранных из группы, включающей заболевания, связанные с деградацией хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацией суставов; и/или состояний, включающих воспаление или иммунные ответы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание, связанное с деградацией хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацией суставов, представляет собой остеоартрит; и состояния, включающие воспаление или иммунные ответы, представляют собой болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, астму, ринит, юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительные заболевания кишечника, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином,способствующим хронической сердечной недостаточности, заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов, врожденные мальформации хрящевой ткани, заболевания, ассоциированные с повышенной секрецией IL6, и отторжение при трансплантации органного трансплантата. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению указанного выше соединения для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных заболеваний. Подробное описание изобретения Определения Следующие термины предназначены для определения значений, изложенных ниже, и являются полезными для понимания описания и предполагаемого объема по настоящему изобретению. При описании изобретения, которое может включать соединения, фармацевтические композиции,содержащие такие соединения и способы применения таких соединений и композиций, следующие термины, если присутствуют, имеют следующие значения, если не указано иначе. Фармацевтически приемлемый обозначает одобренный или заслуживающий одобрения федеральной регулирующей организацией или правительством государства, или соответствующей организацией в странах, отличных от Соединенных Штатов Америки, или тот, который перечислен в фармакопее США или в другой общепризнанной фармакопее для применения на животных, и более конкретно, на людях. Фармацевтически приемлемая соль относится к соли соединения по изобретению, которая является фармацевтически приемлемой и которая содержит требуемую фармакологическую активность исходного соединения. В частности, такие соли являются нетоксичными, могут представлять собой неорганические или органические кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Конкретно, такие соли включают: (1) кислотно-аддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п.; или образованные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота,гексановая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота,молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота,1,2-этан-дисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4 хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, третично-бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтойная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота, и т.п.; или (2) соли, образованные, когда кислотный протон, представленный в исходном соединении, или заменен ионом металла, например ионом щелочного металла, щелочно-земельным ионом, или ионом алюминия; или координирует с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, N-метилглюкамин и т.п. Соли дополнительно включают, только в качестве примера, натрий, калий, кальций, магний, аммоний, тетраалкиламмоний и т.п.; и когда соединение содержит основную функцию, соли нетоксичных органических или неорганических кислот, таких как гидрохлорид, гидробромид, соль винной кислоты, мезилат, ацетат,малеат, оксалат и т.п. Термин физиологически приемлемый катион обозначает нетоксичный, физиологически приемлемый катионный противоион кислой функциональной группы. Такие катионы иллюстрируются катионами натрия, калия, кальция, магния, аммония и тетраалкиламмония и т.п. Фармацевтически приемлемая среда для лекарственного средства относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым вводят соединение по изобретению. Субъект включает людей. Термины человек, пациент и субъект в настоящем документе используют взаимозаменяемо. Терапевтически эффективное количество обозначает количество соединения, которое при введении субъекту для лечения заболевания является достаточным для действия такого лечения на заболевание. Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от соединения, заболевания и его тяжести, и возраста, массы, и т.д. подлежащего лечению субъекта. Предотвращение или предупреждение относятся к снижению риска приобретения или развития заболевания или нарушения перед проявлением болезни (т.е. когда по меньшей мере один из клинических симптомов заболевания не развивается у субъекта, который может быть подвержен действию средства, вызывающего заболевание или предрасположенного к заболеванию). Термин профилактика относится к предупреждению, и относится к воздействию или способу,цель которых предупреждение, а не лечение или устранение заболевания. Неограничивающие примеры профилактических мер могут включать введение вакцин; введение гепарина с низкой молекулярной массой госпитализированным пациентам с риском развития тромбоза вследствие, например, потери подвижности; и введение противомалярийного средства, такого как хлорохин, перед посещением географических областей, в которых малярия является эндемическим заболеванием или если существует высокий риск заражения малярией. Лечение или терапия любого заболевания или нарушение относится, в одном из вариантов осуществления, к улучшению состояния при заболевании или нарушении (т.е. остановке заболевания или уменьшению проявления, степени или тяжести по меньшей мере одного из клинических симптомов заболевания). В другом варианте осуществления лечение или терапия относится к улучшению по меньшей мере одного физического параметра, который может не быть явным для субъекта. В еще одном варианте осуществления лечение или терапия относится к модулированию заболевания или нарушения, или физически (например, стабилизацией явного симптома), физиологически (например, стабилизацией физического параметра), или и тем и другим. В дополнительном варианте осуществления лечение или терапия относится к замедлению прогрессирования заболевания. Как применяют в настоящем документе термин состояние(я), вовлекающее воспаления относится к группе состояний, включающих ревматоидный артрит, остеоартрит, юношеский идиопатический артрит, псориаз, заболевания, связанные с респираторной аллергией (например, астма, ринит), воспалительные заболевания кишечника (например болезнь Крона, колит), состояния, обусловленные действием эндотоксина (например осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующим, например, хронической сердечной недостаточности), и связанным с хрящевой тканью заболеваниям, таким как заболевания суставов. В частности, термин относится к ревматоидному артриту, остеоартриту, заболеваниям, связанным с респираторной аллергией (например, астмой) и воспалительным заболеваниям кишечника. Как применяют в настоящем документе, термин состояние(я), вовлекающее иммунный ответ или аутоиммунные заболевания используют взаимозаменяемо и относят к группе заболеваний, включающих обструктивные заболевания дыхательных путей, включающие такие состояния, как COPD, астма(например эндогенная астма, экзогенная астма, пылевая астма, детская астма) в частности, хроническая или трудноизлечимая астма (например, астма с поздним началом и гиперчувствительность дыхательных путей), бронхит, включающих бронхиальную астму, системную красную волчанку (SLE), рассеянный склероз, сахарный диабет I типа и ассоциированные с ними осложнения, атопическую экзему (атопический дерматит), контактный дерматит и дополнительно экзематозный дерматит, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона и язвенный колит), атеросклероз и боковой амиотрофический склероз. В частности, термин относится к COPD, астме, системной красной волчанке, сахарному диабету I типа и воспалительному заболеванию кишечника. Как применяют в настоящем документе, термин отторжение трансплантата относится к острому или хроническому отторжению клеток, алло- или ксенотрансплантатов ткани или паренхиматозного органа, например панкреатических островков, стволовых клеток, костного мозга, кожной, мышечной ткани, ткани роговицы, нейрональной ткани, сердца, легких, комбинированных сердце-легкие, почек, печени, пищеварительного тракта, поджелудочной железы, трахеи или пищевода, или к реакциям трансплантат против хозяина. Как применяют в настоящем документе, термин пролиферативное заболевание(я) относится к состояниям, таким как злокачественная опухоль (например, лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), миелопролиферативным нарушениям (например, истинная полицитемия, идиопатические тромбоцитоз и миелофиброз), лейкоз (например, острый миелолейкоз и острый лимфобластный лейкоз),множественная миелома, псориаз, рестеноз, склеродермит или фиброз, в частности, термин относится к злокачественной опухоли, лейкозу, множественной миеломе и псориазу. Как применяют в настоящем документе, термин злокачественная опухоль относится к злокачественному или доброкачественному росту клеток в коже или в органах тела, например, но без ограничения,-6 018080 в молочной железе, предстательной железе, легких, почках, поджелудочной железе, желудке или желудочно-кишечном тракте. Злокачественная опухоль имеет склонность проникать в близлежащие ткани и распространяться (метастазировать) в отдаленные органы, например в костную ткань, печень, легкие или мозг. Как применяют в настоящем документе, термин злокачественная опухоль включает и типы клеток, относящиеся к метастатической опухоли, такой как, но не ограничиваясь ими, меланома, лимфома,лейкемия, фибросаркома, рабдомиосаркома и мастоцитома и виды карциномы из тканей, такие как, но не ограничиваясь ими, колоректальный рак, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких и немелкоклеточный рак легких, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря,злокачественная опухоль почки, рак желудка, глиобластома, первичная злокачественная опухоль печени,рак яичников, рак предстательной железы и лейомиосаркома матки. Как применяют в настоящем документе, термин лейкемия относится к неопластическим заболеваниям крови и кроветворным органам. Такие заболевания могут вызывать расстройство функции костного мозга и иммунной системы, что делает хозяина очень восприимчивым к инфекциям и кровотечению. В частности, термин лейкоз относится к острому миелолейкозу (AML) и острому лимфобластному лейкозу (ALL). Как применяют в настоящем документе, термин заболевания, включающие нарушение ремоделирования хрящевой ткани и конкретно заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов включают состояния, такие как остеоартрит, псориатический артрит, юношеский ревматоидный артрит, подагрический артрит, септический или инфекционный артрит, реактивный артрит, симпатическая рефлекторная дистрофия, альгодистрофия, синдром Титце или реберный хондрит, фибромиалгия,остеохондрит, неврогенный или невропатический артрит, артропатия, эндемичные формы артрита, такие как остеоартрит эндемический деформирующий, заболевание Mseleni и заболевание Handigodu; дегенерация, полученная в результате фибромиалгии, системная красная волчанка, склеродермия и анкилозирующий спондилит. Как применяют в настоящем документе, термин врожденная мальформация(и) хрящевой ткани включает состояния, такие как наследственный хондролиз, хондродисплазии и псевдохондродисплазии,в частности, но не ограничиваясь ими, микротию, анотию, метафизарную хондродисплазию и связанные нарушения. Как применяют в настоящем документе, термин заболевание(я), связанные с повышенной секрецией IL6 включает состояния, такие как болезнь Кастлемена, множественная миелома, псориаз, саркома Капоши и/или мезангиально-пролиферативный гломерулонефрит. Соединение(я) по изобретению и равноценные термины нацелены на включение соединений формул, описанных ранее в настоящем документе, где термин включает фармацевтически приемлемые соли и сольваты, например гидраты и сольваты фармацевтически приемлемых солей, если контекст это позволяет. Аналогично, ссылка на промежуточные соединения, независимо от того, являются ли они сами заявленными, нацелены на включение их солей и сольватов, если контекст это позволяет. Соединения Настоящее изобретение основано на открытии того, что ингибиторы JAK пригодны для лечения заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацию суставов, например остеоартрита; и/или состояния, включающие воспаление или иммунные ответы, такие как болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, заболевания, связанные с респираторной аллергией (например,астма, ринит), юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительные заболевания кишечника, болезненные состояния, обусловленные эндотоксином (например осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующим, например, хронической сердечной недостаточности), заболевания, включающие нарушение ремоделирования хрящевой ткани (например, заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов), врожденные мальформации хрящевой ткани, заболевания, ассоциированные с повышенной секрецией IL6, и отторжение при трансплантации (например, отторжение органного трансплантата). Ингибиторы JAK могут также найти применение при лечении пролиферативных заболеваний. В частности, ингибиторы JAK нашли применение при лечении злокачественных опухолей, главным образом, лейкемий и солидных опухолей (например, лейомиосаркомы матки, рака предстательной железы). В частности, заболевания, включающие деградацию хрящевой ткани, костной ткани и/или суставную деградацию и/или воспаление, например остеоартрит. Настоящее изобретение также относится к способам получения этих соединений, фармацевтических композиций, содержащих эти соединения, и способам лечения заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани, костной ткани и/или суставную деградацию, и/или воспаление посредством введения соединения по изобретению. Настоящие соединения могут являться ингибиторами одного или нескольких членов семейства JAK; конкретно, соединения могут ингибировать активность одного или нескольких из JAK1, JAK2, JAK3 и/или TYK2. Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, представленному формулой VIa: или его фармацевтически приемлемой солью. В одном из вариантов осуществления соединение представляет собой соединение 176 из табл. 1. Фармацевтические композиции При использовании в качестве фармацевтических средств соединения по изобретению, как правило,вводят в форме фармацевтической композиции. Такие композиции можно получать способом, хорошо известным в области фармацевтики, и композиции включают по меньшей мере одно активное соединение. Как правило, соединения по данному изобретению вводят в фармацевтически эффективном количестве. Количество фактически введенного соединения будет, как правило, определять врач, исходя из соответствующих условий, включающих состояние, подлежащее лечению, выбранный путь введения, конкретное введенное соединение, возраст, массу и реакцию отдельного пациента, тяжесть симптомов у пациента и т.п. Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить различными путями, включающими пероральный, ректальный, трансдермальный, подкожный, внутрисуставной, внутривенный, внутримышечный и интраназальный. В зависимости от предполагаемого пути доставки соединения по данному изобретению предпочтительно составляют в смесь, или в виде инъецируемых, или в виде оральных композиций, или в виде мазей, лосьонов или в виде пластырей - все для трансдермального введения. Композиции для перорального введения могут быть в форме нерасфасованных жидких растворов или суспензий или нерасфасованных порошков. Чаще, однако, композиции выпускают в стандартных лекарственных формах для облегчения точного дозирования. Термин стандартные лекарственные формы относится к физически отдельным единицам, подходящим в качестве единых доз для человека и другого млекопитающего, где каждая единица содержит заданное количество активного материала, рассчитанного таким образом, чтобы получить надлежащий терапевтический эффект, и находится в сочетании с подходящим фармацевтическим эксципиентом, основой или носителем. Типичные стандартные лекарственные формы включают предварительно наполненные, с предварительно рассчитанным количеством, ампулы или шприцы жидких композиций или, в случае твердых композиций, пилюли, таблетки,капсулы или т.п. В таких композициях соединение фурансульфоновой кислоты представляет собой, как правило, минорный компонент (от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мас.% или предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 40 мас.%), где остальное представляет собой различные основы или носители и технологические добавки, полезные для создания необходимой дозируемой формы. Жидкие формы, подходящие для перорального введения, могут включать подходящую водную или неводную основу с буферами, суспендирующими и диспергирующими средствами, красителями, ароматизаторами и т.п. Твердые формы могут включать, например, любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связывающее средство, такое как микрокристаллическая целлюлоза,трагакант или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза, средство для улучшения распадаемости таблеток, такое как альгиновая кислота, Примогель или кукурузный крахмал; смазочное средство,такое как стеарат магния; средство, улучшающее скольжение, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Инъецируемые композиции, как правило, основаны на инъецируемом стерильном физиологическом растворе или физиологическом растворе, забуференном фосфатом, или других инъецируемых носителях,известных в данной области. Как и сказано ранее, активное соединение в таких композициях является,как правило, минорным компонентом, чаще представленным от приблизительно 0,05 до 10 мас.%, где остальное представлено инъецируемым носителем и т.п. Трансдермальные композиции, как правило, составляют в смесь в виде мази или крема для местного применения, содержащих активный ингредиент(ы), как правило, в количестве в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мас.%, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мас.%, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мас.% и более предпочтительно от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мас.%. В случае составления в смесь в виде мази активные ингредиенты будут, как правило, комбинировать или с парафиновой или с водорастворимой мазевой основой. Альтернативно, активные ингредиенты можно составлять в смесь в виде крема, например с водножировой кремовой основой. Такие трансдермальные составы являются хорошо известными в данной области и, как правило, включают дополнительные ингредиенты для увеличения кожного проникновения, стабильности активных ингредиентов или состава. Все подобные известные трансдермальные составы и ингредиенты включены в объем по данному изобретению. Соединения по изобретению можно также вводить посредством приспособления для трансдермального введения. Таким образом, трансдермальное введение можно выполнять, используя пластырь или резервуарного типа, или тип пластыря с пористой мембраной или вариантом твердого матрикса. Компоненты для перорального введения, описанные выше, инъецируемые или местно вводимые композиции представлены только для примера. Другие материалы, а также способы получения и т.п. изложены в Part 8 of Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company,Easton, Pennsylvania, включенном в настоящее описание в качестве ссылки. Соединения по данному изобретению можно также вводить в формах замедленного высвобождения или из систем доставки лекарственного средства замедленного высвобождения. Описание типичных материалов замедленного высвобождения можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences. Следующие примеры составов иллюстрируют типичные фармацевтические композиции, которые можно получать в соответствии с данным изобретением. Настоящее изобретение, однако, не ограничено следующими фармацевтическими композициями. Состав 1. Таблетки Соединение по изобретению можно смешивать в виде сухого порошка со связывающим средством сухим желатином в массовом отношении приблизительно 1:2. Незначительное количество стеарата магния добавляют в качестве смазочного средства. Смесь формируют в 240-270 мг таблетки (80-90 мг активного амидного соединения на таблетку) в таблеточном прессе. Состав 2. Капсулы Соединение по изобретению можно смешивать в виде сухого порошка с разбавителем крахмалом в массовом отношении приблизительно 1:1. Смесью можно заполнять 250 мг капсулы (125 мг активного амидного соединение на капсулу). Состав 3. Жидкий Соединение по изобретению (125 мг), можно смешивать с сахарозой (1,75 г) и ксантановой камедью (4 мг) и полученную в результате смесь можно смешать, пропускать через отверстия сита U.S.10,и затем смешать с приготовленным заранее раствором микрокристаллической целлюлозы и натрийкарбоксиметилцеллюлозы (11:89, 50 мг) в воде. Бензоат натрия (10 мг), ароматизатор и краситель разбавляют водой и добавляют с перемешиванием. Надлежащее количество воды можно затем добавить с перемешиванием. Надлежащее количество воды затем добавляют для получения общего объема 5 мл. Состав 4. Таблетки Соединение по изобретению можно смешивать в виде сухого порошка со связывающим средством сухим желатином в массовом отношении приблизительно 1:2. Незначительное количество стеарата магния добавляют в качестве смазочного средства. Смесь формируют в 450-900 мг таблетки (150-300 мг активного амидного соединения) в таблеточном прессе. Состав 5. Инъекция Соединение по изобретению можно растворять или суспендировать в инъецируемой водной среде,забуференной стерильным физиологическим раствором, до концентрации приблизительно 5 мг/мл. Состав 6. Местное Стеариловый спирт (250 г) и медицинский вазелин (250 г) растапливают при приблизительно 75 С,и затем смесь соединения по изобретению (50 г), метилпарабена (0,25 г), пропилпарабена (0,15 г), лаурилсульфата натрия (10 г) и пропиленгликоля (120 г), растворенных в воде (приблизительно 370 г), добавляют и полученную в результате смесь перемешивают, пока она не застынет. Способы лечения Настоящие соединения можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения у млекопитающих состояний, которые причинно связывают или приписывают нарушенной активности JAK. В частности, состояния, связанные с нарушенной активностью одного или нескольких из JAK1, JAK2,JAK3 и/или TYK2. Таким образом, соединение по изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению нашли применение в качестве терапевтических средств для предотвращения и/или лечения заболеваний, включающих деградацию хрящевой ткани, костной ткани и/или деградацию суставов, например остеоартрит; и/или состояний, включающих воспаление или иммунные ответы, такие как болезнь Крона, ревматоидный артрит, псориаз, заболеваний, связанных с респираторной аллергией (например, астма, ринит), юношеского идиопатического артрита, колита, воспалительных заболеваний кишечника, болезненных состояний, обусловленных эндотоксином (например, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующим, например, хронической сердечной недостаточности), заболеваний включающих нарушение ремоделирования хрящевой ткани (например, заболевания, включающие анаболическую стимуляцию хондроцитов), врожденных мальформаций хрящевой ткани, заболеваний, ассоциированных с повышенной секрецией IL6, пролиферативных заболеваний и отторжений при трансплантации (например, отторжение органного трансплантата). Ингибиторы JAK могут также найти применение при лечении пролиферативных заболеваний. В частности, ингибиторы JAK нашли применение при лечении злокачественных опухолей, главным образом, лейкемий и солидных опухолей (например, лейомиосаркомы матки, рака предстательной железы). В частности, состояния выбирают из воспалительных состояний, состояний, связанных с деградацией хрящевой ткани и/или суставов у млекопитающих, включая людей. В другом варианте осуществления соединения и фармацевтические композиции по данному изобретению нашли применение в качестве терапевтических средств для предотвращения и/или лечения пролиферативных нарушений у млекопитающих, включая людей. В конкретном варианте осуществления соединение по изобретению и его фармацевтические композиции нашли применение в виде терапевтических средств для предотвращения и/или лечения злокачественной опухоли у млекопитающих, включая людей. В дополнительных аспектах способ лечения относится к способам лечения млекопитающего, подверженного или пораженного состоянием, включающим иммунный ответ или аутоиммунное заболевание. Способы включают введение эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций или соединения по изобретению, описанных в настоящем документе, для лечения состояния или предотвращения состояния. В конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из COPD, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета I типа и воспалительных заболеваний кишечника. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению по изобретению для применения в лечении, предотвращении или профилактике состояния, включающего аутоиммунный ответ или аутоиммунное заболевание. В конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание выбирают изCOPD, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета I типа и воспалительного заболевания кишечника. В аспекте способа лечения данное описание раскрывает способ лечения, предотвращения или профилактики у млекопитающего, подверженного или пораженного заболеванием, включающим нарушение ремоделирования хрящевой ткани (например, состояние, связанное с анаболической стимуляцией хондроцитов или включающее анаболическую стимуляцию хондроцитов), например остеоартрит, псориатический артрит, юношеский ревматоидный артрит, подагрический артрит, септический или инфекционный артрит, реактивный артрит, симпатическую рефлекторную дистрофию, альгодистрофию, синдром Титце или реберный хондрит, фибромиалгию, остеохондрит, неврогенный или невропатический артрит,артропатию, эндемичные формы артрита, такие как остеоартрит эндемический деформирующий, заболевание Mseleni и заболевание Handigodu; дегенерацию, полученную в результате фибромиалгии, системную красную волчанку, склеродермию и анкилозирующий спондилит, где способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения по изобретению, или одной или нескольких фармацевтических композиций или одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. В другом аспекте данное описание раскрывает соединение по изобретению, предназначенное для лечения, предотвращения или профилактики у млекопитающего, подверженного или пораженного заболеванием, включающим нарушение ремоделирования хрящевой ткани (например, состояние, связанное с анаболической стимуляцией хондроцитов или включающее анаболическую стимуляцию хондроцитов),например остеоартрит, псориатический артрит, юношеский ревматоидный артрит, подагрический артрит,септический или инфекционный артрит, реактивный артрит, симпатическую рефлекторную дистрофию,альгодистрофию, синдром Титце или реберный хондрит, фибромиалгию, остеохондрит, неврогенный или невропатический артрит, артропатию, эндемичные формы артрита, такие как остеоартрит эндемический деформирующий, заболевание Mseleni и заболевание Handigodu; дегенерацию, полученную в результате фибромиалгии, системную красную волчанку, склеродермию и анкилозирующий спондилит. Настоящее описание раскрывает способ лечения врожденных мальформаций хрящевой ткани,включающих наследственный хондролиз, хондродисплазию и псевдохондродисплазию, в частности, но не ограничиваясь ими, микротию, анотию, метафизарную хондродисплазию и связанные нарушения, где способ включает введение эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций или одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. В другом аспекте настоящее описание раскрывает соединение по изобретению, предназначенное для применения в лечении, предотвращении или профилактике врожденных мальформаций хрящевой ткани, включающих наследственный хондролиз, хондродисплазию и псевдохондродисплазию, в частности, но не ограничиваясь ими, микротию, анотию, метафизарную хондродисплазию и связанные нарушения. В другом аспекте настоящее описание раскрывает способ лечения млекопитающего, подверженного или пораженного состоянием, включающим воспаление. В дополнительных аспектах способа лечения данное описание раскрывает способ лечения млекопитающего, подверженного или пораженного заболеванием и нарушениям, которые опосредованы или являются результатом воспаления, такие как, например ревматоидный артрит и остеоартрит, заболевания, связанные с респираторной аллергией (например,астма, ринит), юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительные заболевания кишечника, болезненные состояния, обусловленные эндотоксином (например, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующим, например, хронической сердечной недостаточности) и связанные заболевания, вовлекающие хрящевую ткань, такую как хрящевая ткань суставов, где способ включает введение эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций или одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления состояние, включающее воспаление, выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, заболевания, связанного с респираторной аллергией (например, астма) и воспалительных заболеваний кишечника. Способы включают введение эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций или одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе, для лечения или предотвращения состояния. В другом аспекте данное изобретение относится к соединению по изобретению для применения в лечении, предотвращении или профилактике состояния, включающего воспаление. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению по изобретению для применения в лечении, предотвращении или профилактике заболевания и нарушения, которые опосредуют или являются результатом воспаления, такие как, например, ревматоидный артрит и остеоартрит, заболевание, связанное с респираторной аллергией (например, астма, ринит), юношеский идиопатический артрит, колит, воспалительные заболевания кишечника, болезненные состояния, обусловленные эндотоксином (например, осложнения после шунтирования или хронические состояния, обусловленные эндотоксином, способствующим, например, хронической сердечной недостаточности), и связанные заболевания, вовлекающие хрящевую ткань, такую как хрящевая ткань суставов. В конкретном варианте осуществления состояние, включающее воспаление, выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, заболевания, связанного с респираторной аллергией (например, астма), и воспалительных заболеваний кишечника. В дополнительных аспектах способа лечения данное описание раскрывает способ лечения млекопитающего, подверженного или пораженного пролиферативным заболеванием, в частности, злокачественной опухолью (например, солидные опухоли, такие как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), лейкозом (например, AML или ALL), множественной миеломой и/или псориазом, где способы включают введение эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций или одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. В дополнительных аспектах способа лечения данное описание раскрывает способ лечения млекопитающего, подверженного или пораженного злокачественной опухолью (например, солидные опухоли, такие как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы) и/или лейкозом. В другом аспекте настоящее описание раскрывает соединение по изобретению для применения в лечении, предотвращении или профилактике пролиферативного заболевания, в частности, злокачественной опухоли (например, солидные опухоли, такие как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), лейкоза (например, AML или ALL), множественной миеломы и/или псориаза. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению по изобретению для применения в лечении, предотвращении или профилактике злокачественной опухоли, (например, солидные опухоли, такие как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы) и/или лейкоза. В дополнительных аспектах способа лечения данное описание раскрывает способ лечения млекопитающего, подверженного или пораженного заболеваниями, связанными с гиперсекрецией IL6, в частности, болезнью Кастлемена или мезангиально-пролиферативным гломерулонефритом, где способы включают введение эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций или одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению по изобретению для применения в лечении, предотвращении или профилактике заболеваний, связанных с гиперсекрецией IL6, в частности, болезнью Кастлемена или мезангиально-пролиферативным гломерулонефритом. В дополнительных аспектах способа лечения данное описание раскрывает способ лечения млекопитающего, подверженного или пораженного процессом отторжения трансплантата, где способы включают введение эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций или одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения отторжения органного трансплантата. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению по изобретению для применения в лечении, предотвращении или профилактике процесса отторжения трансплантата. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения отторжения органного трансплантата. В качестве дополнительного аспекта настоящие соединения предоставляют для применения в качестве фармацевтических, в частности, в лечении или предотвращении указанных выше состояний и заболеваний. Также представленным в настоящем документе является применение настоящих соединений в производстве лекарственных средств для лечения или предотвращения одного из указанных выше состояний и заболеваний. Конкретная схема лечения по настоящему способу включает введение субъекту, страдающему от заболевания, включающего воспаление, эффективного количества соединения по изобретению в течение периода времени, достаточного для снижения уровня воспаления у пациента и предпочтительно завершения процессов, ответственных за указанное воспаление. Конкретный вариант осуществления способа включает введение эффективного количества соединения по изобретению субъекту, пациенту, страдающему от ревматоидного артрита или подверженному развитию ревматоидного артрита, в течение перио- 11018080 да времени, достаточного для уменьшения или предотвращения, соответственно, воспаления в суставах указанного пациента и предпочтительно завершения процессов, ответственных за указанное воспаление. Дополнительная конкретная схема лечения по настоящему способу включает введение субъекту,страдающему от болезненного состояния, характеризующегося деградацией хрящевой ткани или суставов (например, остеоартрит), эффективного количества соединения по изобретению в течение периода времени, достаточного для уменьшения и предпочтительно завершения самоподдерживающихся процессов, ответственных за указанную деградацию. Конкретный вариант осуществления способа включает введение эффективного количества соединения по изобретению субъекту-пациенту, страдающему от остеоартрита или подверженному развитию остеоартрита, в течение периода времени, достаточного для уменьшения или предотвращения, соответственно, деградации хрящевой ткани в суставах указанного пациента и предпочтительно завершения самоподдерживающихся процессов, ответственных за указанную деградацию. В конкретном варианте осуществления указанные соединения демонстрируют анаболические и/или противокатаболические свойства в хрящевой ткани. Уровни инъецируемой дозы заключаются в пределах от приблизительно 0,1 по меньшей мере 10 мг/кг/ч, все для от приблизительно 1 до приблизительно 120 ч и, в частности, от 24 до 96 ч. Предварительно заданный объем болюса от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг или более также можно вводить для достижения надлежащего плато концентрации. Максимальная общая доза не должна превышать приблизительно 2 г/сутки на от 40 до 80 кг массы пациента, являющегося человеком. Для предотвращения и/или лечения хронических состояний, таких как дегенеративные состояния,схема лечения, как правило, растягивается на многие месяцы или годы, таким образом, для удобства и переносимости лечения пациентом предпочтительным является оральное дозирование. При оральном дозировании от одной до пяти и, в частности, от двух до четырех и, как правило, три оральные дозы в сутки представляют собой типичные схемы лечения. При использовании этих примеров дозирования каждая доза обеспечивает от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг соединения по изобретению, в частности, каждая доза обеспечивает от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг и конкретно, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг/кг. Трансдермальные дозы, как правило, выбирают для обеспечения в крови сходных или более низких уровней, чем достигают при использовании доз инъекциями. При использовании для предотвращения начала проявления воспалительного состояния, соединения по данному изобретению будут вводить пациенту с риском развития состояния, как правило, по совету и под наблюдением врача в дозировке, соответствующей уровню, описанному выше. Пациенты с риском развития конкретного состояния, как правило, включают пациентов, которые имеют семейный анамнез состояния, или тех пациентов, у которых посредством генетического тестирования или скрининга обнаружили подверженность развитию конкретного состояния. Соединения по данному изобретению можно вводить как в виде отдельного активного средства, так и в сочетании с другими средствами, включающими другие соединения, которые показали такую же или схожую терапевтическую активность и которые определены как безопасные и эффективные при таком комбинированном введении. В конкретном варианте осуществления комбинированное введение двух(или более) средств допускает значимо более низкие дозы каждого используемого средства, тем самым снижая наблюдаемые побочные эффекты. В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения заболевания, включающего воспаление; конкретные средства включают, но не ограничиваются ими, иммунорегуляторные средства, например азатиоприн, кортикостероиды (например, преднизолон или дексаметазон), циклофосфамид, циклоспорин А, такролимус,микофенолата мофетил, муромонаб-CD3 (ОКТ 3, например Orthocolone), ATG, аспирин, ацетоминофен,ибупрофен, напроксен и пироксикам. В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения артрита (например, ревматоидного артрита); конкретные средства включают, но не ограничиваются ими, анальгетики, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAIDS), стероиды, синтетические DMARDS (например, но не ограничиваясь ими, метотрексат, лефлуномид, сульфасалазин, ауранофин, натрия ауротиомалат, пеницилламин, хлорохин, гидроксихлорохин, азатиоприн и циклоспорин) и биологические DMARDS (например, но не ограничиваясь ими, Инфликсимаб, Этанерцепт, Адалимубаб, Ритуксимаб и Абатацепт). В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения пролиферативных нарушений; конкретные средства включают, но не ограничиваются ими, метотрексат, лейковорин, адриамицин, пренизон, блеомицин, циклофосфамид, 5-фторурацил, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, винбластин, винорелбин, доксорубицин,тамоксифен, торемифен, мегестрола ацетат, анастрозол, гозерелин, моноклональное антитело против изобретению можно вводить в сочетании с другими видами терапии, включая в качестве неограничивающих примеров лучевую терапию или хирургическое вмешательство. В конкретном варианте осуществления пролиферативное нарушение выбирают из злокачественной опухоли, миелопролиферативного заболевания или лейкемии. В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения аутоиммунных заболеваний, конкретные средства включают, но не ограничиваются ими, глюкокортикоиды, цитостатические средства (например, аналоги пурина), алкилирующие средства (например, азотистые иприты (циклофосфамид), нитрозомочевина, соединения платины и другие), антиметаболиты (например, метотрексат, азатиоприн и меркаптопурин),цитотоксические антибиотики (например, дактиномицин, антрациклины, митомицин С, блеомицин и митрамицин), антитела (например, моноклональные антитела против CD20, против CD25 или противCD3 (ОТК 3), Atgam и Thymoglobuline), циклоспорин, такролимус, рапамицин (сиролимус), интерфероны (например, IFN-), связывающие TNF белки (например, инфликсимаб (Ремикейд), этанерцепт (Энбрел), или адалимумаб (Хумира, микофенолат, Финголимод, Мириоцин. В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения отторжения трансплантата, конкретные средства включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы кальциневрина (например, циклоспорин или такролимус(например, моноклональные антитела против рецептора IL-2R, базиликсимаб, даклизумаб), поликлональные антитела против Т-клеток (например, глобулин против тимоцитов (ATG), глобулин против лимфоцитов (ALG. В одном из вариантов соединение по изобретению вводят вместе с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения астмы, и/или ринита, и/или COPD, конкретные средства включают в качестве неограничивающих примеров агонистов бета 2-адренорецептора (например, сальбутамол,левальбутерол, тербуталин и битолтерол), эпинефрин (ингалируемый или таблетки), антихолинерические средства (например, ипратропия бромид), глюкокортикоиды (оральные или ингалируемые) длительно действующие 2-агонисты (например, салметерол, формотерол, бамбутерол и оральный альбутерол замедленного высвобождения), комбинации ингалируемых стероидов и длительно действующих бронхолитиков (например, флутиказон/салметерол, будесонид/формотерол), антагонистов и ингибиторов синтеза лейкотриена (например, монтелукаст, зафирлукаст и зилеутон), ингибиторы высвобождения медиаторов (например, кромогликат и кетотифен), биологические регуляторы ответа IgE (например, омализумаб), противогистаминные средства (например, цетирезин, циннаризин, фексофенадин), сосудосуживающие средства (например, оксиметазолин, ксилометазолин, нафазолин и трамазолин). Дополнительно, соединение по изобретению можно вводить в сочетании с видами терапии неотложной помощи, в случае астмы и/или COPD, такие виды терапии включают введение кислорода или кислородно-гелиевой смеси, распыляемого сальбутамола или тербуталина (необязательно комбинированного с антихолинергическими (например, ипратропий), системными стероидами (оральным или внутривенным, например преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон, или гидрокортизон),сальбутамолом для внутривенного введения, неспецифическими бета-агонистами, инъецируемыми или ингалируемыми (например, эпинефрин, изоэтарин, изопротеренол, метапротеренол), антихолинергическими средствами (IV или распыляемые, например гликопироллат, атропин, ипратропий), метилксантинами (теофиллин, аминофиллин, бамифиллин), анестетиками для применения в виде ингаляций, которые обладают эффектом бронходилататоров (например, изофлуран, галотан, энфлуран), кетамином, сульфатом магния для внутривенного ведения. В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения IBD, конкретные средства включают, но не ограничиваются ими, глюкокортикоидные (например, преднизон, будезонид) синтетические средства, модифицирующие заболевание, иммуномодулирующие средства (например, метотрексат, лефлуномид, сульфасалазин,мезалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурин и циклоспорин) и биологические средства, модифицирующие заболевание, иммуномодуляторные средства (инфликсимаб, адалимумаб, ритуксимаб и абатацепт). В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения SLE, конкретные средства включают, но не ограничиваются ими, противоревматические лекарственные средства, модифицирующие заболевания (DMARD),такие как противомалярийные средства (например, плаквенил, гидроксихлорохин), иммуносупрессанты(например, метотрексат и азатиоприн), циклофосфамид и микофеноловая кислота; иммуносупрессивные лекарственные средства и анальгетики, такие как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, опиаты (например, декстропропоксифен и ко-кодамол), опиоиды (например, гирокодон, оксикодон, MS контин или метадон) и трансдермальный пластырь с фентанилом - дурагезик. В одном из вариантов соединение по изобретению вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или предотвращения псориаза, конкретные средства включают, но не ограничи- 13018080 ваются ими, лекарственные средства для местного введения, такие как омывающие жидкости, увлажняющие средства, кремы, содержащие лекарственные средства, и мази, содержащие деготь, дитранол(антралин), кортикостероиды, такие как дезоксиметазон (Topicort), флуоцинонид, аналоги витамина D3(например, кальципотриол), масло железного дерева и ретиноиды (этретинат, ацитретин, тазаротен), системные лекарственные средства, такие как метотрексат, циклоспорин, ретиноиды, тиогуанин, гидроксимочевина, сульфасалазин, микофенолата мофетил, азатиоприн, такролимус, сложные эфиры фумаровой кислоты или биологические препараты, так как Amevive, Энбрел, Хумира, Ремикейд, Раптива и устекинумаб (блокатор IL-12 и IL-23). Дополнительно, соединение по изобретению можно вводить в сочетании с другими терапевтическими средствами, включая, в качестве неограничивающих примеров, фототерапию или фотохимиотерапию (например, псорален и ультрафиолетовые лучи спектра A (PUVA. Как будет очевидно специалисту, посредством совместного введения в рамки единой схемы лечения включают любые способы доставки двух или более терапевтических средств пациенту. Хотя два или более средств можно вводить одновременно в одном составе, это не является существенным. Средства можно вводить в различных составах и в различное время. Общие синтетические способы Общее Соединения по изобретению можно получать из легкодоступных исходных материалов, используя следующие общие способы и процедуры. Следует понимать, что в случае, если используют типичные или предпочтительные условия процесса (т.е. температуры реакции, время, молярное соотношение вступающих в реакцию соединений, растворителей, давление и т.д.), также можно использовать другие условия процесса, если не указано иначе. Оптимальные условия реакции могут варьировать в зависимости от конкретных используемых в реакции средств или растворителя, но такие условия может определить специалист в данной области посредством общепринятых способов оптимизации. Дополнительно, как будет очевидно специалистам в данной области, для защиты некоторых функциональных групп от участия в нежелательных реакциях могут потребоваться традиционные защитные группы. Выбор подходящей защитной группы для конкретной функциональной группы, а также условия,подходящие для защиты и удаления защиты, хорошо известны в данной области. Например, ряд защитных групп и их введение и удаление описывают в Т. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protecting Groups inOrganic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991 и цитируемые в них ссылки. Для получения типичных бициклогетероарилов, которые перечислены в настоящем документе ранее, в деталях представлены следующие способы. Соединения по изобретению специалист в данной области органического синтеза может получить из известных или коммерчески доступных исходных материалов и реагентов. Все реагенты являлись техническими и использовались в состоянии поставки, без дополнительной очистки, если не указано иначе. Коммерчески доступные безводные растворители использовали для реакций, проводимых в инертной атмосфере. Химически чистые растворители использовали во всех случаях, если не указано иначе. Хроматографию проводили на колонках с силикагелем 60 (35-70 мкм). Тонкослойную хроматографию осуществляли, используя планшеты, предварительно покрытые силикагелемF-254 (толщина 0,25 мм). Спектры 1 Н ЯМР записали на спектрометре Bruker DPX 400 ЯМР (400 МГц). Химические сдвиги (5) для спектров ЯМР 1 Н представили в частях на миллион (м.д.) относительно тетраметилсилана ( 0,00) или подходящего пика остаточного растворителя, т.е. CHCl3 ( 7,27), в качестве внутреннего источника сравнения. Множественность сигнала указывается как синглет (s), дублет (d),триплет (t), квартет (q), мультиплет (m) и уширенный (br). Константы взаимодействия (J) указываются в Гц. MS спектры с распылением в электрическом поле получили на спектрометре LC/MS Micromass platform. Колонка, используемая для всего анализа LCMS: Waters Acquity UPLC ВЕН С 18 1,7 мкм, 2,1 мм ID50 мм L (партия 186002350. Препаративная ВЭЖХ: Waters XBridge Prep C18 5 мкм ODB 19 мм ID100 мм L (партия 186002978). Во всех способах использовали градиент MeCN/H2O. H2O содержит или 0,1% TFA или 0,1% NH3. Синтетическое получение соединений по изобретению Соединение по изобретению можно получать по следующей схеме. Общий способ синтеза Схема 1 К раствору 2-амино-6-бромпиридина (1) (253,8 г, 1,467 моль) в DCM (2,5 л), охлажденного до 5 С,добавляют этоксикарбонилизотиоцианат (173,0 мл, 1,467 моль) по каплям, в течение 15 мин. Затем реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры (20 С) и перемешивают в течение 16 ч. Испарение in vacuo привело к образованию твердого вещества, которое можно получать фильтрацией,тщательно промывать бензином (3600 мл) и подвергать воздушной сушке для предоставления (2). Тиомочевину как таковую можно использовать для следующей стадии без какого-либо очистки. 1 К суспензии гидроксиламина гидрохлорида (101,8 г, 1,465 моль) в EtOH/MeOH (1:1, 900 мл) добавляют N,N-диизопропилэтиламин (145,3 мл, 0,879 моль) и смесь перемешивают при комнатной температуре (20 С) в течение 1 ч. 1-(6-Бромпиридин-2-ил)-3-карбоэтокситиомочевину (2) (89,0 г, 0,293 моль) можно затем добавлять и медленно нагревать смесь с обратным холодильником (примечание: для улавливания выделенного H2S требуется скруббер с раствором гипохлорита натрия). После 3 ч с обратным холодильником смеси давали охладиться и фильтровали для сбора выпавшего в осадок твердого вещества. Дополнительно продукт можно собрать испарением фильтрата in vacuo, добавлением Н 2 О (250 мл) и фильтрацией. Комбинированные твердые вещества промывают последовательно с Н 2 О (250 мл),EtOH/MeOH (1:1, 250 мл) и Et2O (250 мл), затем высушивают in vacuo для получения производного триазолопиридина (3) в виде твердого вещества. Соединение может быть использовано как таковое для следующей стадии без какой-либо очистки. 1 Н (400 МГц, ДМСО-d6)7,43-7,34 (м, 2 Н, 2 ароматический-Н), 7,24 (дд, 1 Н, J=6,8 Гц J=1,8 Гц,ароматический-Н), 6,30 (уушир., 2 Н, NH2); m/z 213/215 (1:1, М+Н+, 100%). 1.1.3 Общий способ моноацилирования для получения промежуточного соединения (4) К раствору 2-аминотриазолопиридина (3) (7,10 г, 33,3 ммоль) в сухом CH3CN (150 мл) при 5 С добавляют Et3N (11,6 мл, 83,3 ммоль) с последующим добавлением надлежащего хлорангидрида (83,3 ммоль). Реакционной смеси затем дают охладиться до температуры окружающей среды и перемешивают до тех пор, пока не истратится исходный материал (3). Если необходимо, Et3N (4,64 мл, 33,3 ммоль) и хлорангидрид (33,3 ммоль) можно добавить дополнительно, для обеспечения завершения реакции. После выпаривания растворителя in vacuo остаток обрабатывают 7 N раствором аммиака в метаноле (50 мл) и перемешивают при температуре окружающей среды (в течение 1-16 ч) для гидролиза какого-либо бисацилированного продукта. Выделение продукта осуществляют посредством удаления летучих веществ invacuo с последующим титрованием Et2O (50 мл). Твердое вещество можно собрать фильтрацией, промыть Н 2 О (250 мл), ацетоном (50 мл) и Et2O (50 мл), затем высушить in vacuo для получения требуемого ацильного промежуточного соединения (4). В некоторых случаях может потребоваться хроматография на колонке (бензин/EtOAc для получения чистых соединений. Способ А. 1.1.4 Получение соединений по изобретению посредством сочетания Suzuki (5) Надлежащую бороновую кислоту (2 экв.) добавляют к раствору промежуточного соединения брома(4) в 1,4-диоксан/вода (5:1). В раствор добавляют K2CO3 (2 экв.) и PdCl2dppf (5%). Полученную в результате смесь затем нагревают под действием электромагнитных волн при 140 С в течение 30 мин (эту реакцию можно также выполнять традиционным нагреванием на масляной бане при 90 С в течение 16 ч в атмосфере N2). Добавляют воду и раствор экстрагируют этилацетатом. Органические слои высушивают над MgSO4 и выпаривают in vacuo. Готовое соединение получают после очистки флэш-хроматографией. Способ С.(1,1 экв.), полученную посредством способа А, и K2CO3 (5 экв.) (или AgCO3) растворяют в DMF в атмосфере N2 и по каплям добавляют надлежащее алкилирующее средство (1,1 экв.). Полученную в результате суспензию нагревают при 50 С в течение 16 ч. По истечении этого времени реакцию завершают. Соединение экстрагируют EtOAc и водой, промывают насыщенным солевым раствором и высушивают подMgSO4. Органические слои фильтруют и выпаривают. Готовое соединение выделяют посредством препаративной ВЭЖХ. Препаративная ВЭЖХ:Waters XBridge Prep C18 5 мкм ODB 19 мм ID100 мм L (партия 186002978). Во все способах используют градиенты MeCN/H2O. H2O содержит или 0,1% TFA или 0,1% NH3. Способ Е. Надлежащий альдегид (2 экв.), анилиновое производное (1 экв.), полученные способом А и Ti(OPr)4 смешивают и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь разбавляют этанолом и добавляют Na(CN)BH3 (1 экв.). Полученный в результате раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Смесь разбавляют водой и фильтруют. Фильтрат промывают этанолом. Комбинированные растворимые фазы выпаривают под вакуумом. Готовое соединение выделяют препаративной ВЭЖХ. Препаративная ВЭЖХ:Waters XBridge Prep C18 5 мкм ODB 19 мм ID100 мм L (партия 186002978). Во всех способах используют градиенты MeCN/H2O. H2O содержит или 0,1% TFA или 0,1% NH3. Способ F. К раствору 5-бром-2-аминотриазолопиридина (1 экв.) в сухом CH3CN при 5 С добавляют Et3N (2,5 экв.) с последующим добавлением ацетилхлорида (2,5 экв.). Реакционной смеси затем позволяют нагреться до температуры окружающей среды и перемешивают до тех пор, пока не израсходуется исходный материал. Если необходимо, дополнительно Et3N (1 экв.) и хлорангидрид (1 экв.) добавляют для обеспечения полной реакции. После выпаривания растворителя in vacuo осадок обрабатывают 7 N раствором аммиака в метаноле и перемешивают при температуре окружающей среды (в течение 1-16 ч) для гидролиза какого-либо бис-ацилированного продукта. Выделение продукта осуществляют посредством удаления летучих веществ in vacuo с последующим добавлением воды и экстракцией этилацетатом. Органическую фазу затем высушивают над MgSO4, выпаривают in vacuo. Соединение используют без дополнительной очистки. Сочетание Suzuki (общий способ) Бороновую кислоту (2 экв.) добавляют к раствору N-(5-бром-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2 ил)ацетамида в 1,4-диоксан/вода (5:1). K2CO3 (2 экв.) и Pd(dppf)Cl2 (5%) (dppf = 1,1'Бис(дифенилфосфино)ферроцен) добавляют в раствор. Смесь, полученную в результате, затем нагревают в микроволновой печи (СЕМ discover) в запаянной пробирке при 140 С в течение 30 мин. Добавляют воду и раствор экстрагируют этилацетатом. Органические слои высушивают над MgSO4 и выпаривают in vacuo. Готовое соединение получают после очистки препаративной ВЭЖХ. Аналитическая: Waters Acquity UPLC ВЕН С 18 1,7 мкм, 2,1 мм ID50 мм L (партия 186002350). Препаративная ВЭЖХ:Waters XBridge Prep C18 5 мкм ODB 19 мм ID100 мм L (партия 186002978). Во всех способах используются градиенты MeCN/H2O. H2O содержит или 0,1% TFA или 0,1% NH3. Способ L.L.1 Нуклеофильное ароматическое замещение (общий способ) 5-[4-(6-хлорпиридин-3-илметокси)фенил]-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2-иламид циклопропанкарбоновой кислоты, полученный способом С (1 экв.), соответствующий амин, (1,5 экв.) смешивают в ДМСО в запаянной пробирке. Реакцию подвергают нагреванию при 100 С в течение 24 ч. Поскольку всеSM удалены LCMS, воду добавляют в реакционную смесь и органические вещества экстрагируют этилацетатом. Органический слой высушивают над MgSO4 и выпаривают под вакуумом. Готовое соединение выделяют посредством препаративной ВЭЖХ. Аналитическая: Waters Acquity UPLC ВЕН С 18 1,7 мкм, 2,1 мм ID50 мм L (партия 186002350) Препаративная ВЭЖХ: Waters XBridge Prep C18 5 мкм ODB 19 мм ID100 мм L (партия 186002978). Во всех способах используются градиенты MeCN/H2O. H2O содержит или 0,1% TFA или 0,1% NH3.Pd(PPh3)4 (0,04 ммоль) добавляют к дегазированному раствору циклопропанкарбоновой кислоты 5[4-(галогенарил-3-илметокси)фенил]-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2-иламид, полученной в способе В(0,24 ммоль) и Zn(CN)2 (0,24 ммоль) в DMF (1 мл). Реакционную смесь подвергают микроволновому излучению (W:150 W; Т:150 С) в течение 30 мин. Смесь разбавляют этилацетатом и промывают водой. Органический слой высушивают над MgSO4, фильтруют и растворитель удаляют под вакуумом. Соединение очищают препаративной ВЭЖХ для получения продукта (30 до 50%) . Синтез соединения по изобретению Соединение 176: N-(5-(4-6-цианопиридин-3-ил)метокси)фенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2 ил)циклопропанкарбоксамид 176.1 Синтез 5-[4-(4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)феноксиметил]пиридин-2 карбонитрила К сложному эфиру 4-гидроксифенилбороновой кислоты и пинакола (25 г; 0,11 моль; 1,0 экв.) в ацетоне (250 мл) при комнатной температуре добавляют в атмосфере аргона 5-хлорметилпиридин-2 карбонитрил (19 г; 0,12 моль; 1,1 экв.) и карбонат цезия (73,9 г, 0,22 моль; 2 экв.). Реакционную смесь нагревают в течение 4 ч с обратным холодильником. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры,ацетон выпаривают. Добавляют воду (200 мл) и продукт экстрагируют EtOAc (3200 мл). Органический слой высушивают над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют досуха. Осадок, полученный в результате, очищают хроматографией на силикагеле (полученный остаток:EtOAc 10:1) для получения целевого бороната в виде белого твердого вещества. 176.2: Синтез 5-[4-(6-цианопиридин-3-илметокси)фенил]-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2 иламида циклопропанкарбоновой кислоты 5-[4-(4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)феноксиметил]пиридин-2-карбонитрил (10 г,0,03 моль, 1,1 экв.) добавляют к раствору (5-бром-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2-ил)амида циклопропанкарбоновой кислоты (7,6 г, 0,027 моль) в 1,4-диоксан/вода (4:1; 70 мл). K2CO3 (7,45, 0,054 моль, 2 экв.) и PdCl2dppf (5%) добавляют к раствору. Полученную в результате смесь затем нагревают на масля- 19018080 ной бане при 90 С в атмосфере N2 до завершения (контролируют LCMS). 1,4-Диоксан удаляют под вакуумом и добавляют вода/EtOAc и отфильтровывают твердое вещество. Полученное твердое вещество растворяют в метанол/DCM, сушат над MgSO4 и получают готовое соединение после очистки флэшхроматографией, элюируют чистым EtOAc с получением белого твердого вещества. Полученное соединение представлено ниже в табл. I. Спектральные данные ЯМР типичных соединений по изобретению даны в табл. II. Таблица I Таблица II. Данные ЯМР типичных соединений по изобретению Биологические примеры Пример 1. Анализы in vitro Пример 1.1 Анализы ингибирования JAK1 Каталитический домен рекомбинантного JAK1 человека (аминокислоты 850-1154; номер в каталоге 08-144) приобрели у Carna Biosciences. 10 нг JAK1 инкубировали с 12,5 мкг субстрата поли-GT (номер в каталоге Sigma P0275) в буфере для киназной реакции (конечные концентрации 15 мМ трис-HCl рН 7,5,1 мМ DTT, 0,01% Tween-20, 10 мМ MgCl2, 2 мкМ нерадиоактивных АТФ, 0,25 мкКи 33 Р-гамма-АТФ (GEHealthcare, номер в каталоге АН 9968 с наличием или отсутствием 5 мкл, содержащих тестируемое соединение или носитель (конечная концентрация ДМСО 1%), в суммарном объеме 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Greiner, V-образное дно лунок). После 45 мин при 30 С реакции остановили добавлением 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все завершенные киназные реакции перенесли в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 96-луночные фильтр-планшеты (номер в каталоге Perkin Elmer 6005177), используя клеточный харвестер (Perkin Elmer). Планшеты промыли 6 раз 300 мкл 75 мМ раствора фосфорной кислоты на лунку и нижнюю часть планшетов запечатали. Добавили 40 мкл/лунка Microscint-20, верхнюю часть планшетов запечатали, а считывание проводили, используя Topcount (Perkin Elmer). Киназную активность рассчитали, вычитая число импульсов в минуту(cpm), полученное в присутствии положительного контроля ингибитора (10 мкМ стауроспорина), из cpm,полученного в присутствии носителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определили как Процент ингибирования = ( (cpm, определенное для образца, в котором присутствует тестируемое соединение, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора), деленное на(cpm, определенное в присутствии носителя, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора 100%. Для соединений получили серии разведения дозы, позволяющие тестирование эффекта дозы при анализе JAK1 и вычисление IC50 для каждого соединения. Каждое соединение тестировали общепринятым способом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/3, 8 значений (20 мкМ - 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в ДМСО с конечной концентрацией 1%. При повышенной эффективности серий соединений получали больше разведений и/или снижали верхнее значение концентрации (например, 5, 1 мкМ). Полуколичественная оценка: 501 нМ 101-500 нМ 0,1-100 нМ Таблица III. Значения IC50 соединений по отношению к JAK1 Пример 1.2 Анализ ингибирования JAK2 Каталитический домен рекомбинантного JAK2 человека (аминокислоты 808-1132; номер в каталогеPV4210) приобрели у Invitrogen. 0,025 мЕд JAK2 инкубировали с 2,5 мкг субстрата поли-GT (номер в каталоге Sigma P0275) в буфере для киназной реакции (конечные концентрации 5 мМ MOPS pH 7,5, 9 мМ MgAc, 0,3 мМ EDTA, 0,06% Brij и 0,6 мМ DTT, 1 мкМ нерадиоактивных АТФ, 0,25 мкКи 33 Р-гаммаАТФ (GE Healthcare, номер в каталоге АН 9968, с наличием или отсутствием 5 мкл, содержащих тестируемое соединение или носитель (ДМСО в конечной концентрации 1%), в суммарном объеме 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Greiner, V-образное дно лунок). После 90 мин при 30 С реакции остановили добавлением 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все завершенные киназные реакции перенесли в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 96-луночные фильтрпланшеты (номер в каталоге Perkin Elmer 6005177), используя клеточный харвестер (Perkin Elmer). Планшеты промыли 6 раз 300 мкл 75 мМ раствора фосфорной кислоты на лунку и нижнюю часть планшетов запечатали. Добавили 40 мкл/лунка Microscint-20, верхнюю часть планшетов запечатали и считывание проводили, используя Topcotmt (Perkin Elmer). Киназную активность вычислили, вычитая число импульсов в минуту (cpm), полученное в присутствии положительного контроля ингибитора (10 мкМ стауроспорина) из cpm, полученного в присутствии носителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определили как Процент ингибирования = cpm, определенное для образца, в котором присутствует тестируемое соединение, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора), деленное на(cpm, определенное в присутствии носителя, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора 100%. Для соединений получили серии разведения дозы, позволяющие тестирование эффекта дозы в анализе JAK2 и вычисление IC50 для каждого соединения. Каждое соединение тестировали общепринятыми способами при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/3, 8 значений (20 мкМ 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в ДМСО с конечной концентрацией 1%. При повышенной эффективности серий соединений получали больше разведений и/или снижали верхнее значение концентрации (например, 5, 1 мкМ). Полуколичественная оценка:501 нМ 101-500 нМ 1-100 нМ Таблица IV. Значения IC50 соединений по отношению к JAK2 Пример 1.3 Анализ ингибирования JAK3 Каталитический домен рекомбинантного JAK3 человека (аминокислоты 781-1124; номер в каталогеPV3855) приобрели у Invitrogen. 0,025 мЕд JAK3 инкубировали с 2,5 мкг субстрата поли-GT (номер в каталоге Sigma P0275) в буфере для киназной реакции (конечные концентрации 25 мМ Tris pH 7,5, 0,5 мМ EGTA, 0,5 мМ Na3VO4, 5 мМ b-глицеринфосфат, 0,01% triton Х-100, 1 мкМ нерадиоактивного АТФ,0,25 мкКи 33 Р-гамма-АТФ (GE Healthcare, номер в каталоге АН 9968 с наличием или отсутствием 5 мкл,содержащих тестируемое соединение или носитель (ДМСО, конечная концентрация 1%), в суммарном объеме 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Greiner, V-образное дно лунок). После 105 мин при 30C реакции остановили добавлением 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все завершенные киназные реакции перенесли в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 96 луночные фильтр-планшеты (номер в каталоге Perkin Elmer 6005177), используя клеточный харвестер(Perkin Elmer). Планшеты промыли 6 раз 300 мкл 75 мМ раствора фосфорной кислоты на лунку и нижнюю часть планшетов запечатали. Добавили 40 мкл/лунка Microscint-20, верхнюю часть планшетов запечатали, а считывание проводили, используя Topcount (Perkin Elmer). Киназную активность вычислили,вычитая число импульсов в минуту (cpm), полученное в присутствии положительного контроля ингибитора (10 мкМ стауроспорина), из cpm, полученного в присутствии носителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определили как Процент ингибирования = cpm, определенное для образца, в котором присутствует тестируемое соединение, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора), деленное на(срт, определенное в присутствии носителя, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора 100%. Для соединений получили серии разведения дозы, позволяющие тестирование эффекта дозы в анализе JAK3 и вычисление IC50 для каждого соединения. Каждое соединение тестировали общепринятым способом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/3, 8 значений (20 мкМ 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в ДМСО с конечной концентрацией 1%. При повышенной эффективности серий соединений получали больше разведений и/или снижали верхнее значение концентрации (например, 5 мкМ, 1 мкМ). Полуколичественная оценка:+ 501 нМ 101-500 нМ 1-100 нМ Таблица V. Значения IC50 соединений по отношению к JAK3 Пример 1.4 Анализ ингибирования TYK2 Каталитический домен рекомбинантного TYK2 человека (аминокислоты 871-1187; номер в каталоге 08-147) приобрели у Carna biosciences. 5 нг TYK2 инкубировали с 12,5 мкг субстрата поли-GT (номер в каталоге Sigma P0275) в буфере для киназной реакции (конечные концентрации 25 мМ Hepes pH 7,5, 100 мМ NaCl, 0,02 мМ Na3VO4, 0,1% NP-40, 0,1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,125 мкКи 33 Р-гамма-АТФ(GE Healthcare, номер в каталоге АН 9968 с наличием или отсутствием 5 мкл, содержащих тестируемое соединение или носитель (ДМСО, конечная концентрация 1%), в суммарном объеме 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Greiner, V-образное дно лунок). После 90 мин при 30 С реакции остановили добавлением 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все завершенные киназные реакции перенесли в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 96-луночные фильтр-планшеты(номер в каталоге Perkin Elmer 6005177), используя клеточный харвестер (Perkin Elmer). Планшеты промыли 6 раз 300 мкл 75 мМ раствора фосфорной кислоты на лунку и нижнюю часть планшетов запечатали. Добавили 40 мкл/лунка Microscint-20, верхнюю часть планшетов запечатали, а считывание проводили, используя Topcount (Perkin Elmer). Киназную активность вычислили, вычитая число импульсов в минуту (cpm), полученное в присутствии положительного контроля ингибитора (10 мкМ стауроспорина), изcpm, полученного в присутствии носителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определили как Процент ингибирования = cpm, определенное для образца, в котором присутствует тестируемое соединение, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора), деленное на(cpm, определенное в присутствии носителя, - cpm, определенное для образца с положительным контролем ингибитора 100%. Для соединений получили серии разведения дозы, позволяющие тестирование эффекта дозы при анализе TYK2 и вычисление IC50 для каждого соединения. Каждое соединение тестировали общепринятым способом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разведением 1/3, 8 значений (20 мкМ - 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в ДМСО с конечной концентрацией 1%. При повышенной эффективности серий соединений получали больше разведений и/или снижали верхнее значение концентрации (например, 5, 1 мкМ). Полуколичественная оценка:1001 нМ 501-1000 нМ 101-500 нМ 1-100 нМ Таблица VI. Значения IC50 соединений по отношению к TYK2 Пример 2. Клеточный анализ Пример 2.1 Анализ передачи сигнала JAK-STAT: Клетки HeLa поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% инактивированную нагреванием эмбриональную сыворотку теленка, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Для трансфекции использовали клетки HeLa при 70% смыкании монослоя. 20000 клеток в 87 мкл среды для культивирования клеток временно трансфицировали 40 нгpSTAT1(2)-репортерный ген люциферазы (Panomics), 8 нг репортерного гена LacZ в качестве внутреннего контроля репортерного гена, и 52 нг pBSK, используя 0,32 мкл Jet-PEI (Polyplus) в качестве реагента трансфекции на лунку, в формате 96-луночного планшета. После инкубации в течение ночи при 37C 10% СО 2 среду для трансфекции удалили. Добавляли 75 мкл DMEM + 1,5% инактивированную нагрева- 22018080 нием эмбриональную сыворотку теленка. 15 мкл соединения с 6,7 концентрацией добавляли в течение 60 мин и затем добавили 10 мкл OSM человека (Peprotech) в конечной концентрации 33 нг/мл. Все соединения тестировали с дублированием, начиная с 20 мкМ, с последующим серийным разведением 1/3, всего 8 доз (20 мкМ -6,6 мкМ - 2,2 мкМ - 740 нМ - 250 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в конечной концентрации 0,2% ДМСО. После инкубации в течение ночи при 37 С, 10% СО 2, клетки лизировали в 100 мкл буфера для лизиса/лунка (PBS, 0,9 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 5% трегалоза, 0,025% тергитол NP9, 0,15% БСА). 40 мкл клеточного лизата использовали для определения активности -галактозидазы, добавляя 180 мкл раствора Gal (30 мкл ONPG 4 мг/мл + 150 мкл буфера для -галактозидазы (0,06 M Na2HPO4, 0,04 М NaH2PO4, 1 мМ MgCl2 в течение 20 мин. Реакцию остановили добавлением 50 мкл 1 M Na2CO3. Оптическую плотность определили при 405 нм. Люциферазную активность измеряли, используя 40 мкл клеточного лизата плюс 40 мкл Steadylite,как описано у производителя (Perkin Elmer), на Envision (Perkin Elmer). 10 мкМ pan-JAK ингибитора использовали в качестве положительного контроля (100% ингибирование). В качестве отрицательного контроля использовали 0,5% ДМСО (0% ингибирование). Положительный и отрицательный контроль использовали для расчета значения 'z' и 'процент ингибирования'(PIN). Процент ингибирования = флуоресценция, определенная в присутствии носителя, - флуоресценция, определенная для образца, в котором присутствует тестируемое соединение), деленное на (флуоресценция, определенная в присутствии носителя, - флуоресценция, определенная для образца без инициирующего фактора 100%. Значения PIN графически изобразили для соединений, тестированных на эффект дозы и получили значения ЕС 50. Таблица VII.1001 нМ 501-1000 нМ 101-500 нМ 1-100 нМ Таблица VII. Значения ЕС 50 передачи сигнала JAK-STAT Пример 2.2. Анализ передачи сигнала OSM/IL-1OSM и IL-1, как показывают, синергично повышают уровни ММР 13 в клеточной линии хондросаркомы SW1353 человека. Клетки пересевали в 96-луночный планшет из расчета 15000 клеток/лунка в объеме 120 мкл DMEM (Invitrogen), содержащий 10% (об./об.) FBS и 1% пенициллин/стрептомицин (InVitrogen), инкубировали при 37 С 5% СО 2. Клетки предварительно инкубировали с 15 мкл соединения в среде М 199 с 2% ДМСО 1 ч перед инициированием реакции 15 мкл OSM и IL-1, для получения 25 нг/мл OSM и 1 нг/мл IL-1, и уровни ММР 13 измеряли в кондиционированной среде через 48 ч после инициирования реакции. Активность ММР 13 измерили, используя анализ активности с иммобилизованным антителом. С этой целью 384-луночные планшеты (NUNC, 460518, MaxiSorb black) обрабатывали 35 мкл 1,5 мкг/мл раствором антител к ММР 13 человека (RD Systems, MAB511) в течение 24 ч при 4 С. После 2-кратной промывки лунок с PBS + 0,05% Tween, оставшиеся центры связывания блокировали с 100 мкл 5% обезжиренного сухого молока (Santa Cruz, sc-2325, Blotto) в PBS в течение 24 ч при 4 С. Затем лунки промыли 2 раза с PBS + 0,05% Tween и добавили 35 мкл супернатанта культуры с разведением 1/10, содержащим ММР 13 в 100-кратном разведенном блокирующем буфере, и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем лунки промыли дважды с PBS + 0,05% Tween с последующей активацией ММР 13 посредством добавления 35 мкл 1,5 мМ раствора ацетата 4-аминофенил-ртути (АРМА)(Sigma, А 9563) и инкубацией при 3-7 С в течение 1 ч. Лунки промыли снова с PBS + 0,05% Tween и добавили 35 мкл субстрата для ММР 13 (Biomol, P-126, OmniMMP флуорогенный субстрат). После инкубации в течение 24 ч при 37 С флуоресценцию вступившего в реакцию субстрата измерили в Perkin ElmerWallac Envision 2102 Multilabel Reader (длина волны возбуждения: 320 нм, длины волны излучения: 405 нм). Процент ингибирования = флуоресценция, определенная в присутствии носителя, - флуоресценция, определенная для образца, в котором присутствует тестируемое соединение), деленное на (флуоресценцию, определенную в присутствии носителя, - флуоресценция, определенная для образца без инициирующего фактора 100%.1001 нМ 501-1000 нМ 1-500 нМ Пример 2.3 Анализ пролиферации PBL Лимфоциты периферической крови человека (PBL) стимулировали IL-2 и пролиферацию измерили,используя анализ включения BrdU. PBL сначала стимулировали в течение 72 ч с PHA для индуцирования рецептора IL-2, оставляли без питания в течение 24 ч для остановки клеточной пролиферации, с последующей стимуляцией IL-2 еще в течение 72 ч (включая 24 ч на мечение BrdU). Клетки подвергали предварительной инкубации с тестируемыми соединениями в течение 1 ч перед добавлением IL-2. Клетки культивировали в RPMI 1640, содержащим 10% (об./об.) FBS. Пример 3. Модели in vivo Пример 3.1 Модель CIA 3.1.1 Maтериалы Полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA) приобрели у Difco. Бычий коллаген типа II (CII), липополисахарид (LPS) и Энбрел получили у Chondrex (Л'Иль-д'Або, Франция);Sigma (P4252, Л'Иль-д'Або, Франция), Whyett (25 мг шприц для инъекций, Франция) Acros Organics (Пало-Альто, штат Калифорния), соответственно. Все другие используемые реагенты являлись чистыми, а все растворители имели степень чистоты для аналитических целей. 3.1.2 Животные Крыс Dark Agouti (самцы, в возрасте 7-8 недель) получили из Harlan Laboratories (Мэсонс-Алфо,Франция). Крыс содержали при 12-часовом цикле чередования света и темноты (0700-1900). Температуру поддерживали при 22 С, едой и водой обеспечивали ad libitum. 3.1.3 Артрит, индуцированный коллагеном (CIA) За одни сутки до эксперимента получили раствор CII (2 мг/мл) с 0,05 М уксусной кислотой и хранили при 4 С. Непосредственно перед иммунизацией равные объемы адъюванта (IFA) и CII перемешали гомогенизатором в предварительно охлажденной стеклянной колбе на бане с ледяной водой. Дополнительное количество адъюванта и более длительная гомогенизация могли бы потребоваться, если бы эмульсия не сформировалась. 0,2 мл эмульсии ввели внутрикожно в основание хвоста каждой крысы в сутки 1, вторую внутрикожную бустер-инъекцию (2 мг/мл раствора CII в 0,1 мл физиологическом растворе CFA) выполнили в сутки 9. Этот способ иммунизации изменили относительно опубликованных способов (Sims et al., 2004; Jou et al., 2005). 3.1.4 План исследования Терапевтические эффекты тестируемых соединений тестировали на модели CIA у крыс. Крыс случайным образом разделили на равные группы, и каждая группа содержала 10 крыс. Все крысы были иммунизированы в сутки 1 и вторично иммунизированы в сутки 9. Терапевтическое дозирование длилось с суток 16 до суток 30. Группе отрицательного контроля вводили носитель (МС 0,5%), а группе положительного контроля Энбрел (10 мг/кг, 3 неделя, s.c). Представляющее интерес соединение, как правило, тестировали в 3 дозах, например, 3, 10, 30 мг/кг, р.о. 3.1.5 Клиническое исследование артрита Артрит оценили согласно способу Khachigian 2006, Lin et al. 2007 и Nishida et al. 2004. Припухлость каждой из четырех лап классифицировали, по оценке на артрит, следующим образом: 0 - нет симптомов; 1 - легкая, но определяемая краснота и припухлость одного типа сустава, такого как лодыжка или запястье, или очевидная краснота и припухлость, ограниченная отдельными пальцами, независимо от числа затронутых пальцев; 2 - умеренная краснота и припухлость двух или более типов суставов; 3 - сильная краснота и припухлость всей лапы, включая пальцы; 4 - максимально воспаленная конечность, включая множество суставов (максимальная суммарная клиническая оценка артрита 16 на животное) (Nishida etal., 2004) . 3.1.6 Изменение в массе тела (%) после проявления артрита Клинически потерю массы тела связывают с артритом (Shelton et al., 2005; Argiles et al., 1998; Rail,2004; Walsmith et al., 2004), таким образом, изменения в массе тела после проявления артрита можно использовать в качестве неспецифического ожидаемого результата для оценки на модели крысы эффекта терапии. Изменение в массе тела (%) после проявления артрита рассчитывали следующим образом: 3.1.7 Рентгенология Для задних лап каждого отдельного животного сделали рентгеновские снимки. Каждому из сним- 24018080 ков присвоили идентификационный номер вслепую, случайным образом, и тяжесть эрозии костной ткани классифицировали по двум независимым оценкам по радиологической системе оценки Ларсена следующим образом: 0 - нормальный с неповрежденными контурами кости и нормальной суставной щелью; 1 - незначительное повреждение на поверхности любой одной или двух плюсневых костей, имеющих незначительную эрозию костной ткани; 2 - определенное начальное повреждение на поверхности любых трех-пяти плюсневых костей, имеющих эрозию костной ткани; 3 - среднее деструктивное повреждение на поверхности всех плюсневых костей, а также внутри любой одной или двух плюсневых костей,имеющих определенную эрозию костной ткани; 4 - тяжелое деструктивное повреждение во всех плюсневых костях, имеющих определенную эрозию костной ткани и по меньшей мере один из плюсневых суставов внутри полностью затронут эрозией, с сохранением некоторых частично сохраненных костных суставных контуров; 5 -калечащее повреждение без костных контуров. Эта система оценки является модификацией Salvemini et al., 2001; Bush et al., 2002; Sims et al., 2004; Jou et al., 2005. 3.1.8 Гистология После рентгеновского анализа задние лапы мышей фиксировали в 10% формалине, забуференном фосфатом (рН 7,4), декальцифицировали с декальцификатором для тонкой гистологии rapide bone (Laboratories Eurobio) и залили парафином. Для обеспечения наиболее полной оценки артритических суставов получили по меньшей мере четыре серийных среза (5 мкм толщиной) и промежуток между каждыми сериями срезов составил 100 мкм. Срезы окрасили гематоксилином и эозином (НЕ). Гистологические исследования на синовиальное воспаление и повреждения кости и хряща проводили двойным слепым исследованием. Для каждой лапы определяли четыре параметра, используя шкалу из четырех пунктов. Параметры представляли собой клеточную инфильтрацию, тяжесть поверхностного диффузного сосудистого кератита, эрозию хрящевой и костной ткани. Оценку проводили следующим образом: 1 - нормальный, 2 - слабо выраженный, 3 - умеренный, 4 - выраженный. Эти четыре оценки суммировали вместе и представили как дополнительную оценку, а именно, "общая оценка RA". 3.1.9 Микрокомпьютерный томографический анализ (мкСТ) пяточной кости (кости пятки): Деградация костной ткани, наблюдаемая при RA, встречается, в частности, в трубчатой кости и может быть выявлена анализом мкСТ (Sims NA et al., 2004; Oste L. et al., ECTC Montreal 2007). После сканирования и трехмерной объемной реконструкции пяточной кости деградацию кости измеряли как число присутствующих дискретных объектов на слайд, выделенных, компьютерным моделированием,перпендикулярно к продольной оси кости. Чем большей деградации подвержена кость, тем больше дискретных объектов измеряли. Проанализированы 1000 срезов, равномерно распределенных вдоль пяточной кости (промежутки приблизительно 10,8 мкм). 3.1.10 Результаты Соединение 176 являлось эффективным во всех результатах, полученных при исследовании CIA крысы. Статистически значимое значение получено для 3 мг/кг по результатам клинической оценки и припухлости лапы. Пример 3.2 Модель септического шока Инъекция липополисахарида (LPS) вызывает быстрое высвобождение растворимого фактора некроза опухоли (TNF-альфа) в периферическую кровь. Эту модель используют для анализа потенциальных блокаторов высвобождения TNF in vivo. Шести самкам мыши BALB/cJ (20 г) на группу однократно ввели заданную дозировку, п/о. Через 30 мин LPS (15 мкг/кг; серотип Е. coli 0111:B4) ввели и/п. Через 90 мин мышей подвергли эвтаназии и собрали кровь. Уровни циркулирующего TNF-альфа определили, используя коммерчески доступные наборы ELISA. Дексаметазон (5 мкг/кг) использовали в качестве контрольного противовоспалительного соединения. Отобранные соединения тестировали в одной или многих дозах, например 3, и/или 10, и/или 30 мг/кг, п./о. Соединение 176 показало статистически значимое снижение высвобождения TNF (50%) при 3, 10 и 30 мг/кг п./о. Пример 3.3 Модель МАВ Модель МАВ позволяет быстрое исследование модуляции посредством способов лечения, подобного RA воспалительного ответа (Kachigian LM. Nature Protocols (2006) 2512-2516: Collagen antibodyinduced arthritis). Мышам DBA/J ввели в/в смесь mAb, направленную против коллагена II. Через сутки инициировали лечение соединением (носитель: 10% (об./об.) HP3CD). Через трое суток у мышей, получивших и/п инъекцию LPS (50 мкг/мышь), получили в результате быстрое проявление воспаления. Лечение соединением продолжали вплоть до 10 суток после инъекции mAb. Воспаление определяли, измеряя припухлость лапы и регистрируя клиническую оценку для каждой лапы. Суммарную клиническую оценку артрита четырех конечностей представили, чтобы показать тяжесть воспаления. Систему оценки применяют к каждой конечности, используя шкалу 0-4, где 4 соответствует наиболее тяжелому воспалению. 0 - Отсутствие симптомов 1 - Легкая, но определенная краснота и припухлость одного типа сустава, такого как лодыжка или запястье, или очевидная краснота и припухлость, ограниченная отдельными пальцами, независимо от числа затронутых пальцев 2 - Умеренная краснота и припухлость двух или более типов суставов 3 - Тяжелая краснота и припухлость всей лапы, включая пальцы 4 - Максимально воспаленная конечность с вовлечением множества суставов Соединение 176, дозированное п/о в 10 и 30 мг/кг статистически значимо снижало клиническую оценку при 30 мг/кг и статистически значимо снижало воспаление как при дозе 10, так и 30 мг/кг. Пример 3.4 Онкологические моделиIn vivo модели для обоснования эффективности низкомолекулярных соединений при миелопролиферативных заболеваниях, вызванных JAK2, описаны Wernig et al. Cancer Cell 13, 311, 2008 and Geron etIn vitro и in vivo модели для обоснования эффективности низкомолекулярных соединений при IBD описаны Wirtz et al. 2007. Пример 3.6 Модель астмы на мышиIn vitro и in vivo модели для обоснования эффективности низкомолекулярных соединений при астме описаны Nials et al., 2008; Ip et al. 2006; Pernis et al., 2002; Kudlacz et al., 2008. Пример 4. Модели токсичности, DMPK и безопасности Пример 4.1 Термодинамика растворения 1 мг/мл раствора тестируемого соединения получают в 0,2 М фосфатном буфере рН 7,4 или 0,1 М цитратном буфере рН 3,0 при комнатной температуре в стеклянной пробирке. Образцы подвергали вращению в Rotator drive STR 4 (Stuart Scientific, Bibby) на скорости 3,0 при комнатной температуре в течение 24 ч. Через 24 ч 800 мкл образца переносят в пробирки Эппендорф и центрифугируют 5 мин при 14000 об./мин. 200 мкл супернатанта образца переносят затем в планшет MultiscreenR Solubility (Millipore,MSSLBPC50) и супернатант фильтруют (10-12 Hg) при помощи вакуумного коллектора в чистый полипропиленовый 96-луночный планшет с V-образным дном лунок Greiner (номер в каталоге 651201). 5 мкл фильтрата разводят в 95 мкл (F20) того же буфера, используемого для инкубации в планшете, содержащим образцы, являющиеся калибровочной кривой (Greiner, номер в каталоге 651201). Образцы, являющиеся калибровочной кривой для соединения, получают свежеприготовленными в ДМСО, исходя из 10 мМ основного раствора ДМСО, с фактором разбавления 2 в ДМСО (5000 мкМ) и затем дополнительно разбавляя ДМСО до 19,5 мкМ. 3 мкл из серии разведений, начиная от 5000 мкМ,затем переносят в 97 мкл смеси ацетонитрил-буфер (50/50). Диапазон конечной концентрации составляет от 2,5 до 150 мкМ. Планшет запечатывают герметизирующей пленкой (MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk) и образцы измеряют при комнатной температуре на LCMS (ZQ 1525 от Waters) в оптимальных условиях, используяQuanoptimize, для определения соответствующей массы молекулы. Образцы анализируют на LCMS со скоростью потока 1 мл/мин. Растворителем А является 15 мМ аммиак, и растворитель В представляет собой ацетонитрил. Образец пропускают под спреем из положительных ионов на колонке XBridge C18 3,5 мкМ (2,130 мм) от Waters. Градиент растворителя имеет общее время пробега 2 мин и заключается в пределах от 5% В до 95% В. Области пиков анализируют при помощи пакета программного обеспечения Masslynx и площади пиков образцов отображают на графике относительно образцов, являющихся калибровочной кривой, для получения растворимости соединения. Значения растворимости указывают в мкМ или мкг/мл. Пример 4.2 Растворимость в воде Исходя из 10 мМ основного раствора ДМСО, в ДМСО получают серийное разведение соединения. Серии разведений переносят в 96-луночный планшет NUNC Maxisorb с F-образным дном лунок (номер в каталоге 442404) и добавляют при комнатной температуре 0,2 М фосфатный буфер рН 7,4 или 0,1 М цитратный буфер рН 3,0. Диапазон конечной концентрации располагался от 200 мкМ до 2,5 мкМ в 5 эквивалентных стадиях разведения. Конечная концентрация ДМСО не превышала 2%. 200 мкМ пирена добавляют в угловые точки каждого 96-луночного планшета, что служит ориентиром для калибровки оси Z на микроскопе. Анализируемые планшеты запечатывали и инкубировали в течение 1 ч при 37 С, со встряхиванием при 230 об./мин. Планшеты затем анализируют под микроскопом белого света с получением индивидуальных изображений преципитата на концентрацию. Преципитат анализируют и преобразуют в число,которое отображают на графике. Первая концентрация, при которой соединение кажется полностью растворенным, является искомой концентрацией, однако истинная концентрация находится между этой концентрацией и одним шагом разведения выше. Значения растворимости указывают в мкг/мл. Пример 4.3 Связывание белков плазмы (равновесный диализ) 10 мМ основного раствора соединения в ДМСО разбавляют с фактором 5 в ДМСО. Этот раствор дополнительно разбавляют в свежеразмороженной плазме человека, крысы, мыши или собаки (BioReclamation INC) в конечной концентрации 10 мкМ и конечной концентрации ДМСО 0,5% (5,5 мкл вPierce Red Device планшет со вставками (ThermoScientific, номер в каталоге 89809) получают и заполняют буферную камеру 750 мкл PBS и камеру для плазмы 500 мкл плазмы с известным количеством определяемого вещества. Планшет инкубируют в течение 4 ч при 37 С со встряхиванием при 230 об./мин. После инкубации 120 мкл содержимого из обеих камер переносят к 360 мкл ацетонитрила в 96 луночный круглодонный РР планшет с глубокими лунками (Nunc, номер в каталоге 278743) и запечатывают крышкой из алюминиевой фольги. Образцы перемешивают и помещают в лед на 30 мин. Этот планшет затем центрифугируют 30 мин при 1200 об./мин при 4 С и супернатант переносят в 96 РР планшет с V-образным дном лунок (Greiner, 651201) для анализа на LCMS. Планшет запечатывают герметизирующей пленкой (MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk) и образцы измеряют при комнатной температуре на LCMS (ZQ 1525 от Waters) в оптимальных условиях, используяQuanoptimize для определения соответствующей массы молекулы. Образцы анализируют на LCMS со скоростью потока 1 мл/мин. Растворителем А являлся 15 мМ аммиак, и растворителем В являлся ацетонитрил. Образец пропускали под спреем положительных ионов на колонке XBridge C18 3,5 мкМ (2,130 мм) от Waters. Градиент растворителя имеет общее время пробега 2 мин и заключается в пределах от 5 до 95% В. Площади пиков соединения в буферной камере и камере для плазмы, как полагали, составляли 100% соединения. Из этих результатов получили процент связывания с плазмой и отчет отправили вLIMS как процент связывания с плазмой. Растворимость соединения в конечной тестируемой концентрации в PBS проверили под микроскопом для проверки того, наблюдается ли выпадение осадка или нет. Пример 4.4 Возможность удлинения интервала QT Возможность удлинения интервала QT оценили в анализе фиксации потенциала hERG. 4.4.1 Традиционный способ фиксации потенциала целой клетки Измерение показаний фиксации потенциала целой клетки проводили, используя усилитель EPC10,под контролем программного обеспечения Pulse v8.77 (HEKA). Сопротивление серий представляло собой, как правило, менее чем 10 МОм и компенсировали более чем 60%, показания не учитывали утечку. Электроды получили на основе стеклянной пипетки GC150TF (Harvard), сопротивление находилось между 2 и 3 МОм. Внешний раствор для погружения содержал 135 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 5 мМ глюкозу,10 мМ HEPES, рН 7,4. Внутренний раствор для микропипетки содержал 100 мМ К-глюконат, 20 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 5 мМ Na2ATP, 2 мМ глютатион, 11 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, рН 7,2. Лекарственные средства перфузировали, используя систему для быстрой перфузии Biologic MEV9/EVH-9. Все измерения проводили на клетках НЕК 293, стабильно экспрессирующих каналы hERG. Клетки культивировали на 12-мм круглых покровных стеклах (German glass, Bellco), закрепленных в камере для измерения, используя два платиновых стержня (Goodfellow). Вызывают электрический ток в hERG, используя активирующие импульсы в +40 мВ в течение 1000 мс, с последующим затухающим импульсным током в -50 мВ в течение 2000 мс, исходный потенциал составлял -80 мВ. Импульсы применяли каждые 20 с и все эксперименты проводили при комнатной температуре. 4.4.2 Анализ данных Значения IC50 и IC20 вычислили для каждого тестируемого соединения. Рассчитали кратное различие между IC20 и концентрациями несвязанного тестируемого соединения Cmax, полученными в соответствующих лечебных дозах, определенных посредством результатов, полученных на крысиной моделиCIA. Для кривых концентрация-эффект амплитуду пика затухающего тока измерили во время скачка напряжения на -50 мВ. Построение кривой значений концентрация-эффект выполнили, используя уравнение:y=a+[(b-a)/(1+10(logc-x)d)] где а - минимальный эффект, b - максимальный эффект и d - коэффициент Хилла, это уравнение можно использовать для расчета как IC50 (где у=50 и с является значением IC50), так и IC20 (где у=20 и с является значением IC20). Для построения всех кривых использовали программное обеспечение GraphPad Prism (Graphpad Software Inc.). В табл. IX ниже просуммированы результаты, полученные для выбранных тестированных соединений. Различие в 100 или более раз указывает на низкую возможность удлинения интервала QT. Поэтому можно видеть, что по сравнению с соединением 37 результат для соединения 176 показывает намного более низкую возможность удлинения интервала QT. Пример 4.5 Стабильность в микросомах 10 мМ основного раствора соединения в ДМСО развели в 1000 раз в 182 мМ фосфатном буфере рН 7,4 в 96-луночном планшете с глубокими лунками (Greiner, номер в каталоге 780285) и предварительно инкубировали при 37 С. 40 мкл деионизованной воды добавили в лунку полипропиленовой запоминающей электроннолучевой трубки, меченной двумерной кодировкой Data Matrix (Thermo Scientific) и предварительно инкубировали при 37 С. Рабочий основной раствор глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6PDH) получили в 182 мМ фосфатном буфере рН 7,4 и поместили в лед перед использованием. Кофактор, содержащий MgCl2, глюкоза-6 фосфат и NADP+ получили в деионизованной воде и поместили в лед перед использованием. Получили конечный рабочий раствор, содержащий микросомы печени (Xenotech) представляющих интерес видов (человека, мыши, крысы, собаки), ранее описанный G6PDH и кофакторы, и эту смесь инкубировали не более 20 мин при комнатной температуре. 30 мкл предварительно нагретого разведения соединения добавили к 40 мкл предварительно нагретой воды в Matrix tubes и добавили 30 мкл смеси с микросомой. Конечные концентрации в реакции представляли собой 3 мкМ соединения, 1 мг микросом, 0,4 Ед/мл GDPDH, 3,3 мМ MgCl2, 3,3 мМ глюкозо-6 фосфат и 1,3 мМ NADP+. Для измерения процента сохранности соединения в нулевой момент времени добавили в лунку МеОН или ACN (1:1) до добавления смеси с микросомой. Планшеты запечатывали Matrix Sepra sealsTM(Matrix, номер в каталоге 4464) и встряхивали в течение нескольких секунд, чтобы гарантировать полное смешивание всех компонентов. Образцы, в которых реакцию не останавливали, инкубируют при 37 С, 300 об./мин и после 1 ч инкубации реакцию останавливают МеОН или ACN (1:1). После остановки реакции образцы перемешали и поместили в лед на 30 мин для осаждения белков. Затем планшеты центрифугировали 30 мин при 1200 об./мин при 4 С и супернатант перенесли в 96 РР планшет с V-образным дном лунок (Greiner, 651201) для анализа на LCMS. Планшет запечатывали герметизирующей пленкой (MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk) и образцы подвергли измерению при комнатной температуре на LCMS (ZQ 1525 от Waters) в оптимальных условиях, используя Quanoptimize, для определения соответствующей массы молекулы. Образцы анализировали на LCMS со скоростью потока 1 мл/мин. Растворителем А являлся 15 мМ аммиак, и растворитель В представлял собой ацетонитрил, в зависимости от используемого раствора для остановки реакции. Образцы пропускали под спреем из положительных ионов на колонке XBridge C18 3,5 мкМ (2,130 мм) от Waters. Градиент растворителя имеет общее время пробега 2 мин и заключается в пределах от 5% В до 95% В. Площадь пика исходного соединения в начальный момент времени, как полагали, составляет 100% сохранности. Процент сохранности через 1 ч инкубации рассчитали от начального момента времени и вычислили как процент сохранности. Растворимость соединения в конечной тестируемой концентрации в буфере проконтролировали под микроскопом и представили результаты. Данные по стабильности в микросомах выразили как процент общего количества соединения, оставшегося после 60 мин. Таблица X. Стабильность в микросомах Пример 4.6. Проницаемость Сасо 2 Двусторонние анализы Сасо-2 выполнили так, как описано ниже. Клетки Сасо-2 получили из европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС, cat 86010202) и использовали после 21-суточной культивации клеток в 24-луночных планшетах Transwell (Fisher ТКТ-545-020 В). 2105 клетки/лунка пересевали в среду для чашек Петри, состоящую из DMEM + GlutaMAXI + 1%NEAA + 10% FBS (FetalClone II) +1% Pen/Strep. Среду меняли каждые 2-3 суток. Тестируемые и контрольные соединения (пропранолол и родамин 123 или винбластин, все приобретены у Sigma) получили в сбалансированном солевом растворе Хэнкса, содержащем 25 мМ HEPES (рН 7,4), и добавили или в апикальную (125 мкл) или в базолатеральную (600 мкл) камеры сборного планшета Transwell, в концентрации 10 мкМ с конечной концентрацией ДМСО 0,25%. 50 мкМ Lucifer Yellow (Sigma) добавили к донорскому буферу во все лунки, чтобы оценить целостность клеточных слоев мониторингом проникновения Lucifer Yellow. Поскольку Lucifer Yellow (LY) не способен свободно проникать через липофильные барьеры, высокая степень передвижения LY указывает на недостаточную целостность клеточного слоя. После 1 ч инкубации при 37 С, подвергаясь встряхиванию в орбитальном шейкере при 150 об./мин,70 мкл аликвот взяли и из апикальной (А), и из базальной (В) камер и добавили в 96-луночный планшет к 100 мкл раствора ацетонитрил:вода 50:50, содержащим аналитический внутренний стандарт (0,5 мкМ карбамазепин).Lucifer Yellow измерили с Spectramax Gemini XS (Ex 426 нм и Em 538 нм) в чистом 96-луночном планшете, содержащем 150 мкл жидкости с базолатеральной и апикальной сторон. Концентрации соединения в образцах измерили высокоэффективной жидкостной хроматографией/масс-спектроскопией (LC-MS/MS). Значения эффективной магнитной проницаемости (Рарр) вычислили из соотношения:Tinc = время инкубации Площадь поверхности = 0,33 см 2. Коэффициенты выведения как показателя активного выведения с апикальной поверхности клетки вычислили, используя соотношение Рарр ВА/Рарр АВ. Использовали следующие критерии допустимости анализа: пропранолол: Рарр (АВ) значение 20 Пример 4.7 Фармакокинетическое исследование на грызунах 4.7.1 Фармакокинетическое исследование Соединения составляют в смесьPEG400/ДМСО/физиологический раствор для внутривенного применения и в 0,5% метилцеллюлозе или 10-30% гидроксилпропилциклодекстрине рН 3 или рН 7,4 для орального применения. Тестируемые соединения перорально дозированы в виде однократного питания через зонд в пищевод из расчета 5-10 мг/кг и дозированы в виде внутривенного болюса через хвостовую вену по 1 мг/кг. Каждая группа состоит из 3 крыс. Образцы крови собирали или через яремную вену, используя крыс с канюлями, или в ретроорбитальном синусе с литийгепарином в качестве противосвертывающего средства в моменты времени следующего диапазона: от 0,05 до 8 ч (внутривенный путь введения) и от 0,25 до 6 или 24 ч (пероральный путь введения). Образцы цельной крови центрифугировали 10 мин при 5000 об./мин и полученные в результате образцы плазмы хранили при -20 С до завершения анализа. 4.7.2 Определение величины уровней соединения в плазме Концентрации плазмы каждого тестируемого соединения определили способом LC-MS/MS, в котором масс-спектрометр эксплуатируют в режиме положительного электрораспыления. 4.7.3 Определение фармакокинетических параметров Фармакокинетические параметры рассчитали, используя Winnonlin (Pharsight, United). Пример 4.8 7-суточное исследование токсичности на крысах 7-суточное оральное исследование токсичности с тестируемыми соединениями проводили на самцах крыс Sprague-Dawley для оценки токсической активности и кинетики токсичности соединений, в суточных дозах 100, 300 и 500 мг/кг/день, питание через зонд, с постоянным объемом дозировки 5 мл/кг/дней. Тестируемые соединения составляют в смесь в 30% (об./об.) HPCD в очищенной воде. Каждая группа включала 5 основных самцов крысы, а также 3 дополнительных животных для кинетики токсичности. Четвертая группа получала 30% (об./об.) HPCD только в воде, с той же частотой, объемом дозировки и тем же самым путем введения, и группа играла роль контрольной группы по носителю. Цель исследования состояла в определении самой низкой дозы, которая не вызывает видимых нежелательных явлений (уровень, не вызывающий видимых нежелательных явлений - NOAEL). Соединение 176 тестировали в соответствии с этим протоколом. Уровни NOAEL для соединения 176 оценили в 500 мг/кг.