Связывающие молекулы человека, имеющие убивающую активность против стафилококков, и их применения

СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕКА, ИМЕЮЩИЕ УБИВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ПРОТИВ СТАФИЛОКОККОВ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Изобретение обеспечивает связывающие молекулы человека, специфически связывающиеся со стафилококками и имеющие убивающую активность против стафилококков, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эти связывающие молекулы человека, композиции, содержащие связывающие молекулы человека, и способы идентификации или получения связывающих молекул человека. Эти связывающие молекулы человека могут быть использованы в диагностике,профилактике и/или лечении состояния, вызываемого Staphylococcus. Тросби Марк, Геэйен Сесилия А.В., Де Крэйф Корнелис Адриан (NL) Медведев В.Н. (RU) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к медицине. В частности, это изобретение относится к диагностике, профилактике и/или лечению инфекции стафилококками. Уровень техникиStaphylococcus является родом грамположительных бактерий и членом семейства Micrococcaceae. Стафилококки являются сферическими бактериями, которые обнаруживаются первично на коже и в слизистых оболочках людей и других теплокровных животных, и они агрегируются в небольшие, виноградоподобные скопления. Стафилококки могут быть подразделены на две большие группы, т.е. коагулазаположительные и коагулаза-отрицательные стафилококки. В общем и целом, имеются приблизительно тридцать видов стафилококков. Стафилококки могут вызывать большое разнообразие заболеваний у людей либо посредством продуцирования токсина, либо посредством инвазии. Staphylococcus aureus (S. aureus) был признан одним из наиболее важных и летальных бактериальных патогенов человека с начала предыдущего столетия. До эры антибиотиков более 80% пациентов, из крови которых выращивался S. aureus, умирали. Хотя было известно, что инфекции, вызываемые коагулаза-положительным S. aureus, являются потенциально летальными, коагулаза-отрицательные стафилококки были исключены как авирулентные комменсалы кожи, не способные вызывать заболевание человека. Однако на протяжении последних 30 лет инфекции коагулаза-отрицательными стафилококками появились в качестве одного из основных осложнений прогресса медицины. В настоящее время они являются патогенами, наиболее часто выделяемыми из инфекций постоянно находящихся в теле чужеродных устройств, и являются ведущей причиной нозокомиальных (внутрибольничных) бактериемий в больницах Соединенных Штатов. Стафилококковые инфекции лечат обычно антимикробными агентами. Однако доминирующее значение стафилококков в качестве преобладающих нозокомиальных патогенов было также ассоциировано с большим увеличением доли этих изолятов, которые являются резистентными к (множественным) антимикробным агентам. Из оцениваемых 2 млн больничных инфекций в Соединенных Штатах в 2004 году 70% были резистентными по меньшей мере к одному антибиотику, вызывая тем самым большие медицинские и, следовательно, экономические проблемы. 90% штаммов стафилококков являются устойчивыми к пенициллину, оставляя только метициллин и ванкомицин для лечения большинства инфекций. Однако с увеличением количества сообщений о метициллинрезистентном Staphylococcus aureus (MRSA) химики столкнулись с пугающей задачей генерирования новых антибиотиков с новыми механизмами действия. Несмотря на настоятельную потребность в развитии новых антибиотиков, основные фармацевтические компании, повидимому, потеряли интерес в отношении рынка антибиотиков. В 2002 году только 5 из более чем 500 лекарственных средств в клиническом развитии фазы II или фазы III были новыми антибиотиками. В последние 6 лет были зарегистрированы только 10 антибиотиков и только 2 из них не проявляли перекрестной реактивности с существующими лекарственными средствами (и, следовательно, не подвергались тем же самым картинам устойчивости к лекарственным средствам). Эта тенденция была отнесена к нескольким факторам: стоимости развития новых лекарственных средств и относительно малому возврату инвестирования, которые дают лечения инфекционных заболеваний, в сравнении с лекарственными средствами против гипертензии, артрита и лекарственных средств, влияющих на образ жизни, например против импотенции. Другим способствующим этому фактором является увеличивающаяся трудность нахождения новых мишеней, дополнительно повышающая затраты на развитие. Таким образом, исследование новых терапий или превентивных мер для (полирезистентных) бактериальных инфекций срочно необходимо для удовлетворения этого надвигающегося кризиса здравоохранения. Активная иммунизация вакцинами и пассивная иммунизация иммуноглобулинами являются многообещающими альтернативами классической терапии малыми молекулами. Несколько бактериальных заболеваний, которые когда-то вызывали широко распространенные болезнь, потерю трудоспособности и смерть, могут быть теперь предотвращены с использованием вакцин. Эти вакцины основаны на ослабленных (аттенуированных) или мертвых бактериях, компонентах бактериальной поверхности или на инактивированных токсинах. Иммунная реакция, индуцируемая вакциной, в основном направлена на иммуногенные структуры, ограниченное количество белков или сахарные структуры на бактериях, которые активно процессируются иммунной системой. Поскольку эти иммуногенные структуры являются очень специфическими для конкретного организма, эта вакцина должна содержать иммуногенные компоненты всех вариантов бактерий, против которых должна защищать эта вакцина. Вследствие этого,вакцины являются очень комплексными, занимают продолжительное время и являются дорогими для их развития. Дополнительным осложнением создания вакцин является феномен "замещения антигена". Это происходит, когда становятся преобладающими новые штаммы, которые являются серологически и, следовательно, антигенно отличающимися от штаммов, охватываемых этими вакцинами. Иммунный статус популяций при риске нозокомиальных инфекций дополнительно усложняет создание вакцин. Эти пациенты являются неотъемлемо нездоровыми и могут даже быть иммунодефицитными (иммунокомпрометированными) (вследствие действия иммуносупрессивных лекарственных средств), что приводит к замедленному или недостаточному иммунитету против инфицирующих патогенов. Кроме того, за исключением ситуации в случае определенных элективных (избирательных) процедур, может возникнуть не-1 018030 возможность идентификации и вакцинации находящихся при риске пациентов вовремя предоставлением им достаточной иммунной защиты от инфекции. Прямое введение терапевтических иммуноглобулинов, также называемое пассивной иммунизацией,не требует иммунной реакции от пациента и, следовательно, дает немедленную защиту. Кроме того, пассивная иммунизация может быть направлена на бактериальные структуры, которые не являются иммуногенными и которые являются менее специфическими для конкретного организма. Пассивная иммунизация против патогенных организмов основывалась на иммуноглобулинах, полученных из сывороток людей-доноров или доноров, не являющихся людьми. Однако полученные из крови продукты имели потенциальные риски для здоровья, неотъемлемо связанные с этими продуктами. Кроме того, иммуноглобулины могут проявлять вариацию от партии к партии и могут иметь ограниченную доступность в случае неожиданных массовых воздействий. Рекомбинантно полученные антитела не имеют этих недостатков и, следовательно, предоставляют возможность замены иммуноглобулинов, полученных из сывороток. Мышиные моноклональные антитела, направленные против стафилококков, известны в данной области (см. WO 03/059259 и WO 03/059260). Однако мышиные антитела являются ограниченными в отношении их применения in vivo вследствие проблем, связанных с введением мышиных антител людям,таких как короткий полупериод существования в сыворотке, неспособность запуска некоторых эффекторных функций человека и индукция нежелательной разительной иммунной реакции против мышиного антитела в человеке (НАМА). В WO 03/059259 и WO 03/059260 были предприняты попытки преодоления этих проблем, связанных с применением полностью мышиных антител в людях, получением химерных антител. Однако недостатком этих химерных антител является то, что они все еще сохраняют некоторые мышиные последовательности и, следовательно, все еще индуцируют нежелательную иммунную реакцию, особенно при введении в течение продолжительных периодов.WO 2004/043405 относится к полисахаридным вакцинам для стафилококковых инфекций, получаемых из поли-N-ацетилглюкозамина (PNAG), поверхностного полисахарида из стафилококков и его деацетилированной формы (dPNAG). WO 2004/043405 описывает также кроличью антисыворотку к PNAG и dPNAG, связанную с дифтерийным токсоидом (DTm). Хотя WO 03/059259, WO 03/059260 и WO 2004/043405 относятся к антителам человека в качестве желаемых молекул, антитела, фактически описанные и используемые в них, являются антителами частично мышиного или кроличьего происхождения, и ни один из этих документов фактически не описывает каких-либо антител человека и их последовательностей. Ввиду их терапевтического преимущества у людей все еще имеется потребность в моноклональных антителах человека против стафилококков. Данное изобретение обеспечивает эти антитела и их последовательности и показывает, что они могут быть использованы в медицине, в частности, для диагностики,предотвращения и/или лечения стафилококковых инфекций. Описание фигур Фиг. 1 показывает антителоопосредованный фагоцитоз штамма S. aureus Cowan, собранного во время log-фазы роста в отсутствие комплемента с антителами CR2430 (белые кружки), CR5132 (черные треугольники), CR5133 (черные кружки) и моноклональным антителом отрицательного контроля (белые квадраты). Фиг. 2 показывает антителоопосредованный фагоцитоз штамма S. aureus Cowan, собранного во время стационарной фазы роста в отсутствие комплемента с антителами CR2430 (белые кружки),CR5132 (черные треугольники), CR5133 (черные кружки) и моноклональным антителом отрицательного контроля (белые квадраты). Фиг. 3 показывает антителоопосредованный фагоцитоз штамма S. aureus SA125, собранного во время стационарной фазы роста в отсутствие комплемента с антителами CR5132 (черные треугольники),CR5133 (черные кружки) и моноклональным антителом отрицательного контроля (белые квадраты). Фиг. 4 показывает антителоопосредованный фагоцитоз штамма S. epidermidis SE131, собранного во время стационарной фазы роста в отсутствие комплемента с антителами CR5132 (черные треугольники),CR5133 (черные кружки) и моноклональным антителом отрицательного контроля (белые квадраты). Описание изобретения Здесь ниже представлены определения терминов, использованных в этом изобретении. Определения Аминокислотная последовательность. Термин "аминокислотная последовательность" относится в данном контексте к природно встречающимся или синтетическим молекулам и к последовательности пептида, олигопептида, полипептида или белка. Связывающая молекула. В данном контексте термин "связывающая молекула" относится к интактному иммуноглобулину, в том числе моноклональным антителам, таким как химерные, гуманизированные или моноклональные антитела человека, или к содержащему антигенсвязывающий и/или вариабельный домен фрагменту иммуноглобулина, который конкурирует с интактным иммуноглобулином за специфическое связывание с партнером связывания этого иммуноглобулина, например стафилококками. Независимо от структуры этот антигенсвязывающий фрагмент связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным иммуноглобулином. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере 2 смежных аминокислотных остатков,по меньшей мере 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 30 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 35 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности этой связывающей молекулы. Термин "связывающая молекула" в данном контексте включает в себя все классы и подклассы иммуноглобулинов, известные в данной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей связывающие молекулы могут быть разделены на пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgAl, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Антигенсвязывающие фрагменты включают в себя, inter alia, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, фрагменты определяющего комплементарность района (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), бивалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела, триатела, тетратела, (поли)пептиды, которые содержат по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина, который является достаточным для придания специфическому антигену связывания с этим (поли)пептидом, и т.д. Приведенные выше фрагменты могут быть получены синтетически или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов, или они могут быть сконструированы генной инженерией способами рекомбинантных ДНК. Эти способы получения хорошо известны в данной области и описаны, например, в справочнике Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow and D, Lane (1988),Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, который включен здесь в качестве ссылки. Связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент могут иметь один или несколько сайтов связывания. Если имеются более чем один сайт связывания, эти сайты связывания могут быть идентичными друг другу или они могут быть различными. Связывающая молекула может быть "голой" или неконъюгированной связывающей молекулой, но может быть также частью иммуноконъюгата. Голой или неконъюгированной связывающей молекулой называют связывающую молекулу, которая не является конъюгированной, функционально связанной или иным образом физически или функционально ассоциированной с эффекторной частью или меткой,такой как, inter alia, токсичное вещество, радиоактивное вещество, липосома, фермент. Должно быть понятно, что голые или неконъюгированные связывающие молекулы не исключают связывающие молекулы, которые были стабилизированы, мультимеризованы, гуманизированы или подвергнуты иной манипуляции, отличающейся от присоединения эффекторной части молекулы или метки. Таким образом, все посттрансляционно модифицированные голые и неконъюгированные связывающие молекулы включены здесь, в том числе, когда произведены модификации в природном окружении клетки, продуцирующей связывающую молекулу, рекомбинантной клеткой, продуцирующей связывающую молекулу, или введены рукой человека после получения исходной связывающей молекулы. Конечно, термин "голая или неконъюгированная связывающая молекула" не исключает способности этой связывающей молекулы образовывать функциональные ассоциации с эффекторными клетками и/или молекулами после введения в организм, так как некоторые из этих взаимодействий являются необходимыми для проявления биологического действия. Таким образом, отсутствие ассоциированных эффекторных групп или метки примени-3 018030 мо в определении голой или неконъюгированной связывающей молекулы in vitro, но не in vivo. Биологическая проба в данном контексте термин "биологическая проба" включает в себя различные типы проб, в том числе, пробы крови или других жидкостей биологического происхождения, пробы твердых тканей, такие как проба биопсии (биоптат) или культуры тканей, или клеток, полученных из них, и их потомства. Этот термин включает в себя также пробы, которые были подвергнуты манипуляциям каким-либо путем после их заготовки, например, обработкой реагентами, солюбилизацией или обогащением в отношении некоторых компонентов, таких как белки или полинуклеотиды. Этот термин включает в себя различные типы клинических проб, полученных из любых видов, а также включает в себя клетки в культуре, супернатанты клеток и лизаты клеток. Определяющие комплементарность районы (CDR). Термин "определяющие комплементарность районы" означает в данном контексте последовательности в вариабельных областях связывающих молекул, таких как иммуноглобулины, которые обычно способствуют в значительной степени образованию антигенсвязывающего сайта, который является комплементарным по форме и распределению зарядов эпитопу, узнаваемому на антигене. Эти CDR-районы могут быть специфическими в отношении линейных эпитопов, прерываемых эпитопов или конформационных эпитопов белков или фрагментов белков, либо когда они присутствуют на белке в его нативной конформации, либо, в некоторых случаях, когда они присутствуют на белках, денатурированных, например, солюбилизацией в ДСН. Эпитопы могут также состоять из посттрансляционных модификаций белков. Делеция.Термин "делеция" обозначает в данном контексте изменение либо в аминокислотной, либо в нуклеотидной последовательности, в которой один или несколько аминокислотных остатков или нуклеотидных остатков соответственно отсутствуют в сравнении с исходной, часто природно встречающейся, молекулой. Регулирующая экспрессию последовательность нуклеиновой кислоты. Термин "регулирующая экспрессию последовательность нуклеиновой кислоты" относится в данном контексте к полинуклеотидным последовательностям, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности или влияющим на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Эти регулирующие экспрессию последовательности нуклеиновых кислот, такие как inter alia подходящие последовательности инициации транскрипции, терминации, промоторные последовательности, энхансерные последовательности; репрессорные или активаторные последовательности; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматические мРНК; последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (например, сайты связывания рибосом); последовательности, которые увеличивают стабильность белка; и, когда желательно, последовательности, которые усиливают секрецию белка, могут быть любой последовательностью нуклеиновой кислоты, обнаруживающей активность в выбранном организме-хозяине, и могут быть получены из генов, кодирующих белки, которые являются либо гомологичными, либо гетерологичными относительно организма-хозяина. Идентификация и использование регулирующих экспрессию последовательностей является рутиной для лица, квалифицированного в данной области. Функциональный вариант. Термин "функциональный вариант", в данном контексте, относится к связывающей молекуле, которая содержит нуклеотидную и/или аминокислотную последовательность, которая изменена одним или несколькими нуклеотидами и/или аминокислотами в сравнении с нуклеотидной и/или аминокислотной последовательностями исходной связывающей молекулы и которая все еще способна конкурировать за связывание с партнером связывания, например, стафилококками, с исходной связывающей молекулой. Другими словами, эти модификации в аминокислотной и/или нуклеотидной последовательности исходной связывающей молекулы не влияют значимо или не изменяют характеристики связывания связывающей молекулы, кодируемой этой нуклеотидной последовательностью или содержащей эту аминокислотную последовательность, т.е. эта связывающая молекула все еще способна узнавать и связывать ее мишень. Функциональный вариант может иметь консервативные модификации последовательности, включающие в себя нуклеотидные и аминокислотные замены, добавления и делеции. Эти модификации могут быть введены стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и случайный ПЦР-опосредованный мутагенез, и могут содержать как природные, так и неприродные нуклеотиды и аминокислоты. Консервативные аминокислотные замены включают в себя замены, в которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходные структурные или химические свойства. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин,аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин,тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лей-4 018030 цин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например,треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин,триптофан). Квалифицированному в данной области специалисту будет ясно, что могут быть также использованы другие классификации семейств аминокислотных остатков, чем классификация, использованная выше. Кроме того, некоторый вариант может иметь неконсервативные аминокислотные замены,например замену аминокислоты аминокислотным остатком, имеющим отличающиеся структурные или химические свойства. Сходные минорные вариации могут также включать в себя аминокислотные делеции, или инсерции, или и то и другое. Руководство в определении, какие аминокислотные остатки могут быть заменены, инсертированы или делетированы без уничтожения иммунологической активности, может быть найдено с использованием компьютерных программ, хорошо известных в данной области. Мутация в нуклеотидной последовательности может быть единственным изменением, произведенным в локусе (точковой мутацией), такой как транзиционная или трансверсионная (заместительная) мутация, или альтернативно, множественные нуклеотиды могут быть инсертированы, делетированы или изменены в единственном локусе. Кроме того, одно или несколько изменений могут быть произведены в любом количестве локусов в одной нуклеотидной последовательности. Эти мутации могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области. Хозяин. Термин "хозяин", в данном контексте, относится к организму или клетке, в которую был введен вектор, такой как клонирующий вектор или экспрессирующий вектор. Этот организм или эта клетка могут быть прокариотическими или эукариотическими. Должно быть понятно, что этот термин относится не только к конкретному рассматриваемому организму и конкретной рассматриваемой клетке, но также и к потомству такого организма или такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут иметь место в генерациях-потомствах вследствие мутации или влияний окружающей среды, такое потомство может не быть, фактически, идентичным исходному организму или исходной клетке, но все еще они будут включены в объем термина "хозяин" в данном контексте. Человек (человеческий). Термин "человек" ("человеческий") при применении к связывающим молекулам относится к молекулам, которые либо непосредственно получены из человека, либо основаны на человеческой последовательности. При получении связывающей молекулы из человека или на основе человеческой последовательности и последующей модификации, эта молекула все еще должна рассматриваться как человеческая, как это делается во всем этом описании. Другими словами, термин "человеческая" в применении к связывающим молекулам предназначен для включения связывающих молекул, имеющих вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека или основанные на вариабельных или константных областях, встречающихся в человеке или лимфоцитах человека и модифицированных в некоторой форме. Таким образом, связывающие молекулы человека могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека, содержать замены и/или делеции (например, мутации, введенные, например, неспецифическим или сайт-направленным мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Термин "на основе" относится в данном контексте к ситуации, когда последовательность нуклеиновой кислоты может быть точно копирована из матрицы или с минорными мутациями, например, при использовании способов склонной к ошибкам ПЦР, или получена синтетически для точного соответствия матрице или с минорными модификациями. Полусинтетические молекулы на основе последовательностей нуклеиновых кислот человека также рассматриваются в данном контексте как последовательности человека. Инсерция. Термин "инсерция", также известный как термин "добавление", обозначает изменение в аминокислотной или нуклеотидной последовательности, приводящее к добавлению одного или нескольких аминокислотных или нуклеотидных остатков соответственно в сравнении с исходной последовательностью. Внутренняя (эндогенная) активность. Термин "внутренняя (эндогенная) активность" при применении к связывающим молекулам, определенным здесь, относится к связывающим молекулам, которые способны связывать определенные белковые или углеводные антигены на поверхности патогенов, таких как бактерии, и которые могут ингибировать способность этого патогена нормально расти и делиться. Такие связывающие молекулы могут,например, блокировать вхождение специфических нутриентов, требуемых для роста или транспорта элементов токсичных отходов из бактерий. Посредством последнего действия они могут также увеличивать чувствительность бактерий к действию х лекарственных средств-антибиотиков. Выделенные. Термин "выделенные", при применении к связывающим молекулам, определенным здесь, относится к связывающим молекулам, которые являются, по существу, свободными от других белков или полипептидов, в частности свободны от других связывающих молекул, имеющих отличающиеся антигенные специфичности, а также, по существу, свободны от другого клеточного материала и/или химических веществ. Например, когда эти связывающие молекулы получают рекомбинантно, они являются предпочти-5 018030 тельно, по существу, свободными от культуральной среды, а когда эти связывающие молекулы получают химическим синтезом, они предпочтительно, по существу, свободны от химических предшественников или других химических веществ, т.е. они отделены от предшественников или других химических веществ, которые участвуют в синтезе этого белка. Термин "выделенные" в применении к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим связывающие молекулы, определенные здесь, относится к молекулам нуклеиновых кислот, в которых нуклеотидные последовательности, кодирующие эти связывающие молекулы, свободны от других нуклеотидных последовательностей, в частности нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулы, которые связывают партнеры связывания, другие чем стафилококки. Кроме того, термин "выделенные" относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые, по существу,отделены от других клеточных компонентов, которые природно сопутствуют нативной молекуле нуклеиновой кислоты в ее природном хозяине, например от рибосом, полимераз или геномных последовательностей, с которыми она природно ассоциирована. Кроме того, "выделенные" молекулы нуклеиновых кислот, такие как кДНК-молекулы, могут быть, по существу, свободными от другого клеточного материала или культуральной среды при получении рекомбинантными способами или, по существу, свободны от химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Моноклональное антитело. Термин "моноклональное антитело" относится в данном контексте к препарату молекул антител единого молекулярного состава. Моноклональное антитело проявляет единственную специфичность связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Таким образом, термин "моноклональное антитело человека" относится к антителу, проявляющему единственную специфичность связывания, которое имеет вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека или основанные на последовательностях иммуноглобулина зародышевой линии человека, или полученные из полностью синтезированных последовательностей. Способ получения моноклонального антитела не является ограниченным. Природно встречающиеся. Термин "природно встречающиеся" в применении к объекту относится к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, последовательность полипептида или последовательность полинуклеотида, которая присутствует в организме, которая может быть выделена из природного источника и которая не была преднамеренно модифицирована человеком в лаборатории, является природно встречающейся. Молекула нуклеиновой кислоты. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" в контексте данного изобретения относится к полимерной форме нуклеотидов и включает в себя как смысловую, так и антисмысловую цепи РНК, кДНК, геномной ДНК и синтетические формы и смешанные полимеры вышеуказанных молекул. Нуклеотидом называют рибонуклеотид, дезоксинуклеотид или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Этот термин также включает в себя одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. Кроме того, полинуклеотид может включать в себя любой или оба из природно встречающегося и модифицированного нуклеотида, связанных вместе природно встречающимися и/или не встречающимися в природе нуклеотидными связями. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химически или биохимически или могут содержать неприродные или дериватизованные нуклеотидные основания, как будет вполне понятно квалифицированным в данной области специалистам. Такие модификации включают в себя, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких природно встречающихся нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные связи (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.), заряженные связи (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), группы боковых цепей (например, полипептидов), интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), хелаторы, алкилирующие группы и модифицированные связи (например,альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Приведенный выше термин включает в себя также любую топологическую конформацию, в том числе одноцепочечную, двухцепочечную, частично дуплексную, триплексную, в виде шпильки, кольцевую конформацию и запертую "висячим замком" конформацию. Включены также синтетические молекулы, которые имитируют полинуклеотиды в их способности связываться со сконструированной последовательностью через образование водородной связи и другие химические взаимодействия. Такие молекулы известны в данной области и включают в себя, например,молекулы, в которых пептидные связи заменяют фосфатные связи в скелете этой молекулы. Ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя комплементарную ей последовательность,если нет другого указания. Таким образом, при ссылке на молекулу нуклеиновой кислоты, имеющей конкретную последовательность, должно быть понятно, что эта ссылка включает в себя ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Эта комплементарная цепь применима также,например, для антисмысловой терапии, гибридизационных зондов и ПЦР-праймеров. Функционально связанные. Термин "функционально связанные" относится к двум или более элементам последовательности нуклеиновой кислоты, которые обычно физически связаны и находятся в функциональной взаимосвязи друг с другом. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если этот промотор способен инициировать или регулировать транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности, причем в этом случае кодирующая последовательность должна пониматься как последовательность, находящаяся "под контролем" этого промотора. Опсоническая активность."Опсонической активностью" называют способность опсонина (обычно либо связывающей молекулы, например, антитела, либо факторов комплемента сыворотки) связываться с поверхностью патогена либо посредством специфического узнавания антигена (в случае антител), либо через каталитическое действие связанных с поверхностью молекул (например, уменьшенного отложения С 3b как результата действия связанных с поверхностью антител). Фагоцитоз опсонизированных патогенов усиливается вследствие специфического узнавания рецепторов на фагоците для опсонина (Fc-рецептора в случае, когда сами антитела являются опсонинами, и рецептора комплемента в случае, когда комплемент является опсонином). Некоторые бактерии, особенно инкапсулированные бактерии, которые устойчивы к фагоцитозу вследствие присутствия капсулы, становятся чрезвычайно аттрагируемыми фагоцитами, такими как нейтрофилы и макрофаги, при покрытии опсоническим антителом, и их скорость клиренса из кровотока и инфицированных органов поразительно усиливается. Опсоническая активность может быть измерена общепринятым способом (например, анализом опсонического фагоцитарного убивания). Фармацевтически приемлемый эксципиент. Под "фармацевтически приемлемым эксципиентом" имеют в виду инертное вещество, которое объединено с активной молекулой, такой как лекарственное средство, агент или связывающая молекула, для приготовления приемлемой или удобной лекарственной формы. "Фармацевтически приемлемым эксципиентом" является эксципиент, который является нетоксичным в отношении реципиента в используемых дозах и концентрациях и является совместимым с другими ингредиентами готовой формы, содержащей лекарственное средство, агент или связывающую молекулу. Специфически связывающие. Термин "специфически связывающие" в данном контексте при ссылке на взаимодействие связывающей молекулы, например антитела, и его партнера связывания, например антигена, обозначает, что это взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры, например антигенной детерминанты или эпитопа, на партнере связывания. Другими словами, это антитело преимущественно связывает или узнает партнер связывания, даже когда партнер связывания присутствует в смеси других молекул или организмов. Это связывание может быть опосредовано ковалентными или нековалентными взаимодействиями или комбинацией обоих. Другими словами, термин "специфически связывающиеся" означает иммуноспецифическое связывание с антигеном или его фрагментом и неспецифическое связывание с другими антигенами. Связывающая молекула, которая иммуноспецифически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низкой аффинностью, как определено,например, радиоиммуноанализами (RIA), твердофазными иммуноферментными анализами (ELISA),BIACORE или другими анализами, известными в данной области. Связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, могут быть перекрестно реактивными с родственными антигенами. Предпочтительно связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, не реагируют перекрестно с другими антигенами. Замены."Замена" в данном контексте обозначает замену одной или нескольких аминокислот или нуклеотидов отличающимися аминокислотами или нуклеотидами соответственно. Терапевтически эффективное количество. Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество связывающей молекулы,определенной здесь, которое является эффективным для предотвращения, ослабления и/или лечения состояния, возникающего из инфекции Staphylococcus. Лечение. Термин "лечение" относится к терапевтическому лечению, а также профилактическим или превентивным мерам для лечения, или прекращения, или, по меньшей мере, замедления прогрессирования заболевания. Лица, нуждающиеся в лечении, включают в себя лица, уже пораженных состоянием, проявляющимся в результате инфекции Staphylococcus, а также лица, в которых должна быть предотвращена инфекция Staphylococcus. Субъекты, частично или полностью выздоровевшие от инфекции Staphylococcus, могут также нуждаться в лечении. Предотвращение включает в себя ингибирование или уменьшение распространения Staphylococcus или ингибирование или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с инфекцией Staphylococcus. Вектор. Термин "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть встроена другая молекула нуклеиновой кислоты для введения в хозяина, где она будет реплицироваться и, в некоторых случаях, экспрессироваться. Другими словами, вектор способен транспортировать молекулу нуклеиновой кислоты, с которой он был связан. Клонирующие, а также экспрессирующие векторы рассматриваются под термином "вектор" в данном контексте. Векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и дрожжевые искусственные хромосомы (YAC) и векторы, произведенные из бактериофагов или вирусов растений или животных (в том числе человека). Векторы содержат сайт инициации репликации, узнаваемый предполагаемым хозяином, и, в случае экспрессирующих векторов, промотор и другие регуляторные районы, узнаваемые этим хозяином. Вектор, содержащий вторую молекулу нуклеиновой кислоты, вводят в клетку трансформацией, трансфекцией или с использованием механизмов вирусного вхождения. Некоторые векторы способны к автономной репликации в хозяине, в который их вводят (например, векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации, могут реплицироваться в бактериях). Другие векторы могут быть интегрированы в геном хозяина после введения в этого хозяина и посредством этого реплицироваться вместе с геномом хозяина. Сущность изобретения Данное изобретение относится к связывающим молекулам человека, способным специфически связываться со стафилококками и проявляющими убивающую и/или ингибирующую рост активность против стафилококков. Это изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих,по меньшей мере, связывающий район связывающих молекул человека. Это изобретение дополнительно обеспечивает применение связывающих молекул человека по настоящему изобретению в профилактике и/или лечении субъекта, имеющего инфекцию Staphylococcus или находящегося при риске развития инфекции Staphylococcus. Наряду с этим, это изобретение относится к применению связывающих молекул человека по настоящему изобретению в диагностике/детектировании Staphylococcus. Подробное описание изобретения В первом аспекте данное изобретение включает в себя связывающие молекулы, способные специфически связываться со стафилококками. Предпочтительно эти связывающие молекулы являются связывающими молекулами человека. Предпочтительно связывающие молекулы по настоящему изобретению проявляют убивающую активность против стафилококков. В дополнительном аспекте эти связывающие молекулы по настоящему изобретению способны специфически связываться по меньшей мере с двумя разными видами Staphylococcus и/или имеют убивающую активность против по меньшей мере двух разных видов Staphylococcus. Предпочтительно связывающие молекулы по настоящему изобретению способны специфически связываться с по меньшей мере двумя, по меньшей мере тремя, по меньшей мере четырьмя, по меньшей мере пятью, по меньшей мере шестью, по меньшей мере семью, по меньшей мере восемью, по меньшей мере девятью, по меньшей мере десятью, по меньшей мере одиннадцатью, по меньшей мере двенадцатью, по меньшей мере тринадцатью, по меньшей мере четырнадцатью, по меньшей мере пятнадцатью, по меньшей мере шестнадцатью, по меньшей мере семнадцатью, по меньшей мере восемнадцатью, по меньшей мере девятнадцатью, по меньшей мере двадцатью, по меньшей мере двадцатью одним, по меньшей мере двадцатью двумя, по меньшей мере двадцатью тремя, по меньшей мере с двадцатью четырьмя, по меньшей мере с двадцатью пятью, по меньшей мере двадцатью шестью,по меньшей мере двадцатью семью, по меньшей мере двадцатью восемью, по меньшей мере двадцатью девятью, по меньшей мере тридцатью разными видами Staphylococcus и/или имеют убивающую активность против этих разных видов Staphylococcus. Виды Staphylococcus, с которыми способны специфически связываться или против которых имеют убивающую активность связывающие молекулы по настоящему изобретению, выбраны из группы, состоящей из S. aureus, S. Auricularis, S. capitis, S. caprae, S. caseolyticus, S. Chromogenes, S. cohnii, S. epidermitis, S. haemoliticus, S. hominis, S. hyicus, S. intermedium, S.lentus, S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. schleiferi, S. sciuri, S. simulans, S. warneri и S. xylosus. В одном варианте осуществления связывающие молекулы по настоящему изобретению способны специфически связываться с разными штаммами в одном виде Staphylococcus или имеют убивающую активность против разных штаммов в одном виде Staphylococcus. В следующем варианте осуществления связывающие молекулы по настоящему изобретению способны специфически связываться со штаммом Staphylococcus или имеют убивающую активность против штамма Staphylococcus в лаг-фазе, log-фазе, стационарной фазе и/или фазе смерти. Предпочтительно они специфически связываются со штаммом Staphylococcus или имеют убивающую активность против штамма Staphylococcus в log-фазе и стационарной фазе. В другом варианте осуществления связывающие молекулы по настоящему изобретению могут даже быть способны специфически связываться по меньшей мере с одной другой грамположительной бактерией и/или грамотрицательной бактерией и/или имеют убивающую активность против по меньшей мере одной другой грамположительной бактерии и/или грамотрицательной бактерии, в том числе, но не только,стрептококков группы A; Streptococcus pyrogenes, стрептококков группы В; Streptococcus agalactiae,Streptococcus milleri, Streptococcus pneumoniae, Viridans streptococci; Streptococcus mutans, Enterococcus;biflexa, Borrelia recurrentis, Borrelia burgdorferi, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Clamydia trachomatis, Clamydia psittaci, Clamydia pneumoniae. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть способны специфически связываться со стафилококками и необязательно другими грамположительными и/или грамотрицательными бактериями, которые являются жизнеспособными, живыми и/или инфективными или которые находятся в инактивированной/аттенуированной форме. Способы инактивации/аттенуации бактерий хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, обработку антибиотиками, обработку УФ, обработку формальдегидом и т.д. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть также способны специфически связываться с одним или несколькими фрагментами стафилококков (и других грамположительных и/или грамотрицательных бактерий), таких как inter alia препарат одного или нескольких белков и/или (поли)пептидов, полученных из стафилококков или одного или нескольких рекомбинантно полученных стафилококковых белков и/или полипептидов. Для способов лечения и/или предотвращения стафилококковых инфекций эти связывающие молекулы предпочтительно способны специфически связываться с поверхностными доступными белками стафилококков. Для диагностических целей эти связывающие молекулы могут быть также способны специфически связываться с белками, не присутствующими на поверхности стафилококков. Нуклеотидная и/или аминокислотная последовательность белков разных видов и штаммов Staphylococcus может быть найдена в базе данных GenBank, базе данных EMBL и/или других базах данных. Квалифицированный в данной области специалист сможет легко найти такие последовательности в соответствующих базах данных. Альтернативно, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть также способны специфически связываться с другими стафилококковыми молекулами, в том числе, но не только, поверхностными факторами, которые ингибируют фагоцитарное поглощение; факторами, которые усиливают их выживание в фагоцитах; инвазинами, которые лизируют мембраны эукариотических клеток; экзотоксинами, которые повреждают ткани-хозяева или иным образом вызывают симптомы заболевания; полисахаридами; другими компонентами клеточной стенки, такими как тейхоевая кислота, липотейхоевая кислота, рибит, пептидогликан, пентаглициновый олигопептид, N-ацетилглюкозамин, Nацетилмурамовая кислота, N-ацетилгалактозаминуроновая кислота, N-ацетилфукозамин, Nацетилглюкозаминуроновая кислота, N-ацетилманнозаминуроновая кислота, О-ацетилглюкозамин мурамовая кислота, галактозаминуроновая кислота, фукозамин, глюкозаминуроновая кислота, маннозаминуроновая кислота и связывающие звенья между любыми из этих компонентов. В другом варианте осуществления связывающие молекулы по настоящему изобретению способны специфически связываться с фрагментом вышеупомянутых белков и/или других молекул, где этот фрагмент содержит по меньшей мере одну антигенную детерминанту, узнаваемую связывающими молекулами по настоящему изобретению. "Антигенной детерминантой" называют в данном контексте часть молекулы, которая способна связываться со связывающей молекулой по настоящему изобретению с достаточно высокой аффинностью с образованием детектируемого комплекса антигенсвязывающая молекула. Связывающими молекулами по настоящему изобретению могут быть интактные молекулы иммуноглобулина, такие как поликлональные или моноклональные антитела, или этими связывающими молекулами могут быть антигенсвязывающие фрагменты, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими,Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, фрагменты определяющего комплементарность района (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), бивалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела, триатела, тетратела и (поли)пептиды, которые содержат по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина, который является достаточным для придания специфического связывания антигена со стафилококками или их фрагментом. В одном предпочтительном варианте осуществления связывающими молекулами по настоящему изобретению являются моноклональные антитела человека. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы в невыделенной форме или в выделенной форме. Кроме того, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы по отдельности или в смеси, содержащей по меньшей мере одну связывающую молекулу (или ее вариант или фрагмент) по настоящему изобретению. Другими словами, эти связывающие молекулы могут быть использованы в комбинации, например, в виде фармацевтической композиции,содержащей две или более связывающих молекул по настоящему изобретению, их вариантов или фрагментов. Например, связывающие молекулы, имеющие разные, но дополняющие активности, могут быть объединены в единой терапии для достижения желаемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта, но альтернативно, связывающие молекулы, имеющие идентичные активности,могут быть также объединены в единой терапии для достижения желаемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта. Необязательно, эта смесь дополнительно содержит по меньшей мере один другой терапевтический агент. Предпочтительно этот терапевтический агент, такой как, например, антибиотик, применим в профилактике и/или лечении стафилококковой инфекции. Обычно связывающие молекулы согласно этому изобретению могут связываться с их партнерами связывания, т.е. стафилококками или их фрагментами, с константой аффинности (Kd-величиной), которая ниже 0,210-4 М, 1,010-5 М, 1,010-6 М, 1,010-7 М, предпочтительно ниже 1,010-8 М, более предпочтительно ниже 1,010-9 М, более предпочтительно ниже 1,010-10 М, даже более предпочтительно ниже 1,010-11 М и, в частности, ниже 1,010-12 М. Эти константы аффинности могут варьироваться для изотипов антител. Например, аффинность связывания для изотипа IgM является аффинностью связывания по меньшей мере приблизительно 1,010-7 М. Константы аффинности могут быть измерены, например, с использованием резонанса поверхностных плазмонов, например, с использованием системы BIACORE(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). Связывающие молекулы согласно этому изобретению могут связываться со стафилококками или их фрагментом в растворимой форме, например, в пробе или в суспензии, или могут связываться со стафилококками или их фрагментом, связанными с носителем или субстратом или прикрепленными к носителю или субстрату, например, микротитрационным планшетам, мембранам, гранулам и т.д. Носители или субстраты могут быть изготовлены из стекла, пластика (например, полистирола), полисахаридов, найлона, нитроцеллюлозы или Тефлона и т.д. Поверхность таких носителей может быть твердой или пористой и иметь любую удобную форму. Кроме того, эти связывающие молекулы могут связываться со стафилококками в очищенной/выделенной или неочищенной/невыделенной форме. Связывающие молекулы согласно этому изобретению проявляют убивающую активность. Убивающая активность в данном контексте включает в себя, но не ограничивается ими, опсоническую активность или любую другую активность, повышающую/увеличивающую/усиливающую фагоцитоз и/или фагоцитарное убивание бактерий, например стафилококков; внутреннюю (эндогенную) (убивающую) активность, например, уменьшение или ингибирование бактериального роста или прямое убивание бактерий; увеличение чувствительности бактерий к антибиотической обработке; или любую их комбинацию. Опсоническая активность может быть, например, измерена, как описано здесь. Альтернативные анализы, измеряющие опсоническую активность, описаны, например, в Manual of Molecular and ClinicalLaboratory Immunology, 7th Edition. Анализы для измерения других упомянутых активностей также известны. В одном предпочтительном варианте осуществления связывающие молекулы согласно этому изобретению содержат по меньшей мере один район CDR3, предпочтительно район CDR3 тяжелой цепи,содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:9 иSEQ ID NO:15. Районы CDR связывающих молекул по настоящему изобретению показаны в табл. 12. Районы CDR являются районами в соответствии с Kabat et al. (1991), описанными в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, NIH, USA (fifth edition). В одном варианте осуществления связывающие молекулы могут содержать две, три, четыре, пять или даже все шесть районовCDR связывающих молекул по настоящему изобретению. Еще в одном варианте осуществления связывающие молекулы согласно этому изобретению содержат тяжелую цепь, содержащую вариабельную тяжелую цепь аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:30. В дополнительном варианте осуществления связывающие молекулы согласно этому изобретению содержат легкую цепь, содержащую вариабельную легкую цепь аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ IDNO:34 и SEQ ID NO:36. Табл. 13 показывает вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающей молекулы по настоящему изобретению. В другом аспекте связывающие молекулы по настоящему изобретению способны специфически связываться с одним специфическим видом Staphylococcus, предпочтительно одним специфическим штаммом Staphylococcus. Другими словами, они являются видоспецифическими или штаммспецифическими. Предпочтительно связывающие молекулы по настоящему изобретению проявляют убивающую активность против конкретного вида/штамма Staphylococcus. В предпочтительном варианте осуществления видом Staphylococcus является S. aureus, а штаммом является штамм Cowan S. aureus. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть способны специфически связываться с этим конкретным видом/штаммом Staphylococcus или проявляют убивающую активность против этого конкретного вида/штамма Staphylococcus в любой фазе, например log-фазе или стационарной фазе. В предпочтительном варианте осуществления эти связывающие молекулы содержат по меньшей мере один район CDR, предпочтительно район CDR тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3. Районы CDR этих связывающих молекул показаны в табл. 12. Районами CDR являются районами в соответствии с Kabat et al. (1991), описанными в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services, NIH, USA (fifth edition). В одном варианте осуществления связывающие мо- 10018030 лекулы могут содержать два, три, четыре, пять или даже все шесть районов CDR связывающих молекул по настоящему изобретению. Еще в одном варианте осуществления эти связывающие молекулы содержат тяжелую цепь, содержащую вариабельную тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQID NO:26. В другом варианте осуществления эти связывающие молекулы содержат легкую цепь, содержащую вариабельную легкую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32. Табл. 13 показывает вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи связывающих молекул по настоящему изобретению. Другой аспект по настоящему изобретению включает в себя функциональные варианты связывающих молекул, определенных здесь. Молекулы считаются функциональными вариантами связывающей молекулы согласно этому изобретению, если эти варианты способны конкурировать за специфическое связывание со стафилококками (или другими грамположительными и/или грамотрицательными бактериями) или их фрагментом с исходными связывающими молекулами человека, другими словами, когда эти функциональные варианты все еще способны связываться со стафилококками или их фрагментом. Предпочтительно функциональные варианты способны конкурировать за специфическое связывание по меньшей мере с двумя (или более) разными видами Staphylococcus или их фрагментами, которые специфически связаны с исходными связывающими молекулами человека. Кроме того, считается, что молекулы являются функциональными вариантами связывающей молекулы согласно этому изобретению, если они имеют убивающую активность против стафилококков, предпочтительно против по меньшей мере двух (или более) видов Staphylococcus, против которых исходная связывающая молекул проявляет убивающую активность. В другом варианте осуществления эти функциональные варианты связывающей молекулы согласно этому изобретению имеют также убивающую активность против других грамположительных и/или грамотрицательных бактерий. Функциональные варианты включают в себя, но не ограничиваются ими, производные, которые являются, по существу, сходными в первичной структурной последовательности, но которые содержат, например, модификации in vitro или in vivo, химические и/или биохимические, которые не обнаруживаются в исходной связывающей молекуле. Такие модификации включают в себя inter alia ацетилирование, ацилирование, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, сшивание, образование дисульфидной связи, гликозилирование, гидроксилирование, метилирование, окисление, пэгилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование и т.п. Альтернативно, функциональными вариантами могут быть связывающие молекулы, определенные в данном изобретении, содержащие аминокислотную последовательность, содержащую замены, инсерции, делеции или их комбинации одной или нескольких аминокислот в сравнении с аминокислотными последовательностями исходных связывающих молекул. Кроме того, функциональные варианты могут содержать укорочения аминокислотной последовательности на любом или на обоих амино- или карбоксиконцах. Функциональные варианты согласно этому изобретению могут иметь одинаковые или разные,либо более высокие, либо более низкие, аффинности связывания в сравнении с исходной связывающей молекулой, но все еще являются способными связываться со стафилококками или их фрагментом. Например, функциональные варианты согласно этому изобретению могут иметь увеличенные или уменьшенные аффинности связывания в отношении стафилококков или их фрагмента в сравнении с исходными связывающими молекулами. Предпочтительно аминокислотные последовательности этих вариабельных районов, в том числе каркасных областей, гипервариабельных районов, в частности районов CDR3,являются модифицированными. Обычно вариабельные районы легкой цепи и тяжелой цепи содержат три гипервариабельных района, содержащих три CDR, и более консервативные районы, так называемые каркасные районы (FR). Эти гипервариабельные районы содержат аминокислотные остатки из CDR и аминокислотные остатки из гипервариабельных петель. Функциональные варианты, которые, как предполагается, входят в объем данного изобретения, имеют по меньшей мере приблизительно 50 - приблизительно 99%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 60 - приблизительно 99%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70 - приблизительно 99%, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80 - приблизительно 99%, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90 - приблизительно 99%, в частности по меньшей мере приблизительно 95 - приблизительно 99% и, в частности, по меньшей мере приблизительно 97 - приблизительно 99% гомологию аминокислотной последовательности с исходными связывающими молекулами человека, определенными здесь. Компьютерные алгоритмы, такие как inter alia Gap или Bestfit, известные квалифицированному в данной области специалисту, могут быть использованы для оптимального сопоставления аминокислотных последовательностей, подлежащих сравнению, и для определения сходных или идентичных аминокислотных остатков. Функциональные варианты могут быть получены изменением исходных связывающих молекул или их частей обычными способами молекулярной биологии, известными в данной области, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, склонную к ошибкам ПЦР, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, сайт-направленный мутагенез и перетасовку тяжелой и/или легкой цепи. В одном варианте осуществления функциональные варианты по настоящему изобретению имеют убивающую активность против стафилококков. Эта убивающая активность или может быть идентичной, или может быть более высокой или более низкой в сравнении с исходными связывающими молекулами. Кроме того, функциональные варианты, имеющие убивающую активность, могут иметь дополнительную активность, подходящую для борьбы со стафилококками. Другие активности упоминаются выше. Таким образом, при использовании термина связывающая молекула (человека) этот термин включает в себя также функциональные варианты связывающей молекулы (человека). Это изобретение обеспечивает панель применимых моноклональных антител человека, которые имеют опсоническую фагоцитарную убивающую активность против стафилококков, причем указанные антитела содержат вариабельные области любого из антител, названных CR2430, CR5132, CR5133,CR6166, CR6171, CR6176, CR6187, CR6193, CR6249, CR6273, CR6389, CR6403, CR6406, CR6410,CR6446, CR6450, CR6452, CR6453, CR6464, CR6471, CR6516, CR6517, CR6526, CR6528, CR6531,CR6533, CR6536, CR6537, CR6538, CR6540, CR6544, CR6566 или CR6625, или содержащих вариабельные области с последовательностями, которые являются по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичными им. Предпочтительно последовательности этих полных антител являются по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичными последовательностям антител, описанных здесь. Эти антитела попадают в пять разных групп на основе анализа конкуренции за мишень. Группа А состоит из CR5132, CR5133, CR6187 и CR6453; группа В состоит из CR5140 и CR6171; группа С состоит из CR6176; группа D состоит из CR6526 и группа Е состоит из остальных групп панели CR6166, CR6193, CR6249, CR6273, CR6403, CR6406, CR6410, CR6446,CR6450, CR6452, CR6464, CR6471, CR6516, CR6517, CR6528, CR6531, CR6533, CR6536, CR6537,CR6538, CR6540, CR6544, CR6566, CR6625. На основании их активности одно антитело из каждой группы было идентифицировано в качестве предпочтительного антитела, и этими предпочтительными антителами являются CR5133, CR6166, CR6171, CR6176 и CR6526. Было показано, что все эти антитела связываются по меньшей мере с двумя разными видами Staphylococcus и имеют опсоническую фагоцитарную убивающую активность против по меньшей мере двух разных видов Staphylococcus (в том числе S.aureus и S.epidermidis) и против по меньшей мере 3 разных штаммов S. aureus (502, Mn8, Newman). Это изобретение обеспечивает также композиции, содержащие по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или более моноклональных антител человека по настоящему изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере 2 из указанных антител в композиции являются антителами из разных групп-мишеней. Это имеет преимущество, заключающееся в том, что узнаются разные мишени на стафилококках и, следовательно, увеличивается убивание этих бактерий. Конечно, могут быть получены мутанты более высокой аффинности или мутанты с другими предпочтительными свойствами с использованием рутинных способов, на основе последовательностей антител, описанных здесь. Такие улучшенные антитела включены в объем данного изобретения, когда вариабельные области тяжелой и легкой цепи являются по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичными последовательностям вариабельных областей описанных здесь антител. Еще в одном аспекте это изобретение включает в себя иммуноконъюгаты, т.е. молекулы, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу, определенную здесь, и дополнительно содержащие по меньшей мере одну метку, такую как inter alia детектируемая часть молекулы/агент. В данном изобретении рассматриваются также смеси иммуноконъюгатов согласно этому изобретению или смеси по меньшей мере одного иммуноконъюгата согласно этому изобретению и другой молекулы, такой как терапевтический агент или другая связывающая молекула или иммуноконъюгат. В следующем варианте осуществления иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут содержать более одной метки. Эти метки могут быть одинаковыми или отличающимися одна от другой и могут быть соединены/конъюгированы нековалентно со связывающими молекулами. Метка (метки) могут быть соединены/конъюгированы непосредственно со связывающими молекулами человека посредством образования ковалентных связей. Альтернативно, эта метка (метки) могут быть соединены/конъюгированы со связывающими молекулами посредством одного или нескольких линкерных соединений. Способы конъюгирования меток со связывающими молекулами хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту. Метками иммуноконъюгатов по настоящему изобретению могут быть терапевтические агенты, но ими могут быть также детектируемые части молекул/агенты. Метками, подходящими в терапии и/или профилактике, могут быть токсины или их функциональные части, антибиотики, ферменты, другие связывающие молекулы, которые усиливают фагоцитоз или иммунную стимуляцию. Иммуноконъюгаты,содержащие детектируемый агент, могут быть использованы диагностически, например, для оценки, был ли субъект инфицирован видом Staphylococcus, или для мониторинга развития или прогрессирования стафилококковой инфекции как части процедуры клинического тестирования, например для определения эффективности конкретной схемы лечения. Однако они могут быть также использованы для других целей детектирования и/или аналитических, и/или диагностических целей. Детектируемые части молекул/агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, испускающие позитрон металлы и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. Метки, ис- 12018030 пользуемые для мечения связывающих молекул для детектирования и/или аналитических, и/или диагностических целей зависят от конкретных способов детектирования/анализа/диагностики и/или от используемых способов, таких как inter alia, иммуногистохимическое окрашивание (тканевых) проб, проточное цитометрическое детектирование, сканирующее лазерное цитометрическое детектирование, флуоресцентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммуноанализы(RIA), биоанализы (например, анализы фагоцитоза), применения Вестерн-блоттинга и т.д. Подходящие метки для способов детектирования/анализа/диагностики и/или способы, известные в данной области,находятся вполне в пределах квалификации специалистов в данной области. Кроме того, связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть также присоединены к твердым носителям, которые особенно применимы для иммуноанализов in vitro или очистки стафилококков или их фрагмента. Такие твердые носители могут быть пористыми или непористыми, плоскими или неплоскими. Связывающие молекулы по мастоящему изобретению могут быть слиты с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения очистки. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими, гексагистидиновую метку, гемагглютининовую(НА) метку, метку myc или метку flag. Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антитела. В другом аспекте связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть конъюгированы/соединены с одним или несколькими антигенами. Предпочтительно этими антигенами являются антигены, которые узнаются иммунной системой субъекта, которому вводят этот конъюгат связывающая молекула-антиген. Антигены могут быть идентичными,но могут также отличаться друг от друга. Способы конъюгирования для присоединения антигенов и связывающих молекул хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими,применение сшивающих агентов. Связывающие молекулы по настоящему изобретению будут связываться со стафилококками, и антигены, присоединенные к этим связывающим молекулам, будут инициировать мощную Т-клеточную атаку на этот конъюгат, что будет в конечном счете приводить к деструкции стафилококков. После получения иммуноконъюгатов химически, непосредственно или опосредованно, например,через линкер, эти иммуноконъюгаты могут быть получены в виде слитых белков, содержащих связывающие молекулы по настоящему изобретению и подходящую метку. Слитые белки могут быть получены способами, известными в данной области, например, рекомбинантно конструированием молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие связывающие молекулы,в рамке считывания с нуклеотидными последовательностями, кодирующими подходящую метку (подходящие метки), и затем экспрессией этих молекул нуклеиновых кислот. Другой аспект данного изобретения обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну связывающую молекулу, функциональный вариант или иммуноконъюгат согласно этому изобретению. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов для целей клонирования, например, в процессе созревания аффинности, описанном выше. В предпочтительном варианте осуществления эти молекулы нуклеиновых кислот являются выделенными или очищенными. Предполагается, что квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что функциональные варианты этих молекул нуклеиновых кислот являются также частью данного изобретения. Функциональными вариантами являются последовательности нуклеиновых кислот, которые могут быть непосредственно транслированы с использованием стандартного генетического кода с обеспечением аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотной последовательности, транслируемой из исходных молекул нуклеиновой кислоты. Предпочтительно эти молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, содержащие район CDR3, предпочтительно район CDR тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:15. В следующем варианте осуществления эти молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы,содержащие два, три, четыре, пять или даже все шесть районов CDR связывающих молекул по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления эти молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельную тяжелую цепь аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:30. В другом варианте осуществления эти молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, содержащие легкую цепь, содержащую вариабельную легкую цепь аминокислотной последовательности,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 и SEQ ID NO:36. Другой аспект по настоящему изобретению обеспечивает векторы, т.е. конструкции нуклеиновых кислот, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот согласно данному изобретению. Векторы могут быть получены из плазмид, таких как inter alia F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti и т.д.; космид; фагов, таких как лямбда, лямбдоид, М 13, Mu, P1, P22, Q, T-even (Т-четный), T-odd (Тнечетный), Т 2, Т 4, Т 7 и т.д.; вирусы растений. Векторы могут быть использованы для клонирования и/или для экспрессии связывающих молекул по настоящему изобретению и могут быть даже использо- 13018030 ваны для целей генной терапии. Векторы, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот согласно этому изобретению, функционально связанных с одной или несколькими регулирующими экспрессию молекулами нуклеиновых кислот, также включены в данное изобретение. Выбор вектора зависит от рекомбинантных процедур, которые следуют далее, и от используемого хозяина. Введение векторов в клетки-хозяева может выполняться inter alia кальций-фосфатной трансфекцией, вирусной инфекцией, опосредованной DEAE-декстраном трансфекцией, трансфекцией с использованием липофектамина или электропорацией. Векторы могут реплицироваться автономно или могут реплицироваться вместе с хромосомой, в которую они были интегрированы. Предпочтительно эти векторы содержат один или несколько селектируемых маркеров. Выбор маркеров может зависеть от выбранных клеток-хозяев, хотя это не является решающим для настоящего изобретения, как хорошо известно квалифицированным в данной области специалистам. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, канамицин, неомицин, пуромицин, гигромицин, зеоцин, ген тимидинкиназы из вируса Herpes simplex (HSV-TK), ген дигидрофолатредуктазы из мыши (dhfr). Векторы, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, описанных выше, функционально связанных с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот,кодирующими белки или пептиды, которые могут быть использованы для выделения этих связывающих молекул человека, также включены в это изобретение. Эти белки или пептиды включают в себя, но не ограничиваются ими, глутатион-S-трансферазу, мальтозусвязывающий белок, металлсвязывающий полигистидин, зеленый флуоресцентный белок, люциферазу и бета-галактозидазу. Хозяева, содержащие одну или несколько копий вышеупомянутых векторов, являются дополнительным предметом данного изобретения. Предпочтительно этими хозяевами являются клетки-хозяева. Клетки-хозяева включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающего, растения, насекомого, клетки грибного или бактериального происхождения. Бактериальные клетки включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки из грамположительных бактерий или грамотрицательных бактерий, таких как несколько видов родов Escherichia, таких как Е.coli, и Pseudomonas. В группе грибных клеток предпочтительно используют дрожжевые клетки. Экспрессия в дрожжах может быть достигнута с использованием таких штаммов дрожжей, как inter alia Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Hansenulapolymorpha. Кроме того, в качестве клеток-хозяев могут быть использованы клетки насекомых, такие как клетки из Drosophila и Sf9. Кроме этого, клетками-хозяевами могут быть клетки растений, такие как interalia клетки из культурных растений, таких как растения лесов сельскохозяйственного значения, или клетки из растений, обеспечивающих пищевые продукты и сырьевые материалы, таких как злаковые растения или лекарственные растения, или клетки из декоративных растений, или клетки из цветочных луковичных культур. Трансформированные (трансгенные) растения или клетки растений получают известными способами, например Agrobacterium-опосредованным переносом генов, трансформацией дисков из листьев, трансформацией протопластов индуцируемым полиэтиленом переносом ДНК, электропорацией, обработкой ультразвуком, микроинъекцией или баллистическим переносом генов. Дополнительно, подходящей системой экспрессии может быть бакуловирусная система. Экспрессионные системы, использующие клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клеткиCOS, клетки ВНК или клетки меланомы Bowes, являются предпочтительными в данном изобретении. Клетки млекопитающих обеспечивают экспрессированные белки с посттрансляционными модификациями, которые наиболее сходны с природными молекулами, происходящими из млекопитающих. Поскольку данное изобретение имеет дело с молекулами, которые могут быть предназначены для введения людям, особенно предпочтительной могла бы быть полностью человеческая экспрессионная система. Таким образом, даже более предпочтительно, клетками-хозяевами являются клетки человека. Примерами клеток человека являются inter alia клетки HeLa, 911, АТ 1080, А 549, 293 и HEK293T. В предпочтительных вариантах осуществления клетки-продуценты человека содержат, по меньшей мере, функциональную часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей район Е 1 аденовируса, в экспрессируемом формате. Даже в более предпочтительных вариантах указанные клетки-хозяева получают из ретины человека и иммортализуют с нуклеиновыми кислотами, содержащими последовательности аденовирусного Е 1, например, клетки 911 или линия клеток, депонированная в Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain 29 февраля 1996 г. под номером 96022940 и продаваемая под товарным названием PER.C6 (PER.C6 является зарегистрированным товарным названием Crucell Holland B.V.). Для целей этой публикации "PER.C6" относится к клеткам, депонированным под номером 96022940, или их предкам, пассажам, более ранним и более поздним,а также потомкам от предков депонированных клеток, а также производным любых из вышеуказанных. Получение рекомбинантных белков в клетках-хозяевах может выполняться в соответствии со способами,хорошо известными в данной области. Применение этих клеток, продаваемых под товарным названиемPER.C6, в качестве платформы получения представляющих интерес белков, было описано вWO 00/63403, описание которого включено здесь в качестве ссылки в его полном виде. Способ получения связывающей молекулы по этому изобретению является дополнительной частью по настоящему изобретению. Этот способ предусматривает стадии а) культивирования хозяина согласно этому изобретению при условиях, благоприятных для экспрессии этой связывающей молекулы, и b) не- 14018030 обязательно, извлечения экспрессированной связывающей молекулы. Экспрессированные связывающие молекулы или иммуноконъюгаты могут быть извлечены из бесклеточного экстракта, но предпочтительно их извлекают из культуральной среды. Вышеописанный способ получения может быть также использован для получения функциональных вариантов связывающих молекул и/или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Способы извлечения белков, таких как связывающие молекулы, из бесклеточных экстрактов или культуральной среды хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту. Связывающие молекулы, функциональные варианты и/или иммуноконъюгаты, получаемые описанным выше способом, также являются частью данного изобретения. Альтернативно, после экспрессии в хозяевах, таких как клетки-хозяева, связывающие молекулы и иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть получены синтетически с использованием общепринятых пептидных синтезаторов или в бесклеточных системах трансляции с использованием нуклеиновой кислоты (РНК), полученной из ДНК-молекул в соответствии с этим изобретением. Связывающие молекулы и иммуноконъюгаты, получаемые описанными выше синтетическими способами получения или бесклеточными системами трансляции, также являются частью данного изобретения. Еще в одном варианте осуществления связывающие молекулы согласно данному изобретению могут быть также получены в трансгенных, не являющихся человеком, млекопитающих, таких как inter alia кролики, козы или коровы, и секретированы, например, в их молоко. Еще в одном альтернативном варианте осуществления связывающие молекулы согласно данному изобретению, предпочтительно связывающие молекулы человека, специфически связывающиеся со стафилококками или их фрагментом, могут генерироваться трансгенными млекопитающими (не человеком),такими как, например, трансгенные мыши или кролики, которые экспрессируют гены иммуноглобулина человека. Предпочтительно эти трансгенные млекопитающие (не человек) имеют геном, содержащий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, кодирующие все или часть связывающих молекул человека, описанных выше. Эти трансгенные (не человек) млекопитающие могут быть иммунизированы очищенным или обогащенным препаратом стафилококков или их фрагмента. Протоколы для иммунизации млекопитающих (не человека) хорошо установлены в данной области. См. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, ColdMargulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John WileySons Inc., New York, описания которого включены здесь в качестве ссылки. Протоколы иммунизации часто включают в себя множественные иммунизации, либо с адъювантами, либо без адъювантов, таких как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, но могут также включать в себя иммунизации голой ДНК. В другом варианте осуществления связывающие молекулы человека продуцируются В-клетками или клетками плазмы, полученными из трансгенных животных. Еще в одном варианте осуществления связывающие молекулы человека продуцируются гибридомами, которые получают слиянием В-клеток, полученных из описанных выше трансгенных млекопитающих (не человека), с иммортализованными клетками. В-клетки, клетки плазмы и гибридомы, получаемые из описанных выше трансгенных млекопитающих (не человека), и связывающие молекулы человека, получаемые из описанных выше млекопитающих (не человека), В-клеток, клеток плазмы и гибридом, также являются частью данного изобретения. В следующем аспекте это изобретение обеспечивает способ идентификации связывающей молекулы, такой как связывающая молекула человека, например, моноклональное антитело человека или его фрагмент, специфически связывающейся по меньшей мере с двумя разными бактериальными организмами или молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими такие связывающие молекулы, и предусматривает стадии (а) контактирования коллекции связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок с первым бактериальным организмом при условиях, благоприятных для связывания, (b) отбора по меньшей мере один раз на связывание реплицируемой генетической упаковки с этим первым бактериальным организмом, (с) необязательно, отделения реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с первым бактериальным организмом, от реплицируемых генетических упаковок,которые не связываются с первым бактериальным организмом, контактирование отделенных реплицируемых упаковок со вторым бактериальным организмом при условиях, благоприятных для связывания и отбора по меньшей мере один раз на связывание реплицируемой генетической упаковки со вторым бактериальным организмом, и (d) отделения и извлечения реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с первым и/или вторым бактериальным организмом, от реплицируемых генетических упаковок, которые не связываются с первым и/или вторым бактериальным организмом. Конечно, описанные выше способы, продленные отборами на третий и последующие бактериальные организмы, также являются частью данного изобретения. Реплицируемая генетическая упаковка в данном контексте может быть прокариотической или эукариотической и включает в себя клетки, споры, дрожжи, бактерии, вирусы, (бактерио)фаги, рибосомы и полисомы. Предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Связывающие молекулы, такие как, например, одноцепочечные Fv, представляются на этой реплицируемой генетической упаковке, т.е. они присоединяются к группе или молекуле, расположенной на наружной поверхности реплицируемой генетической упаковки. Эта реплицируемая генетическая упаковка является подвергаемым скринингу звеном, содержащим связывающую молекулу, подлежащую скринингу, связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей эту связывающую молекулу. Эта молекула нуклеиновой кислоты должна быть реплицируемой либо in vivo (например, в векторе), либо in vitro (например, при помощи ПЦР, транскрипции и трансляции). In vivo репликация может быть автономной (как для клетки),при помощи факторов хозяина (как для вируса) или при помощи как хозяина, так и хелперного вируса(как для фагмиды). Реплицируемые генетические упаковки, представляющие коллекцию связывающих молекул, образуются введением молекул нуклеиновых кислот, кодирующих экзогенные связывающие молекулы, подлежащие представлению в геномах реплицируемых генетических упаковок, для образования слитых белков с эндогенными белками, которые в норме экспрессируются из наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок. Экспрессия этих слитых белков, транспорт к наружной поверхности и сборка приводит к представлению (дисплею) экзогенных связывающих молекул из наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок. Стадия (стадии) отбора в этом способе по данному изобретению могут выполняться с бактериальными организмами, которые являются живыми и все еще инфекционными или инактивированными. Инактивация бактериального организма может выполняться способами бактериальной инактивации, хорошо известными квалифицированному специалисту, такими как inter alia способ с низким рН, т.е. рН 4,в течение 6 часов - 21 дня; обработка органическим растворителем/детергентом, т.е. добавление органических растворителей и детергентов (Тритона X-100 или Твина-80) к бактерии; облучение УФ/светом; гамма-облучение и обработка релевантными антибиотиками. Способы испытания, является ли бактериальный организм еще живым, инфекционным и/или жизнеспособным или частично или полностью инактивированным, хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту. Используемые в описанном выше способе бактериальные организмы могут быть невыделенными, например, присутствующими в сыворотке и/или крови инфицированного индивидуума. Используемые бактериальные организмы могут быть также выделенными в виде дискретных колоний после ночной культуры при 37 С на подходящей среде, такой как агар с овечьей кровью. В одном варианте осуществления первый и/или второй бактериальный организм находятся в суспензии при контакте с реплицируемыми генетическими упаковками. Альтернативно, они могут быть связаны с носителем при контактировании. В другом варианте осуществления первый и второй бактериальные организмы являются бактериальными организмами из разных бактериальных семейств, например, первый является грамотрицательной бактерией, а второй является грамположительной бактерией. Таким путем могут быть найдены связывающие молекулы, способные специфически связываться с грамположительными и грамотрицательными бактериями. Предпочтительно первый и второй бактериальные организмы являются оба грамположительной бактерией. Первый и второй бактериальные организмы могут быть оба стафилококками. В одном варианте осуществления первый и второй бактериальные организмы являются разными штаммами из одного и того же бактериального вида, например видаStaphylococcus, такого как S. aureus или S. epidermidis. Таким путем могут быть найдены видоспецифические связывающие молекулы, которые способны специфически связываться с разными штаммами в одном виде. В другом варианте осуществления первый и второй бактериальные организмы, каждый, являются членом разных видов Staphylococcus, например первый и второй виды Staphylococcus выбраны из группы, состоящей из S. aureus и S. epidermidis. Таким путем могут быть найдены связывающие молекулы, способные специфически связываться с разными видами в одном роде бактерий. Альтернативно,первый и второй бактериальные организмы могут быть оба энтерококками. В одном варианте осуществления первый и второй бактериальные организмы являются разными штаммами из одного и того же бактериального вида, например вида Enterococcus, такими как Е. faecalis или Е. faecium. Таким путем могут быть найдены видоспецифические связывающие молекулы, которые способны специфически связываться с разными штаммами в одном виде. В другом варианте осуществления первый и второй бактериальные организмы, каждый, являются членом разных видов Enterococcus, например, первый и второй видыEnterococcus выбраны из группы, состоящей из Е. faecalis и Е. faecium. Альтернативно, стадия отбора может выполняться в присутствии фрагмента этих бактериальных организмов, такого как, например, препараты мембран клеток, препараты мембран клеток, которые были ферментативно обработаны для удаления белков (например, протеазой К), препараты мембран клеток,которые были ферментативно обработаны для удаления углеводных частей молекул (например, периодатом), рекомбинантных белков или полисахаридов. Еще в одном варианте осуществления стадия отбора может выполняться в присутствии одного или нескольких белков или (поли)пептидов, полученных из этих бактериальных организмов, слитых белков, содержащих эти белки или (поли)пептиды и т.п. Экспонированные внеклеточно части этих белков могут быть также использованы в качестве селектируемого материала. Живые или инактивированные бактериальные организмы или их фрагменты могут быть иммобилизованы на подходящем материале перед применением. Альтернативно, живые или иммобилизованные бактерии используют в суспензии. В одном варианте осуществления отбор может выполняться на различных материалах, полученных из бактериальных организмов. Например, первый раунд отбора может выполняться на живых или инактивированных бактериальных организмах в суспензии, в то время как второй и третий раунд отбора могут выполняться на рекомбинантных бактериальных белках и полисахаридах соответственно. Конечно, здесь рассматриваются также другие комбинации. Разные бактериальные материалы могут быть также использованы во время одной стадии отбора/пэннинга. В следующем аспекте это изобретение обеспечивает способы, в которых эти бактериальные организмы, используемые в стадии (стадиях) отбора, получают из тех же самых или разных фаз роста этих бактерий, например лаг-фазы, log-фазы, стационарной фазы или фазы смерти. Этим путем, например, могут быть найдены фазоспецифические антибактериальные связывающие молекулы. Например, первым бактериальным организмом может быть S. aureus в стационарной фазе, тогда как вторым бактериальным организмом является S. aureus в log-фазе или первым бактериальным организмом может быть S. aureus в лагфазе, тогда как вторым бактериальным организмом является S. epidermidis в лаг-фазе. Дополнительные комбинации находятся вполне в рамках квалификации специалиста в данной области. В конкретном варианте осуществления это изобретение обеспечивает способ, описанный здесь выше, в котором, если первым и/или вторым видом Staphylococcus является штамм S. aureus, белок А, присутствующий на поверхности этого штамма S. aureus, блокируют перед контактированием этого штаммаS. aureus с реплицируемыми генетическими упаковками. Подходящим блокирующим агентом может быть кроличья сыворотка, очищенный иммуноглобулин кролика, фетальная телячья сыворотка, объединенная сыворотка человека. Еще в одном аспекте это изобретение обеспечивает способ получения связывающей молекулы, специфически связывающейся по меньшей мере с двумя разными бактериальными организмами, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую связывающую молекулу, где этот способ предусматривает стадии а) выполнения описанного выше способа идентификации связывающих молекул и b) выделения из извлеченной реплицируемой генетической упаковки этой связывающей молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эту связывающую молекулу. Коллекцией связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок может быть коллекция scFv или Fab. После установления или идентификации новых scFv или Fab вышеупомянутым способом идентификации связывающих молекул или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих эти связывающие молекулы, ДНК, кодирующая эти scFv или Fab, может быть выделена из этих бактерий или фагов и комбинирована стандартными способами молекулярной биологии для получения конструкций, кодирующих бивалентныеscFv или полные иммуноглобулины человека желаемой специфичности (например, IgG, IgA или IgM). Эти конструкции могут быть трансфицированы в подходящие клеточные линии и могут быть получены полные моноклональные антитела человека (см. Huls et al., 1999; Boel et al., 2000). Как упоминалось ранее, предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Способы фагового дисплея для идентификации и получения связывающих молекул (человека), например моноклональных антител (человека), являются в настоящее время хорошо установленными способами,известными квалифицированному в данной области специалисту. Они описаны, например, в патенте США 5696108; Burton and Barbas, 1994; de Kruif et al., 1995b; и Phage Display: A Laboratory Manual.Press, Cold Spring Harbor, New York. Все эти ссылки включены здесь в их полном виде. Для конструирования библиотек фагового дисплея, коллекции генов вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального антитела человека экспрессируют на поверхности частиц бактериофага, предпочтительно нитеобразного бактериофага, в форме одноцепочечного Fv (scFv) или в форме Fab (см. de Kruif etal., 1995b). Большие библиотеки экспрессирующих фрагмент антитела фагов обычно содержат более 1,0109 специфичностей антител и могут быть собраны из V-областей иммуноглобулина, экспрессируемых в В-лимфоцитах иммунизированных или неиммунизированных индивидуумов. В конкретном варианте осуществления по настоящему изобретению фаговую библиотеку связывающих молекул, предпочтительно фаговую библиотеку scFv, получают из РНК, выделенной из клеток, полученных из субъекта,который был вакцинирован против бактерии, недавно вакцинирован против неродственного патогена,недавно страдавшего от хронической или острой бактериальной инфекции, например, энтерококковой инфекции, или из здорового индивидуума. РНК может быть выделена inter alia из костного мозга или периферической крови, предпочтительно из лимфоцитов периферической крови или на выделенных Вклетках или даже на субпопуляциях В-клеток. Этим субъектом может быть животное, вакцинированное против бактерии, или животное, которое имеет или имело бактериальную инфекцию. Предпочтительно этим животным является субъект-человек, который был вакцинирован против бактерии или имеет или имел хроническую бактериальную инфекцию или острую бактериальную инфекцию. Предпочтительно этот субъект-человек недавно выздоровел от этой бактериальной инфекции. Альтернативно, библиотеки фагового дисплея могут быть сконструированы из вариабельных областей иммуноглобулина, которые были частично собраны in vitro для введения дополнительного разнообразия антител в этой библиотеке (полусинтетические библиотеки). Например, собранные in vitro вариабельные области содержат участки синтетически полученных рандомизированных или частично рандомизированных ДНК в тех областях этих молекул, которые являются важными для специфичности антитела, например, CDR-районах. Фаговые антитела, специфические в отношении бактерий, таких как стафилококки, могут быть отобраны из этой библиотеки подверганием бактерий или их материала дей- 17018030 ствию фаговой библиотеки для создания возможности связывания фагов, экспрессирующих фрагменты антител, специфические в отношении этих бактерий или их материала. Несвязанные фаги удаляют промыванием, а связанные фаги элюируют для инфицирования бактерий Е.coli и последующего размножения. Обычно требуются многочисленные раунды отбора и размножения для достаточного обогащения фагами, связывающимися специфически с этими бактериями или их материалом. Если желательно, перед подверганием этой фаговой библиотеки действию этих бактерий или их материала, эта фаговая библиотека может быть сначала подвергнута "вычитанию" (субтракции) подверганием этой фаговой библиотеки действию материала-не мишени, такого как бактерии отличающегося семейства, вида и/или штамма или бактерии в отличающейся фазе роста, или материал этих бактерий. Эти "вычитающие" бактерии (субтракторы) или их материал могут быть связаны с твердой фазой или могут находиться в суспензии. Фаги могут быть также отобраны на связывание с комплексными антигенами, такими как комплексные смеси бактериальных белков или (поли)пептидов, необязательно дополненные бактериальными полисахаридами или другим бактериальным материалом. Клетки-хозяева, экспрессирующие один или несколько белков или (поли)пептидов бактерий, таких как стафилококки, могут быть также использованы для целей отбора. Способ фагового дисплея, использующий эти клетки-хозяева, может быть продлен и улучшен"вычитанием" (субтракцией) нерелевантных связывающих агентов во время скрининга добавлением избытка клеток-хозяев, не содержащих молекул-мишеней или содержащих молекулы, не являющиеся мишенями, которые являются сходными, но не идентичными относительно мишени, и посредством этого сильно увеличивают шанс нахождения релевантных связывающих молекул. Конечно, это "вычитание"(субтракция) может выполняться до, во время или после скрининга с бактериальным организмом или его материалом. Этот способ называют способом Mabstract (Mabstract является зарегистрированным товарным названием Crucell Holland B.V., см. также патент США 6265150, который включен здесь в качестве ссылки). Еще в одном аспекте это изобретение обеспечивает способ получения связывающей молекулы, потенциально имеющей убивающую активность против двух разных бактериальных организмов, где этот способ предусматривает стадии (а) выполнения способа получения связывающей молекулы, специфически связывающейся по меньшей мере с двумя разными бактериальными организмами или молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей такую связывающую молекулу, как описано выше, и (b) подтверждения, имеет ли эта выделенная связывающая молекула убивающую активность против по меньшей мере двух разных бактериальных организмов. Анализы подтверждения, имеет ли связывающая молекула убивающую активность, например опсоническую активность, хорошо известны в данной области (см.,например, Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, 7th Edition). В следующем варианте осуществления эту связывающую молекулу тестируют также на любую другую активность. Другие применимые активности упоминаются выше. В следующем аспекте это изобретение относится к связывающей молекуле, имеющей убивающую активность против по меньшей мере двух, предпочтительно по меньшей мере трех или более разных бактериальных организмов, таких как, например, стафилококки, и получаемой способами, описанными выше. Фармацевтическая композиция, содержащая эту связывающую молекулу, эта фармацевтическая композиция, дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, также является аспектом данного изобретения. Фармацевтически приемлемые эксципиенты хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту. Фармацевтическая композиция по этому изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один другой терапевтический агент. Подходящие агенты также хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту. Еще в одном дополнительном аспекте это изобретение обеспечивает композиции, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу, предпочтительно моноклональное антитело человека по этому изобретению, по меньшей мере один ее функциональный вариант, по меньшей мере один иммуноконъюгат по этому изобретению или их комбинации. Кроме них, эти композиции могут содержать interalia стабилизирующие молекулы, такие как альбумин или полиэтиленгликоль, или соли. Предпочтительно используемыми солями являются соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность этих связывающих молекул и не сообщают нежелательных токсикологических эффектов. Если необходимо, связывающие молекулы человека по настоящему изобретению могут иметь покрытия или быть внесены в материал или нанесены на материал для защиты их от действия кислот или других природных или неприродных условий, которые могут инактивировать эти связывающие молекулы. Еще в одном аспекте это изобретение обеспечивает композиции, содержащие по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в данном изобретении. Эти композиции могут содержать водные растворы, такие как водные растворы, содержащие соли (например, NaCl или соли, описанные выше), детергенты (например, ДСН) и/или другие подходящие компоненты. Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одну связывающую молекулу, такую как моноклональное антитело человека по этому изобретению (или его функциональный фрагмент или вариант), по меньшей мере один иммуноконъюгат по этому изобретению, по меньшей мере одну композицию по этому изобретению, или их комбинации. Фармацевтическая композиция по данному изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном варианте осуществления эти фармацевтические композиции могут содержать две или более связывающие молекулы, которые имеют убивающую активность против бактериального организма,например, вида Staphylococcus. В одном варианте осуществления эти связывающие молекулы проявляют синергическую убивающую активность при использовании в комбинации. Другими словами, эти композиции содержат по меньшей мере две связывающие молекулы, имеющие убивающую активность, отличающиеся тем, что эти связывающие молекулы действуют синергически в убивании бактериального организма, такого как, например, вид Staphylococcus. В данном контексте термин "синергическое" обозначает, что объединенное действие этих связывающих молекул при использовании в комбинации является более высоким, чем их аддитивные действия при использовании индивидуально. Эти синергически действующие связывающие молекулы могут связываться с разными структурами на одних и тех же или на разных фрагментах этого бактериального организма. В одном варианте осуществления связывающие молекулы, действующие синергически в убивании бактериального организма, могут быть также способны убивать синергически другие бактериальные организмы. Синергию рассчитывают при помощи индекса комбинации. Концепция индекса комбинации (CI) была описана Chou and Talalay, 1984. Две или более связывающие молекулы, имеющие синергическую активность, имеют индивидуальные способы действия. Например, первая связывающая молекула может иметь опсоническую активность, тогда как вторая связывающая молекула может иметь другую активность повышения/увеличения/усиления фагоцитоза, или первая связывающая молекула может иметь внутреннюю (эндогенную) (убивающую) активность, например, уменьшает или ингибирует бактериальный рост или непосредственно убивает бактерии, тогда как вторая связывающая молекула увеличивает чувствительность бактерий к обработке антибиотиком. Должно быть понятно, что здесь рассматриваются также другие комбинации. Фармацевтическая композиция согласно этому изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один другой терапевтический, профилактический и/или диагностический агент. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один другой профилактический и/или терапевтический агент. Предпочтительно указанные дополнительные терапевтический и/или профилактический агенты являются агентами, способными предотвращать и/или лечить бактериальную,например, стафилококковую, инфекцию и/или состояние, происходящее из такой инфекции. Терапевтические и/или профилактические агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, антибактериальные агенты. Такими агентами могут быть связывающие молекулы, малые молекулы, органические или неорганические соединения, ферменты, полинуклеотидные последовательности, противомикробные пептиды и т.д. Другими агентами, которые используются в настоящее время для лечения пациентов, инфицированных бактериальными инфекциями, такими как стафилококковые инфекции, являются антибиотики,такие как метициллин, цефалоспорины 2-го и 3-го поколения, аминогликозиды, Карбапенемы, Макролиды, Кетолиды, Хинолоны и разносторонние антибиотики, такие как даптомицин, линезолид, нитрофурантоин, хинупристин/далфопристин, триметоприм/сульфа, ванкомицин. Они могут быть использованы в комбинации со связывающими молекулами по настоящему изобретению. Агенты, способные предотвращать и/или лечить инфекцию, вызываемую бактериями и/или состояние, происходящее из такой инфекции, которые находятся в экспериментальной фазе, могут быть также использованы в качестве других терапевтических и/или профилактических агентов, применимых в данном изобретении. Связывающие молекулы или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть испытаны в подходящих системах моделей животных перед применением в людях. Такие системы моделей животных включают в себя, но не ограничиваются ими, мышиные модели сепсиса и перитонита, крысиные модели сепсиса и эндокардита и кроличьи модели эндокардита. Обычно фармацевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях приготовления и хранения. Связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции по настоящему изобретению могут быть в форме порошка для воссоздания (воспроизведения) в подходящем фармацевтически приемлемом эксципиенте перед или во время доставки. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, предпочтительными способами получения являются сушка в вакууме и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желаемого ингредиента, из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Альтернативно, связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции по настоящему изобретению могут находиться в растворе и подходящий фармацевтически приемлемый эксципиент может быть добавлен и/или смешан до времени или во время доставки для обеспечения инъецируемой формы унифицированной дозы. Предпочтительно фармацевтически приемлемый эксципиент, используемый в данном изобретении, является подходящим для высокой концентрации лекарственного средства, может сохранять должную текучесть и, если необходимо, может задерживать абсорбцию. На выбор оптимального способа введения фармацевтических композиций будут влиять несколько факторов, в том числе физико-химические свойства активных молекул в этих композициях, безотлага- 19018030 тельность клинической ситуации и взаимосвязь концентраций в плазме активных молекул с желаемым терапевтическим эффектом. Например, если необходимо, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть приготовлены с носителями, которые будут защищать их от быстрого высвобождения, например, в виде формы регулируемого высвобождения, включающей в себя имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть inter alia использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Кроме того, может быть необходимым покрытие связывающих молекул материалом или соединением или совместное введение связывающих молекул с материалом или соединением, которые предотвращают инактивацию связывающих молекул человека. Например, связывающие молекулы могут вводиться субъекту в подходящем носителе,например, липосомах или разбавителе. Способы введения могут быть подразделены на две основные категории, пероральное и парентеральное введение. Предпочтительным способом является внутривенное введение. Пероральные дозированные формы могут быть приготовлены inter alia в виде таблеток, пастилок,лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых капсул, мягких желатиновых капсул, сиропов или эликсиров, пилюль, драже, жидкостей, гелей или суспензий. Эти готовые формы могут содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, в том числе,но не только, инертные разбавители, гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты,смазывающие агенты, консерванты, красящие, ароматизирующие или подслащивающие агенты, растительные или минеральные масла, увлажняющие агенты и загущающие агенты. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть также приготовлены для парентерального введения. Готовые формы для парентерального введения могут быть inter alia в форме водных или неводных изотонических стерильных нетоксичных инъекционных или инфузионных растворов или суспензий. Эти растворы или суспензии могут содержать агенты, которые являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, такие как 1,3-бутандиол, раствор Рингера, раствор Хенка, изотонический раствор хлорида натрия, масла, жирные кислоты, местные анестезирующие агенты, консерванты, буферы, увеличивающие вязкость или растворимость агенты, водорастворимые антиоксиданты, маслорастворимые антиоксиданты и хелатирующие металлы агенты. В следующем аспекте связывающие молекулы, такие как моноклональные антитела человека (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве лекарственного средства. Таким образом, способ лечения и/или предотвращения бактериальной (грамположительной и/или грамотрицательной), например стафилококковой, инфекции с использованием этих связывающих молекул, иммуноконъюгатов, композиций или фармацевтических композиций по настоящему изобретению является другой частью данного изобретения. Вышеуказанные молекулы могут быть inter alia использованы в диагностике, профилактике, лечении или их комбинациях, бактериальной инфекции. Они пригодны для лечения еще не лечившихся пациентов, страдающих от бактериальной инфекции, и пациентов, которые лечились или обрабатывались в отношении бактериальной инфекции. Они могут быть использованы для таких пациентов, как госпитализированные младенцы, младенцы, рожденные преждевременно, жертвы ожогов, пожилые пациенты, иммунодефицитные пациенты, иммуносупрессированные пациенты, пациенты, подвергающиеся инвазивной процедуре, и работники здравоохранения. Каждое введение может защищать против дополнительной инфекции бактериальным организмом в течение до трех или четырех недель и/или будет замедлять проявление или прогрессирование симптомов, ассоциированных с этой инфекцией. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут также увеличивать эффективность существующего антибиотического лечения увеличением чувствительности этой бактерии к данному антибиотику, могут стимулировать иммунную систему для атаки на эту бактерию другими способами, чем посредством опсонизации. Эта активация может приводить к длительно длящейся защите от этой инфекционной бактерии. Кроме того, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут непосредственно ингибировать рост этой бактерии или ингибировать факторы вирулентности, необходимые для ее выживания во время инфекции. Эти вышеуказанные молекулы или композиции могут быть использованы вместе с другими молекулами, применимыми в диагностике, профилактике и/или лечении. Они могут быть использованы invitro, ex vivo или in vivo. Например, связывающие молекулы, такие как моноклональные антитела человека (или их функциональные варианты), иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, могут вводиться совместно с вакциной против этого бактериального организма (если она доступна). Альтернативно, эта вакцина может также вводиться до или после введения молекул по настоящему изобретению. Вместо вакцины антибактериальные агенты могут также использоваться вместе со связывающими молекулами по настоящему изобретению. Подходящие антибактериальные агенты упоминаются выше. Эти молекулы обычно готовят в виде композиций и фармацевтических композиций по настоящему изобретению в терапевтически или диагностически эффективном количестве. Альтернативно, они могут быть приготовлены и введены по отдельности. Например, другие молекулы, такие как антибактериальные агенты, могут применяться системно, в то время как связывающие молекулы по настоящему изобретению могут применяться внутриоболочечно или интравентрикулярно. Схемы введения доз могут быть приспособлены для обеспечения оптимальной желаемой реакции(например, терапевтической реакции). Подходящим диапазоном доз может быть, например, диапазон 0,1-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,5-15 мг/кг массы тела. Кроме того, например, может быть введен единственный болюс (ударная доза), несколько разделенных доз могут вводиться на протяжении времени или эта доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с необходимостью терапевтической ситуации. Молекулы и композиции по данному изобретению являются предпочтительно стерильными. Способы стерилизации этих молекул и композиций хорошо известны в данной области. Другие молекулы, применимые в диагностике, профилактике и/или лечении могут быть введены в сходной схеме введения доз, предложенной для связывающих молекул по настоящему изобретению. Если эти другие молекулы вводят отдельно, они могут вводиться пациенту до (например, за 2 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч, 12 ч, 14 ч, 16 ч, 18 ч, 20 ч,22 ч, 24 ч, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 7 дней, 2 недели, 4 недели или 6 недель ранее), одновременно или после (например, 2 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч, 12 ч, 14 ч,16 ч, 18 ч, 20 ч, 22 ч, 24 ч, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 7 дней, 2 недель, 4 недель или 6 недель после) введения одной или нескольких связывающих молекул человека или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Точную схему введения доз обычно уточняют во время клинических испытаний на пациентах-людях. Связывающие молекулы человека и фармацевтические композиции, содержащие связывающие молекулы человека, особенно применимы и часто предпочтительны при введении людям в качестве in vivo терапевтических агентов, так как иммунная реакция реципиента на введенное антитело часто будет существенно меньшей, чем иммунная реакция в случае введения моноклональной мышиной, химерной или гуманизированной связывающей молекулы. В другом аспекте данное изобретение относится к применению связывающих молекул, таких как убивающие моноклональные антитела человека (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот, композиции или фармацевтические композиции по этому изобретению в приготовлении лекарственного средства для диагностики, профилактики, лечения, или их комбинации, бактериальной (грамположительной и/или грамотрицательной), например стафилокковой,инфекции. Далее, наборы, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу, такую как убивающее моноклональное антитело человека (его функциональные фрагменты и варианты), по меньшей мере один иммуноконъюгат, по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, по меньшей мере одну композицию, по меньшей мере одну фармацевтическую композицию, по меньшей мере один вектор, по меньшей мере одного хозяина по этому изобретению, или их комбинацию, являются также частью данного изобретения. Необязательно, вышеуказанные компоненты этих наборов данного изобретения упакованы в подходящих контейнерах и имеют инструкции в отношении диагностики, профилактики и/или лечения указанных состояний. Эти вышеуказанные компоненты могут храниться в однодозовых или мультидозовых контейнерах в виде водного, предпочтительно стерильного, раствора или в виде лиофилизированной, предпочтительно стерильной, готовой формы для воссоздания. Эти контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик, и могут иметь стерильное входное отверстие для доступа (например, контейнером может быть мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий протыкаемую иглой для подкожных инъекций пробку). Этот набор может, кроме того,содержать дополнительные контейнеры, содержащие фармацевтически приемлемый буфер. Он может дополнительно включать в себя другие материалы, желаемые с коммерческой точки зрения или с точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, культуральную среду для одного или нескольких хозяев и даже, возможно, по меньшей мере один другой терапевтический, профилактический или диагностический агент. С этими наборами могут быть связаны инструкции,включаемые обычно в коммерческие упаковки терапевтических, профилактических или диагностических продуктов, которые содержат информацию, например, о показаниях, применении, дозе, приготовлении,введении, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся применения таких терапевтических,профилактических или диагностических продуктов. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть также использованы для покрытия медицинских устройств или полимерных биоматериалов. Данное изобретение относится дополнительно к способу детектирования бактериального организма(грамположительного и/или грамотрицательного) в пробе, причем этот способ предусматривает стадии(а) контактирования пробы с диагностически эффективным количеством связывающей молекулы (ее функциональных фрагментов и вариантов) или иммуноконъюгата по этому изобретению и (b) определения, связывается ли специфически эта связывающая молекула или иммуноконъюгат с молекулой этой пробы. Предпочтительно этот способ используют для детектирования Staphylococcus в пробе. Этой пробой может быть биологическая проба, в том числе, но не только, кровь, сыворотка, моча, ткань или дру- 21018030 гой биологический материал из (потенциально) инфицированных субъектов, или небиологическая проба,такая как вода, напиток и т.д. Этими (потенциально) инфицированными субъектами могут быть субъекты-люди, но также животные, которые подозреваются в качестве носителей такого бактериального организма, могут быть тестированы на присутствие этого организма с использованием связывающих молекул человека или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Эта проба может быть сначала подвергнута манипуляциям, чтобы она стала более подходящей для этого способа детектирования. Манипуляция означает inter alia обработку пробы, подозреваемой в присутствии или содержании бактериального организма, таким образом, что этот организм будет дезинтегрироваться в антигенные компоненты, такие как белки, (поли)пептиды или другие антигенные фрагменты. Предпочтительно связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению контактируют с пробой при условиях, которые позволяют образование иммунологического комплекса между связывающими молекулами человека и бактериальным организмом или его антигенными компонентами, которые могут присутствовать в этой пробе. Затем образование иммунологического комплекса, если оно происходит, указывающее на присутствие бактериального организма в этой пробе, детектируют и измеряют подходящими способами. Такие способы включают в себя, inter alia, гомогенные и гетерогенные иммуноанализы связывания, такие как радиоиммуноанализы (RIA), ELISA, иммунофлуоресценция, иммуногистохимия, FACS, BIACORE и Вестерн-блот-анализы. Предпочтительными способами анализа, особенно для широкомасштабного клинического скрининга сывороток пациентов и крови и полученных из крови продуктов, являются ELISA и Вестерн-блотспособы. Особенно предпочтительными являются тесты ELISA. Для применения в качестве реагентов в этих анализах связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению предпочтительно связывают с внутренней поверхностью микротитрационных лунок. Связывающие молекулы и иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть непосредственно связаны с микротитрационной лункой. Однако максимальное связывание связывающих молекул или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению с лунками может выполняться предобработкой этих лунок полилизином перед добавлением связывающих молекул или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Кроме того,связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть ковалентно присоединены к лункам известными способами. Обычно связывающие молекулы или иммуноконъюгаты используют в количестве 0,01-100 мкг/мл для покрытия, хотя могут быть также использованы более высокие, а также более низкие количества. Затем пробы добавляют к лункам, покрытым связывающими молекулами или иммуноконъюгатами по настоящему изобретению. Кроме того, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации структур специфического связывания бактериального организма, например, Staphylococcus. Этими связывающими структурами могут быть эпитопы на белках и/или полипептидах. Они могут быть линейными, но также структурными или конформационными. В одном варианте осуществления связывающие структуры могут быть анализированы с использованием анализа PEPSCAN (см. inter aliaWO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al., 1996). Альтернативно, библиотека случайных пептидов, содержащая пептиды из белка бактериального организма, может быть подвергнута скринингу на пептиды,способные связываться со связывающими молекулами по настоящему изобретению. Эти обнаруженные связывающие структуры/пептиды/эпитопы могут быть использованы в качестве вакцин и для диагностики бактериальных инфекций. В случае, если фрагменты, другие чем белки и/или полипептиды, связываются этими связывающими молекулами, связывающие структуры могут быть идентифицированы массспектрометрией, высокоэффективной жидкостной хроматографией и ядерным магнитным резонансом. В следующем аспекте это изобретение обеспечивает способ скрининга связывающей молекулы(или ее функционального фрагмента или варианта) на специфическое связывание с тем же самым эпитопом бактериального организма (грамположительного и/или грамотрицательного), например, Staphylococcus, что и эпитоп, связываемый связывающей молекулой человека по настоящему изобретению, причем этот способ предусматривает стадии (а) контактирования подлежащей скринингу связывающей молекулы, связывающей молекулы по настоящему изобретению, и бактериального организма или его фрагмента, (b) измерения, способна ли подлежащая скринингу связывающая молекула конкурировать за специфическое связывание с бактериальным организмом или его фрагментом со связывающей молекулой по настоящему изобретению. В дополнительной стадии может быть определено, имеют ли подвергаемые скринингу связывающие молекулы, которые способны конкурировать за специфическое связывание с бактериальным организмом или его фрагментом, убивающую активность, например опсоническую активность. Связывающая молекула, которая способна конкурировать за специфическое связывание с бактериальным организмом или его фрагментом со связывающей молекулой по настоящему изобретению,является другой частью данного изобретения. В вышеописанном способе скрининга "специфическое связывание с тем же самым эпитопом" включает в себя также специфическое связывание по существу или в основном с тем же самым эпитопом, что и эпитоп, связываемый связывающей молекулой по настоящему изобретению. Способность блокировать связывание или конкурировать со связыванием связывающих молекул по настоящему изобретению с бактериальным организмом обычно указывает на то, что подлежащая скринингу связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания на бактериаль- 22018030 ном организме, который структурно совпадает с сайтом связывания на бактериальном организме, который иммуноспецифически узнается связывающими молекулами по настоящему изобретению. Альтернативно, это может указывать на то, что подлежащая скринингу связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания по настоящему изобретению для стерического или иного ингибирования связывания связывающих молекул по настоящему изобретению с данным бактериальным организмом. Обычно конкурентное ингибирование измеряют при помощи анализа, в котором антигенную композицию, т.е. композицию, содержащую бактериальный организм или его фрагменты, смешивают со ссылочными связывающими молекулами, т.е. связывающими молекулами по настоящему изобретению,и связывающими молекулами, подлежащими скринингу. Обычно подлежащие скринингу связывающие молекулы присутствуют в избытке. Протоколы на основе ELISA и Вестерн-блоттинга пригодны для применения в таких простых конкурентных исследованиях. С использованием вторичных видо- или изотип-специфических антител можно детектировать только связанные ссылочные связывающие молекулы,связывание которых будет уменьшаться присутствием подлежащей скринингу связывающей молекулы,которая узнает по существу тот же самый эпитоп. В проведении конкурентного исследования связывающей молекулы между ссылочной связывающей молекулой и любой подлежащей скринингу связывающей молекулой (независимой от вида или изотипа) можно сначала пометить эту ссылочную связывающую молекулу детектируемой меткой, такой как, например, биотин, ферментная, радиоактивная или другая метка, для возможности последующей идентификации. Связывающие молекулы, идентифицированные этими конкурентными анализами ("конкурентные связывающие молекулы" или "перекрестнореактивные связывающие молекулы") включают в себя, но не ограничиваются ими, антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, которые связываются с эпитопом или сайтом связывания, связываемым ссылочной связывающей молекулой, т.е. связывающей молекулой по настоящему изобретению,а также антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, которые связываются с эпитопом или сайтом связывания, достаточно проксимальным относительно эпитопа, связываемого ссылочной связывающей молекулой, для осуществления конкурентного связывания между подлежащими скринингу связывающими молекулами и ссылочной связывающей молекулой. Предпочтительно конкурентные связывающие молекулы по настоящему изобретению будут, когда они присутствуют в избытке, ингибировать специфическое связывание ссылочной связывающей молекулы с видом-мишенью по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 75-90% или даже более. Идентификация одной или нескольких конкурентных связывающих молекул, которые связываются приблизительно, по существу или в основном с тем же самым эпитопом, что и связывающие молекулы по настоящему изобретению, является просто вопросом техники. Поскольку идентификацию конкурентно связывающих молекул определяют в сравнении со ссылочной молекулой, т.е. связывающей молекулой по настоящему изобретению,должно быть понятно, что фактически определение эпитопа, с которым связываются ссылочная молекула и конкурентно связывающая молекула, никоим образом не требуется для идентификации конкурентно связывающей молекулы, которая связывается с тем же самым или по существу тем же самым эпитопом,что и ссылочная связывающая молекула. Примеры Для иллюстрации по настоящему изобретению обеспечены следующие примеры. Эти примеры не предназначены для ограничения каким-либо образом объема по настоящему изобретению. Пример 1. Конструирование библиотек scFv фагового дисплея с использованием РНК, экстрагированной из доноров, подвергнутых скринингу на опсоническую активность. Пробы крови брали из доноров, сообщающих о недавней грамположительной бактериальной инфекции, а также здоровых взрослых в возрасте 25-50 лет. Лейкоциты периферической крови выделяли центрифугированием и сыворотку крови сохраняли и замораживали при -80 С. Сыворотку доноров подвергали скринингу на опсоническую активность с использованием анализа фагоцитоза на основе FACS(Cantinieaux et al., 1989) и сравнивали с пулом нормальных здоровых доноров. Сыворотки из доноров,имеющие более высокую фагоцитарную активность, чем нормальная сыворотка, выбирали для применения в генерировании библиотек фагового дисплея. Тотальную РНК получали из лейкоцитов периферической крови этих доноров с использованием отделения органической фазы и последующего осаждения этанолом. Полученную РНК растворяли в не содержащей РНКаз воде и определяли концентрацию измерением OD 260 нм. После этого эту РНК разбавляли до концентрации 100 нг/мл. Затем 1 мкг РНК превращали в кДНК следующим образом: к 10 мкл тотальной РНК добавляли 13 мкл DEPC-обработанной ультрачистой воды и 1 мкл случайных гексамеров (500 нг/мкл) и полученную смесь нагревали при 65 С в течение 5 мин и быстро охлаждали на влажном льду. Затем к этой смеси добавляли 8 мкл 5 Х буфера первой цепи, 2 мкл dNTP (10 мМ каждый), 2 мкл ДТТ (0,1 М), 2 мкл ингибитора РНКаз (40 Е/мкл) и 2 мкл обратной транскриптазы Superscript III MMLV (200 Е/мкл), инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и инкубировали в течение 1 ч при 50 С. Реакцию останавливали инактивацией нагреванием, т.е. инкубированием этой смеси в течение 15 мин при 75 С. Полученные кДНК-продукты разбавляли до конечного объема 200 мкл DEPC-обработанной ультрачистой водой. Для определения концен- 23018030 трации кДНК использовали OD 260 нм разбавленного в 50 раз раствора (в 10 мМ Трис-буфере) разведения полученных кДНК-продуктов. Для каждого донора 5-10 мкл разведенных кДНК-продуктов использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации последовательностей семейства тяжелых цепей и легких цепей каппа или лямбда иммуноглобулина гамма с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров (см. табл. 1-7). Кроме того, для одного донора проводили ПЦР-амплификацию последовательностей семейства тяжелых цепей мю и легкой цепи каппа или лямбда. Реакционные смеси ПЦР содержали, наряду с разбавленными кДНК-продуктами, 25 пмоль смысловой праймер и 25 пмоль антисмысловой праймер в конечном объеме 50 мкл 20 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2,250 мкМ dNTP и 1,25 единиц полимеразы Taq. В термоциклере с нагретой крышкой, имеющем температуру 96 С, полученные смеси быстро расплавляли в течение 2 мин с последующими 30 циклами: 30 с при 96 С, 30 с при 55 С или 60 С и 60 с при 72 С. Наконец, эти пробы инкубировали 10 мин при 72 С и помещали в холодильник при 4 С до последующего использования. В первом раунде амплификации каждый из восемнадцати смысловых праймеров вариабельной области легкой цепи (двенадцать для легкой цепи лямбда (см. табл. 1; смысловые праймеры HuVL1A-Back,HuVL1B-Back и HuVL1C-Back смешивали до эквимолярности перед использованием, так же как и смысловые праймеры HuVL9-Back и HuVL10-Back) и шести для легкой цепи каппа (см. табл. 2 объединяли с антисмысловым праймером, узнающим константную область С-каппа, названным HuCK-FOR 5'ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3' (см. SEQ ID NO:37), или константную область С-лямбда HuCL2FOR 5'-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3' (см. SEQ ID NO:38) и HuCL7-FOR 5'AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3' (см. SEQ ID NO:39) (антисмысловые праймеры HuCL2-FOR иHuCL7-FOR смешивали до эквимолярности перед использованием), с получением 15 продуктов приблизительно 650 п.н. Эти продукты очищали на агарозном геле и выделяли из геля с использованием колонок для экстракции гелей Qiagen. 1/10 каждого из этих выделенных продуктов использовали в идентичной ПЦР-реакции, описанной выше, с использованием восемнадцати смысловых праймеров, посредством которой каждый смысловой праймер легкой цепи лямбда комбинировали с одним из трех J-лямбдаобласть-специфических антисмысловых праймеров и каждый смысловой праймер легкой цепи каппа комбинировали с одним из пяти J-каппа-область-специфических антисмысловых праймеров (см. табл. 3; смысловые праймеры HuVL1A-Back-SAL, HuVL1B-Back-SAL и HuVL1C-Back-SAL смешивали до эквимолярности перед использованием, так же как и смысловые праймеры HuVL9-Back-SAL и HuVL10Back-SAL). Смысловые праймеры, используемые во второй амплификации, были такими же праймерами,которые использовали в первой амплификации, но были удлинены сайтами рестрикции (см. табл. 3) для возможности направленного клонирования в вектор фагового дисплея PDV-C06 (см. SEQ ID NO:40). Это приводило к 57 продуктам приблизительно 400 п.н., которые объединяли, как показано в таблице 4, для сохранения природного распределения разных J-сегментов и семейств легких цепей в этой библиотеке,но не представления завышенно или заниженно определенных семейств. Эти объединенные продукты очищали с использованием колонок для ПЦР-очистки Qiagen. В следующей стадии 3 мкг объединенных продуктов и 100 мкг вектора PDV-C06 расщепляли SalI и NotI и очищали из геля. После этого выполняли лигирование в течение ночи при 16 С следующим образом. К 500 нг вектора PDV-C06 добавляли 35, 70 или 140 нг объединенных продуктов в общем объеме 50 мкл смеси для лигирования, содержащей 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, 25 мкг/мл БСА и 2,5 мкл ДНК-лигазы Т 4(400 Е/мкл). Эти смеси для лигирования очищали экстракцией смесью фенол/хлороформ с последующей экстракцией хлороформом и осаждением этанолом, способами, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту. Полученную ДНК растворяли в 50 мкл 10 мМ Трис-HCl рН 8,5 и 1 или 2 мкл каждой смеси для лигирования электропорировали в 4 0 мкл TG1-компетентных бактерий Е.coli в соответствии с протоколом изготовителя (Stratagene). Трансформанты выращивали в течение ночи при 37 С на 2TY-агаре, дополненном 50 мкг/мл ампициллина и 4,5% глюкозой. Колонии считали для определения оптимального отношения вектора к инсерту. Из смеси для лигирования с оптимальным соотношением множественные аликвоты 1 или 2 мкл электропорировали, как описано выше, и трансформанты росли в течение ночи при 37 С, давая обычно 107 колоний. (Суб)библиотеку вариабельных областей легкой цепи получали выскабливанием трансформантов из чашек с агаром. Эту (суб)библиотеку использовали непосредственно для получения ДНК плазмиды с использованием набора Qiagen QIAFilterMAXI prep. Последовательности тяжелых цепей иммуноглобулина амплифицировали из тех же самых кДНКпрепаратов в сходной процедуре ПЦР с двумя раундами и идентичными параметрами реакции, как описано выше для областей легкой цепи, при условии, что использовали праймеры, представленные в таблицах 5 и 6. Первую амплификацию выполняли с использованием серии из восьми смысловых прямых праймеров (см. табл. 5; смысловые праймеры HuVHlB/7A-Back и HuVH1C-Back смешивали до эквимолярности перед использованием), каждый, в комбинации с IgG-специфическим антисмысловым праймером константной области, названным HuCIgG 5'-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3' (SEQ IDNO:41) с получением семи продуктов приблизительно 650 п.н. Для одного донора использовали IgMспецифический антисмысловой праймер константной области, названный HuCIgM 5'-TGG AAG AGGCAC GTT CTT TTC TTT-3' (SEQ ID NO:42) вместо праймера HuCIgG. Эти продукты очищали на агароз- 24018030 ном геле и выделяли из геля с использованием колонок для экстракции гелей Qiagen. 1/10 каждого из этих выделенных продуктов использовали в идентичной ПЦР-реакции, описанной выше, с использованием восьми смысловых праймеров, посредством которой каждый смысловой праймер тяжелой цепи комбинировали с одним из четырех JH-цепь-специфических антисмысловых праймеров (см. табл. 6; смысловые праймеры HuVH1B/7A-Back-Sfi и HuVH1C-Back-Sfi смешивали до эквимолярности перед использованием). Смысловые праймеры, используемые в этом втором раунде, были теми же самыми праймерами, которые использовали в первой амплификации, но удлиненными сайтами рестрикции (см. табл. 6) для возможности направленного клонирования в векторе (суб)библиотеки легкой цепи. Это приводило к 28 продуктам приблизительно 400 п.н., которые объединяли, как показано в таблице 7, для сохранения природного распределения разных J-сегментов и семейств тяжелых цепей в этой библиотеке,но не представления завышенно или заниженно определенных семейств. Эти объединенные продукты очищали с использованием колонок для ПЦР-очистки Qiagen. Затем 3 мкг очищенных продуктов расщепляли SfiI и XhoI и лигировали в вектор (суб)библиотеки легких цепей, который был разрезан теми же самыми рестрикционными ферментами, с использованием процедуры лигирования и объемов, описанных выше для (суб)библиотеки легких цепей. Очистку смеси для лигирования и последующую трансформацию полученной окончательной библиотеки выполняли, как описано выше для (суб)библиотеки легких цепей. Все бактерии, обычно 107, собирали в культуральной среде 2TY, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 4,5% глюкозу, смешивали с глицерином до 15% (об./об.) и замораживали в виде аликвот 1,5 мл при -80 С. Спасение и отбор каждой библиотеки выполняли, как описано ниже. Различные библиотеки были названы GPB-05-M01, GPB-05-G01, GPB-05-G02, GPB-05-G03, GPB-05-G04 и GPB-05G05. Две другие библиотеки, RAB-03-G01 и RAB-04-G01, конструировали с использованием способа,сходного с вышеописанной процедурой, как описано ранее в международной заявке на патентWO 2005/118644. Пример 2. Конструирование библиотек scFv фагового дисплея с использованием РНК, экстрагированной из Вклеток памяти. Периферическую кровь собирали из нормальных здоровых доноров, выздоровевших доноров или вакцинированных доноров венопункцией с использованием обработанных ЭДТА антикоагуляционных пробирок для крови. Пробу крови (45 мл) разбавляли в 2 раза ЗФР и аликвоты 30 мл наносили на 10 млFicoll-Hypaque (Pharmacia) и центрифугировали при 900g 20 мин при комнатной температуре без прерываний. Супернатант осторожно удаляли до положения выше белого слоя, содержащего фракцию лимфоцитов и тромбоцитов. Затем этот слой осторожно удаляли (10 мл), переносили в свежую пробирку на 50 мл и промывали три раза 40 мл ЗФР и вращали при 400g в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления тромбоцитов. Полученный осадок, содержащий лимфоциты, ресуспендировали в средеRPMI, содержащей 2% ФТС, и количество клеток определяли подсчетом клеток. Приблизительно 1103 лимфоцитов окрашивались для сортинга флуоресцентных клеток с использованием CD24, CD27 и поверхностного IgM в качестве маркеров для выделения В-клеток переключенной памяти и памяти IgM. Устройство Becton Dickinson Digital Vantage, установленное в режиме Yield Mode, использовали для физического сортинга и выделения В-клеток памяти. Лимфоциты дискриминировали в виде малой компактной популяции из окна FSC/SSC. Затем В-клетки (CD24+/CD27+) отделяли от необученных Вклеток (CD24+/CD27-) и Т-клеток памяти (CD24-/CD27+). В следующей стадии В-клетки памяти IgM(IgM+) отделяли от В-клеток переключенной памяти (IgM-) с использованием экспрессии IgM. В этой стадии В-клетки памяти IgM и В-клетки переключенной памяти подвергали сортингу в отдельных пробирках для проб. 1105-1106 клеток каждой популяции собирали в DMEM/50% ФТС и после завершения сортинга клетки каждой популяции центрифугировали при 400g в течение 10 мин. Затем отсортированные В-клетки использовали в качестве исходного материала для конструирования библиотек согласно способу, описанному в примере 1, с использованием праймера HuCIgM в первом раунде амплификации последовательностей тяжелой цепи иммуноглобулина. Разные библиотеки были названы МЕМ 05-М 01, МЕМ-05-М 02, МЕМ-05-М 03, МЕМ-05-М 04, МЕМ-05-М 05, МЕМ-05-МОб, МЕМ-05-М 07, МЕМ 05-М 08, МЕМ-05-М 09 и МЕМ-05-М 10. Пример 3. Отбор фагов, несущих одноцепочечные Fv-фрагменты, специфически связывающиеся со стафилококками. Фрагменты антител отбирали с использованием библиотек фагового дисплея антител, общей технологии фагового дисплея и технологии MAbstract, в основном описанной в патенте США 6265150 и вWO 98/15833 (оба из которых включены здесь в качестве ссылки). Используемыми фаговыми библиотеками антител были подвергнутые скринингу донорные библиотеки, полученные, как описано в примере 1, библиотеки памяти IgM, полученные, как описано в примере 2, и полусинтетические фаговые библиотеки scFv (JK1994), которые были описаны в Kruif et al., 1995b. В данном изобретении использовали способы и хелперные фаги, описанные в WO 02/103012 (включенном здесь в качестве ссылки). Для идентификации фаговых антител, узнающих стафилококки, выполняли эксперименты отбора фагов с использо- 25018030 ванием живых бактерий в суспензии. Используемые для отбора и скрининга клинические изоляты описаны в табл. 8. Эти изоляты являются разными на основе RELP-типирования. Бактерии выращивали в течение ночи при 37 С на чашках с кровяным агаром и соскабливали вRPMI-буфер, содержащий 1 мг/мл кроличьего IgG и 1% БСА при концентрации 5109 бактерий/мл, и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. Аликвоту фаговой библиотеки (приблизительно 1013 КОЕ, амплифицированной с использованием хелперного фага СТ (см. WO 02/103012, блокировали в блокирующем буфере (2% ELK в ЗФР) в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Эту блокированную фаговую библиотеку добавляли к блокированной бактериальной суспензии с получением общего объема 1,5 мл и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в роторе с переворачиванием пробирок с донышка на крышку (5 об/мин). Эту суспензию центрифугировали при 6800g в течение 3 мин при комнатной температуре и супернатант выбрасывали. Бактерии промывали пять раз буфером RPMI, содержащим 1% БСА и 0,05% (об./об.) Твина-20, затем пять раз буфером RPMI, содержащим 1% БСА, для удаления несвязанных фагов. Связанные фаги элюировали из антигена инкубацией с 1 мл 0,1 М триэтиламина в течение 10 мин при комнатной температуре в роторе с переворачиванием пробирки с донышка на крышку (5 об/мин). Затем все содержание пробирки смешивали с 0,5 мл 1 М ТрисHCl, рН 7,5, для нейтрализации рН. эту смесь использовали для инфицирования 5 мл культуры XL1-BlueE.coli, которую выращивали при 37 С до OD 600 нм приблизительно 0,3. Фагам давали инфицировать бактерии XL1-Blue в течение 30 мин при 37 С. Затем эту смесь центрифугировали в течение 10 мин при 3200g при комнатной температуре и бактериальный осадок ресуспендировали в 0,5 мл среды 2 триптон-дрожжевой экстракт (2TY). Полученную бактериальную суспензию делили на две чашки с 2TYагаром, дополненным тетрациклином, ампициллином и глюкозой. После инкубации в течение ночи этих чашек при 37 С колонии выскабливали из чашек и использовали для получения обогащенной фаговой библиотеки, в основном, как описано De Kruif et al. (1995a) и WO 02/103012. Вкратце, соскобленные бактерии использовали для инокуляции среды 2TY, содержащей ампициллин, тетрациклин и глюкозу, и выращивали при температуре 37 С до OD 600 нм 0,3. Добавляли хелперные фаги СТ и давали им инфицировать бактерии, после чего эту среду заменяли на среду 2TY, содержащую ампициллин, тетрациклин и канамицин. Инкубацию продолжали в течение ночи при 30 С. На следующий день бактерии удаляли из среды 2TY центрифугированием, после чего эти фаги в среде осаждали с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000/NaCl. Наконец, фаги растворяли в 2 мл ЗФР с 1% бычьим сывороточным альбумином(БСА), стерильно фильтровали и использовали для следующего раунда отбора. Обычно, два раунда отборов выполняли перед выделением отдельных фаговых антител. Отбор проводили дважды на одном и том же штамме бактерий, или разные штаммы использовали последовательно(см. табл. 8 в отношении отобранных штаммов). После второго раунда отбора отдельные колонии Е.coli использовали для получения моноклональных фаговых антител. В основном, индивидуальные колонии выращивали до log-фазы в формате 96-луночного планшета и инфицировали хелперными фагами СТ,после чего продуцированию фаговых антител давали протекать в течение ночи. Полученные фаговые антитела осаждали ПЭГ/NaCl и стерильно фильтровали и испытывали в ELISA и/или FACS на связывание с Staphylococcus, полученным, как описано выше. Пример 4. Валидизация стафилококковых специфических, одноцепочечных фаговых антител. Отобранные одноцепочечные фаговые антитела, которые получали в скринингах, описанных выше,валидизировали в FACS на специфическую стафилококковую связывающую активность, т.е. связывание с одним или несколькими стафилококковыми штаммами, полученными, как описано выше, но лишенными связывания с Enterococcus, как измерено анализом связывания энтерококка на основе FACSанализа. Фаговые антитела блокировали FACS-буфером (20 мМ HEPES-буфер рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1% БСА) в течение 20 мин на льду. Для каждого окрашивания 1109 бактериальных клеток, выскобленных из чашек с кровяным агаром и промытых в FACS-буфере, добавляли в каждую пробирку Эппендорфа. Бактерии блокировали FACS-буфером, содержащим 15% сыворотку человека (Biowhittaker), в течение 30 мин при комнатной температуре. Бактерии осаждали центрифугированием при 1700g в течение 3 мин и ресуспендировали с блокированными фаговыми антителами и инкубировали в течение 1,5 часов на льду. Затем эти бактерии промывали FACS-буфером и последовательно инкубировали с мышиными биотинилированными мышиными антиМ 13-антителами (RDI) и затем со стрептавидином-РЕ. Эти клетки фиксировали в забуференном 4% формальдегиде и анализировали на FACS caliber. SC05-132 и SC05-133(оба отобранные из RAB-03-G01 на штамме Cowan в суспензии) обнаруживали окрашивание на всех испытанных клинических изолятах, что указывало на то, что они узнают пан-стафилококковую мишень.SC02-430 (отобранный из JK1994 на штамме Cowan в суспензии) обнаруживал специфическое связывание со штаммом Cowan стафилококка (см. табл. 9). В следующих разделах были получены одноцепочечные фаговые антитела, названные SC06-166, SC06-171, SC06-176, SC06-187, SC06-193, SC06-249, SC06273, SC06-389, SC06-403, SC06-406, SC06-410, SC06-446, SC06-450, SC06-452, SC06-453, SC06-464,SC06-471, SC06-516, SC06-517, SC06-526, SC06-528, SC06-531, SC06-533, SC06-536, SC06-537, SC06-538,SC06-540, SC06-544, SC06-566, SC06-625. Эти антитела связывались по меньшей мере с одним из испы- 26018030 танных клинических изолятов (см. табл. 9). SC06-166, SC06-171, SC06-176 и SC06-187 были отобраны из иммунных библиотек, в то время как другие фаговые антитела были отобраны из библиотек В-клеток памяти IgM. Для испытания неспецифической реактивности против небактериальных антигенов использовали анализ ELISA. Смешанные антигены 5% ФТС, 2% ELK и 1% БСА наносили в течение ночи на планшетыMaxisorp ELISA. Отобранные одноцепочечные фаговые антитела инкубировали в течение 15 мин в равном объеме ЗФР, содержащем 1% БСА, для получения блокированных фаговых антител. Эти планшеты опустошали и блокированные одноцепочечные антитела добавляли в эти лунки. Инкубированию давали протекать в течение двух часов при комнатной температуре, планшеты промывали в ЗФР, содержащем 0,1% (об./об.) Твин-20, и связанные фаговые антитела детектировали посредством измерения OD 492 нм с использованием антиМ 13-антитела, конъюгированного с пероксидазой. В качестве контроля эту процедуру выполняли одновременно без одноцепочечного фагового антитела, с одноцепочечным фаговым антителом в качестве отрицательного контроля, направленным против белка оболочки вируса лихорадки Западного Нила (SC04-374). Как показано в таблице 10, отобранные фаговые антитела, названныеSC02-430, SC05-132 и SC05-133, не проявляли какого-либо детектируемого связывания с антигенами отрицательного контроля ФТС, ELK и БСА. Пример 5. Характеристика стафилококковых специфических scFv. Из выбранных клонов специфического одноцепочечного фагового антитела (scFv) получали плазмидную ДНК и определяли нуклеотидные последовательности в соответствии со стандартными способами. Нуклеотидные последовательности scFv (в том числе сайты для клонирования), названных SC02430, SC05-132 и SC05-133, показаны в SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:23 соответственно. Аминокислотные последовательности scFv, названных SC02-430, SC05-132 и SC05-133, показаны в SEQCDR-последовательности этих scFv, специфически связывающих стафилококки, изображены в таблицах 11 и 12, соответственно. Аналогично одноцепочечным фаговым антителам, описанным выше, были определены нуклеотидная и аминокислотная последовательность, идентичность генов VL и VH и CDR-последовательности одноцепочечных фаговых антител, названных SC06-166, SC06-171, SC06-176, SC06-187, SC06-193, SC06249, SC06-273, SC06-389, SC06-403, SC06-406, SC06-410, SC06-446, SC06-450, SC06-452, SC06-453,SC06-464, SC06-471, SC06-516, SC06-517, SC06-526, SC06-528, SC06-531, SC06-533, SC06-536, SC06-537,SC06-538, SC06-540, SC06-544, SC06-566 и SC06-625 (данные не показаны). Пример 6. Конструирование полных человеческих молекул иммуноглобулина (моноклональных антистафилококковых антител человека) из отобранных антистафилококковых одноцепочечных Fv. Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи SC02-430 ПЦР-амплифицировали с использованием олигонуклеотидов для присоединения сайтов рестрикции и/или последовательностей для экспрессии в IgG-экспрессионных векторах pSyn-C03-HC1 (SEQ ID No:43) и pSyn-C04-C (SEQ ID NO:44). Вариабельную область тяжелой цепи SC02-430 клонировали в вектор pSyn-C03-HC1; вариабельную область легкой цепи SC02-430 клонировали в вектор pSyn-C04-C. Сначала амплифицировали ген VLlambda с использованием следующего набора олигонуклеотидов: 5L-B (SEQ ID NO:45) и sy3L-A (SEQ IDNO:46) и продукт ПЦР клонировали в вектор pSyn-C04-C. Нуклеотидную последовательность этой конструкции подтверждали в соответствии со стандартными способами, известными квалифицированному в данной области специалисту. Ген VH сначала амплифицировали с использованием следующего, набора олигонуклеотидов: 5H-F (SEQ ID NO:47) и sy3H-А (SEQ ID NO:48). После этого продукт ПЦР клонировали в вектор pSyn-C03-HCYl и нуклеотидную последовательность подтверждали в соответствии со стандартными способами, известными квалифицированному в данной области специалисту. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи scFv, названных SC05-132, SC05-133, SC06-166,SC06-171, SC06-176, SC06-187, SC06-193, SC06-249, SC06-273, SC06-389, SC06-403, SC06-406, SC06-410,SC06-446, SC06-450, SC06-452, SC06-453, SC06-464, SC06-471, SC06-516, SC06-517, SC06-526, SC06-528,SC06-531, SC06-533, SC06-536, SC06-537, SC06-538, SC06-540, SC06-544, SC06-566, SC06-625, клонировали непосредственно с использованием рестрикционного продукта расщепления для экспрессии в IgGэкспрессионных векторах pIg-C911-HCgammal (SEQ ID NO:49) и pIg-C909-Ckappa (SEQ ID NO:50) илиpIg-C910-Clambda (SEQ ID NO:115). Вариабельные области тяжелой цепи scFv, названных SC05-132,SC05-133, SC06-166, SC06-171, SC06-176, SC06-187, SC06-193, SC06-249, SC06-273, SC06-389, SC06-403,SC06-406, SC06-410, SC06-446, SC06-450, SC06-452, SC06-453, SC06-464, SC06-471, SC06-516, SC06-517,SC06-526, SC06-528, SC06-531, SC06-533, 5 С 06-536, SC06-537, SC06-538, SC06-540, SC06-544, SC06-566 и SC06-625, клонировали в вектор pIg-C911-HCgammal с использованием рестрикционного продукта расщепления при помощи ферментов SfiI и XhoI, и вариабельные области scFv, названных SC05-132,- 27018030SC05-133, SC06-166, SC06-171, SC06-176, SC06-187, SC06-193, SC06-249, SC06-273, SC06-389, SC06-403,SC06-406, SC06-410, SC06-446, SC06-450, SC06-452, SC06-453, SC06-464, SC06-471, SC06-516, SC06-517,SC06-526, SC06-528, SC06-531, SC06-533, SC06-536, SC06-537, SC06-538, SC06-540, SC06-544, SC06-566 и SC06-625, клонировали в вектор pIg-C909-Ckappa или pIg-C910-Clambda с использованием рестрикционного продукта расщепления при помощи ферментов SalI и NotI. После этого эти нуклеотидные последовательности подтверждали в соответствии со стандартными способами, известными квалифицированному в данной области специалисту. Полученные экспрессионные плазмиды pgG102-430C03, pgG105-132 С 911, pgG105-133C911,pgG106-166C911, pgG106-171C911, pgG106-176C911, pgG106-187C911, pgG106-193C911, pgG106249C911, pgG106-273C911, pgG106-389C911, pgG106-403C911, pgG106-406C911, pgG106-410C911,pgG106-446C911, pgG106-450C911, pgG106-452C911, pgG106-453C911, pgG106-464C911, pgG106471C911, pgG106-516C911, pgG106-517C911, pgG106-526C911, pgG106-528C911, pgG106-531C911,pgG106-533C911, pgG106-536C911, pgG106-537C911, pgG106-538C911, pgG106-540C911, pgG106544C911, pgG106-566C911 и pgG106-62 5C911, кодирующие тяжелые цепи антистафилококкового IgG1 человека, и pSyn-C04-Vl2, pgG105-132C909, pgG105-133C909, pgG106-166C910, pgG106-171C910,pgG106-176C909, pgG106-187C909, pgG106-193C910, pgG106-249C910, pgG106-273C910, pgG106389C910, pgG106-403C910, pgG106-406C910, pgG106-410C910, pgG106-446C910, pgG106-450C910,pgG106-452C909, pgG106-453C909, pgG106-464C910, pgG106-471910, pgG106-516C909, pgG106517C910, pgG106-526C910, pgG106-528C910, pgG106-531C910, pgG106-533C909, pgG106-536C909,pgG106-537C910, pgG106-538C910, pgG106-540C910, pgG106-544C910, pgG106-566C910, pgG106625C910, кодирующие легкие цепи антистафилококкового Ig человека, транзиторно экспрессировали вместе в клетках 293 Т, и получали супернатанты, содержащие антитела IgG1 человека. Нуклеотидные последовательности тяжелых цепей антител, названных CR2430, CR5132, CR5133, CR6166, CR6171,CR6176, CR6187, CR6193, CR6249, CR6273, CR6389, CR6403, CR6406, CR6410, CR6446, CR6450,CR6452, CR6453, CR6464, CR6471, CR6516, CR6517, CR6526, CR6528, CR6531, CR6533, CR6536,CR6537, CR6538, CR6540, CR6544, CR6566 и CR6625, показаны в SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ IDNO:174 соответственно. Аминокислотные последовательности тяжелой цепи антител, названныхNO:171, SEQ ID NO:173 и SEQ ID NO:175 соответственно. Нуклеотидные последовательности легкой цепи антител CR2430, CR5132, CR5133, CR6166, CR6171, CR6176, CR6187, CR6193, CR6249, CR6273,CR6389, CR6403, CR6406, CR6410, CR6446, CR6450, CR6452, CR6453, CR6464, CR6471, CR6516,CR6517, CR6526, CR6528, CR6531, CR6533, CR6536, CR6537, CR6538, CR6540, CR6544, CR6566 иNO:228, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:232 и SEQ ID NO:234 соответственно. Аминокислотные последовательности легкой цепи антител CR2430, CR5132, CR5133, CR6166, CR6171, CR6176, CR6187, CR6193,CR6249, CR6273, CR6389, CR6403, CR6406, CR6410, CR6446, CR6450, CR6452, CR6453, CR6464,CR6471, CR6516, CR6517, CR6526, CR6528, CR6531, CR6533, CR6536, CR6537, CR6538, CR6540,CR6544, CR6566 и CR6625 показаны в SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:189, SEQNO:227, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:233 и SEQ ID NO:235 соответственно. Квалифицированный в данной области специалист сможет определить вариабельные области тяжелой и легкой цепей вышеописанных антител по Kabat et al. (1991), как описано Sequences of Proteins of Immunological ласти специалист сможет определить области CDR тяжелой и легкой цепей вышеописанных антител и одноцепочечных фаговых антител по Kabat et al. (1991), Chothia and Lesk (1987) или по обеим статьям. Альтернативно, вариабельные области и области CDR могут быть определены с использованием базы данных VBASE, базы данных, которая хорошо известна квалифицированным в области антител специалистам. Последовательности антител по настоящему изобретению могут сравниваться с последовательностями иммуноглобулинов в базе данных VBASE (см. Tomlinson I.M., Williams S.C., Ignatovitch О., Corbett S.J., Winter G. VBASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/; MRC Centre for Protein Engineering), и на основе этого могут быть определены вариабельные области и области CDR. Вариабельные области некоторых из этих антител приведены в табл. 13. Антистафилококковые антитела IgG1 человека валидизировали в отношении их способности связываться со стафилококками при помощи FACS, как описано для scFv (см. табл. 14). Отрицательным контролем было антитело против вируса лихорадки Западного Нила (CR4374). Альтернативно, получали партии более чем 1 мг каждого антитела и очищали при помощи стандартных процедур. Пример 7.In vitro опсоническая фагоцитарная активность стафилококковых специфических IgG, измеренная при помощи FACS. Опсоническую активность антистафилококковых IgG1 измеряли в опсонофагоцитарном (ОРА) анализе с использованием свежедиффенцированных клеток HL-60. Во время ОРА-анализа флуоресцирующие бактерии смешивали с дифференцированными клетками UL-60 и серийно разведенными IgG. Бактрии выращивали до стационарной или до логарифмической фазы перед мечением. Для выращивания бактерий до стационарной фазы различные стафилококковые изоляты инкубировали в течение ночи на чашках с агаром, содержащим кровь овцы, при 37 С. Бактерии ресуспендировали в 5 мл бикарбонатного буфера (0,1 М NaHCO3, pH 8,0), собирали центрифугированием при 800g в течение 10 мин при комнатной температуре и разбавляли до концентрации 2,9109 бактерий/мл. Бактерии, которые вырастали до логарифмической фазы, сначала культивировали в течение ночи в LB-среде при 37 С, затем эту культуру разбавляли в 10 раз и выращивали в течение дополнительных 3 ч в LB-среде при 37 С. Бактерии собирали центрифугированием при 800g в течение 10 мин и ресуспендировали в бикарбонатном буфере, промывали до концентрации 2,9109 бактерий/мл. 50 мкл раствора 5,6-карбоксифлуоресцеина, сукцинимидилового эфира FAM-SE; Molecular Probes, Eugene, Oregon); 10 мг/мл в диметилсульфоксиде (FisherScientific Co., Fair Lawn, NJ. добавляли к 1 мл 2,9109 бактерий и эту смесь инкубировали в течение 1 ч при 37 С без встряхивания. Меченые бактерии промывали три раза в 20 мл буфера для опсонофагоцитоза (сбалансированного солевого раствора Хенкса с Са 2+ и Mg2+ и 0,2% бычьего сывороточного альбумина), пока не наблюдали отсутствие свободного красителя в супернатанте. FAM-SE-меченые бактерии ресуспендировали в 8 мл ОРА-буфера и хранили в виде аликвот 500 мкл при -20 С с защитой от света. Клетки HL-60 (клетки промиелоцитарного лейкоза человека; ЕСАСС N0 98070106) выращивали при плотностях клеток 1-9105 клеток/мл в среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ L-глутамин, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой (HyClone Laboratories, Logan,Utah) и пенициллином/стрептомицином. Клетки между пассажами 6 и 35 использовали для дифференцировки. Клетки дифференцировались в гранулоциты культивированием в той же самой среде, дополненной 510-7 М полностью-транс-ретиноевой кислотой (Sigma), 610-12 М витамином D3 (Sigma) и 30 нг/мл рекомбинантным G-CSF человека (RD). Клетки HL-60 собирали центрифугированием при 160g в течение 10 мин и промывали дважды в 15 мл промывочного буфера (сбалансированного солевого раствора Хенкса, без Са 2+ и Mg2+, содержащего 0,2% бычий сывороточный альбумин). Клетки промывали один раз в буфере для опсонофагоцитоза, ресуспендировали в 4 мл буфера для опсонофагоцитоза и считали в гемоцитометре. Концентрацию клеток доводили до 5106 клеток/мл. Антистафилококковые IgG и контрольный IgG (CR4374) серийно разводили в буфере для опсонофагоцитоза в общем объеме 20 мкл для получения разведений, имеющих концентрации IgG 2,50 кг/мл,1,20 мкг/мл, 0,60 мкг/мл, 0,30 мкг/мл, 0,15 мкг/мл, 0,075 мкг/мл, 0,0375 мкг/мл и 0,019 мкг/мл. Опсоническую активность разведений измеряли в анализе ОРА в круглодонном планшете, который был блокирован 1% БСА в ЗФР. В качестве контроля этот анализ выполняли без IgG. Аликвоту 15 мкл бактериальной суспензии, содержащую 5,4106 клеток, добавляли в каждую лунку на планшете. При использовании бактериальной суспензии из штамма S. aureus Cowan или S. epidermidis, суспензию IgG/бактерия сначала инкубировали в течение 30 мин при 37 С при горизонтальном качании этого планшета (1300 об/мин) вHeidolph titramax 1000. Затем в каждую лунку планшета добавляли 15 мкл дифференцированных клетокHL-60 (всего: 75103 клеток) и планшет инкубировали при встряхивании при 37 С в течение 30-45 мин. Конечный объем в лунке был равен 50 мкл. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл промывочного буфера, содержащего 4% (об./об.) формальдегид. Содержимое в каждой лунке ресуспендировали и переносили в полистироловые одноразовые пробирки для проточного цитометрического анализа. Пробы хранили в темноте при 4 С до проведения анализа. Пробирки перемешивали на вортексе в течение 3 с перед взятием проб в проточном цитометре. Для контроля дифференцировки клеток HL-60 измеряли экспрес- 29